DE69034100T2

DE69034100T2 - Verktorvermittelte genominsertion und expression von dna in bcg

Info

Publication number: DE69034100T2
Application number: DE69034100T
Authority: DE
Inventors: A. Richard YOUNG; Anna Aldovini
Original assignee: Whitehead Institute for Biomedical Research
Current assignee: Whitehead Institute for Biomedical Research
Priority date: 1989-06-19
Filing date: 1990-06-18
Publication date: 2004-06-09
Anticipated expiration: 2010-06-19
Also published as: ATE250133T1; WO1990015873A1; AU5848090A; EP0478664B1; EP0478664A1; DE69034100D1; CA2063414A1; JPH04506297A

Description

Ausgangspunkt
Mycobakterien stellen für Menschen und Tiere bedeutende Pathogene dar. Beispielsweise wird die Tuberkulose bei Menschen allgemein durch Mycobakterium (M.) tuberculosis und bei Rindern durch Mycobakterium (M.) bovis verursacht (das auf Menschen und andere Tiere übertragen werden kann, bei denen es Tuberkulose verursacht). Die Tuberkulose bleibt nach wie vor weit verbreitet und ist, insbesondere in den Entwicklungsländern, ein bedeutendes öffentliches Gesundheitsproblem. Es wird angenommen, dass ungefähr 10 Millionen Fälle von Tuberkulose weltweit existieren, mit einer jährlichen Mortalität von 3 Millionen. Joint International Union Against Tuberculosis and World Health Organization Study Group, Tubercle, 63: 157–169 (1982).
Die Lepra, die durch M. leprae verursacht wird, betrifft über 10 Millionen Menschen, in erster Linie in den Entwicklungsländern. Bloom, B.R. und T. Godal, Review of Infectious Diseases, 5: 657–679 (1984). M. tuberculosis und Mycobakterien der Avium-intracellularescrofulaceum (MAIS)-Gruppe repräsentieren die bedeutendsten opportunistischen Pathogene von Patienten mit erworbener Immundefizienzkrankheit (Acquired Immunodeficiency Disease = AIDS). Center for Disease Control, Morbidity and Mortality Weekly Report, 34: 774 (1986). M. pseudotuberculosis ist für Rinder ein Hauptpathogen.
Andererseits ist der Bacillus Calmette-Guerin (BCG), ein avirulenter Stamm von M. bovis, die am häufigst verwendete humane Vakzine in der Welt und wurde seit mehr als 50 Jahren als Lebendvakzine verwendet. In den letzten 35 Jahren wurde es an mehr als 2,5 Milliarden Menschen verabreicht, mit bemerkenswert wenigen Nebenwirkungen (beispielsweise eine geschätzte Mortalität von 60/Milliarde). Es hat sich in zahlreichen Studien herausgestellt, dass BCG eine protektive Wirksamkeit gegen Tuberkulose aufweist. Es hat sich jedoch herausgestellt, dass es bei der Vorbeugung der Lungentuberkulose in einigen Versuchen nicht wirksam war, beispielsweise in Südindien. Tuberculosis Prevention Trial, Madras, Indian Journal of Medical Research, 72 (Ergänzungsband): 1–74 (1980).
Mycobakterien wurden zur Verwendung als Lebendvakzin-Vehikel bzw. -Trägermaterialien vorgeschlagen. Gene, die Antigene von einer Vielzahl von Pathogenen kodieren, können in rekombinanten Mycobakterien exprimiert werden, so dass die adjuvanten Eigenschaften der Mycobakterien eine Immunreaktion gegenüber den Fremdantigenen stimulieren, die wiederum eine protektive Immunität gegen diese Pathogene bereitstellt. Mycobakterien bieten mehrere Vorteile als Vakzin-Träger, einschließlich einer langen Berichtszeitspanne der Anwendung in Menschen mit einer sehr geringen Inzidenz von Komplikationen, einer Stabilität auf dem Gebiet und Einzeldosis-Anwendung. Die Fähigkeit, das mycobakterielle Genom zu manipulieren, ist zur Entwicklung dieses Kandidaten-Vakzineträgers essentiell.
Das ideale molekulargenetische System schließt ein Transformationsverfahren und Vektoren ein, die in vitro manipuliert werden können, schließt selektierbare Nahrungs- und Arzneistoffmarker und das Vermögen ein, spezifische genomische DNA-Sequenzen durch exogene Sequenzen zu ersetzen. Ein Mittel, durch das exogene DNA, die ein interessierendes Protein kodiert, in das mycobakterielle Genom anstelle spezifischer genomischer DNA-Sequenzen eingebracht werden kann, um ein rekombinantes Mycobakterium zu produzieren, das zur Expression des kodierten Proteins in der Lage ist, wäre sehr nützlich.
WO90/00594 offenbart rekombinante Mycobakterien mit einer heterologen DNA, die ein Lymphokin oder einen Immunverstärker kodiert, der (das) stabil in die genomische DNA eingebaut und durch den cl-Promotor gesteuert wird.
WO88/06626 offenbart ebenfalls rekombinante Mycobakterien, die heterologe DNA exprimieren, jedoch wird die Expression von DNA, die Immunverstärker oder Lymphokine kodiert, nicht offenbart.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft den Gegenstand der Ansprüche.
Die Expressionskassette schließt DNA von Interesse ein, die das Lymphokin oder das die Immunantwort verstärkende Mittel bzw. den Immunverstärker kodiert, und eine regulierte Promotor-Region (die den cl-Promotor nicht umfasst); die beiden Komponenten sind zueinander in einer solchen Nähe, dass die Expression der interessierenden DNA im rekombinanten Mycobakterium durch die regulierte Promotor-Region gesteuert wird. Die regulierte Promotor-Region ist im Allgemeinen eine mycobakterielle Promotor-Region, kann jedoch ebenfalls ein regulierter bakterieller Promotor sein, wie beispielsweise der E. coli lacZ Promotor. Beispielsweise kann eine Hitzeschockprotein-Promotor-Region oder eine Stressprotein-Promotor-Region (beispielsweise hsp70, hsp60) in einen rekombinanten Plasmidvektor in nächster Nähe zur interessierenden DNA eingefügt werden, so dass die Translation des Genes durch die mycobakterielle Promotor-Region und Ribosomen-Bindungsstellen kontrolliert wird.
Die Mycobakterien der vorliegenden Erfindung können durch Verfahren hergestellt werden, bei denen einen doppelte homologe Rekombination zwischen Plasmid-gestützten DNA-Sequenzen, die zu den DNA-Sequenzen im mycobakteriellen Genom homolog sind und den homologen mycobakteriellen Sequenzen eintritt. Als Folge des Rekombinations-Ereignisses wird ein rekombinantes Mycobakterium produziert, das dem entsprechenden unmodifizierten Mycobakterium sehr ähnlich ist. Ein solches rekombinantes Mycobakterium schließt die Expressionskassette (d. h. interessierende DNA und die regulierte Promotor-Region) ein, die im unmodifizierten Mycobakterium nicht vorliegt. Solche Verfahren können zur Herstellung von rekombinanten Mycobakterien verwendet werden, die keine Vektor-DNA-Sequenzen oder andere Sequenzen enthalten, die normalerweise nicht in Mycobakterien vorliegen, und von denen der interessierenden DNA verschieden sind.
Die sich ergebenden rekombinanten Mycobakterien (beispielsweise rekombinantes BCG, rekombinantes M. smegmatis) sind insbesondere als Träger nützlich, bei denen die DNA, die das Lymphokin oder den Immunverstärker kodiert, exprimiert werden kann. Solche Träger können beispielsweise als regulierbare Vakzin-Träger verwendet werden, die ein Lymphokin oder einen Immunverstärker exprimieren.
Die Vakzine der vorliegenden Erfindung weist bedeutende Vorteile gegenüber gegenwärtig verfügbaren Vakzinen auf.
Insbesondere können die rekombinanten Mycobakterien, wie sie in den Ansprüchen definiert sind, die DNA, die das Lymphokin oder den Immunverstärker kodiert, als Proteinprodukt ohne fremde oder zusätzliche Proteine exprimieren. Dies unterscheidet sich von den gegenwärtig verfügbaren Vakzinträgern, bei denen ein Gen oder Gene von Interesse in einer rekombinanten Form exprimiert werden (beispielsweise Fusionsprotein). Weiterhin weisen Mycobakterien adjuvante Eigenschaften auf, die zu den besten gegenwärtig bekannten gehören, und stimulieren somit das Immunsystem eines Empfängers, so dass es auf andere Antigene mit einer größeren Effektivität reagiert. Dies ist insbesondere deswegen ein wertvoller Aspekt der Vakzine, weil er eine zellvermittelte Immunität vermittelt und somit insbesondere zur Bereitstellung einer Immunität gegen Pathogene in Fällen von Nutzen ist, in denen eine zellvermittelte Immunität für die Resistenz entscheidend erscheint. Zweitens stimuliert das Mycobakterium das Langzeitgedächtnis oder die Immunität. Als Folge kann eine einzige (einmalige) Inokulation dazu verwendet werden, eine Langzeitsensibilisierung gegenüber Proteinantigenen zu erzeugen. Unter Verwendung des Vakzinträgers der vorliegenden Erfindung ist es möglich, ein lang vorhaltendes T-Zell-Gedächtnis ins Leben zu rufen, das sekundäre Antikörperreaktionen stimuliert, die das infektiöse Mittel oder das Toxin neutralisieren. Dies ist beispielsweise gegen Tetanus und Diphtherie-Toxine, Pertussis, Malaria, Influenza, Herpesviren und Schlangengifte von Nutzen.
BCG weist insbesondere bedeutende Vorteile als ein Vakzinträger auf, dahingehend, als es: 1) die einzige Kinder-Vakzine ist, die gegenwärtig bei Geburt gegeben werden kann; 2) in den vergangenen 40 Jahren eine sehr geringe Inzidenz von Nebenwirkungen aufwies, wenn es als Vakzine gegen Tuberkulose verabreicht wurde; und 3) es wiederholt in einem Individuum (beispielsweise in vielfachen Formen) verwendet werden kann.
Ein weiterer Vorteil von BCG liegt insbesondere, ebenso wie bei Mycobakterien im Allgemeinen, im großen Umfang seines Genoms (ungefähr 3 × 10⁶ by Länge). Weil das Genom groß ist, ist es dazu in der Lage, große Mengen an DNA aus anderer Quelle aufzunehmen (d. h. DNA von Interesse) und kann somit dazu verwendet werden, einen Multi-Vakzin-Träger herzustellen (d. h. einer, der DNA von Interesse trägt, die protektive Antigene für mehr als ein Pathogen kodiert).
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion eines markierten Mycobakterien-Ziel-Stammes.
2 ist eine schematische Darstellung der Insertion von interessierender DNA in ein markiertes Ziel-BCG.
3 ist eine schematische Darstellung von Vektor pY6014, der das mycobakterielle PyrF-Gen und die flankierenden DNA-Sequenzen enthält.
4 ist eine schematische Darstellung von Vektor pY6015, der das aph-Gen enthält (kodiert eine Kanamycin-Resistenz), eingefügt an der PyrF-Stelle von pY6014.
5 ist eine schematische Darstellung von Vektor pY6016, der das mycobakterielle PyrF-Gen und flankierende DNA-Sequenzen von pY6014 enthält, wobei mehrere Restriktionsstellen entfernt wurden.
6 ist eine schematische Darstellung von Vektor pY6017, der das hsp70-Gen, eingefügt ungefähr 70 by stromabwärts von PyrF, in pY6016 enthält.
7 ist eine schematische Darstellung von Vektor pY6018, der den hsp70-Promotor und das HIV1-gag-Gen, eingefügt in der hsp70 kodierenden Stelle von pY6017 enthält.
8 ist eine schematische Darstellung von Vektor pY6019, der den hsp70-Promotor und das HIV1-pol-Gen, eingefügt in der hsp70 kodierenden Stelle von pY6017 enthält.
9 ist eine schematische Darstellung von Vektor pY6020, der den hsp70-Promotor und das HIV1-env-Gen, eingefügt in der hsp70 kodierenden Stelle von pY6017 enthält.
10 ist eine schematische Darstellung von Vektor pY6021, der den hsp70-Promotor und das SIV1-gag-Gen, eingefügt in der hsp70 kodierenden Stelle von pY6017 enthält.
11 ist eine schematische Darstellung von Vektor pY6022, der den hsp70-Promotor und das SIV1-pol-Gen, eingefügt in der hsp70 kodierenden Stelle von pY6017 enthält.
12 ist eine schematische Darstellung von Vektor pY6023, der den hsp70-Promotor und das SIV1-env-Gen, eingefügt in der hsp70 kodierenden Stelle von pY6017 enthält.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Mycobakterium bovis-BCG (BCG oder M.-bovis-BCG) ist ein avirulentes M.-bovis-Derivat, das in der ganzen Welt weit verbreitet ist, insbesondere, um einen Schutz gegen Tuberkulose bereitzustellen.
Weil M.-bovis-BCG eine ausgezeichnete adjuvante Aktivität zur Induktion einer zellvermittelten Immunität aufweist, das Langzeitgedächtnis (Immunität) stimuliert und eine geringe Mortalität aufweist, die mit seiner Verwendung assoziiert ist, ist es ein ausgezeichneter Kandidat als rekombinantes Vehikel zur Expression von Proteinen von Interesse, wie beispielsweise eines Protein-Antigens, von Enzymen, Lymphokinen und Immunverstärkern.
Es ist nunmehr möglich, rekombinante Mycobakterien zu produzieren, bei denen DNA, die ein Lymphokin oder einen Immunverstärker kodiert, unter der Kontrolle einer regulierten Promotor-Region exprimiert werden (die den cl-Promotor nicht umfasst). Es ist nunmehr insbesondere möglich, eine solche DNA in Kombination mit der regulierten Promotor-Region einzubringen, wie beispielsweise die Hitzeschockprotein (hsp) 70- oder die hsp60-Promotor-Region. Das sich ergebende rekombinante BCG weist ähnliche Charakteristika wie solche des unmodifizierten BCGs auf. Das rekombinante Mycobakterium schließt die Lymphokin- oder Immunverstärker-DNA und die (nicht cl-Promotor) regulierte Promotor-Region auf, die im unmodifizierten BCG nicht vorliegen. Eine Expression der DNA von Interesse zur Produktion es kodierten Lymphokins oder Immunverstärkers erfolgt unter der Kontrolle der regulierten Promotor-Region. Die rekombinanten Mycobakterien sind als Expressionsvehikel von Nutzen, bei denen eine Expression des Lymphokins oder Immunverstärkers unter der Kontrolle der regulierten Promotor-Region stattfindet und somit regulierbar ist.
Das Folgende ist eine Beschreibung der Konstruktion markierter mycobakterieller Zielstämme; die Konstruktion von Integrationsvektoren, die zur Einbringung interessierender DNA in markierte mycobakterielle Zielstämme von Nutzen ist; die Produktion rekombinanter Mycobakterien, die DNA von Interesse stabil in genomische DNA integriert haben; und die Verwendungen der sich ergebenden rekombinanten Mycobakterien. Obwohl das Nachfolgende bezüglich BCG beschrieben ist, sollte klar sein, dass die Verfahren und Vektoren, die beschrieben sind, ebenfalls zur Erzeugung von rekombinanten M. snegmatis, ebenso wie anderer rekombinanter Mycobakterien verwendet werden können, wie beispielsweise M. avium, M. phlei, M. fortuitum, M. lufu, M. paratuberculosis, M. habana, M. scrofulaceum, M. tuberculosis und M. intracellulare.
1 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion eines markierten mycobakteriellen (BCG) Zielstammes, der das Ziel für eine weitere Manipulation unter Verwendung von gentechnischen Standardverfahren ist. Ein rekombinantes Plasmid, das mycobakterielle DNA enthält, bei der das PyrF-Gen durch ein Gen ersetzt wurde, das einen selektierbaren Marker kodiert, wird dazu verwendet, M.-bovis-BCG unter Verwendung von Standardverfahren wie beispielsweise Elektroporation zu transformieren. Ein doppeltes homologes Rekombinationsereignis (gezeigt in 1 durch zwei Xs) tritt zwischen den Plasmid-getragenen Sequenzen auf, die zu den Sequenzen innerhalb des mycobakteriellen Genoms homolog sind. Damit eine doppelte homologe Rekombination eintritt, werden Plasmid-getragene Sequenzen, die zu Sequenzen im mycobakteriellen Genom homolog sind, an jeder Seite des Genes angeordnet, das den selektierbaren Macker kodiert. Das Ergebnis ist ein Ersatz des PyrF-Gens durch das Gen, das den selektierbaren Macker kodiert (beispielsweise aph, wie in 1 dargestellt), im mycobakteriellen Genom. Transformanten (d. h. Mycobakterien, bei denen das PyrF-Gen durch das selektierbare Marker-kodierende Gen ersetzt wurde) zeigen eine Veränderung im Phänotyp, der von dem unmodifizierten Mycobakterium beobachteten Phänotyp verschieden ist. Die Transformanten werden auf Grundlage jeder dieser Eigenschaften ausgewählt.
Der sich ergebende markierte mycobakterielle Zielstamm wird als Ziel für eine weitere Manipulation verwendet unter Verwendung bekannter Techniken, durch die interessierende DNA in die mycobakterielle genomische DNA integriert wird. Ein Integrationsvektor, wie beispielsweise der in 2 dargestellte, wird für diesen Zweck verwendet. Der Integrationsvektor schließt DNA-Sequenzen ein, die zu den DNA-Sequenzen im mycobakteriellen Zielgenom homolog sind, eine DNA, die einen selektierbaren Marker mycobakteriellen Ursprungs kodiert, eine DNA, die ein Protein oder Polypeptid von Interesse (DNA von Interesse) kodiert, und eine DNA, die eine regulierte mycobakterielle Promotor-Region kodiert. Die verbleibenden Sequenzen, die im Integrationsvektor vorliegen, sind solche eines geeigneten Plasmid-Vektors (wie beispielsweise pUC19). Die Konstruktion von Integrationsvektoren der vorliegenden Erfindung ist ausführlich unten beschrieben. Der Integrationsvektor wird in den markierten mycobakteriellen Zielstamm unter Verwendung von Standardtechniken eingebracht (beispielsweise Elektroporation). Ein doppeltes homologes Rekombinationsereignis (angezeigt in 2 durch 2 Xs) tritt zwischen Plasmid-getragenen mycobakteriellen Sequenzen ein, die zu den Sequenzen im mycobakteriellen Zielgenom homolog sind und die die DNA flankieren, die einen selektierbaren Marker mycobakteriellen Ursprungs (auf einer Seite) und die DNA von Interesse (auf der anderen Seite) kodieren. Das Ergebnis ist ein Ersetzen des Genes im markierten Zielstamm, das einen selektierbaren Marker (in 2 aph) und flankierende Sequenzen kodiert, durch DNA, die zu mycobakteriellen Sequenzen homolog ist, DNA, die einen selektierbaren Marker mycobakteriellen Ursprungs kodiert, DNA von Interesse und DNA, die eine regulierte mycobakterielle Promotor-Region kodiert. Dies ist schematisch in 2 dargestellt. Wie dargestellt, hat das doppelte homologe Rekombinationsereignis rekombinante Mycobakterien zur Folge, die zwei phänotypische Eigenschaften aufweisen, die zum Identifizieren und Auswählen von Zellen, die die interessierende DNA und eine regulierte Promotor-Region aufweisen, von Nutzen sind.
Das rekombinante BCG kann sich vom unmodifizierten BCG lediglich durch das Vorhandensein der interessierenden DNA und der regulierten Promotor-Region unterscheiden, wie dies in 2 dargestellt ist. Hier wurde die mycobakterielle genomische DNA verändert (durch Ersatz des PyrF-Gens und der flankierenden Sequenzen durch das aph-Gen und der flankierenden Sequenzen) und dann in einer solchen Weise „rekonstruiert", dass Äquivalente des PyrF-Gens und der flankierenden Sequenzen integriert werden, zusammen mit der Expressionskassette. Die „Netto"-Veränderung ist der Einbau der DNA von Interesse und der regulierten Promotor-Region in das mycobakterielle Genom.
Die regulierte Promotor-Region, die in der Expressionskassette vorliegt, kann irgendeine regulierte Promotor-Region sein, die in Mycobakterien funktionell ist, mit dem Vorbehalt, dass die Promotor-Region den cl-Promotor nicht umfasst. Die regulierte Promotor-Region schließt den Transkriptions-Promotor und die Translations-Startstellen einschließlich der Ribosomen-Bindungsstellen, ein. Im Allgemeinen ist die Promotor-Region mycobakteriellen Ursprungs. Jedoch können regulierte bakterielle Promotoren, wie beispielsweise der E. coli lacZ Promotor, ebenfalls verwendet werden. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die regulierte Promotor-Region eine Hitzeschockpromotor-Region (hsp) von mycobakteriellem Ursprung, wie beispielsweise das BCG hsp70 oder hsp 60. Die Verwendung einer solchen regulierten Promotor-Region stellt einen bedeutenden Vorteil gegenüber rekombinanten Mycobakterien bereit; insbesondere in Expressionsvehikeln, die Vakzin-Vehikeln sind. Unter Umständen, wie beispielsweise bei einer erhöhten Temperatur oder einer bakteriellen Infektion, bei der ein Individuum Stress ausgesetzt wird, werden die hsp-Promotoren aufgedreht und es tritt eine verstärkte Proteinproduktion auf. In der vorliegenden Erfindung ist dies insbesondere nützlich, weil die Expression der DNA von Interesse unter der Kontrolle der regulierten Promotor-Region stattfindet, die nach oben reguliert wird und somit die Expression der DNA von Interesse auf einem höheren als dem normalen Niveau antreibt.
Bis zum gegenwärtigen Zeitpunkt war es nicht möglich, ein rekombinantes mycobakterielles Expressionsvehikel zu erzeugen, bei dem DNA, die ein Polypeptid oder Protein kodiert, wie beispielsweise eines, gegen das eine Immunreaktion erwünscht ist, an ausgewählten Stellen und in ausgewählten Orientierungen in genomische DNA stabil integriert wird. Ein mycobakterieller Promotor und eine Ribosomen-Bindungsstelle, wie beispielsweise eine Hitzeschockprotein-Promotor-Region (beispielsweise hsp 70, hsp 60) kann als regulierbare Expressionssignale dienen, die die Expression der DNA, die das Lymphokin oder den Immunverstärker kodieren, kontrolliert. Wie in 6 dargestellt, kann die Expressionskassette einen Polylinker in Sequenzen einschließen, die die mycobakteriellen Sequenzen, die für die doppelte homologe Rekombination notwendig sind, umgeben (d. h. das PyrF-Gen). Als Folge kann die DNA von Interesse in das mycobakterielle Genom eingefügt werden und mycobakterielle Expressionssignale werden das Niveau der Produktion der Proteine oder Polypeptide von Interesse kontrollieren. Eine Selektion mycobakterieller Zellen, bei denen die PyrF-Expressionskassetten-DNA-von-Interesse-Kombination stabil integriert wird, kann wie früher beschrieben durchgeführt werden.
Die DNA, die das Lymphokin oder den Immunverstärker kodiert, kann durch Isolation der natürlich vorkommenden DNA; durch Klonieren und Amplifikation der interessierenden DNA unter Verwendung bekannter gentechnischer Verfahren (siehe beispielsweise Maniatis, T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982)); oder durch mechanische oder chemische Synthese (beispielsweise Polymerase-Kettenreaktion (PCR)) erzielt werden.
Die oben und in den nachfolgenden Abschnitten beschriebenen Vektoren können dazu verwendet werden, Mycobakterien mit DNA gentechnisch zu verändern, die ein Lymphokin oder einen Immunverstärker kodieren.
Es ist als Folge möglich, rekombinante mycobakterielle Vakzinen zu erzeugen.
Ein bedeutender Vorteil des hierin beschriebenen Verfahrens, das in 2 dargestellt ist, besteht darin, dass die Integration interessierender DNA ohne gleichzeitige Integration von Plasmid-DNA in das Genom auftritt. Das heißt, außer der DNA von Interesse ist der Nettoeffekt, dass die Sequenzen, die normalerweise nicht in Mycobakterien vorliegen (d. h. Plasmid-Sequenzen) in den rekombinanten mycobakteriellen Zellen nicht vorliegen.
Überblick von Verwendungen und Vorteilen der Integrationsvektoren der vorliegenden Erfindung
Es existieren zahlreiche Anwendungen für und Vorteile von Integrationsvektoren der vorliegenden Erfindung. Mehrere von diesen sind unten beschrieben, genauso wie die Verwendung der Integrationsvektoren beim Konstruieren von Expressions- oder Vakzin-Vehikeln. Als Resultat der vorliegenden Erfindung wird die interessierende DNA, die ein Lymphokin oder einen Immunverstärker kodiert, in das mycobakterielle Genom integriert und die Expression der DNA wird durch eine regulierte Promotor-Region reguliert, mit dem Vorbehalt, dass die Promotor-Region den cl-Promotor nicht umfasst.
Neue genetische Ansätze, um Fragen der Krankheits-Pathogenese zu verstehen, sind nunmehr verfügbar. Der Integrationsvektor kann in der Insertionsmutagenese und in der Markierung von Genen pathogener Mycobakterien durch homologe Rekombination mit dem Ziel Anwendung finden, spezifische genetische Funktionen zu identifizieren, die für die Virulenz und Pathogenese erforderlich sind. Beispielsweise können unter Verwendung dieses Vektors und von Mycobakterien (beispielsweise M. smegmatis, M.-bovis-BCG), Virulenzgene von M. tuberculosis oder M. leprae identifiziert und Diagnostica (diagnostische Tests) entwickelt werden. Durch spezifisches Deletieren oder Ersetzen solcher Gene kann es möglich sein, spezifischere und effektiv attenuierte Vakzinen gegen Tuberkulose zu entwickeln als die gegenwärtige M.-bovis-BCG-Vakzine. Alternativ wird, weil spezifische protektive Antigene für Tuberkulose und Lepra durch Studie von Antigenen, die durch T-Zellen aus resistenten Individuen erkannt werden, identifiziert werden, es nunmehr möglich sein, diese in gegenwärtig existierende M.-bovis-BCG-Vakzinen einzubringen und zu exprimieren.
Überblick der Verwendungen und Vorteile rekombinanter Mycobakterien
Vehikel der Mycobakterien der vorliegenden Erfindung können beispielsweise als Vakzine verwendet werden.
Vakzin-Vehikel der vorliegenden Erfindung können zur Behandlung von humanen Krebsarten, wie beispielsweise Blasenkrebs oder Melanomen, verwendet werden. In diesem Kontext sind Mycobakterien, die Interferon α, β und/oder γ, ein oder mehrere Interleukine (Interleukin 1–7) und/oder TNF α oder β enthalten oder exprimieren, besonders nützlich.
Es ist möglich, in den Integrationsvektor DNA einzuschließen, die eine Signalsequenz kodiert und somit ein Mittel bereitstellt, durch das der exprimierte Immunverstärker oder Lymphokin im Zytoplasma hergestellt und dann an die Zellwände sezerniert wird. Beispielsweise kann die Signalsequenz des α-Antigens, das in Mycobakterien sezerniert wird, verwendet werden. Alternativ kann die Signalsequenz für β-Galaktosidase, Agarase oder α-Amylase verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung wird nunmehr durch die nachfolgenden Beispiele beschrieben, die keinesfalls als einschränkend aufgefasst werden sollen.
Beispiel 1
Konstruktion eines rekombinanten Plasmids zur Einbringung des Kan-Gens in M.-bovis-BCG und eines markierten Ziel-BCGs
Der bakterielle Stamm DH5α wurde zur Herstellung eines rekombinanten Plasmids verwendet (Bethesda Research Lab, Maryland). Genomische DNA von M.-bovis-BCG (Moreau) wurde durch Standardverfahren hergestellt.
Der Ausgangsvektor pY6014 wurde durch Einfügen eines Sac1 Teil-EcoRI 4510 by Fragmentes produziert, das aus pY6013 in pUC19 DNA kloniert wurde, digeriert mit Sac1 und EcoRI (siehe 3). Das pY6011-Plasmid wurde durch Einfügen eines 5610 by EcoRI Fragmentes aus Y3330 in EcoRI digeriertes pGEM-7Zf+ (Promega Biotech) gewonnen. Y3330 ist ein λgt11-Klon aus einer λgy11-Bibliothek einer BCG-DNA, erzielt durch Screenen der Bibliothek mit einem Fragment des BCG-PyrF-Gens. Das pY6014 enthält das mycobakterielle PyrF-Gen und eine 1,4–1,6 kb flankierende mycobakterielle DNA auf jeder Seite des PyrF-Gens.
Das aph-Gen, das die Kanamycin-Resistenz kodiert, wurde aus pY6005 gewonnen und in das rekombinante pY6014-Plasmid eingefügt, um die PyrF-kodierenden Sequenzen zu ersetzen, unter Verwendung von Standardtechniken (pY6005; (Kan^R) Kanamycin-Resistenz-Kartusche bzw. -Kassette, gewonnen aus Tn903 wurde in pUC4 Sac1, ein Derivat von pUC4, eingefügt, wobei pUC1 die Sac1-Stelle im Polylinker ersetzt). Das aph-Gen wurde in das HincII 6,1 kb Fragment aus pY6014 kloniert, als BamHI Einfüll-Fragment aus pY6005. Dies erzeugte das rekombinante Plasmid pY6015, das zur Herstellung des markierten Ziel-BCG-Stammes verwendet wurde (siehe 4).
Isolierung von markiertem Ziel-BCG, das das Kan-Gen enthält
Wie in 1 dargestellt ist, wurde ein markierter Ziel-BCG-Stamm durch Transformieren von BCG mit dem rekombinanten Plasmid pY6015, oben beschrieben, hergestellt. Dieses Verfahren wurde wie folgt durchgeführt: BCG-Zellen wurden in Suspensionskulturen bei einer optischen Dichte (OD) von 0,5, konzentriert 50fach in Elektroporationspuffer PSB (Phosphatsaccharose-Puffer) gezüchtet und auf eine Küvette übertragen. Nach Zusatz von 10 μg Plasmid-DNA wurde ein elektrischer Impuls von 6.250 V/cm und 25 μF gegeben und die Zellen wurden in 10 ml Medium resuspendiert, bei 37°C für zwei Stunden gezüchtet und ausplattiert.
Das markierte Zell-BCG wurde durch Ausplattieren der Transformation auf Middlebrook 7H10 Agarplatten, die 20 μg/ml Kanamycin und 1 mg/ml FOA enthielten, isoliert.
Beispiel 2
Konstruktion eines Integrationsvektors zur Einbringung von interessierender DNA in markiertes Ziel-M.-bovis-BCG
Ein Integrationsvektor, der zum Transformieren des markierten Ziel-BCGs (hergestellt im Beispiel 1) in der Lage war, wurde hergestellt, bei dem das mycobakterielle PyrF-Gen, DNA-Sequenzen, die zu den Sequenzen, die die mycobakteriellen PyrF-Sequenzen flankieren, homolog sind, notwendig zur homologen Rekombination, den mycobakteriellen hsp 70-Promotor und DNA von Interesse enthielten (d. h. das HIV1- oder SIV1-gag-, -pol- oder -env-Gen). Dieses Verfahren ist unten beschrieben und in 2 dargestellt.
Der rekombinante Vektor pY6014, beschrieben in Beispiel 1, der das mycobakterielle PyrF-Gen und flankierende DNA-Sequenzen enthält, wurde mit KpnI und HindIII digeriert, mit stumpfen Enden versehen und selbst-ligiert, um den Vektor pY6016 zu produzieren (siehe 5). Dieses Verfahren wurde gemäß Standardverfahren durchgeführt. Dies hat die Entfernung mehrerer Restriktionsstellen zur Folge, die in pY6014 in der originalen Polylinker-DNA-Sequenz vorliegen.
Das hsp 70 M. tuberculosis EcoRI-HindIII 1,8 kb Einfüll-Fragment wurde aus Y3334 gewonnen (ein M13 mp18 Phage, der das EcoRI-Kpm 1,8 Kb Fragment aus λgt11-Klon Y3111 enthält, der durch Screenen einer λgt11-Bibliothek einer M.-tuberculosis-DNA mit Antikörpern gegen das 70-kDa-Antigen gewonnen wurde) und in die HpaI-Stelle von pY6016 (160 by stromabwärts von PyrF) unter Verwendung von Standardverfahren kloniert.
Wie in 6 dargestellt, hat dies das rekombinante Plasmid pY6017 zur Folge, das den hsp70-Promotor und einen Teil der kodierenden Sequenz ebenso wie die mycobakteriellen (BCG) flankierenden Sequenzen enthält, die für eine doppelte homologe Rekombination, mit dem markierten Ziel-BCG, erzeugt in Beispiel 1, notwendig sind. Unter Verwendung dieses Vektors (pY6017) wurden 6 Integrationsvektoren mit DNA, die das HIV1-gag-, -pol- oder -env-Gen oder das SIV1-gag-, -pol- oder -env-Gen kodieren, produziert. Jeder dieser Vektoren wurde durch das nachfolgende Verfahren produziert, bei dem die hsp 70-kodierende Region durch die DNA von Interesse ersetzt wurde.
Einfügung von DNA von Interesse in pY6017
Die NcoI-Stelle im hsp 70-Insert befindet sich am ATG des hsp70-Gens. DNA, die ein Gen von Interesse kodiert, wurde in diesen Vektor (pY6017) unter Verwendung einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) bezüglich des interessierenden Gens als Matrize kloniert. Die zwei Oligonucleotide, die in der Reaktion verwendet wurden, enthalten an den beiden Enden zwei herkömmliche Restriktionsstellen (in diesem Falle NcoI für die Oligonucleotide am 5'-Ende des Gens und eine der Stellen des Polylinkers für die Oligonucleotide am 3'-Ende des Gens). Das PCR-Produkt wurde mit den beiden Enzymen, die für die Oligonucleotide ausgewählt wurden, digeriert bzw. verdaut und Gel-gereinigt. Der Vektor wurde vollständig mit einem der Enzyme des Polylinkers (KpnI, XbaI) geschnitten und ein Teilverdau mit NcoI durchgeführt. Falls NcoI im interessierenden Gen vorlag, wurde die NcoI-Stelle vor der Verdauung mit dem KpnI- oder XbaI-Enzym mit stumpfen Enden versehen. Das PCR-Produkt wurde am 5'-Ende eingefüllt und mit dem 3'-End-Enzym geschnitten.
Die nachfolgenden rekombinanten Plasmid-Vektoren wurden hergestellt:
pY6018: das HIV1-gag-Gen wurde als 1500 by NcoI XbaI Fragment unter Verwendung von PCR synthetisiert und in NcoI Teil-XbaI digeriertes pY6017 kloniert (siehe 7).
pY6019: das HIV1-pol-Gen wurde als 2720 by NcoI-XbaI Fragment unter Verwendung einer PCR synthetisiert und in NcoI Teil-XbaI digeriertes pY6017 eingeführt (siehe 8).
pY6020: das HIV1-env-Gen wurde als 2570 by NcoI-XbaI Fragment unter Verwendung von PCR synthetisiert und in NcoI Teil-XbaI digeriertes pY6017 eingefügt (siehe 9).
pY6021: das SIV1-gag-Gen wurde als 1520 by Stumpf (blunt)-KpnI-Fragment unter Verwendung einer PCR synthetisiert und wurde in NcoI teilbefüllt in KpnI, digeriertes pY6017 eingeführt (siehe 10).
pY6022: das SIV1-pol-Gen wurde als 3125 by SmaI-Fragment unter Verwendung einer PCR synthetisiert und wurde in NcoI Teil-XbaI digeriertes und eingefülltes pY6017 eingeführt (siehe 11).
pY6023: das SIV1-env-Gen wurde als 2750 by SmaI-XbaI-Fragment unter Verwendung einer PCR synthetisiert und wurde in NcoI teileingefülltes und XbaI-disgeriertes pY6017 eingefügt (siehe 12).

Claims

Rekombinantes Mycobakterium, das eine heterologe DNA aufweist, die ein Lymphokin oder ein die Immunantwort verstärkendes Mittel kodiert, stabil eingebaut in deren genomische DNA, wobei die Expression der heterologen DNA unter der Kontrolle einer regulierten Promotor-Region erfolgt, unter dem Vorbehalt, dass die Promotor-Region den cl-Promotor nicht umfasst.
Mycobakterium nach Anspruch 1, wobei die Promotor-Region eine mycobakterielle Promotonegion umfasst.
Mycobakterium nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Lymphokin ein Interferon oder ein Interleukin ist.
Mycobakterium nach Anspruch 3, wobei das Interferon IFN_γ ist.
Mycobakterium nach Anspruch 3, wobei das Interleukin IL-2 ist.
Mycobakterium nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Lymphokin oder das die Immunantwort verstärkende Mittel sezerniert wird.
Mycobakterium nach Anspruch 6, wobei die heterologe DNA weiterhin einen Anteil umfasst, der eine Signalsequenz zur Sekretion kodiert.
Mycobakterium nach Anspruch 7, wobei die Signalsequenz aus einem α-Antigen, β-Galaktosidase, Agarase oder α-Amylase stammt.
Mycobakterium nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die heterologe DNA unter der Kontrolle einer Expressionskassette steht.
Mycobakterium nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das aus folgendem ausgewählt ist: (a) Mycobakterium smegmatis; (b) Mycobakterium bovis-BCG; (c) Mycobakterium avium; (d) Mycobakterium phlei; (e) Mycobakterium fortuitum; (f) Mycobakterium lufu; (g) Mycobakterium paratuberculosis; (h) Mycobakterium habana; (i) Mycobakterium scrofulaceum; (j) Mycobakterium intracellulare; (k) generische Varianten irgendeines des Vorhergehenden.
Mycobakterium nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die heterologe DNA: (a) IL-2 oder IFN_γ kodiert; und (b) unter der Kontrolle eines mykobakteriellen Promotors steht; und (c) weiterhin eine Signalsequenz zur Sekretion des IL-2 oder IFN_γ umfasst.
Immunogene/pharmazeutische Zusammensetzung (beispielsweise Vakzine), die das Mycobakterium nach einem der vorhergehenden Ansprüche umfasst.
Integrationsvektor (beispielsweise Plasmid) zur stabilen Integration in die genomische DNA eines Mykobakteriums, wobei der Vektor folgendes umfasst: (a) DNA-Sequenzen, die zu DNA-Sequenzen im mykobakteriellen Genom ausreichend homolog sind, um eine doppelt homologe Rekombination mit dem mykobakteriellen Genom zu fördern; (b) eine regulierte Promotor-Region kodiert, unter dem Vorbehalt, dass die Promotor-Region den cl-Promotor nicht umfasst; (c) DNA, die einen selektierbaren Marker kodiert; und (d) heterologe DNA, die ein Lymphokin oder ein die Immunantwort verstärkendes Mittel zur Expression im Mykobakterium kodiert.
Vektor nach Anspruch 13, wobei die heterologe DNA wie in einem der Ansprüche 1–11 definiert ist.
Mykobakterium nach einem der Ansprüche 1–11 oder Zusammensetzung nach Anspruch 12 zur Verwendung in der Krebstherapie (beispielsweise zur Verwendung in der Behandlung eines Blasenkarzinoms oder von Melanomen).