CN104277094A - Dc靶向肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种DC靶向肽及其应用，所述种DC靶向肽氨基酸序列如SQEIDNo:1或者SQEIDNo:2或者SQEIDNo:3所示。本发明所述DC靶向肽的靶向性和DC细胞富集能力：融合有DC靶向肽的肿瘤特异性抗原可以精确指导并富集到DC细胞表面。

Description

DC靶向肽及其应用

  

技术领域

    本发明属于多肽领域，尤其是涉及DC靶向肽及其制备方法和应用。 

背景技术

癌症是全球导致死亡的主要原因之一，2007年全球死于癌症的人数达到790万，约占所有死亡人数的13%，发病率呈逐年上升趋势。其治疗主要以手术、化疗和放疗为主，但放化疗副作用大，疗效都不是很理想。目前，免疫细胞治疗正在成为一种新的癌症治疗手段。 

随着分子生物学和免疫学等基础学科的飞速发展，对肿瘤的研究日益深入，特别是近十几年来，多种与肿瘤的发生发展密切相关的肿瘤抗原被发现，这些抗原可以作为癌症免疫治疗的靶标。 肿瘤特异性的抗原可以通过DC（dendritic cells ，树突状细胞）细胞递呈给T细胞，启动T细胞的特异性杀伤肿瘤的能力。（Banchereau, J., and Steinman, R. M. (1998) Dendritic cells and the control of immunity. Nature  392, 245–2522. Palucka, K., Banchereau, J., and Mellman, I. (2010) Designing  vaccines based on biology of human dendritic cellsubsets.Immunity 33, 464–478）。如何让抗原准确高效的到达DC细胞，是肿瘤免疫治疗的关键。噬菌体展示技术为我们提供了一种筛选DC靶向分子的方法。 

噬菌体展示技术，在1985 年首次被Smith阐述,原理是通过将外源蛋白或肽段的基因克隆到丝状噬菌体的基因组DNA中, 与噬菌体的外壳蛋白形成融合蛋白, 从而使该外源分子呈现于噬菌体表面。该技术的主要特点是将特定分子的基因型和表型统一在同一噬菌体颗粒内, 即在噬菌体表面表达特定蛋白,而在噬菌体核心DNA 中含有该蛋白的结构基因, 通过表型筛选就可以获得其编码基因, 因此噬菌体展示技术是一种强有力的基因表达筛选技术。噬菌体展示肽库技术具有高库容、高效方便及灵活的筛选技术等特点，近几年已经广泛用于抗肿瘤疫苗，药物，及肿瘤诊断标志物的筛选研发（Johnson DH.Targeted therapy in non-small cell lung cancer.myth and reality[J].lung Cancer,2003,41 (suppl1):S3-S8） 

MUC1又称附膜蛋白,是由muc1基因表达的一种高分子量,高糖基化蛋白,它一种是跨膜分子。它在上皮更新与分化，维持上皮完整性和癌的发生与转移等方面都起到重要的作用(Moniaux N，Escande F，Porchet N,et alStructural organization and classification of the human mucin genes〔J〕Front Biosci，2001；6(1):D1192206)。正常情况下,MUC1 可在多种组织、器官中的上皮细胞如消化道、呼吸道、乳腺、胰腺、生殖道中表达，主要分布于腺细胞顶膜或以分泌形式存在于腺腔内，不被免疫系统识别。而在恶性肿瘤细胞中, 乳腺癌、胃癌、结肠癌等多种癌组织中, MUC1表达量可达正常时的10倍以上,且结构发生改变，使MUC1 的核心蛋白暴露出新的蛋白表位或新的糖抗原,分布于整个癌细胞表面，作为肿瘤特异的抗原，成为免疫细胞攻击靶点(Miles DW，TaylorPapadimitriou JTherapeutic aspects of polymorphic epithelial mucin in adenocarcinoma〔J〕Pharmacol Ther，1999；82(1):97106),

本发明通过从噬菌体展示技术从肽库中筛选得到了一种可以高效靶向DC细胞的多肽, 并与MUC1肿瘤特异性多肽抗原融合，利用多肽固相合成方法合成了“DC靶向融合肽”。并对其DC靶向能力、DC细胞致敏能力和激活CTL细胞肿瘤杀伤能力进行了评价。

  

发明内容

本发明的一个目的是提供一种靶向DC细胞的多肽。 

本发明所提供的DC靶向多肽，其氨基酸序列如SQE ID No:1或者SQE ID No:2或者SQE ID No:3所示。本发明提供一种DC靶向肽介导的DC-CTL免疫细胞治疗技术。 

比起其他技术靶向肽技术具有以下优点： 

(1)              靶向性和DC细胞富集能力：融合有DC靶向肽的肿瘤特异性抗原可以精确指导并富集到DC细胞表面。

(2)              高效抗原递呈能力：特殊的柔性Linker设计使肿瘤抗原表达相对独立，使DC细胞能有效递呈肿瘤抗原。 

(3)              安全性：靶向肽不具有免疫原性，可避免引起人体不良免疫反应，相对于病毒载体靶向技术安全性极高。 

  

附图说明

图1所示为 DC靶向的噬菌体筛选示意图；C1-富集在DC细胞上的噬菌体占总数的百分数；A- 筛选次数； 

图2 所示为噬菌体克隆结合DC细胞的能力示意图；

图3所示为靶向融合肽结合DC细胞的能力示意图；

图4所示为 ³H-TdR掺入实验示意图；

图5所示为 CTL 体外杀伤MUC1阳性肿瘤实验示意图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步详细的阐述： 

实例一，以DC细胞为靶细胞来筛选获得本发明的DC靶向肽

本发明用噬菌体随机肽库，来筛选获得靶向DC细胞的DC靶向肽：

1．以DC细胞为靶细胞进行筛选：

（1）              获取DC细胞：

从健康人的外周血中分离单个核细胞（peripheral blood mononuclearcell,PBMC），经体外诱导培养获取成熟树突状细胞（dendritic cell,DC）方法：

①              取健康人新鲜外周血,加入淋巴细胞分离液，经密度梯度离心法分离,获得单个核细胞。

②              在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养.置37℃、5%CO2培养箱内静置培养2 h后除去悬浮细胞。 

③              培养液中加入rhGM-CSF和rhIL-4继续培养贴壁细胞5 d,然后加入TNF-α促进其分化成熟。 

④              倒置显微镜下观察DC形态,流式细胞仪（flowcytometer,FCM）对其进行表型鉴定。 

⑤              在显微镜到观察DC细胞形态不规则,表面有大量的毛刺状突起; 越成熟的DC细胞表面CD83、CD80分子表达明显增高。 

(2)             以DC细胞为固相筛选目标来筛选： 

噬菌体随机肽库的体外消减筛选，DC细胞为靶细胞，进行3轮消减筛选，并逐渐增加筛选强度。所得噬菌体经扩增、滴定。具体步骤如下：选择生长状态良好的DC细胞一瓶(细胞总数约5×10⁶个)；倾去原有的培养基，然后用洗脱液PBST充分洗脱3—5遍，去除杂蛋白的的干扰；加入用PBST稀释到10¹¹/ml的噬菌体随机肽库约1m1后继续孵育1h。用PBST充分洗脱3～7遍，去除未结合的噬菌体；再次用PBST强力洗脱2～4遍，去除特异性结合但结合不紧密的噬菌体； 后采用细胞刮刀收集贴壁的细胞以及结合在上面的候选噬菌体；收集物加入预先准备好的感受态细菌（大肠杆菌）中进行扩增，然后采用常规的纯化方法扩增后进行第三轮的筛选；将扩增好的洗脱物重复淘洗3次，获得与DC细胞紧密特异性结合的噬菌体克隆。

  

2.  阳性噬菌体克隆的ELISA鉴定：

噬菌体肽库经过3轮减性筛选后，随机挑选10个噬菌体的单克隆，用常规ELISA法来鉴定噬菌体克隆对DC细胞的亲和力。具体步骤如下：将DC细胞按1×10⁵／孔的密度接种于96孔板上，放到37℃、5% CO2培养箱中；对细胞进行营养饥饿处理1h；用4%的多聚甲醛固定20min,0.1%的TritonX-100处理10min；用3%的BSA封闭1h，加入一定浓度的噬菌体（大于10¹²）37℃孵育2h；用PBST洗3次，加入抗体HRP-antiM13抗体，37℃孵育1h；PBST洗5遍，之后每孔加入100ul的TMB显色作用2min；用150ul,2M的H₂SO₄终止反应，用酶标仪测定反应液的A450值。随机挑取噬菌体原库斑作为对照，以排除非特异性吸附的隐性噬菌体克隆对实验结果的影响。

由图2可知，其中8号噬菌体单克隆对DC细胞的亲合力最强，命名为phage NP8.OD值为（0.450±0.02），8号高于对照同时高于其他，对照为原库随机噬菌体克隆OD值为（1.832±0.008）P﹤0.05，n=8。 

  

3.  删选阳性噬菌体克隆的测序及靶向DC细胞的靶向肽的合成: 将筛选OD值最高的三个噬菌体克隆进行测序，其序列分别如SQE ID No:1，SQE ID No:2，SQE ID No:3所示。

  

实例二，获得的DC靶向肽和肿瘤相关抗原MUC1融合制成的融合肽

1.      融合肽合成：

将筛选到的DC靶向肽（phage NP8）与MUC1肿瘤抗原肽中间通过柔性linker相连接，合成DC靶向融合肽。同时制备FITC标记的该融合肽备用。

  

2.      融合肽DC结合能力鉴定：

将制备出来的NP-MUC1融合肽用靶细胞DC来鉴定，以Hela细胞作对照，具体步骤如下：将DC细胞按1×10⁵／孔的密度接种于96孔板上，放到37℃、5% CO2培养箱中；细胞进行营养营养胁迫处理2h；无水甲醇固定20min,0.1%的TritonX-100处理10min；5%的脱脂牛奶封闭1h，加入一定浓度的刚制备的NP-MUC1融合肽,37℃孵育2h；PBST洗5-6次，加入MUC1的抗体，37℃孵育1h；PBST洗7-8遍，之后每孔加入100ul的TMB显色作用2min; 150ul,2M的H₂SO₄终止反应，用酶标仪测定反应液的A450值。

结果如图3所示，与HeLa细胞相比，融合肽能特异靶向与DC细胞相结合。 

  

实例三，DC融合肽效果评价

1．抗原递呈细胞DC对NP-MUC1融合肽的吸收

我们利用激光共聚焦显微镜观察了融合肽进入DC细胞的效率。具体步骤如下：将DC细胞接种于含有小玻片的六孔板中，37℃、5% CO2培养箱中培养；然后加入荧光素（FITC）标记的MUC1多肽或者FITC标记的DC融合肽。孵育6小时后，洗去培养基；4%多聚甲醛固定后10分钟，0.1% Triton-x100打孔5分钟；然后加入DAPI染色后，利用激光共聚焦显微镜观察抗原递呈细胞DC对MUC1和DC靶向融合肽的吸收效率。

  

2．混合淋巴细胞反应( allo-MLR)测定抗原递呈细胞的抗原递呈能力

分离和体外培养单核吞噬细胞和树突状细胞DC。然后用上述多肽（MUC1多肽、NP-MUC1融合肽,对照多肽）体外致敏抗原递呈细胞。

取正常人外周血,常规分离单个核细胞( PBMC) ,加入rhIL2 培养5天,作为同种异体效应细胞。分为四组：①只有DC细胞②DC细胞+靶向融合肽③DC细胞+MUC1④DC细胞+阴性对照肽。将上述多肽致敏的DC细胞,加入丝裂霉素25μg/ ml ,去增殖后,按DC与效应细胞按1∶10 的比例于37 ℃,5 % CO2 培养箱培养6 天,收获前12 小时加入³H-TdR ,1μCi/孔。用细胞收集器收集细胞,液体闪烁计数器检测³H 掺入的cpm 值，以下为四组中³H 掺入的cpm 值（图4）。结果表明与其他对照肽相比，NP-MUC1融合肽显著更强地刺激了效应细胞的增殖。 

  

3.     CTL 体外杀伤MUC1阳性肿瘤的实验

分离和体外培养DC细胞。然后用上述多肽（对照多肽、MUC1多肽、NP-MUC1融合肽）体外致敏抗原递呈细胞。

取正常人外周抗凝血,常规分离PBMC ,作为同种异体效应细胞。将各组诱导培养的DC细胞,加入25μg/ ml 丝裂霉素,去增殖后作为刺激细胞。将刺激细胞和效应细胞以1∶10比例,于37 ℃,5 % CO2 培养箱中培养5 天,收集细胞作为CTL 细胞。选用生长良好的MDA-MB-231乳腺癌细胞（HLA class A2.1 和MUC1阳性）加入Na2 51CrO4 1 mCi/ ml ,37 ℃,5 % CO2 培养4 小时后收集细胞作为靶细胞。将上述制备的CTL 细胞与靶细胞以5∶1 效靶比加入96 孔圆底板中培养6 小时,培养结束后,收集全部上清,用γ2能谱仪测量上清中51Cr 放射性含量(cpm) 。 

如图5所示，与其他多肽相比较，NP-MUC1融合肽刺激的CTL杀伤肿瘤细胞的能力显著最强。 

  

序列表 （SEQUENCE LISTING）

<110>文康医疗科技（深圳）有限公司

<120>DC靶向肽及其应用

<160> 3

<210> 1

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IISAVVGIL

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RLLQETELV。

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Claims (10)

1.一种DC靶向肽，其氨基酸序列如SQE ID No:1或者SQE ID No:2或者SQE ID No:3所示。

2.权利要求1中所述DC靶向肽的编码基因。

3.含有权利要求2中所述DC靶向肽编码基因的重组表达载体。

4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为重组噬菌体。

5.含有权利要求2中所述基因的的转基因细胞系。

6.根据权利要求5中所述的转基因细胞系，其特征在于：所述基因细胞系为导入权利要求3或4所述的重组表达载体的转基因细胞系。

7.含有权利要求3所述重组表达载体的重组菌。

8.权利要求7所述的重组菌，其特征在于：所述重组表达载体为重组噬菌体。

9.权利要求1中所述DC靶向肽的融合肽及载体，其特征是：所述融合肽典型特征为MUC1肿瘤抗原多肽。

10.权利要求1中的DC靶向肽在预防和治疗癌症药物中的应用。