ES2303364T3

ES2303364T3 - Proteinas de matriz extracelular con aminoacidos modificados.

Info

Publication number: ES2303364T3
Application number: ES99119184T
Authority: ES
Inventors: Elliott A. Gruskin; Douglas D. Buechter; Guanghui Zhang; Kevin Connolly
Original assignee: United States Surgical Corp
Current assignee: United States Surgical Corp
Priority date: 1998-10-09
Filing date: 1999-10-07
Publication date: 2008-08-01
Anticipated expiration: 2019-10-07
Also published as: DE69938579D1; CA2639757A1; US20050196830A1; EP1914311A1; CA2284397A1; EP0992586A3; DE69938579T2; EP0992586A2; CA2639637A1; EP0992586B1; CA2639620A1; US6958223B2; US6492508B1; CA2284397C; US20040086961A1

Abstract

La incorporación de ciertos análogos de aminoácidos en polipéptidos producidos mediante células que no proporcionan normalmente polipéptidos que contiene a estos análogos de aminoácidos se realiza sometiendo las células a un medio de crecimiento que contiene a estos análogos de aminoácidos. El grado de incorporación se puede regular ajustando la concentración de análogos de aminoácidos en el medio y/o ajustando la osmolalidad del medio. Esta incorporación permite alterar las características químicas y físicas de los polipéptidos y su estudio. Además, también se describen en la invención el ácido nucleico y las proteínas correspondientes incluyendo un dominio de un péptido fisiológicamente activo y un dominio de una proteína de una matriz extracelular que es capaz de proporcionar un autoagregado. También se refiere la invención a proteínas de matriz extracelular humana capaces de proporcionar un colágeno autoagregado que se produce mediante las células procarióticas. Preferentemente se emplea codon para producir proteínas de matriz extracelular en procarióticas.

Description

Proteínas de matriz extracelular con aminoácidos modificados.

Antecedentes 1. Ámbito técnico

Polipéptidos por ingeniería genética y polipéptidos quiméricos a los que se les ha incorporado aminoácidos que mejoran o, si no, modifican las propiedades de tales polipéptidos.

2. Descripción de la técnica relacionada

La ingeniería genética permite que la producción de polipéptidos se transfiera de un organismo a otro. Al hacerlo, una porción del aparato de producción natural de un huésped original se trasplanta a un receptor. Con frecuencia, el huésped original ha evolucionado ciertas vías de procesamiento únicas en asociación con la producción de polipéptidos que no están contenidos en el receptor o no se le han transferido. Por ejemplo, se sabe que las células de los mamíferos incorporan un conjunto complejo de sistemas enzimáticos postraduccionales que confieren características únicas a los productos proteicos de los sistemas. Cuando un gen que codifica una proteína normalmente producida por las células de los mamíferos se transfiere a una célula bacteriana o a una célula de levadura, la proteína puede no estar sujeta a tal modificación postraduccional y la proteína puede no funcionar como se pretendía originalmente.

Normalmente, el procedimiento de síntesis de polipéptidos o de proteínas en las células vivas implica la transcripción de ADN en ARN y la traducción del ARN en la proteína. En la síntesis de proteínas están implicadas tres formas de ARN: el ARN mensajero (ARNm) transporta la información genética a los ribosomas compuestos de ARN ribosómico (ARNr) mientras que el ARN de transferencia (ARNt) se une a los aminoácidos libres en el medio celular. Los complejos aminoácido/ARNt se alinean con los codones del ARNm, cuyo reconocimiento real y unión está mediado por el ARNt. Las células pueden contener hasta 20 aminoácidos que se combinan y se incorporan en secuencias proteicas en diferentes permutaciones. Cada aminoácido es diferente de los otros 19 aminoácidos y se carga en el ARNt mediante las enzimas conocidas como aminoacil-ARNt ligasas. Como regla general, los complejos aminoácido/ARNt son bastante específicos y normalmente sólo se forman con una molécula que tenga una configuración estereoquímica exacta mediante una aminoacil-ARNt ligasa específica.

En muchas células vivas se toman algunos aminoácidos del medio circundante y otros se sintetizan dentro de la célula a partir de precursores que, a su vez, se han asimilado desde el exterior de la célula. En algunos casos, una célula es auxótrofa, es decir, requiere una sustancia de crecimiento específica más allá de lo mínimo requerido para el metabolismo y la reproducción normales, que debe obtener del medio circundante. Algunos auxótrofos dependen del medio exterior para proporcionarse determinados aminoácidos. Esta característica permite incorporar determinados análogos de aminoácidos en las proteínas producidas por los auxótrofos aprovechando las excepciones relativamente raras a la norma anterior en relación con la especificidad estereoquímica de las aminoacil-ARNt ligasas. Por ejemplo, la prolina es una excepción de este tipo, es decir, las enzimas activadoras de los aminoácidos, responsables de la síntesis del complejo prolil-ARNt, no son tan específicas como las otras. Como consecuencia, se han incorporado ciertos análogos de la prolina en sistemas de células bacterianas, vegetales y animales. Véase Tan et al., "Proline analogues inhibit human skin fibroblast growth and collagen production in culture, journal", Journal of Investigative Dermatology, 80: 261-267 (1983).

Un método para incorporar aminoácidos no naturales en las proteínas se describe, por ejemplo, en Noren et al., "A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins", Science, vol. 244, pág. 182-188 (1989) en donde se utiliza un ARNt supresor acilado químicamente para introducir un aminoácido en respuesta a un codón de parada sustituido por el codón que codifica el resto de interés. Véase también, Dougherty et al., "Synthesis of a genetically engineered repetitive polypeptide containing periodic selenomethionine residues", Macromolecules, vol. 26, n.º 7, pág. 1779-1781 (1993), que describe la incubación de una E. coli auxótrofa para la metionina en un medio que contiene selenometionina y propone, a partir de los datos experimentales, que la selenometionina puede reemplazar completamente a la metionina en todas las proteínas producidas por la célula.

Se ha utilizado la cis-hidroxi-L-prolina para estudiar sus efectos en el colágeno mediante la incorporación en las células eucarióticas tales como fibroblastos de piel normal cultivados (véase Tan et al., citada más arriba) y las células de tendón de embriones de pollo [véase por ejemplo, Uitto et al., "Procollagen polypeptides containing cis-4-hydroxy-L-proline are overglycosylated and secreted as nonhelical pro-\gamma-Chains", Archives of Biochemistry and Biophysics, 185:1:214-221 (1978)]. No obstante, los investigadores encontraron que la trans-4-hidroxiprolina no se uniría al ARNt específico de la prolina del procariota E. coli. Véase Papas et al., "Analysis of the amino acid binding to the proline transfer ribonucleic acid synthetase of Escherichia coli", Journal of Biological Chemistry, 245:7:1588-1595 (1970). Otro intento sin éxito de incorporar la trans-4-hidroxiprolina en los procariotas se describe en Deming et al., "In vitro incorporation of proline analogs into Artificial proteins", Poly. Mater. Sci. Engin. Proceed., vol. 71, p. 673-674 (1994). Deming et al., informan del estudio de la posible incorporación de determinados análogos de la prolina, es decir, ácido L-azetidina-2-carboxílico, L-\gamma-tiaprolina, 3,4-deshidroprolina y L-trans-4-hidroxiprolina en proteínas artificiales expresadas en células de E. coli. Se ha descrito que sólo el ácido L-azetidina-2-carboxílico, la L-\gamma-tiaprolina y la 3,4-deshidroprolina se han incorporado en las proteínas de las células de E. coli in vivo.

Las proteínas de la matriz extracelular (las PME) se encuentran en espacios alrededor, o cerca, de las células de los organismos pluricelulares y normalmente son proteínas fibrosas de dos tipos funcionales pincipales: estructurales, por ejemplo, colágeno y elastina, y adhesivas, por ejemplo, fibronectina y laminina. Los colágenos son una familia de proteínas fibrosas secretadas normalmente por las células del tejido conjuntivo. Se han identificado 20 cadenas de colágeno distintas que se ensamblan para formar unas 10 moléculas de colágeno diferentes. En Alberts et al., The Cell, Garland Publishing, pp. 802-823 (1989) se proporciona una discusión general del colágeno. Otras proteínas fibrosas o filamentosas incluyen las proteínas IF de tipo I, por ejemplo, queratinas; las proteínas IF de tipo II, por ejemplo, vimentina, desmina y proteína ácida fibrilar glial; las proteínas IF de tipo III, por ejemplo, proteínas de los neurofilamentos; y las proteínas IF de tipo IV, por ejemplo, las lamininas nucleares.

El colágeno de tipo I es la forma más abundante de los colágenos fibrilares intersticiales y es el componente principal de la matriz extracelular. Los monómeros de colágeno consisten en unos 1000 restos de aminoácidos en un orden repetitivo de tripletes Gly-X-Y. Aproximadamente un 35% de las posiciones X e Y están ocupadas por la prolina y la trans-4-hidroxiprolina. Los monómeros de colágeno se asocian en hélices triples que consisten en una cadena \alpha2 y dos cadenas \alpha1. Las hélices triples se asocian en fibrillas que están orientadas en haces compactos. Los haces de las fibrillas de colágeno se organizan adicionalmente para formar el armazón de la matriz extracelular.

En las células de los mamíferos, la modificación postraduccional del colágeno contribuye a darle las propiedades físicas y químicas finales e incluye la digestión proteolítica de prorregiones, la hidroxilación de la lisina y la prolina, y la glucosilación de la lisina hidroxilada. La digestión proteolítica del colágeno implica la escisión de las prorregiones del extremo amino y del extremo carboxilo. Se sabe que la hidroxilación de la prolina es esencial para las propiedades mecánicas del colágeno. El colágeno con poca 4-hidroxiprolina tiene propiedades mecánicas malas, lo que se resaltó con las secuelas del escorbuto. La 4-hidroxiprolina añade estabilidad a la triple hélice por los puentes de hidrógeno y por restringir la rotación de los enlaces C-N en el esqueleto del polipéptido. En ausencia de una estructura estable, las enzimas celulares que se producen de forma natural contribuyen a degradar el polipéptido del colágeno.

Los atributos estructurales del colágeno de tipo I junto con su biocompatibilidad normalmente percibida lo convierten en un material de implante quirúrgico deseable. El colágeno se purifica a partir de la piel bovina o el tendón y se utiliza para dar forma a numerosos productos sanitarios incluidos los hemostatos, geles implantables, vehículos para la administración de fármacos y sustitutos del hueso. Sin embargo, al implantarse en humanos, el colágeno bovino puede causar respuestas inmunitarias agudas y retardadas.

Por consiguiente, los investigadores han intentado producir colágeno recombinante humano con todos sus atributos estructurales en cantidades comerciales a través de la ingeniería genética. Lamentablemente, no ha resultado exitosa la producción de colágeno por los productores comerciales en masa de proteínas como E. coli. Un problema importante es la abundante modificación postraduccional del colágeno mediante enzimas que no están presentes en E. coli. La imposibilidad de que las células de E. coli hidroxilen prolina en las prolinas del colágeno sin hidroxilar impide la fabricación de colágeno estructuralmente válido en cantidades comerciales.

Otro problema al intentar utilizar E. coli para producir colágeno humano es que E. coli prefiere codones determinados para producir los polipéptidos. Aunque el código genético es idéntico en los organismos procariotas y eucariotas, el codón concreto (de los varios posibles para la mayor parte de los aminoácidos) que se utiliza con más frecuencia puede variar ampliamente entre procariotas y eucariotas. Véase Wada, K.-N., Y. Wada, F. Ishibashi, T. Gojobori y T. Ikemura. "Nucleic Acids Res". 20, Supplement: 2111-2118, 1992. La expresión eficaz de los genes heterólogos (por ejemplo, de los mamíferos) en los procariotas tales como E. coli puede verse afectada negativamente por la presencia en el gen de codones utilizados con poca frecuencia en E. coli y los niveles de expresión de la proteína heteróloga a menudo aumentan cuando los codones infrecuentes se reemplazan por los más habituales. Véanse, por ejemplo, Williams, D. P., D. Regier, D. Akiyoshi, F. Genbauffe y J. R. Murphy. Nucleic Acids Res. 16: 10453-10467, 1988 y Höög, J.-O., H. v. Bahr-Lindström, H. Jörnvall y A. Holmgren. Gene. 43: 13-21, 1986. Se cree que este fenómeno está relacionado, al menos en parte, con la observación de que la baja frecuencia de la aparición de un codón determinado se correlaciona con un bajo nivel celular del ARN de transferencia para ese codón. Véanse Ikemura, T. J. Mol. Biol. 158: 573-597, 1982 e Ikemura, T. J. Mol. Biol. 146: 1-21, 1981. Así, el nivel celular del ARNt puede limitar la velocidad de la traducción del codón y, por lo tanto, influir en la velocidad global de la traducción de la proteína completa. Véanse Ikemura, T.J. Mol. Biol. 146: 1-21, 1981; Bonekamp, F. y F. K. Jensen. Nucleic Acids Res. 16: 3013-3024, 1988; Misra, R y P. Reeves, Eur. J. Biochem., 152: 151-155, 1985; y Post. L. E., G. D. Strycharz, M. Nomura, H. Lewis y P. P Lewis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76: 1697-1701, 1979. En apoyo de esta hipótesis está la observación de que los genes para las proteínas abundantes de E. coli normalmente muestran un sesgo hacia los codones utilizados con más frecuencia que representan los ARNt muy abundantes. Véase Ikemura, T. J. Mol. Biol. 146: 1-21, 1981; Bonekamp, F. y F. K. Jensen. Nucleic Acids Res. 16: 3013-3024, 1988; Misra, R. and P. Reeves, Eur. J. Biochem., 152: 151-155, 1985; y Post, L. E., G. D. Strycharz, M. Nomura, H. Lewis y P. P. Lewis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1697-1701, 1979. Además de la frecuencia del codón, el contexto del codón (a saber, los nucleótidos circundantes) también pueden afectar a su expresión.

Aunque pueda parecer que la sustitución de los codones preferidos por codones infrecuentes podría dar lugar a un aumento de la expresión de proteínas heterólogas en los organismos hospedadores, no es el caso. De hecho, "no ha sido posible formular unas normas generales y sin ambigüedad para predecir si el contenido de los codones poco usados en un gen específico podría afectar negativamente a la eficacia de su expresión en E. coli". Véase la página 524 de S. C.Makrides (1996), "Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli" Microbiological Reviews 60, 512-538. Por ejemplo, en un caso, se realizaron varias fusiones génicas entre el factor \alpha de la levadura y la somatomedina C que diferían sólo en la secuencia codificante. En estos experimentos, no se encontró ninguna correlación entre el sesgo de los codones y los niveles de expresión en E. coli. Ernst, J. F. y Kawashima, E. (1988), J. Biotechnology, 7, 1-10. En otro ejemplo, se demostró que, a pesar de la mayor frecuencia de los codones óptimos en un gen de \beta-globina sintético en comparación con la secuencia nativa, no se encontró ninguna diferencia en la expresión de la proteína de estas dos construcciones cuando se colocaban detrás del promotor de T7. Hernan et al. (1992), Biochemistry, 31, 8619-8628. Por el contrario, hay muchos ejemplos de proteínas con un porcentaje relativamente elevado de codones infrecuentes que se expresan bien en E. coli. Una tabla que enumera algunos de estos ejemplos y se puede encontrar una discusión general en Makoff, A. J. et al. (1989), Nucleic Acids Research, 17, 10191-10202. En un caso, la introducción de codones de arginina infrecuentes no óptimos en el extremo 3' de un gen realmente aumentó la producción de la proteína expresada. Gursky, Y. G. y Beabealashvilli, R. Sh. (1994), Gene, 148, 15-21.

La imposibilidad de proporcionar modificaciones postraduccionales como la hidroxilación de la prolina y la presencia de codones infrecuentes para E. coli en el colágeno humano puede estar contribuyendo a las dificultades encontradas para expresar los genes del colágeno humano en E. coli.

Resumen

Se da a conocer un método para incorporar un análogo de aminoácido en un polipéptido producido por una célula, que incluye proporcionar una célula seleccionada del grupo que consiste en célula procariota y célula eucariota, proporcionando medios de crecimiento hipertónico que contienen, al menos, un análogo del aminoácido seleccionado del grupo que consiste en trans-4-hidroxiprolina, 3-hidroxiprolina y combinaciones de los mismos y poner en contacto la célula con el medio de crecimiento, en el que, al menos, un análogo del aminoácido es asimilado por la célula y se incorpora en, al menos, un polipéptido.

La solicitud de patente internacional PCT WO 97/38710 trata sobre la síntesis de procolágenos y colágenos humanos en sistemas de ADN recombinante. La solicitud de patente europea EP 0 704 532 A2 trata sobre proteínas quiméricas recombinantes y sus métodos. En Haardt M. et al., Mol. Gen. Genet. (1995) 246: 783-786 se trata la betaína de prolina osmoprotectora como un sustrato principal para el sistema de transporte ProU dependiente de proteínas de unión de Escherichia coli K-12.

También se da a conocer un método para sustituir un análogo de aminoácido de un aminoácido en un polipéptido producido por una célula seleccionada del grupo que consiste en célula procariota y célula eucariota, que incluye proporcionar una célula seleccionada del grupo que consiste en célula procariota y célula eucariota, proporcionar un medio de crecimiento hipertónico que contiene, al menos, un análogo del aminoácido seleccionado del grupo que consiste en trans-4-hidroxiprolina, 3-hidroxiprolina y combinaciones de los mismos, y poner en contacto la célula con el medio de crecimiento, en el que, al menos, un análogo del aminoácido es asimilado por la célula y se incorpora como una sustitución para, al menos, un aminoácido que aparece de forma natural en al menos un polipéptido.

También se da a conocer un método para controlar la cantidad de un análogo del aminoácido incorporado en un polipéptido, que incluye proporcionar, al menos, un primera célula seleccionada del grupo que consiste en célula procariota y célula eucariota, proporcionar un primer medio de crecimiento hipertónico que contiene una primera cantidad predeterminada de, al menos, un análogo del aminoácido seleccionado del grupo que consiste en trans-4-hidroxiprolina, 3-hidroxiprolina y combinaciones de los mismos, y poner en contacto la primera célula con el primer medio de crecimiento, en el que una primera cantidad del análogo del aminoácido es asimilada por la primera célula y se incorpora en, al menos, un polipéptido. También se proporciona al menos una segunda célula seleccionada del grupo que consiste en célula procariota y célula eucariota junto con un segundo medio de crecimiento hipertónico que contiene una segunda cantidad predeterminada de un análogo del aminoácido seleccionado del grupo que consiste en trans-4-hidroxiprolina, 3-hidroxiprolina y combinaciones de los mismos y, al menos, la segunda célula se pone en contacto con el segundo medio de crecimiento, en el que una segunda cantidad del análogo del aminoácido es asimilada por la segunda célula y se incorpora en, al menos, un polipéptido.

También se da a conocer un método para aumentar la estabilidad de un polipéptido recombinante producido por una célula que incluye proporcionar una célula seleccionada del grupo que consiste en célula procariota y célula eucariota, y proporcionar un medio de crecimiento hipertónico que contiene un análogo del aminoácido seleccionado del grupo que consiste en trans-4-hidroxiprolina, 3-hidroxiprolina y combinaciones de los mismos y poner en contacto la célula con el medio de crecimiento, en el que el análogo del aminoácido es asimilado por la célula y se incorpora en un polipéptido recombinante, y de este modo se estabiliza el polipéptido.

También se proporciona un método para aumentar la captación de un análogo del aminoácido en una célula y provocar la formación de un complejo análogo del aminoácido/ARNt que incluye proporcionar una célula seleccionada del grupo que consiste en célula procariota y célula eucariota, proporcionar un medio de crecimiento hipertónico que contiene un análogo del aminoácido seleccionado del grupo que consiste en trans-4-hidroxiprolina, 3-hidroxiprolina y combinaciones de los mismos, y poner en contacto la célula con el medio de crecimiento hipertónico, en el que el análogo del aminoácido es asimilado por la célula y se incorpora en un complejo análogo del aminoácido/ARNt. En uno cualquiera de los métodos anteriores, se puede incorporar opcionalmente un medio de crecimiento hipertónico para aumentar la captación de un análogo del aminoácido en una célula.

Se describe una composición que incluye una célula que se selecciona del grupo que consiste en célula procariota y célula eucariota, y un medio hipertónico que incluye un análogo del aminoácido seleccionado del grupo que consiste en trans-4-hidroxiprolina, 3-hidroxiprolina y combinaciones de los mismos.

También se da a conocer un método para producir una proteína de la matriz extracelular (PME) o una fragmento de la misma capaz de proporcionar un autoagregado en una célula que habitualmente no hidroxila la prolina, que incluye proporcionar una secuencia del ácido nucleico que codifica la PME o un fragmento de la misma que se ha optimizado para la expresión en la célula mediante la sustitución de los codones preferidos por la célula por codones que se producen de forma natural que no son los preferidos de la célula, incorporar la secuencia del ácido nucleico en la célula, proporcionar un medio de crecimiento hipertónico que contiene, al menos, un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en trans-4-hidroxiprolina y 3-hidroxiprolina, y poner en contacto la célula con el medio de crecimiento, en el que, al menos, un aminoácido es asimilado por la célula y se incorpora en la PME o un fragmento de la misma.

Se describe un ácido nucleico que codifica una proteína quimérica que incluye un dominio de un péptido fisiológicamente activo y un dominio de una proteína de la matriz extracelular (PME) que es capaz de proporcionar un autoagregado. El ácido nucleico se puede introducir en un vector de clonación que después se puede incorporar en una célula.

También se describe una proteína quimérica que incluye un dominio de un péptido fisiológicamente activo y un dominio de una proteína de la matriz extracelular (PME) que es capaz de proporcionar un autoagregado.

También se describe colágeno humano producido por una célula procariota, siendo capaz el colágeno humano de proporcionar un autoagregado.

También se describe un ácido nucleico que codifica una proteína de la matriz extracelular (PME), en el que que el uso de codones en la secuencia del ácido nucleico refleja el uso de codones preferido de una célula procariota.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un mapa plasmídico que ilustra el pMAL-c2.

La figura 2 es una representación gráfica de la concentración de la hidroxiprolina intracelular sobre la base de la concentración de la trans-4-hidroxiprolina en el cultivo de crecimiento a lo largo del tiempo.

La figura 2A es una representación gráfica de la concentración de la hidroxiprolina intracelular en función de la concentración de cloruro de sodio.

Las figuras 3A y 3B ilustran una secuencia de ADN que codifica el colágeno humano de tipo I (\alpha_{1}) (SEQ ID n.º 1).

La figura 4 es un mapa plasmídico que ilustra el pHuCol.

La figura 5 representa una secuencia de ADN que codifica un fragmento del colágeno humano de tipo I (\alpha_{1}) (SEQ ID n.º 2).

La figura 6 es un mapa plasmídico que ilustra el pHuCol-F1.

La figura 7 representa una secuencia de ADN que codifica un péptido similar al colágeno, en el que la región que codifica el péptido del gen similar al colágeno está subrayado (SEQ ID n.º 3).

La figura 8 representa una secuencia de aminoácidos de un péptido similar al colágeno (SEQ ID n.º 4).

La figura 9 es un mapa plasmídico que ilustra el pCLP.

La figura 10 representa una secuencia de ADN que codifica la proteína morfogénica de hueso maduro (SEQ ID n.º 5).

La figura 11 es un mapa plasmídico que ilustra el pCBC.

La figura 12 es una representación gráfica del porcentaje de incorporación de prolina y trans-4-hidroxiprolina en la proteína de unión a la maltosa en distintas condiciones.

La figura 13 representa una secuencia de aminoácidos quimérica de colágeno I (\alpha1)/ BMP-2B (SEQ ID n.º 6).

La figura 14A-14C representa una secuencia nucleotídica quimérica de colágeno I (\alpha1)/BMP-2B (SEQ ID n.º 7).

La figura 15 representa una secuencia de aminoácidos de colágeno I (\alpha1)/TGF-\beta_{1} (SEQ ID n.º 8).

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La figura 16A-16C representa una secuencia nucleotídica de colágeno I (\alpha1)/TGF-\beta_{1} (SEQ ID n.º 9). Las letras minúsculas indican una secuencia no codificante.

Las figuras 17A-17B representan una secuencia de aminoácidos de colágeno I (\alpha_{1})/decorina (SEQ ID n.º 10).

La figura 18 representa una secuencia de aminoácidos de colágeno I (\alpha_{1})/péptido de decorina (SEQ ID n.º 11).

La figura 19A-19D representa una secuencia nucleotídica de colágeno I (\alpha_{1})/decorina (SEQ ID n.º 12).

Las figuras 20A-20C representan una secuencia nucleotídica de colágeno/péptido de decorina (SEQ ID n.13). Las letras minúsculas indican una secuencia no codificante.

La figura 21 representa un vector de clonación pMal y el sitio de clonación múltiple.

La figura 22 representa un sitio de clonación múltiple contenido en el vector de clonación pMal de la figura 21 (SEQ ID n.º 14).

La figura 23 representa un vector de clonación pMal que contiene una construcción quimérica nucleotídica BMP/
colágeno.

La figura 24 representa un vector de clonación pMal que contiene una construcción quimérica nucleotídica TGF-\beta_{1}/colágeno.

La figura 25 representa un vector de clonación pMal que contiene una construcción quimérica nucleotídica decorina/colágeno.

La figura 26 representa un vector de clonación pMal que contiene una construcción quimérica nucleotídica péptido de decorina/colágeno.

La figura 27A-27E representa una secuencia nucleotídica de colágeno humano de tipo I (\alpha1) (SEQ ID n.º 15) y la secuencia de aminoácidos correspondiente (SEQ ID n.º 16).

La figura 28 es un diagrama esquemático de la construcción del gen del colágeno humano a partir de oligonucleótidos sintéticos.

La figura 29 es una ilustración esquemática de la secuencia de aminoácidos de proteínas quiméricas GST-ColECol (SEQ ID n.º 17) y GST-D4 (SEQ ID n.º 18).

La figura 30 es una tabla que ilustra la frecuencia de cuatro codones de prolina y de cuatro codones de glicina en el gen de colágeno humano de tipo I (\alpha_{1}) con el uso de codones optimizado (ColIECol).

La figura 31 representa un gel que refleja la expresión de GST-D4 y que su expresión depende de la hidroxiprolina.

La figura 32 representa un gel que muestra la expresión de GST-D4 en medio hipertónico.

La figura 33 es una gráfica que muestra el espectro de dicroísmo circular de la D4 nativa y desnaturalizada en tampón fosfato neutro.

La figura 34 representa un gen que muestra la digestión de D4 con la pepsina bovina.

La figura 35 representa un gel que muestra la expresión de GST-H Col y GST-ColECol en condiciones específicas.

La figura 36 representa un gel que muestra la expresión de GST-CM4 en medio con o sin NaCl y bien prolina o hidroxiprolina.

La figura 37 representa un gel de muestras de GST-CM4 tras una inducción de 6 horas expresada en E. coli con diferentes concentraciones de NaCl.

La figura 38 representa un gel de muestras de GST-CM4 tras una inducción de 4 horas expresada en E. coli con una cantidad constante de hidroxiprolina y diferentes cantidades de prolina.

Las figuras 39A-39E representan la secuencia nucleotídica (SEQ ID n.º 19) y de aminoácidos (SEQ ID n.º 20) de HuCol^{Ec}, la región helicoidal de colágeno humano de tipo I (\alpha_{1}) más 17 aminoácidos extrahelicoidales del extremo amino y 26 aminoácidos extrahelicoidales del extremo carboxilo con el uso de codones optimizado para E. coli.

La figura 40 representa la secuencia y los mapas de restricción de los oligonucleótidos sintéticos utilizados para reconstruir los primeros 243 pares de bases del gen del colágeno humano de tipo I (\alpha_{1}) con el uso de codones optimizado para E. coli. Los oligonucleótidos sintéticos se identifican como N-1 (SEQ ID n.º 21), N1-2 (SEQ ID n.º 22), N1-3 (SEQ ID n.º 23) y N1-4 (SEQ ID n.º 24).

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La figura 41 representa un mapa del plásmido pBSN1-1 que contiene un fragmento de 114 pares de bases de colágeno humano de tipo I (\alpha_{1}) con el uso de codones optimizado para E. coli.

La figura 42 representa la secuencia nucleotídica (SEQ ID n.º 25) y de aminoácidos (SEQ ID n.º 26) de un fragmento del gen del colágeno humano de tipo I (\alpha_{1}) con el uso de codones optimizado para E. coli codificado por el plásmido pBSN1-1.

La figura 43 representa un mapa del plásmido pBSN1-2 que contiene un fragmento de 243 pares de bases de colágeno humano de tipo I (\alpha_{1}) con el uso de codones optimizado para E. coli.

La figura 44 representa la secuencia de nucleótidos (SEQ ID n.º 27) y de aminoácidos (SEQ ID n.º 28) de un fragmento del gen del colágeno humano de tipo I (\alpha_{1}) con el uso de codones optimizado para E. coli codificado por el plásmido pBSN1-2.

La figura 45 representa un mapa del plásmido pHuCol^{EC} que contiene el colágeno humano de tipo I (\alpha_{1}) con el uso de codones optimizado para E. coli.

La figura 46 representa un mapa del plásmido pTrcN1-2 que contiene un fragmento del colágeno humano de tipo I (\alpha_{1}) de 234 nucleótidos con el uso de codones optimizado para E. coli.

La figura 47 representa un mapa del plásmido pN1-3 que contiene un fragmento del colágeno humano de tipo I (\alpha_{1}) de 360 nucleótidos con el uso de codones optimizado para E. coli.

La figura 48 representa un mapa del plásmido pD4 que contiene un fragmento del colágeno humano de tipo I (\alpha_{1}) de 657 nucleótidos en 3' con el uso de codones optimizado para E. coli.

Las figuras 49A-49E representan la secuencia nucleotídica (SEQ ID n.º 29) y la aminoacídica (SEQ ID n.º 30) de una región helicoidal de colágeno humano de tipo I (\alpha_{2}) más 11 aminoácidos extrahelicoidales del extremo amino y 12 aminoácidos extrahelicoidales del extremo carboxilo.

Las figuras 50A-50E representan la secuencia nucleotídica (SEQ ID n.º 31) y la aminoacídica (SEQ ID n.º 32) de HuCol(\alpha_{2})^{Ec}, la región helicoidal de colágeno humano de tipo I (\alpha_{2}) más 11 aminoácidos extrahelicoidales del extremo amino y 12 aminoácidos extrahelicoidales del extremo carboxilo con el uso de codones optimizado para E. coli.

La figura 51 representa la secuencia y los mapas de restricción de los oligonucleótidos sintéticos utilizados para reconstruir los primeros 240 pares de bases del gen del colágeno humano de tipo I (\alpha_{2}) con el uso de codones optimizado para E. coli. Los oligonucleótidos sintéticos se denominan N1-1 (\alpha_{2}) (SEC ID n.º 33), N1-2 (\alpha_{2}) (SEQ ID n.º 34), N1-3 (\alpha_{2}) (SEQ ID n.º 35) y N1-4 (\alpha_{2}) (SEQ ID n.º 36).

La figura 52 representa un mapa del plásmido pBSN1-1 (\alpha_{2}) que contiene un fragmento de 117 pares de bases del colágeno humano de tipo I (\alpha_{2}) con el uso de codones optimizado para E. coli.

La figura 53 representa un mapa del plásmido pBSN1-2 (\alpha_{2}) que contiene un fragmento de 240 pares de bases del colágeno humano de tipo I (\alpha_{2}) con el uso de codones optimizado para E. coli.

La figura 54 representa la secuencia nucleotídica (SEQ ID n.º 37) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID n.º 38) de un fragmento del gen del colágeno humano de tipo I (\alpha_{2}) con el uso optimizado para E. coli codificado por el plásmido pBSN1-2 (\alpha_{2}).

La figura 55 representa un mapa del plásmido pHuCol(\alpha_{2})^{Ec} que contiene el gen completo del colágeno humano de tipo I (\alpha_{2}) con el uso de codones optimizado para E. coli.

La figura 56 representa un mapa del plásmido pN1-2 (\alpha_{2}) que contiene un fragmento de 240 pares de bases del colágeno humano de tipo I (\alpha_{2}) con el uso de codones optimizado para E. coli.

La figura 57 representa un gel que refleja la expresión de GST y TGF-\beta1 en condiciones específicas.

La figura 58 representa un gel que refleja la expresión de MBP, FN-BMP-2A, FN-TGF-\beta1 y FN en condiciones específicas.

La figura 59 representa un gel que muestra la expresión de GST-Coll en condiciones específicas.

La figura 60 representa un mapa del plásmido pGST-CM4 que contiene el gen de la glutatión S-transferasa fusionado con el gen del mimético 4 del colágeno.

La figura 61 representa la secuencia nucleotídica (SEQ ID n.º 39) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID n.º 40) del mimético 4 del colágeno.

La figura 62A representa un cromatograma de la elución del mimético 4 del colágeno que contiene hidroxiprolina en una columna Poros RP2. La flecha indica el pico que contiene el mimético 4 del colágeno que contiene hidroxiprolina.

La figura 62B representa un cromatograma de la elución del mimético 4 del colágeno que contiene prolina en una columna Poros RP2. La flecha indica el pico que contiene el mimético 4 del colágeno que contiene prolina.

La figura 63A representa un cromatograma de un patrón del aminoácido prolina (250 pmol).

La figura 63B representa un cromatograma de un patrón del aminoácido hidroxiprolina (250 pmol)

La figura 63C representa un cromatograma del análisis de aminoácidos de la hidrólisis del mimético 4 del colágeno que contiene prolina.

La figura 63D representa un cromatograma del análisis de aminoácidos de la hidrólisis del mimético 4 del colágeno que contiene hidroxiprolina.

La figura 64 es una gráfica de DO600 frente al tiempo para los cultivos de E. coli JM109 (F-) cultivados hasta la fase estacionaria y, luego, complementados con varios aminoácidos.

La figura 65 representa un mapa del plásmido pcEc-\alpha1 que contiene el gen de la HuCol(\alphal)^{Ec}.

La figura 66 representa un mapa del plásmido pcEc-\alpha2 que contiene el gen de la HuCol(\alpha_{2})^{Ec}.

La figura 67 representa un mapa del plásmido pD4-\alpha1 que contiene el gen de un fragmento del extremo carboxilo de 219 aminoácidos del colágeno humano de tipo I (\alpha1) con el uso de codones optimizado para E. coli fusionado al gen de la glutatión S-transferasa.

La figura 68 representa un mapa del plásmido pD4-\alpha2 que contiene el gen de un fragmento del extremo carboxilo de 207 aminoácidos del colágeno humano de tipo I (\alpha2) con el uso de codones optimizado para E. coli fusionado al gen de la glutatión S-transferasa.

La figura 69 representa la secuencia de aminoácidos predicha a partir de la secuencia del ADN de los primeros 13 aminoácidos de la proteína D4-\alpha1 (SEQ ID n.º 41) y la secuencia de aminoácidos que se determinó experimentalmente (SEQ ID n.º 42).

La figura 70 representa el espectro de masas de la D4-\alpha1 que contiene hidroxiprolina.

La figura 71 representa la secuencia de nucleótidos de un fragmento del colágeno humano de tipo I (\alpha_{1}) de 657 nucleótidos en 3' con el uso de codones optimizado para E. coli denominado D4 (SEQ. ID n.º 43).

La figura 72 representa la secuencia de aminoácidos de un fragmento del extremo carboxilo de 219 aminoácidos del colágeno humano de tipo I (\alpha1) denominado D4 (SEQ ID n.º 44).

La figura 73 es un mapa plasmídico que ilustra el pGEX-4T-1, que contiene el gen de la glutatión S-transferasa.

La figura 74 es un mapa plasmídico que ilustra el pTrc-TGF, que contiene el gen del polipéptido TGF-\beta1 humano maduro.

La figura 75 es un mapa plasmídico que ilustra el pTrc-Fn, que contiene el gen de un fragmento de 70 kDa de la fibronectina humana.

La figura 76 es un mapa plasmídico que ilustra el pTrc-Fn-TGF, que contiene el gen de una proteína de fusión de un fragmento de 70 kDa de fibronectina humana y el polipéptido TGF-\beta1 humano maduro.

La figura 77 es un mapa plasmídico que ilustra el pTrc-Fn-BMP, que contiene el gen de una proteína de fusión de un fragmento de 70 kDa de la fibronectina humana y la proteína morfogénica de hueso humano 2A.

La figura 78 es un mapa plasmídico que ilustra el pGEX-HuColl^{Ec}, que contiene el gen de una fusión entre la glutatión S-transferasa y el colágeno humano de tipo I (\alpha1) con el uso de codones optimizado para E. coli.

La figura 79 representa la secuencia nucleotídica de un fragmento de colágeno humano de tipo I (\alpha2) de 627 nucleótidos en 3' con el uso de codones para E. coli (SEQ ID n.º 45).

La figura 80 representa la secuencia de aminoácidos de un fragmento del extremo carboxilo de 209 aminoácidos del colágeno humano de tipo I (\alpha2) (SEQ ID n.º 46).

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La figura 81 representa la secuencia de los oligonucleótidos sintéticos utilizados para reconstruir los primeros 282 pares de bases del gen de los 219 aminoácidos del extremo carboxilo del colágeno humano de tipo I (\alpha_{1}) con el uso de codones optimizado para E. coli denominados N4-1 (SEQ ID n.º 47), N4-2 (SEQ ID n.º 48), N4-3 (SEQ ID n.º 49) y N4-4 (SEQ ID n.º 50).

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Descripción detallada de las realizaciones preferidas

Se puede hacer que las células procariotas y las eucariotas asimilen e incorporen de forma inesperada la trans-4-hidroxiprolina en las proteínas, contrariamente a lo indicado en Papas et al. y a Deming et al., véase más arriba. Tal asimilación e incorporación es especialmente útil cuando la estructura y la función de un polipéptido depende de la hidroxilación postraduccional de la prolina que no proporciona el sistema de producción de la proteína nativa de un huésped recombinante. Así, bacterias procariotas tales como E. coli y células eucariotas tales como Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis y Schizosaccharomyces pombe que habitualmente no hidroxilan la prolina, y otros eucariotas tales como células de insectos que incluyen las estirpes celulares de lepidópteros que incluyen Spodoptera frugiperda, Trichoplasia ni, Heliothis virescens, Bombyx mori infectadas con un baculovirus; células CHO; células COS y células NIH 3T3 que son incapaces de producir adecuadamente determinados polipéptidos cuya estructura y función depende de que se pueda realizar tal hidroxilación para producir polipéptidos que tienen prolinas hidroxiladas. La incorporación incluye añadir la trans-4-hidroxiprolina a un polipéptido, por ejemplo, cambiando primero un aminoácido a prolina, lo que crea una nueva posición de prolina que, a su vez, se puede sustituir por la trans-4-hidroxiprolina o sustituir también una prolina que se produce de forma natural en un polipéptido por la trans-4-hidroxiprolina.

Se conoce bien el procedimiento para producir polipéptidos recombinantes en organismos productores en masa. Los vectores de expresión replicables tales como plásmidos, virus, cósmidos y cromosomas artificiales se utilizan frecuentemente para transportar de un huésped a otro los genes que codifican las proteínas deseadas. Se contempla que se puede utilizar en apoyo de la presente descripción cualquier método conocido de clonación génica, de ligación del gen con un vector de expresión y de transformación de una célula hospedadora con tal vector de expresión.

La incorporación de la trans-4-hidroxiprolina en los polipéptidos que dependen de la trans-4-hidroxiprolina para sus propiedades químicas y físicas no sólo es útil en los sistemas de producción que no tienen los sistemas adecuados para convertir la prolina en trans-4-hidroxiprolina, sino que también es útil para estudiar la estructura y la función de los polipéptidos que normalmente no contienen trans-4-hidroxiprolina. Se contempla que los análogos del aminoácido siguientes también se pueden incorporar de acuerdo con la presente descripción: trans-4-hidroxiprolina, 3-hidroxiprolina y combinaciones de los mismos (de aquí en adelante se citan como "análogos del aminoácido"). La utilización de procariotas y eucariotas es deseable porque permiten una producción en masa relativamente barata de tales polipéptidos. Se contempla que los análogos del aminoácido se pueden incorporar en cualquier polipéptido deseado. En una realización preferida, las células procariotas y las células eucariotas se privan de prolina mediante la disminución o eliminación de la cantidad de prolina en el medio de crecimiento antes de añadir un análogo del aminoácido en él.

Los vectores de expresión que contienen el gen de la proteína de unión a la maltosa (MBP), por ejemplo véase la figura 1 que ilustra el plásmido pMAL-c2, que se puede adquirir de New England Bio-Labs, se transforman en procariotas tales como E. coli auxótrofas para la prolina o eucariotas tales como S. cerevisiae auxótrofas que dependen de la prolina suministrada desde el exterior para la síntesis y el anabolismo de las proteínas. Otros vectores de expresión preferidos para utilizar en los procariotas son los plásmidos disponibles comercialmente que incluyen pKK-223 (Pharmacia), pTRC (Invitrogen), pGEX (Pharmacia), pET (Novagen) y pQE (Quiagen). Se debe comprender que los expertos en la técnica pueden utilizar cualquier vector de expresión adecuado.

La sustitución de los análogos del aminoácido por la prolina en la síntesis de las proteínas se produce porque la prolil-ARNt ligasa es suficientemente promiscua para permitir la acilación incorrecta del ARNt de la prolina con cualquiera de los análogos del aminoácido. Una cantidad suficiente, a saber, que oscila por lo general de aproximadamente 0,001 M a aproximadamente 1,0 M, pero más preferiblemente de aproximadamente 0,005 M a aproximadamente 0,5 M de el(los) análogo(s) del aminoácido se añade al medio de crecimiento para que las células transformadas compitan por la captación celular de la prolina. Después de un tiempo suficiente, generalmente de unos 30 minutos a unas 24 horas o más, el(los) análogo(s) del aminoácido es(son) asimilado(s) por la célula e incorporado(s) en las vías de síntesis de las proteínas. Tal y como se puede observar en las figuras 2 y 2A, la concentración intracelular de la trans-4-hidroxiprolina aumenta al aumentar la concentración de cloruro de sodio en el medio de cultivo. En una realización preferida, las células procariotas y/o las células eucariotas se privan de prolina disminuyendo o eliminando la cantidad de prolina en el medio de crecimiento antes de añadir un análogo del aminoácido en éste.

Los vectores de expresión que contienen el gen del colágeno humano de tipo I (\alpha1) (secuencia de ADN ilustrada en las figuras 3 y 3A; mapa plasmídico ilustrado en la figura 4) se introducen por transformación en auxótrofos de prolina procariotas o eucariotas que dependen de la prolina suministrada desde el exterior para la síntesis de las proteínas y el anabolismo. Al igual que antes, la sustitución del(de los) análogo(s) del aminoácido se produce porque la prolil-ARNt sintetasa es lo suficientemente promiscua como para permitir la acilación incorrecta del ARNt de la prolina con el(los) análogo(s) del aminoácido. Es igualmente válida la cantidad del(de los) análogo(s) del aminoácido en los medios dada anteriormente.

Los vectores de expresión que contienen fragmentos que codifican el ADN del colágeno humano de tipo I (\alpha_{1}) (por ejemplo, la secuencia del ADN ilustrada en la figura 5 y el mapa plasmídico ilustrado en la figura 6) se introducen por transformación en auxótrofos procariotas o eucariotas como se ha descrito anteriormente. Asimismo, los vectores de expresión que contienen el ADN que codifica el polipéptido similar al colágeno (por ejemplo, la secuencia de ADN ilustrada en la figura 7, la ilustración de la secuencia de aminoácidos de la figura 8 y el mapa plasmídico ilustrado en la figura 9) se pueden utilizar para transformar los auxótrofos procariotas o eucariotas como anteriormente. Los péptidos similares al colágeno son los que contienen al menos una homología parcial con el colágeno y muestran unas características químicas y físicas similares a las del colágeno. Así, los péptidos similares al colágeno consisten, por ejemplo, en series repetitivas de tripletes Gly-X-Y en las que aproximadamente un 35% de las posiciones X e Y están ocupadas por prolina y 4-hidroxiprolina. Los péptidos similares al colágeno se citan intercambiablemente en la presente memoria como proteínas similares al colágeno, polipéptidos similares al colágeno, polipéptidos miméticos del colágeno y mimético del colágeno. Algunos fragmentos del colágeno y péptidos similares al colágeno preferidos de acuerdo con la presente memoria son capaces de ensamblarse en una matriz extracelular. Tanto en los fragmentos de colágeno como en los péptidos similares al colágeno tal y como se describen más arriba, la sustitución con análogo(s) del aminoácido se produce porque la prolil ARNt sintetasa es lo suficiente promiscua como para permitir la acilación incorrecta del ARNt de la prolina con uno o más análogo(s) del aminoácido. La cantidad del(de los) análogo(s) del aminoácido dada más arriba es igualmente válida.

Se contempla que cualquier polipéptido que tenga un dominio proteico de matriz extracelular, tal como un colágeno, un fragmento de colágeno o un dominio peptídico similar al colágeno, se puede hacer que incorpore análogo(s) del aminoácido de acuerdo con la descripción de la presente memoria. Tales polipéptidos incluyen colágeno, un fragmento del colágeno o un dominio peptídico similar al colágeno y un dominio que tiene una región que incorpora uno o más agentes fisiológicamente activos tales como glucoproteínas, proteínas, péptidos y proteoglicanos. Tal y como se usa en la presente memoria, los agentes fisiológicamente activos controlan o modifican las funciones fisiológicas existentes en los seres vivos. Los agentes fisiológicamente activos incluyen hormonas, factores de crecimiento, enzimas, ligandos y receptores. Se han definido y aislado muchos dominios activos de agentes fisiológicamente activos. Se describe que los polipéptidos que tienen un colágeno, fragmento de colágeno o dominio peptídico similar al colágeno también pueden tener un dominio que incorpora uno o más dominios fisiológicamente activos que son fragmentos activos de tales agentes fisiológicamente activos. Tal y como se utiliza en la presente memoria, a agente fisiológicamente activo se le da el significado para que incluya péptidos completos, polipéptidos, proteínas, glucoproteínas, proteoglicanos y fragmentos activos de cualquiera de ellos. Por lo tanto, se fabrican proteínas quiméricas que incorporan análogo(s) del aminoácidos transformando un auxótrofo de prolina procariota o un auxótrofo de prolina eucariota con un vector de expresión adecuado y poniendo en contacto el auxótrofo transformado con un medio de crecimiento que contiene, al menos, uno de los análogos del aminoácido. Por ejemplo, una construcción de colágeno quimérico/proteína morfogénica de hueso (BMP) o varias construcciones de colágeno quimérico/factor de crecimiento son útiles de acuerdo con la presente memoria. Tales factores de crecimiento se conocen bien e incluyen el factor de crecimiento insulinoide, el factor de crecimiento transformante, el factor de crecimiento derivado de las plaquetas y similares. La figura 10 ilustra el ADN de la BMP que se puede fusionar con el extremo 3' del ADN que codifica el colágeno, del ADN que codifica un fragmento de colágeno o del ADN que codifica un péptido similar al colágeno. La figura 11 ilustra un mapa del plásmido pCBC que contiene una construcción colágeno/BMP. En una realización preferida, las proteínas que tienen un colágeno, un fragmento de colágeno o un dominio peptídico similar al colágeno se ensamblan o se agregan para formar una matriz extracelular que se puede utilizar como un implante quirúrgico. La propiedad de la autoagregación tal y como se utiliza en la presente memoria incluye la capacidad de formar un agregado con la misma molécula o moléculas similares, o de formar un agregado con moléculas diferentes que comparten la propiedad de agregación para formar, por ejemplo, una hélice doble o triple. Un ejemplo de tal agregación es la estructura de matrices de colágeno ensamblado.

De hecho, los polipéptidos quiméricos también se pueden citar en la presente memoria como proteínas quiméricas que proporcionan una combinación integrada de un dominio terapéuticamente activo a partir de un agente fisiológicamente activo y una o más porciones de las PME. El dominio PME proporciona un vehículo integral para llevar una porción terapéuticamente activa a un sitio de destino. Los dos dominios están unidos covalentemente mediante uno o más enlaces peptídicos contenidos en una región conectora. Tal y como se utiliza en la presente memoria, integrado o integral se refiere a las características que son resultado de la asociación covalente de uno o más dominios de las proteínas quiméricas. Las porciones terapéuticamente activas descritas en la presente memoria están hechas por lo general de aminoácidos unidos para formar péptidos, polipéptidos, proteínas, glucoproteínas o proteoglicanos. Tal y como se utiliza en la presente memoria, péptido abarca polipéptidos y proteínas.

Las características inherentes de las PME son ideales para que se utilicen como vehículo de la porción terapéutica. Una de las característica es la capacidad que tienen las PME para formar el autoagregado. Ejemplos de PME adecuadas son colágeno, elastina, fibronectina, fibrinógeno y fibrina. Los colágenos fibrilares (tipo I, II y III) se ensamblan en polímeros ordenados y, a menudo, se agregan en haces más grandes. El colágeno de tipo IV se ensambla en mallas laminares. Las moléculas de elastina forman filamentos y láminas en los que las moléculas de elastina se entrecruzan fuertemente entre sí para proporcionar una buena elasticidad y una mayor resistencia a la tensión. La estructura enrollada aleatoriamente y entrecruzada de la red de fibras permite que se estire y se encoja como una goma elástica. La fibronectina es una fibrilla grande que forma glucoproteínas que, en una de sus formas, consiste en fibrillas muy insolubles entrecruzadas entre sí mediante puentes disulfuro. La fibrina es una proteína insoluble que se forma a partir del fibrinógeno mediante la actividad proteolítica de la trombina durante la coagulación normal de la sangre.

La forma molecular y macromolecular de las PME anteriores define redes o matrices que proporcionan el sustrato o soporte en la asociación covalente integral con el resto terapéuticamente activo. Las redes o matrices formadas por el dominio PME proporcionan un entorno especialmente adecuado para el crecimiento de las células autólogas implicadas en el crecimiento, reparación y reemplazamiento del tejido existente. Los restos terapéuticamente activos integrales que se unen covalentemente dentro de las redes o matrices proporcionan la exposición máxima de los agentes activos a sus dianas para que se desencadene una respuesta deseada.

Los implantes formados por, o a partir de, las proteínas quiméricas de la presente invención proporcionan una actividad de liberación prolongada en, o a, un lugar deseado o sitio de destino. Dado que se une a un dominio PME, el dominio terapéuticamente activo de la presente proteína quimérica no es libre de difundir por separado o, si no, de desentenderse del vehículo que la transporta, si no se produce una escisión de enlaces de péptidos. En consecuencia, las proteínas quiméricas en la presente memoria proporcionan un anclaje eficaz para la actividad terapéutica que permite que la actividad se confine en una localización de destino durante un tiempo prolongado. Ya que el suministro del agente terapéuticamente activo no se tiene que reponer tan a menudo cuando se compara con formas farmacéuticas de liberación no prolongada, se pueden utilizar cantidades más pequeñas del agente terapéuticamente activo durante el transcurso del tratamiento. En consecuencia, algunas de las ventajas proporcionadas por las proteínas quiméricas de la presente invención son una disminución o eliminación de los efectos secundarios locales y sistémicos, una menor potenciación o reducción en la actividad terapéutica con el uso crónico, y la disminución al máximo de la acumulación del fármaco en el tejido óseo con la dosificación crónica.

El uso de la tecnología recombinante permite fabricar proteínas quiméricas no inmunógenas. El ADN que codifica la porción terapéuticamente activa y la porción de la PME se debería obtener preferiblemente a partir de las mismas especies conforme se trate al paciente para evitar una reacción inmunógena. Por ejemplo, si el paciente es humano, el resto terapéuticamente activo así como la porción de la PME se obtiene preferiblemente de ADN humano.

Las proteínas quiméricas osteogénicas/PME proporcionan agentes biodegradables y biocompatibles para inducir la formación de hueso en el sitio deseado. Tal y como se mencionó más arriba, en una realización, una porción de BMP se une covalentemente a una PME para formar una proteína quimérica. La porción de la BMP induce la osteogenia y el resto de la proteína de la matriz extracelular proporciona un sustrato integral o soporte para el resto de BMP y las células que están implicadas en la reconstrucción y el crecimiento. Las composiciones que contienen la proteína quimérica BMP/PME proporcionan una administración de liberación sostenida eficaz de la porción de la BMP a los sitios de destino deseados. El método para fabricar tal osteógeno es eficaz porque se elimina la necesidad de unas etapas extras costosas en tiempo conforme se purifica la PME y, luego, mezclarla con la BMP purificada. Una ventaja añadida de la proteína quimérica de BMP/PME surge de la estabilidad creada por el enlace covalente entre la BMP y la PME, a saber, la porción de la BMP no puede difundir por separado de la PME, lo que proporciona un agente terapéutico más estable.

Las proteínas morfogénicas del hueso se clasifican como BMP-1 hasta BMP-9. Una proteína osteogénica preferida para el uso en los pacientes humanos es la BMP-2B humana. En la figura 13 (SEQ ID n.º 6) se ilustra una proteína quimérica BMP-2B/colágeno IA . La secuencia de la proteína ilustrada en la figura 15 (SEQ ID n.º 8) incluye un dominio helicoidal del colágeno descrito en los aminoácidos 1-1057 y una forma madura de la BMP-2B en los aminoácidos 1060-1169. Las propiedades físicas de la proteína quimérica están dominadas en parte por el componente de la PME. En el caso de una porción de colágeno, una solución concentrada de la proteína quimérica tendrá una consistencia gelatinosa que permite el manejo fácil por parte del médico que la use. La porción PME actúa como un agente secuestrante para prevenir la desorción rápida de la porción BMP desde el sitio deseado y para proporcionar una liberación prolongada de la actividad de la BMP. Como resultado, la porción BMP permanece en el sitio deseado y proporciona una liberación prolongada de la actividad BMP en el sitio deseado durante un periodo de tiempo necesario para inducir de forma eficaz la formación ósea. La porción PME también proporciona una matriz que permite recoger en ella las células autólogas del paciente, por ejemplo, condrocitos y similares, que normalmente están implicadas en la osteogenia y formar una red autóloga para el crecimiento del nuevo tejido. La consistencia gelatinosa de la proteína quimérica también proporciona una forma terapéutica útil y conveniente para inmovilizar la BMP activa en un vehículo o implante adecuado para administrar la porción BMP a un sitio en el que se desea que crezca el hueso.

La porción BMP y la porción PME están opcionalmente unidas entre sí mediante secuencias conectoras aminoacídicas. Ejemplos de las secuencias conectoras utilizadas se ilustran en la secuencia representada en las figuras 14A-14C (SEQ ID n.º 7), 16A-16C (SEQ ID n.º 9), 19A-19C (SEQ ID n.º 12) y 20A-20C (SEQ ID n.º 13), y se describen en más detalle más adelante. Las secuencias conectoras se pueden elegir sobre la base de las propiedades particulares que imparten a la proteína quimérica. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos tales como Ile-Glu-Gly-Arg y Leu-Val-Pro-Arg son escindidas por las enzimas factor XA y trombina, respectivamente. La incorporación de secuencias que se escinden con enzimas proteolíticas y dan proteínas quiméricas en la presente memoria proporciona la escisión en el sitio del conector durante la exposición a la enzima adecuada y la separación de los dos dominios en entidades distintas. Se contempla que se pueden incorporar numerosas secuencias de conectores en cualquiera de las proteínas quiméricas.

Una construcción de ADN quimérico incluye un gen que codifica una proteína osteogénica o un fragmento de la misma unido a un gen que codifica una PME o un fragmento de la misma. Se conocen las secuencias génicas de varias BMP, véase, por ejemplo, las patentes de los EE.UU. n.º 4.294.753, 4.761.471, 5.106.748, 5.187.076, 5.141.905, 5.108.922, 5.116.738 y 5.168.050. Un gen de BMP-2B utilizable en la presente memoria se sintetiza ligando oligonucleótidos que codifican una proteína BMP. Los oligonucleótidos que codifican la BMP-2B se sintetizan mediante un sintetizador de ADN automático (Beckman Oligo-1000). La secuencia nucleotídica que codifica la BMP se optimiza para la expresión en E. coli. Esto se lleva a cabo utilizando tablas de uso de E. coli para traducir la secuencia de aminoácidos de la BMP en codones que E. coli utiliza más a menudo. Alternativamente, se puede purificar y utilizar el ADN nativo que codifica la BMP aislado de mamíferos, incluidos los humanos.

El gen de la BMP y la secuencia de ADN que codifica una proteína de la matriz extracelular se clonan mediante métodos de ingeniería genética estándares tal y como se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1989.

La secuencia de ADN que corresponde a la región helicoidal y del telepéptido del colágeno I (\alpha1) se clona a partir de una estirpe celular de fibroblastos humanos. Se llevan a cabo dos series de las reacciones en cadena de la polimerasa utilizando ADNc preparado mediante métodos estándares a partir de las células AG02261A. El primer par de cebadores de la PCR incluye un cebador en 5' que lleva la secuencia conectora XmnI y un cebador en 3' que lleva el sitio de BsmI en el nucleótido número 1722. El producto resultante de la PCR consiste en una secuencia desde la posición 1 a la 1722. El segundo par de cebadores incluye el sitio BsmI en 1722 y una secuencia conectora en el extremo 3' que lleva un sitio BglII. El producto resultante de la PCR consiste en una secuencia desde la posición 1722 a la 3196. La secuencia completa se ensambla mediante técnicas de clonación estándares. Los dos productos de PCR se ligan por el sitio BsmI, y se introduce el clon combinado en cualquier vector con los sitios XmnI-BglII tal como el vector pMAL-c2.

Para clonar el gen de BMP-2B, se aísla ARN celular total de células humanas de osteosarcoma (U-2OS) mediante el método descrito por Robert E. Farrel Jr. (Academic Press, CA, 1993, pp, 68-69). Se comprueba la integridad del ARN mediante análisis espectrofotométrico y electroforesis en geles de agarosa. El rendimiento normal de ARN total es 50 \mug a partir de una placa de cultivo de tejido confluente de 100 mm. El ARN se utiliza para generar el ADNc mediante transcripción inversa utilizando el sistema de preamplificación Superscript de Gibco BRL. El ADNc se utiliza de molde para la amplificación por PCR utilizando cebadores cadena arriba y cadena abajo específicos de la BMP-2B (HUMBMP2B, N.º de acceso M22490 de GenBank). El producto resultante de la PCR consiste en la secuencia de BMP-2B desde la posición 1289 a la 1619. El producto de la PCR se resuelve mediante electroforesis en geles de agarosa, se purifica con GeneClean (BIO 101) y se liga en el vector pMal-c2 (New England Biolabs). El dominio de la cadena del colágeno humano I (\alpha1) se clona de un modo similar. No obstante, el ARN celular total se aísla a partir de la estirpe celular del fibroblastos humanos (fibroblastos de la piel humana AG02261A).

Se obtiene una construcción quimérica de ADN BMP/PME ligando un gen sintético de BMP a una secuencia de ADN que codifica una PME tal como colágeno, fibrinógeno, fibrina, fibronectina, elastina o laminina. Sin embargo, los polipéptidos quiméricos de la presente memoria no se limitan a estas proteínas en particular. Las figuras 14A-14C (SEQ ID n.º 7) ilustran una construcción de ADN que codifica una proteína quimérica BMP-2B/colágeno I (\alpha1). La secuencia codificante de una PME puede estar ligada cadena arriba y/o cadena abajo y en fase con una secuencia codificante de la BMP. El ADN que codifica una PME puede ser una porción del gen o un gen de la PME completa. Además, se pueden ligar dos PME diferentes cadena arriba y cadena abajo de la BMP.

La proteína quimérica BMP-2B/colágeno I (\alpha1) ilustrada en las figuras 14A-14C incluye una secuencia conectora XmnI en los pares de base (pb) 1 a 19, un dominio de colágeno (pb de 20 a 3190), una secuencia conectora BgIII/BamHI (pb de 3191 a 3196), una forma madura de BMP2b (pb de 3197 a 3529) y una secuencia conectora HindIII (pb de 3530 a 3535).

Se describe cualquier combinación de secuencias de factor de crecimiento y de proteína de la matriz, incluidas las unidades repetitivas, o varias disposiciones de cada segmento en cualquier orden.

También se describe la incorporación de fragmentos de proteínas de la matriz y de factor de crecimiento. Por ejemplo, en el caso del colágeno, sólo se puede incluir el dominio helicoidal. Otras proteínas de la matriz tienen dominios definidos, tales como la laminina, que tiene dominios similares al FCE. En estos casos, se pueden elegir las funcionalidades específicas para conseguir los efectos deseados. Además, puede ser útil combinar dominios a partir de proteínas de la matriz dispares, tales como la región helicoidal del colágeno y las regiones de adhesión celular de la fibronectina. En el caso de los factores de crecimiento, se ha demostrado que se han retirado segmentos específicos de la proteína madura mediante procesamiento postraduccional. Las proteínas quiméricas se pueden diseñar para que incluyan sólo la región biológicamente activa madura. Por ejemplo, en el caso de BMP-2B, sólo se encuentran los 110 aminoácidos finales en la proteína activa.

En otra realización, una porción del factor de crecimiento transformante (TGF) se une covalentemente a una PME para formar una proteína quimérica. La porción TGF aumenta la eficacia de la respuesta de reparación de las partes blandas normal del cuerpo y también induce la osteogenia. Por consiguiente, las proteínas quiméricas TGF/PME se pueden utilizar para ambas funciones o para cualquiera de ellas. Una de las propiedades fundamentales de los TGF-\beta es su capacidad para estimular varias actividades que dan lugar a la síntesis de tejido conjuntivo nuevo. Véase Piez y Sporn, eds., "Transforming growth factor-\betas chemistry, biology and therapeutics", Annals of the New York Academy of Sciences, vol, 593, (1990). Se sabe que el TGF-\beta existe en al menos cinco isoformas diferentes. Se conoce y se ha clonado la secuencia del ADN del TGF-\beta_{1} humano. Véase Derynck et al., "Human transforming growth factor-beta cDNA sequence and expression in tumour cell lines", Nature, vol. 316, pág. 701-705 (1985). Se ha aislado el TGF-\beta_{2} de los osteocitos bovinos, de las células del glioblastoma humano y de los trombocitos de cerdo. También se ha clonado el TGF-\beta_{3}. Véase ten Dijke et al., "Identification of a new member of the transforming growth factor-\beta gene family", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 85, pág. 4715-4719 (1988).

Una proteína quimérica TGF-\beta/PME incorpora las actividades conocidas de los TGF-\beta y proporciona un soporte integral o sustrato de la PME tal y como se describió anteriormente para producir una composición que además proporciona una administración focalizada de liberación prolongada en los sitios de destino.

La porción TGF-\beta y la porción PME están unidas opcionalmente mediante secuencias conectoras aminoacídicas. Las secuencias conectoras se pueden elegir según las propiedades específicas que confieren a la proteína quimérica. Por ejemplo, las secuencias aminoacídicas tales como Ile-Glu-Glyn-Arg y Leu-Val-Pro-Arg son escindidas por las enzimas Factor XA y trombina, respectivamente. La incorporación de secuencias que escinden las enzimas proteolíticas dentro de la proteína quimérica facilita la escisión en el sitio conector al exponerlo a la enzima adecuada y la separación de los dominios en entidades diferentes. La figura 15 describe una secuencia de aminoácidos para la proteína quimérica TGF-\beta_{1}/colágeno IA (SEQ ID n.º 8). La secuencia de aminoácidos ilustrada incluye el dominio de colágeno (1-1057) y la forma madura del TGF-\beta_{1} (1060-1171).

Una construcción de ADN quimérico incluye un gen que codifica el TGF-\beta_{1}, o un fragmento del mismo, o un gen que codifica el TGF-\beta_{2}, o un fragmento del mismo, o un gen que codifica el TGF-\beta_{3}, o un fragmento del mismo, ligado a una secuencia de ADN que codifica una proteína PME tal como colágeno (I-IV), fibrina, fibrinógeno, fibronectina, elastina o laminina. Una construcción de ADN quimérico preferida combina el ADN que codifica el TGF-\beta_{1}, una secuencia conectora de ADN y un ADN que codifica el colágeno IA. Una construcción de ADN quimérico que contiene el gen del TGF-\beta_{1} y un gen del colágeno I (\alpha_{1}) se muestra en las figuras 16A-16C (SEQ ID n.º 9). La construcción ilustrada incluye una secuencia conectora XmnI (pb de 1 a 19), el ADN que codifica un dominio de colágeno (pb 20-3190), una secuencia conectora BgIII (pb de 3191-3196), el ADN que codifica una forma madura del TGF-\beta_{1} (3197-3535) y una secuencia conectora XbaI (pb de 3536 a 3541).

La secuencia codificante de la PME se puede ligar cadena arriba y/o abajo y en fase con una secuencia que codifique el TGF-\beta. El ADN que codifica la proteína de la matriz extracelular puede codificar una porción de un fragmento de la PME o puede codificar toda la PME. Así mismo, el ADN que codifica el TGF-\beta puede ser uno o más fragmentos del mismo o todo el gen. Además, dos o más TGF-\beta diferentes o dos o más PME diferentes se pueden ligar cadena arriba o cadena abajo a porciones alternativas.

En otra realización, un resto de proteoglicano de dermatán-sulfato, también conocido como decorina o proteoglicano II, se une covalentemente con una PME para formar una proteína quimérica. Se sabe que la decorina se une al colágeno de tipo I y, de este modo, altera la formación de la fibrilla, y que inhibe la actividad promotora de la adhesión celular del colágeno y el fibrinógeno uniéndose a tales moléculas cerca de sus sitios de unión en la célula. Las proteínas quiméricas que contienen un resto de decorina actúan reduciendo la cicatriz del tejido que se está regenerando. La estructura primaria de la proteína central de la decorina se ha deducido a partir del ADNc clonado. Véase Krusius et al., "Primary structure of an extracellular matrix proteoglycan core protein-deduced from cloned cDNA", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 83, pág. 7683-7687 (1986).

Una proteína quimérica decorina/PME incorpora las actividades conocidas de la decorina y proporciona un soporte integral o sustrato de la PME tal y como se describió anteriormente para producir una composición que permite la administración focalizada de liberación prolongada en los sitios de destino. Las figuras 17A a 17B ilustran una proteína quimérica decorina/colágeno IA (SEQ ID n.º 10) en la que el dominio de colágeno incluye los aminoácidos 1 a 1057 y la proteína madura de la decorina incluye los aminoácidos 1060 a 1388. La figura 18 ilustra una proteína quimérica péptido de decorina/colágeno IA (SEQ ID n.º 11) en la que el dominio helicoidal del colágeno incluye los aminoácidos 1 a 1057 y el fragmento peptídico de la decorina incluye los aminoácidos 1060 a 1107. El fragmento peptídico de la decorina está compuesto por P46 a G93 de la forma madura de la decorina.

Además, se da a conocer la construcción de ADN quimérico que incluye un gen que codifica la decorina o uno o más fragmentos de la misma, opcionalmente ligado mediante una secuencia conectora de ADN a una secuencia de ADN que codifica una PME tal como colágeno (I-IV), fibrina, fibrinógeno, fibronectina, elastina o laminina. Una construcción de ADN quimérico preferida combina un ADN que codifica la decorina, una secuencia conectora de ADN y un ADN que codifica el colágeno I (\alpha1). Una construcción de ADN quimérico que contiene un gen de decorina y un gen de colágeno I (\alpha1) se muestra en las figuras 19A a 19D (SEQ ID n.º 12). La construcción ilustrada incluye una secuencia conectora XmnI (pb de 1 a 19), un ADN que codifica un dominio de colágeno (pb 20 a 3190), una secuencia conectora BglII (pb 3191 a 3196), un ADN que codifica una forma madura de la decorina (pb 3197 a 4186) y una secuencia conectora PstI. Una construcción de ADN quimérico que contiene el gen de un péptido de la decorina y un gen del colágeno I (\alpha1) se muestra en las figuras 20A a 20C (SEQ ID n.º 13). La construcción ilustrada incluye una secuencia conectora XmnI (pb 1 a 19), un ADN que codifica un dominio de colágeno (pb 20 a 3190), una secuencia conectora BgIII (pb 3191 a 3196), un ADN que codifica un fragmento del péptido de la decorina (pb 3197 a 3343) y una secuencia conectora PstI (pb 3344 a 3349).

La secuencia codificante de una PME se puede ligar cadena arriba y/o cadena abajo y en fase con una secuencia codificante de la decorina. El ADN que codifica la PME puede codificar una porción o fragmento de la PME o puede codificar toda la PME. Asimismo, el ADN que codifica la decorina puede ser una fragmento del mismo o todo el gen. Además, dos o más PME diferentes se pueden ligar cadena arriba y/o abajo a partir del ADN que codifica el resto decorina.

Cualquiera de las construcciones de ADN quimérico descritas anteriormente se puede incorporar en un vector de clonación adecuado. La figura 21 describe un vector de clonación pMal que contiene un sitio de clonación múltiple. Ejemplos de vectores de clonación son los plásmidos pMal-p2 y pMal-c2 (disponibles comercialmente de New England Biolabs). La construcción del ADN quimérico deseada se incorpora en una secuencia policonectora del plásmido que contiene ciertos sitios de endonucleasas de restricción útiles que se describen en la figura 22 (SEQ ID n.º 14). La secuencia policonectora de pMal-p2 tiene los sitios de las endonucleasas de restricción XmnI, EcoRI, BamHI, HindIII, XbaI, SalI y PstI que se representan en la figura 22. La secuencia policonectora se digiere con una endonucleasa de restricción adecuada y la construcción quimérica se incorpora en el vector de clonación al ligarla a las secuencias de ADN del plásmido. La construcción del ADN quimérico se puede unir al plásmido mediante la digestión de los extremos de la construcción de ADN y el plásmido con la misma endonucleasa de restricción para generar "extremos cohesivos" que tengan grupos fosfato en 5' y grupos hidroxilo en 3' que permitan que la construcción de ADN se hibride con el vector de clonación. A continuación, los huecos entre la construcción de ADN introducida y el plásmido se cierran con la ADN ligasa. Otras técnicas para incorporar la construcción de ADN en el ADN del plásmido incluyen la ligación de extremos romos, técnicas de adición de colas de poli(dA.dT), y el uso de conectores sintetizados químicamente. Un método alternativo para introducir la construcción de ADN quimérico en un vector de clonación es incorporar el ADN que codifica la proteína de la matriz extracelular en un vector de clonación que ya contiene un gen que codifica una porción terapéuticamente activa.

Los sitios de clonación en el sitio del policonector identificado anteriormente permiten introducir el ADNc para la proteína quimérica colágeno I (\alpha1)/BMP-2B ilustrada en las figuras 14A a 14C (SEQ ID n.º 7) entre los sitios XmnI y HindIII. El ADNc que codifica la proteína colágeno I (\alpha1)/TGF-\beta_{1} ilustrada en las figuras 16A a 16C (SEQ ID n.º 9) se introduce entre los sitios XmnI y XbaI. El ADNc que codifica la proteína colágeno I (\alpha_{1})/decorina que se ilustra en las figuras 19A a 19D (SEQ ID n.º 12) se introdujo entre los sitios XmnI y PstI. El ADNc que codifica el colágeno I (\alpha1)/péptido de decorina ilustrado en las figuras 20A a 20C (SEQ ID n.º 13) se introduce entre los sitios XmnI y PstI.

Los plásmidos que contienen la construcción de ADN quimérico se identifican mediante técnicas estándares tales como electroforesis en gel. Los procedimientos y materiales para la preparación de vectores recombinantes, la transformación de las células hospedadoras con los vectores y la expresión en las células hospedadoras de los polipéptidos se describen en Sambrook et al., "Molecular cloning: a laboratory manual", véase más arriba. Generalmente, las células hospedadoras procariotas o eucariotas se pueden transformar con los plásmidos de ADN recombinante. Las células hospedadoras transformadas se pueden localizar mediante la selección fenotípica de los genes del vector de clonación que proporcionan resistencia a un antibiótico determinado cuando las células hospedadoras se hacen crecer en un medio de cultivo que contiene ese antibiótico.

Las células hospedadoras transformadas se aíslan y se cultivan para favorecer la expresión de la proteína quimérica. Luego, la proteína quimérica se puede aislar y purificar del medio de cultivo mediante diferentes métodos tales como diálisis, centrifugación en gradiente de densidad, cromatografía líquida en columna, precipitación isoeléctrica, fraccionamiento del disolvente y electroforesis. No obstante, se prefiere la purificación de la proteína quimérica mediante cromatografía de afinidad, por medio de lo cual la proteína quimérica se purifica al ligarla a una proteína de unión y al ponerla en contacto con un ligando o sustrato por el que la proteína de unión tiene una afinidad específica.

Para obtener una expresión más eficaz de los genes eucarióticos de los mamíferos o de los humanos en las bacterias (procariotas), el gen de mamífero o de humano se puede colocar bajo el control de un promotor bacteriano. Se utiliza un sistema de fusión y purificación de proteínas para obtener la proteína quimérica. Preferiblemente, cualquiera de las construcciones de ADN quimérico descritas más arriba se clona en un vector pMal en un sitio en la secuencia policonectora del vector. Como resultado, la construcción del ADN quimérico está fusionada operativamente con el gen malE del vector pMal. El gen malE codifica la proteína de unión a la maltosa (MBP). La figura 23 representa un vector de clonación pMal que contiene una construcción del ADN de BMP/colágeno. Una secuencia espaciadora que codifica 10 restos de asparragina se localiza entre la secuencia de malE y la secuencia policonectora. Esta secuencia espaciadora aísla la MBP de la proteína de interés. Las figuras 24, 25 y 26 representan los vectores de clonación pMal que contienen el ADN que codifica quimeras de colágeno con TGF-\beta_{1}, decorina y un péptido de decorina, respectivamente. El vector pMal que contiene cualquiera de las construcciones de ADN quimérico fusionadas con el gen malE se transforma en E. coli.

Se cultiva E. coli en un medio que induce a la bacteria a producir la proteína de unión a la maltosa fusionada a la proteína quimérica. Esta técnica utiliza el promotor P_{tac} del vector pMal. La MBP contiene una secuencia señal en el extremo amino de 26 aminoácidos que hace que la proteína quimérica de MBP atraviese la membrana citoplasmática de E. coli. A continuación, la proteína se puede purificar a partir del periplasma. Alternativamente, se puede utilizar el vector de clonación pMal-c2 con este sistema de fusión y purificación de proteínas. El vector pMal-c2 contiene una deleción exacta de la secuencia señal de malE que da lugar a la expresión citoplasmática de la proteína de fusión. Se prepara un extracto celular bruto que contiene la proteína de fusión y se vierte sobre una columna con resina de amilosa. Como la MBP tiene afinidad por la amilosa, se une a la resina. Alternativamente, la columna puede incluir cualquier sustrato por el que la MBP tenga una afinidad específica. Las proteínas no deseadas presentes en el extracto bruto se lavan de la columna. La MBP fusionada con la proteína quimérica se eluye de la columna con un tampón neutro que contiene maltosa o una disolución diluida de otro agente de desorción para desplazar el polipéptido híbrido. La proteína quimérica de la MBP purificada se escinde con una proteasa tal como la proteasa factor Xa para escindir la MBP de la proteína quimérica. El plásmido mMal-p2 tiene una secuencia que codifica el sitio de reconocimiento de la proteasa factor Xa que escinde detrás de la secuencia de aminoácidos isoleucina-ácido glutámico-glicina-arginina de la secuencia policonectora.

A continuación, se separa la proteína quimérica de la MBP escindida haciendo pasar la mezcla por una columna de amilosa. Un método alternativo para separar la MBP de la proteína quimérica es mediante cromatografía de intercambio iónico. Este sistema produce hasta 100 mg de MBP-proteína quimérica por litro de cultivo. Véase Riggs, P., en Ausebel, F. M., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. (eds.) "Current protocols in molecular biology", Supplement, 19 (16.6.1-16.6.10) (1990) Green Associates/Wiley Interscience, Nueva York, sistema de fusión y purificación de proteínas con pMal de New England Biolabs (n.º de catálogo 800-65S 9pMALc2) (véase también la patente europea n.º 286.239 que describe un método similar para producir y purificar una proteína tal como el colágeno).

Se pueden emplear otros sistemas de fusión y purificación de proteínas para producir proteínas quiméricas. Las procariotas tales como E. coli son células hospedadoras preferidas para la expresión de la proteína quimérica. Sin embargo, también son aceptables los sistemas que utilizan estirpes celulares hospedadoras eucariotas, tales como estirpes celulares de levadura, humanos, ratón, rata, hámster, mono, anfibio, insecto, algas y células vegetales. Por ejemplo, HeLa (célula epitelial humana), 3T3 (fibroblasto de ratón), CHO (células de ovario de hámster chino) y SP2 (célula plasmática de ratón) son estirpes celulares aceptables. Las células hospedadoras que se elijan en particular deben ser compatibles con el vector de clonación concreto que se elija.

Otro sistema de expresión de proteínas aceptable es el sistema de expresión de baculovirus fabricado por Invitrogen en San Diego, California. Los baculovirus forman oclusiones cristalinas notables dentro de los núcleos de las células que infectan. Cada oclusión cristalina consiste en numerosas partículas de virus envueltas en una proteína llamada polihedrina. En el sistema de expresión de baculovirus, el gen nativo que codifica la polihedrina se sustituye por una construcción de ADN que codifica una proteína o péptido que tiene una actividad deseada. A continuación, el virus produce grandes cantidades de la proteína codificada por la construcción del ADN extraño. El vector de clonación preferido para utilizar con este sistema es el pBlueBacIII (obtenido de Invitrogen de San Diego, California). El sistema de baculovirus utiliza promotor de la polihedrina regulado por el virus de la polihidrosis nuclear múltiple de Autograph californica (ACMNPV) para dirigir la expresión de los genes extraños. El gen quimérico, a saber, la construcción de ADN que codifica la proteína quimérica, se introduce en el vector pBlueBacIII inmediatamente detrás del promotor de la polihedrina del baculovirus.

El vector de transferencia pBlueBacIII contiene un gen indicador \beta-galactosidasa que permite la identificación del virus recombinante. El gen de la \beta-galactosidasa está dirigido por el promotor ETL del baculovirus (P_{ETL}) que está ubicado en orientación contraria al promotor de la polihedrina (P_{PH}) y el sitio de clonación múltiple del vector. Por lo tanto, el virus recombinante coexpresa la \beta-galactosidasa y el gen quimérico.

A continuación, células del insecto Spodoptera frugiperda (Sf9) se contransfectan con el ADN vírico de tipo salvaje y el vector pBlueBacIII que contiene el gen quimérico. Las secuencias recombinantes en el vector pBlueBacIII dirigen la integración del vector en el genoma del baculovirus de tipo salvaje. Se produce la recombinación homóloga, lo que da lugar al reemplazo del gen de la polihedrina nativa del baculovirus con la construcción del ADN que codifica la proteína quimérica. Los baculovirus de tipo salvaje que no contienen ADN extraño expresan la proteína polihedrina en los núcleos de las células de insecto infectadas. No obstante, los recombinantes no producen la proteína polihedrina y no producen las oclusiones víricas. En cambio, los recombinantes producen la proteína quimérica.

La estirpe celular de Sf21 derivada de Spodoptera frugiperda y las estirpes celulares High Five derivadas de Trichoplusia ni son células hospedadoras de insecto alternativas.

Otros vectores de clonación aceptables incluyen fagos, cósmidos o cromosomas artificiales. Por ejemplo, el bacteriófago lambda es un vector de clonación útil. Este fago puede aceptar porciones de ADN extraño de hasta 20.000 pares de bases de longitud. El genoma del fago lambda es una molécula lineal de ADN bicatenario con extremos (cohesivos) complementarios monocatenarios que pueden hibridarse entre sí cuando están dentro de una célula hospedadora infectada. El ADN del lambda se corta con una endonucleasa de restricción y el ADN extraño, por ejemplo, el ADN a clonar, se liga a los fragmentos del ADN del fago. Después, la molécula recombinante resultante se empaqueta en partículas de fago infecciosas. Las células hospedadoras se infectan con las partículas de fago que contienen el ADN recombinante. El ADN del fago se replica en la célula hospedadora para producir muchas copias de la secuencia del ADN deseado.

Los cósmidos son vectores híbridos plásmido/bacteriófago que se pueden utilizar para clonar fragmentos de ADN de unas 40.000 pares de bases. Los cósmidos son plásmidos que tienen una o más secuencias de ADN llamadas sitios "cos" derivadas del bacteriófago lambda para empaquetar el ADN del lambda en partículas de fago infecciosas. Se ligan dos cósmidos al ADN a clonar. La molécula resultante se empaqueta en partículas de fagos lambda infecciosas y se introducen por transfección en las células hospedadoras bacterianas. Cuando los cósmidos se encuentran dentro de la célula hospedadora, se comportan como plásmidos y se multiplican bajo el control de un origen de replicación del plásmido. El origen de replicación es una secuencia de ADN que permite que un plásmido se multiplique dentro de una célula hospedadora.

Los vectores de cromosomas artificiales de levadura son similares a los plásmidos pero permiten la incorporación de secuencias de ADN mucho mayores de unos 400.000 pares de bases. Los cromosomas artificiales de levadura contienen secuencias para la replicación en la levadura. El cromosoma artificial de levadura que contiene el ADN a clonar se introduce por transformación en las células de levadura, en las que se replica y de este modo produce muchas copias de la secuencia de ADN deseada. Cuando se empleen fagos, cósmidos o cromosomas artificiales de levadura como vectores de clonación, la expresión de la proteína quimérica se puede obtener cultivando las células hospedadoras que se han transfectado o transformado con el vector de clonación en un medio de cultivo
adecuado.

Las proteínas quiméricas descritas en la presente memoria se han diseñado para utilizarlas en el tratamiento de los mamíferos o de otros animales. Los restos terapéuticamente activos descritos anteriormente, por ejemplo, agentes osteógenos tales como las BMP, los TGF, la decorina, y/o fragmentos de cada uno de ellos, se debe considerar que se derivan o se han obtenido de agentes fisiológicamente activos para los propósitos de esta descripción. Las proteínas quiméricas y las construcciones de ADN que incorporan un dominio obtenido de uno o más agentes fisiológicamente activos se pueden utilizar para el tratamiento terapéutico in vivo, la investigación in vitro o para propósitos de diagnóstico en general.

Cuando se utilizan in vivo, las formulaciones que contienen las proteínas quiméricas de la presente invención se pueden poner en contacto con tejido viable, incluido el hueso, para inducir o potenciar el crecimiento, la reparación y/o el reemplazo de tal tejido. Esto se puede realizar aplicando una proteína quimérica directamente a un sitio de destino durante la operación quirúrgica. Se contempla que hay que utilizar técnicas mínimamente invasivas tales como la endoscopia para aplicar una proteína quimérica en una ubicación deseada. Las formulaciones que contienen las proteínas quiméricas descritas en la presente memoria pueden consistir únicamente en una o más proteínas quiméricas o también pueden incorporar uno o más adyuvantes farmacéuticamente aceptables.

Cualquiera de las proteínas quiméricas anteriormente descritas se puede poner en contacto con, adherir a, o si no incorporar a, un implante tal como un dispositivo de administración de fármacos o un dispositivo protésico. Las proteínas quiméricas pueden estar microencapsuladas o macronencapsuladas por liposomas u otros materiales formadores de membranas tales como los derivados del ácido algínico antes de la implantación y después de haberse implantado en forma de un implante bursiforme. Se puede microencapsular la proteína quimérica en estructuras en forma de esferas, agregados de material central incluido en un continuo de material de pared o diseños capilares. Se conocen bien las técnicas de microencapsulación en la técnica y se describen en la Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, vol. 9, pág. 724 y siguientes (1980).

Las proteínas quiméricas también se pueden cubrir con, o incorporar en, materiales útiles en medicina tales como mallas, almohadillas, fieltros, vendajes o dispositivos protésicos tales como férulas, agujas, placas óseas, articulaciones artificiales, extremidades artificiales o implantes de aumento óseo. Los implantes pueden, en parte, estar hechos de materiales biocompatibles tales como materiales a base de vidrio, metal, cerámica,fosfato de calcio o carbonato de calcio. Los implantes que tienen biomateriales biocompatibles se conocen bien en la técnica y todos son adecuados para ser utilizados en la presente memoria. Los biomateriales de implante derivados de fuentes naturales tales como fibras de proteínas, polisacáridos y tejidos tratados que se obtienen de forma natural se describen en la Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, vol. 2, pág. 267 y siguientes (1989). Los polímeros biocompatibles sintéticos se conocen bien en la técnica y también son materiales de implante adecuados. Ejemplos de polímeros sintéticos adecuados incluyen uretanos, olefinas, tereftalatos, acrilatos, poliésteres y similares. Otros materiales de implante aceptables son hidrogeles biodegradables o agregados de partículas muy empaquetadas tal como perlas de polimetilmetacrilato con un revestimiento de hidroxietil-metacrilato polimerizado. Véase la Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, vol. 2, pág. 267 y siguientes (1989).

La proteína quimérica de la presente memoria proporciona una manera útil de inmovilizar o recubrir un agente fisiológicamente activo en un vehículo farmacéuticamente aceptable para administrar el agente fisiológicamente activo a los sitios deseados en el tejido viable. Los vehículos adecuados incluyen los hechos de polímeros bioabsorbibles, polímeros no absorbibles biocompatibles, masilla de lactona y yeso. Ejemplos de polímeros bioabsorbiles y biocompatibles adecuados incluyen homopolímeros, copolímeros y mezclas de hidroxiácidos tales como lactido y glicolido, otros polímeros absorbibles que se pueden utilizar solos o en combinación con hidroxiácidos incluidas las dioxanonas, carbonatos tales como carbonato de trimetileno, lactonas tales como caprolactona, polioxialquilenos y oxilatos. Véase la Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, vol. 2, página 230 y siguientes (1989).

Estos vehículos pueden estar en forma de perlas, partículas, masilla, revestimientos o vehículos peliculados. Sistemas de difusión en los que un núcleo de la proteína quimérica está rodeado por una capa de membrana porosa y otros vehículos aceptables.

En otro aspecto, la cantidad del(de los) análogo(s) del aminoácido transportado dentro de una célula de destino se puede regular controlando la tonicidad del medio de crecimiento. Un medio de crecimiento hipertónico aumenta la captación de la trans-4-hidroxiprolina en E. coli tal y como se ilustra en la figura 2A. Todos los medios conocidos que aumentan la osmolaridad de los medios de crecimiento son adecuados para su uso en la presente memoria, incluidas la adición de sales tales como cloruro de sodio, KCl, MgCl_{2} y similares, y azúcares tales como sacarosa, glucosa, maltosa, etc., y polímeros tales como polietilenglicol (PEG), dextrano, celulosa, etc, y aminoácidos tales como glicina. Al aumentar la osmolaridad del medio de crecimiento se obtiene una mayor concentración intracelular de(de los) análogo(s) del aminoácido y a un mayor grado de complejación de(de los) análogo(s) del aminoácido a ARNt. Como consecuencia, las proteínas producidas por la célula consiguen un mayor grado de incorporación de análogos de aminoácidos. La figura 12 ilustra el porcentaje de incorporación de la prolina y la hidroxiprolina en la MBP en las condiciones de medio isotónico e hipertónico en comparación con la prolina en la MBP nativa. Así, la manipulación de la osmolaridad, además del ajuste de la concentración del(de los) análogo(s) del aminoácido en los medios de cultivo, permite un enfoque de doble acción para regular su captación en las células procariotas y las células eucariotas tal y como se describió anteriormente, y la consiguiente incorporación en los polipéptidos de
destino.

Se puede utilizar cualquier medio de crecimiento en la presente memoria, incluidos los medios disponibles comercialmente tales como el medio mínimo M9 (disponible de Gibco Life Technologies, Inc.), medio LB, medio NZCYM, caldo tremendo, medio SOB y otros que se conocen bien en la técnica.

El colágeno de diferentes tejidos puede contener diferentes cantidades de trans-4-hidroxiprolina. Por ejemplo, los tejidos que requieren una mayor resistencia como el hueso contienen un mayor número de restos de trans-4-hidroxiprolina que el colágeno de los tejidos que requieren menos resistencia, por ejemplo, la piel. El sistema de la presente invención proporciona un método para ajustar la cantidad de la trans-4-hidroxiprolina en el colágeno, los fragmentos de colágeno, los péptidos similares al colágeno y los péptidos quiméricos anteriores que tienen un dominio de colágeno, un dominio de fragmento de colágeno o un dominio peptídico similar al colágeno fusionado a un dominio fisiológicamente activo, ya que al aumentar o disminuir la concentración de la trans-4-hidroxiprolina en el medio de cultivo, la cantidad de trans-4-hidroxiprolina que se incorpora en tales polipéptidos aumenta o disminuye en consecuencia. El colágeno, los fragmentos de colágeno, los péptidos similares al colágeno y los péptidos quiméricos anteriores se pueden expresar con niveles predeterminados de trans-4-hidroxiprolina. De este modo, se pueden ajustar las características físicas de una matriz extracelular según los requisitos del uso final. Sin desear unirse a ninguna teoría particular, se cree que la incorporación de la trans-4-hidroxiprolina en los restos de la PME en la presente memoria proporciona una base para la autoagregación tal y como se describe en la presente
memoria.

En otro aspecto, la combinación de la incorporación de la trans-4-hidroxiprolina en colágeno y fragmentos del mismo, utilizando medio hiperosmótico y genes que se han alterado de tal forma que el uso de codones refleje lo mejor posible el encontrado en E. coli, pero conservando la secuencia de aminoácidos encontrada en el colágeno humano nativo, dio lugar sorprendentemente a la producción por E. coli de colágeno humano y fragmentos del mismo que eran capaces de autoagregarse.

La secuencia del gen del colágeno humano de tipo I (\alpha_{1}) (figuras 27A a 27E) (SEQ ID n.º 15) contiene un gran número de codones de glicina y prolina (347 codones de glicina y 240 codones de prolina) dispuestos de una manera muy repetitiva. La tabla I de más abajo muestra la frecuencia de codones para el gen del colágeno humano de tipo I (\alpha_{1}). Es interesante resaltar que el codón de la glicina GGA aparece 64 veces y el codón CCC de la prolina aparece 93 veces. Ambos codones se consideran codones poco frecuentes en E. coli. Véase, Sharp, P. M. y W.-H. Li. Nucleic Acids Res. 14: 7737-7749, 1986. Estas y otras consideraciones similares sobre otros genes del colágeno humano se muestran en la presente memoria para explicar lo difícil que resulta expresar los genes del colágeno humano en E. coli.

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TABLA 1

1

2

En una primera etapa, la secuencia del gen del colágeno heterólogo se cambia para reflejar el sesgo de codones de E. coli tal y como se expone en las tablas del uso de codones [por ejemplo, Ausubel et al., (1995) Current protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, Nueva York; Wada et al., 1992, véase más arriba]. Se evitan los codones poco frecuentes en E. coli (véase, Sharp, P. M y W,-H. Li. Nucleic Acid Res. 14: 7737-7749, 10986). Segundo, se eligen sitios únicos de enzimas de restricción que estén ubicados aproximadamente cada 120-150 pares de bases en la secuencia. En algunos casos, esto comporta alterar la secuencia nucleotídica pero no cambia la secuencia de aminoácidos. Tercero, se sintetizan oligonucleótidos de unos 80 nucleótidos de tal forma que cuando dos oligonucleótidos de estos se hibridan entre sí y se extienden con una ADN polimerasa, reconstruyen una sección de unos 120 a 150 pares de bases del gen (figura 28). La sección del gen que codifica la porción del extremo amino de la proteína tiene un codón de metionina (ATG) iniciador en el extremo 5' y un sitio de restricción único seguido de una señal de parada (TAAT) en el extremo 3'. Las secciones restantes tienen sitios de restricción únicos en el extremo 5' y sitios de restricción únicos seguidos de una señal de parada TAAT en el extremo 3'. El gen se ensambla mediante la adición secuencial de cada sección a la sección 5' precedente. De este modo, cada sección sucesivamente mayor se puede construir y expresar independientemente. La figura 28 es una representación esquemática de la construcción del gen del colágeno humano iniciada a partir de oligonucleótidos sintéticos.

Se preparó un fragmento de la cadena de colágeno humano de tipo I (\alpha1) unido al extremo carboxilo de la glutatión S-transferasa (GST-D4, figura 29) (SEQ ID N.º 18) y se comprobó su expresión en la cepa JM109 (F^{-}) de E. coli en condiciones de choque hiperosmótico. El fragmento de colágeno incluía los 193 aminoácidos del extremo carboxilo de la región que forma hélices triples y el telopéptido del extremo carboxilo de 26 aminoácidos. La figura 29 es un esquema de la secuencia de aminoácidos de las proteínas de fusión GST-ColECol (SEQ ID n.º 17) y GST-D4 (SEQ ID n.º 18). ColECol comprende el telopéptido del extremo amino de 17 aminoácidos, los 338 tripéptidos repetidos Gly-X-Y, y el telopéptido del extremo carboxilo de 26 aminoácidos. Hay una única metionina en la unión de GST y D4, seguida de 64 repeticiones Gly-X-Y y del telopéptido de 26 aminoácidos. Se indica el resto (Phe199) en el telopéptido carboxiterminal de D4 donde corta la pepsina. El gen del fragmento de colágeno se sintetizó a partir de oligonucleótidos sintéticos diseñados para reflejar el uso óptimo de codones de E. coli. La figura 30 es una tabla que describe la aparición de cuatro codones de prolina y de cuatro codones de glicina en el gen humano de tipo I (\alpha1) (HCol) y en el gen de tipo I (\alpha1) con el uso de codones optimizado para E. coli (ColECol). El uso de los codones restantes en ColECol también se optimizó para la expresión de E. coli según Wada et al., véase más arriba. Tal y como se describe en Wada et al., las características del uso de codones de un amplio margen de organismos, así como virus y orgánulos, estando disponible la frecuencia (por miles) del uso de codones en cada organismo para el cual hay disponibles más de 20 genes, se calculan mediante la suma de los números del uso de codones. La proteína GST-D4 se expresó de manera eficaz en JM109 (F^{-}) en medio mínimo que carece de prolina pero complementado con Hyp y NaCl (véanse las figuras 31 y 32). La expresión fue dependiente de la inducción con isopropil-1-tio-\beta-galactopiranósido (IPTG), trans-4-hidroxiprolina y NaCl. A una concentración fija de NaCl de 500 mM, la expresión fue mínima a concentraciones de trans-4-hidroxiprolina por debajo de \sim20 mM mientras que el nivel de expresión se saturó a concentraciones de trans-4-hidroxiprolina por encima de 40 mM. Véase la figura 31, que representa un gel que muestra la expresión de GST-D4 y lo que la expresión de ésta depende de la hidroxiprolina. La concentración de hidroxiprolina se indica encima de cada calle. Se añadió el osmolito (NaCl) a 500 mM en cada cultivo y cada uno se indujo con IPTG a 1,5 mM. La flecha marca la posición de la GST-D4. Así mismo, a una concentración fija de trans-4-hidroxiprolina de 40 mM, las concentraciones de NaCl por debajo de 300 mM dieron lugar a poca acumulación de proteínas y la expresión disminuyó por encima de NaCl a 700-800 mM. Véase la figura 32, que representa un gel que muestra la expresión de la GST-D4 en un medio hiperosmótico. Las calles 2 y 3 son muestras sin inducir e inducidas, respectivamente, cada una sin la adición del osmolito. La identidad y la cantidad de osmolito está indicada encima de cada una de las calles. Se añadió la trans-4-hidroxiprolina a 40 mM en cada cultivo y todos los cultivos salvo el cultivo en la calle 1 se indujeron con IPTG a 1,5 mM. La flecha marca la posición de la GST-D4.

Para hacer de osmolito, tanto la sacarosa como el KCI se pueden sustituir al NaCl (véase, la figura 32). Así, la acumulación intracelular mediada por el choque osmótico de la trans-4-hidroxiprolina fue un determinante decisivo de la expresión en vez de la identidad química precisa del osmolito. A pesar del gran número de prolinas (66) en la OST-D4, su tamaño (46 kDa) y las condiciones de crecimiento no óptimas, se expresó al \sim10% de la proteína celular total. Las proteínas expresadas menores de la longitud total son indicativas de que no se detectó la transcripción o que se abortó la traducción, o la inestabilidad del ARNm.

Tal como se describe en Wada et al., las características del uso del codón de un amplio intervalo de organismos, así como virus y orgánulos, la frecuencia (por mil) de uso del codón en cada organismo por la cual más de 20 genes están disponibles, tienen que ser calculadas recapitulando números del uso del codón.

El gen de la proteína D4 contiene 52 codones de prolina. En los experimentos de expresión reflejados en las figuras 31 y 32, se esperaba que la trans-4-hidroxiprolina se introdujera en cada uno de estos codones, dando lugar a una proteína en la que la trans-4-hidroxiprolina había sustituido todas las prolinas. Para confirmar esto, se escindió la GST-D4 con BrCN en HCl a 0,1 N por las metioninas de la GST y en la única metionina del extremo amino de D4, y se purificó D4 mediante HPLC de fase inversa. Se disolvió la GST-D4 bruta en HCl a 0,1 M en un matraz con fondo redondo con agitación. Después de añadir un exceso molar de 2 a 10 veces de BrCN cristalino transparente, se evacuó el matraz y se llenó con nitrógeno. Se dejó que la escisión tuviera lugar durante 24 horas, tras lo cual se retiró el disolvente al vacío. Se disolvió el residuo en ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1% y se purificó mediante HPLC de fase inversa utilizando una columna de RP-HPLC RP de Vydac (10 x 250 mm, 5 \mu, 300 \ring{A}) en un sistema BioCad Sprint (Perceptive Biosystems, Framingham, MA). Se eluyó D4 con un gradiente de acetonitrilo del 15 al 40%/TFA al 0,1% durante 45 minutos. Se eluyó la D4 como un solo pico en acetonitrilo al 26%/TFA al 0,1%. Las condiciones de escisión con BrCN estándares (ácido fórmico al 70%) dieron lugar a una extensa formilación de D4, presumiblemente en los grupos hidroxilo de los restos de trans-4-hidroxiprolina. La formilación de proteínas escindidas en BrCN/ácido fórmico se había observado con anterioridad [Beavis et al., Anal. Chem., 62, 1836 (1990)]. Se llevó a cabo el análisis de los aminoácidos en un instrumento de intercambio de iones de Beckman con derivación poscolumna. Se secuenció el extremo amino en un secuenciador de Applied Biosystems equipado con un sistema de HPLC en línea. Se obtuvieron espectros de masa por electropulverización con un analizador cuadrúpolo VG Biotech BIO-Q de M-Scan, Inc. (West Chester, PA). Para las fusiones térmicas para el DC, se aumentó la temperatura en incrementos de 0,5ºC desde 4ºC hasta 85ºC con un equilibrio de cuatro minutos entre las etapas. Se registraron los datos a 221,5 nm. Se calculó la transición térmica utilizando el programa ThermoDyne (MORE). La espectroscopia de masas por electropulverización de esta proteína proporcionó un único ion molecular que corresponde a una masa de 20.807 Da. Esta masa se encuentra dentro del 0,05% de lo esperado para D4 si contiene un 100% de trans-4-hidroxiprolina en vez de prolina. No se detectó prolina en el análisis de aminoácidos de la D4 purificada, lo que de nuevo era coherente con la sustitución completa de la prolina por la trans-4-hidroxiprolina. Para confirmar adicionalmente que la sustitución con trans-4-hidroxiprolina se había producido solamente en los codones de prolina, se secuenciaron como antes los 13 aminoácidos del extremo amino de D4. Los 13 primeros codones de D4 especifican la secuencia de la proteína H_{2}N-Gly-Pro-Pro-Gly-Leu-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Ser-Gly (SEQ ID n.º 41). La secuencia encontrada era H_{2}N-Gly-Hyp-Hyp-Gly-Leu-Ala-Gly-Hyp-Hyp-Gly-Glu-Ser-Gly (SEQ ID n.º 42), véase la figura 69. En conjunto, estos resultados indican que se introdujo la trans-4-hidroxiprolina (Hyp) sólo en los codones de prolina y que la fidelidad de la maquinaria traduccional de E. coli no se alteró de ningún modo, bien mediante la elevada concentración intracelular de la trans-4-hidroxiprolina, o bien por las condiciones hiperosmóticas del cultivo.

Para determinar si D4, que contiene la trans-4-hidroxiprolina en las posiciones X e Y, forma hélices homotriméricas y para comparar la estabilidad con el colágeno nativo, se observó lo siguiente: en un tampón fosfato de pH neutro, D4 muestra un espectro de dicroísmo circular (DC) característico de una hélice triple [véase la figura 33 y Bhatnagar et al., Circular Dichroism and the conformational analysis of biomolecules, G. D. Fasman, Ed. Plenum Press, Nueva York, (1996, página 183)]. La figura 33 ilustra el espectro de dicroísmo circular de la D4 nativa y desnaturalizada por calor en tampón fosfato neutro. La D4 purificada por HPLC se disolvió en fosfato de sodio a 0,1 M, pH 7,0, a una concentración final de 1 mg/ml (E^{280} = 3628 M^{-1} cm^{-1}). Se incubó la disolución a 4ºC durante dos días para permitir que se formaran hélices triples antes del análisis. Se obtuvieron espectros en un espectropolarímetro Aviv modelo 62DS (Universidad de Yale, Molecular Biophysics and Biochemistry Department). Se utilizó una cubeta de cuarzo Suprasil para fluorímetro de una longitud de paso de 1 mm. Después de incubar 10 minutos a 4ºC, se registraron los espectros a las longitudes de onda estándares desde 260 a 190 nm utilizando un tiempo de adquisición de 10 segundos y un intervalo de escaneo de 0,5 nm. Este espectro se caracteriza por una elipticidad negativa a 198 nm y una elipticidad positiva a 221 nm. Las magnitudes de ambas absorbencias fueron mayores en el tampón de pH neutro en comparación con las condiciones ácidas. Se ha observado una dependencia comparable del pH en relación con la estabilidad para las hélices triples similares al colágeno. Véase, por ejemplo, Venugopal et al., Biochemistry, 33, 7948 (1994). El calentamiento a 85ºC durante 5 minutos antes de obtener el espectro de DC disminuyó la magnitud de la absorbencia a 198 nm y eliminó la absorbencia a 221 nm (figura 33). Este comportamiento también es característico de la estructura helicoidal triple del colágeno. Véase, R. S. Bhatnagar et al., Circular dichroism and the conformational analysis of biomolecules, G. D. Fasman, Ed. véase más arriba. Una curva de fusión térmica de D4 realizada como anteriormente en tampón fosfato proporcionó una temperatura de fusión de unos 29ºC. Un fragmento de la región del extremo carboxilo de la cadena de colágeno bovino de tipo I (\alpha_{1}) de loingitud comparable a D4 forma hélices homotriméricas con una temperatura de fusión de 26ºC (véase A. Rossi et al., Biochemistry 35, 6048, (1996)].

La resistencia a la digestión de la pepsina es una segunda indicación de la estructura helicoidal triple que se utiliza con frecuencia. A 4ºC, la mayor parte de D4 se digiere rápidamente con pepsina hasta dar una proteína de masa molecular ligeramente inferior. La figura 34 es un gel que ilustra el resultado de la digestión de D4 con la pepsina bovina. Se disolvió la D4 purificada en fosfato de sodio a 0,1 M, pH 7,0, a 1,6 \mug/\mul y se incubó a 4ºC durante 7 días. Se colocaron alícuotas (10 \mul) en tubos de centrifugación de 1,5 ml y se ajustaron con agua y disoluciones de ácido acético a 1 M para dar un volumen final de 25 \mul y una concentración de ácido acético final de 200 mM. A continuación, cada tubo se incubó durante 20 minutos a la temperatura indicada y se le añadió pepsina (0,5 \mul de una disolución a 0,25 \mug/\mul) a cada tubo y se dejó continuar la digestión durante 45 minutos. Después de la digestión, se detuvo la reacción con tampón de carga y se analizó mediante SDS-PAGE. Sin embargo, el producto inicial de escisión de la pepsina es resistente a una digestión posterior de hasta \sim30ºC. La secuenciación como antes del extremo amino del producto inicial de escisión de la pepsina demostró que el extremo amino era idéntico al de la D4 completa. El análisis como antes de los espectros de masa del producto de la digestión proporcionó un ion progenitor con una masa molecular coherente con la escisión por el telopéptido del extremo carboxilo en el lado del extremo amino de la Phe119 (véase la figura 29), lo que sugiere que esta porción de la proteína es globular o con una estructura mal definida y que se escinde rápidamente con la pepsina mientras que la región helicoidal triple es resistente a la digestión. Por lo tanto, a pesar de la sustitución global de la trans-4-hidroxiprolina por las prolinas en las posiciones X e Y, la D4 formó hélices triples que tenían una estabilidad similar en comparación con los fragmentos de dimensiones similares del colágeno bovino que contiene Hyp en un porcentaje normal y sólo en la posición Y.

La cadena del colágeno humano de tipo I \alpha1 completo, aunque de un tamaño 4 veces el de D4, también se expresaba como una fusión en el extremo amino con GST (GST-ColECol, figura 29) en JM109 (F^{-}) en medio Hyp/NaCl. La figura 35 es un gel que representa la expresión de GST-HCol y GST-ColECol. Se añadió la trans-4-hidroxiprolina a 40 mM y el NaCl a 500 mM. Se indujo la expresión con IPTG a 1,5 mM. La flecha marca la posición de GST-ColECol. En los procedimientos que dan lugar a los geles mostrados en las figuras 31, 32 y 35, se hicieron crecer durante una noche, en medio LB con ampicilina a 100 \mug/ml, cultivos de 5 ml de JM109 (F^{--}) que albergan el plásmido de expresión. Se centrifugaron los cultivos y se lavaron dos veces los sedimentos celulares con 5 ml de medio M9/Amp [véase, J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A laboratory manual. (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989)] complementado con glucosa al 0,5% y 100 \mug/ml de todos los aminoácidos, salvo glicina y alanina que se encontraban a 200 \mug/ml, y sin prolina. Finalmente, se resuspendieron las células en 5 ml del medio anteriormente citado. Después de la incubación a 37ºC durante 30 minutos, se añadieron hidroxiprolina, osmolito o IPTG como se indicó. Después de 4 horas, se analizaron alícuotas de los cultivos mediante SDS-PAGE.

Al igual que con D4, se construyó el gen para la proteína ColECol a partir de los oligonucleótidos sintéticos diseñados para imitar el uso de codones de los genes que se expresaban mucho en E. coli. A diferencia de GST-ColECol, la expresión a partir de la fusión GST-gen humano de tipo I \alpha1 (pHCol) idéntica a GST-ColECol en la secuencia de aminoácidos codificada, pero que contiene la distribución de codones humanos, no se pudo detectar en geles de SDS-PAGE teñidos con azul de Coomassie con lisados totales de células de cultivos de JM109 (F^{-})/pHCol inducidos (figura 35). El gen para el polipéptido del colágeno de tipo I \alpha1 se clonó mediante la reacción en cadena de la polimerasa a partir del ARNm del gen aislado de las células de prepucio humano (HS27, ATCC 1634) con cebadores diseñados de la secuencia publicada del gen (GenBank Z74615). El cebador en 5' añadió un sitio de reconocimiento EcoRI flanqueante y el cebador en 3' un sitio de reconocimiento HindIII flanqueante. Se clonó el gen en el sitio EcoRI/HindIII del plásmido pBSKS^{+} (Stratagene, La Jolla, CA), se corrigieron 4 mutaciones utilizando el kit de mutagénesis ExSite (Stratagene, La Jolla, CA), se confirmó la secuencia mediante secuenciación por didesoxinucleótidos y, finalmente, se subclonó el fragmento EcoRI/XhoI en el plásmido pGEX-4T.1 (Pharmacia, Piscataway, NJ). El gen GST-HCol se puede expresar porque se detecta una proteína de la misma masa molecular que GST-ColECol cuando se rastrean inmunotransferencias de lisados totales de células con un anticuerpo de anti-colágeno de tipo I. Así, las diferencias de secuencia o estructurales entre los genes ColECol y HCol son determinantes decisivos de la eficacia de la expresión en E. coli. Esto se debe seguramente a la distribución de los codones en estos genes y en última instancia a las diferencias en los niveles de los ARNt isoaceptores en E. coli en comparación con los humanos. GST-ColECol, GST-D4 y GST-HCol no se acumulan en el medio de choque hiperosmótico cuando la prolina sustituye la hidroxiprolina o en medio rico. Una posible explicación es que las proteínas que contienen la trans-4-hidroxiprolina pueden ser resistentes a la degradación porque se pliegan en una triple hélice resistente a la proteasa, mientras que las proteínas que contienen prolina no adoptan esta estructura. El gran número de codones no óptimos para E. coli encontrados en el gen humano y la inestabilidad del colágeno que contiene prolina en E. coli puede, en parte, explicar por qué no se ha descrito previamente la expresión del colágeno humano en E. coli.

Tal y como se discutió anteriormente, también se proporcionan en la presente memoria polipéptidos que imitan al colágeno, a saber, polipéptidos modificados genéticamente que contienen ciertas características de composición y estructurales en común con el colágeno. También se pueden hacer que tales polipéptidos que imitan al colágeno incorporen análogos del aminoácido tal y como se describió anteriormente. La GST-CM4 consiste en la glutatión S-transferasa fusionada con 30 repeticiones de la secuencia Gly-X-Y. La sección repetitiva Gly-X-Y imita la unidad repetitiva Gly-X-Y del colágeno humano y se cita como mimético 4 del colágeno o CM4 en la presente memoria. Así, también se demostró que la tecnología que incorpora hidroxiprolina funcionaba con una proteína y una secuencia de ADN análoga a la encontrada en el colágeno humano. El análisis de aminoácidos de la proteína CM4 purificada expresados en la cepa de E. coli JM109 (F^{-}) en condiciones de incorporación de la hidroxiprolina en comparación con el análisis de la misma proteína expresada en condiciones de incorporación de la prolina demuestra que las técnicas de la presente memoria dan lugar esencialmente a una sustitución completa la prolina por la hidroxiprolina. Se realizó el análisis de aminoácidos en la proteína CM4 que se había escindido de la GST y purificado sin ésta. Esto elimina cualquier posible ambigüedad asociada a la proteína de fusión.

Para acumular una cantidad significativa de proteína que contiene hidroxiprolina es preferible la expresión en medios que contienen NaCl a al menos 200 mM aproximadamente. Una concentración de NaCl a unos 400 a 500 mM resulta ser óptima. Se puede utilizar KCl, sacarosa o sus combinaciones en sustitución del NaCl o con él. No obstante, la expresión en medios sin osmolito (a saber, en condiciones que imitan más cercanamente las de Deming et al., "In vivo incorporation of proline analogs into artificial protein", Poly. Mater. Sci. Engin. Proceed., véase más arriba) no dio lugar a una expresión significativa de proteínas que contienen hidroxiprolina en JM109 (F^{-}). Esto se ilustra en la figura 36 que es una exploración de un gel mediante SDS-PAGE que muestra la expresión de GST-CM4 en medios con o sin NaCl a 500 mM y que contiene prolina o hidroxiprolina. El gel SDS-PAGE refleja muestras 5 horas después de la inducción de la GST-CM4 expresada en JM109 (F^{-}). En cada calle se cargaron cantidades equivalentes de cada cultivo, sobre la base de la DO a 600 nm. Los geles se tiñeron con azul de Coomassie, se destiñeron y se exploraron en un escáner PDI 420oe. Calle 1: prolina a 2,5 mM/NaCl a 0 mM. Calle 2: prolina a 2,5 mM/NaCl a 500 mM. Calle 3: hidroxiprolina a 80 mM/NaCl a 0 mM. Calle 4: hidroxiprolina a 80 mM/NaCl a 500 mM. Calle 5: marcadores de masa molecular. La flecha inferior indica la posición de migración de la GST-CM4 que contiene prolina en las calles 1 y 2. La flecha superior indica la posición de migración de la GST-CM4 que contiene hidroxiprolina en las calles 3 y 4. Obsérvese que la GST-CM4 expresada en presencia de hidroxiprolina migra a una masa molecular aparentemente mayor (compárense las calles 1 y 4). Es lo esperado ya que la hidroxiprolina tiene una masa molecular mayor que la prolina. Si todas las prolinas en GST-CM4 están sustituidas con hidroxiprolina, el aumento de la masa molecular es de 671 Da (+2%). Obsérvese también que la proteína expresada en presencia de prolina se acumula en los cultivos independientemente de la concentración de NaCl (compárense las calles 1 y 2). En cambio, la expresión significativa en presencia de hidroxiprolina sólo se produce en el cultivo que contiene NaCl a 500 mM (compárense las calles 3 y 4). La figura 37 ilustra adicionalmente la dependencia que tiene la expresión de la concentración de NaCl al mostrar que la expresión significativa de la GST-CM4 se produce sólo a una concentración de NaCl de más de 200 mM. El gel SDS-PAGE refleja muestras 6 horas después de la inducción de la GST-CM4 expresada en JM109 (F^{-}) con diferentes concentraciones de NaCl. Todos los cultivos contenían hidroxiprolina a 80 mM. Calle 1: NaCl a 500 mM, sin inducir. Calles 2 a 6: NaCl a 500 mM, 400 mM, 300 mM, 200 mM y 100 mM, respectivamente. Todas inducidas con IPTG a 1,5 mM. Calle 7: marcadores de masa molecular. La flecha indica la posición a la que migra la GST-CM4 que contiene hidroxiprolina. La figura 38 es una exploración de un gel SDS-PAGE de la expresión de la GST-CM4 en NaCl a 400 mM o sacarosa a 800 mM. El gel SDS-PAGE ilustra muestras 4 horas después de la inducción de la GST-CM4 expresada en JM109 (F^{-}). Todos los cultivos contenían hidroxiprolina a 80 mM y todos, salvo el migrado en la calle 2, contenían NaCl a 400 mM. La calle 2 muestra la expresión en sacarosa en lugar de NaCl. Calle 1: marcadores de masa molecular. Calle 2: sacarosa a 800 mM (sin NaCl). Calles 3 a 9: prolina a 0 mM, 0,025 mM, 0,1 mM, 0,4 mM, 0,8 mM, 1,25 mM, 2,5 mM, respectivamente. La flecha superior indica la posición a la que migra la GST-CM4 que contiene hidroxiprolina y la flecha inferior indica la posición a la que migra la GST-CM4 que contiene prolina. La expresión es evidente en ambos casos (compárense las calles 2 y 3).

Si la expresión de la GST-CM4, tal y como se describe en el ejemplo 17 de más abajo, se realiza en proporciones diferentes de hidroxiprolina y prolina, la proteína expresada parece contener diferentes cantidades de hidroxiprolina. Así, si sólo está presente la hidroxiprolina durante la expresión, se pone de manifiesto en un gel SDS-PAGE la expresión de una sola proteína con la masa molecular esperada (figura 38, calle 3). Si está presente la prolina a más de aproximadamente 1 mM, de nuevo se pone de manifiesto la expresión de una sola proteína, pero con una masa molecular aparente menor, como se esperaba para la proteína que contiene sólo prolina (figura 38, calles 7 a 9). Si se utiliza una cantidad menor de prolina durante la expresión, se ponen de manifiesto especies de masa molecular aparente intermedia entre estos extremos. Este fenómeno, que se manifiesta como una "estela" o "escalera" de proteínas que migran entre los dos extremos de masa molecular en el gel SDS-PAGE, se ilustra en las calles 3 a 9 de la figura 38. Las calles 3 a 9 en este gel son proteínas expresadas en una concentración fija de hidroxiprolina a 80 mM y NaCl a 400 mM. Sin embargo, al moverse de la calle 3 a la 9, la concentración de prolina aumenta de nada (calle 3) a 2,5 mM (calle 9) y la expresión cambia de una proteína de mayor masa molecular (la GST-CM4 que contiene hidroxiprolina) a una proteína de menor masa molecular (la GST-CM4 que contiene prolina). A concentraciones de prolina de 0,025 mM y 0,1 mM, se ponen de manifiesto especies de masa molecular intermedia (calles 4 y 5). Esto demuestra claramente que la incorporación porcentual de hidroxiprolina durante la expresión de una proteína se puede controlar mediante la expresión en proporciones diferentes de análogo por aminoácido.

El ayuno prolongado de prolina antes de la incorporación de hidroxiprolina es una técnica importante utilizada en la presente memoria. Asegura que no queden residuos de prolina que compitan con la hidroxiprolina durante la expresión. Esto posibilita una sustitución esencialmente del 100% por el análogo. Tal y como se muestra en la figura 38, las condiciones de ayuno prolongado permiten la expresión en proporciones de prolina e hidroxiprolina controladas con precisión. Por lo tanto, se puede controlar la cantidad de hidroxiprolina frente a la prolina incorporada en la proteína recombinante. Así, determinadas propiedades de la proteína recombinante que dependen de la cantidad relativa del análogo incorporado se pueden establecer a medida mediante la metodología de la presente invención para producir polipéptidos con propiedades únicas y beneficiosas.

El colágeno humano, los fragmentos de colágeno, los péptidos similares al colágeno (imitadores del colágeno) y los polipéptidos quiméricos anteriores producidos mediante procedimientos recombinantes tienen ventajas diferentes frente al colágeno y sus derivados obtenidos de animales no humanos. Ya que se utiliza el gen humano, el colágeno no actuará como un xenotrasplante en el contexto de un implante médico. Además, a diferencia del colágeno que se produce de forma natural, se puede predeterminar el grado de hidroxilación de la prolina. Este grado de control sin precedentes permite la investigación pormenorizada de la contribución de la trans-4-hidroxiprolina en la estabilización de la triple hélice, la formación de las fibrillas y la actividad biológica. Además, se posibilita el diseño de implantes médicos sobre la base de la resistencia deseada para las fibrillas del colágeno.

Los ejemplos siguientes se incluyen para propósitos de ilustración y no se deben considerar como limitaciones de la presente memoria.

Ejemplo 1 Transporte a través de la membrana

Un cultivo de 5 ml de la cepa de E. coli DH5\alpha (supE44 \DeltalacU169 (\Phi80lacZ\DeltaM15) hsdR17 recA1 gyrA96 thi-1 relA1) que contiene un plásmido que confiere resistencia a la ampicilina (pMAL-c2, figura 1) se hizo crecer en el caldo de Luria hasta la saturación (\sim16 horas después de la inoculación). Se utilizaron estás células para inocular un matraz de agitador de 1 l que contiene 500 ml de medio mínimo M9 (sales M9, glucosa al 2%, tiamina al 0,01 mg/ml, ampicilina a 100 \mug/ml complementado con todos los aminoácidos a 20 \mug/ml) que se hizo crecer hasta alcanzar una A_{600} de 1,0 (de 18 a 20 horas). Se dividió el cultivo en dos mitades y se recogieron las células por centrifugación. Las células de un cultivo se resuspendieron en 250 ml de medio M9 y las del otro en 250 ml de medio M9 que contiene NaCl a 0,5 M. Se equilibraron los cultivos en un agitador de aire durante 20 minutos a 37ºC (225 rpm) y se dividieron en diez alícuotas de 25 ml. Se devolvieron los cultivos al agitador y se añadieron a cada tubo 125 \mul de hidroxiprolina a 1 M en H_{2}O destilada. A los 2, 4, 8, 12 y 20 minutos, se filtraron con vacío 4 tubos de cultivo (2 isotónicos, 2 hipertónicos) en filtros de policarbonato de 1 \mum que se colocaron inmediatamente en tubos de microcentrifugación de 2 ml que contenían 1,2 ml de NaOH a 0,2 M/SDS al 2% en H_{2}O destilada. Después de una noche de lisis, los filtros se retiraron meticulosamente de los tubos, y se analizó el tampón sobrenadante para detectar la hidroxiprolina según el método de Grant, Journal of Clinical Pathology, 17. 685 (1964). En la figura 2 se ilustra gráficamente la concentración intracelular de la trans-4-hidroxiprolina frente al tiempo.

Ejemplo 2 Efectos de la concentración salina sobre el transporte a través de la membrana

Para determinar los efectos de la concentración salina sobre el transporte a través de la membrana, se siguió un método similar al del ejemplo 1. Un cultivo de 5 ml de la cepa de E. coli DH5\alpha [supE44 \DeltalacU169 (\Phi80lacZ\DeltaM15) hsdR17 recA1 gyrA96 thi-1 relA1] que contiene un plásmido que confiere resistencia a la ampicilina (pMAL-c2, figura 1) se hizo crecer en el caldo de Luria hasta la saturación (\sim16 horas después de la inoculación). Se utilizaron estas células para inocular un matraz de agitador de 1 l que contenía 500 ml de medio mínimo M9 (sales M9, glucosa al 2%, tiamina a 0,01 mg/ml, ampicilina a 100 \mug/ml complementado con todos los aminoácidos a 20 \mug/ml) que, a continuación, se hizo crecer hasta alcanzar una A_{600} de 0,6. Se dividió el cultivo en tres partes iguales, las células de cada parte se recogieron por centrifugación y se resuspendieron en 150 ml de medio M9, 150 ml de medio M9 que contiene NaCl a 0,5 M y 150 ml de medio M9 que contiene NaCl a 1,0 M, respectivamente. Se equilibraron los cultivos durante 20 minutos en un agitador a 37ºC (225 rpm) y después se dividieron en seis alícuotas de 25 ml. Se devolvieron los cultivos al agitador y a cada tubo se le añadieron 125 \mul de hidroxiprolina a 1 M en H_{2}O destilada. A los 5 y 15 minutos, se filtraron con vacío 9 tubos de cultivo (3 isotónicos, 3 de NaCl a 0,5 M y 3 de NaCl a 1,0 M) por filtros de policarbonato de 1 \mum que se colocaron inmediatamente en los tubos de microcentrifugación de 2 ml que contenían 1,2 ml de NaOH a 0,2 M/SDS al 2% en H_{2}O destilada. Después de una noche de lisis, se retiraron los filtros de los tubos y se analizó el tampón sobrenadante para detectar la hidroxiprolina según el método de Grant, véase más arriba.

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Ejemplo 2a

Efectos de la concentración salina sobre el transporte a través de la membrana

Para determinar los efectos de la concentración salina sobre el transporte a través de la membrana, se realizó un método similar al del ejemplo 1. Un cultivo saturado de JM109 (F^{-}) que contiene el plásmido pD4 (figura 48) crecido en el caldo de Luria (LB) que contiene ampicilina (Amp) a 100 \mug/ml se utilizó para inocular cultivos de 20 ml de LB/Amp hasta alcanzar una DO a 600 nm de 0,1. Se hicieron crecer los cultivos con agitación a 37ºC hasta alcanzar una DO a 600 nm entre 0,7 y 1,0. Se recogieron las células por centrifugación y se lavaron con 10 ml del medio M9. Se resuspendió cada sedimento celular en 20 ml de medio M9/Amp complementado con glucosa al 0,5% y 100 \mug/ml de todos los aminoácidos salvo prolina. Se hicieron crecer los cultivos a 37ºC durante 30 minutos para agotar la prolina endógena. Después del crecimiento resultante, se añadió NaCl a la concentración indicada, y se añadieron Hyp a 40 mM e IPTG a 1,5 mM. Después de 3 horas a 37ºC, se recogieron por separado las células de tres alícuotas de 5 ml de cada cultivo sobre filtros de policarbonato y se lavaron dos veces con 5 ml de medio M9 que contiene glucosa al 0,5% y la concentración adecuada de NaCl. Se lisaron las células en 1 ml de etanol al 70% mediante agitación vorticial durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se secaron los sobrenadantes de la lisis celular, se resuspendieron en 100 \mul de NaOH a 2,5 N, y se analizó la presencia de Hyp en ellos mediante el método de Neuman y Logan, R. E. Neuman y M. A. Logan, Journal of Biological Chemistry, 184: 299 (1950). Se determinó la cantidad total de proteínas con el kit BCA (Pierce, Rockford II) después de la lisis celular mediante tres ciclos de sonicar/congelar-descongelar. Los datos son la media \pm error estándar de tres experimentos diferentes. En la figura 2A se ilustra gráficamente la concentración intracelular de la trans-4-hidroxiprolina frente a la concentración de NaCl.

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Ejemplo 3 Determinación de las condiciones de ayuno prolongado de prolina en E. coli

La cepa de E. coli auxótrofa para la prolina NM519 (pro^{-}) que incluye el plásmido pMAL-c2 que confiere resistencia a la ampicilina se hizo crecer en medio mínimo M9 (sales M9, glucosa al 2%, tiamina a 0,01 mg/ml, ampicilina a 100 \mug/ml complementada con todos los aminoácidos a 20 \mug/ml excepto la prolina que se complementó a 12,4 mg/l) hasta una A_{600} constante de 0,53 (17 horas después de la inoculación). Se añadió hidroxiprolina a 0,08 M y se demostró el crecimiento dependiente de la hidroxiprolina mediante el aumento en la DO_{600} hasta 0,61 en el transcurso de 1 hora.

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Ejemplo 4 Incorporación de la hidroxiprolina en proteína en E. coli en condiciones de ayuno prolongado de prolina

El plásmido pMal-c2 (disponible comercialmente en New England Biolabs) que contiene el ADN que codifica la proteína de unión a la maltosa (MBP) se utilizó para transformar la cepa de E. coli auxótrofa para la prolina NM519 (pro^{-}). Dos cultivos de 1 l de NM519 (pro^{-}) transformada en medio mínimo M9 (sales M9, glucosa al 2%, tiamina al 0,01 mg/ml, ampicilina a 100 \mug/ml complementada con todos los aminoácidos a 20 \mug/ml excepto la prolina que se complementó a 12,5 mg/l) se hicieron crecer hasta una A_{600} de 0,53 (unas 17 horas después de la inoculación). Se recogieron las células por centrifugación, el medio de un cultivo se reemplazó por un volumen igual de medio M9 que contenía hidroxiprolina a 0,08 M y el medio del segundo cultivo se reemplazó por un volumen igual de medio M9 que contenía hidroxiprolina a 0,08 M y NaCl a 0,5 M. Después de equilibrar durante 1 hora, se indujeron los cultivos con isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido a 1 mM. Después de 3,25 horas más de crecimiento, se recogieron las células por centrifugación, se resuspendieron en 10 ml de Tris-HCl a 10 mM (pH 8), EDTA a 1 mM, NaCl a 100 mM (tampón TEN), y se lisaron mediante congelación y sonicación. Se purificó la MBP haciendo pasar los lisados por columnas centrifugables de 4 ml de resina de amilosa, se lavaron las columnas con 10 ml de tampón TEN y después se eluyó la MBP unida con 2 ml del tampón TEN que contenía maltosa a 10 mM. Las muestras eluidas se sellaron en ampollas con nitrógeno con un volumen igual de HCl concentrado (11,7 M) y se hidrolizaron durante 12 horas a 120ºC. Después del aclaramiento con carbón activado, se determinó el contenido de hidroxiprolina de las muestras mediante HPLC y el método de Grant, véase más arriba. En la figura 12 se muestra gráficamente el porcentaje de incorporación de la trans-4-hidroxiprolina en comparación con prolina en la MBP.

Ejemplo 5 Incorporación de hidroxiprolina en proteína en S. cerevisiae mediante vectores integrativos en condiciones de ayuno prolongado de prolina

El procedimiento descrito en el ejemplo 4 anterior se realiza en la levadura utilizando un vector integrativo que destruye la vía biosintética de la prolina. Se introduce un gen que codifica el colágeno humano de tipo I (\alpha_{1}) en un único vector bifuncional detrás del promotor inducible GAL10. Esta casete promotor/gen está flanqueada por una secuencia en los extremos 5' y 3' derivada del gen de la prolina sintetasa de S. cerevisiae. El plásmido se linealiza mediante digestión de restricción en ambas regiones 5' y 3' terminales, y se utiliza para transformar una cepa de S. cerevisiae protótrofa para la prolina. La mezcla de la transformación se siembra en placas de medio selectivo y se seleccionan los transformantes. Mediante la recombinación homóloga y la interrupción génica, la construcción forma simultáneamente una integración estable y convierte la cepa de S. cerevisiae en un auxótrofo para la prolina. Se selecciona un sólo transformante y se hace crecer a 30ºC en medio YPD hasta alcanzar una DO_{600} de 2. Se centrifuga el cultivo y se resuspenden las células en un medio de retirada para levaduras complementado con todos los aminoácidos salvo la prolina y se hacen crecer hasta alcanzar una DO_{600} constante, lo que indica que está en condiciones de ayuno prolongado de prolina. A continuación, se añade L-hidroxiprolina a 0,08 M y galactosa al 2% (p/v). Se hacen crecer los cultivos durante 6 a 48 horas más. Se recogen las células por centrifugación (5000 rpm, 10 minutos) y se lisan mediante rotura mecánica. El colágeno humano de tipo 1 (\alpha_{1}) que contiene hidroxiprolina se purifica mediante el fraccionamiento con sulfato de amonio y cromatografía en columna.

Ejemplo 6 Incorporación de la hidroxiprolina en proteína en S. cerevisiae mediante vectores no integrativos en condiciones de ayuno prolongado de prolina

El procedimiento descrito anteriormente en el ejemplo 4 se realiza en una levadura auxótrofa para la prolina utilizando un vector no integrativo. Se inserta un gen que codifica el colágeno humano de tipo 1 (\alpha_{1}) detrás del promotor inducible GAL10 en el vector bifuncional YEp24 que contiene el marcador de selección Ura^{+}. El plásmido resultante se introduce por transformación en S. cerevisiae auxótrofa para la prolina mediante transformación de esferoplastos. La mezcla de la transformación se siembra en placas de medio de selección y se seleccionan los transformantes. Se hace crecer un único transformante a 30ºC en medio YPD hasta alcanzar una DO_{600} de 2. Se centrifuga el cultivo y se resuspenden las células en medio de retirada para levadura complementado con todos los aminoácidos salvo la prolina y se hace crecer hasta alcanzar una OD_{600} constante, lo que indica se encuentra en condiciones de ayuno prolongado de prolina. A continuación, se añade L-hidroxiprolina a 0,08 M y galactosa al 2% (p/v). Se hacen crecer los cultivos durante 6 a 48 horas más. Se recogen las células por centrifugación (5000 rpm, 10 minutos) y se lisan mediante rotura mecánica. Se purifica el colágeno humano de tipo I (\alpha_{1}) que contiene hidroxiprolina mediante fraccionamiento con sulfato de amonio y cromatografía en columna.

Ejemplo 7 Incorporación de la hidroxiprolina en proteína en un sistema de expresión de baculovirus

Se inserta un gen que codifica el colágeno humano de tipo I (\alpha_{1}) en el vector de expresión del baculovirus pBacPAK8 detrás del promotor polihedro del AcMNPV. Con esta construcción se cotransfectan las células SF9 junto con ADN del AcMNPV linealizado mediante coprecipitación con fosfato de calcio estándar. Se cultivan los transfectantes durante 4 días a 27ºC en medio TNM-FH complementado con SFB al 10%. Se recoge el medio y se aíslan las partículas víricas recombinantes mediante un ensayo en placa. Se utiliza el virus recombinante para infectar 1 litro de células SF9 que crecen en medio de Grace sin prolina complementado con SFB al 10% e hidroxiprolina a 0,08 M. Después del crecimiento a 27ºC durante 2 a 10 días, se recogen las células mediante centrifugación y se lisan mediante rotura mecánica. Se purifica el colágeno humano de tipo I (\alpha_{1}) que contiene hidroxiprolina mediante fraccionamiento con sulfato de amonio y cromatografía en columna.

Ejemplo 8 Incorporación de la hidroxiprolina en la proteína del colágeno humano en Escherichia coli en condiciones de ayuno prolongado de prolina

Un plásmido (pHuCol, figura 4) que codifica la secuencia génica del colágeno humano de tipo I (\alpha1) (figuras 3A y 3B) (SEQ ID n.º 1) colocada detrás del promotor tac inducible por el isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) y que también codifica la \beta-lactamasa se introduce por transformación en la cepa auxótrofa para prolina de Escherichia coli NM519 (pro^{-}) mediante transformación estándar por choque térmico. Los cultivos de la transformación se siembran en placas de caldo de Luria (LB) que contiene ampicilina a 100 \mug/ml y después de una noche de crecimiento se utiliza una colonia aislada resistente a la ampicilina para inocular 5 ml de LB que contiene ampicilina a 100 \mug/ml. Después de 10 a 16 horas de crecimiento con agitación (225 rpm) a 37ºC, se utiliza este cultivo para inocular 1 l de medio mínimo M9 (sales M9, glucosa al 2%, tiamina a 0,01 mg/ml, ampicilina a 100 \mug/ml, complementado con todos los aminoácidos a 20 \mug/ml excepto la prolina que se añade a 12,5 mg/l) en un matraz de agitador de 1,5 l. Después de hacerlas crecer a 37ºC, 225 rpm, durante 15 a 20 horas tras de la inoculación, la densidad óptica a 600 nm es constante a aproximadamente 0,5 DO/ml. Se recogen las células por centrifugación (5000 rpm, 5 minutos), se decanta el medio y se resuspenden las células en 1 l de medio mínimo M9 que contiene ampicilina a 100 \mug/ml, L-hidroxiprolina a 0,08 M y NaCl a 0,5 M. Después de 1 hora de crecimiento a 37ºC, 225 rpm, se añade el IPTG a 1 mM y se dejan crecer los cultivos durante 5 a 15 horas más. Se recogen las células por centrifugación (5000 rpm, 10 minutos) y se lisan mediante rotura mecánica. Se purifica colágeno que contiene hidroxiprolina mediante fraccionamiento con sulfato de amonio y cromatografía en columna.

Ejemplo 9 Incorporación de la hidroxiprolina en fragmentos de la proteína del colágeno humano en Escherichia coli en condiciones de ayuno prolongado de prolina

Un plásmido (pHuCol-FI, figura 6) que codifica la secuencia génica de los primeros 80 aminoácidos del colágeno humano de tipo I (\alpha_{1}) (figura 5) (SEQ ID n.º 2) colocado detrás del promotor tac inducible por el isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG), y que también codifica la \beta-lactamasa, se introduce por transformación en la cepa NM519 (pro^{-}) auxótrofa para prolina de Escherichia coli mediante la transformación estándar por choque térmico. Los cultivos de la transformación se siembran en placas de caldo de Luria (LB) que contiene ampicilina a 100 \mug/ml y, después de una noche de crecimiento, se utiliza una colonia aislada resistente a la ampicilina para inocular 5 ml de LB que contiene ampicilina a 100 \mug/ml. Después de 10 a 16 horas de crecimiento con agitación (225 rpm) a 37ºC, se utiliza este cultivo para inocular 1 l de medio mínimo M9 (sales M9, glucosa al 2%, tiamina a 0,01 \mug/ml, ampicilina a 100 \mug/ml, complementado con todos los aminoácidos a 20 \mug/ml excepto la prolina que se añade a 12,5 mg/l) en un matraz de agitador de 1,5 l. Después de hacerlas crecer a 37ºC, 225 rpm, durante 15 a 20 horas tras la inoculación, la densidad óptica a 600 nm es constante a aproximadamente 0,5 DO/ml. Se recogen las células por centrifugación (5000 rpm, 5 minutos), se decanta el medio, y se resuspenden las células en 1 l de medio mínimo M9 que contiene ampicilina a 100 \mug/ml, L-hidroxiprolina a 0,08 M y NaCl a 0,5 M. Después de 1 hora de crecimiento a 37ºC, 225 rpm, se añade el IPTG a 1 mM y se dejan crecer los cultivos durante 5 a 15 horas más. Se recogen las células por centrifugación (5000 rpm, 10 minutos) y se lisan mediante rotura mecánica. Se purifica el fragmento de colágeno que contiene hidroxiprolina mediante fraccionamiento con sulfato de amonio y cromatografía en columna.

Ejemplo 10 Construcción y expresión en E. coli del gen del colágeno humano de tipo I (\alpha_{1}) con el uso de codones optimizado para E. coli A. Construcción del gen

La secuencia nucleotídica de la región helicoidal del gen del colágeno humano de tipo I (\alpha_{1}) flanqueado por 17 aminoácidos de la región extrahelicoidal aminorterminal y por 26 aminoácidos de la región extrahelicoidal carboxiterminal se muestra en la figura 27 (SEQ ID n.º 15). En la tabla I se proporciona en forma ordenada la frecuencia de codones de este gen. La secuencia del gen mostrada en la figura 27 se cambió primero para reflejar el sesgo de codones de E. coli. Se introdujo una metionina iniciadora en el extremo 5' del gen y una secuencia de parada TAAT en el extremo 3'. Se identificaron sitios de restricción únicos o se crearon aproximadamente cada 150 pares de bases. El gen resultante (HuCol^{EC}, figura 39A-39E) (SEQ ID n.º 20) tiene el uso de codones ofrecido en la tabla II tal y como se muestra más abajo. También son aceptables otras secuencias que se acercan al sesgo de codones de E. coli.

TABLA II

3

4

Se sintetizaron oligonucleótidos de unos 80 nucleótidos en un sintetizador de ADN Beckman Oligo 1000, se escindieron y se desprotegieron con NH_{4}OH acuoso, y se purificaron por electroforesis en geles de urea a 7 M/poliacrilamida al 12%. Se diseñó cada conjunto de oligonucleótidos para que tuvieran un sitio para la enzima de restricción EcoRI en el extremo 5', un sitio de restricción único cerca del extremo 3', seguido por la secuencia de parada TAAT y un sitio para la enzima de restricción HindIII en el propio extremo 3'. Los primeros cuatro oligonucleótidos, que comprenden los primeros 81 aminoácidos del gen del colágeno humano de tipo I (\alpha_{1}) se ofrecen en la figura 40, que muestra la secuencia y el mapa de restricción de los oligonucleótidos sintéticos utilizados para construir los primeros 243 pares de bases del gel del colágeno de tipo humano (\alpha_{1}) con el uso de codones optimizado para E. coli. Se diseñaron los oligonucleótidos N1-1 (SEQ ID n.º 21) y N1-2 (SEQ ID n.º 22) para introducir un codón de metionina iniciador (ATG) en el extremo 5' del gen.

En un caso, se hibridaron los oligonucleótidos N1-1 y N1-2 (1 \mug de cada uno) en 20 \mul de tampón de la ADN polimerasa de T7 [Tris-HCl a 40 mM (pH 8,0), MgCl_{2} a 5 mM, ditiotreitol a 5 mM, NaCl a 50 mM, albúmina de suero bovino al 0,05 mg/ml] calentando a 90ºC durante 5 minutos y después enfriando lentamente a temperatura ambiente. Después de una breve centrifugación a 14000 rpm, se añadieron 10 unidades de ADN polimerasa de T7 y 2 \mul de una disolución de los cuatro dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP a 2,5 mM cada uno) a los oligonucleótidos hibridados. Se incubaron las reacciones de extensión a 37ºC durante 30 minutos y luego se calentaron a 70ºC durante 10 minutos. Después de enfriar a temperatura ambiente, se añadieron tampón de HindIII (5 \mul de la concentración 10x), 20 \mul de H_{2}O y 10 unidades de la enzima de restricción HindIII, y se incubaron los tubos a 37ºC durante 10 horas. Se añadieron a cada tubo tampón de HindIII (2 \mul de la concentración 10x), 13,5 \mul de Tris-HCl a 0,5 M (pH 7,5), 1,8 \mul de Tritón X100 al 1%, 5,6 \mul de H_{2}O y 20 U de EcoRI y se continuó la incubación durante 2 horas a 37ºC. Se extrajeron una vez las digestiones con un volumen igual de fenol, una vez con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico y una vez con cloroformo/alcohol isoamílico. Después de la precipitación en etanol, se resuspendió el sedimento en 10 \mul del tampón TE [Tris-HCl a 10 mM (pH 8,0), EDTA a 1 mM]. Se ligó el sedimento resuspendido (4 \mul) durante una noche a 16ºC con el vector pBSKS^{+} (1 \mug) digerido con EcoRI/HindIII y purificado de gel de agarosa utilizando la ADN ligasa de T4 (100 unidades). La mitad de la mezcla de transformación se introdujo por transformación mediante choque térmico en las células DH5\alpha y 100 \mul del mililitro de mezcla de transformación se sembraron en placas con agar de caldo de Luria (LB) que contiene ampicilina a 70 \mug/ml. Se incubaron las placas durante una noche a 37ºC. Se escogieron colonias resistentes a la ampicilina (de 6 a 12) y se hicieron crecer durante una noche en el medio LB que contiene ampicilina a 70 mg/ml. Se aisló el ADN plasmídico de cada cultivo mediante minipreparaciones Wizard (Promega Corporation, Madison WI) y se cribaron por la presencia de un inserto de aproximadamente 120 pares de bases mediante digestión con EcoRI y HindIII, y se migraron los productos de la digestión en geles de electroforesis de agarosa. Se confirmaron los clones con inserto mediante secuenciación estándar del ADN por terminación con didesoxinucleótidos. El clon correcto se denominó pBSN1-1 (figura 41) y el fragmento del colágeno tiene la secuencia del ácido nucleico ofrecida en la figura 42 (SEQ ID n.º 25).

Los oligonucleótidos N1-3 (SEQ ID n.º 23) y N1-4 (SEQ ID n.º 24) (figura 40) se sintetizaron, purificaron, hibridaron, extendieron y clonaron en el pBSKS^{+} siguiendo el mismo procedimiento descrito anteriormente para los oligonucleótidos N1-1 y N1-2. El plásmido resultante se llamó pBSN1-2A. Para clonar juntas las secciones del gen del colágeno de pBSN1-1 y pBSN1-2A, se digirió el plásmido pBSN-1-1 (1 \mug) durante 2 horas a 37ºC con RsrII y HindIII. Se purificó el vector digerido mediante electroforesis en gel de agarosa. Se digirió el plásmido pBSN1-2A (3 \mug) durante 2 horas a 37ºC con RsrII y HindIII y se purificó el inserto mediante electroforesis en gel de agarosa. Se ligó el pBSN1-1 digerido con RsrII/HindIII con este inserto durante una noche a 16ºC con ADN ligasa de T4. La mitad de la mezcla de ligación se introdujo por transformación en las células DH5\alpha y 1/10 de la mezcla de transformación se sembró en placas con agar de LB que contiene ampicilina a 70 \mug/ml. Después de incubar durante una noche a 37ºC, se escogieron algunos clones resistentes a la ampicilina y se cribaron por la presencia del ADN insertado tal y como se describió anteriormente. Se confirmaron los clones mediante secuenciación por terminación con didesoxinucleótidos. El clon
correcto se denominó pBSN1-2 (figura 43) y el fragmento del colágeno tiene la secuencia ofrecida en la figura 44.

De forma similar, se construye el resto del gen del colágeno de tal forma que la secuencia final del ADN es la ofrecida en la figura 39A-39E (SEQ ID n.º 19).

B) Expresión del gen en E. coli

Después de la reconstrucción del gen del colágeno humano de tipo I (\alpha_{1}) con el uso de codones optimizado para E. coli, el gen clonado se expresa en E. coli. Un plásmido (pHuCol^{EC}, figura 45) que codifica el gen completo sintético del colágeno (figura 39A-39E) colocado detrás del promotor tac inducible por el isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) y que también codifica la \beta-lactamasa se introduce por transformación en la cepa de Escherichia coli DH5\alpha [supE44 \DeltalacU169 (\Phi80lacZ\DeltaM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1] mediante transformación estándar por choque térmico. Los cultivos de la transformación se siembran en placas de caldo de Luria (LB) que contiene ampicilina a 100 \mug/ml y después de una noche de crecimiento, se utiliza una colonia aislada resistente a la ampicilina para inocular 10 ml de LB con ampicilina a 100 \mug/ml. Después de 10 a 16 horas de crecimiento con agitación (225 rpm) a 37ºC, se utiliza este cultivo para inocular 1 l de LB con ampicilina a 100 \mul en un matraz de agitador de 1,5 l. Después del crecimiento a 37ºC, 225 rpm, durante 2 horas tras la inoculación, la densidad óptica a 600 nm es de aproximadamente 0,5 DO/ml. Se añade el IPTG a 1 mM y se deja crecer el cultivo durante 5 a 10 horas más. Se recogen las células por centrifugación (5000 rpm, 10 minutos) y se lisan mediante rotura mecánica. Se purifica el colágeno humano recombinante mediante fraccionamiento con sulfato de amonio y cromatografía en columna. El rendimiento por lo general es de 15 a 25 mg/l de cultivo.

Ejemplo 11 Expresión en E. coli de un fragmento de 81 aminoácidos del colágeno humano de tipo I (\alpha1) con el uso de codones optimizado para E. coli

Un plásmido (pTrcN1-2, figura 46) que codifica la secuencia génica de los primeros 81 aminoácidos del colágeno humano de tipo I (\alpha_{1}) con el uso de codones optimizado para E. coli clonado en fusión con una etiqueta de 6 histidinas en el extremo 5' del gen y colocado detrás del promotor tac inducible por el isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) y que también codifica la \beta-lactamasa se construyó subclonando el inserto EcoRI/HindIII del pBSN1-2 en el sitio EcoRI/HindIII del plásmido pTrcB (Invitrogen, San Diego, CA). Se introdujo por transformación el plásmido pTrcN1-2 en la cepa DH5\alpha de Escherichia coli [supE44 \DeltalacU169 (\Phi80lacZ\DeltaM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1) mediante transformación estándar por choque térmico. Los cultivos de la transformación se sembraron en placas de caldo de Luria (LB) que contiene ampicilina a 100 \mug/ml y después de una noche de crecimiento, se utilizó una colonia aislada resistente a la ampicilina para inocular 5 ml de LB que contiene ampicilina a 100 \mug/ml. Después de 10 a 16 horas de crecimiento con agitación (225 rpm) a 37ºC, se utilizó este cultivo para inocular 50 ml de LB que contiene ampicilina a 100 \mug/ml en un matraz de agitador de 250 ml. Después del crecimiento a 37ºC, 225 rpm, durante 2 horas tras la inoculación, la densidad óptica a 600 nm era aproximadamente de 0,5 DO/ml. Se añadió el IPTG a 1 mM y se dejó crecer el cultivo durante 5 a 10 horas más. Se recogieron las células por centrifugación (5000 rpm, 10 minutos) y se guardaron a -20ºC. La fusión del fragmento de colágeno con la etiqueta de 6 histidinas se purificó en columnas con resina de níquel. Se resuspendieron los sedimentos celulares en 10 ml de clorhidrato de guanidina a 6 M/ fosfato de sodio a 20 mM/NaCl a 500 mM (pH 7,8) y se unieron a la resina de níquel en dos lotes de 5 ml. Se lavaron las columnas dos veces con 4 ml del tampón de unión [urea a 8 M/fosfato de sodio a 20 mM/NaCl a 500 mM (pH 7,8)], dos veces con el tampón de lavado 1 [urea a 8 M/fosfato de sodio a 20 mM/ NaCl a 500 mM (pH 6,0)] y dos veces con el tampón de lavado 2 [urea a 8 M/fosfato de sodio a 20 mM/NaCl a 500 mM (pH 5,3)]. La fusión etiqueta de 6 histidinas-fragmento de colágeno se eluyó de la columna con 5 ml de tampón de elución [urea a 8 M/fosfato de sodio a 20 mM/NaCl a 500 mM (pH 4,0)] en fracciones de 1 ml. Se evaluó la cantidad de proteína en las fracciones mediante electroforesis en gel y las fracciones que contenían la fusión se concentraron y se guardaron a -20ºC. La producción fue normalmente de 15 a 25 mg/l de cultivo.

Se separa el colágeno de la etiqueta de 6 histidinas con la enterocinasa. Las fracciones que contienen la fusión se dializan frente al tampón de escisión (Tris-HCl a 50 mM, pH 8,0/CaCl_{2} a 5 mM). Después de añadir la enterocinasa a razón de 1 \mug de enzima por cada 100 \mug de fusión, se incuba la disolución a 37ºC durante 4 a 10 horas. Se monitoriza el progreso de la escisión mediante electroforesis en gel. La etiqueta de 6 histidinas escindida se puede separar del fragmento de colágeno haciéndola pasar por una columna de resina de níquel tal y como se describió anteriormente.

Ejemplo 12 Expresión en E. coli de los fragmentos del colágeno humano de tipo I (\alpha_{1}) con el uso de codones optimizado para E. coli

Un plásmido (pN1-3, figura 47) que codifica el gen de los 120 aminoácidos del extremo amino del colágeno humano de tipo I (\alpha_{1}) con el uso de codones optimizado para E. coli colocado detrás del promotor tac inducible por el isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) y que también codifica la \beta-lactamasa se introduce por transformación en la cepa DH5\alpha de Escherichia coli (supE44 \DeltalacU169 (\Phi80lacZ\DeltaM15) hsdR17 endA1 recA1 gyrA96 thi-1 relA1] mediante transformación estándar por choque térmico. Los cultivos de la transformación se siembran en placas de caldo de Luria (LB) que contiene ampicilina a 100 \mug/ml y, después de una noche de crecimiento, se utiliza una colonia aislada resistente a la ampicilina para inocular 10 ml de LB que contiene ampicilina a 100 \mug/ml. Después de 10 a 16 horas de crecimiento con agitación (225 rpm) a 37ºC, se utiliza este cultivo para inocular 1 l de LB que contiene ampicilina a 100 \mug/ml en un matraz de agitador de 1,5 l. Después del crecimiento a 37ºC, 225 rpm, durante dos horas después de la inoculación, la densidad óptica a 600 nm es de aproximadamente 0,5 DO/ml. Se añade el IPTG a 1 mM y se deja crecer el cultivo durante 5 a 10 horas más. Se recogen las células mediante centrifugación (5000 rpm, 10 minutos) y se lisan mediante rotura mecánica. Se purifica el colágeno humano recombinante mediante fraccionamiento
con sulfato de amonio y cromatografía en columna. El rendimiento por lo general es de 15 a 25 mg/l de cultivo.

Ejemplo 13 Expresión en E. coli de un fragmento del extremo carboxilo del colágeno humano de tipo I (\alpha_{1}) con el uso de codones optimizado para E. coli

Un plásmido (pD4, figura 48) que codifica el gen de los 219 aminoácidos del extremo carboxilo del colágeno humano de tipo I (\alpha_{1}) con el uso de codones optimizado para E. coli colocado detrás del promotor tac inducible por el isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) y que también codifica la \beta-lactamasa se introduce por transformación en la cepa de Escherichia coli DH5\alpha (supE44 \DeltalacU169 (\Phi80lacZ\DeltaM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1) mediante transformación estándar por choque térmico. Los cultivos de la transformación se sembraron en placas de caldo de Luria (LB) que contiene ampicilina a 100 \mug/ml y después de una noche de crecimiento, se utilizó una colonia aislada resistente a la ampicilina para inocular 100 ml de LB que contiene ampicilina a 100 \mug/ml. Después de 10 a 16 horas de crecimiento con agitación (225 rpm) a 37ºC, se utilizó este cultivo para inocular 1 l de LB que contiene ampicilina a 100 \mug/ml en un matraz de agitador de 1,5 l. Después del crecimiento a 37ºC, 225 rpm, durante dos horas tras la inoculación, la densidad óptica a 600 nm es de aproximadamente 0,5 DO/ml. Se añade IPTG a 1 mM y se deja crecer el cultivo durante 5 a 10 horas más. Se recogen las células por centrifugación (5000 rpm, 10 minutos) y se lisan por rotura mecánica. Se purifica el fragmento de colágeno humano recombinante mediante fraccionamiento con sulfato de amonio y cromatografía en columna. El rendimiento por lo general es de 15 a 25 mg/l de cultivo.

Ejemplo 14 Construcción y expresión en E. coli del gen del colágeno humano de tipo I (\alpha2) con el uso de codones optimizado para E. coli A) Construcción del gen

La secuencia nucleotídica de la región helicoidal del gen del colágeno humano de tipo I (\alpha_{2}) flanqueado por 11 aminoácidos de la región extrahelicoidal aminoterminal y por 12 aminoácidos de la región extrahelicoidal carboxiterminal se muestra en las figuras 49A a 49E (SEQ ID n.º 29). Se ofrece una tabla con la frecuencia de codones de este gen en la tabla III que viene a continuación. La secuencia del gen mostrada en las figuras 49A a 49E se cambió primero para reflejar el sesgo de codones de E. coli. Se introdujo una metionina iniciadora en el extremo 5' del gen y una secuencia de parada TAAT en el extremo 3'. Se identifican sitios de restricción únicos o se crean aproximadamente cada 150 pares de bases. El gen resultante [HuCol(\alpha_{2})^{EC}, figuras 50A a 50E] (SEQ ID n.º 31) tiene el uso de codones dado en la tabla IV que viene a continuación. También son aceptables otras secuencias que se acerquen al sesgo de codones de E. coli.

TABLA III

6

TABLA IV

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Se sintetizan oligonucleótidos de unos 80 nucleótidos en un sintetizador de ADN Oligo 1000 de Beckman, se escinden y se desprotegen con NH_{4}OH acuoso, y se purifican mediante electroforesis en geles de urea a 7 M/poliacrilamida al 12%. Cada conjunto de oligonucleótidos se diseña para que tenga un sitio de la enzima de restricción EcoRI en el extremo 5', un sitio de restricción único cerca del extremo 3'; seguido de la secuencia parada TAAT y un sitio de la enzima de restricción HindIII en el propio extremo 3'. Se diseñan los oligonucleótidos N1-1(\alpha_{2}) y N1-2(\alpha_{2}) para introducir un codón de metionina iniciador (ATG) en el extremo 5' del gen.

En un caso, los oligonucleótidos N1-1(\alpha_{2}) y N1-2(\alpha_{2}) (1 \mug de cada uno) (la figura 51 describe la secuencia y el mapa de restricción de los oligonucleótidos sintéticos utilizados para construir los primeros 240 pares de bases del gen del colágeno humano de tipo I (\alpha_{2}) con el uso de codones optimizado para E. coli)se hibridan en 20 \mul de tampón de la ADN polimerasa de T7 [Tris-HCl a 40 mM (pH 8,0), MgCl_{2} a 5 mM, ditiotreitol a 5 mM, NaCl a 50 mM, seroalbúmina bovina a 0,05 mg/ml] calentando a 90ºC durante 5 minutos y después enfriando lentamente hasta la temperatura ambiente. Después de una breve centrifugación a 14.000 rpm, se añaden 10 unidades de la ADN polimerasa de T7 y 2 \mul de una disolución de los cuatro NTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP, a 2,5 mM cada uno) a los oligonucleótidos hibridados. Se incuban las reacciones de extensión a 37ºC durante 30 minutos y a continuación se calientan a 70ºC durante 10 minutos. Después de enfriar a la temperatura ambiente, se añaden tampón de HindIII (5 \mul de una concentración 10x), 20 \mul de H_{2}O y 10 unidades de la enzima de restricción HindIII, y se incuban los tubos a 37ºC durante 10 a 16 horas. A cada tubo se le añade el tampón de HindIII (2 \mul de una concentración 10x), 13,5 \mul de Tris-HCl a 0,5 (pH 7,5), 1,8 \mul de Tritón X100 al 1%, 5,6 \mul de H_{2}O y 20 U de EcoRI y se continúa la incubación durante 2 horas a 37ºC. Se extraen una vez las digestiones con un volumen igual de fenol, una vez con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico y una vez más con cloroformo/alcohol isoamílico. Después de precipitar con etanol, se resuspende el sedimento en 10 \mul del tampón TE [Tris-HCl a 10 mM (pH 8,0), EDTA a 1 mM]. Se liga el sedimento resuspendido (4 \mul) durante una noche a 16ºC con el vector pBSKS^{+} digerido con EcoRI/HindIII purificado en gel de agarosa (1 \mug) usando la ADN ligasa de T4 (100 unidades). Se transforma una mitad de la mezcla de transformación mediante choque térmico en las células DH5\alpha y se siembran en placas 100 \mul del mililitro de la mezcla de transformación en placas con agar de caldo de Luria (LB) que contiene ampicilina a 70 \mug/ml. Se incuban las placas durante una noche a 37ºC. Se escogen algunas colonias resistentes a la ampicilina (de 6 a 12) y se hacen crecer durante una noche en medio LB que contiene ampicilina a 70 \mug/ml. Se aísla el ADN plasmídico de cada cultivo mediante minipreparaciones Wizard (Promega Corporation, Madison, WI) y se criban por la presencia del inserto de aproximadamente 120 pares de bases mediante la digestión con EcoRI y HindIII y se migran los productos de la digestión en geles de electroforesis de agarosa. Se confirman los clones con inserto mediante la secuenciación estándar del ADN por terminación con didesoxinucleótidos. El clon correcto se denomina pBSH-1- (\alpha_{2}) (figura 52).

Los oligonucleótidos N1-3(\alpha_{2}) y N1-4(\alpha_{2}) se sintetizan, purifican, hibridan, extienden y clonan en el pBSKS^{+} siguiendo el mismo procedimiento descrito anteriormente para los oligonucleótidos N1-1(\alpha_{2}) y N1-2 (\alpha_{2}). El plásmido resultante se llama pBSN1-2A. Para clonar juntas las secciones del gen del colágeno, se digiere el pBSN1-1(\alpha_{2}) (1 \mug) durante 2 horas a 37ºC con BsrFI y HindIII. Se purifica el vector digerido mediante electroforesis en gel de agarosa. Se digiere el plásmido pBSn1-2 (\alpha_{2}) (3 \mug) durante dos horas a 37ºC con BsrFI y HindIII y se purifica el inserto mediante electroforesis en gel de agarosa. Se liga el pBSN1-1 digerido por BsrF/HindIII con este inserto durante una noche a 16ºC con la ADN ligasa de T4. Se introduce por transformación una mitad de la mezcla de ligación en las células DH5\alpha y 1/10 de la mezcla de transformación se siembra en placas con agar de LB que contiene ampicilina a 70 \mug/ml. Después de incubar durante una noche a 37ºC, se escogen algunos clones resistentes a la ampicilina y se criban por la presencia del ADN insertado tal y como se describió anteriormente. Se confirman los clones mediante la secuenciación por terminación con didesoxinucleótidos. El clon correcto se denomina pBSN1-2 (\alpha_{2}) (figura 53) y el fragmento de colágeno tiene la secuencia ofrecida en la figura 54 (SEQ ID n.º 37).

De manera similar, se construye el resto del gen de colágeno de tal forma que la secuencia del ADN final es la ofrecida en las figuras 50A a 50E (SEQ ID n.º 31).

B) Expresión del gen en E. coli

Después de construir todo el gen del colágeno humano de tipo I (\alpha_{2}) con el uso de codones optimizado para E. coli, se expresa en E. coli el gen clonado. Un plásmido [pHuCol(\alpha_{2})^{EC}, figura 55] que codifica el gen completo del colágeno sintético (figuras 50A A 50E) colocado detrás del promotor tac inducible por el isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) y que también codifica la \beta-lactamasa se introduce por transformación en la cepa de Escherichia coli DH5\alpha (supE44 \DeltalacU169 (\Phi80lacZ\DeltaM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1) mediante transformación estándar por choque térmico. Los cultivos de la transformación se siembran en placas de caldo de Luria (LB) que contiene ampicilina a 100 \mug/ml y, después de hacerlas crecer durante una noche, se utiliza una colonia aislada resistente a la ampicilina para inocular 10 ml de LB que contienen ampicilina a 100 \mug/ml y, después de una noche de crecimiento, se utiliza una única colonia resistente a la ampicilina para inocular 10 ml de LB que contiene ampicilina a 100 \mug/ml. Después de 10 a 16 horas de crecimiento con agitación (225 rpm) a 37ºC, se utiliza este cultivo para inocular 1 l de LB que contiene ampicilina a 100 \mug/ml en un matraz de agitador de 1,5 l. Después del crecimiento a 37ºC, 225 rpm, durante 2 horas tras la inoculación, la densidad óptica a 600 nm es de aproximadamente 0,5 DO/ml. Se añade el IPTG a 1 mM y se deja crecer el cultivo durante 5 a 10 horas más. Se recogen las células por centrifugación (5000 rpm, 10 minutos) y se lisan mediante rotura mecánica. Se purifica el colágeno humano recombinante mediante fraccionamiento con sulfato de amonio y cromatografía en columna. El rendimiento por lo general es de 15 a 25 mg/l de cultivo.

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Ejemplo 14A

Construcción alternativa y expresión en E. coli del gen del colágeno humano de tipo I (\alpha_{2}) con el uso de codones optimizado para E. coli A) Construcción del gen

La secuencia nucleotídica de la región helicoidal del colágeno humano de tipo I (\alpha_{2}) flanqueada por 11 aminoácidos extrahelicoidales aminoterminales y por 12 aminoácidos de la región extrahelicoidal carboxiterminales se muestra en las figuras 49A a 49E (SEQ ID n.º 29). Una tabla de la frecuencia de codones de este gen se ofrece en la tabla III. La secuencia del gen mostrada en las figuras 49A a 49E se cambió primero para reflejar el sesgo de codones de E. coli. Se introdujo una metionina iniciadora en el extremo 5' del gen y una secuencia de parada TAAT en el extremo 3'. Se identificaron o crearon sitios de restricción únicos en las posiciones adecuadas del gen (aproximadamente cada 150 pares de bases). El gen resultante (HuCol(\alpha2)^{EC}, figuras 50A a 50E) (SEQ ID n.º 31) tiene el uso de codones ofrecido en la tabla IV. Otras secuencias que se aproximan al sesgo de codones de E. coli también son aceptables.

Se sintetizaron oligonucleótidos en un sintetizador de ADN Oligo 1000 de Beckman, se escindieron y se desprotegieron con NH_{4}OH acuoso, y se purificaron por electroforesis en geles de urea a 7M/poliacrilamida al 12%. Se disolvieron los oligonucleótidos purificados (32,5 pmol) en 20 \mul de tampón de ligación (Boehringer Mannheim, n.º de catálogo 1 635 379) y se hibridaron calentando a 95ºC y después enfriando lentamente durante 45 minutos hasta alcanzar los 20ºC. Los oligonucleótidos hibridados se ligaron durante 5 minutos a temperatura ambiente con el vector digerido (1 \mug) utilizando la ADN ligasa de T4 (5 unidades). La mitad de la mezcla de transformación se introdujo por transformación mediante choque térmico en las células DH5\alpha y 100 \mul del mililitro de mezcla de transformación se sembró en placas con agar de caldo de Luria (LB) que contiene ampicilina a 70 \mug/ml. Se incubaron las placas durante una noche a 37ºC. Se escogieron algunas colonias resistentes a la ampicilina (de 6 a 12) y se hicieron crecer durante una noche en medio LB que contiene ampicilina a 70 \mug/ml. Se aisló el ADN plasmídico de cada cultivo mediante minipreparación QIAprep (Qiagen, Valencia, CA) y se cribaron por la presencia del inserto mediante digestión con las enzimas de restricción flanqueantes y migrando los productos de la digestión en geles de electroforesis de agarosa. Se confirmaron los clones con inserto mediante secuenciación estándar del ADN por terminación con didesoxinucleótidos. Para clonar juntas las secciones del gen del colágeno, el inserto que cubre una porción flanqueante del gen se ligó en un vector que contiene la porción vecina del gen. Se aislaron los insertos de los plásmidos y se cortaron los vectores mediante digestión doble durante 2 horas a 37ºC con las enzimas de restricción adecuadas. El vector y el inserto digeridos se purificaron por electroforesis en gel de agarosa. Se ligaron el inserto y el vector durante 5 minutos a temperatura ambiente siguiendo el procedimiento del kit de ligación de ADN Rapid (Boehringer Mannheim). La mitad de la mezcla de ligación se introdujo por transformación en las células DH5\alpha y 1/10 de la mezcla de transformación se sembró en placas con agar de LB que contiene ampicilina a 70 \mug/ml. Después de incubar durante una noche a 37ºC, se escogieron algunos clones resistentes a la ampicilina y se cribaron por la presencia del ADN insertado tal y como se describió anteriormente. Se confirmaron los clones mediante secuenciación por terminación con didesoxinucleótidos.

El resto del gen del colágeno se construye de forma similar, de tal forma que la secuencia final del ADN es la que se ofrece en las figuras 50A a 50E (SEQ ID n.º 31).

B) Expresión del gen en E. coli

Después de la construcción del gen completo del colágeno humano de tipo I (\alpha2) con el uso de codones optimizado para E. coli, el gen clonado se expresa en E. coli. Un plásmido (pHuCol)(\alpha_{2})^{Ec}, figura 55) que codifica el gen del colágeno completo (figuras 50A a 50E) colocado detrás del promotor tac inducible por el isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) y que también codifica la \beta-lactamasa se introduce por transformación en la cepa de Escherichia coli DH5\alpha (supE44 \DeltalacU169 (\Phi80lacZ\DeltaM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1) mediante transformación estándar por choque térmico. Los cultivos de la transformación se sembraron en placas con caldo de Luria (LB) que contiene ampicilina a 100 \mug/ml y, después de hacerlas crecer durante una noche, se utiliza una única colonia resistente a la ampicilina para inocular 10 ml de LB que contiene ampicilina a 100 \mug/ml. Después de 10 a 16 horas de crecimiento con agitación (225 rpm) a 37ºC, se utiliza este cultivo para inocular 1 l de LB que contiene ampicilina a 100 \mug/ml en un matraz de agitador de 1,5 l. Después del crecimiento a 37ºC, 225 rpm, durante 2 horas tras la inoculación, la densidad óptica a 600 nm es de aproximadamente 0,5 DO/ml. Se añade el IPTG a 1 mM y se deja crecer el cultivo durante 5 a 10 horas más. Se recogen las células por centrifugación (5000 rpm, 10 minutos) y se lisan por rotura mecánica. Se purifica el colágeno humano recombinante mediante fraccionamiento con sulfato de amonio y cromatografía en columna. El rendimiento por lo general es de 15 a 25 mg/l de cultivo.

Ejemplo 15 Expresión en E. coli de los fragmentos del colágeno humano de tipo I (\alpha_{2}) con el uso de codones optimizado para E. coli

Un plásmido (pN1-2, figuras 56) que codifica el gen de los 80 aminoácidos del extremo amino del colágeno humano de tipo I (\alpha_{2}) (SEQ ID n.º 31, figura 54) con el uso de codones optimizado para E. coli colocado detrás del promotor tac inducible por el isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) y que también codifica la \beta-lactamasa se introduce por transformación en la cepa de Escherichia coli DH5\alpha (supE44 \DeltalacU169 (\Phi80lacZ\DeltaM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1)mediante transformación estándar por choque térmico. Los cultivos de la transformación se siembran en placas con caldo de Luria (LB) que contiene ampicilina a 100 \mug/ml y, después de hacerlas crecer durante una noche, se utiliza una única colonia resistente a la ampicilina para inocular 10 ml de LB que contiene ampicilina a 100 \mug/ml. Después de10 a 16 horas de crecimiento con agitación (225 rpm) a 37ºC, se utiliza este cultivo para inocular 1 l de LB que contiene ampicilina a 100 \mug/ml en un matraz de agitador de 1,5 l. Después del crecimiento a 37ºC, 225 rpm, durante 2 horas tras la inoculación, la densidad óptica a 600 nm es de aproximadamente 0,5 DO/ml. Se añade el IPTG a 1 mM y se deja crecer el cultivo durante 5 a 10 horas más. Se recogen las células por centrifugación (5000 rpm, 10 minutos) y se lisan mediante rotura mecánica. Se purifica el colágeno humano recombinante mediante fraccionamiento con sulfato de amonio y cromatografía en columna. El rendimiento es por lo general de 15 a 25 mg/l de cultivo.

Ejemplo 16 Incorporación de la hidroxiprolina en proteínas en E. coli en condiciones de ayuno prolongado de prolina

Siete plásmidos, pGEX-4T.1 (figura 73), pTRc-TGF (figura 74), pMal-C2 (figura 1), pTrc-FN (figura 75), pTrc-FN-TGF (figura 76), pTrc-FN-Bmp (figura 77) y pGEX-HuColl^{EC}, cada uno de los cuales contiene uno de los genes que codifican las proteínas siguientes: glutatión S-transferasa (GST), polipéptido de TGF-\beta1 humano maduro (TGF-\beta1), proteína de unión a la manosa (MBP), un fragmento de 70 kDa de la fibronectina humana (FN), una fusión de la FN y el TGF-\beta1 (FN-TGF-\beta1), una fusión de la FN y la proteína morfogénica de hueso humano 2A (FN-BMP-2A) y una fusión de la GST y el colágeno (GST-Coll), se utilizaron individualmente para transformar la cepa de E. coli auxótrofa para la prolina JM109 (F^{-}). Los cultivos de las transformaciones se sembraron en placas con agar de LB que contiene ampicilina a 100 \mug/ml. Después de incubar durante una noche a 37ºC, una única colonia de una placa de transformación reciente se utilizó para inocular 5 ml de un medio LB que contiene 400 mg de ampicilina. Después de una noche de crecimiento a 37ºC, se centrifugó este cultivo, se desechó el sobrenadante y se lavó el sedimento celular dos veces con 5 ml de medio M9 (sales M9 a 1X, glucosa al 0,5%, MgCl_{2} a 1 mM, tiamina al 0,01%, glicina a 200 \mug/ml, alanina a 200 \mug/ml, 100 \mug/ml de los otros aminoácidos salvo la prolina y ampicilina a 400 \mug/ml). Finalmente, las células se resuspendieron en 5 ml de medio M9. Después de incubar con agitación a 37ºC durante 30 minutos, se añadió la trans-4-hidroxiprolina a 40 mM, NaCl a 0,5 mM e isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido a 1,5 mM. En algunos cultivos, no se hizo una de estas adiciones, tal y como se indica en los rótulos de las calles de los geles. Después de la adición, se continuó la incubación con agitación a 37ºC. Después de 4 horas, se centrifugaron los cultivos, se desecharon los sobrenadantes y se resuspendieron los sedimentos celulares en tampón de muestra de SDS-PAGE [Tris a 300 mM (pH 6,8)/SDS al 0,5%/glicerol al 10%/\beta-mercaptoetanol a 0,4 M/azul de bromofenol al 0,2%] para dar 15 OD600 nm/ml, se colocaron en agua hirviendo durante cinco minutos y se migraron por electroforesis en geles de poliacrilamida desnaturalizantes. Se visualizaron las proteínas en los geles mediante tinción con azul de Coomassie R250. Los resultados de los geles se describen en las exploraciones mostradas en las figuras 57 a 59. Las exploraciones referentes a GST, TGF-\beta1, MBP, FN, FN-TGF-\beta1 y FN-BMP-2A (figuras 57 y 58) muestran tres calles para cada péptido, a saber, una calle que indica +NaCl/+Hyp en el que están presentes el NaCl (hiperosmótico) y la trans-4-hidroxiprolina; una calle que indica -NaCl en la que está presente la trans-4-hidroxiprolina pero no hay NaCl; y una calle que indica -Hyp que es +NaCl pero sin trans-4-hidroxiprolina. Los asteriscos de las exploraciones marcan las bandas de las proteínas que corresponden a la expresión de la proteína deseada. Los casos en los que se expresaba la proteína deseada implican +NaCl en conexión con +Hyp, lo que demuestra la dependencia de +NaCl y +Hyp.

La exploración mostrada en la figura 59 que se refiere a la GST-colágeno muestra cuatro calles que se refieren a la GST-Coll, a saber, una calle que indica +Hyp/+NaCl/-IPTG en la que la trans-4-hidroxiprolina y el NaCl están presentes pero el IPTG (el inductor de la expresión de la proteína) no lo está, y como no hay inductor, no se observa la banda de la proteína deseada; una calle que indica +NaCl/+IPTG/-Hyp en la que el NaCl y el IPTG están presentes pero la trans-4-hidroxiprolina no lo está y, como la trans-4-hidroxiprolina no está presente, no se observa la banda de la proteína deseada; una calle que indica +NaCl/+Pro/+IPTG en la que el NaCl, la prolina y el IPTG están presentes, pero como la proteína deseada no es estable cuando contiene prolina, no hay banda de proteína deseada; y una calle designada +IPTG/+NaCl/+Hyp en la que el IPTG, el NaCl y la trans-4-hidroxiprolina están presentes y, como la proteína está estabilizada por la presencia de la trans-4-hidroxiprolina, se observa de una banda de proteína que se marca con un asterisco.

Ejemplo 17 Incorporación de la hidroxiprolina en un péptido similar al colágeno en E. coli

Un plásmido (pGST-CM4, figura 60) que contiene el gen del mimético 4 del colágeno (CM4, figura 61) (SEQ ID n.º 39) unido genéticamente al extremo 3' del gen de la glutatión S-transferasa de S. japonicum se utilizó para transformar por electroporación la cepa de E. coli auxótrofa para la prolina JM109 (F^{-}). Los cultivos de la transformación se sembraron en placas con agar de LB que contiene ampicilina a 100 \mug/ml. Después de incubar durante una noche a 37ºC, se utilizó una única colonia de una placa de transformación reciente para inocular 5 ml de medio LB que contiene ampicilina a 100 \mug/ml. Después de una noche de crecimiento a 37ºC, se centrifugaron 500 \mul de este cultivo, se desechó el sobrenadante y se lavó el sedimento celular una vez con 500 \mul de medio M9 (sales M9 a 1X, glucosa al 0,5%, MgCl_{2} a 1 mM, tiamina al 0,01%, glicina a 200 \mug/ml, alanina a 200 \mug/ml, 100 \mug/ml de los otros aminoácidos excepto prolina y ampicilina a 400 \mug/ml). Finalmente, las células se suspendieron en 5 ml de medio M9 que contiene prolina a 10 \mug/ml y 2 ml de éste se utilizaron para inocular 30 ml de medio M9 que contenía prolina a 10 \mug/ml. Después de incubar con agitación a 37ºC durante 8 horas, se centrifugó el cultivo y se lavó el sedimento celular una vez con medio M9 que contenía prolina a 5 \mug/ml. Se resuspendió el sedimento en 15 ml de medio M9 que contenía 5 \mug/ml de prolina y se utilizó este cultivo para inocular 1 l de medio M9 que contenía 5 \mug/ml de prolina. Este cultivo se hizo crecer durante 18 horas a 37ºC para el ayuno prolongado de la prolina. En este momento, se centrifugó el cultivo, se lavaron una vez las células una vez con medio M9 (sin prolina) y se resuspendieron las células en 1 L de medio M9 que contenía hidroxiprolina a 80 mM, NaCl a 0,5 M e isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido a 1,5 mM. Se continuó la incubación a 37ºC con agitación durante 22 horas. Se centrifugaron los cultivos y se guardaron los sedimentos celulares a -20ºC hasta que se procesaron después.

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Ejemplo 18 Incorporación de la prolina en un péptido similar al colágeno en E. coli

Un plásmido (pGST-CM4, figura 60) que contiene el gen del mimético 4 del colágeno (CM4, figura 61) (SEQ ID n.º 39) unido genéticamente al extremo 3' del gen de la glutatión-S-transferasa de S. japonicum se utilizó para transformar por electroporación la cepa de E. coli auxótrofa para la prolina JM109 (F^{-}). Se sembraron los cultivos de la transformación en placas de agar de LB que contienen ampicilina a 100 \mug/ml. Después de incubar durante una noche a 37ºC, se utilizó una única colonia de la placa de transformación reciente para inocular 5 ml de medio LB que contiene ampicilina a 100 \mug/ml. Después de una noche de crecimiento a 37ºC, se centrifugaron 500 \mul de este cultivo, se desechó el sobrenadante y se lavó el sedimento celular una vez con 500 \mul de medio M9 (sales M9 a 1X, glucosa al 0,5%, MgCl_{2} a 1 mM, tiamina al 0,01%, glicina a 200 \mug/ml, alanina a 200 \mug/ml, 100 \mug/ml de los otros aminoácidos excepto la prolina y ampicilina a 400 \mug/ml). Finalmente, se resuspendieron las células en 5 ml de medio M9 que contiene prolina a 10 \mug/ml y se utilizaron 2 ml de éste para inocular 30 ml de medio M9 que contiene prolina a 10 \mug/ml. Se incubó este cultivo con agitación a 37ºC durante 8 horas. Se centrifugó el cultivo y se lavó el sedimento celular una vez con medio M9 que contiene prolina a 5 \mug/ml. Se resuspendió el sedimento en 15 ml de medio M9 que contiene 5 \mug/ml de prolina y se utilizo este cultivo para inocular 1 l de medio M9 que contiene 5 \mug/ml de prolina. Se hizo crecer este cultivo durante 18 horas a 37ºC para el ayuno prolongado de la prolina. En este momento, se centrifugó el cultivo, se lavaron las células una vez con medio M9 (sin prolina) y, finalmente, las células se resuspendieron en 1 l de medio M9 que contiene prolina a 2,5 mM, NaCl a 0,5 M e isopropil-p-\beta-tiogalactopiranósido a 1,5 M. Se continuó la incubación a 37ºC con agitación durante 22 horas. Luego, se centrifugaron los cultivos y se guardaron los sedimentos celulares a -20ºC hasta que se procesaron.

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Ejemplo 19 Purificación desde E. coli del péptido similar al colágeno que contiene hidroxiprolina

El sedimento celular de un cultivo de fermentación de 1 l preparado tal y como se describe en el ejemplo 17 anterior se resuspendió en 20 ml de una solución salina tamponada de fosfato de Dulbecco (pH 7,1) (PBS) que contiene EDTA a 1 mM, PMSF a 100 \muM, E64 a 0,5 \mug/ml y pepstatina a 0,7 \mug/ml (tampón de resuspensión). Se lisaron las células dos veces haciéndolas pasar por una prensa French. Después de la lisis, se centrifugó la suspensión durante 30 minutos a 30.000 xg. Se desechó el sobrenadante y se lavó el sedimento una vez con 5 ml de tampón de resuspensión que contiene urea a 1 M y Tritón X100 al 0,5% y después se lavó con 7 ml de tampón de resuspensión sin urea o Tritón X100. Finalmente, se resuspendió el sedimento en 5 ml de hidrocloruro de guanidina a 6 M en una disolución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (pH 7,1) que contiene EDTA a 1 mM y \beta-mercaptoetanol a 2 mM, y se sometió a ultrasonidos en hielo durante 3 x 60 segundos (microsonda, potencia = 3,5, sonicador modelo Heat System XL-2020). La suspensión sometida a ultrasonidos se incubó a 4ºC durante 18 horas y luego se centrifugó a 14000 rpm en una microcentrifugadora. El sobrenadante (6 ml) se dializó (10.000 MWCO) frente a 4 x 4 l de agua destilada a 4ºC. El contenido de los tubos de diálisis se transfirió a un matraz con fondo redondo de 150 ml y se liofilizó hasta secarlo completamente. Se disolvió el residuo (\sim30 mg) en 3 ml de ácido fórmico al 70% y se añadieron 40 mg de bromuro de cianógeno. Se enjuagó el matraz una vez con nitrógeno, se evacuó y se dejó en agitación durante 18 horas a temperatura ambiente. El contenido del matraz se secó completamente al vacío a temperatura ambiente, se resuspendió el residuo en 5 ml de agua destilada y se evaporó hasta secarlo completamente de nuevo. Se repitió esto 2 veces. Finalmente, se disolvió el residuo en 2 ml de ácido trifluoroacético (TFA) al 0,2%. El material soluble en ácido trifluoroacético se aplicó en alícuotas de 100 \mul a una columna R2 de Poros (4,6 mm x 100 mm) que se eluye a 5 ml/min con un tampón de comienzo de 98% de ácido trifluoroacético al 0,1% en agua/2% de TFA al 0,1%en acetonitrilo. Se eluyó la proteína que contiene hidroxiprolina con un gradiente desde el 2% de TFA al 0,1%/acetonitrilo hasta el 40% de TFA al 0,1%/acetonitrilo durante 25 volúmenes de columna (figura 62A). El mimético del colágeno se eluyó entre el 18% y el 23% de TFA al 0,1%/acetonitrilo. La figura 62A es un cromatograma de la elución del CM4 que contiene hidroxiprolina en una columna RP2 de Poros (disponible en Perseptive Biosystems, Framingham, MA). La flecha indica el pico que contiene la CM4 que contiene hidroxiprolina. Se analizaron las fracciones por SDS-PAGE y se agruparon y se liofilizaron las fracciones que contienen el mimético del colágeno. El material liofilizado se guardó a -20ºC.

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Ejemplo 20 Purificación a partir de E. coli del péptido similar al colágeno que contiene prolina

El sedimento celular de un cultivo de fermentación de 500 ml se preparó tal y como se describe en el ejemplo 18 anterior, se resuspendió en 20 ml de la disolución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (pH 7,1) (PBS) que contiene EDTA a 10 mM, PMSF a 100 \muM, E64 al 0,5 \mug/ml y aprotinina a 0,06 \mug/ml. Se añadió lisozima (2 mg) y se incubó la suspensión a 4ºC durante 60 minutos. La suspensión se sometió a ultrasonidos durante 5 x 60 segundos (microsonda, potencia = 3,5, sonicador modelo Heat Systems XL-2020). Se centrifugó la suspensión sometida a ultrasonidos a 20.000 xg durante 15 minutos. Se ajustó el sobrenadante a Tritón X100 al 1% y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente con 7 ml de 4B de glutatión-sefarosa 4B preequilibrada en PBS. Se centrifugó la suspensión a 500 rpm durante 3 minutos. Se decantó el sobrenadante y se lavó la resina 3 veces con 8 ml de PBS. Se eluyeron las proteínas unidas con 3 alícuotas (2 ml cada una, agitando suavemente durante 10 minutos a temperatura ambiente) de glutatión a 10 mM en Tris a 50 mM (pH 8,0). Se reunieron los eluyentes y se dializaron (10.000 MWCO) frente a 3 x 4 l de agua destilada a 4ºC. El contenido de los tubos de diálisis se transfirieron a un matraz con fondo redondo de 150 ml y se liofilizaron hasta la secarlos completamente. Se disolvió el residuo en 3 ml de ácido fórmico al 70% y se añadieron 4 mg de bromuro de cianógeno. Se enjuagó el matraz una vez con nitrógeno, se evacuó y se mantuvo en agitación durante 18 horas a temperatura ambiente. El contenido del matraz se secó completamente al vacío a temperatura ambiente, se resuspendió el residuo en 5 ml de agua destilada y se evaporó de nuevo hasta secarlo complemente. Esto se repitió dos veces. Finalmente, se disolvió el residuo en 2 ml de ácido trifluoroacético (TFA) al 0,2%. El material soluble en ácido trifluoroacético se aplicó en alícuotas de 100 \mul a una columna R2 de Poros (4,6 mm x 100 mm) que se eluye a 5 ml/min con tampón de comienzo de 98% de ácido trifluoroacético al 0,1% en agua/2% de TFA al 0,1% en acetonitrilo. Se eluyó la proteína unida con un gradiente desde el 2% de TFA al 0,1%/acetonitrilo hasta el 40% de TFA al 0,1%/acetonitrilo durante 25 volúmenes de columna (figura 62B). El mimético del colágeno se eluyó entre el 24 y el 27% de TFA al 0,1%/acetonitrilo. La figura 62 B es un cromatograma de la elución de la CM4 que contiene prolina de una columna RP2 de Poros. La flecha señala el pico que contiene el CM4 que contiene prolina. Se analizaron las fracciones por SDS-PAGE y se agruparon y liofilizaron las fracciones que contenían el mimético del colágeno. Se guardó el material liofilizado a -20ºC.

Ejemplo 21 Análisis de aminoácidos del mimético del colágeno que contiene hidroxiprolina y del mimético del colágeno que contiene prolina

Aproximadamente 30 \mug de mimético del colágeno que contiene hidroxiprolina y de mimético del colágeno que contiene prolina purificados que se prepararon tal y como se describe en los ejemplo 19 y 20, respectivamente, se disolvieron en 250 \mul de ácido clorhídrico a 6 N en ampollas de vidrio. Se enjuagaron las ampollas dos veces con nitrógeno, se sellaron al vacío y se incubaron a 110ºC durante 23 horas. Después de la hidrólisis, se retiraron las muestras de las ampollas y se secaron completamente al vacío. Se disolvieron las muestras en 15 \mul de ácido clorhídrico a 0,1 N y se sometieron al análisis de aminoácidos en un analizador de aminoácidos AminoQuant 1090 de Hewlett Packard utilizando química de derivación de OPA y FMOC estándar. En las figuras 63A a 63D se muestran ejemplos de los resultados del análisis de aminoácidos que ilustran la región de los cromatogramas donde se eluyen los aminoácidos secundarios (prolina e hidroxiprolina). Estas figuras también muestran cromatogramas de los estándares de aminoácidos de la prolina y la hidroxiprolina. Más particularmente, la figura 63A ilustra un cromatograma de un estándar de aminoácido de la prolina (250 pmol). El asterisco (*) señala un pico contaminante; la figura 63B ilustra un cromatograma de un estándar de aminoácido de la hidroxiprolina (250 pmol). El asterisco (*) indica un pico contaminante. La figura 63C ilustra un cromatograma de análisis de aminoácidos de la hidrólisis del CM4 que contiene prolina. Sólo se muestra la región del cromatograma donde se eluyen la prolina y la hidroxiprolina. El asterisco (*) indica un pico contaminante. La figura 63D describe un cromatograma de análisis de aminoácidos de la hidrólisis del CM4 que contiene la hidroxiprolina. Sólo se muestra la región del cromatograma donde se eluyen la prolina y la hidroxiprolina. El asterisco (*) indica un pico contaminante.

Ejemplo 22 Determinación de las condiciones de ayuno prolongado de la prolina para E. coli [cepa JM109 (F^{-})]

Un plásmido (pGST-CM4, figura 60) que contiene el gen del mimético 4 del colágeno (CM4, figura 61) unido genéticamente al extremo 3' del gen de la glutatión S-transferasa de S. japonicum se utilizó para transformar por electroporación la cepa de E. coli auxótrofa para la prolina JM109 (F^{-}). Los cultivos de la transformación se sembraron en placas con agar de LB que contiene ampicilina a 100 \mug/ml. Después de incubar durante una noche a 37ºC, se utilizó una colonia aislada de una placa de transformación reciente para inocular 2 ml de medio M9 (sales M9 a 1X, glucosa al 0,5%, MgCl_{2} a 1 mM, tiamina al 0,01%, glicina a 200 \mug/ml, alanina a 200 \mug/ml, 100 \mug/ml de los otros aminoácidos excepto la prolina y carbenicilina a 200 \mug/ml) y que contiene prolina a 20 \mug/ml. Después del crecimiento a 37ºC con agitación durante 8 horas, se utilizaron 1,5 ml para inocular 27 ml del medio M9 que contiene prolina a 45 \mug/ml. Después de la incubación a 37ºC con agitación durante 7 horas, se centrifugó el cultivo, se lavó el sedimento celular con 7 ml de medio M9 sin prolina y, finalmente, se resuspendió en 17 ml de medio M9 sin prolina. Se utilizó este cultivo para inocular cuatro cultivos de 35 ml de medio M9 que contiene prolina a 4 \mug/ml a una DO600 de 0,028. Se incubaron los cultivos con agitación a 37ºC y se monitorizó la DO600. Después de 13,5 horas de crecimiento, la DO600 se mantenía constante. Entonces, se complementó un cultivo con prolina a 15 \mug/ml, uno con hidroxiprolina a 15 \mug/ml, uno con todos los aminoácidos a 15 \mug/ml excepto la prolina y la hidroxiprolina, y un cultivo sin nada. Se continuó la incubación y se monitorizó la DO600 durante 24 horas. La figura 64 es una gráfica de la DO600 frente al tiempo para los cultivos de JM109 (F-) crecidos hasta la fase estacionaria y, después, complementados con distintos aminoácidos. El punto en el que se complementaron los cultivos está indicado con una flecha. El ayuno prolongado de la prolina resulta evidente porque sólo el cultivo complementado con la prolina siguió creciendo más allá de la fase estacionaria.

Ejemplo 23 Incorporación de la hidroxiprolina en el colágeno de tipo I (\alpha1) en E. coli

Un plásmido (pHuCol(\alpha1)^{EC}, figura 65), que contiene el gen del colágeno de tipo I (\alpha1) con el uso de codones optimizado para E. coli (figura 39A a 39E) (SEQ ID n.º 19) bajo el control del promotor tac y que contiene el gen de la resistencia al cloranfenicol se utilizó para transformar por electroporación la cepa de E. coli auxótrofa para la prolina JM109 (F^{-}). Los cultivos de la transformación se sembraron en placas con agar de LB que contiene cloranfenicol a 20 \mug/ml. Después de la incubación durante una noche a 37ºC, se utilizó una colonia aislada de una placa de transformación reciente para inocular 100 ml del medio LB que contiene cloranfenicol a 20 \mug/ml. Se hizo crecer este cultivo hasta alcanzar una DO600nm de 0,5 y se transfirieron alícuotas de 100 \mul a tubos de 1,5 ml. Se guardaron los tubos a -80ºC. Para la expresión, se descongeló un tubo en hielo y se utilizó para inocular 25 ml de medio LB que contiene cloranfenicol a 20 \mug/ml. Después de una noche a 37ºC de crecimiento, se retiró una alícuota de 4 ml, se centrifugó, se lavó el sedimento celular una vez con 1 ml de medio YT a 2x que contiene cloranfenicol a 20 \mug/ml y se utilizaron las células lavadas para inocular 1 l de medio YT a 2x que contiene cloranfenicol a 20 \mug/ml. Se hizo crecer este cultivo a 37ºC hasta alcanzar una DO600nm de 0,8. Se centrifugó el cultivo y se lavó el sedimento celular una vez con 100 ml de medio M9 (sales M9 a 1X, glucosa al 0,5%, MgCl_{2} a 1 mM, tiamina al 0,01%, glicina a 200 \mug/ml, alanina a 200 \mug/ml, 100 \mug/ml de los otros aminoácidos excepto la prolina y cloranfenicol a 20 \mug/ml). Se resuspendieron las células en 910 ml de medio M9 (sales M9 a 1X, glucosa al 0,5%, MgCl_{2} a 1 mM, tiamina al 0,01%, glicina a 200 \mug/ml, alanina a 200 \mug/ml, 100 \mug/ml de los otros aminoácidos excepto la prolina y cloranfenicol a 20 \mug/ml) y se dejaron crecer a 37ºC durante 30 minutos. Se añadieron NaCl (80 ml de 5 M), hidroxiprolina (7,5 ml de 2 M) e IPTG (500 \mul de 1 M) y se prosiguió el crecimiento durante 3 horas. Se recogieron las células por centrifugación y se guardaron a -20ºC.

Ejemplo 24 Incorporación de la hidroxiprolina en el tipo I (\alpha2) en E. coli

Un plásmido (pHuCol(\alpha2)^{Ec}, figura 66) que contiene el gen del colágeno de tipo I (\alpha2) con el uso de codones optimizado para E. coli (figura 50A a 50E) (SEQ ID n.º 31) bajo el control del promotor tac y que contiene el gen de la resistencia al cloranfenicol se utilizó para transformar por electroporación la cepa de E. coli auxótrofa para la prolina JM109 (F^{-}). Los cultivos de la transformación se sembraron en placas con agar de LB que contiene cloranfenicol a 20 \mug/ml. Después de incubar durante una noche a 37ºC, se utilizó una colonia aislada de una placa de transformación reciente para inocular 100 ml de medio LB que contiene cloranfenicol a 20 \mug/ml. Se hizo crecer este cultivo hasta alcanzar una DO600nm de 0,5 y se transfirieron alícuotas de 100 \mul a tubos de 1,5 ml. Se guardaron los tubos a
-80ºC. Para la expresión, se descongeló un tubo en hielo y se utilizó para inocular 25 ml de medio LB que contiene cloranfenicol a 20 \mug/ml. Después de una noche de crecimiento a 37ºC, se retiró una alícuota de 4 ml, se centrifugó, se lavó el sedimento celular una vez con 1 ml del medio YT a 2x que contiene cloranfenicol a 20 \mug/ml, y se utilizaron las células lavadas para inocular 1 l del medio YT a 2x que contiene cloranfenicol a 20 \mug/ml. Se hizo crecer este cultivo a 37ºC hasta alcanzar una DO600nm de 0,8. Se centrifugó el cultivo y se lavó el sedimento celular una vez con 100 ml de medio M9 (sales M9 a 1X, glucosa al 0,5%, MgCl_{2} a 1 mM, tiamina a 0,01%, glicina a 200 \mug/ml, alanina a 200 \mug/ml, 100 \mug/ml de los otros aminoácidos excepto la prolina y cloranfenicol a 20 \mug/ml). Se resuspendieron las células en 910 ml del medio M9 (sales M9 a 1X, glucosa al 0,5%, MgCl_{2} a 1 mM, tiamina al 0,01%, glicina a 200 \mug/ml, alanina a 200 \mug/ml, 100 \mug/ml de los otros aminoácidos excepto la prolina y cloranfenicol a 20 \mug/ml) y se dejaron crecer a 37ºC durante 30 minutos. Se añadieron NaCl (80 ml de 5 M), hidroxiprolina (7,5 ml de 2 M) e IPTG (500 \mul de 1 M) y el crecimiento continuó durante 3 horas. Se recogieron las células por centrifugación y se guardaron a -20ºC.

Ejemplo 25 Incorporación de la hidroxiprolina en un fragmento carboxiterminal del colágeno de tipo I (\alpha1) en E. coli

Un plásmido (pD4-\alpha1, figura 67) que codifica el gen de los 219 aminoácidos del extremo carboxilo del colágeno humano de tipo I (\alpha1) con el uso de codones optimizado para E. coli fusionado con el extremo 3' del gen de la glutatión S-transferasa y bajo el control del promotor tac, y que contiene el gen de la resistencia a la ampicilina, se utilizó para transformar por electroporación la cepa de E. coli auxótrofa para la prolina JM109 (F^{-}). Los cultivos de la transformación se sembraron en placas con agar de LB que contiene ampicilina a 100 \mug/ml. Después de incubar durante una noche a 37ºC, se utilizó una colonia aislada de una placa de transformación reciente para inocular 100 ml de medio LB que contiene ampicilina a 100 \mug/ml. Se hizo crecer este cultivo hasta alcanzar una DO600nm de 0,5 y se transfirieron alícuotas de 100 \mul a tubos de 1,5 ml. Los tubos se guardaron a -80ºC. Para la expresión, se descongeló un tubo en hielo y se utilizó para inocular 25 ml de medio LB que contiene ampicilina a 400 \mug/ml. Después de una noche de crecimiento a 37ºC, se retiró una alícuota de 4 ml, se centrifugó, se lavó el sedimento celular una vez con 1 ml del medio YT a 2X que contiene ampicilina a 400 \mug/ml y se utilizaron las células lavadas para inocular 1 l del medio YT a 2x que contiene ampicilina a 400 \mug/ml. Se hizo crecer este cultivo a 37ºC hasta alcanzar una DO600nm de 0,8. Se centrifugó el cultivo y se lavó el sedimento celular una vez con 100 ml del medio M9 (sales M9 a 1X, glucosa al 0,5%, MgCl_{2} a 1 mM, tiamina a 0,01%, glicina a 200 \mug/ml, alanina a 200 \mug/ml, 100 \mug/ml de los otros aminoácidos excepto la prolina y ampicilina a 400 \mug/ml). Se resuspendieron las células en 910 ml del medio M9 (sales M9 a 1X, glucosa a 0,5%, MgCl_{2} a 1 mM, tiamina al 0,01%, glicina a 200 \mug/ml, alanina a 200 \mug/ml, 100 \mug/ml de los otros aminoácidos excepto la prolina y ampicilina a 400 \mug/ml) y se dejaron crecer a 37ºC durante 30 minutos. Se añadieron NaCl (80 ml de 5 M), hidroxiprolina (7,5 ml de 2 M) e IPTG (500 \mul de 1 M) y se prosiguió el crecimiento durante 3 horas. Se recogieron las células por centrifugación y se guardaron a -20ºC.

Ejemplo 26 Incorporación de la hidroxiprolina en un fragmento carboxiterminal del colágeno de tipo I (\alpha2) en E. coli

Un plásmido (pD4-\alpha2, figura 68) que codifica el gen de los 219 aminoácidos del extremo carboxilo del colágeno humano de tipo I (\alpha2) con el uso de codones optimizados para E. coli, tal y como se construyó de acuerdo con el ejemplo 14A, fusionado con el extremo 3' del gen para la glutatión S-transferasa y bajo el control del promotor tac, y que contiene el gen de la resistencia a la ampicilina, se utilizó para transformar por electroporación la cepa de E. coli auxótrofa para la prolina JM109 (F^{-}). Los cultivos de la transformación se sembraron en placas con agar de LB que contienen ampicilina a 100 \mug/ml. Después de incubar durante una noche a 37ºC, se utilizó una colonia aislada de una placa de transformación reciente para inocular 100 ml de medio LB que contiene ampicilina a 100 \mug/ml. Se hizo crecer este cultivo hasta alcanzar una DO600nm de 0,5 y se transfirieron alícuotas de 100 \mul a tubos de 1,5 ml. Se guardaron los tubos a -80ºC. Para la expresión, se descongeló un tubo en hielo y se utilizó para inocular 25 ml del medio LB que contiene ampicilina a 400 \mug/ml. Después de una noche de crecimiento a 37ºC, se retiró una alícuota de 4 ml, se centrifugó, se lavó el sedimento celular una vez con 1 ml del medio YT a 2x que contiene ampicilina a 400 \mug/ml, y se utilizaron las células lavadas para inocular 1 l del medio YT a 2x que contiene ampicilina a 400 \mug/ml. Se hizo crecer este cultivo a 37ºC hasta alcanzar una DO600nm de 0,8. Se centrifugó el cultivo y se lavó el sedimento celular una vez con 100 ml de medio M9 (sales M9 a 1X, glucosa a 0,5%, MgCl_{2} a 1 mM, tiamina a 0,01%, glicina a 200 \mug/ml, alanina a 200 \mug/ml, 100 \mug/ml de los otros aminoácidos excepto la prolina y ampicilina a 400 \mug/ml). Se resuspendieron las células en 910 ml de medio M9 (sales M9 a 1X, glucosa al 0,5%, MgCl_{2} a 1 mM, tiamina al 0,01%, glicina a 200 \mug/ml, alanina a 200 \mug/ml, 100 \mug/ml de los otros aminoácidos excepto la prolina y ampicilina a 400 \mug/ml) y se dejó crecer a 37ºC durante 30 minutos. Se añadieron NaCl (80 ml de 5 M), hidroxiprolina (7,5 ml de 2 M) e IPTG (500 \mug de 1 M) y se prosiguió el crecimiento durante 3 horas. Se recogieron las células por centrifugación y se guardaron a -20ºC.

Ejemplo 27 Purificación del fragmento carboxiterminal del colágeno de tipo I (\alpha1) que contiene hidroxiprolina

La pasta celular recogida de un cultivo de 1 l que se ha hecho crecer como en el ejemplo 25 se resuspendió en 30 ml de tampón de lisis (urea a 2 M, NaCl a 137 mM, KCl a 2,7 mM, Na_{2}HPO_{4} a 4,3 mM, KH_{2}PO_{4} a 1,4 mM, EDTA a 10 mM, \betaME a 10 mM, Tritón X-100 al 0,1%, pH 7,4) a 4ºC. Se añadió lisozima (clara de huevo de gallina) a 100 \mug/ml y se incubó la disolución a 4ºC durante 30 minutos. Se pasó la disolución dos veces por una prensa de rotura celular (SLM Instruments, Rochester, NY) y luego se centrifugó a 30.000 x g durante 30 minutos. Se resuspendió el sedimento en 30 ml de Tris-HCl a 50 mM, pH 7,6, se centrifugó a 30.000 x g durante 30 minutos, y se solubilizó el sedimento en 25 ml de tampón de solubilización (urea a 8 M, NaCl a 137 mM, KCl a 2,7 mM, Na_{2}HPO_{4} a 4,3 mM, KH_{2}PO_{4} a 1,4 mM, EDTA a 5 mM, \betaME a 5 mM). Se centrifugó la disolución a 30.000 x g durante 30 minutos y se dializó el sobrenadante frente a dos cambios de 4 l de agua destilada a 4ºC. Después de la diálisis, se liofilizó toda la mezcla. Se disolvió el sólido liofilizado en HCl a 0,1 M en un matraz con agitación. Después de añadir un exceso de 5 veces de BrCN cristalino, se evacuó el matraz y se llenó con nitrógeno. Se dejó proseguir la escisión durante 24 horas, tras lo cual se retiró el disolvente al vacío. Se disolvió el residuo en ácido trifluoroacético al 0,1% (TFA) y se purificó mediante HPLC de fase inversa utilizando una columna de RP-HPLC de Vydac C4 (10 x 250 mm, 5 \mu, 300 \ring{A}) en un sistema BioCad Sprint (Perceptive Biosystems, Framingham, MA). Se eluyó la proteína D4 que contiene hidroxiprolina con un gradiente de acetonitrilo de 15-40% de acetonitrilo/TFA al 0,1% durante 45 minutos. Se eluyó la proteína D4-\alpha1 en acetonitrilo al 26%/TFA al 0,1%.

Ejemplo 28 Purificación del fragmento carboxiterminal del colágeno de tipo I (\alpha2) que contiene hidroxiprolina

La pasta celular recogida de un cultivo de 1 l que se hizo crecer como en el ejemplo 26 se resuspendió en 30 ml de tampón de lisis (urea a 2 M, NaCl a 137 mM, KCl a 2,7 mM, Na_{2}HPO_{4} a 4,3 mM, KH_{2}PO_{4} a 1,4 mM, EDTA a 10 mM, \betaME a 10 mM, Tritón X-100 al 0,1%, pH 7,4) a 4ºC. Se añadió lisozima (clara de huevo de gallina) a 100 \mug/ml y se incubó la disolución a 4ºC durante 30 minutos. Se pasó la disolución dos veces por una prensa de rotura celular (SLM Instruments, Rochester, NY) y después se centrifugó a 30.000 x g durante 30 minutos. Se resuspendió el sedimento en 30 ml de Tris-HCl a 50 mM, pH 7,6, se centrifugó a 30.000 x g durante 30 minutos y se solubilizó el sedimento en 25 ml del tampón de solubilización (urea a 8 M, NaCl a 137 mM, KCl a 2,7 mM, Na_{2}HPO_{4} a 4,3 mM, KH_{2}PO_{4} a 1,4 mM, EDTA a 5 mM y \betaME a 5 mM). Se centrifugó la disolución a 30.000 x g durante 30 minutos y se dializó el sobrenadante frente a dos cambios de 4 l de agua destilada a 4ºC. Después de la diálisis, se liofilizó toda la muestra. Se disolvió el sólido liofilizado en HCl a 0,1 M en un matraz con agitación. Después de añadir un exceso de 5 veces de BrCN cristalino, se evacuó el matraz y se llenó con nitrógeno. Se dejó proseguir la escisión durante 24 horas, tras lo cual se retiró el disolvente al vacío. Se disolvió el residuo en ácido trifluoroacético al 0,1% (TFA) y se purificó mediante HPLC de fase inversa utilizando una columna de RP-HPLC de Vydac C4 (10 x 250 mm, 5 \mu, 300 \ring{A}) en un sistema BioCad Sprint (Perceptive Biosystems, Framingham, MA). Se eluyó la proteína D4 que contiene hidroxiprolina con un gradiente de acetonitrilo del 15 al 40%/TFA al 0,1% durante 45 minutos. La proteína D4-\alpha2 eluyó en acetonitrilo al 25%/TFA al 0,1%.

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Ejemplo 29 Análisis de la composición de los aminoácidos del fragmento carboxiterminal del colágeno de tipo I (\alpha1) que contiene hidroxiprolina

La proteína D4-\alpha1 (10 \mug) purificada como en el ejemplo 27 se secó completamente al vacío en un tubo de microcentrifugación de 1,5 ml. Se analizó la composición de aminoácidos de una muestra en el Biotechnology Resource Laboratory de la fundación W. M. Keck (New Haven, CT) en un secuenciador de Applied Biosystems equipado con un sistema de HPLC en línea. La secuencia determinada experimentalmente de los primeros 13 aminoácidos (SEQ ID n.º 41) y la secuencia predicha a partir de la secuencia del ADN (SEQ ID n.º 42) se muestran en la figura 69. Una muestra de la proteína D4-\alpha1 se analizó por espectrometría de masas en un analizador cuadrupolo BIO-Q de VG Biotech en M-Scan, Inc (West Chester, PA). El espectro de masas y la masa molecular predicha de la proteína D4-\alpha1 si contuviera hidroxiprolina al 100% en vez de prolina se dan en la figura 70. La masa molecular predicha de la proteína D4-\alpha1 que contiene hidroxiprolina al 100% en vez de prolina es de 20.807,8 Da. La masa molecular determinada experimentalmente era de 20.807,5 Da.

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Ejemplo 30 Construcción de los 219 aminoácidos carboxiterminales del gen del fragmento del colágeno de tipo I (\alpha1) con el uso de codones optimizado para E. coli

La secuencia nucleotídica del gen de 657 nucleótidos de los 219 aminoácidos carboxiterminales del colágeno humano de tipo I (\alpha1) con el uso de codones optimizado para E. coli se muestra en la figura 71. Para la síntesis de este gen, se identificaron o crearon sitios de restricción únicos aproximadamente cada 150 pares de bases. Se sintetizaron oligonucleótidos de aproximadamente 80 nucleótidos en un sintetizador de ADN Oligo 1000 de Beckman, se escindieron y se desprotegieron con NH_{4}OH acuoso, y se purificó por electroforesis en geles de urea a 7 M/poliacrilamida al 12%. Se diseñó cada conjunto de oligonucleótidos para que tuvieran un sitio de la enzima de restricción EcoRI en el extremo 5', un sitio de restricción único cerca del extremo 3', seguido de una secuencia de parada TAAT y un sitio de la enzima de restricción HindIII en el mismo extremo 3'. Los primeros 4 oligonucleótidos, que comprenden los primeros 84 aminoácidos de los 219 aminoácidos carboxiterminales del colágeno humano de tipo (\alpha1) con el uso de codones optimizado para E. coli se ofrecen en la figura 81 (SEQ ID n.º 47 a 50).

Se hibridaron los oligonucleótidos N4-1 (SEQ ID n.º 47) y N4-2 (SEQ ID n.º 48) (1 \mug cada uno) en 20 \mul del tampón de la ADN polimerasa de T7 [Tris-HCl a 40 mM (pH 8,0), MgCl_{2} a 5 mM, ditiotreitol a 5 mM, NaCl a 50 mM, seroalbúmina bovina a 0,05 mg/ml] calentando a 90ºC durante 5 minutos y enfriando después lentamente hasta alcanzar la temperatura ambiente. Después de una centrifugación breve a 14000 rpm, se añadieron 10 unidades de la ADN polimerasa de T7 y 2 \mul de una disolución de los cuatro dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP, a 2,5 mM cada uno) a los oligonucleótidos hibridados. Se incubaron las reacciones de extensión a 37ºC durante 30 minutos y a continuación se calentaron a 70ºC durante 10 minutos. Después de enfriar a temperatura ambiente, se añadieron el tampón de HindIII (5 \mul de la concentración 10x), 20 \mul de H_{2}O y 10 unidades de la enzima de restricción HindIII, y se incubaron los tubos a 37ºC durante 10 horas. Se añadieron el tampón de HindIII (2 \mul de la concentración 10x), 13,5 \mul de Tris HCl a 0,5 M (pH 7,5), 1,8 \mul de Tritón X100 al 1%, 5,6 \mul de H_{2}O, y 20 U de EcoRI a cada tubo, y se continuó la incubación durante 2 horas a 37ºC. Se extrajeron una vez las digestiones con un volumen igual de fenol, una vez con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico y una vez con cloroformo/alcohol isoamílico. Después de precipitar con etanol, se resuspendió el sedimento en 10 \mul del tampón TE [Tris HCl a 10 mM (pH 8,0), EDTA a 1 mM]. Se ligaron 4 \mul del sedimento resuspendido durante una noche a 16ºC con el vector pBSKS^{+} digerido con EcoRI/HindIII purificado en gel de agarosa (1 \mug) usando la ADN ligasa de T4 (100 unidades). La mitad de la mezcla de transformación se introdujo por transformación mediante choque térmico en las células DH5\alpha y se sembraron 100 \mul del mililitro de la mezcla de transformación en placas con agar de caldo de Luria (LB) que contiene ampicilina a 70 \mug/ml. Se incubaron las placas durante una noche a 37ºC. Se escogieron algunas colonias resistentes a la ampicilina (de 6 a 12) y se hicieron crecer durante una noche en medio LB que contiene ampicilina a 70 \mug/ml. Se aisló el ADN plasmídico de cada cultivo mediante minipreparaciones Wizard (Promega Corporation, Madison WI) y se cribaron por la presencia del inserto de aproximadamente 120 pares de bases mediante la digestión con EcoRI y HindIII, y se migraron los productos de digestión en geles de electroforesis de agarosa. Se confirmaron los clones con insertos mediante secuenciación de ADN estándar por terminación con didesoxinucleótidos. El clon correcto se denominó pBSN4-1.

Los oligonucleótidos N4-3 (SEQ ID n.º 49) y N4-4 (SEQ ID n.º 50) (figura 81) se sintetizaron, purificaron, hibridaron, extendieron y clonaron en el pBSKS^{+} siguiendo exactamente el mismo procedimiento dado anteriormente para los oligonucleótidos N4-1 y N4-2. El plásmido resultante se denominó pBSN4-2A. Para clonar juntas las secciones del gen del colágeno de pBSN4-1 y pBSN4-2A, se digirió el plásmido pBSN4-1 (1 \mug) durante 2 horas a 37ºC con ApaL1 y HindIII. El vector digerido se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa. El plásmido pBSN4-2A (3 \mug) se digirió durante 2 horas a 37ºC con ApaL1 y HindIII y se purificó el inserto por electroforesis en gel de agarosa. Se ligó el pBSN4-1 digerido con ApaL1/HindIII con este inserto durante una noche a 16ºC usando la ADN ligasa de T4. Se introdujo por transformación la mitad de la mezcla de reacción en las células DH5\alpha y 1/10 de la mezcla de transformación se sembró en placas con agar de LB que contiene ampicilina a 70 \mug/ml. Después de incubar durante una noche a 37ºC, se escogieron algunos clones resistentes a la ampicilina y se cribaron por la presencia del ADN insertado tal y como se describió anteriormente. Se confirmaron los clones por secuenciación de terminación con didesoxinucleótidos. El clon correcto se denominó pBSN4-2.

De modo similar, el resto del gen de los 219 aminoácidos carboxiterminales del colágeno humano de tipo I (\alpha1) con el uso de codones optimizado para E. coli se construyó de tal forma que la secuencia del ADN final es la ofrecida en la figura 71 (SEQ ID n.º 43).

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(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE: GRUSKIN, ELLIOT A.

\hskip3.9cm

BUECHTER, DOUGLAS

\hskip3.9cm

BROKAW, JANE

\hskip3.9cm

ZHANG, GUANGHUI

\hskip3.9cm

PAOLELLA, DAVID

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TITULO DE LA INVENCIÓN: POLIPÉPTIDOS DE AMINOÁCIDOS MODIFICADOS

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 50

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DIRECCIÓN: DILWORTH & BARRESE

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 333 EARLE OVINGTON BOULEVARD

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: UNIONDALE

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: NY

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: U.S.A.

\vskip0.500000\baselineskip

(F): ZIP: 11553

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE LECTURA DE ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Floppy disk

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOFTWARE: Publicación Patentln #1.0, Version #1.30

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: STEEN, JEFFREY S

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TELÉFONO: (516) 228-8484

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TELEFAX: (516) 228-8516

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 3170 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1

800

8000

9

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 240 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

\vskip1.000000\baselineskip

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 100 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

\vskip1.000000\baselineskip

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 amino ácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: amino ácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 330 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1169 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

\vskip1.000000\baselineskip

14

15

16

810

17

18

19

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 3531 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:

\vskip1.000000\baselineskip

21

22

23

24

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1171 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:

\vskip1.000000\baselineskip

26

27

28

29

30

31

32

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 3541 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:

\vskip1.000000\baselineskip

34

35

36

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1388 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:

\vskip1.000000\baselineskip

38

39

40

41

42

43

44

45

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1107 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:

\vskip1.000000\baselineskip

47

48

49

50

51

52

53

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO;12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 4167 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:

\vskip1.000000\baselineskip

54

55

56

57

58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 3349 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:

59

61

62

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 57 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:

\vskip1.000000\baselineskip

64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 3171 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:

65

66

67

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ 10 NO: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1057 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:

\vskip1.000000\baselineskip

69

71

72

73

74

75

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SBQ ID NO: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 46 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Región

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1..2

\vskip0.500000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Secuencia de aminoácidos para glutation S-transferasa"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Región

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 19..20

\vskip0.500000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "338 repeticiones del siguiente triplete Gly-X-Y, donde alrededor del 35% de las posiciones X e Y están ocupadas por Prolina y 4-hidroxiprolina".

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:

76

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Región

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1..2

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Secuencia de aminoácidos para glutation S-transferasa".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Región

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 4..5

\vskip0.500000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /nota = "338 repeticiones del siguiente triplete Gly-X-Y, donde alrededor del 35% de las posiciones X e Y están ocupadas por Prolina y 4-hidroxiprolina".

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18:

77

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 3171 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:19:

78

79

80

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SBQ ID NO:20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1057 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:20:

\vskip1.000000\baselineskip

81

83

84

85

86

87

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 79 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:21:

88

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 75 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:22:

\vskip1.000000\baselineskip

89

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 81 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:23:

\vskip1.000000\baselineskip

90

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 87 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:24:

\vskip1.000000\baselineskip

91

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 111 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:25:

\vskip1.000000\baselineskip

92

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 37 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:26:

\vskip1.000000\baselineskip

93

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INPARAMACION PARA SEQ ID NO:27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 240 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:27:

\vskip1.000000\baselineskip

94

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 80 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:28:

95

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 3120 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:29:

97

98

99

100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1040 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:30:

101

102

103

104

105

106

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 3120 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:31:

\vskip1.000000\baselineskip

107

108

109

110

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1040 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:32:

111

113

114

115

116

117

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 76 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:33:

118

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 79 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:34:

\vskip1.000000\baselineskip

119

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 82 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:35:

\vskip1.000000\baselineskip

120

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 84 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:36:

\vskip1.000000\baselineskip

121

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 240 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:37:

\vskip1.000000\baselineskip

122

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 80 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:38:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

123

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 276 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:39:

\vskip1.000000\baselineskip

125

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 91 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:40:

\vskip1.000000\baselineskip

126

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:41:

\vskip1.000000\baselineskip

127

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 2..3

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /producto = "4-hidroxiprolina^{n}"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 8. .9

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /producto** "Xaa = 4-hidroxiprolina"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): SECUENCIA DESCRIPCIÓN: SEQ ID NO:42:

\vskip1.000000\baselineskip

128

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 660 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:43:

129

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 219 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:44:

\vskip1.000000\baselineskip

131

132

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 627 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:45:

\vskip1.000000\baselineskip

133

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:46:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 219 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:46:

134

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:47:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 95 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:47:

136

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:48:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 97 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:48:

137

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:49:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(a): LONGITUD: 91 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:49:

138

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:50:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 91 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:50:

\vskip1.000000\baselineskip

139

\newpage

LISTADO DE SECUENCIAS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<110> United States Surgical Corporation

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> POLIPÉPTIDOS DE AMINOÁCIDOS MODIFICADOS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> CIP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140> EP99119184

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 1999-10-07

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 09/169,768

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1998-10-09

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3170

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

140

141

142

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 240

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

143

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Secuencia de ADN que codifica un péptido de tipo gen de colágeno

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

144

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<212> Proteína

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Secuencia de aminoácidos de un péptido de tipo colágeno

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

145

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 330

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

146

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1169

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<212> Proteína

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Secuencia de aminoácidos de una proteína quimérica colágeno I (alfa1)/BMP-2B

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

147

148

149

150

151

152

153

154

155

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3531

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Secuencia de ADN que codifica una proteína quimérica colágeno I (alfa1)/BMP -2B

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

156

157

158

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1171

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<212> Proteína

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Secuencia de aminoácidos de una proteína quimérica colágeno I (alfa1)/TGF -beta1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

159

160

161

162

163

164

165

166

167

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3541

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Secuencia de ADN que codifica una proteína quimérica colágeno I (alfa1)/TGF-beta1

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

168

170

171

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1388

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<212> Proteína

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Secuencia de aminoácidos de una proteína quimérica colágeno I (alfa1)/decorina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

172

173

174

175

176

177

178

179

180

181

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1107

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<212> Proteína

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Secuencia de aminoácidos para la proteína quimérica colágeno I(alfa)/péptido decorina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

183

184

185

186

187

188

189

190

191

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4167

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Secuencia de ADN que codifica una proteína quimérica colágeno I (alfa1)/decorina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

192

193

194

195

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3349

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Secuencia de ADN que codifica una proteína quimérica colágeno/decorina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

196

197

198

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Secuencia de ADN de sitio de clonaje poliunión contenido en el vector de clonaje pMaI

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

199

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3171

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

200

201

202

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1057

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<212> Proteína

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

203

204

205

206

207

208

209

210

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 46

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\vskip0.400000\baselineskip

<212> Proteína

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\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Secuencia de aminoácidos de la proteína quimérica GST-Co1Eco1

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en posición 1 es la secuencia de aminoácidos para glutation S-transferasa

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<220>

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\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en posición 20 es 388 repeticiones del siguiente triplete Gly-X-Y donde alrededor del 35% de las posiciones X e Y están ocupadas por prolina y 4-hidroxiprolina

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

211

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

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\vskip0.400000\baselineskip

<212> Proteína

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

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<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Secuencia de aminoácidos de la proteína quimérica GST-D4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

212

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3171

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\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Proteína de colágeno Tipo I alfa humana con codón de uso optimizado de E. coli

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

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213

214

215

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1057

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<212> Proteína

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Proteína de colágeno Tipo I (alfa) humana con codón de uso optimizado de E. Coli

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

216

218

219

220

221

222

223

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 79

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\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Oligonucleótidos sintéticos para reconstruir el gen de colágeno Tipo I (alfa1) humano con el uso de E. Coli optimizada

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

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225

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<210> 22

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 75

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\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Oligonucleótidos sintéticos para reconstruir el gen de colágeno Tipo I (alfa 1) humano con el uso de E. Coli optimizada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

226

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 81

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\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Oligonucleótidos sintéticos para reconstruir el gen de colágeno Tipo I (alfa1) humano con el uso de E. Coli optimizada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

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227

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<210> 24

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<211> 87

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<212> ADN

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\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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<220>

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<400> 24

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228

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<210> 25

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 111

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\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Secuencia de ADN del fragmento del gen de colágeno Tipo I (alfa 1) humano con uso de E. coli optimizada codificado por el plásmido pBSN-1

\vskip1.000000\baselineskip

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<400> 25

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229

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<210> 26

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

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\vskip0.400000\baselineskip

<212> Proteína

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Secuencia de aminoácidos del gen de colágeno Tipo I (alfa1) humano con uso de E. Coli optimizada codificado por el plásmido pBNI-1

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

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230

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 240

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\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Secuencia de ADN del fragmento del gen de colágeno Tipo I (alfa1) humano con uso de E. Coli optimizada codificado por el plásmido pBSN1-2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

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231

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<212> Proteína

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Secuencia de aminoácidos del fragmento del gen de colágeno Tipo I (alfa 1) humano con uso optimizado de E. Coli

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

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232

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3120

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\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Secuencia de ADN de una región helicoidal del colágeno Tipo I (alfa2) humano más 11 aminoácidos amino termilanes extra-hélice y 12 aminoácidos carboxi terminales extra- hélice

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

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233

234

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<210> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1040

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<212> Proteína

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\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Secuencia de aminoácidos de una región helicoidal del colágeno Tipo I(alfa2) humano más 11 aminoácidos amino terminales extra-hélice y 12 carboxi terminales extrahélice

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

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236

237

238

239

240

241

242

243

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3120

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\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Secuencia de ADN de E. coli HuCol(alfa2), la región helicoidal del colágeno Tipo I(alfa2) humano más 11 aminoácidos amino terminales y 12 aminoácidos carboxi terminales

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

244

245

246

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1040

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<212> Proteína

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Secuencia de ADN de E. Coli HuCol(alfa2), la región helicoida del colágeno Tipo I (alfa2) humano más 11 aminoácidos amino terminales y 12 aminoácidos carboxi terminales

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

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247

248

249

250

251

252

253

254

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<210> 33

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 76

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\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<2l3> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Oligonucleótidos sintéticos para reconstruir las primeras 240 pares de bases del gen de colágeno Tipo 1 (alfa2) humano con el codón de uso optimizado de E. Coli

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

255

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 79

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\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

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256

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

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258

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

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259

\vskip1.000000\baselineskip

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<210> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 240

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Secuencia del fragmento del gen de colágeno Tipo I (alfa2) humano con el uso optimizado de E. Coli

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

260

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<212> Proteína

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Secuencia de aminoácidos del fragmento del gen de colágeno Tipo I (alfa2) humano con el uso optimizado de E. Coli

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

261

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 276

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\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: Secuencia de ADN del mimético 4 de colágeno

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

262

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 91

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<212> Proteína

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

263

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<212> Proteína

\vskip1.000000\baselineskip

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: Secuencia de aminoácidos predictiva de la secuencia de ADN de los primeros 13 aminoácidos de la proteína D4-alfa1

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<400> 41

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265

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<210> 42

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<211> 13

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<212> Proteína

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Xaa en posiciones 2 y 3 es 4-hidroxiprolina

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<220>

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<223> Xaa en posiciones 8 y 9 es 4-hidroxiprolina

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: Secuencia de aminoácidos determinada experimentalmente de la secuencia de ADN de los 13 primeros aminoácidos de la proteína D4-alfa1

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<400> 42

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266

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<210> 43

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<211> 660

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: Secuencia de ADN de un fragmento 3' de 657 nucleótidos del colágeno Tipo I (alfa1) humano con el uso del codón de E. coli optimizado designado D4

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<400> 43

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267

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<210> 44

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<211> 19

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<212> Proteína

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: Secuencia de aminoácidos de un fragmento C- terminal de 219 aminoácidos del colágeno Tipo I (alfa I) humano designado D4

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<400> 44

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268

269

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<210> 45

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<211> 627

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: Secuencia de ADN de un fragmento 3' de 627 nucleótidos del colágeno Tipo I (alfa2) humano con el uso del codón de E. coli optimizado

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<400> 45

270

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<210> 46

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<211> 219

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: Secuencia de aminoácidos de un fragmento C- terminal de 209 aminoácidos del colágeno Tipo I (alfa2) humano

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<400> 46

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<210> 47

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<211> 95

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<212> Proteína

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: Oligonucleótidos sintéticos

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<400> 47

271

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<210> 48

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<211> 97

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: Oligonucleótidos sintéticos

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<400> 48

274

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<210> 49

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<211> 91

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: Oligonucleótidos sintéticos

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<400> 49

275

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<210> 50

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<211> 91

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: Oligonucleótidos sintéticos

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<400> 50

276

Claims

1. Un método para producir una proteína de matriz extracelular (PME) o un fragmento de la misma que comprende hidroxiprolina capaz de proporcionar un autoagregado en una célula que habitualmente no hidroxila la prolina, que comprende proporcionar una secuencia de ácido nucleico que codifica la PME o un fragmento de la misma que se ha optimizado para la expresión en la célula mediante la sustitución de los codones que se producen de forma natural que no son los preferidos por la célula con codones preferidos por la célula; incorporar la secuencia del ácido nucleico en la célula; proporcionar el medio de crecimiento hipertónico que contiene, al menos, un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en trans-4-hidroxiprolina y 3-hidroxiprolina; y poner en contacto la célula con el medio de crecimiento en el que el al menos un aminoácido se asimila en la célula y se incorpora en la PME o fragmento de la misma.

2. Un método para producir una proteína de matriz extracelular (PME) o un fragmento de la misma de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la PME se selecciona del grupo que consiste en colágeno, fibrinógeno, fibronectina y péptido similar al colágeno humanos.

3. Un método para producir una proteína de matriz extracelular (PME) o un fragmento de la misma de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que la célula es un procariota.

4. Un método para producir una proteína de matriz extracelular (PME) o un fragmento de la misma de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el procariota es E. coli.

5. Un método para producir una proteína de matriz extracelular (PME) o un fragmento de la misma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que el colágeno humano es el tipo I \alpha1.

6. Un método para producir una proteína de matriz extracelular (PME) o un fragmento de la misma de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el ácido nucleico que codifica el colágeno humano de tipo I \alpha1 incluye la secuencia mostrada en la SEQ ID N.º 19.

7. Un método para producir una proteína de matriz extracelular (PME) o un fragmento de la misma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en la que el colágeno humano es el tipo I \alpha2.

8. Un método para producir una proteína de matriz extracelular (PME) o un fragmento de la misma de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el ácido nucleico que codifica el colágeno humano de tipo I \alpha2 incluye la secuencia mostrada en la SEQ ID n.º 31.

9. Un método para producir una proteína de matriz extracelular (PME) o un fragmento de la misma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el ácido nucleico que codifica la PME incluye la secuencia mostrada en la SEQ ID n.º 43.

10. Un método para producir una proteína de matriz extracelular (PME) o un fragmento de la misma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el ácido nucleico que codifica la PME incluye la secuencia mostrada en la SEQ ID n.º 45.

11. Un método para producir una proteína de matriz extracelular (PME) o un fragmento de la misma de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la secuencia del ácido nucleico incluye el ácido nucleico que codifica un péptido fisiológicamente activo.

12. Un método para producir una proteína de matriz extracelular (PME) o un fragmento de la misma de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el péptido fisiológicamente activo se selecciona del grupo que consiste en proteína morfogénica del hueso, factor \beta del crecimiento transformante y decorina.

13. Un método para producir una proteína de matriz extracelular (PME) o un fragmento de la misma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la PME o el fragmento de la misma es un péptido similar al colágeno.

14. Un método para producir una proteína de matriz extracelular (PME) o un fragmento de la misma de acuerdo con la reivindicación 13, en el que la PME o el fragmento de la misma incluye la secuencia de los aminoácidos representada en la SEQ ID n.º 4.

15. Un método para producir una proteína de matriz extracelular (PME) o un fragmento de la misma de acuerdo con la reivindicación 13, en el que la PME incluye la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID n.º 40.

16. Un método para producir una proteína de matriz extracelular (PME) o un fragmento de la misma de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la PME incluye la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID n.º 44.

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17. Un método para producir una proteína de matriz extracelular (PME) o un fragmento de la misma de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la PME es un fragmento de colágeno que incluye la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID n.º 26.

18. Un método para producir una proteína de matriz extracelular (PME) o un fragmento de la misma de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la PME es un fragmento de colágeno que incluye la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID n.º 46.