JP2013021999A - ウイルス粒子様ナノカプセル - Google Patents
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Abstract
【解決手段】下記の(1)〜(4)のいずれかに示すアミノ酸配列からなるタンパク質を含むナノカプセル:(1)特定のアミノ酸配列;(2)上記(1)に示されるアミノ酸配列に、更に生体分子を認識するアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列;(3)(1)と異なる特定のアミノ酸配列;(4)上記(1)〜(3)のいずれかに示されるアミノ酸配列において、1個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列。
【選択図】なし
Description
(1)配列番号1に示されるアミノ酸配列;
(2)上記(1)に示されるアミノ酸配列に、更に生体分子を認識するアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列;
(3)配列番号2に示されるアミノ酸配列;
(4)上記(1)〜(3)のいずれかに示されるアミノ酸配列において、1個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列。
(5)配列番号1に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列;
(6)配列番号3に示される塩基配列;
(7)上記(5)または(6)に示される塩基配列に、更に生体分子を認識するアミノ酸配列をコードする塩基配列が付加された塩基配列;
(8)配列番号2に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列;
(9)配列番号4に示される塩基配列;
(10)上記(5)〜(9)のいずれかに示される塩基配列において、1個又は数個の塩基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加された塩基配列。
本発明のナノカプセルは、下記の(1)〜(4)のいずれかに示すアミノ酸配列からなるタンパク質を含む。
(2)上記(1)に示されるアミノ酸配列に、更に生体分子を認識するアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列;
(3)配列番号2に示されるアミノ酸配列;
(4)上記(1)〜(3)のいずれかに示されるアミノ酸配列において、1個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列。
(b)78番目及び79番目のアルギニン残基の、それぞれセリン残基への置換。
(c)173−226番目のアミノ酸残基を欠失。
本発明のポリヌクレオチドは下記の(5)〜(10)のいずれかに示す塩基配列からなる。
(6)配列番号3に示される塩基配列。
(7)上記(5)または(6)に示される塩基配列に、更に生体分子を認識するアミノ酸配列をコードする塩基配列が付加された塩基配列。
(8)配列番号2に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列。
(9)配列番号4に示される塩基配列。
(10)上記(5)〜(9)のいずれかに示される塩基配列において、1個又は数個の塩基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加された塩基配列。
本発明の本発明の組換えベクターは、上述した本発明のポリヌクレオチドを含むものである。組換えベクターとは生物宿主に導入することによって、特定の遺伝子を発現するものであり、本発明においては、上述した本発明のポリヌクレオチドを発現するものである。
本発明の形質転換体は、上述した本発明の組換えベクターを含むものであり、上述した組換えベクターによって上述の生物宿主が形質転換されたものを意味する。
本発明のナノカプセルを製造する方法は、以下の3つの工程を含むものである。
(i)上述した本発明の形質転換体を培養する工程、
(ii)当該形質転換体の培養物の可溶化液を回収する工程、及び
(iii)当該可溶化液からナノカプセルを精製する工程。
C末端54残基を欠失させFLAG−tag配列で置換したHBsAg抗原タンパク質をコードするプラスミドDNAである、ベクターpBO749(国際公開番号WO2005/049824)を鋳型とし、primer#1575(配列番号7)と#1555(配列番号8)とを用いたPCRにより、N末端76残基とC末端54残基とを同時に欠失した、配列番号9に示す塩基配列を含む欠失型HBsAg遺伝子(以後、dHBsAgと称することがある。)断片を増幅した。
上記のdHBsAg大腸菌発現用ベクターpBO1465及びs+dHBsAg大腸菌発現ベクターpBO1458を遺伝子発現用大腸菌Origami2(DE3)株、C41(DE3)株、C43(DE3)株、並びにKRXに形質転換し、翌日出現したコロニー数十個を、0.5%glucoseと終濃度で200μg/mlのアンピシリンを含む4mL若しくは30mLのLB培地で、37℃で2〜5時間振盪培養した。
dHBsAgを発現する大腸菌Origami2(DE3)株を上記の各種培養条件で培養し、菌体回収時の遠心後の上清を培養上清(C)とした。1mLの培地による培養にて得られた菌体を、20%のsucroseを含む30mMのTris−HCl(pH8)を75mL用いて再懸濁した。ここに、0.5MのEDTA(pH8)を1.5μL加え、室温条件下で10分間Vortex処理を行った。
引き続いて、dHBsAgタンパク質を含むナノカプセル(以後、dBNCと呼ぶことがある。)の精製を行った。
<Sucrose密度勾配遠心解析>
16mLの遠心管(16PA TUBE ASSY;HITACHI社)に底からスクロース濃度を50、40、30、20、及び10重量%含むBufferA[68.4mMのNa2HPO4、31.6mMのNaH2PO4、15mMの EDTA・2Na、及び0.85%のNaCl]を2.5mLずつ順に重層し、その上に上記4)にて示す可溶性画分(S−)を2.5mL重層した後、超遠心機(himac CP70MXX;HITACHI社)を用いて4℃、24000rpmの条件で14時間遠心した。
抗FLAG抗体溶出画分について、ネガティブ染色法を用いて透過型電子顕微鏡(ELECTRON MICROSCOPE H−7100S;HITACHI)観察した。比較対象として野生型HBsAg粒子(ビークル社製)を用いた。結果を図5に示す。
2種の市販のHBV体外診断用酵素免疫測定法キット(IMx HBsAg System;Abbott社、及びEnzygnost HBsAg 5.0 kit;SIMENS社)を用いて、精製dBNCの抗原性を市販のHBsAgS粒子(HBsAg−adr recombinant protein;GenWay Biotech社、10−663−45362)を標準試料として測定した。表1に結果を示す。
まず、dHBsAg遺伝子発現ベクターpBO1465を鋳型とし、primer#361(配列番号12)と、#1633(配列番号13)とを用いたPCRを行いて遺伝子断片を増幅し、その反応液をフェノール抽出後エタノール沈殿した後、NdeI及びNotIで制限酵素消化処理を行うことにより、C末端にFLAGタグを含まない約0.3kbのdHBsAgの遺伝子断片を調製した。
上述のdHBsAg−ZZ発現ベクターpBO1595を、大腸菌株Origami2(DE3)に形質転換した。翌日出現したコロニー数十個について、実施例2と同様の方法で遺伝子の発現及び培養を行い、得られた遺伝子発現菌体について、Tween80を含まない緩衝液にて超音波破砕処理によって可溶化して得られる可溶性画分Tween−(S−)、Tween80を含む緩衝液にて超音波破砕処理によって可溶化して得られる可溶性画分(S+)、及び不溶性画分(I)を調製した。これらの試料(100μLの培養液分)に当容量の2×sample bufferを加えて溶解し、95℃で5分間加熱処理した後、SDS−PAGE処理に供し、次いでCBB染色を行った。結果を図9(A)に示す。
<抗体認識能>
ウサギ血清由来のIgGを固相化しスキムミルクでブロッキングしたマイクロウェルプレートに、TBSで希釈したdHBsAg−ZZ遺伝子の発現菌体の可溶性画分、及びdHBsAg遺伝子の発現菌体の可溶性画分を添加し、室温で2時間反応させた。各ウェルを3回洗浄後、標識抗体としてTBSで希釈したウサギ由来HRP標識化IgGを添加して室温で2時間反応させた。各ウェルを6回洗浄後、基質溶液[6mgのo−Phenylenediamine、12mLの0.1Mクエン酸緩衝液(pH5.0)、及び12μLの30%H2O2を混合して要事調製したもの]を加えて30分間反応させ、492nmの吸光度を測定した。その結果を図10に示す。
精製したdBNC−ZZ粒子を、上記5)のdHBsAgナノカプセルの性状解析にて示したsucrose密度勾配遠心処理と同様の手法を用いて解析した結果を図11に示す。比較対象として、酵母細胞を用いて生産した野生型HBsAg−ZZ粒子(ビークル社製)を用いた。
精製したdBNC−ZZを電子顕微鏡観察した。観察結果を図12に示す。
4.1μg/10μLの濃度の精製したdBNC−ZZ粒子に、終濃度が12.5ng/μLとなるようにTPCK-トリプシン(Worthington Biochemial Corporation)を加えた後、37℃で、20分、2時間若しくは16時間消化反応を行った。
精製したdBNC−ZZ粒子を金属板に固定したマイカ(雲母)に4μl添加した後に15分間乾燥させ、大塚蒸留水(大塚製薬,徳島)により3回洗浄した。再び乾燥させ、この試料を走査型プローブ顕微鏡(SPA400−DFM、SII NanoTechnology Inc.;千葉)により観察した。比較対象として、酵母にて作製した野生型BNC−ZZ粒子を用いた。結果を図14に示す。
Claims (5)
- 下記の(1)〜(4)のいずれかに示すアミノ酸配列からなるタンパク質を含むナノカプセル:
(1)配列番号1に示されるアミノ酸配列;
(2)上記(1)に示されるアミノ酸配列に、更に生体分子を認識するアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列;
(3)配列番号2に示されるアミノ酸配列;
(4)上記(1)〜(3)のいずれかに示されるアミノ酸配列において、1個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列。 - 下記の(5)〜(10)のいずれかに示す塩基配列からなるポリヌクレオチド:
(5)配列番号1に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列;
(6)配列番号3に示される塩基配列;
(7)上記(5)または(6)に示される塩基配列に、更に生体分子を認識するアミノ酸配列をコードする塩基配列が付加された塩基配列;
(8)配列番号2に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列;
(9)配列番号4に示される塩基配列;
(10)上記(5)〜(9)のいずれかに示される塩基配列において、1個又は数個の塩基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加された塩基配列。 - 請求項2に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
- 請求項3に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
- 請求項1に記載のナノカプセルを製造する方法。
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JPN6015028298; 生化学 抄録CD, 2008, 4P-1364 * |
JPN6015028299; 日本蛋白質科学会年会プログラム・要旨集 , 2008, p.52, 1P-031 * |
JPN6015028301; J. Control. Release Vol.118, 2007, pp.348-356 * |
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