KR20040095333A - 단백질 중공 나노입자를 사용한 간질환 치료용 약제 - Google Patents

Abstract

단백질 중공 나노입자를 사용하는 간질환 치료용 약제로서, 동물실험에 의해 실제로 치료 효과가 인정된 약제 및 이 약제를 사용하는 치료 방법을 제공한다. 간세포 인식 능력을 갖고, 입자 형성 능력을 갖는 단백질(예를 들면 B형 간염 바이러스 표면 항원 단백질)로 이루어진 중공 나노입자에 간질환 치료용 세포 도입 물질(예를 들면, 암 치료용 유전자인 단순 헤르페스 바이러스 유래 티미딘키나아제 유전자)이 포함되어 이루어진 약제이다.

Description

단백질 중공 나노입자를 사용한 간질환 치료용 약제{Drugs for Treating Hepatic Diseases with the Use of Hollow Protein Nanoparticles}

근래 의학 분야에 있어서, 환부에 직접 작용하고 높은 효과를 나타내는 부작용이 적은 약품의 개발이 활발히 진행되고 있다. 특히 약물 전달 시스템(DDS)으로 불리는 방법은 목적 세포 또는 목적 조직에 대하여 특이적으로 약제 등의 유효 성분을 운반하고, 목적 개소에서 유효 성분을 작용시킬 수 있는 방법으로서 주목받고 있다.

또한, 최근의 분자 세포 생물학의 분야에 있어서도 특정 세포에의 유전자 도입은 필요 불가결한 기술로서 활발히 연구되고 있다. 또한, 인간 게놈 프로젝트의 진전에 의해 각종 질환의 유전적인 배경이 밝혀지고 있는 현재, 이와 같은 세포 및 조직에 대한 특이성이 높은 유전자 도입법이 확립되면 유전자 치료 분야에서의 응용도 가능하게 된다.

세포에 유전자를 도입하는 방법으로서는 지금까지 유전자를 거대 분자화하여 엔도시토시스에 의해서 유전자를 받아들이게 하는 방법(인산 칼슘 법, 리포펙타민 법)이나, 전기 펄스 자극에 의해 세포막에 천공을 뚫고 유전자를 유입시키는 방법(전기 천공법, 유전자 총법)이 알려져 있고, 어느 것이나 오늘날에는 분자 생물학적 실험에 있어서 일반적으로 실시되고 있는 방법이다.

이러한 방법들은 간편하지만 세포를 직접 물리적으로 손상시켜 유전자 도입부위를 외과적으로 노출시킬 필요가 있기 때문에, 생체 내부의 세포나 조직에는 용이하게 적용할 수 없다. 또한, 100%에 가까운 도입률을 얻기 어렵다.

한편, 안전성이 높은 물질도입 방법으로서는 리포솜법이 알려져 있다. 이 방법은 세포를 손상시키지 않기 때문에 생체 내부의 세포나 조직에도 적용할 수 있다. 그러나 단순한 지질인 리포솜에 고도의 세포 및 조직 특이성을 부여하는 것은 곤란하고, 또한 in vivo로의 유전자 도입률이 요구되는 값에 비해 훨씬 낮은 문제점이 있다.

최근 들어 바이러스 DNA에 목적으로 하는 유전자를 삽입하고 감염성 바이러스를 생성하여 유전자 도입을 행하는 기술이 개발되었다. 이 방법은 도입 부위를 노출할 필요가 없고, 개체에도 응용할 수 있으며, 도입 효율도 100%에 가까운 획기적인 방법으로서 주목받고 있으나, 바이러스가 광범위한 세포에 비특이적으로 감염하기 때문에 목적 세포 이외에도 유전자가 도입되어 버리는 중대한 문제가 있다. 또한, 바이러스 게놈 본체가 염색체에 편입되어 장래 예기할 수 없는 부작용을 일으킬 가능성이 있기 때문에, 실제로는 질병의 초기 치료 등에는 사용되지 않고 말기의 환자에 적용되는데 머무르고 있는 실정이다.

이상과 같은 상황을 감안하여 본 발명자들은 국제공개번호 제 WO01/64930호의 국제출원(공개일: 2001년 9월 7일)(이하, 「국제출원 WO01/64930」이라 한다)에서, 입자 형성 능력을 갖는 단백질에 생체 인식 분자가 도입된 중공 나노입자를 사용하여 목적 세포나 조직에 물질(유전자, 단백질, 화합물 등)을 특이적이면서 안전하게 운반, 도입하기 위한 방법을 제안하고 있지만, 이 방법을 이용하면서 특정한 세포 또는 조직에 대하여 특이적으로 작용하는 치료 약제의 개발 등이 더욱 더 문제가 되고 있다.

본 발명은 상기의 과제를 감안하여 이루어진 것으로, 그 목적은 단백질 중공 나노입자를 사용한 간질환 치료용 약제로서 동물실험에 의하여 실제로 치료 효과가 인정된 약제 및 이 약제를 사용하는 치료 방법을 제공하는 데에 있다.

본 발명은 단백질 중공 나노입자를 사용한 간질환 치료용 약제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 입자 내부에 간질환 치료용의 세포 도입 물질을 포함하고, 이 세포 도입 물질을 간세포 내에 특이적으로 도입 가능한 약제에 관한 것이다.

도 1은 본 발명의 실시예에서의 HBsAg 유전자의 각 단백질 영역을 나타내는 개략 모식도이다. 부호 1 내지 부호 8은 표면 항원에 있어서의 각 부위의 작용을 나타내고 있다. 도 1 중의 부호 1은 입자 형성 억제부위를 나타낸다. 부호 2는 직접적인 인간 간세포 특이적 리셉터를 나타낸다. 부호 3은 당쇄 1을 나타낸다. 부호 4는 간접적인 인간 간세포 특이적 리셉터(중합 인간 혈청 알부민 리셉터)를 나타낸다. 부호 5는 막관통 영역1을 나타낸다. 부호 6은 막관통 영역2를 나타낸다. 부호 7은 당쇄2를 나타낸다. 부호 8은 막관통 영역3을 나타낸다.

도 2는 본 발명의 실시예에서의 유전자 재조합 효모를 사용한 HBsAg 입자의 발현 및 정제 조작을 예시한 개략 설명도이고 (a)는 유전자 재조합 효모의 제조, (b)는 High-Pi 배지에서의 배양, (c)는 8S5N-P400 배지에서의 배양, (d)는 파쇄, (e)는 밀도 구배 원심분리, (f)는 HBsAg 입자를 나타내는 도이다.

도 3은 본 발명에 관한 약제에 관하여 실험동물로 행한 치료 효과를 나타내는 그래프이다.

도 4는 세포 도입 물질로서 이용가능한 단백질을 나타내는 표이다.

도 5는 그 밖의 세포 도입 물질로서 이용가능한 단백질을 나타내는 표이다.

도 6은 그 밖의 세포 도입 물질로서 이용가능한 단백질을 나타내는 표이다.

도 7은 그 밖의 세포 도입 물질로서 이용가능한 단백질을 나타내는 표이다.

도 8은 본 발명에 관한 약제에 관하여 실험동물로 행한 치료 효과를 나타내는 표이다.

본 발명자들은 예의 검토를 거듭한 결과, 인간 간암을 이식한 실험동물에 간암 치료용 유전자를 포함한 B형 간염 바이러스 표면 항원 입자를 정맥 주사함으로써, 인간의 간장 유래 조직부분에 특이적으로 유전자가 도입되어 이식암을 치료하는 효과가 있는 것을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명에 관한 약제는 간세포 인식능력을 보유하고 입자 형성 능력을 갖는 단백질로 이루어진 중공 나노입자에 간질환 치료용의 세포 도입 물질이 포함되어 이루어진 약제이다.

상기 「입자 형성 능력을 갖는 단백질」로서는 예를 들면 B형 간염 바이러스 표면 항원 단백질을 들 수 있다. 이 단백질을 진핵세포에서 발현시키면 소포체막상에 막 단백질로서 발현, 축적되어 입자로서 방출된다. 이렇게 얻어진 중공 나노입자는 간세포를 인식하고 간세포에 대하여 특이적으로 입자내의 물질을 운반할 수 있기 때문에 간질환 치료용 물질(약제)을 포함시킴으로써 간세포에 대하여 특이적이면서 효과적으로 작용하는 유효한 치료약으로 된다.

상기 「특정한 세포 표면 분자와 결합하는 분자」로서는, 상피 성장 인자(EGF) 등의 증식 인자(바꿔 말하면 성장 인자) 외에 인터류킨, 인터페론, 콜로니 자극 인자, 종양 괴사 인자, 트랜스포밍 증식 인자β, 혈소판 유래 증식 인자, 에리스로포이에틴(erythropoietin), Fas 항원, 액티빈, 골 형성 인자, 신경 성장 인자 등을 들 수 있다.

상기 중공 나노입자내에 포함시키는 세포 도입 물질로서는, 예를 들면 암 치료용의 유전자를 들 수 있다. 암 치료용 유전자로서, 단순 헤르페스 바이러스 유래 티미딘키나아제(HSV1 tk) 유전자를 포함한 약제를 사용하는 경우는 후술하는 실시예에 나타난 바와 같이 별도의 간시클로비르(ganciclovir: GCV)를 투여한다.

본 발명의 약제는 정맥주사라고 하는 간편한 방법으로 간질환을 효과적으로 치료할 수 있고, 종래의 간질환 치료 방법과 크게 다르며, 다량의 약제 투여 혹은 유전자 치료 등에서의 외과 수술을 필요로 하지 않고, 부작용의 우려도 매우 적어 그대로 임상 응용이 가능하다.

본 발명의 치료 방법은 본 발명의 약제를 투여하는 것에 의한 간질환의 치료 방법이다.

본 발명의 또 다른 목적, 특징 및 우수한 점은 이하에 나타낸 기재에 의해 충분히 알 수 있을 것이다. 또한 본 발명의 이익은 첨부된 도면을 참조한 다음 설명에서 명백하게 될 것이다.

본 발명의 약제를 구성하는 중공 나노입자는 입자 형성 능력을 갖는 단백질에 생체 인식 분자를 도입함으로써, 간세포 또는 간조직에 특이적으로 물질을 운반하는 것을 가능하게 한다. 이와 같은 입자 형성 능력을 갖는 단백질로서는 여러 가지의 바이러스로부터 얻어지는 서브 바이러스 입자를 적용할 수 있다. 구체적으로는 B형 간염 바이러스(Hepatitis B Virus: HBV) 표면 항원 단백질 등이 예시된다.

또한, 이와 같은 입자 형성 능력을 갖는 단백질로 이루어진 단백질 입자로서는 진핵세포에서 단백질을 발현시킴으로써 얻어지는 것을 들 수 있다. 요컨대, 진핵세포에서 입자 형성 능력을 갖는 단백질을 발현시키면 동 단백질은 소포체막상에 막 단백질로서 발현, 축적되어 입자로서 방출되는 것이다. 이 때, 진핵세포로서는 효모, 곤충세포, 포유세포 등의 동물세포 등을 적용할 수 있다.

본 발명자들은 후술하는 실시예에 나타난 바와 같이 유전자 재조합 효모에서상기 HBV 표면 항원 L단백질을 발현시킴으로써, 발현된 HBV 표면 항원 L단백질에서 효모 유래의 지질 이중막에 다수의 동 단백질이 삽입된 단직경 약 20nm, 장직경 약 150nm의 타원 형상 중공 입자가 형성되는 것을 발견하고 보고하고 있다(J. Biol. Chem. , Vol. 267, No.3, 1953-1961, l992). 이와 같은 입자는 HBV 게놈을 전혀 포함하지 않기 때문에 바이러스로서는 기능하지 않으며, 인체에서의 안전성이 매우 높다. 또한, HBV의 간세포에의 매우 높은 감염력을 맡는 간세포 특이적 리셉터를 입자 표면에 제시(present)하고 있기 때문에 간세포에 대하여 특이적인 물질을 운반하는 운반체로서의 효과도 높다.

이와 같이 유전자 재조합 효모를 사용하여 단백질 입자를 형성하는 방법은 균체내의 가용성 단백질로부터 고효율로 입자가 생산되는 점에서 매우 적합하다.

한편, 곤충 세포는 효모보다도 고등 동물에 가까운 진핵세포라 할 수 있고, 효모에서는 재현할 수 없는 당쇄 등의 고차원 구조도 재현할 수 있는 점에서 이종(異種) 단백질의 대량 생산에 있어서 바람직한 방법이라고 할 수 있다. 종래의 곤충 세포의 계는 바큐로 바이러스를 사용한 계로, 바이러스 발현을 수반하는 것이었기 때문에 단백질 발현시에 세포가 사멸하거나 용해하였다. 그 결과 단백질 발현을 연속적으로 행하거나, 사멸 세포로부터 유리된 프로테아제에 의해 단백질이 분해되거나 하는 문제점이 있었다. 또한, 단백질을 분비 발현시키는 경우에는 배지 속에 포함되는 대량의 소 태아 혈청이 혼입되므로 배지 중에 분비되어도 정제가 곤란하였다. 그러나 최근 들어 바큐로 바이러스를 거치지 않는 곤충 세포계로, 무혈청 배양 가능한 것이 Invitrogen사에 의하여 개발되어 시판되고 있다. 따라서 이와 같은 곤충 세포를 사용하면 정제가 용이하고 고차원 구조도 재현된 단백질 입자를 얻을 수 있다.

본 발명의 단백질 중공 나노입자에서는 이상과 같은 여러 가지의 방법에 의해 얻어진 입자 표면에 리셉터를 임의의 생체 인식 분자에 변이시키거나 여러 가지의 물질(DNA, RNA, 단백질, 펩티드 및 약제 등)을 입자내에 도입하거나 함으로써, 간세포 및 간조직에 매우 높은 특이성으로 물질을 운반, 도입하는 것이 가능해진다.

물론, 입자 형성 능력을 갖는 단백질은 상기 B형 간염 바이러스 표면 항원 단백질에 한정되는 것은 아니고, 입자를 형성할 수 있는 단백질이라면 어떤 것이라도 좋으며, 동물 세포, 식물 세포, 바이러스, 균류 등에서 유래하는 천연 단백질이나 여러 가지의 합성 단백질 등이 고려된다. 또한, 예를 들면 바이러스 유래의 항원 단백질 등이 생체내에서 항체를 야기할 가능성이 있는 경우 등은 변이시켜 항원성을 감소시킨 것을 입자 형성 능력을 갖는 단백질로서 사용하여도 좋다. 예를 들면 국제 출원 WO01/64930호에 개시된 항원성을 감소시킨 B형 간염 바이러스 표면 항원 단백질이라도 좋고, 동 국제출원에 개시된 그 밖의 변이 단백질(B형 간염 바이러스 표면 항원 단백질을 유전자 조작 기술을 사용하여 변이된 단백질)이라도 좋다. 또한 B형 간염 바이러스 표면 항원 단백질이나 동 단백질을 변이시킨 변이 단백질에 증식 인자나 항체 등의 다른 단백질을 부가한 것을 입자 형성 능력을 갖는 단백질로서 사용하여도 좋다.

입자 형성 능력을 갖는 단백질에 도입된 생체 인식 분자(바꾸어 말하면 간세포 또는 간조직을 인식하는 분자)로서는 예를 들면 사이토카인 등의 세포 기능 조절분자, 세포 표면 항원, 조직 특이적 항원, 리셉터 등의 세포 및 조직을 식별하기 위한 분자, 바이러스 및 미생물에 유래하는 분자, 항체, 당쇄, 지질 등이 바람직하게 사용된다.

본 발명에서는 이상과 같은 단백질 중공 나노입자에 간세포 또는 간조직에 도입하고자 하는 물질(세포 도입 물질)을 내포시킴으로써 간세포 특이성을 갖는 물질 운반체가 얻어진다. 이 물질 운반체에 내포되는 세포 도입 물질이란, 예를 들면 DNA, RNA 등의 유전자, 천연 또는 합성 단백질, 올리고 뉴클레오티드, 펩티드, 약제, 천연 또는 합성 화합물 등 어떤 것이라도 좋다.

구체적으로는 이미 발명자들에 의해 보고된 인간 RNase 1(Jinno H., Ueda M., Ozawa S., Ikeda T., Enomoto K., Psarras K., Kitajima M., Yamada H., Seno M. Life Sci. 1996; 58(21):1901-8) 또는 RNase 3(별칭 ECP: eosinophil cationic protein; Mallorqui Fernandez G., Pous J., Peracaula R., Aymami J., Maeda T., Tada H., Yamada H., Seno M., de Llorens R., Gomis-Ruth F.X., Coll M.; J Mol Biol. 2000 Jul 28;300(5):1297-307.) 등이 적용된다.

이러한 단백질은 세포내외에서 작용하여 세포 상해 활성을 갖는 것이지만, 이러한 RNase를 본 발명의 물질 운반체(약제)에 내포시켜 운반함으로써 세포외에서는 무독화하는 한편, 세포내에서만 작용시킬 수 있으므로 보다 부작용이 적은 새로운 암 치료 방법으로서 기대된다.

또한, 상기 세포 도입 물질로서 그 밖에 도 4 내지 도 7에 나타나는 단백질또는 해당 단백질을 코딩하는 유전자를 들 수 있고, 또한 간질환에 유효한 각종 사이토카인(각종 인터페론, 각종 인터류킨 등), 암 억제 유전자(p53 등) 등의 치료 유전자도 들 수 있다.

또한, 이들 세포 도입 물질을 상기의 중공 나노입자에 도입하는 방법으로서는 통상의 화학적, 분자 생물학적 실험 방법에서 사용되는 다양한 방법이 적용된다. 예를 들면 전기천공법, 초음파법, 단순확산법 또는 전하를 갖는 지질을 사용하는 방법 등이 바람직하게 예시된다.

그리고 이들 단백질 중공 나노입자 또는 물질 운반체를 사용하여 in vivo 또는 in vitro에서 세포 또는 조직에 특이적으로 물질을 도입하는 것이 가능해진다. 나아가서는 상기의 RNase를 사용한 예와 같이, 이상과 같은 단백질 중공 나노입자로 이루어진 약제를 사용하여 특정 세포 또는 조직에 물질을 도입하는 것을 각종 질환의 치료법 또는 치료법의 한 단계로서 행하는 것도 가능하게 된다.

본 발명의 약제에 의한 치료 효과에 관해서는 후술하는 실시예에 나타난 바와 같이 동물실험에 의하여 실제로 확인되었다. 이 실시예에서는 인간 간암 유래 세포를 이식한 누드 래트에 단순 헤르페스 바이러스 유래 티미딘키나아제(HSV1 tk) 유전자를 포함한 본 발명의 약제를 투여하고, 또한 간시클로비르를 투여한 후, 이식한 암 조직의 크기를 관찰함으로써 치료 효과를 확인하였다. 약제의 투여는 정맥내투여에 의하여 행하였지만, 투여 방법으로서는 이외에 경구투여, 근육내투여, 복강내투여, 피하투여 등을 들 수 있다.

이하, 실시예 및 비교예에 의해 본발명을 더욱 상세히 설명하지만 본발명은이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

이하의 실시예에 있어서 HBsAg란 B형 간염 바이러스 표면 항원 (Hepatitis B virus surface Antigen)을 나타낸다. HBsAg는 HBV의 외피 단백질이며, 도 1의 모식도에 나타낸 것처럼 HBsAg에는 S단백질, M단백질, L단백질의 세 종류가 있다. 이 중, S단백질은 3종의 단백질에 공통한 중요한 외피 단백질이며, M단백질은 S단백질의 N말단측에 55개의 아미노산(pre-S2 peptide)이 부가된 것이다. 또한, L단백질은 M단백질의 N말단측에 108개 또는 119개의 아미노산(pre-S1 peptide)이 부가된 것이다.

HBsAg L단백질의 Pre-S 영역(pre-S1, pre-S2)은 HBV가 간세포에 결합할 때에 각각 중요한 역할을 맡는 것으로 알려져 있다. Pre-S1은 간세포에 직접 결합할 부위를 갖고, pre-S2는 혈중의 중합 알부민을 통하여 간세포에 결합하는 중합 알부민 리셉터를 갖는다.

진핵세포에서 HBsAg를 발현시키면 동 단백질은 소포체막상에 막 단백질로서 발현, 축적된다. HBsAg의 L단백질은 분자간에서 응집을 일으키고, 소포체막을 수용하면서 출아 양식으로 루멘측에 입자로서 방출된다.

이하의 실시예에서는 HBsAg의 L단백질을 사용하였다. 또한, 도 2에 이하의 실시예에 기재된 HBsAg 입자의 발현 및 정제 조작의 개략 설명도를 나타냈다.

< 실시예 A >

유전자 재조합 효모에 의한 HBsAg 입자의 발현

본 발명자들에 의해 보고된 J.Biol.Chem., Vo1.267, No.3, 1953-1961, 1992기재의 방법에 근거하여, pGLDLⅡP39-RcT를 유지한 유전자 재조합 효모(Saccharomyces Cerevisiae AH22R-주)를 합성 배지 High-Pi 및 8S5N-P400 중에서 배양하여, HBsAg L단백질 입자를 발현시켰다.(도 2a 내지 c)

정상 성장기(약 72시간 후)에 있는 유전자 재조합 효모로부터 Yeast Protein Extraction Reagent(Pierce Chemical Co. 제품)를 사용하여 whole cell extract를 준비하고, 도데실 황산 나트륨-폴리아크릴 아미드 겔 전기 영동(SDS-PAGE)을 사용하여 분리해서, 은염색에 의해 시료중의 HBsAg을 동정하였다.

이것으로부터 HBsAg는 분자량 약 52kDa의 단백질인 것이 분명해졌다.

< 실시예 B >

HBsAg 입자의 유전자 재조합 효모로부터의 정제

(1) 합성 배지 8S5N-P400에서 배양된 유전자 재조합 효모(습중량 26g)를 buffer A 용액(7.5M 요소, O.1M 인산 나트륨, pH 7.2, 15mM EDTA, 2mM PMSF, 0.1% Tween 80) 100ml에 현탁하여, 글라스 비드를 사용해서 비드 비터(BEAD-BEATER)로 효모를 파쇄하였다. 파쇄 후, 원심분리에 의해 상층액을 회수하였다.(도 2d)

(2) 다음에 상층액을 0.75배 용량의 33%(w/w) PEG6000과 혼합하여 30분간 냉각하였다. 그 후, 원심분리(7000rpm, 30분간)를 행하여 펠렛을 회수하였다. 동 펠렛은 Tween 80을 포함하지 않는 buffer A 용액속에서 재현탁하였다.

(3) 재현탁한 용액을 10 내지 40%의 구배를 거친 CsCl에 첨가하여 밴드를 형성하고, 28000rpm으로 16시간 동안 초원심분리를 행하였다. 원심분리 후의 시료를 12분획으로 나누어 웨스턴블롯법(Western Blotting)(1차 항체는 anti-HBsAg 모노크로날 항체)에 의해 HBsAg를 포함하는 분획을 동정하였다. 또한, HBsAg를 포함하는 분획을 Tween 80을 포함하지 않는 buffer A 용액으로 투석하였다.

(4) 상기 (3)에서 얻어진 투석액(12ml)을 5 내지 50%의 구배를 거친 자당(sucrose)에 첨가하여 밴드를 형성하고 28000rpm에서 16시간 동안 초원심분리를 행하였다. 원심분리 후 (3)과 마찬가지로 HBsAg를 포함하는 분획를 동정하여, HBsAg를 포함한 분획을 요소와 Tween 80은 포함하지 않고 대신에 0.85%의 NaCl을 포함하는 buffer A 용액으로 투석하였다.((2) 내지 (4); 도 2e)

(5) 상기 (4)와 동일한 조작을 반복하여 투석 후의 시료를 울트라 필터(Ultra Filter) Q2000(어드밴텍사 제품)을 이용하여 농축하고, 사용할 때까지 4℃로 냉장 보존하였다.(도 2f)

CsCl 평형 원심분리후의 웨스턴블롯 (3)의 결과로부터 HBsAg는 분자량 52kDa로 S항원성을 갖는 단백질인 것을 알 수 있었다. 최종적으로 배지2.5L 유래 습중량 26g의 균체로부터 약 24mg의 정제 HBsAg 입자를 얻었다.

일련의 정제 과정에 있어서 분획을 은염색 SDS-PAGE로 확인하였다. 또한, 정제에 의하여 효모 유래의 프로테아제가 제거되고 있는 것을 확인하기 위해 (5)에서 얻어진 HBsAg 입자를 37℃에서 12시간 배양한 후, SDS-PAGE를 행하고 은염색에 의해 동정을 행하였다.

그 결과, 효모 유래의 프로테아제는 일련의 정제 과정에 있어서 완전하게 제거되고 있는 것이 확인되었다.

< 실시예 C >

HBsAg 입자에의 HSV1 tk 유전자의 봉입(HSV1 tk 유전자를 포함한 HBsAg 입자의 제조)

다음으로 상기 방법에 의하여 제조한 HBsAg 입자내에 암 치료용 유전자로서 단순 헤르페스 바이러스 유래 티미딘키나아제(HSV1 t) 유전자를 봉입하고, 본 발명의 약제로서의 HSV1 tk 유전자를 포함한 HBsAg 입자를 제조하였다.

상기 HSV1 tk 유전자가 도입된 암세포에서는 이 HSV1 tk 유전자가 발현함으로써 간시클로비르에 대하여 민감하게 되어, 간시클로비르가 투여되면 강력한 휘말림 효과를 야기하면서 암세포는 사멸한다. 이와 같이 HSV1 tk 유전자는 암 유전자 치료에 폭넓게 사용되는 유전자의 하나이다.

본 실시예에서는, HBsAg 입자내로 HSV1 tk 유전자를 봉입하기 위해 HSV1 tk 유전자를 발현하는 Invivogen 사 제품의 벡터 pGT65-hIFN-α를 사용하여, 이 발현 벡터를 전기천공법에 의해 HBsAg 입자내에 도입함으로써 HSV1 tk 유전자가 포함된 HBsAg 입자를 제조하였다. 구체적으로는 HBsAg 입자중의 L단백질 입자 50μg에 대하여 상기 발현 벡터 10μg을 도입하였다. 또한 이 때 PBS 버퍼를 사용하였고, 전기천공의 조건은 220V, 950μF에서 4mm의 큐벳을 사용하여 행하였다.

< 실시예 D >

인간 간암을 이식한 누드 래트에 대하여 HSV1 tk 유전자를 포함한 HBsAg 입자에 의한 암 치료 효과

다음으로 상기 방법에 의하여 제조한 HSV1 tk 유전자를 포함한 HBsAg 입자의 인간 간암에 대한 치료 효과를 실험동물에 의하여 확인하였다.

본 실시예에서는 실험동물로서 일본 쿠레아로부터 구입한 누드 래트 (계통: F344/NJcl-rnu/rnu, 성별:암컷)의 양측 등부위 피하에 인간 간암 유래 세포 HuH-7(JCRB0403) 및 음성 대조로서 인간 대장암 유래 세포 WiDr(ATCC CCL-218)을 갖는 각각의 암 이식 래트에 의해 치료효과를 확인하였다. 상기 암 이식 래트는 각각의 종양세포를 Matrigel(Beckton & Dickinson 사 제품)과 혼합하고 사용 설명서대로 사용하여 상기 누드 래트에게 종양을 이식하고 이식한 종양이 직경 2 내지 3cm 정도의 고형암이 될 때까지 약 3주간 생육시킴으로써 얻었다.

그 후, 상기 암 이식 래트에 약 10μg의 HSV1 tk 유전자를 포함하는 HBsAg 입자를 미정맥으로 정맥주사하였다. 그리고 정맥주사 5일후부터 상기 암 이식 래트에 대하여 삼투압 펌프(alzet osmotic pump; Cat번호 2ML2)를 사용하여 간시클로비르를 50mg/kg/day의 비율로 투여하였다. 상기 삼투압 펌프는 GCV를 포함한 약액과 함께 상기 암 이식 래트의 등 피하에 이식하였다. 이 간시클로비르의 투여는 최대 14일간 행해졌다. 간시클로비르의 투여 후, 상기 암 이식 래트의 종양 조직의 상태(크기)를 경시적으로 관찰하였다. 구체적으로는 노기스로 종양 부분의 단직경과 장직경을 측정하고, 종양 용적 근사식(장직경x단직경x단직경/2)을 계산하여 행하였다. 측정은 쥐에 대하여 3번 연속으로 행하였다. 그 결과를 도 3 및 도 8에 나타내었다.

도 3 및 도 8에 나타낸 것처럼 인간 대장암 유래의 종약 조직(WiDr)에서는 경시적인 퇴축은 관찰되지 않고 치료 효과는 인정되지 않았던 것에 대하여, 인간 간암 유래의 종양 세포(NUE)에서는 경시적인 퇴축이 관찰되어 HBsAg-HSV1 tk 입자에 의한 간암 특이적인 치료 효과가 인정되었다.

이와 같이 본 발명에 관계된 약제로서의 상기 HBsAg-HSV1 tk 입자는 인간 간세포에 대하여 매우 높은 특이성과 효율로 유전자 도입이 가능하고, 간암에 대하여 실제로 치료 효과가 있는 것이 확인되었다. 또한, 본 실험에 의하여 상기 HBsAg-HSV1 tk 입자에 의한 간암치료를 위한 프로토콜을 실험동물로 확립할 수 있었다.

또한, 발명을 실시하기 위한 최선의 형태의 항에서 이룬 구체적인 실시형태 또는 실시예는 어디까지나 본 발명의 기술 내용을 명확하게 하는 것으로, 그러한 구체예에만 한정하여 협의로 해석되어야 할 것이 아니라, 본 발명의 정신과 다음에 기재하는 특허 청구의 범위내에서 여러 가지로 변경하여 실시할 수 있는 것이다.

이상과 같이 본 발명에 관계된 약제는 정맥 주사라는 간편한 방법으로 간암 등으로 대표되는 간질환을 특이적이면서 효과적으로 치료할 수 있고, 종래의 유전자 치료와 크게 다르며, 대수술을 필요로 하지 않고, 부작용의 우려도 매우 낮아, 그대로 임상 응용이 가능하다.

Claims (7)

1. 간세포 인식 능력을 갖고 입자 형성 능력을 갖는 단백질로 이루어진 중공 나노입자에 간질환 치료용의 세포 도입 물질이 포함되어 이루어진 약제.
2. 제1항에 있어서,

   상기 단백질은 B형 간염 바이러스 표면 항원 단백질인 것을 특징으로 하는 약제.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,

   상기 세포 도입 물질은 유전자인 것을 특징으로 하는 약제.
4. 제3항에 있어서,

   상기 유전자는 암 치료용 유전자인 것을 특징으로 하는 약제.
5. 제4항에 있어서,

   상기 유전자는 단순 헤르페스 바이러스 유래 티미딘키나아제(HSV1 tk) 유전자인 것을 특징으로 하는 약제.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 약제는 정맥 주사에 의해 인체에 투여되는 것을 특징으로 하는 약제.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 약제를 투여하는 것에 의한 간질환의 치료 방법.