WO2003082343A1

WO2003082343A1 - Medicaments pour troubles hepatiques a base de nanoparticules proteiques creuses

Info

Publication number: WO2003082343A1
Application number: PCT/JP2003/002600
Authority: WO
Inventors: Shunichi Kuroda; Katsuyuki Tanizawa; Akihiko Kondo; Masakazu Ueda; Masaharu Seno; Hidehiko Iwabuki
Original assignee: Japan Science And Technology Agency
Priority date: 2002-03-29
Filing date: 2003-03-05
Publication date: 2003-10-09
Also published as: JP2003286199A; KR20040095333A; EP1491214A1; US20060034869A1

Description

明細書タンパク質中空ナノ粒子を用いる肝臓疾患治療用薬剤技術分野

本発明は、タンパク質中空ナノ粒子を用いる肝臓疾患治療用薬剤に関し、より詳細には、粒子内部に肝臓疾患治療用の細胞導入物質を包含し. この細胞導入物質を肝細胞内に特異的に導入可能な薬剤に関するものである。背景技術

近年、医学の分野において、患部に直接作用し、高い効果を示す副作用の少ない薬品の開発が盛んに行われている。特に、ドラッグデリバリ一システム（D D S ) と呼ばれる方法は、目的細胞、あるいは、目的組織に対して特異的に薬剤等の有効成分を運搬し、目的箇所で有効成分を作用させることのできる方法として注目されている。

また、最近の分子細胞生物学の分野においても特定細胞への遺伝子導入は必要不可欠な技術として盛んに研究されている。さらに、ヒトゲノム計画の進展により各種疾患の遺伝的な背景が明らかになりつつある現在、このような細胞および組織に対する特異性の高い遺伝子導入法が確立されれば遺伝子治療の分野での応用も可能となる。

細胞に遺伝子を導入する方法としては、これまでに、遺伝子を巨大分子化してエンドサイトーシスによつて遺伝子を取込ませる方法（リン酸カルシウム法、リポフエクタミン法）や、電気パルス刺激により細胞膜に穿孔を開け、遺伝子を流入させる方法（エレクト口ポレーシヨン法、遺伝子銃法）が知られており、いずれも今日では分子生物学的実験において、一般的に実施されている手法である。

これらの方法は簡便であるが、細胞を直接、物理的に傷つけ、遺伝子導入部位を外科的に露出させる必要があるため、生体内部の細胞や組織には容易に適用できない。また、 1 0 0 %近い導入率を得ることは難しレヽ

一方、安全性の高い物質導入方法としてはリボソーム法が知られている。この方法は、細胞を傷つけることがないため、生体内部の細胞や組織にも適用することが可能である。しかし、単純な脂質であるリポソ一ムに高度な細胞および組織特異性を付与することは困難であり、さらに i n v i vo での遺伝子導入率は、要求される値に比べてはるかに低いという問題がある。

最近になって、ウィルス D N Aに目的の遺伝子を組み込み、感染性ゥィルスを生成して遺伝子導入を行う技術が開発された。この方法は導入部位を露出する必要がなく、個体にも応用でき、導入効率も 1 0 0 %近い画期的な方法として注目されるが、ウィルスが広範囲の細胞に非特異的に感染するため目的の細胞以外にも遺伝子が導入されてしまうという重大な問題がある。また、ウィルスゲノム本体が染色体に組み込まれ、将来予期できぬ副作用を引き起こす可能性があるため、実際には疾病の初期治療等には用いられず、末期の患者に適用されるに留まっているのが現状である。

以上のような状況に鑑み、本発明者らは、国際公開番号 W O 0 1 / 6 4 9 3 0 (公開日： 2 0 0 1年 9月 7 日）の国際出願（以下、「国際出願^ 0 0 1 6 4 9 3 0」とレヽう）において、粒子形成能を有するタンパク質に生体認識分子が導入された中空ナノ粒子を用いて、目的とする細胞や組織に、物質（遺伝子、タンパク質、化合物等）を特異的かつ安全に運搬、導入するための方法を提案しているが、この方法を用いる特定臓器の疾患に対する治療薬の開発等がさらなる課題となっていた。本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、タンパク質中空ナノ粒子を用いる肝臓疾患治療用薬剤であって、動物実験により実際に治療効果が認められた薬剤、およびこの薬剤を用いる治療方法を提供することにある。発明の開示

本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、ヒト肝臓癌を移植した実験動物に、肝臓癌治療用遺伝子を包含した B型肝炎ゥィルス表面抗原粒子を静脈注射することにより、ヒト肝臓由来組織部分に特異的に遺伝子が導入され、移植癌を治療する効果があることを見出し、本発明を完成させるに至った。

即ち、本発明に係る薬剤は、肝細胞認識能を有し、粒子形成能を有するタンパク質からなる中空ナノ粒子に、肝臓疾患治療用の細胞導入物質が包含されてなる薬剤である。

上記「粒子形成能を有するタンパク質」としては、たとえば B型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質を挙げることができる。このタンパク質は真核細胞で発現させると、小胞体膜上に膜タンパク質として発現、蓄積され、粒子として放出される。こうして得られた中空ナノ粒子は、肝細胞を認識し、肝細胞に対して特異的に粒子内の物質を運搬することができるので、肝臓疾患治療用の物質（薬剤）を包含させることにより、肝細胞に対して特異的かつ効果的に作用する有効な治療薬となる。

上記中空ナノ粒子内に包含させる細胞導入物質としては、たとえば癌治療用の遺伝子を挙げることができる。癌治療用遺伝子として、単純へルぺスウィルス由来チミジンキナーゼ（H S V 1 tk) 遺伝子を包含した薬剤を用いる場合は、後述の実施例に示すとおり、別途ガンシクロビルを投与する。

本発明の薬剤は、静脈注射という簡便な方法で肝臓疾患を効果的に治療することができ、従来の肝臓疾患の治療方法と大きく異なり、多量の薬剤の投与あるいは遺伝子治療等における外科手術を必要とせず、副作用の心配も極めて低く、そのまま臨床応用可能なものである。

本発明の治療方法は、本発明の薬剤を投与することによる肝臓疾患の治療方法である。

本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。図面の簡単な説明

図 1 は、本発明の実施例における H B s A g遺伝子の各タンパク質領域を表す概略摸式図である。 1 〜 8は、表面抗原における各部位の働きを示している。なお、図 1 中の符号 1 は、粒子形成抑制部位を示す。符号 2は、直接的なヒト肝細胞特異的レセプターを示す。符号 3は、糖鎖 1 を示す。符号 4は、間接的なヒト肝細胞特異的レセプター（重合ヒト血清アルブミンレセプター）を示す。符号 5は、膜貫通領域 1 を示す。符号 6は、膜貫通領域 2を示す。符号 7は、糖鎖 2 を示す。符号 8は、膜貫通領域 3 を示す。

図 2は、本発明の実施例における遺伝子組換え酵母を用いた H B s A g粒子の発現および精製操作を例示した概略説明図であり、（ a ) は遺伝子組換え酵母の作製、（ b ) は H i g h— P i培地における培養、（ c ) は 8 S 5 N— P 4 0 0培地における培養、（ d ) は破砕、（ e ) は密度勾配遠心分離、（ f ) は H B s A g粒子を示す図である。

図 3は、本発明に係る薬剤について、実験動物で行った治療効果を示すグラフである。

図 4は、細胞導入物質として利用可能なタンパク質を示す表である。図 5は、その他の細胞導入物質として利用可能なタンパク質を示す表である。

図 6は、その他の細胞導入物質として利用可能なタンパク質を示す表である。

図 7は、その他の細胞導入物質として利用可能なタンパク質を示す表である。

図 8は、本発明に係る薬剤について、実験動物で行った治療効果を示す表である。発明を実施するための最良の形態

本発明の薬剤を構成する中空ナノ粒子は、粒子形成能を有するタンパク質に生体認識分子を導入することによって、肝細胞あるいは肝組織に特異的に物質を運搬することを可能とするものである。このような粒子形成能を有するタンパク質としては、種々のウィルスから得られるサブウィルス粒子を適用することができる。具体的には、 B型肝炎ウィルス (Hepatitis B Virus:H B V) 表面抗原タンパク質等が例示される。また、このような粒子形成能を有するタンパク質からなるタンパク質粒子としては、真核細胞でタンパク質を発現させることにより得られるものが挙げられる。つまり、真核細胞で粒子形成能を有するタンパク質を発現させると、同タンパク質は、小胞体膜上に膜タンパク質として発現、蓄積され、粒子として放出されるのである。このとき、真核細胞としては、酵母、昆虫細胞、哺乳細胞等の動物細胞などが適用できる。本発明者らは、後述の実施例に示すとおり、遺伝子組換え酵母で上記 H B V表面抗原 Lタンパク質を発現させることにより、発現された H B

V表面抗原 Lタンパク質から酵母由来の脂質二重膜に多数の同タンパク質が埋め込まれた短径約 2 0 n m、長径約 1 5 0 n mの楕円状中空粒子が形成されることを見出し、報告している（J. Biol. Chem. , Vol.267, No.3， 1953-1961, 1992) 。このような粒子は、 H B Vゲノムを全く含まないので、ウィルスとしては機能せず、人体への安全性が極めて高い, また、 H B Vの肝細胞への極めて高い感染力を担う肝細胞特異的レセプターを粒子表面に提示しているため、肝細胞に対して特異的に物質を運搬する運搬体としての効果も高いのである。

このように遺伝子組換え酵母を用いてタンパク質粒子を形成する方法は、菌体内の可溶性タンパク質から高効率で粒子が生産される点で好適である。

一方、昆虫細胞は、酵母よりも高等動物に近い真核細胞であるといえ酵母では再現しきれない糖鎖等の高次構造をも再現できる点で異種タンパク質の大量生産において好ましい方法といえる。従来の昆虫細胞の系はバキュ口ウィルスを用いた系で、ウィルス発現を伴うものであつたために、タンパク質発現に際して細胞が死滅したり溶解したりした。その結果、タンパク質発現を連続的に行ったり、死滅細胞から遊離したプロテアーゼによりタンパク質が分解したりするという問題があった。また. タンパク質を分泌発現させる場合には、培地中に含まれる大量の牛胎仔血清が混入することで、折角培地中に分泌されても精製が困難であった _c しかし、最近になって、バキュロウィルスを介さない昆虫細胞系で、無血清培養可能なものが Invi trogen 社により開発され、市販されている _c 従って、このような昆虫細胞を用いれば、精製が容易で高次構造をも再現されたタンパク質粒子が得られる。

本発明のタンパク質中空ナノ粒子では、以上のような種々の方法によつて得られた粒子表面のレセプターを任意の生体認識分子に改変したり . 種々の物質（D N A、 R N A、タンパク質、ペプチド、および薬剤等）を粒子内に導入したりすることにより、肝細胞及び肝組織に極めて高い特異性で物質を運搬、導入することが可能となる。

もちろん、粒子形成能を有するタンパク質は、上記の B型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質に限られるものではなく、粒子を形成することができるタンパク質であれば、どのようなものでもよく、動物細胞、植物細胞、ウィルス、菌類等に由来する天然タンパク質や、種々の合成タンパク質等が考慮される。また、例えばウィルス由来の抗原タンパク質等が生体内において抗体を惹起する可能性がある場合などは、改変して抗原性を減少させたものを生体認識分子として用いてもよい。例えば、粒子形成能を有するタンパク質としては、国際出願 W O 0 1 / 6 4 9 3 0 に開示される抗原性を減少させた B型肝炎ゥィルス表面抗原タンパク質であってもよいし、同国際出願に開示されるその他の改変型タンパク質 ( B型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質を、遺伝子操作技術を用いて改変したタンパク質）であってもよい。また、 B型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質や同タンパク質を改変した改変型タンパク質に、さらに増殖因子や抗体などの他のタンパク質を付加したものを、粒子形成能を有するタンパク質として用いてもよい。

粒子形成能を有するタンパク質に導入される生体認識分子（換言すれば、肝細胞あるいは肝組織を認識する分子）としては、たとえば成長因子、サイトカイン等の細胞機能調節分子、細胞表面抗原、組織特異的抗原、レセプターなどの細胞および組織を識別するための分子、ウィルスおよび微生物に由来する分子、抗体、糖鎖、脂質などが好ましく用いられる。

本発明では、以上のとおりのタンパク質中空ナノ粒子に、肝細胞または肝組織に導入したい物質（細胞導入物質）を内包させることによって、肝細胞特異性を有する物質運搬体が得られる。この物質運搬体に内包される細胞導入物質とは、例えば D N A、 R NAなどの遺伝子、天然あるいは合成タンパク質、オリゴヌクレオチド、ペプチド、薬剤、天然あるいは合成化合物など、どのようなものであってもよレ、。

具体的には、既に発明者らにより報告されたヒト R N a s e 1 ( Jinno H, Ueda M, Ozawa S, Ikeda T, Enomoto K, Psarras K,

Kitajima M, Yamada H， Seno M Life Sci. 1996158 (21)： 1901-8) または R N a s e 3 (另 'J名 E C P : eosinophil cat ioni c protein ； Mai lor qui -Fernandez G, Pous J, Peracaula R, Aymami J, Maeda T, Tada H, Yamada H, Seno M, de Llorens R, Gomis - Ruth FX, Coll M; J Mo l B i o l . 2000 Ju l 28 ; 300 (5) : 1297- 307. ) 等が適用される。

これらのタンパク質は、細胞内外で作用し細胞傷害活性を有するものであるが、これらの R N a s e を本発明の物質運搬体（薬剤）に内包させて運搬することにより、細胞外では無毒化する一方、細胞内だけで作用させることができるので、より副作用の少ない新しい癌治療方法として期待される。

なお、上記細胞導入物質として、ほかに図 4〜図 7に示すタンパク質あるいは当該タンパク質をコードする遺伝子が挙げられ、さらに、肝臓疾患に有効なサイトカイン各種（インターフェロン各種、インターロイキン各種など）、癌抑制遺伝子（ p 5 3等）等の治療遺伝子も挙げることができる。

また、これらの細胞導入物質を上記の中空ナノ粒子に導入する方法としては、通常の化学的、分子生物学的実験手法で用いられる様々な方法が適用される。たとえば、エレクトロポレーシヨン法、超音波法、単純拡散法、あるいは電荷を有する脂質を用いる方法等が好ましく例示される。

そして、これらのタンパク質中空ナノ粒子、あるいは物質運搬体を用いて、 i n v i vo あるいは i n v i tro で細胞、または組織に特異的に物質を導入することが可能となる。さらには、上記の R N a s e を用いた例のように、以上のとおりのタンパク質中空ナノ粒子からなる薬剤を用いて、特定細胞または組織に物質を導入することを各種疾患の治療法あるいは治療法の 1 ステップとして行うことも可能になるのである。

本発明の薬剤による治療効果については、後述の実施例に示すとおり動物実験により実際に確認された。この実施例では、ヒト肝臓癌由来の細胞を移植したヌ一ドラットに、単純へルぺスゥィルス由来チミジンキナーゼ（H S V 1 tk) 遺伝子を包含した本発明の薬剤を投与後、さらにガンシク口ビル（ganciclovir:GCV)を投与した後、移植した癌組織の大きさを観察することにより治療効果を確認した。薬剤の投与は静脈内投与により行ったが、投与方法としては、このほかに、経口投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与等が挙げられる。

以下、実施例および比較例により、本発明をさらに詳細に説明するが, 本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。

以下の実施例において、 H B s A g とは、 B型肝炎ウィルス表面抗原 (Hepatitis B virus surface Antigen) を示す。 H B s A gは、 H B

Vの外被タンパク質であり、図 1 の摸式図に示すように、 H B s A gには、 Sタンパク質、 Mタンパク質、 Lタンパク質の 3種類がある。このうち、 Sタンパク質は、 3種のタンパク質に共通した、重要な外被タンパク質であり、 Mタンパク質は、 Sタンパク質の N末端側に 5 5ァミノ酸（pre- S2 peptide) が付加したものである。また、 Lタンパク質は、 Mタンパク質の N末端側に、 1 0 8 もしくは 1 1 9 アミノ酸（pre- S1 peptide) が付加したものである。

H B s A g Lタンパク質の Pre— S 領域 (pre-Sl, pre— S2) は、 H B Vが肝細胞に結合する際に、それぞれ重要な役割を担うことが知られている。 Pre-Sl は、肝細胞に直接結合する部位を持ち、 pre- S2 は、血中の重合アルブミンを介して肝細胞に結合する重合アルブミンレセプターを有するのである。

真核細胞で H B s A g を発現させると、同タンパク質は、小胞体膜上に膜タンパク質として発現、蓄積される。 H B s A gの Lタンパク質は分子間で凝集を起こし、小胞体膜を取り込みながら、出芽様式でルーメン側に粒子として放出される。

以下の実施例では、 H B s A gの Lタンパク質を用いた。また、図 2 に以下の実施例に記載される H B s A g粒子の発現および精製操作の概略説明図を示した。

〔実施例 A〕遺伝子組換え酵母による H B s A g粒子の発現本発明者らによって報告された J. Biol. Chem. , Vol.267, No.3, 1953-1961， 1992 記載の方法に基づいて、 p G L D L 11 P 3 9 _ R c T を保持した遺伝子組換え酵母 (Saccharomyces Cerevisiae AH22R -株）を、合成培地 High- Pi および 8S5N- P400 中で培養し、 H B s A g Lタンパク質粒子を発現させた。（図 2 a〜 c )

定常成長期（約 7 2時間後）にある遺伝子組換え酵母から、 Yeast Protein Extraction Reagent ( Pierce Chemical Co.製) を用レヽて、 whole cell extract を準備し、ドデシル硫酸ナトリウム—ポリアタリルアミドゲル電気泳動（ S D S— P AG E) を用いて分離して、銀染色によって試料中の H B s A gの同定を行った。

これより、 H B s A gは分子量約 5 2 k D a のタンパク質であることが明らかとなった。

〔実施例 B〕 H B s A g粒子の遺伝子組換え酵母からの精製

( 1 ) 合成培地 8 S 5 N— P 4 0 0で培養された遺伝子組換え酵母

(湿重量 2 6 g ) を buffer A 溶液（ 7. 5 M 尿素、 0. 1 M リン酸ナトリウム、 p H 7. 2、 1 5 mM E D TA、 2 mM PM S F、 0. 1 % T w e e n 8 0 ) 1 0 0 m 1 に懸濁し、グラスビーズを用いてビ一ドビーター（BEAD- BEATER) にて酵母を破砕した。破砕後、上清を遠心分離により回収した。（図 2 d )

( 2 ) 次に、上清を 0. 7 5倍容の 3 3 % ( w/w) P E G 6 0 0 0 と混合し、 3 0分間氷冷した。その後、遠心分離（ 7 0 0 0 r p m、 3 0分間）を行い、ペレットを回収した。同ペレットは、 T w e e n 8 0 を含まない buffer A溶液中で再懸濁した。

( 3 ) 再懸濁した液を、 1 0〜 4 0 %の勾配をかけた C s C 1 に重層し、 2 8 0 0 0 r p m、 1 6時間の超遠心分離を行った。遠心分離後の試料を 1 2画分に分け、ウェスタンブロット法（Western Blotting) ( 1次抗体は、 a n t i —H B s A gモノクローナル抗体）により H B s A g を含む画分を同定した。さらに、 H B s A gを含む画分を、 T w e e n 8 0を含まない buffer A溶液で透析した。

( 4 ) ( 3 ) で得られた透析液（ 1 2 m l ) を 5〜 5 0 %の勾配をかけたショ糖に重層し、 2 8 0 0 0 r p m、 1 6時間の超遠心分離を行つた。遠心分離後、（ 3 ) と同様に、 H B s A gを含む画分を同定し、 H B s A gを含む画分を尿素と T w e e n 8 0は含まず、代わりに 0. 8

5 %の N a C 1 を含む buffer A 溶液で透析した。（（ 2 ) 〜（ 4 ) ：図 2 e )

( 5 ) ( 4 ) と同様の操作を繰り返し、透析後の試料をウルトラフィノレター（Ultra Filter) Q 2 0 0 0 (アドバンテック社製）を用いて濃縮し、使用する時まで 4 °Cにて冷蔵保存した。（図 2 f )

C s C 1 平衡遠心分離後のゥヱスタンプロット（ 3 ) の結果から、 H B s A gは、分子量 5 2 k D a で S抗原性を有するタンパク質であることが分かった。最終的に、培地 2. 5 L由来、湿重量 2 6 gの菌体から約 2 4 m gの精製 H B s A g粒子を得た。一連の精製過程における画分を銀染色 S D S — P A G Eで解析した。また、精製により酵母由来のプロテア一ゼが除去されていることを確認するために、（ 5 ) で得られた H B s A g粒子を 3 7 °Cで 1 2時間インキュペートした後、 S D S — P A G Eを行い、銀染色により同定を行つた。

その結果、酵母由来のプロテアーゼは、一連の精製過程において完全に除去されていることが確認された。

〔実施例 C〕 H B s A g粒子への H S V 1 tk 遺伝子の封入（H S V I tk遺伝子を包含した H B s A g粒子の製造）

次に、上記方法により作製した H B s A g粒子内へ、癌治療用遺伝子として単純へルぺスウィルス由来チミジンキナーゼ（H S V 1 tk) 遺伝子を封入し、本発明の薬剤としての H S V 1 tk 遺伝子を包含した H B s A g粒子を製造した。

上記 H S V 1 tk 遺伝子が導入された癌細胞では、この H S V 1 tk 遺伝子が発現することによりガンシクロビル（ganciclovir:GCV)に対して感受性になり、ガンシクロビルが投与されると、強力な巻き添え効果を惹起しつつ、癌細胞は死滅する。このように、 H S V 1 tk 遺伝子は癌遺伝子治療に広く使用される遺伝子の 1つである。

本実施例では、 H B s A g粒子内へ H S V 1 tk 遺伝子を封入するため、 H S V 1 tk遺伝子を発現する Invivogen社製のベクタ一 p G T 65 一 h I F - αを使用し、この発現べクターをエレクトロポレーシヨン法により H B s A g粒子内に導入することによって、 H S V 1 tk 遺伝子が包含された H B s A g粒子を作製した。具体的には、 H B s A g粒子中の Lタンパク質粒子 5 0 μ gに対し、上記発現べクタ一 1 0 μ g導入した。またこのとき、 P B Sノくッファーを使用し、エレクト口ポレーシヨンの条件は、 2 2 0 V、 9 5 0 Fで 4 mmのキュベットを使用して行った。

〔実施例 D〕ヒト肝臓癌を移植したヌ一ドラットに対する H S V 1 tk遺伝子包含 H B s A g粒子による癌治療効果

次に、上記方法により作製した H S V 1 tk 遺伝子を包含する H B s A g粒子の肝臓癌に対する治療効果を実験動物により確認した。

本実施例では、実験動物として日本クレアから購入したヌードラット (系統： F344/NJcl-rnu/rnu、性別：メス）の両側背部皮下に、ヒト肝臓癌由来細胞 H u H— 7 (JCRB0403) 、および陰性対照としてヒト大腸癌由来細胞 W i D r (ATCC CCL- 218) を有するそれぞれの担癌ラットにより治療効果を確認した。上記担癌ラットは、それぞれの腫瘍細胞を Matrigel (ベタトン &ディッキンソン社製）と混合して、使用説明書どおりに使用して、上記ヌードラットに腫瘍生着させ、生着させた腫瘍が直径 2〜 3 c m程度の固形癌になるまで約 3週間生育させることにより得た。

その後、上記担癌ラットに、約 1 0 μ gの H S V 1 tk 遺伝子を包含する H B s A g粒子を尾静脈より投与した（静脈注射した）。そして、静脈注射の 5 日後から、上記担癌ラットに対し、浸透圧ポンプ（alzet osmotic pump; Cat 番号 2ML2) を用いてガンシクロビル（G C V) を 5 0 m gノ k g / d a yの割合で投与した。上記浸透圧ポンプは、 G C V を含む薬液とともに上記担癌ラットの背中皮下に移植した。このガンシクロビルの投与は、最大 1 4 日間行った。ガンシクロビル投与後、上記担癌ラットの腫瘍組織の状態（大きさ）を経時的に観察した。具体的には、ノギスで腫瘍部分の短径と長径とを測定し、腫瘍容積近似式（長径 X短径 X短径ノ 2 ) を計算して行った。測定は、ネズミ 3連で行った。その結果を下記の図 3およぴ図 8に示す。

図 3および図 8 に示すように、ヒト大腸癌由来の腫瘍組織（W i D r ) では経時的な退縮は観察されず、治療効果は認められなかったのに対して、ヒト肝臓癌由来の腫瘍細胞（N U E ) では経時的な退縮が観察され、 H B s A g— H S V 1 tk 粒子による肝臓癌特異的な治療効果が認められた。

このように、本発明に係る薬剤としての上記 H B s A g - H S V 1 tk 粒子は、ヒト肝細胞に対して極めて高い特異性と効率で遺伝子導入が可能であり、肝臓癌に対して実際に治療効果があることが確認されたまた、本実験により、上記 H B s A g - H S V 1 tk 粒子による肝臓癌治療のためのプロトコールを実験動物で確立することができた。

尚、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する特許請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。産業上の利用の可能性

以上のように、本発明に係る薬剤は、静脈注射という簡便な方法で、肝臓癌などに代表される肝臓疾患を特異的かつ効果的に治療することができ、従来の遺伝子治療と大きく異なり、大手術を必要とせず、副作用の心配もきわめて低く、そのまま臨床応用可能なものである。

Claims

請求の範囲

1 . 肝細胞認識能を有し、粒子形成能を有するタンパク質からなる中空ナノ粒子に、肝臓疾患治療用の細胞導入物質が包含されてなる薬剤。

2. 請求の範囲 1 に記載の上記タンパク質は、 B型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質であることを特徴とする薬剤。

3. 請求の範囲 1 または 2に記載の上記細胞導入物質は、遺伝子であることを特徴とする薬剤。

4. 請求の範囲 3に記載の上記遺伝子は、癌治療用の遺伝子であることを特徴とする薬剤。

5. 請求の範囲 4に記載の上記遺伝子は、単純へルぺスウィルス由来チミジンキナーゼ（H S V 1 tk) 遺伝子であることを特徴とする薬剤。

6. 請求の範囲 1〜 5のいずれか 1項に記載の薬剤は、静脈注射により人体に投与されることを特徴とする薬剤。

7. 請求の範囲 1〜 6のいずれか 1項に記載の薬剤を投与することによる肝臓疾患の治療方法。