WO2004082720A1

WO2004082720A1 - 血友病治療用薬剤及びそれを用いた血友病治療方法

Info

Publication number: WO2004082720A1
Application number: PCT/JP2004/003560
Authority: WO
Inventors: Masakazu Ueda; Shunichi Kuroda; Katsuyuki Tanizawa; Masaharu Senoo; Akihiko Kondo; Thierry Vandendriessche; Marinee Chuah
Original assignee: Beacle Inc.; Vib (Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie) Vzw; D. Collen Research Foundation Vzw Onderwijs En Navorsing Campus Gasthuiserg K. U. Leuven
Priority date: 2003-03-17
Filing date: 2004-03-17
Publication date: 2004-09-30
Also published as: CN1787840A; EP1609482A1; JP2004277355A; EP1609482A4; US20060240114A1

Abstract

粒子形成能を有するタンパク質、例えばＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質を真核細胞中で発現させることにより得られた中空ナノ粒子に、血友病治療用の血液凝固第ＶIII（IＸ）因子の遺伝子を包含させるという簡便な方法により、血液凝固因子の遺伝子を肝細胞に効率的に導入することができると共に副作用の心配も極めて低い薬剤を得る。

Description

明細書血友病治療用薬剤及びそれを用いた血友病治療方法技術分野本発明は、中空ナノ粒子を用いる血友病治療用薬剤及びそれを用いた血友病治療方法に関し、より詳細には、粒子内部に血友病治療用の細胞導入物質を包含し、この細胞導入物質を細胞内に特異的に導入可能な薬剤及びそれを用いた血友病治療方法に関する。

本出願は、日本国において 2 0 0 3年 3月 1 7日に出願された日本特許出願番号 2 0 0 3— 0 7 1 7 8 8を基礎として優先権を主張するものであり、この出願は参照することにより-，本出願に援用される。背景技術近年、医学の分野において、患部に直接作用し、高い効果を示す副作用の少ない薬品の開発が盛んに行われている。特に、ドラッグデリバリーシステム（D D S ) と呼ばれる方法は、目的細胞や目的組織に対して特異的に薬剤等の有効成分を運搬し、目的箇所で有効成分を作用させることのできる方法として注目されている。

また、最近の分子細胞生物学の分野においても、特定細胞への遣伝子導入は必要不可欠な技術として盛んに研究されている。さらに、ヒトゲノム計画の進展により各種疾患の遺伝的な背景が明らかになりつつある現在、このような細胞、組織に対する特異性の高い遺伝子導入法が確立されれば、遺伝子治療の分野での応用も可能となる。 +

細胞に遺伝子を導入する方法としては、これまでに、遺伝子を巨大分子化してエンドサイトーシスによって遺伝子を取り込ませる方法（リン酸カルシウム法、リポフエクタミン法）や、電気パルス刺激により細胞膜に穿孔を開け、遗伝子を導入させる方法（エレクトロボレ一シヨン法、遺伝子銃法）が知られており、何れも今日では、分子生物学的実験において一般的に実施されている方法である。これらの方法は簡便であるが、細胞を直接、物理的に傷つけ、遺伝子導入部位を外科的に露出させる必要があるため、生体内部の細胞や組織には容易に適用できない。また、 100 %近い導入率を得ることは難しい。

一方、安全性の高い物質導入方法としてはリボソーム法が知られている。この方法は、細胞を傷つけることがないため、生体内部の細胞や組織にも適用することが可能である。しかしながら、単純な脂質であるリボソームに高度な細胞及び組織特異性を付与することは困難であり、さらに、 in vivo での遺伝子導入率は、要求される値に比べてはるかに低いという問題がある。

最近になって、ウィルス DNAに目的の遺伝子を組み込み、感染性ウィルスを生成して遗伝子導入を行う技術が開発された。この方法は導入部位を露出する必要がなく . 個体にも応用でき、導入効率も 1 00 %近いため，各種遺伝性疾患や後天性疾患に対する造伝子治療のための画期的な方法として注目されている。例えば、血友病は血液凝固因子の欠乏により出血を主徵とする遺伝性疾患である。このうち血液凝固第 VIII因子（抗血友病因子）の欠乏症が血友病 A、血液凝固第 IX因子 (クリスマス因子) の欠乏症が血友病 Bであり . 両者とも X染色体上にある第 VIII (IX) 因子の遺伝子異常が原因とされる。一般に，このような血友病患者に対しては、第 VIII (IX) 因子製剤の静脈内投与による補充療法が行われるが、生理的レベルに近い量の凝固因子を恒常的に発現させるために、例えば日本公表特許公報 2002 - 527493号では、第 VIII因子をコ一ドする配列を含むアデノ随伴ベクターを作製し、これを血友病 Aの患者に投与する技術が提案されている。

しかしながら、このようなウィルス DN Aを用いた遺伝子導入では、ウィルスが広範囲の細胞に非特異的に感染するため目的の細胞以外にも遺伝子が導入されてしまうという重大な問題がある。また、ウィルスゲノム本体が染色体に組み込まれ、将来予期できぬ副作用を引き起こす可能性がある。さらに、細胞及び組織特異性がないため、この第 VIII因子を肝臓で発現させるた.めには、例えば門脈投与するか、又は第 VIII因子をコードする配列と組織型により特異的に転写される制御配列とを連結する必要がある。

一方、本件発明者らは、日本公開特許公報 2 0 0 1— 3 1 6 2 9 8号において、粒子形成能を有する蛋白質に生体認識分子が導入された中空ナノ粒子を用いて、目的とする細胞や組織に、物質（遺伝子、タンパク質、化合物等）を特異的且つ安全に運搬、導入するための方法を提案している。

この日本公開特許公報 2 0 0 1 - 3 1 6 2 9 8号に記載の技術によれば、中空ナノ粒子により種々の物質を運搬するとができるが、この方法を用いる特定疾患、例えば血友病に対する治療薬の開発がさらなる課題となっていた。発明の開示本発明は、このような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、簡便な方法により血液凝固因子の遗伝子を肝細胞に効率的に導入することができると共に、副作用の心配も極めて低い血友病治療用薬剤、及びそれを用いた血友病治療方法を提供することを目的とする。

本件発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、ヒト肝臓癌細胞を移植した実験動物に血液凝固第 V I I I、第 I X因子の遺伝子を包含した B型肝炎ウィルス表面抗原粒子を静脈注射することによりヒト肝臓由来組織部分に特異的に造伝子が導入されて血液凝固因子を発現し、血友病を治療する効果があることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明に係る血友病治療用薬剤は、粒子形成能を有するタンパク質からなる中空ナノ粒子に、血友病治療用の造伝子が包含されてなるものである。また、本発明に係る血友病治療用薬剤は、真核細胞でタンパク質を発現させて得られるタンパク質粒子に生体認識分子が導入された中空ナノ粒子に、血友病治療用の遺伝子が包含されてなるものである。

粒子を形成する上記タンパク質としては、例えば B型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質を挙げることができる。このタンパク質は、真核細胞で発現させると、小胞体膜上に膜タンパク質として発現、蓄積され、粒子として放出される。こうして得られた中空ナノ粒子は、肝細胞を認識し、肝細胞に対して特異的に粒子内の物質を運搬することができるので、血友病治療用の遺伝子、具体的には血液凝固第 VIII因子又は血液凝固第 IX因子を包含させることにより、肝細胞において特異的にその遺伝子を発現させることができる。

本発明に係る血友病治療用薬剤は、静脈注射という簡便な方法で血友病を効果的に治療することができ、副作用の心配も極めて低く、そのまま臨床応用可能なものである。

また、本発明に係る血友病治療方法は、本発明に係る血友病治療用薬剤を投与することにより血友病を治療するものである。

本発明の更に他の目的、本発明によって得られる具体的な利点は、以下に説明される実施例の説明から一層明らかにされるであろう。図面の簡単な説明図 1は、本発明の実施例における HB s A g遺伝子の各夕ンパク質領域を表す概略模式図である。

図 2は、本発明の実施例における遺伝子組換え酵母を用いた HB s Ag粒子の発現及び精製操作を例示した概略説明図である。

図 3は、本発明の実施例における h F VIII遺伝子を包含した HB s A g粒子による血液凝固第 VIII因子の発現効果を示す図である。

図 4は、本発明の実施例における h FIX遺伝子を包含した HB s A g粒子による血液凝固第 IX因子の発現効果を示す図である。発明を実施するための最良の形態本実施の形態における中空ナノ粒子は、粒子形成能を有するタンパク質に生体認識分子を導入することによって、任意の細胞或いは組織、例えば肝細胞、肝組織に特異的に血液凝固第 VIII、第 IX因子をコードする遺伝子を運搬することを可能とするものである。このような粒子形成能を有するタンパク質としては、種々のウィルスから得られるサブウィルス粒子を適用することができる。具体的には、 B型肝炎ウィルス（Hepat i t i s B Vi rus； H B V ) 表面抗原タンパク質等が例示される。

また、このような粒子形成能を有する夕ンパク質からなるタンパク質粒子としては、真核細胞でタンパク質を発現させることにより得られるものが挙げられる。つまり、真核細胞で粒子形成能を有するタンパク質を発現させると、同タンパク質は、小胞体膜上に膜タンパク質として発現、蓄積され、粒子として放出される。このとき、真核細胞としては、酵母や遺伝子組換え酵母、昆虫細胞、動物細胞等が適用できる。

本件発明者らは、後述の実施例に示す通り、遺伝子組換え酵母で前記 H B V表面抗原 Lタンパク質を発現させることにより、発現された H B V表面抗原 Lタンパク質から酵母由来の脂質二重膜に多数の同タンパク質が埋め込まれた短径約 2 0 n m, 長径約 1 5 0 n mの楕円状中空粒子が形成されることを見出し、報告している ( J. B io. Chem. , Vol. 267, No. 3, 1953-1961, 1992) 。このような粒子は, H B Vゲノムや H B Vタンパク質を全く含まないので、ウィルスとしては機能せず、人体への安全性が極めて高い。また、 H B Vの肝細胞への極めて高い感染力を担う肝細胞特異的レセプ夕一を粒子表面に提示しているため、肝細胞に対して特異的に物質を運搬する運搬体としての効果も高い。

このように遺伝子組換え酵母を用いてタンパク質粒子を形成する方法は、菌体内の可溶性タンパク質から高効率で粒子が生産される点で好適である。

一方、昆虫細胞や動物細胞は、酵母よりも高等動物に近い真核細胞であるといえ、酵母では再現しきれない糖鎖等の高次構造をも再現できる点で異種タンパク質の大量生産において好ましい方法といえる。従来の昆虫細胞の系はバキュロウィルスを用いた系で、ウィルス発現を伴うものであったために、タンパク質発現に際して細胞が死滅したり溶解したりした。その結果、タンパク質発現を連続的に行ったり、死滅細胞から遊離したプロテアーゼによりタンパク質が分解したりするという問題があった。また、タンパク質を分泌発現させる場合には、培地中に含まれる牛胎仔血清が大量に混入することで、その精製が困難であった。しかし、最近になって、バキュロウィルスを介さない昆虫細胞系で、無血清培養可能なものがインビトロゲン（Invi trogen) 社により開発され、市販されている。しえ、酵母では再現しきれない糖鎖等の高次構造をも再現できる点で異種タンパク質の大量生産において好ましい方法といえる。従来の昆虫細胞の系はバキュロウィルスを用いた系で、ウィルス発現を伴うものであったために、タンパク質発現に際して細胞が死滅したり溶解したりした。その結果、タンパク質発現を連続的に行つたり、死滅細胞から遊離したプロテアーゼにより夕ンパク質が分解したりするという問題があった。また、タンパク質を分泌発現させる場合には、培地中に含まれる牛胎仔血清が大量に混入することで、その精製が困難であった。しかし、最近になって、バキュロウィルスを介さない昆虫細胞系で、無血清培養可能なものがインピトロゲン（Inv i t rogen) 社により開発され、市販されている。したがって、このような昆虫細胞を用いれば、精製が容易で高次構造をも再現されたタンパク質粒子が得られる。

本発明の中空ナノ粒子では、以上のような種々の方法によって得られた粒子表面のレセプ夕一を任意の生体認識分子に改変することにより、肝細胞以外にも、任意の細胞及び組織に極めて高い特異性で物質を運搬導入することが可能となる。

勿論、粒子形性能を有するタンパク質は、前記の B型肝炎ウィルス表面抗原夕ンパク質に限られるものではなく、粒子を形成することができるタンパク質であれば、どのようなものでもよく、動物細胞、植物細胞、ウィルス、菌類等に由来する天然タンパク質や、種々の合成タンパク質等が考慮される。また、例えばゥィルス由来の抗原タンパク質等が生体内において抗体を惹起する可能性がある場合などは、改変して抗原性を減少させたものを生体認識分子として用いてもよい。粒子形成能を有するタンパク質に導入される生体認識分子としては、例えば成長因子、サイト力イン等の細胞機能調節分子、細胞表面抗原、組織特異的抗原、レセプ夕一などの細胞及び組織を識別するための分子、ウィルス及び微生物に由来する分子、抗体、糖鎖、脂質などが好ましく用いられる。これらは、目的とする細胞或いは組織に応じて適宜選択される。

本発明では、以上のような中空ナノ粒子に、任意の細胞又は組織、例えば肝細胞又は肝組織に導入したい血液凝固第 V I I I、第 I X因子をコードする遺伝子を内包させることによって、血友病治療治療用の物質運搬体を得る。この遺伝子を上記の中空ナノ粒子に導入する方法としては、通常の化学的、分子生物学的実験手法で用いられる様々な方法が適用される。例えば、エレクト口ポレーシヨン法、超音波法、単純拡散法、或いは電荷を有する脂質を用いる方法等が好ましく例示される。

そして、これらの中空ナノ粒子、或いは物質運搬体を用いて、 in vivo 或いは in vitro で細胞又は組織に特異的に物質を導入することが可能となる。さらには、中空ナノ粒子や物質運搬体を用いて、特定細胞又は組織に物質を導入することを各種疾患の治療法或いは治療法の 1ステップとして行うことも可能になる。

本発明の薬剤の効果については、後述の実施例に示す通り、動物実験により実際に確認された。この実施例では、ヒト肝臓癌由来の細胞を移植したヌードマウスに、血液凝固第 VIII (IX) 因子をコードする遺伝子を包含した本発明の薬剤を投与後、血清中の第 VIII (IX) 因子の発現レベルを測定することによって確認した。薬剤の投与は静脈内投与により行ったが.，投与方法としてはこの他に経口投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与等が挙げられる。

以下本発明を適用した具体的な実施例について.，図面を参照しながら詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、添付の請求の範囲及びその主旨を逸脱することなく、様々な変更、置換又はその同等のものを行うことができることは当業者にとって明らかである。

実施例

以下の実施例において、 HB s Agとは、 B型肝炎ウィルス表面抗原 (Hepati tis B virus surface Antigen) を示す。 HB s Agは、 HBVの外被タンパク質であり、図 1の摸式図に示すように、 HB s Agには、 Sタンパク質、 Mタンパク質、 Lタンパク質の 3種類がある。このうち、 Sタンパク質は、 3種のタンパク質に共通した、重要な外被タンパク質であり、 Mタンパク質は、 Sタンパク質の N末端側に 5 5アミノ酸からなる p r e— S 2ぺプチドが付加したものである。また、 Lタンパク質は、 Mタンパク質の N末端側に、 1 0 8又は 1 1 9アミノ酸からなる p r e— S 1ぺプチドが付加したものである。この Lタンパク質の塩基配列を配列番号 1に、アミノ酸配列を配列番号 2に示す。

HB s Ag Lタンパク質の p r e— S 1領域は、肝細胞に直接結合する部位を持ち、 HBVが肝細胞に結合する際に、それぞれ重要な役割を担うことが知られている (Cell, Vol.46, 429-436, 1986 ； J. of Virol. , Vol.73, 2052-2057, 1 999) 。

真核細胞で HB s Agを発現させると、同タンパク質は、小胞体膜上に膜タンパク質として発現、蓄積される。 HB s A gの Lタンパク質は、分子間で凝集を起こし、小胞体膜を取り込みながら、出芽様式でルーメン側に粒子として放出される。

以下の実施例では、 HB s Agの Lタンパク質を用いた。また、図 2に以下の実施例に記載される HB s A g粒子の発現及び精製操作の概略説明図を示した。

実施例 1

遺伝子組換え酵母による HB s A g粒子の発現

本件発明者らによって報告された文献「； T. Bio. Chem. , Vol.267, No.3, 1953-1

961, 1992」記載の方法に基づいて Lタンパク質発現プラスミド pGLDLIIP39-Rc Tを保持した造伝子組換え酵母 (Saccharomyces Cerevisiae AH22R- 株）を、合成培地 Higli-Pi 及び 8S5N- P400 中で培養し、 Lタンパク質粒子を発現させた（図 2 a、 b) 。定常成長期（約 7 2時間後）にある遺伝子組換え酵母から、 Yeast Pr otein Extract ion Reagent (Pierce Chemical Co.製) を用レて whole cell ex tract を準備し、ドデシル硫酸ナトリウム一ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) により分離して、銀染色によって試料中の HB s A gの同定を行つた。これにより、 H B s A gは分子量約 5 2 k D aのタンパク質であることが明らかとなつた。

実施例 2

HB s A g粒子の遗伝子組換え酵母からの精製

(1) 合成培地 8 S 5 N— P 40 0で培養された遺伝子組換え酵母（湿重量 2 6 g) を buffer A溶液（ 7. 5 M 尿素、 0. 1 M リン酸ナトリウム（p H 7. 2) 、 1 5mM EDTA、 2 mM PMS F、 0. 1 % Tween80 ) 1 0 Om 1に懸濁し、グラスピーズを用いてビ一ドビー夕一（BEAD-BEATER) にて酵母を破碎した。破砕後、上清を遠心分離により回収した（図 2 c、 d) 。

(2) 次に、上清を 0. 7 5倍容の 33 % (w/w) PEG 6 00 0と混合し、 30分間氷冷した。その後、遠心分離（7 0 00 r pm、 3 0分間）を行い、ぺレットを回収した。同ペレットは、 TweenSO を含まない buffer A溶液中で再懸濁した。

(3) 再懸濁した液を、 1 0〜40 %の勾配をかけた C s C 1に重層し、 28 00 0 r pm、 1 6時間の超遠心分離を行った。遠心分離後の試料を 1 2画分に分け、ウエスタンプロット法（Western Blotting) ( 1次抗体は、抗 HB s Ag モノクローナル抗体）により HB s A gを含む画分を同定した。さらに、 HB s A gを含む画分を TweenSO を含まない buffer A溶液で透析した。

(4) ( 3 ) で得られた透析液 ( 1 2m l ) を 5〜 50 %の勾配をかけたショ糖に重層し、 2 80 0 0 r pm、 1 6時間の超遠心分離を行った。遠心分離後、

(3) と同様に、 HB s A gを含む画分を同定し、 HB s A gを含む画分を尿素と Tween80 は含まず、代わりに 0. 8 5 %の N a C 1 を含む buffer A溶液で透析した（（2) 〜（4) ：図 2 e) 。

(5) (4) と同様の操作を繰り返し、透析後の試料をウルトラフィルター (Ultra Filter) Q 20 0 0 (アドバンテック社製）を用いて濃縮し、使用する時まで 4 °Cにて冷蔵保存した (図 2 f ) 。 C s C 1平衡遠心分離後のウエスタンプロット（3) の結果から、 HB s Agは分子量 52 k D aで S抗原性を有するタンパク質であることが分かった。最終的に、培地 2. 5 L由来、湿重量 26 gの菌体から、約 24mgの精製 HB s A g粒子を得た。

一連の精製過程における画分を銀染色 S D S— PAGEで解析した。また、精製により酵母由来のプロテア一ゼが除去されていることを確認するために、

(5) で得られた HB s A g粒子を 3 7でで 1 2時間インキュベートした後、 S D S— PAGEを行い、銀染色により同定を行った。その結果、酵母由来のプロテア一ゼは、一連の精製過程において完全に除去されていることが確認された。

実施例 3

HB s Ag粒子への h F VIII、 h F I X遗伝子の封入（ h F V 111、 h FIX遗伝子を包含した HB s A g粒子の製造）

上記方法により作製した HB s A g粒子内へ、血友病治療用遺伝子としてヒト血液凝固第 VIII (IX) 因子をコードする遺伝子（h FVIII、 h FIX) を封入し、本発明の薬剤としての h F VIII (h F IX) 遺伝子を包含した H B s A g粒子を製造した。

本実施例では、 HB s A g粒子内へ h F VIII遺伝子及び h FIX遺伝子を封入するため、それぞれトリノ大学の L. Naldini 博士から恵与された pRRLsin. cPPT. C MV. FVIII. Wpre 及び pRRLsin. cPPT. Alb. FIX. Wpre (Human Gene Therapy, Vol.13, 243-260, 2002) を発現ベクターとして使用した。

この発現べクタ一をエレクトロポレーシヨン法により HB s A g粒子内に導入することによって、 hFVIII (h F IX) 遺伝子が包含された H B s A g粒子を作製した。具体的には、 500 1の 83 (p H 7. 2) に溶解された HB s Ag粒子中の Lタンパク質粒子 100 gに対し、上記発現べクタ一を 20 a g 導入した。またこのとき、エレクトロボレ一シヨンは、 Gene Pulser II electro poration system (Bio- Rad社製）により、 50V、 7 50 Fで 4 mmのキュべットを使用して行った。

実施例 4

ヒト肝臓癌を移植したヌードマウスに対する h F VIII (h FIX) 遺伝子包含 HB s A g粒子による血液凝固第 VIII (IX) 因子の発現効果

上記実施例により作製した h F VIII (h F IX) 遺伝子を包含する H B s A g 粒子による血液凝固第 VIII (IX) 因子の発現効果を実験動物により確認した。本実施例では、実験動物として日本クレアから購入したヌードマウス（Balb/c nu/nu、メス 5週齢）の両側背部皮下に、ヒト肝臓癌由来細胞 N u Eを 1 X 10 ⁷個投与し、直径 1 c m程度の固形癌になるまで約 5 , 6週間生育させ、担癌マウスを得た。

その後、上記担癌マウスに、約 20 gの hFVIII (h FIX) 遺伝子発現べクタ一を包含する HB s A g粒子を尾静脈より投与し、血漿中の血液凝固第 VII I (IX) 因子の量をェンザィムィムノアッセィ（ELISA) により継時的に測定した。

EL I SAは、それぞれ第 VIII、第 IX因子に特異的な Asserachom VIIIC： Ag kit, Asserachom IX： Ag kit (Diagnostics Stago社製）を使用して行った。

なお、陰性対照としてはヒト大腸癌由来細胞 W i D rを 1 X 10⁷個投与して得た担癌マウスを用い、上記と同様にして血漿中の血液凝固第 VIII (IX) 因子の量を測定した。

測定した血漿中の血液凝固第 VIII因子量の、上記キットの陽性対照血漿中の血液凝固第 VIII因子量に対する割合 (%) の推移を図 3に示す。また、血漿中の血液凝固第 IX因子の濃度推移を図 4に示す。図 3， 4に示すように、陰性対照では継時的な変化は見られなかったのに対して、ヒト肝臓由来の腫瘍細胞（Nu e) を投与したマウスでは 10日前後経過してから血液凝固第 VIII、第 IX因子の発現が見られ、「重度」のヒト患者を「中度」に改善する程度の発現レベル（Cur. Gene Therapy, Vol.1, 301-305, 2001) に達した。その後、このレベルが少なくとも 1ヶ月維持され、 40日程度経過後に低下した。この発現の低下は、腫瘍細胞 (N u e ) に由来する癌のネクロ一シスによるものと考えられる。

このように、本実施の形態における薬剤としての h F VIII (h F IX) 遗伝子包含 HB s Ag粒子は、ヒト肝細胞に対して極めて高い特異性と効率で遺伝子導入が可能であり血友病に対して実際に治療効果があることが確認された。また本実験により、上記 h F VIII (h FIX) 遺伝子包含 H B s A g粒子による血友病治療のためのプロトコールを実験動物で確立することができた。

なお、上述した実施例では、 h F VIII (h FIX) 遺伝子を発現するべクタ一として pRRLsinPPTCMVFVIIIpre (p RLs inPPTAlbFIXpre) を使用したが、これに限定されるものではなく、例えば文献 rcur. Gene Therapy, Vol.1, 301-305, 200 1」に記載されているような種々のべクタ一を利用することができる。また、例えば血液凝固第 V I II因子の軽鎖と重鎖とを別々のべクタ一に組み込むようにしてもよく、 Bドメインを欠失させた血液凝固第 VIII因子をベクターに組み込むようにしても、同様の効果を奏することができる。産業上の利用可能性上述した本発明に係る血友病治療用薬剤は、静脈注射という簡便な方法で血友病を効果的に治療することができ、副作用の心配も極めて低く、そのまま臨床応用可能なものである。

Claims

請求の範囲

1 . 粒子形成能を有するタンパク質からなる中空ナノ粒子に、血友病治療用の遺伝子が包含されてなることを特徴とする血友病治療用薬剤。

2 . 真核細胞でタンパク質を発現させて得られるタンパク質粒子に生体認識分子が導入された中空ナノ粒子に、血友病治療用の遺伝子が包含されてなることを特徵とする血友病治療用薬剤。

3 . 上記真核細胞は、酵母又は遺伝子組換え酵母であることを特徴とする請求の範囲第 2項記載の血友病治療用薬剤。

4 . 上記真核細胞は、昆虫細胞であることを特徴とする請求の範囲第 2項記載の血友病治療用薬剤。

5 . 上記真核細胞は、動物細胞であることを特徴とする請求の範囲第 2項記載の血友病治療用薬剤。

6 . 粒子を形成する上記夕ンパク質は、 B型肝炎ウィルス表面抗原夕ンパク質であることを特徴とする請求の範囲第 1項乃至第 5項のいずれか 1項記載の血友病治療用薬剤。

7 . 上記血友病治療用の遗伝子は、血液凝固第 V I I I因子又は血液凝固第 I X因子であることを特徴とする請求の範囲第 1項乃至第 6項のいずれか 1項記載の血友病治療用薬剤。

8 . 静脈注射により人体に投与されることを特徴とする請求の範囲第 1項乃至第 7項のいずれか 1項記載の血友病治療用薬剤。

9 . 請求の範囲第 1項乃至第 8項のいずれか 1項記載の薬剤を投与することを特徴とする血友病治療方法。