KR100686356B1 - 중공 나노입자를 형성하는 단백질에 질환 치료용 세포도입 물질을 융합시킨 약제 - Google Patents

Abstract

단백질 중공 나노입자를 사용한 목적 세포나 조직에 특이적으로 작용하는 질환 치료용 약제로서, 입자 내부에 단백질 약제를 효율적으로 포함시킬 수 있는 약제 및 이 약제를 사용한 치료 방법을 제공한다. 간세포 등의 특정 세포에 대한 인식 능력을 갖고 입자 형성 능력을 갖는 단백질(예를 들면, B형 간염 바이러스 표면 항원 단백질)로 이루어진 중공 나노입자에 있어서, 해당 단백질에 질환 치료용 세포 도입 물질(예를 들면, 인터페론 또는 간세포 성장 인자 등)이 융합되어 이루어지는 약제이다.

Description

중공 나노입자를 형성하는 단백질에 질환 치료용 세포 도입 물질을 융합시킨 약제{Drugs Comprising Protein Forming Hollow Nanoparticles and Therapeutic Substance to Be Transferred into Cells Fused Therewith}

본 발명은 중공 나노입자를 형성하는 단백질에 질환 치료용 세포 도입 물질이 융합되어 이루어진 약제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 입자 내부에 질환 치료용 세포 도입 물질을 포함하고, 이 세포 도입 물질을 특정 세포 또는 조직내에 특이적으로 도입 가능한 약제에 관한 것이다.

근래 의학 분야에서 환부에 직접 작용하고 높은 효과를 나타내는 부작용이 적은 약품 개발이 활발히 진행되고 있다. 특히 약물 전달 시스템(DDS)으로 불리는 방법은 목적 세포 또는 목적 조직에 대하여 특이적으로 약제 등의 유효 성분을 운반하고, 목적 위치에서 유효 성분을 작용시킬 수 있는 방법으로서 주목받고 있다.

목적 세포 또는 목적 조직에 대하여 특이적으로 약제가 되는 단백질을 보내 는 방법으로서는 종래 해당 단백질을 코딩하는 유전자가 편입된 발현 벡터를 전기천공법 등에 의해 목적 세포에 도입하여 이 유전자를 세포내에서 발현시킴으로써 단백질 약제를 세포내로 보내는 이른바 유전자 도입 방법이 개발되어 왔다. 그러나 이와 같은 종래의 유전자 도입 방법은 모두 목적 세포 또는 목적 조직에 대하여 특이적으로 단백질 약제를 보내는 방법으로서는 불충분한 것이었다. 다른 한편, 약제로 되는 단백질을 직접적으로 목적 세포 또는 목적 조직에 보내는 방법에 관해서는 아직 유효한 방법이 개발되어 있지 않은 실정이다.

이상과 같은 상황을 감안하여 본 발명자들은 국제공개번호 WO01/64930호의 국제출원(공개일: 2001년 9월 7일)(이하, 「국제 출원 WO01/64930」이라 한다)에서, 입자 형성 능력을 갖는 단백질에 생체 인식 분자가 도입된 중공 나노입자를 사용하여 목적 세포나 조직에 물질(유전자, 단백질, 화합물 등)을 특이적이면서 안전하게 운반, 도입하기 위한 방법을 제안하고 있지만, 이 방법을 응용하면서 목적 세포 또는 조직에 대하여 특이적으로 전달할 수 있는 단백질 약제의 개발 등이 이하와 같은 문제를 극복하기 위해서도 과제로 남아 있었다.

종래에는 단백질 약제를 목적 세포나 조직에 특이적이면서 안전하게 운반, 도입하는 것이 곤란하였기 때문에 단백질 약제를 사용한 치료는 환자에 큰 부담을 주었다.

예를 들면, 바이러스성 간염(특히 C형 간염)의 치료에는 정맥 주사에 의하여 단백질 약제인 인터페론을 장기간 전신 투여하는 방법을 취하고 있다. 이 방법은 높은 치료 효과가 인정되지만, 환부 이외에도 인터페론이 작용하기 때문에 투여 때마다 고열, 탈모, 허탈감, 면역 반응 등의 부작용이 일어나는 문제가 있다.

또한, 간세포 성장 인자는 간경변 치료에 유효한 것으로 알려져 있으나, 정 맥주사로 전신 투여하면 예측할 수 없는 부작용이 일어날 가능성이 있으므로, 카테터에 의하여 간장에 직접 투여하는 방법을 채택하고 있다. 그러나 카테터에 의하여 투여하기 위해서는 수술이 필요하며, 장기간의 치료는 환자에게 부담이 되고 있다.

본 발명은 상기의 과제를 감안하여 이루어진 것으로, 그 목적은 단백질 중공 나노입자를 사용한 목적 세포나 조직에 특이적으로 작용하는 질환 치료용 약제로서 입자 내부에 단백질 약제를 효율적으로 포함시킬 수 있는 약제 및 이 약제를 사용한 치료 방법을 제공하는 데에 있다.

본 발명자들은 예의 검토를 거듭한 결과, 입자를 형성하는 단백질과 질환 치료용 단백질 약제(세포 도입 물질)가 융합된 단백질을 발현하는 벡터를 제조하고, 이 벡터를 사용하여 약제가 되는 입자를 제조함으로써, 입자 내부에 단백질 약제를 효율적으로 포함시킬 수 있다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명에 관한 약제는 특정 세포(예를 들면 간세포 등)에 대한 인식 능력을 갖고 입자 형성 능력을 갖는 단백질로 이루어진 중공 나노입자에 있어서, 해당 단백질에 질환 치료용 세포 도입 물질이 융합되어 이루어진 약제이다.

상기 「입자 형성 능력을 갖는 단백질」로서는, 예를 들면 B형 간염 바이러스 표면 항원 단백질을 들 수 있다. 이 단백질은 진핵세포에서 발현시키면 소포체막상에 막 단백질로서 발현, 축적되어 입자로서 방출된다. 본 발명의 약제는 이와 같은 입자 형성 능력을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자와 그 하류 측에 상기 세포 도입 물질(바꿔 말하면 단백질 약제)을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터에 의해서 진핵세포(예를 들면 포유류 등의 동물세포, 효모 또는 곤충세포)를 형질전환시키고 당해 진핵세포에서 유전자 발현시킴으로써 해당 단백질에 세포 도입 물질을 융합시킨 형태로 입자로서 제조할 수 있다.

이와 같이 입자를 형성하는 단백질에 질환 치료용 세포 도입 물질이 융합한 형태로 입자가 형성되므로 입자 형성 시 아울러 입자 내부에 세포 도입 물질을 포함시킬 수 있고, 입자의 형성 후에 후공정에서 입자 내부에 세포 도입 물질을 도입하는 공정이 불필요해지고, 약제의 제조가 용이해진다. 또한, 입자의 형성 후에 입자 내부에 도입하는 것이 곤란한 거대 분자 등이라도 입자 내부에 효율적으로 포함시키는 것이 가능해진다.

상기 B형 간염 바이러스 표면 항원 단백질을 사용하여 형성된 입자는 간세포를 인식하고 간세포에 대해서 특이적으로 입자내의 물질을 운반할 수 있으므로 간질환 치료용 물질(단백질 약제)을 포함시킴으로써, 간세포에 대하여 특이적이면서 효과적으로 작용하는 유효한 치료약이 된다. 이 경우 입자 내부에 포함시키는 물질로서는 예를 들면 인터페론(IFN) 또는 간세포 성장 인자(HGF) 등의 단백질 약제를 들 수 있다. IFN은 바이러스성 간염의 치료약으로서 사용되고 있고, HGF는 간경변에 걸린 간을 재생시키는 효과가 있다. 이들을 입자 내부에 포함시킴으로써 간세포에 특이적으로 도입할 수 있고, 유효하고 부작용이 적은 간염 치료 또는 간경변 치료를 할 수 있다.

또한, 예를 들면 상기 B형 간염 바이러스 표면 항원 단백질을 본래의 간세포에 대한 감염 능력을 상실하도록 변이시키고, 또한 증식 인자나 항체를 제시(present)하도록 변이시켜 이와 같이 변이된 B형 간염 바이러스 표면 항원 단백질을 사용해서 입자를 형성함으로써 간세포 이외의 특정 세포에 대하여 특이적으로 입자내의 물질을 운반할 수 있다. 예를 들면 어떤 암세포를 특이적으로 인식하는 항체가 제시된 것에 의해 그 암세포를 인식하여 그 암세포에 대해서 특이적으로 입자내의 물질을 운반할 수 있다.

본 발명의 약제는 정맥주사라고 하는 간편한 방법으로 특정 세포 또는 조직에 있어서의 질환을 효과적으로 치료할 수 있고, 종래의 치료 방법과 크게 다르며, 다량의 약제 투여 또는 유전자 치료 등에서 외과 수술을 필요로 하지 않고, 부작용의 우려도 매우 적어 그대로 임상 응용 가능한 것이다.

본 발명의 치료 방법은 본 발명의 약제를 투여하는 것에 의한 질환의 치료 방법이다.

도 1은 본 발명의 약제를 구성하는 입자의 개략 모식도로서 입자를 형성하는 HBsAg L단백질에 단백질 약제가 융합된 상태를 나타내는 도이다.

도 2는 본 발명의 실시예에서의 HBsAg L단백질 유전자의 각 단백질 영역을 나타내는 개략 모식도이다. 부호 1 내지 부호 8은 표면 항원에 있어서의 각 부위의 작용을 나타내고 있다.

도 3은 본 발명의 실시예에서의 유전자 재조합 효모를 사용한 HBsAg L단백질 입자의 발현 및 정제 조작을 예시한 개략 설명도이다. 또한, (a)는 유전자 재조합 효모의 작성, (b)는 High-Pi 배지에서의 배양, (c)는 8S5N-P400 배지에서의 배양, (d)는 파쇄, (e)는 밀도 구배 원심분리, (f)는 HBsAg L단백질 입자를 각각 나타낸다.

도 4는 본 발명의 실시예에서의 HBsAg L단백질과 EGFP와의 융합 단백질을 발현하는 플라스미드의 제조 방법을 설명하는 도이다.

도 5는 본 발명의 실시예에 있어서, HBsAg L단백질과 EGFP와의 융합 단백질에 의하여 EGFP를 도입한 인간 간암세포 HepG2가 공초점 레이저 형광 현미경에 의하여 관찰된 모습을 나타내는 도이다.

도 6은 본 발명의 실시예에 있어서, HBsAg L단백질과 EGFP와의 융합 단백질에 의하여 EGFP를 도입한 인간 편평 상피암 유래세포 A431이 공초점 레이저 형광 현미경에 의하여 관찰된 모습을 나타내는 도이다.

도 7은 본 발명의 실시예에 있어서, HBsAg L단백질과 EGFP와의 융합 단백질을 정맥주사한 인간 간암 유래 HuH-7 세포를 이식받은 암 이식 마우스의 종양부가 공초점 레이저 형광 현미경에 의하여 관찰된 모습을 나타내는 도이다.

도 8은 본 발명의 실시예에 있어서, HBsAg L단백질과 EGFP와의 융합 단백질을 정맥주사한 인간 대장암 유래 WiDr 세포를 이식받은 암 이식 마우스의 종양부가 공초점 레이저 형광 현미경에 의하여 관찰된 모습을 나타내는 도이다.

도 9는 물질 운반체에 내포되는 세포 도입 물질을 예시한 표이다.

도 10은 물질 운반체에 내포되는 세포 도입 물질을 예시한 표로서 도 9에 연속된다.

도 11은 물질 운반체에 내포되는 세포 도입 물질을 예시한 표로서 도 10에 연속된다.

본 발명의 약제를 구성하는 중공 나노입자는 입자 형성 능력을 갖는 단백질에 세포 도입 물질이 융합되어 이루어진 것인데, 그 입자 형성 능력을 갖는 단백질에 생체 인식 분자(바꿔 말하면 특정한 세포를 인식하는 분자)를 도입함으로써, 목적 세포 또는 목적 조직에 특이적으로 물질을 운반할 수 있다. 이와 같은 입자 형성 능력을 갖는 단백질로서는 여러 가지의 바이러스로부터 얻어지는 서브 바이러스 입자를 적용할 수 있다. 구체적으로는 B형 간염 바이러스(Hepatitis B Virus: HBV) 표면 항원 단백질 등이 예시된다.

또한, 이와 같은 입자 형성 능력을 갖는 단백질로부터 이루어진 단백질 입자로서는 진핵세포에서 단백질을 발현시킴으로써 얻어지는 것을 들 수 있다. 즉, 진핵세포에서 입자 형성 능력을 갖는 단백질을 발현시키면 동 단백질은 소포체막상에 막 단백질로서 발현, 축적되어 입자로서 방출된다. 이 때, 진핵세포로서는 포유류 등의 동물세포, 효모, 곤충세포 등을 적용할 수 있다.

본 발명자들은 후술하는 실시예에 나타나는 바와 같이 유전자 재조합 효모에서 상기 HBV 표면 항원 L단백질을 발현시킴으로써, 발현된 HBV 표면 항원 L단백질 에서 효모 유래의 지질 이중막에 다수의 동 단백질이 삽입된 단직경 약 20nm, 장직경 약 150nm의 타원 형상 중공 입자가 형성되는 것을 발견하고 보고하고 있다(J. Biol. Chem. , Vol. 267, No.3, 1953-1961, l992). 이와 같은 입자는 HBV 게놈을 전혀 포함하지 않기 때문에 바이러스로서는 기능하지 않으며, 인체에서의 안전성이 매우 높다. 또한, HBV의 간세포에 매우 높은 감염력을 나타내는 간세포 특이적 리셉터를 입자 표면에 제시하고 있기 때문에 간세포에 대하여 특이적으로 물질을 운반하는 운반체로서의 효과도 높다.

이와 같이 유전자 재조합 효모를 사용하여 단백질 입자를 형성하는 방법은 균체내의 가용성 단백질로부터 고효율로 입자가 생산되는 점에서 매우 적합하다.

한편, 곤충세포는 효모보다도 고등 동물에 가까운 진핵세포라 할 수 있고, 효모에서는 재현할 수 없는 당쇄 등의 고차원 구조도 재현할 수 있는 점에서 이종(異種) 단백질의 대량 생산에 있어서 바람직하다. 종래의 곤충세포의 계(系)는 바큐로 바이러스를 사용한 계로, 바이러스 발현을 수반하는 것이었기 때문에 단백질 발현시에 세포가 사멸하거나 용해하였다. 그 결과 단백질 발현을 연속적으로 행하거나, 사멸세포로부터 유리된 프로테아제에 의해 단백질이 분해되거나 하는 문제점이 있었다. 또한, 단백질을 분비 발현시키는 경우에는 배지 속에 포함되는 대량의 소 태아 혈청이 혼입되므로 배지 중에 분비되어도 정제가 곤란하였다. 그러나 최근 들어 바큐로 바이러스를 거치지 않는 곤충세포계로, 무혈청 배양 가능한 것이 Invitrogen 사에 의하여 개발되어 시판되고 있다. 따라서 이와 같은 곤충세포를 사용하면 정제가 용이하고 고차원 구조도 재현된 단백질 입자를 얻을 수 있다.

본 발명의 단백질 중공 나노입자에서는 이상과 같은 여러 가지의 방법에 의하여 얻어진 입자 표면의 리셉터를 임의의 생체 인식 분자로 변이시킴으로써, 간 세포이외에도 임의의 세포 및 조직에 매우 높은 특이성으로 물질을 운반, 도입하는 것이 가능하게 된다.

물론, 입자 형성 능력을 갖는 단백질은 상기 B형 간염 바이러스 표면 항원 단백질에 한정되는 것은 아니고, 입자를 형성할 수 있는 단백질이라면 어떤 것이라도 좋으며, 동물세포, 식물세포, 바이러스, 균류 등에서 유래하는 천연 단백질이나 여러 가지의 합성 단백질 등이 고려된다. 또한, 예를 들면 바이러스 유래의 항원 단백질 등이 생체내에서 항체를 야기할 가능성이 있는 경우 등에서는 변이시켜 항원성을 감소시킨 것을 입자 형성 능력을 갖는 단백질로서 사용하여도 좋다. 예를 들면 입자 형성 능력을 갖는 단백질로서는 국제 출원 WO01/64930호에 개시된 항원성을 감소시킨 B형 간염 바이러스 표면 항원 단백질이라도 좋고, 동 국제 출원에 개시된 그 밖의 변이 단백질(B형 간염 바이러스 표면 항원 단백질을 유전자 조작 기술을 사용하여 변이시킨 단백질)이라도 좋다. 또한, B형 간염 바이러스 표면 항원 단백질이나 동 단백질을 변이시킨 변이 단백질에 다시 증식 인자나 항체 등의 다른 단백질을 부가한 것을 입자 형성 능력을 갖는 단백질로서 사용하여도 좋다.

입자 형성 능력을 갖는 단백질에 도입되는 생체 인식 분자{입자 형성 능력을 갖는 단백질에 생체 인식 분자가 포함되는 경우와 입자 형성 능력을 갖는 단백질에 생체 인식 분자를 융합(또는 직접 간접으로 결합)시킨 경우를 둘 다 포함한다}로서는 예를 들면 성장 인자, 사이토카인 등의 세포 기능 조절 분자, 세포 표면 항원, 조직 특이적 항원, 리셉터 등의 세포 및 조직을 식별하기 위한 분자, 바이러스 및 미생물로부터 유래하는 분자, 항체, 당쇄, 지질 등이 바람직하게 사용된다. 구체적으로는 암세포에 특이적으로 나타나는 EGF 수용체, IL-2 수용체에 대한 항체, EGF 및 HBV가 제시하는 리셉터도 포함된다. 이들은 목적으로 하는 세포 또는 조직에 따라 적절히 선택된다. 또한, 여기에서 「생체 인식 분자」란 특정 세포를 인식하는 분자(바꿔 말하면, 특정 세포에 대한 인식 능력을 본 발명의 약제에 부여하는 분자)를 의미한다.

본 발명에서는 이상과 같은 단백질 중공 나노입자를 입자 형성 능력을 갖는 단백질에 목적 세포 또는 목적 조직에 도입하고 싶은 물질(세포 도입 물질)을 융합시킨 형태로 형성함으로써, 특정 세포에 대하여 특이성을 갖는 물질 운반체가 얻어진다. 이 물질 운반체에 내포되는 세포 도입 물질로서는 전술한 바와 같이 인터페론(IFNα, IFNβ, IFNω 등) 또는 간세포 성장 인자(HGF) 등의 단백질 약제(펩티드를 포함한다)를 들 수 있고, 도 9 내지 도 11에 나타난 물질 또한 여기에 해당된다.

입자 형성 능력을 갖는 단백질에 세포 도입 물질을 융합시키는 방법으로서는 후술하는 실시예에 나타난 바와 같이 예를 들면 B형 간염 바이러스 표면 항원 단백질을 코딩하는 유전자와 그 하류측에 상기 단백질 약제를 코딩하는 유전자가 삽입된 플라스미드를 제조하고, 이 플라스미드를 사용하여 진핵세포에 입자를 형성시킴으로써 입자를 형성하는 B형 간염 바이러스 표면 항원 단백질에 단백질 약제가 융합된 본 발명의 약제를 제조할 수 있다(도 1 참조).

이상과 같이 제조된 본 발명의 약제는 특정 세포에 대하여 특이적으로 약제를 전달하는 것으로서 유용하다. 예를 들면, 본 발명의 약제로서 IFN이 융합된 B형 간염 바이러스 표면 항원 단백질로부터 이루어진 입자를 정맥주사 등에 의하여 체내에 투여하면 해당 입자는 체내를 순환하고 입자 표면에 제시한 간세포 특이적 리셉터에 의해 간세포에 유도되어 감염된다. 그리고 IFN이 간세포 중에 보내져 IFN이 간조직에 특이적으로 도입된다. 또한, 약제 투여 방법으로서는 정맥주사에 의한 투여 외에 경구투여, 근육내투여, 복강내투여, 피하투여 등을 들 수 있다.

종래, 인터페론, 인터류킨 등의 단백질 약제는 부작용이 강하고, 전신 투여를 하면 환자에게 부담이 되기 때문에, 목적 세포나 조직에 대해서만 특이적으로 약제를 전달할 필요가 있었다. 본 발명의 약제는 상술한 바와 같이 특정 세포나 조직에 대하여 선택적으로 약제를 전달할 수 있으므로, 부작용이 강한 약제라도 환자에게 부담을 주지 않고 효과적으로 치료할 수가 있다.

이와 같이 본 발명의 약제를 사용하면 in vivo 또는 in vitro에서 세포 또는 조직에 특이적으로 물질을 도입할 수 있고, 특정 세포 또는 조직에 물질을 도입하는 것을 각종 질환의 치료법 또는 치료법의 한 단계로서 행하는 것도 가능하게 된다.

이하, 첨부한 도면에 따라 실시예를 나타내고, 본 발명의 실시 형태에 관하여 더욱 상세하게 설명한다. 물론 본 발명은 이하의 예에 한정되는 것이 아니고 세부에 관해서는 다양한 형태가 가능한 것은 말할 필요도 없다.

이하의 실시예에 있어서, HBsAg란 B형 간염 바이러스 표면 항원(Hepatitis B virus surface Antigen)을 나타낸다. HBsAg는 HBV의 외피 단백질이며 도 2의 모식도에 나타낸 것처럼 HBsAg에는 S단백질, M단백질, L단백질의 3 종류가 있다. 이 중 S단백질은 3종의 단백질에 공통한 중요한 외피 단백질이며, M단백질은 S단백질의 N말단측에 55개의 아미노산(pre-S2 peptide)이 부가된 것이다. 또한, L단백질은 M단백질의 N말단측에 108개 또는 119개의 아미노산(pre-S1 peptide)이 부가된 것이다.

HBsAg의 L단백질의 Pre-S 영역(pre-S1, pre-S2)은 HBV가 간세포를 인식하여 결합할 때에 각각 중요한 역할을 담당하는 것이 알려져 있다. Pre-S1은 간세포에 직접 결합할 부위를 갖고, pre-S2는 혈중 중합 알부민을 통하여 간세포에 결합하는 중합 알부민 리셉터를 갖는다.

진핵세포에서 HBsAg를 발현시키면 동 단백질은 소포체막상에 막 단백질로서 발현, 축적된다. HBsAg의 L단백질은 분자간에서 응집을 일으키고, 소포체 막을 수용하면서 출아 양식으로 루멘측에 입자로서 방출된다.

이하의 실시예에서는 HBsAg의 L단백질을 사용하였다. 또한, 도 3에 이하의 실시예에 기재된 HBsAg 입자의 발현 및 정제 조작의 개략 설명도를 나타내었다.

< 실시예 A >

유전자 재조합 효모에 의한 HBsAg 입자의 발현

본 발명자들에 의해 보고된 J.Biol.Chem., Vo1.267, No.3, 1953-1961, 1992 에 기재된 방법에 근거하여 pGLDLⅡP39-RcT를 유지한 유전자 재조합 효모(Saccharomyces Cerevisiae AH22R-주)를 합성 배지 High-Pi 및 8S5N-P400 중에서 배양하여 HBsAg L단백질 입자를 발현시켰다.(도 3(a) 내지 (c))

정상 성장기(약 72시간 후)에 있는 유전자 재조합 효모로부터 Yeast Protein Extraction Reagent(Pierce Chemical Co.제품)을 사용하여 whole cell extract를 준비하고, 도데실 황산 나트륨-폴리아크릴 아미도 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 사용하여 분리해서 은염색에 의해 시료중의 HBsAg를 동정하였다.

이로부터 HBsAg는 분자량 약 52kDa의 단백질인 것이 분명해졌다.

< 실시예 B >

HBsAg 입자의 유전자 재조합 효모로부터의 정제

(1) 합성 배지 8S5N-P400에서 배양된 유전자 재조합 효모(습중량 26g)를 buffer A 용액(7.5M 요소, O.1M 인산 나트륨, pH 7.2, 15mM EDTA, 2mM PMSF, 0.1% Tween 80) 100ml에 현탁하여, 글라스 비드를 사용해서 비드 비터(BEAD-BEATER)로 효모를 파쇄하였다. 파쇄 후, 원심분리에 의해 상층액을 회수하였다.(도 3(c),(d))

(2) 다음에 상층액을 0.75배 용량의 33%(w/w) PEG6000과 혼합하여 30분간 냉각하였다. 그 후, 원심분리(7000rpm, 30분간)를 행하여 펠렛을 회수하였다. 동 펠렛은 Tween 80을 포함하지 않는 buffer A 용액 속에서 재현탁하였다.

(3) 재현탁한 용액을 10 내지 40%의 구배를 거친 CsCl에 첨가하여 밴드를 형성하고, 28000rpm으로 16시간 동안 초원심분리를 행하였다. 원심분리 후의 시료를 12분획으로 나누어 웨스턴블롯법(Western Blotting)(1차 항체는 anti-HBsAg 모노크로날 항체)에 의해 HBsAg를 포함하는 분획을 동정하였다. 또한, HBsAg를 포함하는 분획을 Tween 80을 포함하지 않는 buffer A 용액으로 투석하였다.

(4) 상기 (3)에서 얻어진 투석액(12ml)을 5 내지 50%의 구배를 거친 자당(sucrose)에 첨가하여 밴드를 형성하고 28000rpm에서 16시간 동안 초원심분리를 행하였다. 원심분리 후 (3)과 마찬가지로 HBsAg를 포함하는 분획를 동정하여, HBsAg를 포함하는 분획을 요소와 Tween 80은 포함하지 않고 대신에 0.85%의 NaCl을 포함하는 buffer A용액으로 투석하였다.((2) 내지 (4); 도 3(e))

(5) 상기 (4)와 동일한 조작을 반복하여 투석 후의 시료를 울트라 필터(Ultra Filter) Q2000(어드밴텍사 제품)을 이용하여 농축하고, 사용할 때까지 4℃로 냉장 보존하였다.(도3(f))

CsCl 평형 원심분리 후의 웨스턴블롯 (3)의 결과로부터 HBsAg는 분자량 52kDa로 S항원성을 갖는 단백질인 것을 알 수 있었다. 최종적으로 배지 2.5L 유래 습중량 26g의 균체로부터 약 24mg의 정제 HBsAg 입자를 얻었다.

일련의 정제 과정에 있어서의 분획을 은염색 SDS-PAGE로 확인하였다. 또한, 정제에 의하여 효모 유래의 프로테아제가 제거되고 있는 것을 확인하기 위해 (5)에서 얻어진 HBsAg 입자를 37℃에서 12시간 배양한 후, SDS-PAGE를 행하고 은염색에 의해 동정을 행하였다.

그 결과, 효모 유래의 프로테아제는 일련의 정제 과정에 있어서 완전하게 제거되고 있는 것이 확인되었다.

< 실시예 C >

HBsAg에 EGFP가 융합한 입자의 제조

(1) EGFP와 HBsAg의 융합 단백질을 발현하는 플라스미드의 제조(도 4 참조)

전술한 HBsAg 발현 플라스미드 pGLDLⅡP39-RcT를 XhoI 및 AccI에 의해 절단하는 것으로, 닭 리소자임(lysozyme) 분비 시그널에 융합된 HBVsAg L단백질을 코딩하는 유전자 단편(이하, HBsAg 유전자라 한다)이 잘려나게 된다. 이 때, HBsAg 유전자의 상류측이 XhoI에 의해 절단되고, 하류측이 AccI에 의해 절단된다.

한편, 플라스미드 pEGFP-N1(pEGFP-F; Clontech 사)은 녹색 형광 단백질 EGFP를 코딩하는 유전자 단편을 갖고 있다. 이 플라스미드 pEGFP-N1을 XhoI 및 AgeI에 의해 절단하여 개방시켜 둔다. 이 때, 플라스미드는 EGFP 유전자와 프로모터(CMVIE) 사이에서 절단되는데, EGFP 유전자의 상류측이 AgeI에 의해 절단되고, 프로모터의 하류측이 XhoI에 의해 절단된다.

또한, FLAG tag(NH2-YIDYKDDDDKI-COOH)는 공지의 단백질인데 HBsAg와 EGFP 융합 단백질의 사이에 두는 것으로 항FLAG 항체에 의해 융합 단백질을 검출할 수 있다. FLAG tag를 발현시키기 위해 센스측에 서열 번호 2의 올리고 뉴클레오티드, 안티 센스측에 서열 번호 1의 올리고 뉴클레오티드를 준비하였다. 이 FLAG tag를 코딩하는 합성 DNA는 상류측은 제한 효소 AccI 사이트를, 하류측은 제한 효소 AgeI 사이트를 갖도록 설계하고 있다.

이상의 HBVsAg, FLAG tag, EGFP 발현 플라스미드는 T4 DNA 리가제에 의해 동일한 제한 효소로 절단된 부위끼리 결합된다. 이것에 의해 상기 HBVsAg, FLAG tag가 EGFP 발현 플라스미드의 프로모터와 EGFP 유전자의 사이에 삽입되어, EGFP와 HBsAg의 유전자를 포함하는 플라스미드 pBOP001을 구축하였다. 이 구축에 의해 플 라스미드의 CMV 프로모터의 하류에 삽입된 유전자는 아미노 말단측으로부터 닭 리소자임 유래 분비 시그널, HBVsAgL 단백질, FLAG tag, EGFP 단백질을 차례로 융합한 단백질을 코딩한다.

(2) 원숭이 신장 유래 COS-7 세포에의 상기 플라스미드의 도입과 그 발현

상기 유전자의 염기 서열을 확인한 후, 상기 플라스미드 pBOP001을 아프리카 녹색 원숭이 신장 유래 COS-7 세포에 유전자 도입 장치인 진 펄서(바이오라도)를 사용하여 도입하였다. 도입 후 1x10⁴ 세포씩 16구멍 웰 플레이트의 각 웰에 파종하고, 37℃, 5% CO₂ 존재하에서 1O% 소 태아 혈청을 포함하는 둘베코 변이 배지 D-MEM을 사용하여 하룻밤 배양하였다. 다음날 배지를 무혈청 배지 CHO-SFMII (Gibco-BRL)로 대체하여 다시 4일간 배양하고 COS-7 세포를 포함하는 배지를 회수하였다.

우선, 회수한 배지 중에 HBsAg 입자가 발현되고 있는가를 확인하였다. IMx 키트(다이나보토 사)에 의해 배지 중의 S항원성을 확인하고 배지 중에서 입자가 검출되었다.

또한, IMx의 아가로스 비드에 고정된 1차 항체를 사용하여 배지 중의 입자를 면역 침강시키고, 침강한 단백질에 대하여 도데실 황산 나트륨-폴리아크릴 아미드겔 전기영동(SDS-PAGE)을 행한 다음, 웨스턴블롯팅을 하여, 항FLAG 항체에 의해 단백질을 검출하였다. 여기에서 분자량 약 80kDa의 밴드가 검출되어 융합 단백질이 구축한 대로 발현하고 있는 것을 확인하였다.

또한, 형광 분광기에 의해 여기광 480nm로 EGFP의 형광 스펙트럼을 검출하였 다. 이것에 의해 발현한 EGFP 융합형 HBsAg L단백질이 각각의 구조를 유지한 채 입자를 형성하고 있는 것을 확인하였다.

(3) 효모 세포에의 플라스미드의 도입과 그 발현

또한, 상기 융합 단백질을 효모 세포에서 발현시키기 위해 플라스미드 pBOP001을 EGFP 유전자의 번역 정지 코돈의 3'측에 존재하는 제한 효소 NotI의 인식 부위에서 절단하고, 대장균 DNA 폴리머라제 라지 프레그먼트(polymerase large fragment)로 점착 말단을 메워 평활 말단으로 하였다. 여기에 T4 DNA 리가제에 의하여 XhoⅠ 링커 5'-CCTCCGAGG-3'를 삽입하여 평활 말단을 라이게이션(ligation)하여 플라스미드를 구축하였다. 이 플라스미드로부터 제한효소 XhoⅠ를 사용하여 상기 융합 단백질을 코딩하는 부분을 잘라내고, 플라스미드 pGLDLⅡP39-RcT가 갖는 HBsAg L단백질 유전자와 교체하여 플라스미드 pBOP002를 구축하였다. 이것을 사용하여 효모(Saccharomyces Cerevisiae AH22R-주)를 형질전환하고, 얻어진 유전자 재조합 효모를 합성 배지 High-Pi 및 8S5N-P400 속에서 배양하여 EGFP 단백질 융합 HBsAg L단백질을 발현시켰다.

정상 성장기(약 72시간 후)에 있는 유전자 재조합 효모로부터 Yeast Protein Extraction Reagent(Pierce Chemical Co. 제품)를 사용하여, whole cell extract를 준비하고, IMx 키트에 의하여 HBsAg의 S항원성을 검출하였다.

또한, IMx의 아가로스 비드에 고정된 1차 항체를 사용하여 배지중의 입자를 면역 침강시키고, 침강한 단백질에 대해 SDS-PAGE를 행한 다음 웨스턴블롯팅을 하여 항FLAG M2 항체(Sigma)에 의해 단백질을 검출하였다. 여기에서 분자량 약 80kDa의 밴드가 검출되었다.

또한, 형광 분광기에 의하여 여기광 480nm로 EGFP의 형광 스펙트럼을 검출하였다. 이것에 의해 효모에서 발현한 EGFP 융합형 HBsAg L단백질이 각각의 구조를 유지한 채 입자를 형성하고 있는 것을 확인하였다.

(4) 곤충세포로 플라스미드의 도입과 그 발현

다음에 상기 pBOP002로부터 융합 단백을 코딩하는 유전자의 XhoⅠ 단편을 잘라내어 대장균 유래 DNA 폴리머라제 라지 프래그먼트에 의해 말단을 평활화하고 곤충세포 안정 발현용 벡터 pIZT/V5-His(Invitrogen 사)의 EcoRV 부위로 삽입해 라이게이션시켰다. 염기 서열을 확인한 후 이 플라스미드를 pBOP003이라고 명명하였다.

한편, 곤충세포 High Five 주(BTI-TN-5Bl-4: Invitrogen 사)는 약 1개월에 걸쳐서 점차로 소 태아 혈청 함유 배지에서 무혈청 배지(Ultimate Insect Serum-Free Medium: Invitrogen 사)로 순화시켜 두었다. 다음으로 상기 플라스미드 pBOP003을 유전자 도입용 지질 Insectin-Plus(Invitrogen 사)를 사용하여 무혈청 배지에 순화시킨 High Five 주를 형질전환하였다. 그 후, 무혈청 배지에서 27℃, 48시간 동안 배양하고, 항생 물질 zeocin(Invitrogen 사)을 400μg/mL 함유하는 무혈청 배지에서 더욱 세포가 융합될 때까지 4 내지 7일간 배양하였다.

1500Ⅹg에서 5분간 원심분리하여 배양 상층액을 회수하고, IMx키트(다이나보토 사)에 의해 배지 중의 HBsAg 입자를 발현 측정한 바, HBsAg 입자가 발현하고 있는 것이 확인되었다. 또한, IMx의 아가로스 비드에 고정된 1차 항체를 사용하여 배지 중의 입자를 면역 침강시켜 침강한 단백질에 대해 SDS-PAGE를 행한 다음, 웨스턴블롯팅을 하여 항FLAG M2 항체에 의해 단백질을 검출하였다. 여기에서 분자량 약 80kDa의 밴드가 검출되어 융합 단백질이 구축한 대로 발현하고 있는 것을 확인하였다. 또한, 형광 분광기를 사용해서 여기광 480nm로 EGFP의 형광 스펙트럼을 검출하였다. 이것에 의하여 발현한 EGFP 융합형 HBsAg L단백질이 각각의 구조를 유지한 채 입자를 형성하고 있는 것을 확인하였다.

상기 EGFP 융합형 HBsAg L단백질의 유전자 서열은 서열 번호 13으로, 그 아미노산 서열은 서열 번호 14로 각각 나타내어진다.

< 실시예 D >

HBsAg에 인간 인터페론ω(IFNω)가 융합한 입자의 제조

(1) IFNω와 HBsAg의 융합 단백질을 발현하는 플라스미드의 제조

플라스미드 pGT65-hIFN-α(InvivoGen)는 IFNω를 코딩하는 유전자 단편을 갖고 있다. 이 유전자 단편을 주형으로 하여 IFNω를 코딩하는 유전자 단편을 PCR법에 의하여 통상의 방법으로 증폭하였다.

사용한 2종류의 PCR 프라이머는 서열 번호 3과 서열 번호 4와의 올리고 뉴클레오티드이다. 상류측에 AgeI 사이트를, 하류측에 제한 효소 NotI 사이트를 갖도록 설계하였다.

PCR 산물을 아가로스 전기영동으로 분리한 후, 목적 cDNA를 포함하는 밴드를 회수하여 TOPO TA Cloning kit(Invitrogen 사)를 사용하여 pCR2.1-TOPO 벡터(Invitrogen 사)에 서브클로닝 하였다. 삽입한 염기 서열을 정보(pORF-hIFNa v.11 제품에 첨부된 자료)에 따라 확인한 후, 제한 효소 AgeI와 NotI로 상기 cDNA 단편을 잘라내고, 상기 플라스미드 pEGFP-N1의 AgeI와 NotI 부위를 이용해서 EGFP 유전자와 교체하여 플라스미드 pBOPO04를 구축하였다.

상기 플라스미드 pBOP004에 FLAG tag 유전자 및 HBsAg 유전자를 삽입한다. 삽입 방법은 상기 실시예 C의 (1)에 기재한 방법과 동일하다. 이것에 의해 플라스미드 pBOP005를 구축하였다. 이 구축에 의해 플라스미드의 CMV프로모터 하류에 삽입된 유전자는 아미노 말단측으로부터 닭 리소자임 유래 분비 시그널, HBVsAg L단백질, FLAG tag, IFNω를 차례로 융합한 단백질을 코딩한다.

(2) 원숭이 신장 유래 COS-7 세포에의 상기 플라스미드의 도입과 그 발현

상기 유전자의 염기 서열을 확인한 후, 상기 플라스미드 pBOP005를 아프리카 녹색 원숭이 신장 유래 COS-7 세포에 유전자 도입장치 진 펄서(바이오라도)를 사용하여 도입하였다. 도입 후 1O% 송아지 태아혈청을 포함하는 둘베코 변이 배지를 사용하여 하룻밤 배양하였다. 그 다음 배지를 무혈청 배지 CHO-SFMII (Gibco-BRL)로 대체하여 다시 4일간 배양하고 COS-7 세포를 포함하는 배지를 회수하였다.

배지 중의 S항원성을 IMx 키트(다이나보토 사)에 의하여 확인하여 배지 중에 입자가 검출되었다. 또한, IMx의 아가로스 비드에 고정된 1차 항체를 사용하여 배지중의 입자를 면역 침강하고 침강한 단백질에 대하여 SDS-PAGE를 행한 다음 웨스턴블롯팅을 하여 항FLAG M2 항체에 의해 단백질을 검출하였다. 여기에서 분자량 약 70kDa의 밴드가 검출되어 융합 단백질이 구축한 대로 발현하고 있는 것을 확인하였다. 이것에 의해 발현한 IFNω 융합형 HBsAg L단백질이 각각의 구조를 유지한 채 입자를 형성하고 있는 것을 확인하였다.

(3) 효모 세포에의 플라스미드의 도입과 그 발현

또한, 상기 융합 단백질을 효모 세포에서 발현시키기 위해 플라스미드 pBOP005를 IFNω 유전자의 번역 정지 코돈의 3'측에 존재하는 제한 효소 NotI의 인식 부위에서 절단하고, 대장균 DNA 폴리머라제 라지 프레그먼트로 점착 말단을 메워 평활 말단으로 하였다. 여기에 T4 DNA 리가제에 의하여 XhoⅠ 링커 5'-CCTCCGAGG-3'를 삽입하여 평활 말단을 라이게이션하여 플라스미드를 구축하였다. 이 플라스미드로부터 제한 효소 XhoⅠ를 사용하여 상기 융합 단백질을 코딩하는 부분을 잘라내고, 플라스미드 pGLDLⅡP39-RcT가 갖는 HBsAg L단백질 유전자와 교체하여 플라스미드 pBOP006를 구축하였다. 이것을 사용하여 효모(Saccharomyces Cerevisiae AH22R-주)를 형질전환하고, 얻어진 유전자 재조합 효모를 합성 배지 High-Pi 및 8S5N-P400 속에서 배양하여 IFNω 단백질 융합형 HBsAg L단백질을 발현시켰다.

정상 성장기(약 72시간 후)에 있는 유전자 재조합 효모로부터 Yeast Protein Extraction Reagent(Pierce Chemical Co. 제품)를 사용하여 whole cell extract를 준비하고, IMx 키트에 의하여 S항원성을 검출하였다. 또한, IMx의 아가로스 비드에 고정된 1차 항체를 사용하여 배지중의 입자를 면역 침강시키고, 침강한 단백질에 대하여 SDS-PAGE를 행한 다음 웨스턴블롯팅을 하여 항FLAG M2 항체(Sigma)에 의해 시료중의 융합 단백질을 검출하였다. 여기에서 분자량 약 70kDa의 밴드가 검출되었다. 이것에 의해 효모에서 발현한 인간 인터페론ω 융합형 HBsAg L단백질이 각각의 구조를 유지한 채 입자를 형성하고 있는 것을 확인하였다.

(4) 곤충세포에의 플라스미드의 도입과 그 발현

다음으로 상기 pBOP006로부터 융합 단백질을 코딩하는 유전자의 XhoⅠ 단편을 잘라내고, 대장균 유래 폴리머라제 라지 프래그먼트에 의하여 말단을 평활화하여 곤충세포 안정 발현용 벡터 pIZT/V5-His(Invitrogen 사)의 EcoRV 부위로 삽입해 라이게이션 하였다. 염기 서열을 확인한 후, 이 플라스미드를 pBOP007이라고 명명하였다.

한편, 곤충세포 High Five 주(BTI-TN-5Bl-4: Invitrogen 사)는 약 1개월에 걸쳐서 점차로 소 태아 혈청 함유 배지에서 무혈청 배지(Ultimate Insect Serum-Free Medium: Invitrogen 사)로 순화시켜 두었다. 다음으로 상기 플라스미드 pBOP007을 유전자 도입용 지질 Insectin-Plus(Invitrogen 사)를 사용하여 무혈청 배지에 순화시킨 High Five 주를 형질전환하였다. 그 후 무혈청 배지에서 27℃, 48시간 동안 배양하고, 항생물질 zeocin(Invitrogen 사)을 400μg/mL 함유하는 무혈청 배지에서 더욱 세포가 융합될 때까지 4 내지 7일간 배양하였다.

1500Ⅹg에서 5분간 원심분리하여 배양 상층액을 회수하고, IMx키트(다이나보토 사)에 의해 배지 중의 HBsAg 입자를 발현 측정한 바, HBsAg 입자가 발현하고 있는 것이 확인되었다. 또한, IMx의 아가로스 비드에 고정된 1차 항체를 사용하여 배지 중의 입자를 면역 침강시켜 침강한 단백질에 대해 SDS-PAGE를 행한 다음, 웨스턴블롯팅을 하여 항FLAG M2 항체에 의해 단백질을 검출하였다. 여기에서 분자량 약 70kDa의 밴드가 검출되어 융합 단백질이 구축한 대로 발현하고 있는 것을 확인 하였다. 이것에 의해 발현한 인간 인터페론ω 융합형 HBsAg L단백질이 각각의 구조를 유지한 채 입자를 형성하고 있는 것을 확인하였다.

상기 인간 인터페론ω 융합형 HBsAg L단백질의 유전자 서열은 서열 번호 15로, 그 아미노산 서열은 서열 번호 16으로 각각 나타내어진다.

< 실시예 E >

HBsAg에 인간 인터페론 β1 (IFN β1) 이 융합한 입자의 제조

(1) IFN β1과 HBsAg의 융합 단백질을 발현하는 플라스미드의 제조

플라스미드 pCMV(Hu beta)는 IFNβ1을 코딩하는 유전자 단편을 갖고 있다. 이 유전자 단편을 주형으로 하여 IFNβ1을 코딩하는 유전자 단편을 PCR법에 의하여 통상의 방법으로 증폭하였다.

사용한 2종류의 PCR 프라이머는 센스측이 서열 번호 5의 올리고 뉴클레오티드, 안티 센스측이 서열 번호 6의 올리고 뉴클레오티드이다. 상류측은 제한 효소 AgeI 사이트를, 하류측은 제한 효소 NotI 사이트를 갖도록 설계하였다.

PCR 산물을 아가로스 전기영동으로 분리한 후 목적 cDNA를 포함하는 밴드를 회수하여, TOPO TA Cloning kit(Invitrogen 사)를 사용해서 pCR2.1-TOPO 벡터(Invitrogen 사)에 서브클로닝하였다. 삽입한 염기 서열을 정보(GenBank accession no. M28622)에 따라 확인한 후, 제한 효소 AgeI와 NotI로 상기 cDNA 단편을 잘라내고, 상기 플라스미드 pEGFP-N1의 AgeI와 NotI부위를 이용해서 EGFP 유전자와 교체하여 플라스미드를 구축하였다.

상기 플라스미드에 FLAG tag 유전자 및 HBsAg 유전자를 삽입한다. 삽입 방 법은 상기 실시예 C의 (1)에 기재한 방법과 동일하다. 이것에 의해 플라스미드 pBOP008를 구축하였다. 이 구축에 의해 플라스미드의 CMV 프로모터의 하류에 삽입된 유전자는 아미노 말단측으로부터 닭 리소자임 유래 분비 시그널, HBVsAg L단백질, FLAG tag, IFN β1을 차례로 융합한 단백질을 코딩한다.

(2) 원숭이 신장 유래 COS-7 세포에의 상기 플라스미드의 도입과 그 발현

상기 유전자의 염기 서열을 확인한 후, 상기 플라스미드 pBOP008을 아프리카 녹색 원숭이 신장 유래 COS-7 세포에 유전자 도입 장치 진 펄서(바이오라도)를 사용하여 도입하였다. 도입 후 1O% 송아지 태아혈청을 포함하는 둘베코 변이 배지를 사용하여 하룻밤 배양하였다. 다음날 배지를 무혈청 배지 CHO-SFMII(Gibco-BRL)로 대체하여 다시 1주간 배양하고, COS-7 세포를 포함하는 배지를 회수하였다.

배지 중의 S항원성을 IMx 키트(다이나보토 사)에 의하여 확인하여 배지 중에 입자가 검출되었다. 또한, IMx의 아가로스 비드에 고정된 1차 항체를 사용하여 배지 중의 입자를 면역 침강시키고, 침강한 단백질에 대하여 SDS-PAGE를 행한 다음 웨스턴블롯팅을 하여 항FLAG M2 항체에 의해 단백질을 검출하였다. 여기서 분자량 약 70kDa의 밴드가 검출되어 융합 단백질이 구축한 대로 발현하고 있는 것을 확인하였다. 이것에 의해 발현한 IFN β1 융합형 HBsAg L단백질이 각각의 구조를 유지한 채 입자를 형성하고 있는 것을 확인하였다.

(3) 효모 세포에의 플라스미드의 도입과 그 발현

또한, 상기 융합 단백질을 효모 세포에서 발현시키기 위해 플라스미드 pBOP008을 IFN β1 유전자의 번역 정지 코돈의 3'측에 존재하는 제한 효소 NotI의 인식 부위에서 절단하고, 대장균 DNA 폴리머라제 라지 프레그먼트로 점착 말단을 메워 평활 말단으로 하였다. 여기에 T4 DNA 리가제에 의하여 XhoⅠ 링커 5'-CCTCCGAGG-3'를 삽입하여 평활 말단을 라이게이션하여 플라스미드를 구축하였다. 이 플라스미드로부터 제한 효소 XhoⅠ를 사용하여 상기 융합 단백질을 코딩하는 부분을 잘라내고, 플라스미드 pGLDLⅡP39-RcT가 갖는 HBsAg L단백질 유전자와 교체하여 플라스미드 pBOP009를 구축하였다. 이것을 사용하여 효모(Saccharomyces Cerevisiae AH22R-주)를 형질전환하고, 얻어진 유전자 재조합 효모를 합성 배지 High-Pi 및 8S5N-P400 속에서 배양하여 IFN β1 단백질 융합형 HBsAg L단백질을 발현시켰다.

정상 성장기(약 72시간 후)에 있는 유전자 재조합 효모로부터 Yeast Protein Extraction Reagent(Pierce Chemical Co. 제품)를 사용하여 whole cell extract를 준비하고, IMx 키트에 의하여 S항원성을 검출하였다. 또한, IMx의 아가로스 비드에 고정된 1차 항체를 사용하여 배지중의 입자를 면역 침강시키고, 침강한 단백질에 대하여 SDS-PAGE를 행한 다음, 웨스턴블롯팅을 하여 항FLAG M2 항체(Sigma)에 의해 시료중의 융합 단백질을 검출하였다. 여기서 분자량 약 70kDa의 밴드가 검출되었다. 이로 인해 효모에서 발현한 인간 인터페론 β1 융합형 HBsAg L단백질이 각각의 구조를 유지한 채 입자를 형성하고 있는 것을 확인하였다.

(4) 곤충세포에의 플라스미드의 도입과 그 발현

다음으로 상기 pBOP009로부터 융합 단백을 코딩하는 유전자의 XhoⅠ 단편을 잘라내어 대장균 유래 DNA 폴리머라제 라지 프래그먼트에 의하여 말단을 평활화하 여 곤충세포 안정 발현용 벡터 pIZT/V5-His(Invitrogen 사)의 EcoRV 부위로 삽입해 라이게이션시켰다. 염기 서열을 확인한 후 이 플라스미드를 pBOP010이라고 명명하였다.

한편, 곤충세포 High Five 주(BTI-TN-5Bl-4: Invitrogen 사)는 약 1개월에 걸쳐서 점차로 소 태아 혈청 함유 배지로부터 무혈청 배지(Ultimate Insect Serum-Free Medium: Invitrogen 사)로 순화시켜 두었다. 다음으로 상기 플라스미드 pBOP010을 유전자 도입용 지질 Insectin-Plus(Invitrogen 사)를 사용하여 무혈청 배지에 순화시킨 High Five 주를 형질전환하였다. 그 후 무혈청 배지에서 27℃, 48시간 동안 배양하고, 항생 물질 zeocin(Invitrogen 사)을 400μg/mL 함유하는 무혈청 배지에서 더욱 세포가 융합될 때까지 4 내지 7일간 배양하였다.

1500Ⅹg에서 5분간 원심분리하여 배양 상층액을 회수하고, IMx키트(다이나보토 사)에 의해 배지 중의 HBsAg 입자를 발현 측정한 바, HBsAg 입자가 발현하고 있는 것이 확인되었다. 또한, IMx의 아가로스 비드에 고정된 1차 항체를 사용하여 배지 중의 입자를 면역 침강시켜 침강한 단백질에 대해 SDS-PAGE를 행한 다음, 웨스턴블롯팅을 하여 항FLAG M2 항체에 의해 단백질을 검출하였다. 여기에서 분자량 약 70kDa의 밴드가 검출되어 융합 단백질이 구축한 대로 발현하고 있는 것을 확인하였다. 이것에 의해 발현한 인간 인터페론β1 융합형 HBsAg L단백질이 각각의 구조를 유지한 채 입자를 형성하고 있는 것을 확인하였다.

상기 인간 인터페론β1 융합형 HBsAg L단백질의 유전자 서열은 서열 번호 17로, 그 아미노산 서열은 서열번호 18로 각각 나타내어진다.

< 실시예 F >

HBsAg에 인간 간세포 성장 인자(HGF)가 융합한 입자의 제조

(1) HGF와 HBsAg의 융합 단백질을 발현하는 플라스미드의 제조

인간 간장 유래 RNA(ClonTech)로부터 Oligo-dT 프라이머를 사용하여 역전사 효소 슈퍼 스크립트Ⅱ(Gibco-BRL)에 의해 cDNA를 합성하였다. 얻어진 cDNA를 HGF유전자를 특이적으로 증폭하는 서열 번호 7 및 서열 번호 8의 올리고 뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 PCR을 행하여 약 2.2kbp의 HGF 유전자를 증폭하였다. 이 때, 프라이머는 증폭된 HGF 유전자가 상류측은 AgeI 사이트를, 하류측은 제한 효소 NotI 사이트를 갖도록 설계하였다.

PCR 산물을 아가로스 전기영동으로 분리한 후, 목적 cDNA를 포함하는 밴드(약 2.2kbp)를 회수하고, TOPO TA Cloning kit(Invitrogen 사)를 사용하여 pCR2.1-TOP0 벡터(Invitrogen 사)에 서브클로닝 하였다.

다음으로 플라스미드의 구축을 용이하게 하기 위해 HGF 유전자중에 존재하는 2 군데의 제한 효소 인식 부위를 변이시켰다. 그 순서를 이하에 나타낸다.

2쌍의 상보적인 합성 DNA, 서열 번호 9의 올리고 뉴클레오티드와 그 상보 배열인　서열 번호 10의 올리고 뉴클레오티드 및 서열 번호 11의 올리고 뉴클레오티드와 그 상보 배열인　서열 번호 12의 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 QuickChange^TMSite-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene 사)에 의해 상기 플라스미드 DNA의 PCR을 행하였다.

먼저, 최초의 한쌍의 프라이머에 의해 내열성 DNA 폴리머라제로서 Pfu DNA polymerase(Stratagene)를 사용하여 PCR을 행하였다. PCR은 95℃에서 30초간의 변성, 55℃에서 1분간의 어닐링, 68℃에서 30분간의 합성 반응을 30회 반복하여 행하였다. 그 후, PCR 산물을 제한 효소 DpnⅠ로 처리하여 대장균 DH5α를 형질전환하였다. 그리고 형질전환된 대장균 DH5α를 배양하고 출현 콜로니로부터 벡터 DNA를 추출하여 염기 서열을 확인하여 변이 도입된 플라스미드를 선발하였다. 다음으로, 얻어진 플라스미드를 주형으로 하여 둘째 쌍의 프라이머를 사용해서 동일한 조작을 행하였다. 그 결과 HGF cDNA에 코딩되는 아미노산을 변경하지 않고 2군데의 XhoⅠ인식 부위가 소거된 인간 HGF cDNA를 유지하는 플라스미드 pBOP01l가 얻어졌다.

염기 서열을 GenBank의 정보(GenBank accession no. M29145)에 의해 확인한 후, 제한 효소 AgeI 및 NotI로 상기 cDNA 단편을 잘라내고, 상기 플라스미드 pEGFP-N1의 AgeI 및 NotI 부위를 이용하여 EGFP 유전자와 교체하여 플라스미드를 구축하였다.

상기 플라스미드에 FLAG tag 유전자 및 HBsAg 유전자를 삽입한다. 삽입 방법은 상기 실시예 C의 (1)에 기재한 방법과 동일하다. 이것에 의해 플라스미드 pBOP012를 구축하였다. 이 구축에 의해 플라스미드의 CMV 프로모터의 하류에 삽입된 유전자는 아미노 말단측으로부터 닭 리소자임 유래 분비 시그날, HBsAg L단백질, FLAG tag, 인간 HGF를 차례로 융합한 단백질을 코딩한다.

(2) 원숭이 신장 유래 COS-7 세포에의 상기 플라스미드의 도입과 그 발현

상기 유전자의 염기 서열을 확인한 후, 상기 플라스미드 pBOP012를 아프리카 녹색 원숭이 신장 유래 COS-7 세포에 유전자 도입 장치 진 펄서(바이오라도)를 사용하여 도입하였다. 도입 후, 1O% 송아지 태아 혈청을 포함하는 둘베코 변이 배지를 사용하여 하룻밤 배양하였다. 다음날 배지를 무혈청 배지 CHO-SFMII (Gibco-BRL)로 대체하여 다시 4일간 배양하고, COS-7 세포를 포함하는 배지를 회수하였다.

배지 중의 S항원성을 IMx 키트(다이나보토 사)에 의하여 확인하여 배지 중에 입자가 검출되었다. 또한, IMx의 아가로스 비드에 고정된 1차 항체를 사용하여 배지 중의 입자를 면역 침강시키고, 침강한 단백질에 대하여 SDS-PAGE를 행한 다음 웨스턴블롯팅을 하여 항FLAG M2 항체에 의해 단백질을 검출하였다. 여기에서 분자량 약 125kDa의 밴드가 검출되어 융합 단백질이 구축한 대로 발현하고 있는 것을 확인하였다. 이것에 의해 발현한 인간 HGF 융합형 HBsAg L단백질이 각각의 구조를 유지한 채 입자를 형성하고 있는 것을 확인하였다.

(3) 효모 세포에의 플라스미드의 도입과 그 발현

또한, 상기 융합 단백질을 효모 세포에서 발현시키기 위해 플라스미드 pBOP012를 HGF유전자의 번역 정지 코돈의 3'측에 존재하는 제한 효소 NotI의 인식 부위에서 절단하고, 대장균 DNA 폴리머라제 라지 프레그먼트로 점착 말단을 메워 평활 말단으로 하였다. 여기에 T4 DNA 리가제에 의하여 XhoⅠ 링커 5'-CCTCCGAGG-3'를 삽입하여 평활 말단을 라이게이션하여 플라스미드를 구축하였다. 이 플라스미드로부터 제한 효소 XhoⅠ를 사용하여 상기 융합 단백질을 코딩하는 부분을 잘라내고, 플라스미드 pGLDLⅡP39-RcT가 갖는 HBsAg L단백질 유전자와 교체하여 플라스미드 pBOP013을 구축하였다. 이것을 사용하여 효모(Saccharomyces Cerevisiae AH22R-주)를 형질전환하고, 얻어진 유전자 재조합 효모를 합성 배지 High-Pi 및 8S5N-P400 속에서 배양하여 인간 HGF단백질 융합형 HBsAg L단백질을 발현시켰다.

정상 성장기(약 72시간 후)에 있는 유전자 재조합 효모로부터 Yeast Protein Extraction Reagent(Pierce Chemical Co. 제품)를 사용하여 whole cell extract를 준비하고, IMx 키트에 의하여 HBsAg L단백질의 S항원성을 검출하였다. 또한, IMx의 아가로스 비드에 고정된 1차 항체를 사용하여 배지중의 입자를 면역 침강하고, 침강한 단백질에 대하여 SDS-PAGE를 행한 다음 웨스턴블롯팅를 하여 항 FLAG M2 항체(Sigma)에 의해 시료중의 융합 단백질을 검출하였다. 여기에서 분자량 약 125kDa의 밴드가 검출되었다. 이로 인해 효모에서 발현한 인간 HGF 융합형 HBsAg L단백질이 각각의 구조를 유지한 채 입자를 형성하고 있는 것을 확인하였다.

(4) 곤충세포로 플라스미드의 도입과 그 발현

다음으로 상기 pBOP013로부터 융합 단백을 코딩하는 유전자의 XhoⅠ 단편을 잘라내고, 대장균 유래 DNA 폴리머라제 라지 프래그먼트에 의하여 말단을 평활화하여 곤충세포 안정 발현용 벡터 pIZT/V5-His(Invitrogen 사)의 EcoRV 부위로 삽입해 라이게이션시켰다. 염기 서열을 확인한 후, 이 플라스미드를 pBOP014라고 명명하였다.

한편, 곤충세포 High Five 주(BTI-TN-5Bl-4: Invitrogen 사)는 약 1개월에 걸쳐서 점차로 소 태아 혈청 함유 배지로부터 무혈청 배지(Ultimate Insect Serum-Free Medium: Invitrogen 사)로 순화시켜 두었다. 다음으로 상기 플라스미드 pBOP014를 유전자 도입용 지질 Insectin-Plus(Invitrogen 사)를 사용하여 무혈청 배지에 순화시킨 High Five 주를 형질전환하였다. 그 후 무혈청 배지에서 27℃, 48시간 동안 배양하고, 항생 물질 zeocin(Invitrogen 사)을 400μg/mL 함유하는 무혈청 배지에서 더욱 세포가 융합될 때까지 4 내지 7일간 배양하였다.

1500Ⅹg에서 5분간 원심분리하여 배양 상층액을 회수하고, IMx키트(다이나보토 사)에 의해 배지 중의 HBsAg 입자를 발현 측정한 바, HBsAg 입자가 발현하고 있는 것이 확인되었다. 또한, IMx의 아가로스 비드에 고정된 1차 항체를 사용하여 배지 중의 입자를 면역 침강시켜 침강한 단백질에 대해 SDS-PAGE를 행한 다음, 웨스턴블롯팅을 하여 항FLAG M2 항체에 의해 단백질을 검출하였다. 여기에서 분자량 약 125kDa의 밴드가 검출되어 융합 단백질이 구축한 대로 발현하고 있는 것을 확인하였다. 이것에 의해 발현한 인간 HGF 융합형 HBsAg L단백질이 각각의 구조를 유지한 채 입자를 형성하고 있는 것을 확인하였다.

상기 인간 HGF 융합형 HBsAgL단백질의 유전자 서열은 서열 번호 19로, 그 아미노산 서열은 서열 번호 20으로 각각 나타내어진다.

< 실시예G >

인간 간암 세포 HepG2에서 HBsAg L단백질 입자에 의한 GFP의 도입

지수 증식기에 있는 인간 간암 세포 HepG2를 1Ⅹ10⁵ cells/well이 되도록 3.5cm 유리 저명 샤알레에 접종하여 37℃, 5%의 CO₂ 존재하에 10% 소 태아 혈청을 포함하는 D-MEM을 사용하여 하룻밤 배양하였다. 다음날 실시예 C에서 사용한 HBsAg L단백질에 EGFP가 융합한 입자를 1Oμg/well이 되도록 첨가하여 37℃, 5%의 CO₂ 존재하에 6시간 동안 배양하였다.

또한, 음성 대조로서 인간 편평 상피암 유래세포 A431(JCRB9009)에 대해서도 동일한 조작을 하였다.

HepG2와 A431에 있어서, 세포내에서의 GFP의 발현의 모습을 공초점 레이저 형광 현미경으로 관찰하였다.

이것에 의해 인간 간암 세포 HepG2에 GFP로부터 유래하는 형광이 감지되었다(도 5). 그러나 인간 편평 상피암 유래세포 A431에서는 형광이 감지되지 않았다(도 6).

이상에서 HBsAg L단백질 입자를 사용함으로써 인간 간세포에 대해 매우 높은 특이성과 효율로 단백질 구조를 유지한 채 도입되는 것으로 나타났다. 따라서 본 발명의 물질 운반체는 매우 유효한 것으로 확인되었다.

< 실시예 H >

인간 간암을 이식한 누드 마우스에 대한 HBsAg L단백질 입자에 의한 물질 도입

암 이식 마우스는 누드 마우스(계통: BALB/c nu/nu, 미생물학적 품질: SPF, 성별: 수컷 5주)의 양측 등 부분 피하에 인간 간암 유래세포 HuH-7(JCRB0403)을 1Ⅹ10⁷ 세포 피하에 주사하고, 이식 종양이 직경 2cm 정도의 고형암이 될 때까지 2 내지 4주간 생육시켜 얻었다.

또한, 음성 대조로서 인간 대장암 유래세포 WiDr(ATCC CCL-218)도 마찬가지 로 누드 마우스에 이식하였다.

각각의 마우스에 실시예 C의 HBsAg L단백질에 EGFP가 융합한 입자 50μg을 복강 내에 26G 주사침을 사용하여 투여하였다. 투여 후 12시간 후에 마우스를 도살하고 종양부, 간장, 비장, 신장, 장관을 적출하여 GFP용 수지 포매 키트(Technovit7100)를 사용해 조직을 고정·포매하였다.

구체적으로 고정은 4% 중화 포름알데히드에 침지하여 행하였고, 탈수는 70% EtOH로 실온에서 2시간, 96% EtOH로 실온에서 2시간, 100% EtOH로 실온에서 1시간, 예비 침지는 100% EtOH/Technovit7100 등량 혼합액으로 실온에서 2시간 동안 행하였다. 그 후, Technovit7l00으로 실온에서 24시간 이내의 침지를 행하고 꺼낸 다음, 실온에서 1시간 및 37℃에서 1시간 동안 정치(靜置)하여 중합 반응시켰다.

통상의 방법에 따라 절편을 제조하고, 동시에 헤마토키신에오린 염색(일반적인 조직 염색)을 행하여 형광 현미경에 의해 HBsAg L단백질 입자 투여군과 비투여군의 GFP에 의한 형광을 비교하였다.

이것에 의해 인간 간암 유래 HuH-7 세포에 의한 암 이식 마우스의 종양부에 GFP에서 유래하는 형광이 감지되었다(도 7). 그러나 동 마우스에서 동시에 적출한 간장, 비장, 신장, 장관에는 형광이 감지되지 않았다. 또한, 인간 대장암 유래 WiDr 세포에 의한 암 이식 마우스의 종양, 간장, 비장, 신장, 장관에도 형광이 감지되지 않았다.(종양부: 도 8).

이상에서 HBsAg L단백질 입자를 사용함으로써, 실험 동물 레벨에서도 인간 간세포에 대하여 매우 높은 특이성과 효율로 단백질이 구조를 유지한 채 도입되는 것으로 나타났다. 따라서 본 발명의 물질 운반체는 매우 유효한 것으로 확인되었다.

또한, 발명을 실시하기 위한 최선의 형태의 항에서 이룬 구체적인 실시 형태 또는 실시예는 어디까지나 본 발명의 기술 내용을 명확하게 하는 것이고, 그러한 구체예에만 한정하여 협의로 해석되어야 할 것은 아니며, 본 발명의 정신과 다음에 기재하는 특허청구의 범위내에서 다양하게 변경하여 실시할 수 있는 것이다.

이상과 같이 본 발명에 관한 약제는 정맥 주사 등과 같은 간편한 방법으로 특정 세포 또는 조직에 대하여 선택적이면서 효율적으로 질환 치료용 세포 도입 물질을 보낼 수 있으므로 종래의 유전자 치료와 크게 다르며, 외과 수술을 필요로 하지 않고, 부작용의 우려도 매우 낮아, 그대로 임상 응용 가능한 것이다.

또한, 입자를 형성하는 단백질에 세포 도입 물질이 융합한 형태로 입자를 형성함으로써, 입자 형성시 아울러 입자 내부에 세포 도입 물질을 포함시킬 수 있어 약제의 제조를 용이하게 할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (11)

1. 특정 세포에 대한 인식 능력을 가지고 입자 형성 능력을 가지는 단백질로 이루어진 중공 나노입자에 있어서, 해당 단백질에 질환 치료용 세포 도입 물질이 융합되어 이루어지는 약제로서,

   상기 약제는, 상기 단백질을 코딩하는 유전자와 그 하류측에 상기 세포 도입 물질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 진핵세포를 형질전환시켜 해당 진핵 세포에 유전자를 발현시킴으로써 얻어지는 것이며,

   상기 단백질은 B형 간염 바이러스 표면 항원 단백질이고,

   상기 세포 도입 물질은 인터페론인 것을 특징으로 하는 바이러스성 간염 치료용 약제.
2. 삭제
3. 특정 세포에 대한 인식 능력을 가지고 입자 형성 능력을 갖는 단백질로 이루어진 중공 나노입자에 있어서, 해당 단백질에 질환 치료용 세포 도입 물질이 융합되어 이루어지는 약제로서,

   상기 약제는, 상기 단백질을 코딩하는 유전자와 그 하류측에 상기 세포 도입 물질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 진핵세포를 형질전환시켜 해당 진핵 세포에 유전자를 발현시킴으로써 얻어지는 것이며,

   상기 단백질은 B형 간염 바이러스 표면 항원 단백질이고,

   상기 세포 도입 물질은 간세포 성장인자인 것을 특징으로 하는 간경변 치료용 약제.
4. 제3항에 있어서,

   상기 진핵 세포는 동물세포, 효모 또는 곤충세포인 것을 특징으로 하는 간경변 치료용 약제.
5. 삭제
6. 삭제
7. 제1항에 있어서,

   정맥 주사에 의해 인체에 투여되는 것을 특징으로 하는 바이러스성 간염 치료용 약제.
8. 제1항에 따른 약제를 인간 이외의 포유동물에 투여하는 것에 의한 바이러스성 간염의 치료 방법.
9. 제3항에 따른 약제를 인간 이외의 포유동물에 투여하는 것에 의한 간경변의 치료 방법.
10. 제1항에 있어서,

    상기 진핵 세포는 동물세포, 효모 또는 곤충세포인 것을 특징으로 하는 바이러스성 간염 치료용 약제.
11. 제3항에 있어서,

    정맥 주사에 의해 인체에 투여되는 것을 특징으로 하는 간경변 치료용 약제.

Images