ES2845212T3 - Partículas de HPV y usos de las mismas - Google Patents

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Maxime J J Fleury
Nicolas Combelas
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Aura Biosciences Inc
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Abstract

Una nanopartícula que comprende una proteína L1 de papilomavirus que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 que comprende las sustituciones de aminoácidos D273T, N285T y S288N.

Description

DESCRIPCIÓN
Partículas de HPV y usos de las mismas
Campo de la invención
La invención se refiere a partículas similares a papilomavirus (VLP) humanas y su uso como agentes terapéuticos.
Antecedentes de la invención
El cáncer de cuello uterino es una de las principales causas de muerte por cáncer en las mujeres en todo el mundo, matando a más de 233.000 mujeres al año. El cáncer de cuello uterino fue la enfermedad maligna más común tanto en incidencia como en mortalidad entre las mujeres antes del siglo 20. La reducción en la incidencia del cáncer de cuello uterino es uno de los principales logros de salud pública en las naciones desarrolladas, principalmente debido a la puesta en práctica de programas de cribado, detección y tratamiento basados en la población para la enfermedad preinvasiva. Sin embargo, aunque la incidencia del cáncer de cuello uterino en las naciones desarrolladas ha caído, la enfermedad continúa siendo el segundo cáncer más común en las mujeres en todo el mundo.
Los frotis de Papanicolaou (Pap) pueden detectar el cáncer de cuello uterino o cambios precancerosos en el cuello uterino, muchos de los cuales están relacionados con el HPV. Estos frotis de Pap han reducido mucho la incidencia y la mortalidad del cáncer de cuello uterino en los países desarrollados en los que se presentan procedimientos de cribado amplios. En los países desarrollados en los que los procedimientos de cribado todavía son limitados, el cáncer de cuello uterino es el cáncer más frecuentemente presentado en las mujeres, y la incidencia continúa aumentando.
Todos los tratamientos actuales para las anormalidades intraepiteliales del cuello uterino, incluyendo crioterapia, ablación láser, conización escisional y el procedimiento de escisión electroquirúrgica con asa (LEEP), son procedimientos quirúrgicos invasivos que conducen a menudo a efectos secundarios significativos incluyendo descarga excesiva, infección, hemorragia, calambres e incompetencia del cuello uterino, que pueden conducir a aborto espontáneo, pérdida de la integridad del cuello uterino e incapacidad para el embarazo. Además, estos procedimientos se deben realizar en un centro ambulatorio, incrementando el coste del tratamiento.
La neoplasia intraepitelial de cuello uterino (CIN) se refiere a un intermedio patológico preinvasivo para el cáncer de cuello uterino. Las anormalidades observadas en un frotis citológico o una biopsia tisular del cuello uterino representan alteraciones en el grado de diferenciación de células epiteliales del cuello uterino. Esta displasia celular se clasifica en tres grupos diferentes de gravedad: CIN I se refiere a displasia leve confinada al tercio basal del epitelio; CIN II se refiere a lesiones confinadas a los dos tercios basales del epitelio; y CIN III se refiere a displasia celular que abarca más de dos tercios del espesor epitelial.
Aproximadamente 3,5 millones de mujeres en los Estados Unidos tendrán pruebas de frotis de Pap anormales cada año. Aproximadamente 1,2 millones de estas mujeres tienen una lesión intraepitelial escamosa (SIL) de las que de 200.000 a 300.000 se clasifican como de alto grado. La incidencia de CIN de alto grado en Latinoamérica es más de 3 veces la observada en los EE. UU. La Tabla 1 proporciona un sumario de la prevalencia de infecciones por HPV y CIN en todo el mundo.
Tabla 1: Prevalencia mundial de HPV y CIN
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La infección por HPV es endémica entre los individuos sexualmente activos. Las mujeres que tienen múltiples parejas sexuales tienen una probabilidad superior de adquirir HPV y, por consiguiente, una infección del cuello uterino relacionada con HPV. La infección con tipos de HPV de alto riesgo incrementa las posibilidades de que una mujer desarrolle cáncer de cuello uterino. El cribado y el tratamiento posterior de afecciones precancerosas del cuello uterino es altamente eficaz en la prevención del cáncer de cuello uterino en mujeres infectadas con HPV. Sin embargo, los tratamientos actuales requieren a menudo una intervención quirúrgica y se necesitan opciones terapéuticas alternativas. El documento US 2004/146531 A1 se refiere a partículas similares a virus carentes de epítopos de anticuerpo específicos para el tipo HPV 16 como portadores de péptidos para la introducción en células.
Sumario de la invención
La invención está definida por las reivindicaciones. Cualquier materia fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona únicamente a efectos informativos. La presente invención divulga nanopartículas, sistemas que divulgan dichas nanopartículas y proteínas L1 de papilomavirus de acuerdo con las reivindicaciones. Aspectos de la invención se refieren a partículas basadas en HPV y usos de las mismas para tratar enfermedades y/o aportar agentes terapéuticos. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos descritos son útiles para tratar afecciones mucosas (p. ej., enfermedades y/o infecciones del tejido mucoso, por ejemplo de células epiteliales mucosas). En algunas realizaciones, aspectos de la invención se refieren a partículas basadas en HPV modificadas que pueden aportar un agente terapéutico a tejido mucoso (p. ej., tópicamente). En algunas realizaciones, el agente terapéutico puede ser un agente antiviral. El agente antiviral se puede usar para tratar una infección viral por, por ejemplo, un papilomavirus humano, un herpesvirus, u otro virus que elija como diana el tejido mucoso. En algunas realizaciones, el agente terapéutico puede ser un agente anticanceroso. El agente anticanceroso se puede usar para tratar, por ejemplo, cáncer de cuello uterino o cualquier otro cáncer de un tejido mucoso. Se describen métodos para el tratamiento de la infección por papilomavirus humano (HPV) y métodos para el tratamiento de enfermedades asociadas con HPV que incluyen, pero no se limitan a, cáncer de cuello uterino, en un sujeto. Sin embargo, se debe apreciar que las partículas virales modificadas de la invención se pueden usar para aportar otros tipos de agentes terapéuticos y/o médicos (p. ej., agentes de diagnóstico por imagen o de contraste).
En algunas realizaciones, las partículas de la invención se pueden aportar tópicamente (p. ej., en la formar de una crema, una espuma, una pulverización, un aerosol u otra formulación adecuada para el aporte tópico) a cualquier tejido mucoso (p. ej., a tejido mucoso del cuello uterino, nasal, oral u otro). Sin embargo, aspectos de la invención no se limitan al aporte tópico y las partículas modificadas se pueden aportar subcutáneamente, intravenosamente, parenteralmente y/o a través de cualquier otra vía de aporte adecuada.
Los métodos descritos en la presente comprenden administrar al sujeto uno o más agentes terapéuticos aportados mediante un sistema de aporte de partículas similares a virus (VLP). En ciertas realizaciones, el sistema de aporte basado en VLP comprende partículas similares a papilomavirus humano (HPV). En algunas realizaciones, las nanopartículas de HPV comprenden proteína L1 viral. En algunas realizaciones, las nanopartículas de HPV comprenden proteína L1 viral y proteína L2 viral. En algunas realizaciones, las proteínas L1 y/o L2 pueden ser proteínas virales silvestres. En algunas realizaciones, las proteínas L1 y/o L2 se pueden alterar mediante mutación y/o inserción/eliminación. En ciertas realizaciones, los aminoácidos en los bucles expuestos superficialmente de la nanopartícula de HPV que comprenden L1 y/o L2 están mutados, insertados y/o eliminados. En ciertas realizaciones, la mutación, la eliminación y/o la inserción de aminoácidos en los bucles expuestos superficialmente conduce a cambios en la inmunogenicidad de la nanopartícula de HPV. En ciertas realizaciones, la inmunogenicidad se puede alterar de tal como que las nanopartículas de HPV de un cierto serotipo ya no sean reconocidas por anticuerpos producidos contra este serotipo. En estas realizaciones, la nanopartícula de HPV alterada es inmunosilenciosa en el hospedador que aloja los anticuerpos específicos para un serotipo.
Según esto, en algunas realizaciones, las partículas basadas en HPV de la invención se pueden modificar para tener una inmunogenicidad reducida o alterada. Estas partículas se pueden seleccionar para el aporte a pacientes que tienen una respuesta anti-HPV neutralizadora. En algunas realizaciones, una serie de partículas basadas en HPV que tienen diferentes serotipos se administran a un sujeto con propósitos terapéuticos para reducir el efecto de una respuesta inmunitaria neutralizadora contra uno cualquiera de los serotipos. Por ejemplo, se puede usar un primer serotipo para un primer grupo (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 5-10 o más) de administraciones a un sujeto. Posteriormente, se puede usar un segundo serotipo para un segundo grupo (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 5-10 o más) de administraciones para reducir el impacto de una respuesta inmunitaria neutralizadora que el sujeto desarrolla contra el primer serotipo. Se debe apreciar que grupos adicionales de administración pueden implicar un tercer, cuarto, quinto, etc. serotipo. Los diferentes serotipos pueden ser serotipos presentes en la naturaleza, serotipos quiméricos, otros serotipos mutantes o cualquier combinación de los mismos. Se debe apreciar que estar aplicaciones en serie o secuenciales se pueden usar para la administración (p. ej., tratamiento) crónica de un compuesto particular (p. ej., el mismo en cada uno de los diferentes serotipos) o una serie de compuestos diferentes, a lo largo de un período de meses y/o años.
En algunas realizaciones, la mutación, la eliminación y/o la inserción de aminoácidos se introducen en las proteínas de la cápside viral L1 y/o L2 de tal modo que la nanopartícula de HPV resultante no pierda la capacidad de aportar agentes terapéuticos a la célula diana. En algunas realizaciones, la nanopartícula de HPV no pierde la capacidad de transferir ácidos nucleicos (p. ej., ARNsi o ARNsh) en células diana.
En algunas realizaciones, la inmunogenicidad se puede alterar de tal modo que las nanopartículas de HPV de un cierto serotipo inducen una respuesta inmunitaria que produce anticuerpos neutralizadores específicos cruzadamente. En estas realizaciones, la nanopartícula de HPV se altera de tal modo que exhiba múltiples epítopos seroespecíficos sobre su superficie (por ejemplo mediante la inserción de epítopos en bucles expuestos superficialmente) o que exhiba epítopos que están más conservados entre serotipos (por ejemplo mediante inserción de porciones de la proteína L2 en bucles expuestos superficialmente, o mediante la unión de epítopos conservados a la superficie de la nanopartícula de HPV). En algunas realizaciones, la producción de anticuerpos neutralizadores específicos cruzadamente se induce en un individuo infectado con HPV que ha sido sometido a tratamiento para eliminar o reducir el número de células infectadas con HPV. En algunas realizaciones, el individuo infectado con HPV ha sido sometido a tratamiento para eliminar o reducir el tamaño de un tumor asociado a HPV. En estas realizaciones, se puede inducir la producción de anticuerpos neutralizadores específicos cruzadamente para generar una respuesta inmunitaria que sea suficiente para la inmunosupervisión de las células infectadas con HPV que puedan permanecer después del tratamiento. La inmunosupervisión resultante, en algunas realizaciones, es suficiente para prevenir una nueva infección de HPV o la repoblación de células infectadas por HPV o la recaída de tumores infectados por HPV. En algunas realizaciones, los anticuerpos neutralizadores específicos cruzadamente son eficaces contra uno o más serotipos de HPV.
En ciertas realizaciones, los agentes terapéuticos aportados por el sistema de aporte basado en VLP son ácidos nucleicos. Agentes terapéuticos que son ácidos nucleicos pueden ser, por ejemplo, moléculas de ARNsi o ARNsh o plásmidos que las codifican. Otros agentes terapéuticos pueden ser, por ejemplo, moléculas pequeñas, tales como moléculas pequeñas con actividad antiviral o anticancerosa.
En ciertas realizaciones, la administración a un sujeto que tiene una infección por HPV o un cáncer asociado a HPV, tal como un cáncer de cuello uterino, o una lesión, de uno o más agentes terapéuticos aportados por un sistema de aporte basado en VLP conduce a la destrucción y/o la depuración de células infectadas por HPV. Se cree que las células transformadas infectadas por HPV son causantes de cánceres o lesiones asociados a HPV. En algunas realizaciones, la destrucción y/o la depuración de las células infectadas con HPV conduce a la remisión parcial o completa del cáncer asociado a HPV.
En algunas realizaciones, los métodos de tratamiento descritos en la presente se pueden combinar con la administración de otros agentes terapéuticos (p. ej., agentes anticancerosos y/o agentes antivirales) y/o inmunomoduladores y/o radioterapia o inmunoterapia bien antes, bien simultáneamente o bien después del tratamiento con nanopartículas de HPV que comprende agentes terapéuticos. En algunas realizaciones, los agentes anticancerosos y/o antivirales pueden ser aportados por las nanopartículas de HPV. En algunas realizaciones, los agentes anticancerosos y/o antivirales se pueden administrar junto con las nanopartículas de HPV o se pueden administrar separadamente, p. ej., en un momento diferente o en una zona de administración diferente o a través de una vía de administración diferente.
En algunas realizaciones, la mayoría de o todas las células infectadas con HPV en un sujeto tratado según los métodos descritos en la presente son destruidas y depuradas y el HPV ya no es detectable en el sujeto infectado con HPV. En otras realizaciones, algunas células infectadas con HPV en un sujeto son destruidas o depuradas y el HPV todavía es detectable en el sujeto infectado con HPV. En algunas realizaciones, un sujeto que tiene una lesión o un cáncer asociados a HPV puede experimentar una remisión parcial o completa del cáncer o la lesión. En algunas realizaciones, los sujetos no experimentan una recaída de la lesión o el cáncer o la infección viral. En otras realizaciones, los sujetos experimentan una recaída de la lesión o el cáncer o la infección viral. En algunas realizaciones, los métodos de tratamiento descritos en la presente se combinan además con un tratamiento antiviral durante y/o después del tratamiento con nanopartículas de HPV que comprenden agentes terapéuticos. El tratamiento antiviral se puede aportar para prevenir, por ejemplo, la replicación de HPV, la propagación viral y/o la repoblación de células con HPV que hayan sobrevivido al tratamiento inicial o que hayan entrado en el cuerpo del sujeto como una nueva infección.
En otras realizaciones, las nanopartículas de HPV alteradas se administran al final del régimen de tratamiento inicial. Las nanopartículas de HPV se alteran de tal modo que exhiban múltiples epítopos seroespecíficos sobre su superficie o que exhiban epítopos que están más conservados entre serotipos. En algunas realizaciones, la administración de estas nanopartículas de HPV alteradas puede inducir una respuesta inmunitaria local dirigida contra los epítopos administrados, por ejemplo induciendo un incremento en anticuerpos neutralizadores específicos cruzadamente, que sea suficiente para una inmunosupervisión capaz de detectar y destruir células recientemente infectadas con HPV. En algunas realizaciones, la prevención de nueva infección y/o propagación o repoblación viral es suficiente inhibe la recaída del cáncer o la lesión asociados a HPV.
Los métodos descritos en la presente comprenden la administración de nanopartículas de HPV que comprenden uno o más agentes terapéuticos a través de diferentes vías. En algunas realizaciones, las nanopartículas de HPV se administran a través de aplicación tópica. En algunas realizaciones, la administración tópica elige como diana membranas mucosas. Por ejemplo, la nanopartícula de HPV que comprende uno o más agentes terapéuticos se puede aplicar tópicamente a o adyacente a un epitelio tal como el epitelio del cuello uterino o tópicamente a o adyacente a una lesión epitelial tal como carcinoma epitelial del cuello uterino o anal.
En ciertas realizaciones, se proporcionan nanopartículas de HPV que comprenden proteínas de la cápside viral alteradas, en donde las proteínas de la cápside viral son alteradas por mutaciones de aminoácidos silvestres, inserciones de aminoácidos adicionales un/o eliminación de aminoácidos silvestres, según se describe en la presente. En ciertas realizaciones, las nanopartículas de HPV alteradas son más o menos inmunogénicas en un sujeto o tienen una inmunogenicidad alterada. En algunas realizaciones, las nanopartículas de HPV alteradas mantienen la capacidad de aportar o transferir agentes terapéuticos a una célula diana.
Se describen métodos y composiciones para aportar uno o más compuestos a un sujeto. En algunas realizaciones, se usa una partícula similar a papilomavirus humano (HPV) modificada, en donde la partícula comprende uno o más compuestos heterólogos empaquetados en una partícula similar a HPV que comprende una proteína superficial que tiene inmunogenicidad alterada. Los compuestos heterólogos no son moléculas de HPV (p. ej., un compuesto que no es un genoma de HPV, ni un ácido nucleico de HPV y/o ni otra molécula de HPV). Estos compuestos pueden ser compuestos terapéuticos u otros compuestos médicos. En algunas realizaciones, el compuesto puede ser uno o más de: un agente terapéutico o médico, un ácido nucleico o una molécula pequeña, o un agente de diagnóstico por imagen o de contraste. En algunas realizaciones, el agente terapéutico es un ARNsi, un ARNsh, un ácido nucleico antisentido o un ácido nucleico que codifica un ARNsi, un ARNsh un ácido nucleico antisentido. En algunas realizaciones, el ARNsi, el ARNsh o el ácido nucleico antisentido elige como diana HPV-E6 y/o HPV-E7. En algunas realizaciones, la molécula pequeña es un agente antiviral. En algunas realizaciones, la molécula pequeña es un agente anticanceroso (p. ej., gemcitabina).
Se debe apreciar que los métodos y las composiciones descritos se pueden proporcionar junto con uno o más de otros agentes (p. ej., un agente antiviral, un agente anticanceroso, por ejemplo gemcitabina o cualquier combinación de los mismos).
En algunas realizaciones de los métodos y las composiciones descritos, la partícula similar a HPV comprende una proteína L1 o una proteína L1 y una proteína L2. En algunas realizaciones de los métodos y las composiciones descritos, la proteína superficial es una proteína L1 modificada con una secuencia del bucle FG modificada. En algunas realizaciones, la proteína L1 tiene una secuencia de un serotipo HPV16, HPV31, HPV33, HPV34, HPV35, HPV52, HPV58, HPV73 o HPV91, y en donde el bucle FG de la proteína L1 tiene uno o más cambios de aminoácido que alteran la inmunogenicidad de la proteína en un sujeto humano. En algunas realizaciones, el uno o más cambios de aminoácido están en una o más de las posiciones X1 - X17 de SEQ ID NO: 11. En algunas realizaciones, el aminoácido en la posición X16 no está alterado. En algunas realizaciones, una o más de las posiciones X1, X2 , X3, X5 , X6 , X11 y X14 de SEQ ID NO: 11 están modificadas. En algunas realizaciones, 2-3 de las posiciones X1, X2 , X3 , X5, X6 , X11 y X14 de SEQ ID NO: 11 están modificadas. En algunas realizaciones, 4-7 de las posiciones X1, X2 , X3 , X5 , X6 , X11 y X14 de SEQ ID NO: 11 están modificadas. En algunas realizaciones, 3 de las posiciones X1, X2 , X3 , X5 , X6 , X11 y X14 de SEQ ID NO: 11 están modificadas. En algunas realizaciones, las posiciones X6 , X11 y X14 de SEQ ID NO: 11 están modificadas. En algunas realizaciones, todas las posiciones X1, X2 , X3 , X5, X6 , X11 y X14 de SEQ ID NO: 11 están modificadas. En algunas realizaciones, la proteína L1 tiene una secuencia de un serotipo HPV16 con las posiciones X6 , X11 y X14 de SEQ ID NO: 11 cambiadas por T, T y N, respectivamente, y teniendo el resto de las posiciones de SEQ ID NO: 11 un aminoácido característico de un serotipo HPV16. En algunas realizaciones, la proteína L1 tiene una secuencia de un serotipo HPV16 con las posiciones X1, X2 , X3 , X5 , X6 , X11 y X14 cambiadas por F, S, T, S, T, T y N, respectivamente, y teniendo el resto de las posiciones de SEQ ID NO: 11 un aminoácido característico de un serotipo HPV16.
Se apreciará que en algunas realizaciones, una partícula similar a HPV se administra a un sujeto que no tiene una respuesta inmunitaria neutralizadora contra el serotipo de la proteína superficial, por ejemplo cuando el sujeto no se ha inmunizado contra el serotipo de la proteína superficial, o cuando el sujeto se ha infectado con un HPV que tiene el mismo serotipo que el serotipo de la proteína superficial en la partícula similar a HPV. En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria del sujeto se evalúa antes de seleccionar una partícula similar a HPV para la administración.
En algunas realizaciones, una partícula similar a HPV se administra a un tejido mucoso. El tejido mucoso puede estar en cualquier zona según se describe en la presente (p. ej., del cuello uterino, urogenital, oral, etc.). Por otra parte, en algunas realizaciones, una partícula similar a HPV se administra a una zona epidérmica (p. ej., para tratar un cáncer o una infección cutáneos o epidérmicos).
Se apreciará que las composiciones descritas se pueden administrar tópicamente y/o a través de cualquier otra vía adecuada (p. ej., a través de inyección, aerosol, pulverización u otra forma de administración).
Las composiciones descritas se pueden administrar a un tejido infectado con un virus, una bacteria y/u otros microbios o parásitos. En algunas realizaciones, una zona de infección puede estar infectada con varios organismos diferentes (p. ej., múltiples virus y/u otros microbios, por ejemplo HPV y un herpesvirus, por ejemplo HSV). Según esto, una composición puede incluir un compuesto que elige como diana ampliamente varios organismos diferentes, o varios compuestos diferentes que eligen cada uno como diana un organismo diferente, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la misma partícula similar a HPV puede contener diferentes compuestos terapéuticos. En algunas realizaciones, una composición o un régimen de tratamiento puede incluir dos o más partículas similares a HPV diferentes que contienen cada una un compuesto que es dirigido a una infección particular.
Las composiciones descritas se pueden administrar a un sujeto para tratar un cáncer (p. ej., en o cerca del lugar de la administración). En algunas realizaciones, el cáncer puede estar asociado con una infección (p. ej., una infección con HPV o HSV). En algunas realizaciones, el cáncer puede no estar asociado con una infección. Según esto, las composiciones descritas se pueden usar para tratar el cáncer de piel (p. ej., cáncer de piel no melanómico).
En algunas realizaciones, las composiciones descritas se pueden administrar a un sujeto que tiene una deficiencia del sistema inmunitario para tratar una afección (p. ej., infección, cáncer u otra afección) asociada con la deficiencia del sistema inmunitario. La deficiencia del sistema inmunitario puede estar provocada por una infección (p. ej., una infección por HIV, sida) u otra afección (p. ej., cáncer).
En algunas realizaciones, una partícula similar a HPV de la invención se puede administrar junto con una composición que promueva una respuesta inmunitaria inespecífica (p. ej., en o cerca del lugar de la administración). La respuesta inmunitaria inespecífica puede ser útil para tratar la infección y/o un cáncer u otra afección. En algunas realizaciones, puede ser beneficiosa una respuesta inmunitaria incrementada en respuesta a la administración de varias partículas similares a HPV con diferentes serotipos. Según esto, algunas composiciones comprenden varios serotipos diferentes.
En algunas realizaciones, se puede efectuar una administración crónica de una composición al administrar una primera partícula similar a HPV que comprende un compuesto a un sujeto durante un primer período y administrar una segunda partícula similar a HPV que comprende el compuesto al sujeto durante un segundo período, en donde las partículas similares a HPV primera y segunda tienen diferentes serotipos. Se pueden realizar administraciones adicionales usando serotipos adicionales. En algunas realizaciones, los serotipos de las partículas similares a HPV primera y segunda son independientemente serotipos presentes en la naturaleza o alterados. En algunas realizaciones, el serotipo de la partícula similar a HPV primera y/o segunda es un serotipo quimérico.
En algunas realizaciones, una composición o método descrito puede implicar administrar una partícula similar a HPV que tiene un serotipo quimérico al incluir una secuencia de L2 fusionada a un bucle de L1. En algunas realizaciones, la secuencia de L2 está ligada a la superficie de una partícula de L1. En algunas realizaciones, la secuencia de L2 consiste en los residuos 13 a 88 de la proteína L2 HPV31.
Estos y otros aspectos de la invención se describen con más detalle en los siguientes ejemplos no limitantes y la descripción.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 representa la localización de ARNsis sobre genes E6 y E7 genes de HPV-16.
La Figura 2 representa un gráfico de barras que muestra el papel de ZnCl2 en la producción de pseudoviriones que codifican luciferasa. La expresión del gen de luciferasa se evaluó en células 293FT transfectadas con pseudoviriones reensamblados sin ZnCl2 y en células 293FT, TC1, C33 y CaSki transfectadas mediante pseudoviriones generados en presencia de ZnCl2.
La Figura 3 representa A) una fotografía de ARNm transcrito inversamente extraído de células CaSki que se transfectaron con ARNsh de LacZ, E6-1, E6-2, E7-1 y E7-2. El ADNc se amplificó por PCR con cebadores específicos de los genes E6 y E7 y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) como control. B) una fotografía de una transferencia Western de extractos celulares procedentes de células CaSki (simulación) que se transfectaban con ARNshs de LacZ, E6-2, E6-1, E7-2 y E7-1. Los extractos se analizaron usando anticuerpos para p53 y p-actina.
La Figura 4 muestra un gráfico de barras que representa los efectos de ARNshs de E6 y E7 sobre el crecimiento de células C33 (columnas grises), CaSki (columnas negras) y TC1 (columnas blancas). Las células (C) se transfectaron con ARNshs de LacZ, E6-1, E6-2, E7-1 y E7-2.
La Figura 5 representa una fotografía que muestra la inhibición del crecimiento de tumores TC1 en ratones C57 BL6. Las células de TC1 se transfectaron in vitro. A) comparación de tumores obtenidos después de la inyección de células TC1 tratadas con VLP solas (parte inferior) y pseudoviriones E7-1 (parte superior). B) cuantificación en gráfico de barras de la comparación del peso de tumores después de diferentes tratamientos con pseudoviriones de ARNsh y lentivirus de ARNsh.
La Figura 6 representa gráficos que muestran la inhibición del crecimiento de tumores TC1 en ratones C57 BL6 después de la inyección intratumoral de pseudoviriones (Pv) de ARNsh de control y ARNsh de E7-1 (Pv). A) evolución del tamaño (diámetro medio) del tumor después de la primera inyección de pseudoviriones de ARNsh de control o ARNsh de E7-1. B) peso de los tumores a las 3 semanas en ratones tratados con pseudoviriones de ARNsh de control o ARNsh de E7-1.
La Figura 7 (a) representa gráficos de datos de resonancia plasmónica superficial representativos. (b) representa un mapa epitópico construido a partir de estudios de interacción entre los 15 MAbs para HPV31 que reconocían epítopos de conformación mediante SPR. Los anticuerpos que neutralizaban la internalización están en negro y los que neutralizaban la ligazón celular están subrayados. El anticuerpo H31.D24 era no neutralizador (recuadrado). (c) Los anticuerpos AQ5 que inhibían la unión de VLP a heparina están subrayados.
La Figura 8 representa la cartografía de los epítopos de proteína L1 de HVP31 reconocidos por un MAb no neutralizador (H31.D24) y cuatro MAbs neutralizadores (H31.B1, H31.F7, H31.F16 y H31.H12) usando el método de exposición bacteriana.
La Figura 9 representa la neutralización con MAb de pseudoviriones antes y después de la ligazón. (a) Inhibición de la entrada de pseudoviriones de HPV31 por MAbs para HPV31. Los pseudoviriones de HPV31 se preincubaron con MAbs para HPV31 y a continuación se añadieron a las células. (b) Inhibición de la internalización de pseudoviriones de HPV31 por MAbs para HPV31. Los pseudoviriones de HPV31 se preligaron a las células y a continuación se añadieron los MAbs para HPV31. Los cinco MAbs investigados usando el método de exposición bacteriana se agrupan a la derecha de la figura. Columnas grises, MAbs específicos del tipo neutralizador; columna negra, MAb F7 de neutralización cruzada.
La Figura 10 representa VLP que se une a HS y ECM: efectos de MAbs para HPV31 y supresión C-terminal de L1. (a) Inhibición de la unión a heparina después de la preincubación de VLP con MAbs. (b) Inhibición de la unión a ECM después de la preincubación de VLP con MAbs. Los cinco MAbs investigados usando el método de exposición bacteriana se agrupan a la derecha de la figura. Columnas grises, MAbs específicos del tipo neutralizador; columna negra, MAb de neutralización cruzada F7; columna abierta: MAb no neutralizador D24. Los valores son el porcentaje de inhibición con SD. Una inhibición mayor de 50% se consideraba positiva.
La Figura 11 representa la unión a heparina de VLP naturales (columnas negras) y VLP desnaturalizados (columnas grises) para el tipo 16 y el tipo 31 con o sin eliminaciones C-terminales (D9 y D31).
La Figura 12 representa la localización de los epítopos reconocidos por cinco anticuerpos monoclonales sobre el bucle FG de HPV31. La posición de los epítopos reconocidos sobre el bucle FG de la proteína L1 de HPV31 por cuatro MAbs.
La Figura 13 representa un alineamiento de secuencias de los bucles FG de HPV16 y HPV31, respectivamente, y mutaciones insertadas en la secuencia silvestre del bucle FG de HPV16 para generar quimeras (X e Y).
La Figura 14 representa una gráfica que muestra la actividad de extractos de luciferasa (recuentos por minuto, CPM) procedentes de células COS-7 transfectadas con wt HPV16 y las quimeras HPV X y HPV Y.
La Figura 15 representa una tabla que muestra títulos (títulos medios geométricos, GMT) de anticuerpos específicos para HPV16, HPV31, HPV X y HPV Y medidos en un ensayo ELISA a partir de ratones inmunizados con HPV16, HPV31, HPV X o HPV Y.
La Figura 16 representa micrografías electrónicas de las VLP quiméricas L1STII (A) y 31L1-16L2 (13-88) (B) (barra=200 nm).
La Figura 17 representa gráficos de barras que muestran el análisis de la antigenicidad de partículas VPL HPV16 L1-STII, HPV16 L1STIIL2SA y HPV31 L1-16 L213-88 quiméricas mediante ELISA. Los resultados se ajustaron a la reactividad de L1 usando el Mab CamVir-1. Los resultados se presentan como reactividad relativa, es decir, la relación entre la OD obtenida con el antígeno considerado y la OD obtenida con el antígeno de referencia (*). Las partículas se analizaron en condiciones naturales usando anticuerpos monoclonales dirigidos contra epítopos de conformación (C) y exposición a StrepTagII o L2. HPV16 L1 STII y HPV16 L1STII L2SA se analizaron con H16.V5 (C), un anticuerpo monoclonal dirigido contra la secuencia StrepTagII y un antisuero de HPV 16 L2 policlonal. Se usaron como controles VLP de HPV16 L1 y VLP de L1L2 31. Las v Lp de HPV31 L1-16 L213-88 se analizaron usando H31.F16 (C) y un antisuero de HPV16 L2 policlonal. Los resultados son medias de duplicados.
La Figura 18 representa una fotografía de un análisis de transferencia Western de la expresión de proteína L2. 1) proteína de fusión L2SA purificada, 2) después de la interacción con VLP L1STII y 3) con VLP de L1; 4) en células Cos-7 transducidas con pseudoviriones de HPV58 que codifican GFP y 5) con un pseudovirión de HPV58 que codifica L2.
La Figura 19 representa una gráfica que muestra la detección de anticuerpos neutralizadores para HPV31, HPV58 y HPV18. Los títulos de neutralización de ratones individuales son las medias de la última dilución recíproca mayores de 50% de inhibición de la expresión de luciferasa. Los títulos medios geométricos se indican mediante barras.
Descripción detallada de la invención
Se describen métodos y composiciones basados en partículas de HPV y su uso para aplicaciones médicas y/o terapéuticas. En algunas realizaciones, las partículas basadas en HPV se usan para aportar uno o más agentes (p. ej., agentes terapéuticos, agentes de diagnóstico por imagen y/u otros agentes médicos) a una célula o tejido diana (p. ej., a tejido mucoso, por ejemplo una superficie de tejido mucoso).
En algunas realizaciones, aspectos de la invención se refieren a una partícula de HPV que contiene una o más proteínas superficiales de HPV presentes en la naturaleza (p. ej., proteínas L1 y/o L2) y que está cargada con uno o más agentes médicos y/o terapéuticos, o una combinación de dos o más de los mismos. En algunas realizaciones, aspectos de la invención se refieren a partículas basadas en HPV modificadas que contienen una o más proteínas superficiales variantes (p. ej., proteínas L1 y/o L2 variantes) que tienen una inmunogenicidad reducida o modificada en un sujeto. La modificación puede ser un cambio en la secuencia de aminoácidos que reduce o impide la neutralización por el sistema inmunitario del sujeto. En algunas realizaciones, una partícula basada en HPV modificada es una partícula que contiene una proteína de HPV recombinante (p. ej., una proteína L1 y/o L2 recombinante) que incluye uno o más cambios de aminoácido que alteran la inmunogenicidad de la proteína en un sujeto (p. ej., en un sujeto humano). En algunas realizaciones, una partícula basada en HPV modificada tiene una inmunogenicidad alterada pero retiene la capacidad para empaquetar y aportar moléculas a un sujeto. Según esto, las partículas de HPV modificadas de la invención se pueden cargar con uno o más agentes (p. ej., en lugar de un ácido nucleico de HPV). Estas partículas se pueden aportar a un sujeto sin inducir una respuesta inmunitaria que sería inducida por una partícula de HPV presente en la naturaleza.
Ciertas realizaciones de la invención son útiles para aportar uno o más agentes terapéuticos a tejido enfermo (p. ej., tejido mucoso enfermo). En algunas realizaciones, un tejido enfermo (p. ej., tejido mucoso, tejido epitelial o tejido endotelial) puede ser un tejido infectado (p. ej., infectado con un virus tal como HPV o HSV). En algunas realizaciones, el tejido mucoso es tejido de cuello uterino y la enfermedad es displasia o cáncer (p. ej., displasia del cuello uterino, cáncer de cuello uterino, por ejemplo asociado con infección persistente con HPV). Sin embargo, en algunas realizaciones, las partículas basadas en HPV se pueden usar para aportar composiciones a otros tejidos (p. ej., la epidermis). En algunas realizaciones, las partículas basadas en HPV se pueden usar para tratar HPV. Sin embargo, en algunas realizaciones, las partículas basadas en HPV se pueden usar para aportar agentes terapéuticos para tratar otras enfermedades o afecciones.
Algunas realizaciones de la invención son útiles para aportar uno o más agentes de diagnóstico por imagen o de contraste a un sujeto. Por ejemplo, se pueden aportar puntos cuánticos, metales y/u otros agentes de diagnóstico por imagen. En algunas realizaciones, se pueden usar agentes para rastrear enfermedades en fase inicial (p. ej., metástasis en fase inicial). En algunas realizaciones, se pueden usar agentes radiosensibles para mejorar los efectos de la radioterapia. En algunas realizaciones, se pueden aportar agentes para inducir a que las células tumorales expresen diferentes receptores o azúcares en su membrana. Por ejemplo, se pueden usar aspectos de la invención para aportar un agente que promueve la expresión en una célula tumoral de una señal que mejoraría el reconocimiento del tumor por el sistema inmunitario (p. ej., un agente que hiciera que la célula tumoral pareciera una bacteria o un virus). En algunas realizaciones, se puede aportar un agente para bloquear la captación de un azúcar por una célula tumoral. Sin embargo, se apreciará que cualquier agente terapéutico y/u otro agente médico adecuado se puede aportar según los aspectos de la invención.
En algunas realizaciones, aspectos de la invención se refieren a partículas basadas en HPV que están modificadas para exponer epítopos procedentes de dos o más variantes de HPV presentes en la naturaleza. Estas partículas modificadas se pueden usar para proporcionar inmunización contra la infección por cualquiera de dos o más variantes de HPV presentes en la naturaleza.
Se describen protocolos para administrar una o más partículas de HPV diferentes para aplicaciones terapéuticas. Las diferentes partículas de HPV pueden ser cualquier combinación de diferentes variantes de HPV, partículas basadas en HPV que contienen diferentes agentes y partículas de HPV que tienen inmunogenicidad modificada.
En ciertas realizaciones, se pueden usar nanopartículas de HPV para aportar uno o más agentes terapéuticos a células mucosas (p. ej., células infectadas con HPV). En otras realizaciones, se pueden usar nanopartículas de HPV alteradas para aportar el uno o más agentes terapéuticos a células diana. En ciertas realizaciones, a nanopartícula de HPV alterada es inmunosilenciosa en el hospedador que aloja anticuerpos específicos para un serotipo. Por ejemplo, un sujeto infectado con un primer serotipo de HPV (p. ej., HPV-16) desarrolla anticuerpos contra ese serotipo. En este sujeto, las partículas virales que tienen el primer serotipo (p. ej., VPLs basadas en HPV 16 silvestre) pueden inducir una respuesta inmunitaria que reduce la eficacia del aporte de fármaco basado en VLP.
En otro ejemplo, un sujeto se puede inmunizar contra HPV (p. ej., con GARDASIL y CERVARIX) y ha desarrollado anticuerpos neutralizadores contra un primer y/o segundo serotipo (p. ej., HPV-16 y HPV18). En este sujeto, las partículas virales que tienen el primer y/o serotipo (p. ej., VLP basadas en tipo HPV16 o HPV18 silvestres) pueden inducir una respuesta inmunitaria que reduce drásticamente la eficacia del aporte de fármaco basado en VLP.
Sin embargo, las nanopartículas de HPV se pueden alterar mediante métodos descritos en la presente de modo que la nanopartícula de HPV alterada no sea reconocida por los anticuerpos específicos para el primer serotipo en el hospedador (p. ej., loa anticuerpos específicos para el serotipo HPV-16 en el hospedador) y/o los anticuerpos específicos para el segundo serotipo en el hospedador (p. ej., los anticuerpos específicos para el serotipo HPV-18 en el hospedador). Estos HPV o nanopartículas de HPV alterados que comprenden proteínas L1 y/o L2 de un serotipo diferente se pueden usar terapéuticamente. Por ejemplo, estas nanopartículas de HPV alteradas o VLP basada en un serotipo diferente se pueden usar para aportar uno o más agentes terapéuticos a un hospedador inmunizado a HPV o infectado con HPV sin inducir una respuesta inmunitaria específica del serotipo y/o sin ser neutralizadas por una respuesta del hospedador y sin perder eficacia. Estas nanopartículas de HPV alteradas o VLP basada en un serotipo diferente se pueden usar repetidamente (p. ej., para 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más administraciones) para aportar agentes terapéuticos. En ciertas realizaciones, el sujeto desarrollará nuevos anticuerpos que reconocerán la nanopartícula de HPV alterada o la VLP basada en un serotipo diferente. Además, un sujeto que no está infectado con HPV puede desarrollar una respuesta inmunitaria contra el serotipo de una partícula basada en HPV que se administra al sujeto con propósitos terapéuticos. En estos casos, se puede usar una segunda nanopartícula de HPV alterada diferentemente o una segunda nanopartícula de HPV que comprende proteínas L1 y/o L2 procedente de un serotipo diferente para el aporte continuado de agentes terapéuticos a un sujeto (p. ej., a células infectadas con HPV o células dentro de un sujeto que se ha inmunizado contra HPV o se ha tratado con composiciones basadas en HPV de la invención) sin inducir una respuesta inmunitaria (p. ej., una respuesta inmunitaria neutralizadora) específica para el serotipo de HPV original y la segunda nanopartícula de HPV alterada. En el caso de que un sujeto desarrolle una respuesta inmunitaria (o a fin de evitar el desarrollo de una respuesta inmunitaria) contra la segunda nanopartícula de HPV alterada o la segunda VLP que contiene las segundas proteínas L1 y/o L2, se puede usar una tercera nanopartícula de HPV alterada o una tercera VLP que contienen terceras proteínas L1 y/o L2. Este procedimiento se puede repetir varias veces con una serie de diferentes nanopartículas de HPV alteradas y/o se pueden usar diferentes VLP que contienen una serie de diferentes proteínas L1 y/o L2. Se debe apreciar que en algunas realizaciones, el cambio de un grupo de partículas a uno diferente se puede realizar cuando el primer grupo pierde eficacia en el sujeto, cuando se detecta en el sujeto una respuesta inmunitaria al primer grupo, o en un momento predeterminado (p. ej., después de un número predeterminado de administraciones o un período predeterminado de administración del primer grupo) después de que se inicie el tratamiento.
En ciertas realizaciones, la VLP basada en un serotipo se elige sobre la base de la similitud de genotipo y/o serotipo del HPV. En algunas realizaciones, la VLP basada en un serotipo diferente se elige sobre la base de la reactividad cruzada neutralizadora de los anticuerpos. En algunas realizaciones, se elige una VLP basada en un serotipo diferente que sea la más distantemente relacionada con el primer y/o el segundo serotipo contra el que el sujeto ha desarrollado anticuerpos neutralizadores. Por ejemplo, HPV 18 y HPV 45 están estrechamente relacionados y muestran un alto grado de protección cruzada de anticuerpos neutralizadores. HPV 16 y HPV 31 están estrechamente relacionados y muestran un alto grado de protección cruzada de anticuerpos neutralizadores. HPV 58 está relacionado más distantemente con HPV 16 y HPV18 y se observa poca o ninguna protección cruzada por anticuerpos neutralizadores.
Según esto, una serie de tratamiento puede implicar administrar una serie de composiciones de VLP (p. ej., que contienen uno o más agentes terapéuticos), en donde cada composición de VLP sucesiva se basa en una VLP procedente de un serotipo de HPV diferente, por ejemplo, de serotipos remotamente relacionados. Por ejemplo, en un sujeto inmunizado contra HPV 16 y HPV 18, una VLP adecuada basada en un serotipo diferente puede ser una partícula que comprende proteínas L1 y/o L2 procedentes de HPV 58 silvestre.
En otra realización, la VLP relacionada distantemente con el primer y/o segundo serotipo contra el que el sujeto ha desarrollado anticuerpos neutralizadores se puede seleccionar de papilomavirus que no son HPV. En algunas realizaciones, la VLP puede comprender proteínas de la cápside procedentes de un papilomavirus que infecta a un mamífero que no es humano, p. ej., papilomavirus bovino (BVP) o papilomavirus de conejo de cola de algodón (CRVP) o papilomavirus de Shope. Se debe apreciar que una serie de tratamiento puede implicar una serie de VLP basadas en diferentes serotipos de HPV y/o diferentes papilomavirus que infectan a otros hospedadores no humanos.
La nanopartícula de HPV diferentemente alterada o la nanopartícula de HPV de un serotipo diferente se puede usar para el aporte de agentes terapéuticos hasta que el sujeto desarrolle anticuerpos para la nanopartícula de HPV diferentemente alterada o la nanopartícula de HPV de un serotipo diferente. En ciertas realizaciones, usando el método descrito anteriormente, alterando VLP basadas en diferencias de serotipo y/o mutaciones que alteran la respuesta inmunitaria, los sujetos se pueden tratar durante múltiples rondas con agentes terapéuticos sin la pérdida de eficacia del sistema de aporte debida a respuesta inmunitarias del sujeto. En algunas realizaciones, estos regímenes permiten un tratamiento repetido o continuado de la infección por HPV y/o el cáncer asociado a HPV hasta que se eliminan esencialmente todas las células infectadas con HPV y/o se ha producido la remisión (parcial o completa) del cáncer o la lesión. Sin embargo, se debe apreciar que estos regímenes se pueden usar para el tratamiento repetido o continuado de otras afecciones.
En algunas realizaciones, un sujeto se vacuna usando una vacuna para HPV (tal como una disponible comercialmente, p. ej., GARDASIL y CERVARIX). En estas realizaciones, la inmunización protege al sujeto de ser infectado con los virus que son elegidos como diana por la vacuna (por ejemplo, los virus para los que el sujeto ha producido una respuesta inmunitaria al vacunarse) y de desarrollar enfermedades asociadas con HPV provocadas por estos virus específicos de la vacuna. Sin embargo, se apreciará que las vacunas actualmente disponibles no protegerán contra la infección de todos los genotipos y/o serotipos de HPV. En algunas realizaciones, los sujetos vacunados con HPV se infectarán con un HPV (p. ej., un HPV de alto riesgo) que no es elegido como diana por la vacuna, por ejemplo, para el que el sujeto vacunado no ha desarrollado una respuesta inmunitaria. En algunas realizaciones, el sujeto vacunado encuentra múltiples incidencias de infección con diferentes tipos de HPV. En algunas realizaciones, los sujetos se pueden infectar con uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, o más tipos de HPV diferentes que infectan - y están alojados en - diferentes células del sujeto. En algunas realizaciones, un sujeto vacunado se infecta con un HPV de alto riesgo para el que el sujeto vacunado no ha desarrollado una respuesta inmunitaria puede desarrollar una enfermedad asociada a HPV, p. ej., una displasia o cáncer asociados a HPV, provocada por el HPV de alto riesgo para el que el sujeto vacunado no ha desarrollado una respuesta inmunitaria. En estas realizaciones, el sujeto se puede tratar con las VLP descritas en la presente usando los métodos descritos en la presente.
Por ejemplo, un sujeto inmunizado con las vacunas disponibles comercialmente puede desarrollar anticuerpos neutralizadores contra HPV16 y 18 y también puede desarrollar anticuerpos neutralizadores contra HPV6 y 11. El sujeto inmunizado está protegido contra el desarrollo de precánceres de cuello uterino y/o verrugas genitales provocados por estos tipos de HPV (HPV 16, 18 (cáncer) y HPV 6, 11 (verrugas)). Un sujeto que haya desarrollado anticuerpos neutralizadores contra HPV 16 y 18 con la inmunización puede desarrollar algunos anticuerpos neutralizadores que exponen reactividad cruzada con otros tipos de HPV (tales como, p. ej., HPV 31, para anticuerpos neutralizadores que se producen contra HPV 16 y HPV 45 para anticuerpos neutralizadores que se producen contra HPV 18). Sin embargo, los sujetos inmunizados todavía serán sensibles a la infección con otros tipos de HPV de alto riesgo para los que no son desarrollado anticuerpos neutralizadores cruzados por el sujeto (tales como, p. ej., HPV58 u otros). Tipos de HPV de alto riesgo adicionales que pueden infectar al sujeto inmunizado pueden ser, por ejemplo, h Pv -33, HPV-35, HPV-39, HPV-51, HPV-52, HPV-56, HPV-59, HPV-68 y HPV-69. Si el sujeto inmunizado no ha desarrollado anticuerpos neutralizadores cruzados o no ha desarrollado anticuerpos neutralizadores cruzados suficientemente específicos o no ha desarrollado suficientes títulos de anticuerpos neutralizadores cruzados, el sujeto inmunizado todavía está en riesgo de desarrollar una enfermedad asociada a HPV, tal como displasia o cáncer, cuando se infecta con uno o más de los tipos de HPV de alto riesgo, para los que no ha sido desarrollada por el sujeto una protección suficiente.
En este sujeto, las VLP modificadas descritas en la presente o las partículas virales de un serotipo diferente (más distantemente relacionado) (p. ej., VLP basadas en HPV58 silvestre) que comprenden uno o más agentes terapéuticos (p. ej., ARNsi de e7) se pueden administrar al sujeto para tratar una enfermedad en fase inicial desarrollada por la infección persistente con HPV de alto riesgo de ese sujeto provocada por un HPV de alto riesgo para el que no se desarrollaba suficiente protección por el sujeto. En este ejemplo, el tratamiento permite la eliminación de la displasia inicial y adicionalmente puede producir una protección cruzada más amplia al sujeto contra una infección adicional con otros tipos de HPV adicionales.
En algunas realizaciones, las nanopartículas de HPV comprenden proteína L1 viral. En algunas realizaciones, las nanopartículas de HPV comprende proteína L1 viral y proteína L2 viral. Las proteínas L1 y/o L2 pueden, en algunas realizaciones, ser proteínas virales silvestres. En algunas realizaciones, las proteínas L1 y/o L2 se pueden alterar mediante mutación y/o eliminación de modo que las proteínas L1 y/o L2 resultantes comprendan solamente dominios 'mínimos' esenciales para el ensamblaje de la nanopartícula. En algunas realizaciones, las proteínas L1 y/o L2 se pueden fusionar a otras proteínas y/o péptidos que proporcionen una funcionalidad adicional. Estas otras proteínas pueden ser virales o no virales y, en algunas realizaciones, podrían ser, por ejemplo, específicas para el hospedador o específicas para el tipo de célula. Se debe apreciar que las VLP se pueden basar en partículas que contienen una o más proteínas recombinantes o fragmentos de las mismas (p. ej., una o más proteínas de la membrana y/o superficiales de HPV o fragmentos de las mismas). En algunas realizaciones, las VLP se pueden basar en partículas presentes en la naturaleza que se procesan para incorporar uno o más agentes como los descritos en la presente, como aspectos de la invención no se limitan a este respecto. En ciertas realizaciones, se pueden usar partículas que comprenden uno o más péptidos de elección de diana. Se pueden usar otras combinaciones de proteínas y péptidos de HPV, como aspectos de la invención no se limitan a este respecto.
En algunas realizaciones, las proteínas de la cápside silvestres virales se alteran mediante mutaciones, inserciones y eliminaciones. Todos los epítopos específicos de un tipo dependientes de la conformación identificados hasta la fecha se encuentran en la superficie de HPV-VLP dentro de bucles hipervariables en los que la secuencia de aminoácidos es ligeramente divergente entre tipos de HPV, que se denominan bucles BC, DE, EF, FG y HI. La mayoría de los anticuerpos neutralizadores se generan contra epítopos en estos bucles variables y son específicos del tipo, con reactividad cruzada, neutralización cruzada y protección cruzada limitadas. Diferentes serotipos de HPV inducen anticuerpos dirigidos a diferentes epítopos específicos del tipo y/o a diferentes bucles.
Se proporcionan en la presente métodos para explotar la reactividad cruzada limitada de anticuerpos generados contra serotipos de HPV específicos para terapia. En ciertas realizaciones, las proteínas de la cápside viral, HPV L1 y/o L2, se mutan en una o más posiciones de aminoácido localizadas en uno o más bucles hipervariables y/o expuestos superficialmente. Las mutaciones se realizan en posiciones de aminoácido dentro de los bucles que no están conservadas entre serotipos de HPV. Estas posiciones pueden ser completamente no conservadas, esto es que cualquier aminoácido puede estar en esta posición, o la posición puede ser conservada, en la que solamente se pueden realizar cambios de aminoácido conservativos.
Se pueden realizar cambios de aminoácido conservativos según consideraciones funcionales, químicas o estructurales. Por ejemplo, se pueden realizar cambios de aminoácido conservativos según la similitud química: ácido (D/E), alifático (A/G/I/L/V), amídico (N/Q), aromático (F/W/Y), básico (R/H/K), hidroxilado (S/T), imínico (P), azufrado (C/M); o la similitud funcional: ácido (D/E), básico (R/H/K), hidrófilo (A/I/L/M/F/P/W/V), polar (N/C/Q/G/S/T/Y); o la similitud en la carga: ácido, básico, neutro; o la similitud estructural: ambivalente (a /C/G/P/S/T/W/Y), externo (R/N/D/Q/E/H/K), interno (I/L/M/F/v ), en donde cualquier aminoácido de un grupo de aminoácidos entre paréntesis se puede cambiar por otro en ese grupo y este cambio se considera un cambio conservativo según la consideración aplicada, p. ej., estructural, funcional o química. En algunas realizaciones, se pueden considerar uno o más factores.
En ciertas realizaciones, se introducen cambios de aminoácidos en uno o más bucles en una o más posiciones que alteran la secuencia de aminoácidos silvestre de un serotipo en la una o más posiciones de aminoácido y en el uno o más bucles hasta una secuencia de aminoácidos que se encuentra en otros serotipos de HPV. Por ejemplo, si en un bucle la secuencia de aminoácidos para el serotipo X es ABCDEFG y en el mismo bucle en un serotipo diferente Y la secuencia de aminoácidos es ABHIJG (donde ABCDEFG y ABHIJFG son secuencias de aminoácidos diferentes) entonces AB y FG se conservan y CDE se puede mutar. Se pueden introducir mutaciones en el serotipo Y en C o D o E, o se pueden introducir en CD o DE o CE, o se pueden introducir en CDE. En estas realizaciones, C se puede mutar a H, D se puede mutar a I y E se puede mutar a J. En estas realizaciones, el uno o más bucles pueden tener la secuencia de aminoácidos de un serotipo (p. ej., Y) mientras que el resto de la proteína y el resto de los (bucles inalterados) son de un serotipo diferente (p. ej., X). En estas realizaciones, solo se muta una pequeña porción de la proteína de la cápside viral.
La Tabla 2 muestra ejemplos de un alineamiento de bucles FG de diferentes tipos de HPV:
Figure imgf000011_0001
Consenso:
FVRHX1FNRX2GX3X4G(E/D)X5 (V/I)PX6DLX7IX8G(S/T)—GX9X10 (A/G)
Xi iXi2X13X14Xi5X,6 (F/Y)(F/Y)X,7T
(SEQ ID NO: 11)
El ejemplo de la Tabla 2 muestra que se pueden introducir mutaciones en cualquier posición 'X' y se pueden introducir mutaciones conservativas en cualesquiera posiciones marcadas entre paréntesis, mientras que se mantienen iguales los aminoácidos conservados (negrita). Un experto normal en la especialidad, basándose en el ejemplo de la Tabla 2, puede alinear secuencias de HPV de cualquier número de virus HPV para cualquiera de los bucles hipervariables expuestos superficialmente y derivar los aminoácidos conservados y los que no están conservados sin experimentación excesiva usando programas de alineamiento bien conocidos .
En ciertas realizaciones, se pueden realizar uno o más cambios de aminoácido en uno o más bucles, cambiando los aminoácidos silvestres no conservados de un serotipo por los aminoácidos silvestres equivalentes de otro serotipo. Por ejemplo, según el ejemplo de la Tabla 2, el aminoácido silvestre de la posición 260 (L) del bucle FG de HPV 16 se puede alterar hasta (F), que es el aminoácido silvestre equivalente en la posición 261 de HPV31. Adicionalmente, el aminoácido silvestre de la posición 264 (A) del bucle FG de HPV16 se puede alterar hasta (S), que es el aminoácido silvestre equivalente en la posición 265 de HPV31, etc. De este modo, uno o más bucles de la proteína de la cápside viral de un serotipo (p. ej., el bucle FG de L1 de HPV16) se puede alterar para imitar más o menos estrechamente la secuencia de aminoácidos del bucle de la misma proteína de la cápside viral de otro serotipo (p. ej., bucle FG de L1 de HPV31) manteniendo silvestres todos los otros aminoácidos de la proteína de la cápside (p. ej., L1 de HPV16). En algunas realizaciones, alterar los aminoácidos de uno o más bucles que alojan los principales epítopos de un serotipo específico hasta aminoácidos localizados en las posiciones equivalentes del mismo bucle en un serotipo diferente, del modo descrito en la presente, reduce el reconocimiento de la partícula viral por anticuerpos específicos para HPV del sistema inmunitario de un individuo infectado con HPV. En algunas realizaciones, la nanopartícula de HPV alterada es inmunosilenciosa y no es reconocida por los anticuerpos específicos de HPV desarrollados por el sujeto infectado con HPV contra HPV. Por ejemplo, un sujeto inmunizado o infectado con HPV16 desarrolla anticuerpos específicos para HPV16. Si el sistema inmunitario encuentra VLP que comprenden proteína L1 silvestre derivada de HPV16, se producirá una respuesta inmunitaria. Sin embargo, si el sistema inmunitario encuentra VLP que comprenden proteína L1 derivada de HPV16 que está alterada de un modo descrito en la presente, (inicialmente) no se producirá una respuesta inmunitaria específica de HPV16. Después de una estimulación repetida con la VLP alterada, el sujeto que recibe la VLP alterada desarrollará una nueva respuesta inmunitaria dirigida contra la partícula. En este caso, se puede usar una VLP diferentemente alterada y/o una VLP procedente de otro serotipo para los métodos de tratamiento descritos en la presente.
Sorprendentemente, en algunas realizaciones, en las que uno o más bucles de la proteína de la cápside viral de un serotipo se alteran para imitar la estructura epitópica de los bucles de la proteína de la cápside viral de otro serotipo, la VLP que comprende la proteína de la cápside alterada no es reconocida por anticuerpos neutralizadores dirigidos contra cualquier serotipo. Según aspectos de la invención, aunque el bucle (p. ej., el bucle FG) contenga un epítopo principal, el serotipo está determinado por ese epítopo en el contexto del resto de la proteína de la cápside viral. Cuando solo se modifica el bucle sin cambiar la secuencia del resto de la proteína de la cápside viral, se obtiene un nuevo serotipo que sorprendentemente no es reconocido por contra el serotipo (o los serotipos cuando la secuencia del bucle se cambia desde la secuencia de un primer serotipo a la secuencia de un segundo serotipo) original. En algunas realizaciones, se pueden cambiar una o más posiciones para generar un nuevo serotipo mientras se retiene la capacidad para empaquetar y aportar un agente (p. ej., un ácido nucleico, por ejemplo un ARN o ADN, por ejemplo un ácido nucleico recombinante, por ejemplo un ácido nucleico terapéutico como el descrito en la presente).
En algunas realizaciones, una o más de las posiciones X1, X2 , X3 , X5 , X6 , X11 y X14 del bucle FG se pueden alterar para generar un nuevo serotipo que todavía es capaz de empaquetar y aportar un agente (p. ej., un ácido nucleico heterólogo que es diferente del ácido nucleico de HPV (p. ej., un ácido nucleico, por ejemplo un ARN o ADN, por ejemplo un ácido nucleico recombinante, por ejemplo un ácido nucleico terapéutico como el descrito en la presente). En algunas realizaciones, una o más de estas posiciones en una primera proteína L1 se cambian desde el aminoácido de un primer serotipo al aminoácido de un segundo serotipo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, todas las posiciones X1, X2 , X3 , X5 , X6, X11 y X14 se pueden cambiar desde una primera secuencia del serotipo de HPV (p. ej., una secuencia del serotipo HPV16) hasta una segunda secuencia del serotipo de HPV (p. ej., una secuencia del serotipo HPV31) en el contexto de la primera secuencia de L1 (p. ej., e1HPV16). En algunas realizaciones, solo X6, X11 y X14 se cambian desde un aminoácido de una primera secuencia del serotipo de HPV (p. ej., una secuencia del serotipo HPV16) hasta una segunda secuencia del serotipo de HPV (p. ej., una secuencia del serotipo de HPV31) en el contexto de la primera secuencia de L1 (p. ej., e1HPV16). En algunas realizaciones, cualquier combinación de X1, X2, X3 , X5, X6 , X11 y X14 (p. ej., cualesquiera 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 de las posiciones) se puede alterar desde un aminoácido de un primer serotipo hasta el aminoácido de un segundo serotipo sin cambiar el resto de la secuencia de L1. Se debe apreciar que los serotipos primero y segundo pueden ser cualesquiera serotipos adecuados (p. ej., HPV16, HPV31, HPV33, HPV 34, HPV35, HPV52, HPV58, HPV73, HPV91, o cualquier otro serotipo con secuencias del bucle FG específicas). También se debe apreciar que, en algunas realizaciones, una cualquiera o más de estas posiciones se puede cambiar por cualquier aminoácido conservativo o no conservativo (independientemente de si el cambio corresponde a un aminoácido procedente de otro serotipo presente en la naturaleza) en el contexto de una secuencia de L1 por lo demás inalterada o porción de la misma que retiene la capacidad de empaquetar y aportar un agente (p. ej., un ácido nucleico que es diferente del ácido nucleico de HPV natural, o cualquier otro agente como el descrito en la presente).
En algunas realizaciones, una partícula de HPV modificada que todavía puede empaquetar y aportar un agente no tiene una modificación en la posición X16 de la proteína L1. Por ejemplo, un HPV16 modificado puede tener uno o más cambios en otras posiciones pero retiene una asparagina (N) en la posición X16.
Se debe apreciar que los principales epítopos MAbs neutralizadores se han identificado en uno o más bucles que difieren entre serotipos de HPV. Por ejemplo, para HPV11 en el bucle DE, para HPV6 en los bucles BC y EF y para HPV33 en los bucles BC, DE y FG, para HPV16 en el bucle FG y para HPV31 en el bucle EF (como se describe, por ejemplo, en Fleury y cols. Prot. Sci. 2009). Usando la estrategia descrita en la presente, un experto normal puede alinear secuencias de otros bucles que se ha mostrado que comprenden epítopos principales para generar VLP modificadas adicionales.
También se debe apreciar que se puede realizar cualquier número de cambios (mutaciones, eliminaciones, adiciones) de aminoácidos en cualquier posición de aminoácido dentro de la proteína de la cápside viral (en uno o más de los bucles superficiales, en sitios que comprenden un aminoácido con grupos enfrentados internamente, o en cualquier otra posición en la proteína de la cápside) para modificar o alterar la inmunogenicidad o por cualquier otra razón (p. ej., para inducir o evitar cambios de conformación, para incrementar o disminuir grupos de aminoácidos cargados, para alterar la elección de la diana, para incrementar la biodisponibilidad, para inducir modificaciones específicas para incrementar la captación a través de una vía de administración específica), manteniendo la capacidad de la proteína de la cápside alterada para formar VLP y manteniendo la capacidad de las VLP resultantes para transferir agente o agentes terapéuticos a la célula diana.
Se debe apreciar además que se pueden introducir modificaciones de aminoácidos guiados por los que se enseña en la presente y por lo que se conoce en la especialidad acerca de epítopos lineales y de conformación situados dentro de los bucles. Se han identificado epítopos de conformación que, por ejemplo, pueden ser sitios de reconocimiento para anticuerpos neutralizadores o pueden ser sitios importantes para la elección de dianas celulares o pueden ayudar a la entrada en la célula por la VLP (como se describe, por ejemplo, en Fleury y cols. Prot. Sci. 2009 y Sadeyen y cols. Virology, 2002, 309:32-40). La modificación de uno o más aminoácidos dentro de los bucles se puede diseñar según los epítopos de conformación y puede comprender la modificación de uno o más aminoácidos que están conservados además de los que no están conservados.
En algunas realizaciones, se pueden insertar secuencias de aminoácidos en los bucles. Por ejemplo, se pueden insertar secuencias de aminoácidos cortas en uno o más bucles expuestos superficialmente. Las inserciones de secuencias de aminoácidos cortas pueden tener una longitud de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200 o 250 o cualquier longitud entre 4 aminoácidos y 250 aminoácidos. En ciertas realizaciones, las inserciones tienen una longitud de entre 4 y 50, 5 y 25 o 5 y 15 aminoácidos. Las inserciones se pueden insertar en cualquier lugar de los bucles. En algunas realizaciones, las inserciones se insertan aproximadamente en el medio de un bucle. Se apreciará que si se sabe que ciertos motivos son presentados por un cierto bucle y se desea mantener el motivo, la inserción se realizará fuera del motivo, bien N-terminal o bien C-terminal del motivo. Por otra parte, si se desea alterar un cierto motivo presentado en un cierto bucle, entonces la inserción se realizará dentro del motivo. El motivo puede ser lineal o estructural, esto es, se puede basar en la secuencia de aminoácidos primaria o su estructura secundaria (o terciaria). El motivo puede ser un motivo de reconocimiento celular, que puede facilitar la captación por VLP y/o el reconocimiento de células diana, o puede ser un epítopo que sea reconocido por ciertos anticuerpos o que se sepa que es antigénico. En algunas realizaciones, en las que se usan inserciones para promover la elección de dianas o la captación celular, las inserciones pueden comprender, por ejemplo, dominios de elección de diana virales. Se apreciará que estos dominios no se limitan a HPV. Los dominios de elección de diana virales se pueden derivar de cualquier virus para elegir como diana cualquier célula que se desee. Las inserciones también pueden comprender, por ejemplo, motivos de reconocimiento celular específicos del hospedador, tales como motivos de reconocimiento de receptores. En algunas realizaciones, las inserciones pueden comprender secuencias de aminoácidos que comprenden epítopos para etiquetas de afinidad, tales como, p. ej., Strep Tag™ (STII, WSHPQFEK, SEQ ID NO: 12).
En algunas realizaciones, se usan inserciones para estimular una respuesta inmunitaria. En estas realizaciones, las inserciones pueden comprender uno o más epítopos (p. ej., un polítopo) de origen viral (p. ej., de diversos serotipos de HPV). Por ejemplo, se puede construir un polítopo que comprende regiones antigénicas (epítopos) de la proteína L1 de diversos serotipos de HPV, p. ej., HPV16, 18, 31, 33 y 45. En algunas realizaciones, se pueden insertar regiones de la proteína L2.
En algunas realizaciones, las inserciones de uno o más epítopos generarán una respuesta inmunitaria en un sujeto al uno o más epítopos. En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria confiere protección contra la reinfección con un virus (p. ej., HPV) y/o la repoblación de un virus (p. ej., originada a partir del virus restante después del tratamiento antiviral) y/o la recurrencia de un cáncer asociado a virus (p. ej., originado a partir de las células cancerosas viralmente transformadas restantes después del tratamiento anticanceroso).
En algunas realizaciones, se pueden ligar péptidos a la superficie de VLP para inducir una respuesta inmunitaria alterada o amplificada (p. ej., si el péptido comprende uno o más epítopos) o para alterar o amplificar la elección de dianas y/o la captación celular de la VLP (p. ej., si el péptido comprende uno o más receptores celulares). Por ejemplo, la VLP puede tener un dominio de unión a albúmina para potenciar su transporte a través de los vasos sanguíneos o un péptido para potenciar la transcitosis (p. ej., un motivo de unión a integrina (RGD) que potencia la transcitosis basal a apical; restos de sulfato de heparano u otros restos) y/o un dominio de unión específico de un receptor para potenciar su captación por las células elegidas como diana (p. ej., péptido de unión a EGFR) y/o péptidos que potencian el transporte endosómico y/o nuclear.
En algunas realizaciones, los péptidos se pueden ligar a través de reticulación química usando un conector adecuado, p. ej., glutaraldehído, imidoéster y BS(PEG)9, BS(PEG)5, DTSSP, EDC, SM(PEG)2, SMCC y sulfoSMCC (Thermo scientific).
En algunas realizaciones, los péptidos se pueden ligar a través de etiquetas de afinidad, tales como StrepTag™. En algunas realizaciones, los péptidos tienen una longitud de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 o 500 aminoácidos.
En ciertas realizaciones, la proteína L1 y la proteína L1+L2 se pueden producir recombinantemente. En ciertas realizaciones, la proteína L1 y la proteína L1+L2 producidas recombinantemente se pueden autoensamblar para formar partículas similares a virus (VLP). La producción recombinante se puede producir en un sistema hospedador bacteriano, de insecto, de levadura o de mamífero. La proteína L1 se puede expresar o la proteína L1+L2 se pueden coexpresar en el sistema hospedador.
Métodos para expresar y purificar proteínas virales recombinantes L1 y L2 en sistemas hospedadores, métodos para el desensamblaje y el reensamblaje de nanopartículas de HPV o VLP y ejemplos de modificaciones en las secuencias de aminoácidos de L1 y L2, la administración de VLP a sujetos y composiciones farmacéuticas que comprenden VLP son muy conocidos en la especialidad y se enseñan en la presente. Por ejemplo, las Patentes de EE. UU. N°: 6.416.945, 6.991.795 y 7.205.126. Sin embargo, se apreciará que los métodos y los modos proporcionados en la presente no se limitan a los descritos en las susodichas patentes de EE. UU. También se pueden emplear otros métodos y modos conocidos por los expertos en la especialidad.
En ciertas realizaciones, las nanopartículas de HPV o las VLP se cargan con uno o más agentes terapéuticos. Las nanopartículas de HPV se pueden cargar al desensamblar y reensamblar partículas virales L1 o L1 y L2, como se describe en la presente. Sales que son útiles para ayudar al desensamblaje/reensamblaje de proteínas de la cápside viral en VLP incluyen sales de Zn, Cu y Ni, Ru y Fe. Se pueden usar otros métodos de carga. En algunas realizaciones, las nanopartículas de HPV se pueden cargar con uno o más agentes terapéuticos.
En algunas realizaciones, las nanopartículas de HPV que comprenden proteína L1, o proteína L1 y L2 comprenden además uno o más agentes terapéuticos. En ciertas realizaciones, el agente terapéutico comprende una o más moléculas de ARNsi o uno o más ácidos nucleicos (p. ej., un plásmido u otro vector) cada uno de los cuales es capaz de expresar una o más moléculas de ARNsi. En algunas realizaciones, el agente terapéutico comprende uno o más ácidos nucleicos antisentido (p. ej., anti-E6 y/o anti-E7) uno o más ácidos nucleicos (p. ej., un plásmido u otro vector) que son capaces cada uno de expresar uno o más ácidos nucleicos antisentido. En algunas realizaciones, las nanopartículas de HPV comprenden combinaciones de dos o más agentes terapéuticos.
En algunas realizaciones, el agente terapéutico es un inductor de la interferencia de ARN u otro inductor del silenciamiento génico. Un inductor de la interferencia de ARN puede ser un ARNsi, un ARNsh, una molécula de ácido nucleico híbrida que comprende una primera parte que comprende una molécula de ácido ribonucleico (ARN) doble y una segunda parte que comprende una molécula de ácido desoxirribonucleico (ADN) monocatenario, un ARN bicatenario más largo o una construcción de ADN para la expresión de ARNsi o secuencias de ARN más largas. Otros inductores del silenciamiento génico incluyen inductores de la metilación de ADN, o ribozimas o aptámeros. En otras realizaciones, el agente terapéutico puede ser un modulador de la expresión génica tal como un APN (ácido peptidonucleico).
La interferencia de ARN la interferencia de ARN (iARN) es un procedimiento por el que la introducción de ARN bicatenario (ARNds) en una célula inhibe la expresión génica postraduccionalmente, de un modo dependiente de la secuencia. La iARN puede estar mediada por ARNdss cortos (por ejemplo 19-25 nucleótidos) o ARNs' interferentes pequeños (ARNsi). El ARNds se escinde en la célula para crear ARNsis que están incorporados en un complejo silenciador inducido por ARN (RISC), guiando el complejo hasta un ARNm endógeno homólogo, escinden el transcrito de ARNm y dando como resultado la destrucción del ARNm.
Para inducir la interferencia de ARN en una célula, se puede introducir ARNds en la célula como un fragmento de ácido nucleico aislado o a través de un transgén, un plásmido o un virus. En ciertas realizaciones, se usan VLP para aportar ARNds a las células diana.
En algunas realizaciones, se expresa en la célula una molécula de ARN de horquilla corto (ARNsh). Un ARNsh comprende repeticiones cortas invertidas separadas por una pequeña secuencia de bucle. Una repetición invertida es complementaria a la diana génica. A continuación, el ARNsh se procesa en un ARNsi que degrada el ARNm del gen diana. Los ARNshs se puede producir dentro de una célula con una construcción de ADN que codifica la secuencia de ARNsh bajo el control de un promotor de ARN polimerasa III, tal como el promotor HI o 7SK humano. Alternativamente, el ARNsh puede sintetizarse exógenamente e introducirse directamente en la célula, por ejemplo a través de aporte con VLP. En ciertas realizaciones, la secuencia de ARNsh tiene una longitud de entre 40 y 100 bases o una longitud de entre 40 y 70 bases. El tallo de la horquilla, por ejemplo, tiene una longitud entre 19 y 30 pares de bases. El tallo puede contener apareamientos G-U para estabilizar la estructura de horquilla.
Las secuencias de ARNsi se seleccionan sobre la base de su homología con el gen diana. La homología entre dos secuencias nucleotídicas se puede determinar usando una variedad de programas incluyendo el programa BLAST (Altschul y cols. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10) o BestFit (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EE. UU. de A., Wisconsin 53711). Las comparaciones de secuencias se pueden realizar usando FASTA y FASTP (véase Pearson & Lipman, 1988. Methods in Enzymology 183: 63-98). Herramientas para el diseño y la calidad de ARNsis, ARNshs y/o ARNmis se conocen en la especialidad. Un sistema de software en línea basado en Internet para diseñar secuencias de ARNsi y secuencias de ARNsi desordenadas son, por ejemplo, siDirect, siSearch, SEQ2SVM, Deqor, ARNsi Wizard (InvivoGen). La especificidad se puede predecir usando, por ejemplo, SpecificityServer, miRacle. Las secuencias diana se pueden investigar, por ejemplo, en HuSiDa (base de datos de ARNsi humanos) y RNAsidb (una base de datos de secuencias de ARNsi). La comparación de secuencias se puede realizar a lo largo de toda la longitud de la secuencia pertinente, o más preferiblemente a lo largo de una secuencia contigua de aproximadamente o 10, 15, 20, 25 o 30 bases. En ciertas realizaciones, el grado de homología entre el ARNsi y el gen diana es al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 97% o al menos 99%, o 100%. El ARNsi puede tener una longitud entre 10 pb y 30 pb, o entre 20 pb y 25 pb, o el ARNsi tiene una longitud de 20, 21 o 22 pb.
La presencia de la iARN se puede detectar al transfectar células cultivadas con el ARNsi, seguido por RT-PCR del ARNm de interés. Cuando se induce iARN mediante el ARNsi, los niveles del ARNm de interés se reducirán en células transfectadas en comparación con células de control. Una reducción en la producción de proteína se puede confirmar mediante la transferencia Western de lisados celulares seguida por sondeo con un anticuerpo reactivo a la proteína de interés.
En algunas realizaciones, el gen que se va a silenciar es un gen E6 o E7 de HPV. La secuencia de ARNsi puede ser cualquier secuencia contigua de 10-30 pb procedente de una cualquiera de las secuencias de los genes E6 o E7, p. ej., las de HPV16 o HPV18, que induzca iARN. Alternativamente, se pueden usar fragmentos de ARNds más largos que comprenden secuencias contiguas procedentes de estas secuencias, ya que se escindirán para formar ARNsis dentro de la célula.
Las moléculas de ARNsi también se pueden sintetizar usando técnicas de síntesis en solución o fase sólida estándar que son conocidas en la especialidad. ARNsis sintéticos contra ARNms que codifican HPV-16 E6 y HPV-18 E6, respectivamente, se pueden obtener comercialmente (por ejemplo, de Dharmacon Research, Lafayette, EE. UU. de A.).
En algunas realizaciones, el ARNsi tiene un saliente en uno o ambos extremos de una o más bases de desoxitimidina para incrementar la estabilidad del ARNsi dentro de las células al reducir su sensibilidad a la degradación por nucleasas.
En algunas realizaciones, el ARNsi es una molécula de ácido nucleico híbrida que comprende una primera parte que comprende una molécula de ácido ribonucleico (ARN) doble y una segunda parte que comprende una molécula de ácido desoxirribonucleico (ADN) monocatenaria.
Las conexiones entre nucleótidos pueden ser enlaces fosfodiéster o alternativas, por ejemplo, grupos de conexión de la fórmula P (O) S, (tioato) ; P (S) S, (ditioato); P (O) NR'2 ; P (O) R'; P (O) OR6; CO; o CONR'2 en donde R es H (o una sal) o alquilo (1 -12C) y R6 es alquilo (1-9C) está enlazado a nucleótidos adyacentes a través de -O- o -S-. Se pueden usar bases nucleotídicas modificadas además de las bases presentes en la naturaleza. Por ejemplo, las bases modificadas pueden incrementar la estabilidad de la molécula de ARNsi, reduciendo de ese modo la cantidad requerida para el silenciamiento. El término nucleótido modificado abarca nucleótidos con una base y/o un azúcar covalentemente modificados. Por ejemplo, los nucleótidos modificados incluyen nucleótidos que tienen azúcares que están ligados covalentemente a grupos orgánicos de bajo peso molecular distintos de un grupo hidroxilo en la posición 3' y distintos de un grupo fosfato en la posición 5'. Así, los nucleótidos modificados también pueden incluir azúcares sustituidos en 2' tales como 2'-0-metil- ; 2-0-alquil; 2-0-alil; 2'-S-alquil; 2'-S-alil; 2'-fluoro-; 2'-halo o 2; azidoribosa, análogos sacáricos carbocíclicos azúcares a-anómeros; azúcares epímeros tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares de piranosa, azúcares de furanosa y sedoheptulosa.
Los nucleótidos modificados son conocidos en la especialidad e incluyen purinas y pirimidinas alquiladas, purinas y pirimidinas aciladas y otros heterociclos. Estas clases de pirimidinas y purinas se muestran en la especialidad e incluyen pseudoisocitosina, N4, N4-etanocitosina, 8-hidroxi-N6-metiladenina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroxilmetil)uracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, inosina, N6-isopentil-adenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudouracilo, 1-metilguanina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, -D-manosilqueosina, 5metoxicarbonilmetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, éster metílico de ácido uracil-5-oxiacético, psueouracilo, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico de ácido N-uracil-5-oxiaceético, ácido uracil-5-oxiacético, queosina, 2-tiocitosina, 5-propiluracil, 5-propilcitosina, 5-etiluracilo, 5-etilcitosina, 5-butiluracilo, 5-peniluracilo, 5-pentilcitosina y 2,6-diaminopurina, metilpsuedouracilo, 1-metilguanina, 1-metilcitosina.
En algunas realizaciones, las moléculas de ARNsi o moléculas de ARNds más largas se pueden elaborar recombinantemente mediante la transcripción de una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo contenido dentro de un vector como se describe en la presente. El vector puede ser cualquier vector de ARN o ADN.
El vector puede ser un vector de expresión, en el que la secuencia nucleotídica está conectada operativamente a un promotor compatible con la célula. Promotores adecuados para el uso en diversos sistemas de vertebrados son muy conocidos en la especialidad. Por ejemplo, promotores adecuados incluyen promotores virales tales como promotores de retrovirus de mamífero o virus de ADN, p. ej. promotores de MLV, CMV, RSV, SV40 IEP (promotor temprano inmediato) y adenovirus y promotor de metalotioneína. También se pueden usar promotores de mamífero fuertes. Se apreciará que también se pueden usar variantes de estos promotores que retienen actividad de transcripción sustancialmente similares.
En algunas realizaciones, el vector puede tener al menos dos promotores, uno para dirigir la expresión de la cadena de sentido y uno para dirigir la expresión de la cadena antisentido del ARNds. En otras realizaciones, se pueden usar dos vectores, uno para la cadena de sentido y uno para la cadena antisentido. Alternativamente, el vector puede codificar ARNs que forman estructuras de tallo-bucle que posteriormente son escindidas por la célula para producir ARNds.
La construcción de ácido nucleico puede contener un promotor o represor de la expresión génica celular, viral u otro, específico. El promotor o represor se puede diseñar para reflejar el contexto de la célula en la que se introduce la construcción. Por ejemplo, la construcción puede contener un promotor viral de modo que la expresión a partir de la construcción dependa de la presencia de una proteína viral, de modo que la construcción se exprese solamente en células infectadas viralmente. De forma similar, la construcción puede tener un promotor o represor específico para ciertos tipos de células o para ciertas fases de desarrollo. Por ejemplo, cuando el vector es para el uso en una célula infectada viralmente tal como células infectadas con HPV, se puede usar un promotor viral que coincide con el virus causante de la enfermedad. p. ej. un promotor de HPV (tal como el promotor que provoca la expresión de HPV16 E6/E7) para células infectadas con HPV. En estas realizaciones, el vector solo se expresará en las células infectadas viralmente.
En ciertas realizaciones, el agente terapéutico de ARNsi se dirige contra agentes que promueven o median en la muerte celular o la apoptosis de la célula diana. En ciertas realizaciones, el agente terapéutico de ARNsi se dirige contra proteínas virales de HPV. En algunas realizaciones, las proteínas virales que son elegidas como diana por moléculas de ARNsi son E6 y/o E7 virales. Se ha encontrado que ARNsi de E6 es potente en la supresión de la expresión de oncogenes virales y ARNsi de E6 exhibe una potente actividad inhibidora del crecimiento (Yoshinouchi y cols., 2003). El silenciamiento de E7 producido por ARNsi induce la muerte celular apoptótica. Sin querer limitarse por una teoría particular, se ha descrito que los ARNs interferentes pequeños (si) sintéticos, específicamente dirigidos contra el oncogén de E7 de HPV antiapoptótico, restauran rutas supresoras de tumores durmientes en células cancerosas positivas a HPV que de otro modo son inactivas en presencia de E7 conduciendo a apoptosis y muerte celular. En algunas realizaciones, el silenciamiento de E7 por ARNsi puede ser suficiente para conducir a la apoptosis de la célula hospedadora infectada, sin la necesidad de inhibir E6. (Milner y cols.). ARNsis para E6 y E7 virales se describen, por ejemplo, en Butz y cols. (Oncogene (2003) 22, 5938-5945) y Milner y cols. (Solicitudes de patente 0117359.0 y 0216929.0 y documento WO 2005/051431).
En ciertas realizaciones, E6 de HPV-16 y E6 de HPV-18 pueden ser elegidos específicamente como diana por ARNsi. En ciertas realizaciones, la secuencia diana respectiva para E6 de HPV-16 es 5'-UACAACAAACCGUUGUGUG (SEQ ID NO: 13, nucleótidos 377-395). En ciertas realizaciones, la secuencia diana respectiva para E6 de HPV-18 es 5'-CUAACUAACACUGGGUUAU (SEQ ID NO: 14, nucleótidos 381-399) (como se describe en Butz y cols.).
En otras realizaciones, las construcciones de ARNsi de E6 y E7 son:
E6 (directo): 5' GAGGUAUAUGACUUUGCUUTT (SEQ ID NO: 15);
E6 (inverso): TTCUCCAUAUACUGAAACGAA 5' (SEQ ID NO: 16) y
E7 (directo): 5' AGGAGGAUGAAAUAGAUGGTT (SEQ ID NO: 17);
E7 (inverso): TTUCCUCCUACUUUAUCUACC 5' (SEQ ID NO: 18)
(como se describe en Milner, documento WO 2005/051431).
En otras realizaciones, las construcciones de ARNsh de E6 y E7 son:
Tabla 3
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(como se describe en Bousarghin y cols, Mol Cancer Ther, 2009, 8:357-365).
En ciertas realizaciones, los aminoácidos de las proteínas silvestres virales, tales como L1 y/o L1+L2, que se ensamblan en las nanopartículas de HPV están mutados y/o sustituidos y/o eliminados. En ciertas realizaciones, estos aminoácido están modificados para potenciar la carga positiva del interior de la VLP. En ciertas realizaciones, se introducen modificaciones para permitir una interacción electrostática más fuerte de la molécula de ARNsi con uno o más de los aminoácidos enfrentados al interior de la VLP y/o para evitar la fuga del ARNsi de la nanopartícula de HPV.
Los ácidos nucleicos están altamente cargados y no cruzan membranas celulares mediante difusión libre. Adicionalmente, el carácter hidrófilo y el esqueleto aniónico de los ARNsis reduce su captación por las células. En ciertas realizaciones, se puede aportar ARNsi antiviral terapéutico a un sujeto administrando nanopartículas de HPV para incrementar la captación celular (atravesar barreras de membrana biológica in vivo) y/o la biodisponibilidad del ARNsi.
Se debe apreciar que las composiciones de VLP que comprenden agentes que promueven la apoptosis en células infectadas con HPV solo son particularmente útiles en algunas realizaciones, debido a que eligen como diana células que están infectadas por HPV (p. ej., los componentes superficiales de VLP eligen como diana el mismo tipo de célula que es elegido como diana por HPV naturalmente infeccioso) y aportan agentes que destruyen las células infectadas con HPV. Estas composiciones se pueden usar para curar infecciones por HPV en algunas realizaciones. En algunas realizaciones, no se requiere tratamiento crónico con la condición de que se usen dosificaciones adecuadas (p. ej., dosificaciones individuales o un curso de tratamiento a lo largo de un período de tratamiento predeterminado, pero no crónico) para destruir las células infectadas con HPV. Sin embargo, en algunas realizaciones, las composiciones pueden no ser suficientes para destruir todas las células infectadas con HPV y se requiere más de un curso de tratamiento y/o tratamiento crónico. En algunas realizaciones, se pueden usar composiciones de VLP que comprenden agentes antivirales (en oposición a agentes proapoptóticos) para tratamientos crónicos.
En ciertas realizaciones, el agente terapéutico es un agente anticanceroso. En una realización preferida, el agente anticanceroso es gemcitabina.
En ciertas realizaciones, el agente terapéutico es un agente quimioterapéutico, por ejemplo, metotrexato, vincristina, adriamicina, cisplatina, cloroetilnitrosoureas que no contienen azúcares, 5-fluorouracilo, mitomicina C, bleomicina, doxorrubicina, dacarbazina, taxol, fragilina, meglamina GLA, valrrubicina, carmustaína y poliferposano, MMI270, BAY 12-9566, inhibidor de famesil transferasa de RAS, inhibidor de famesil transferasa, MMP, MTA/LY231514, LY264618/lometexol, Glamolec, CI-994, TNP-470, Hycamtin/topotecano, PKC412, Valspodar/PSC833, Novantron/mitroxantrona, Metaret/suramina, batimastat, E7070, BCH-4556, CS-682, 9-AC, AG3340, AG3433, Incel/VX-710, VX-853, ZD0101, ISI641, ODN 698, TA 2516/marmistat, BB2516/marmistat, CDP 845, D2163, PD183805, DX8951f, nemonal DP 2202, FK 317, Picibanil/OK-432, AD 32/valrrubicina, Metastron/derivado de estroncio, Temodal/temozolomida, Evacet/doxorrubicina liposómica, Yewtaxan/paclitaxel, Taxol/paclitaxel, Xeload/capecitabina, Furtulon/doxifluridina, Cyclopax/paclitaxel oral, taxoide oral, SPU-077/cisplatino, HMR 1275/flavopiridol, CP-358 (774)/EGFR, CP-609 (754)/inhibidor del oncogén RAS, BMS-182751/platino oral, UFT(tegafur/uracilo), ergamisol/levamisol, eniluracilo/776C85/potenciador de 5FU, campto/levamisol, camptosar/irinotecano, tumodex/ralitrexed, leustatina/cladribina, Paxex/paclitaxel, doxilo/doxorrubicina liposómica, caelix/doxorrubicina liposómica, Fludara/fludarabina, Pharmarubicin/epirrubicina, DepoCyt, ZD1839, LU 79553/bisnaftalimida, LU 103793/dolastaína, Caetix/doxorrubicina liposómica, Gemzar/gemcitabina, ZD 0473/Anormed, YM 116, semillas de yodo, inhibidores de CDK4 y CDK2, inhibidores de PARP, D4809/dexifosamida, Ifes/Mesnex/ifosamida, Vumon/tenipósido, paraplatino/carboplatino, Plantinol/cisplatino, Vepeside/etopósido, ZD 9331, Taxotere/docetaxel, profármaco de arabinósido de guanina, análogo de taxano, nitrosoureas, agentes alquilantes tales como melfelano y ciclofosfamida, aminoglutetimida, asparaginasa, busulfano, carboplatino, clorombucilo, HCI de citarabina, dactinomicina, HCl de daunorrubicina, fosfato sódico de estramustina, etopósido (VP16-213), floxuridina, fluorouracilo (5-FU), flutamida, hidroxiurea (hidroxicarbamida), Iifosfamida, interferón alfa-2a, alfa-2b, acetato de leuprolida (análogo de factor de liberación de LHRH), lomustina (CCNU), HCl de mecloretamina (mostaza nitrogenada), mercaptopurina, mesna, mitotano (o.p'-DDD), HCl de mitoxantrona, octreótido, plicamicina, HCl de procarbazina, estreptozocina, citrato de tamoxifeno, tioguanina, tiotepa, sulfato de vinblastina, amsacrina (m-AMSA), azacitidina, ertropoyetina, hexametilmelamina (HMM), interleucina 2, mitoguazona (metil-GAG; bisguanilhidrazona de metilglioxal; MGBG), pentostatina (2'-desoxicoformicina), semustina (metil-CCNU), tenipósido (VM-26) o sulfato de vindesina, pero no limitados a estos.
En ciertas realizaciones, el agente terapéutico es un agente inmunoterapéutico, por ejemplo, Ributaxin, Herceptin, Quadramet, Panorex, IDEC-Y2B8, BEC2, C225, Oncolym, SMART M195, ATrAGe N, Ovarex, Bexxar, LDP-03, ior t6, MDX-210, MDX-11, MDX-22, OV103, 3622W94, anti-VEGF, Zenapax, MDX-220, MDX-447, MELIMMUNE-2, MELIMMUNE-1, CEACIDE, Pretarget, NovoMAb-G2, TNT, Gliomab-H, g Ni-250, EMD-72000, LymphoCide, CMA 676, Monopharm-C, 4B5, ior egf.r3, ior c5, BABS, anti-FLK-2, MDX-260, ANA Ab, SMART 1D10 Ab, SMART ABL 364 Ab o ImmuRAIT-CEA, pero no limitados a estos.
En ciertas realizaciones, el agente terapéutico es un agente antiviral. Ejemplos de agentes antivirales son: polisulfatos (PVAS), polisulfonatos (PVS), policarboxilatos, polioxometalatos, ácido chicórico, zintevir, derivados de cosalano, biciclams (es decir, AMD3100), T-22, T-134, ALX-40-4C, CGP-64222, TAK-779, a Zt (azidotimidina), ddI, ddC, d4T (dideshidrodidesoxitimidina), 3TC (3'-tiadidesoxicitidina), ABC y otros análogos de ddN (2',3'-didesoxinucleósido), nevirapina, delavirdina, efavirenz, emivirina (MKC-442), capravirina, tiocarboxanilida UC-781, aciclovir, valaciclovir, penciclovir, famciclovir, bromovinildesoxiuridina (BVDU, brivudia), cidofovir, adefovir dipivoxil, tenofovir disoproxil, ribavirina, valaciclovir, ganciclovir, formivirseno, foscarnet, EICAR (5-etinil-1 -p-D-ribofuranosilimidazol-4-carboxamida), ácido micofenólico, neplanocina A, 3-desazaneplanocina A, 6'-C-metilneplanocina A, DHCeA (9-(trans-2',trans-3'-dihidroxiciclopent-4'-enil)adenina) o c3DHCeA (9-(trans-2',trans-3'-dihidroxiciclopent-4'-enil)-3-desazaadenina), como se describe, por ejemplo, en De Clercq J Pharmacol Exp Ther 2001,297: 1-10, pero no limitados a estos.
En algunas realizaciones, el tratamiento con ARNi que se describe en la presente comprende además el tratamiento con cidofovir. El cidofovir es un fármaco antiviral usado para tratar, por ejemplo, papilomatosis laríngea inducida por HPV. El cidofovir también tiene actividad en células de carcinoma de cuello uterino. El cidofovir se puede administrar antes, simultáneamente o después del tratamiento con ARNi (p. ej., ARNsi o ARNsh específicos para E6 o E7) basado en VLP. En algunas realizaciones, el cidofovir se administra simultáneamente con la molécula de ARNi y es aportado por las VLP descritas en la presente.
Agentes terapéuticos adicionales son, por ejemplo, inhibidores de la transducción de señales, por ejemplo, inhibidores de serina-treonina cinasas, inhibidores de Ras/MAPK, inhibidores del receptor de factor de crecimiento insulínico, inhibidores de EGFR y/o PDGFR, agentes antiangiongénicos como inhibidores de VEGF y/o VEGFR, moduladores e inhibidores de PARP, inhibidores de la ruta del erizo, agentes relacionados con la inhibición de las rutas metabólicas, interferón beta, TDF o cPrPMEDAP.
En ciertas realizaciones, nanopartículas de HPV que comprenden uno o más agentes terapéuticos se administran a un sujeto infectado con HPV en una cantidad suficiente para tratar al sujeto. En ciertas realizaciones, el tratamiento de un sujeto que tiene infección por HPV con nanopartículas de HPV que comprenden uno o más agentes terapéuticos comprende además la administración de un agente anticanceroso y/o antiviral. Estos agentes se pueden coadministrar en el mismo momento o en un momento diferente, por ejemplo antes o después de la administración de nanopartículas de HPV que comprenden uno o más agentes terapéuticos.
En ciertas realizaciones, nanopartículas de HPV que comprenden uno o más agentes terapéuticos se administran tópicamente a un sujeto infectado con HPV. La administración tópica puede incluir administrar las nanopartículas de HPV que comprenden uno o más agentes terapéuticos en la forma de una composición o formulación farmacéutica adecuada. En ciertas realizaciones, la composición o formulación farmacéutica adecuada para la administración tópica puede ser un gel o una crema. El gel o la crema se pueden aplicar, en ciertas realizaciones, a membranas mocosas.
En ciertas realizaciones, nanopartículas de HPV que comprenden uno o más agentes terapéuticos se administran a tejidos epiteliales con superficies mucosas, por ejemplo para el tratamiento carcinomas de cuello uterino o colorrectal. En estas realizaciones, la composición farmacéutica que comprende nanopartículas de HPV comprende además una sustancia mucoadhesiva, tal como un polímero. Una sustancia mucoadhesiva es cualquier formulación que se adhiera a una superficie mucosa que reviste una cavidad o superficie corporal incluyendo la superficie luminal del epitelio gastrointestinal, de el epitelio colorrectal y del cuello uterino. Las capas celulares epiteliales mucosas son ricas en una secreción viscosa (moco). Los polímeros mucoadhesivos tienen la capacidad de adherirse a superficies del tejido mucoso húmedas o mojadas tales como las del epitelio colorrectal o del epitelio del cuello uterino.
Se pueden utilizar muchos polímeros para formar geles, cremas u otras sustancias adhesivas, por ejemplo, un gel, tal como un hidrogel, organogel o gel termorreversible. Otros tipos de polímeros útiles incluyen, pero no se limitan a, termoplásticos y películas. El polímero puede ser, por ejemplo, poli(óxido de etileno), poli(etilenglicol), poli(alcohol vinílico), poli(vinilpirrolidina), poli(ácido acrílico), poli(metacrilato de hidroxietilo), hidroxietiletilcelulosa, hidroxietilcelulosa y quitosano y mezclas de los mismos, polisacáridos (agar) o carboximetilcelulosa. En algunas realizaciones, los geles, las cremas u otras sustancias adhesivas pueden contener otros materiales que proporcionan un efecto mucoadhesivo. Estos materiales incluyen dióxido de titanio, dióxido de silicio y arcillas.
La composición farmacéutica se puede aplicar directamente, por ejemplo como un gel, o puede estar comprendida dentro de un parche premontado u otro dispositivo que permite la yuxtaposición del gel con los tejidos o las células que se van a elegir como diana (como se describe, por ejemplo, en el documento WO 2005/051431 de Milner y cols.). Por ejemplo, se podría emplear un parche que comprende una capa bioadhesiva o una capa mucoadhesiva ligada a una capa de soporte (que comprende por ejemplo poli(cloruro de vinilo) o hidroxipropilcelulosa) de flexibilidad adecuada para ajustarse a la arquitectura tisular de la superficie del cuello uterino para el aporte terapéutico de las nanopartículas de HPV que comprenden los agentes terapéuticos y opcionalmente agentes terapéuticos adicionales (tales como agentes anticancerosos y/o antivirales) a los tejidos del cuello uterino. Las propiedades físicas del parche se deben retener idealmente durante de varias horas a uno o más días sin molestias para la paciente y sin desplazamiento del parche durante los movimientos corporales normales.
En algunas realizaciones, la nanopartícula de HPV que comprende uno o más agentes terapéuticos se puede proporcionar en la forma de un gel tal como una preparación de propilenglicol metilcelulosa para la aplicación a una zona diana a la que se desea prestar atención. Los geles se pueden proporcionar en un tubo, tal como 50 mg del ingrediente activo suspendido en el gel. Estos geles son particularmente convenientes para la aplicación a la piel u otra superficie epitelial (por ejemplo la zona del cuello uterino o la anogenital).
En algunas realizaciones, el gel se distribuye desde un tubo aplicador alargado (tal como un aplicador rectal o vaginal), por ejemplo para aplicarlo rectalmente o intravaginalmente. Sin embargo, se debe apreciar que una composición descrita se puede administrar en cualquier forma adecuada para alcanzar células infectadas con HPV u otras células diana. Por ejemplo, las composiciones se pueden proporcionar en la forma de supositorios, cápsulas, cremas, geles, espumas, pulverizaciones, aerosoles y/o sobre la superficie de o impregnadas dentro de un material que se puede poner en contacto con una región diana (p. ej., oral, de la garganta, del cuello uterino, vaginal, anal, etc.) o cualquier combinación de dos o más de los mismos.
En algunas realizaciones, la nanopartícula de HPV que comprende uno o más agentes terapéuticos también se puede aplicar como una crema o cristales simples o una pella que se puede aplicar sobre o insertada en la superficie epitelial o la piel con una aguja de trocar de calibre 16 para tratamientos a corto plazo.
Se debe apreciar que las composiciones descritas se pueden administrar a un sujeto infectado con HPV (p. ej., un sujeto diagnosticado o que se sabe que tiene una infección persistente por HPV de alto riesgo) a fin de tratar una displasia o un cáncer y/o prevenir el desarrollo de una displasia o un cáncer u otra afección asociada con una infección por HPV. Sin embargo, en algunas realizaciones, las composiciones se pueden administrar (p. ej., profilácticamente) a un sujeto con una infección persistente por HPV de alto riesgo que se sospecha que tiene alto riesgo de ser infectado con otro serotipo de infección por HPV de alto riesgo.
Cuando una composición como la descrita en la presente se va a administrar a un individuo, la administración es en una "cantidad profilácticamente eficaz" o una "cantidad terapéuticamente eficaz". La composición final se administra según sea necesario, lo que dependerá de la enfermedad que se vaya a tratar y el tamaño de la zona afectada. La administración puede ser, por ejemplo, diaria, semanal o mensual.
El término "cantidad eficaz" de una composición se refiere a la cantidad necesaria o suficiente para que una composición sola, o junto con dosis adicionales, consiga un efecto biológico deseado. La respuesta deseada, por supuesto, dependerá de la afección particular que se trate. Combinado con las enseñanzas proporcionadas en la presente, al elegir entre los diversos compuestos activos y factores de ponderación tales como la potencia, la biodisponibilidad relativa, el peso corporal del paciente, la gravedad de los efectos secundarios adversos y el modo de administración preferido, se puede planear un régimen de tratamiento profiláctico o terapéutico que no provoque una toxicidad sustancial y sin embargo sea totalmente eficaz para tratar al sujeto particular. La cantidad eficaz para cualquier aplicación particular puede variar dependiendo de factores tales como la enfermedad o el estado adverso que se trate, el tamaño del sujeto o la gravedad de la enfermedad o el estado adverso. Generalmente, se prefiere que se use una dosis máxima de los componentes individuales o las combinaciones de los mismos, esto es, la dosis segura más alta según el juicio médico razonable. Sin embargo, se entenderá por los expertos normales en la especialidad que un paciente puede insistir en una dosis inferior o dosis tolerable por razones médicas, razones psicológicas o virtualmente por cualesquiera otras razones. Un experto normal en la especialidad puede determinar empíricamente la cantidad eficaz sin necesitar una experimentación excesiva.
Para cualquier compuesto descrito en la presente, la cantidad terapéuticamente eficaz se puede determinar inicialmente a partir de modelos animales. Una dosis terapéuticamente eficaz también se puede determinar a partir de datos para compuestos que se sabe que exhiben actividades farmacológicas similares, tales como otras nanopartículas. La dosis aplicada se puede ajustar basándose en la biodisponibilidad relativa y la potencia del compuesto administrado. Ajustar la dosis para alcanzar una eficacia máxima basándose en los métodos descritos anteriormente y otros métodos que son muy conocidos en la técnica está totalmente dentro de las capacidades del experto normal.
En ciertas realizaciones, se describen métodos composiciones para el tratamiento de un sujeto. El sujeto puede ser un mamífero. Según se usa en la presente, los términos "tratar", "tratado" o "tratamiento", cuando se usan con respecto a un estado adverso, tal como un trastorno o una enfermedad, por ejemplo, un cáncer, displasia o neoplasma, se refiere a un tratamiento profiláctico que incrementa la resistencia de un sujeto al desarrollo del estado adverso, o, en otras palabras, disminuye la probabilidad de que el sujeto desarrolle el estado adverso, así como un tratamiento después de que el sujeto haya desarrollado el estado adverso, a fin de combatir la enfermedad o evitar que el estado adverso empeore.
En ciertas realizaciones, las composiciones para el uso en el tratamiento descrito en la presente son adecuadas para cualesquiera sujetos infectados con HPV. En ciertas realizaciones, se proporcionan composiciones para el tratamiento de verrugas genitales y/o verruga vulgar. En ciertas realizaciones, se proporcionan composiciones para el tratamiento de displasia en fase inicial, CIN (II, III) y/o de carcinoma in situ. En ciertas realizaciones, se proporcionan composiciones para el tratamiento de cáncer de cuello uterino y todas las otras neoplasias relacionadas con HPV, tales como, por ejemplo, cáncer labial, cáncer de pene, carcinoma oral de células escamosas, cáncer de cabeza y cuello o cáncer de piel no melanómico. En algunas realizaciones, se proporcionan métodos para el tratamiento de infecciones concomitantes a una infección por HPV, por ejemplo infección por virus del herpes simple. En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano. En ciertas realizaciones, el sujeto es de sexo femenino. De forma similar, se describe el tratamiento de infecciones de uno o más de estos tejidos (p. ej., infecciones de tejido labial, del pene, oral, vaginal, del cuello uterino, cutáneo u otros).
En ciertas realizaciones, las nanopartículas de HPV que comprenden L1 o L1 y L2 y que comprenden además uno o más agentes terapéuticos pueden elegir como diana células infectadas con HPV en un sujeto infectado con HPV que tienen el potencial de convertirse en células cancerosas. En ciertas realizaciones, las nanopartículas de HPV que comprenden L1 o L1 y L2 y que comprenden además uno o más agentes terapéuticos puede elegir como diana células infectadas con HPV en un sujeto infectado con HPV que son células cancerosas.
En ciertas realizaciones, la administración de nanopartículas de HPV que comprenden uno o más agentes terapéuticos a un sujeto infectado con HPV destruye células cancerosas infectadas con HPV en el sujeto. En ciertas realizaciones, la administración de nanopartículas de HPV que comprenden uno o más agentes terapéuticos a un sujeto infectado con HPV provoca la apoptosis en las células cancerosas infectadas con HPV en el sujeto.
Habitualmente, el cáncer de cuello uterino se desarrolla lentamente a lo largo del tiempo. Antes de que el cáncer aparezca en el cuello uterino, las células del cuello uterino pasan a través de cambios conocidos como displasia, en los que empiezan a aparecer células que no son normales en el tejido del cuello uterino. Más tarde, las células cancerosas empiezan a crecer y a propagarse más profundamente en el cuello uterino y en zonas circundantes.
Se describen métodos para tratar a un sujeto que necesite tratamiento. Los sujetos que necesitan tratamiento son preferiblemente sujetos que tienen infección por HPV. En algunas realizaciones, los sujetos están en una fase inicial de infección. En algunas realizaciones, los sujetos presentan displasia de cuello uterino en fase inicial. En algunas realizaciones, los sujetos presentan CIN. En algunas realizaciones, los sujetos presentan carcinoma de cuello uterino.
En algunas realizaciones, los métodos descritos comprenden administrar una nanopartícula de HPV que comprende L1 o L1 y L2 y que comprende además uno o más agentes terapéuticos a un sujeto infectado con HPV en una cantidad suficiente para tratar la infección por HPV. En ciertas realizaciones, la nanopartícula de HPV se administra tópicamente a una membrana mucosa. Los métodos comprenden además administrar agentes anticancerosos y/o antivirales. En algunas realizaciones, el uno o más agentes terapéuticos son moléculas de ARNsi o moléculas que codifican ARNsi. En ciertas realizaciones el ARNsi se dirige contra E6 y/o E7 viral. En algunas realizaciones, el agente anticanceroso es gemcitabina.
En algunas realizaciones, las VLP se pueden usar para aportar agentes anticancerosos a un sujeto que tiene cáncer.
En ciertas realizaciones, la nanopartícula de HPV que comprende uno o más agentes terapéuticos se puede aplicar tópicamente a o adyacente a un epitelio tal como el epitelio del cuello uterino o tópicamente a o adyacente a una lesión epitelial tal como carcinoma epitelial del cuello uterino o anal. En algunas realizaciones, el uno o más agentes terapéuticos son moléculas de ARNsi o moléculas que codifican ARNsi.
En algunas realizaciones, la nanopartícula de HPV que comprende uno o más agentes terapéuticos se sitúa en una preparación tópica para la aplicación a una superficie epitelial, por ejemplo mediante la aplicación a un epitelio maligno, tal como un neoplasma urogenital, tal como neoplasma anal, vaginal o de cuello uterino, tal como CIN de cuello uterino.
En algunas realizaciones, la nanopartícula de HPV que comprende uno o más agentes terapéuticos se prepara en una preparación tópica para la aplicación a la epidermis, por ejemplo para el tratamiento de cáncer de piel no melanómico.
En algunas realizaciones, el uno o más agentes terapéuticos son moléculas de ARNsi o moléculas que codifican ARNsi.
En algunas realizaciones, se pueden usar una o más composiciones o métodos de HPV descritos junto con un tratamiento actual para la infección por HPV y/o el cáncer de cuello uterino. Por ejemplo, los métodos de tratamiento y/o las composiciones descritas se pueden usar antes y/o después de las técnicas de tratamiento esbozadas en la Tabla 4.
La Tabla 4 esboza técnicas comunes usadas actualmente para el tratamiento de CIN.
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Estos tratamientos tienen grados de eficacia variables que van de 60-90%. Sin embargo, todos estos tratamientos son procedimientos invasivos que retiran o destruyen tejido del cuello uterino y a menudo están asociados con complicaciones.
La patogénesis del cáncer de cuello uterino está muy relacionada con la infección persistente por papilomavirus humano (revisado en zur Hausen y cols 2002). Los papilomavirus son pequeños virus de ADN sin envuelta y su cápside icosaédrica está constituida por las proteínas L1 y L2, que encapsidan un ADN bicatenario circular cerrado de aproximadamente 8 kpb. La cápside viral 50-60 nm de diámetro contiene 72 pentámeros de la proteína principal L1 y de 12 a 72 copias de la proteína secundaria de la cápside L2.
Un subgrupo de 15 HPVs incluyendo los tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68 y HPV-69 se ha denominado de alto riesgo. Genes de HPV de alto riesgo se encuentran casi en 100% de muestras tisulares de cáncer de cuello uterino (Walboomers y cols., 1999). Se considera que la integración del genoma viral y la posterior expresión de dos oncogenes virales principales, E6 y E7, son etapas críticas en el desarrollo de este cáncer particular. E6 se une a proteína supresora de tumores p53 y la elige como diana para la degradación mediada por ubiquitina (Münger y Howley, 2002). p53 orquesta la respuesta celular a diversos estímulos de estrés, por ejemplo el daño genotóxico por radiación ionizante o fármacos quimioterapéuticos. Dependiendo de cuán extensivo sea el daño, la activación de p53 puede dar como resultado interrupción del ciclo celular, activación de la maquinaria de reparación de ADN o apoptosis (Vousden y Lu, 2002). p53 no funcional o ausente permite una velocidad de división celular acelerada y promueve inestabilidad genética, facilitando la transformación maligna (Attardi, 2005). La expresión constante de ARNm de E6 y E7 por papilomavirus humanos (HPV) de alto riesgo suprime la función de p53 y pRb, respectivamente, y es esencial para el desarrollo del cáncer de cuello uterino.
Adicionalmente, HPV 16 está asociado con un pequeño subgrupo de tumores de cabeza y cuello, principalmente del tejido del anillo de Waldeyer. Se ha demostrado que un espectro de tipos de HPV, incluyendo tipo de HPV de bajo riesgo, está presente en lesiones malignas de otras zonas de la cabeza y el cuello, incluyendo cánceres orales así como cánceres esofágicos (de Villers y cols).
El cáncer de piel no melanómico (carcinomas de células basales y escamosas) es con mucho el cáncer más frecuente entre la población caucasiana en todo el mundo. Estos cánceres se producen principalmente en zonas expuestas al sol, lo que apunta a la irradiación UV como un factor medioambiental importante en la patogénesis de esta enfermedad. Además, se han asociado varios cambios genéticos, incluyendo mutaciones en el gen celular p53. Varios tipos de HPV del género beta-papilomavirus parecen estar asociados con el carcinoma de células escamosas de la piel. Esto incluye tipos de HPV cutáneo (HPV 20, HPV 38 y HPV 27) que son bien activados o bien suprimidos por UV.
Según esto, aspectos de la invención se pueden usar para tratar afecciones distintas al cáncer de cuello uterino asociadas con infección por HPV. Por ejemplo, se pueden usar aspectos de la invención para tratar cánceres de cabeza y cuello (p. ej., cánceres orales y/o esofágicos) asociados con la infección con HPV. Sin embargo, se debe apreciar que las partículas basadas en HPV de la invención se pueden usar como vehículos de aporte general para tratar enfermedades o afecciones mucosas independientemente de que estén provocadas por infección con HPV. Según esto, los métodos y las composiciones descritas se pueden usar para tratar otras infecciones tales como infección por HSV o HIV y/o, por ejemplo, infecciones bacterianas tales como Gardnerella vaginalis, Neisseria gonorrhoeae; una infección fúngica tal como infecciones por Candida Albicans, o infecciones parasitarias tales como el parásito Trichomonas vaginalis, u otras infecciones que son infecciones comunes en el tracto genital.
En algunas realizaciones, una nanopartícula de HPV que comprende uno o más agentes terapéuticos se puede usar para tratar infección persistente por HPV de alto riesgo, displasia de cuello uterino, lesiones precancerosas CIN I, II, III (CIN2/3, VIN2/3) y/o carcinoma in situ.
En algunas realizaciones, una nanopartícula de HPV que comprende uno o más agentes terapéuticos se puede usar para tratar verrugas genitales, cáncer de piel no melanómico, cáncer de cabeza y cuello, cáncer orofaríngeo, cáncer vulvar, cáncer vaginal, cáncer de pene y/o cáncer anal.
Las composiciones descritas se pueden administrar a sujetos de sexo femenino o masculino dependiendo de la zona de tratamiento.
En algunas realizaciones, las composiciones que comprenden VLP basada en HPV se pueden usar para el aporte de agentes terapéuticos a células epiteliales, por ejemplo a la piel. En algunas realizaciones, las composiciones se pueden administrar para tratar infecciones de la epidermis provocadas por bacterias grampositivas que incluyen, por ejemplo, Staphylococcus, Micrococcus y Corynebacterium sp., Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes, que provocan, por ejemplo, enfermedades de la piel, tales impétigo y ectima. En algunas realizaciones, las composiciones que comprenden VLP basada en HPV se pueden usar para tratar cáncer de piel no melanómico.
En algunas realizaciones, las partículas de HPV modificadas, que se describen en la presente, que comprenden uno o más agentes terapéuticos se pueden administrar sistémicamente (p. ej., i.v.) para el tratamiento de tumores, p. ej., cáncer ovárico, cáncer de mama, carcinoma oral de células escamosas, cáncer de cabeza y cuello, NSCLC, SCLC, cáncer de vejiga urinaria o cáncer de próstata. En algunas realizaciones, las células cancerosas que exponen receptores para HPV VLP y partículas de HPV modificadas, como se describe en la presente, se pueden usar para elegir como diana estas células cancerosas. En algunas realizaciones, las partículas de HPV modificadas se pueden alterar adicionalmente para exponer agentes de elección de dianas que son específicos para una célula cancerosa.
Ejemplos
Ejemplo 1: Inhibición del crecimiento de células de cáncer de cuello uterino mediante VLP de HPV empaquetadas con ARNshs de oncoproteína de HPV
Los principales objetivos de este estudio eran construir un sistema de expresión de ARNsh basado en HPV y explorar la interferencia de ARN mediada por HPV para el silenciamiento eficaz de los genes E6 y E7. Los presentes inventores muestran aquí que los pseudoviriones de HPV que expresan ARNsh de E6 y E7 en células de cáncer de cuello uterino daban como resultado el agotamiento de la expresión de E6 y E7 y la supresión del crecimiento de células cancerosas, sugiriendo que las VLP de HPV son valiosas para aportar plásmidos que codifican ARNsh para el tratamiento del cáncer de cuello uterino.
Materiales y métodos
Líneas celulares, cultivo celular y transfección celular
Las líneas celulares de carcinoma de cuello uterino humano CaSki (ATCC CRL-150) y C33-A (ATCC HTB-31; American Type Culture Collection) se hicieron crecer a 37°C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2 en DMEM complementado con 10% de FCS (Invitrogen), 1% de penicilina/estreptomicina y 1% de piruvato sódico. Las células CaSki se infectaron mediante HPV-16 y expresan E6 y E7, mientras que las células C33-A eran negativas con respecto a HPV. La línea celular murina TC1 (ATCC CRL-2785) se cotransformó mediante las oncoproteínas E6/E7 de HPV-16 y c-Has-Ras. Estas células se hicieron crecer en RPMI 1640 con 10 mmol/l de HEPES, 1 mmol/l de piruvato sódico complementado con 2 mmol/l de aminoácidos no esenciales y 10% de FCS. Las células 293FT murinas (Invitrogen) se derivaron de la línea celular 293T (ATCC CRL 11268). Expresan en antígeno T grande de SV40 y se cultivaron en presencia de 500 pg/ml de geneticina (Invitrogen).
Un día antes de la transfección, las células se tripsinizaron y se sembraron en placas de seis pocillos. A continuación, las células se transfectaron con plásmidos que codifican ARNsh usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen), pseudoviriones de HPV-31 o lentivirus que codifican ARNsh. Las células se recogieron para el análisis en diversos momentos según se indica en los resultados.
Diseño y producción de plásmidos que expresan ARNsh específico de E6 y E7
A fin de producir el clon de entrada pENTR/U6, se usó el vector de entrada BLOCK-iT U6. En primer lugar, los presentes inventores diseñaron y sintetizaron oligonucleótidos de ADN complementarios (Invitrogen), que contenía cada uno cuatro salientes nucleotídicos necesarios para la clonación direccional. Secuencias complementarias de ARNsh correspondientes a ARNsi de E6 y E7 se describen en la Fig. 1B. Las secuencias de E6-2 y E7-2 se seleccionaron usando el software "diseñador de ARNsh" de Invitrogen. Las secuencias de E6-1 y E7-1 eran las descritas por Jiang y Milner (Oncogene 2002; 21:6041-8). Los presentes inventores usaron LacZ y la secuencia de ARNsh de control descritos por Jiang y Milner (Oncogene 2002; 21:6041 -8) como controles. Todas las secuencias se confirmaron mediante BLAST con respecto a la especificidad.
Cantidades iguales de los oligonucleótidos de cadena directa e inversa se reasociaron para generar los oligonucleótidos bicatenarios mediante incubación en tampón de reasociación a 95°C durante 4 min. Después de generar oligonucleótidos bicatenarios, se ligaron en el vector pENTER/U6 (Invitrogen). Los plásmidos se secuenciaron, se propagaron y se purificaron usando el Qiagen plasmid midi kit (Qiagen, Francia). Los clones de entrada se usaron para análisis de interferencia de ARN transitorios.
Producción de pseudoviriones de HPV que expresan ARNsh de E6 y E7 HPV-31
Se expresaron VLP en células Sf21 infectadas con un baculovirus recombinante que codifica los genes L1 y L2 de HPV-31 optimizados codónicamente (Fleury y cols., Clin Vaccine Immunol 2008; 15:172-5). Las células se incubaron a 27°C durante 72 h (Touze y cols., Nucleic Acids Res 1998; 26:1317-23; Bousarghin y cols., J Clin Microbiol 2004; 40:926-32). Las células se recogieron mediante centrifugación, se resuspendieron en PBS que contenía 0,5% de NP40 y se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 30 min. A continuación, los lisados celulares se centrifugaron a 14.000 x g durante 15 min a 4°C. La fracción nuclear se resuspendió adicionalmente en PBS y se trató con ultrasonidos. A continuación, la fracción se cargo en la parte superior de un gradiente de cloruro de cesio preformado y se centrifugó en el equilibrio en un rotor Beckman SW28 (24 h, 27.000 rpm, 4°C). Las fracciones positivas a L1 se reunieron en PBS y se centrifugaron (rotor SW28, 3 h, 28.000 rpm, 4°C). Las VLP se resuspendieron en 0,15 mol/l de NaCl.
Se generaron pseudoviriones como se describe previamente con algunas modificaciones (Touze y cols., Nucleic Acids Res 1998; 26:1317-23). Brevemente, se incubó 1 pg de VLP de HPV-31 en 50 mmol/l de tampón de Tris-HCl (pH 7,5) que contenía 20 mmol/l de DTT y 1 mmol/l de EGTA durante 30 min a temperatura ambiente. En esta fase, plásmidos de expresión que codifican ARNsh, luciferasa o proteína fluorescente verde (100 ng) se añadieron a las VLP perturbadas. A continuación, la preparación se diluyó con concentraciones crecientes de CaCl2 hasta una concentración final de 5 mmol/l, con o sin ZnCl2 (10 nmol/l). Se usó ZnCl2 debido a que se ha presentado que el ZnCl2 potencia el montaje de capsómeros de HPV en VLP (Hanslip y cols., Biotechnol Prog 2006; 22:554-60). A continuación, los pseudoviriones se dializaron contra 1 x PBS durante la noche y se almacenaron a 4°C antes del uso.
La presencia de capsómeros, VLP y pseudoviriones se analizó mediante microscopía electrónica. Con este propósito, las muestras se aplicaron a rejillas revestidas de carbono, se tiñeron negativamente con acetato de uranilo al 1,5% y se observaron con una ampliación nominal de x 50.000 usando un microscopio electrónico JEOL 1010.
Producción de lentivirus que expresan ARNh de E6 y E7s
La producción de lentivirus se realizó usando el sistema de expresión de interferencia de ARN lentiviral BLOCK-iT (Invitrogen). Brevemente, se realizó una reacción de recombinación LR entre el plásmido pENTR/U6 que codifica ARNsh de E7 y plenti6/BLOCK-iTDEST para generar la construcción de expresión plenti6/BLOCK-iT-DEST. El lentivirus se produjo al transfectar células 293FT con 9 pg de la ViraPower Packaging Mix y 3 pg de ADN del plásmido de expresión plenti6/BLOCK-iT-DEST usando LipofectAMINE 2000 (Invitrogen). Los sobrenadantes de cultivo celular se recogieron a las 48 h después de la transfección. Los títulos de lentivirus que expresan ARNsh de E7 se determinaron al infectar células TC1 con diluciones en serie de lentivirus. El título de la solución madre lentiviral era 1 x 106 TU/ml. Las células TC1 transducidas establemente se seleccionaron al poner las células bajo selección con blasticidina (10 pg/ml).
Análisis de niveles de ARN de E6 y E7m mediante PCR de transcripción inversa
Células CaSki (106) transfectadas con pseudoviriones de ARNsh se lavaron con 1 x PBS y a continuación el ARNm se aisló usando el Dynabeads mARN direct kit (Dynal Francia SA según las instrucciones del fabricante. Se sintetizaron ADNcs monocatenarios a partir de ARNms mediante transcripción inversa durante 1 h a 42°C en 1x tampón de incubación que contenía 250 pmol/l de cada trifosfato de desoxinucleótido, 5 pmol/l de oligo(dT) 20, 25 unidades de inhibidor de RNasa y 20 unidades de transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar (Roche Diagnostics). Las muestras de ADNc se sometieron a amplificación por PCR con cebadores directo e inverso específicos para E6, E7 de HPV-16 o gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). los cebadores usados eran E6 directo, 5' CACCAAAAGAGAACTGCAATGT 3' (SEQ ID NO: 31); e inverso, TTGCTGTTCTAATGTT GTTCCA (SEQ ID NO: 32); E7 directo, 5' GGAGATACACCTACATTGCATGA 3' (SEQ ID NO: 33); e inverso, GGGGCACACAATTCCTAGTG (SEQ ID NO: 34); gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa directo, 5' ACAGTCCATGCCATCACTG CC 3' (SEQ ID NO: 35); e inverso, 5' GCCTGCTTCACCACCTTCTTG 3' (SEQ ID NO: 36). La PCR se estableció con 200 gmol/l de trifosfato de desoxinucleótido, 2 gmol/l de cada cebador específico y 1 unidad de polimerasa de Taq (Invitrogen) en un termociclador GeneAmp 9700 (Pekin Elmer Applied Biosystems, Francia) programado para 25 ciclos a 50°C, 55°C o 62°C para E7, E6 y GAPDH, respectivamente. Los productos de PCR se visualizaron sobre geles de agarosa al 2% y se analizaron con el sistema GelDoc (Bio-Rad).
Detección de p53
Las células (2 x 105) se lavaron con PBS 1 x, se disolvieron directamente en 50 gl de tampón de carga en gel de SDS y se incubaron durante 10 min. a 95°C. Se separaron quince microlitros de cada muestra sobre geles de SDS al 12%-PAGE. Las proteínas separadas se electrotransfirieron sobre membrana de nitrocelulosa para la detección de anticuerpos. Se detectó proteína p53 humana usando el anticuerpo monoclonal DO-1 (Santa Cruz Biotechnologies) y se detectó p-actina endógena usando un anticuerpo policlonal (Sigma). Los anticuerpos unidos se visualizaron usando un anticuerpo anti-IgG de ratón conjugado a fosfatasa alcalina (Sigma) con nitroazul de tetrazolio y fosfato de bromocloroindolilo (Sigma) como sustratos.
Detección de la actividad de p-galactosidasa y luciferasa
La detección de p-galactosidasa en células CaSki,C33-A y TC1 transfectadas con plásmido de p-galactosidasa y ARNsh de LacZ se llevó a cabo en células lavadas con PBS 1x y fijadas con PBS que contenía 2% de formaldehido y 0,2% de glutaraldehído. Después de 10 min a temperatura ambiente, las células se lavaron y se incubaron con solución de revelación de p-galactosidasa (2 mmol/l de MgCl2, 4 mmol/l de ferrocianuro potásico, 4 mmol/l de ferricianuro portásico y 1 mg/ml de X-gal). Las células azules que mostraban actividad de p-galactosidasa se contaron. La detección de la expresión del gen de luciferasa se midió mediante un ensayo de luminiscencia (Firefly luciferase assay kit; Interchim). La luminiscencia se integró a lo largo de 10 s (Victor2, Wallac; Perkin-Elmer) y los resultados se expresaron como recuentos por segundo (cps) por pocillo.
Ensayos de viabilidad celular
Células transfectadas y no transfectadas se tripsinizaron y a continuación se sembraron en placas de 96 pocillos. Se añadió bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (0,5 mg/ml) a células sembradas en 100 gl de DMEM sin FCS y se incubaron a 37°C. Después de 2 h, se añadieron 100 gl de isopropanol y 0,4 mmol/l de HCl y la y absorbancia se midió a 540 nm. La viabilidad celular se determinó como la relación entre la absorbancia obtenida en pocillos de prueba y la absorbancia obtenida en células no tratadas.
Ensayos de apoptosis
La apoptosis se detectó usando el anti-ssADN/APOSTAIN (Abcys). Brevemente, células TC1 (2 x 105) desarrolladas en placas de seis pocillos se transdujeron con 10 gg de pseudoviriones que contenían 1 gg de ARNshs de E6-1, E6-2, E7-1, E7-2 y ARNsh de control. Después de 2 días de infección, los sobrenadantes se recogieron y las células se fijaron con etanol enfriado con hielo. Después de la centrifugación, 5 x 105 células fijadas se resuspendieron en 250 gl de formamida durante 5 min a temperatura ambiente y a continuación se incubaron a 75°C durante 10 min. Después de esta etapa, se añadieron 2 ml de PBS que contenía 1% de leche desnatada en polvo. Después de 15 min, las células se centrifugaron y la pella se resuspendió en 100 gl de PBS que contenía anticuerpo monoclonal anti-ssADN F7-26. Después de 15 min de incubación y centrifugación, la pella celular se resuspendió en 100 gl de PBS que contenía anti-IgM de ratón conjugado por fluorescencia (20 gg/ml en PBS y 1% de leche desnatada en polvo). Después de 15 min de incubación, las células se enjuagaron, se centrifugaron y se resuspendieron en 500 gl de PBS que contenía 1 gg/ml de yoduro de propidio. Los controles negativos se trataron con IgM de ratón en lugar del anticuerpo primario específico. A continuación, las células se analizaron usando un citómetro de flujo Coulter XL y con el software Expo32 (Beckman Coulter, Francia).
La apoptosis también se investigó usando el estuche de ensayo Caspase-Glo 3/7 (Promega). Las células se transdujeron con diferentes ARNsh. Dos días después de la transducción, 2 x 105 células se transfirieron a cada pocillo de una placa de 96 pocillos con paredes blancas (Perkin-Elmer) y se añadieron 100 gl de un sustrato luminogénico de caspasa. Después de 1 h de incubación a temperatura ambiente, se leyó la luminiscencia de las placas se leyeron en un luminómetro Luminoscan Ascent (Thermo Electron).
Evaluación de los efectos antitumorales en un modelo de ratón
Para investigar los efectos de pseudoviriones de ARNsh de E6 y E7 sobre la tumorigenicidad de células TC1, seis grupos (cinco ratones/grupo) de ratones C57BL6 hembra de 6 semanas de edad (CERJ, Le Genest St Isle, Francia) fueron inoculados subcutáneamente con células TC1 (2 x 105). Antes de la administración a los ratones, las células TC1 se transfectaron con pseudoviriones (10 qg de VLP/1 qg de ARNsh de E6-1 o E7-1), con un lentivirus que codifica ARNsh de E7-1 (multiplicidad de infección, 50), o con 1 qg de ARNsh de E7-1 con Lipofectamine. Un grupo de control recibía células TC1 sin tratamiento (simulación) y un grupo de control recibía células TC1 tratadas con VPLs de HPV. Después de 3 semanas, los ratones fueron sacrificados y los tumores se extirparon y se pesaron.
La eficacia antitumoral de los pseudoviriones que codifican ARNsh de E7 también se investigó en ratones con tumores de células TC1. Dos grupos (10 ratones/grupo) de ratones C57BL6 hembra de 6 semanas de edad se inocularon s.c. con células TC1 (2 x 105). Siete días después de la inoculación, se habían formado tumores palpables en todos los ratones y se inyectaron directamente en cada tumor pseudoviriones que contenían ARNsh a una dosis de 20 qg de VLP/ 2 qg de E7-1 o 20 qg de VLP/2 qg de ARNsh de control cada 2 días durante 2 semanas. Después de 3 semanas, los ratones fueron sacrificados y los tumores se extrajeron y se pesaron. Todos los estudios en animales estaban aprobados por el comité regional de ética con animales (CREEA).
Análisis estadístico
Los datos se expresaron con la media F EE. El análisis estadístico se realizó usando la prueba de la t de Student y P < 0,05 se consideraban significativas.
Resultados
Diseño de ARNshs dirigidos a las proteínas E6 y E7 de HPV-16
Se diseñaron seis secuencias para promover el silenciamiento específico. Dos de estas secuencias, es decir, siE6-1 (138-159) y siE7-1 (101-119), ya han sido descritas por Jiang y Milner (Oncogene 2002; 21:6041-8) como ARNsi, otras dos secuencias, siE6-2 (421-441) y siE7-2 (148-167), correspondientes a E6 y E7, respectivamente, se seleccionaron usando el software diseñador de ARNsh de Invitrogen y dos secuencias (ARNsh de LacZ y ARNsh de control de Jiang) se usaron como controles (Fig. 1 y Tabla 3). Estas secuencias se reasociaron y se insertaron en pENTR/U6.
Para investigar la eficacia del sistema de pseudoviriones para el aporte de ARNsh, células TC1, CaSki y C33-A se transfectaron con un plásmido que codifica hgalactosidasa, con o sin del plásmido pENTR/U6 LacZ que codifica ARNsh de LacZ. En presencia de ARNsh de LacZ, se observaba una disminución en la expresión de hgalactosidasa en todas las líneas celulares investigadas con 80%, 83% y 81% de inhibición en células TC1, CaSki y C33-A, respectivamente.
Producción de pseudoviriones que codifican ARNsh mediante el ensamblaje de capsómeros de L1 en VLP en presencia de ZnCl2
Se usaron VLP de HPV para encapsidar plásmidos que codifican ARNshs de E6 y E7. Para generar estos pseudoviriones, los presentes inventores usaron el método de desensamblaje-reensamblaje que se describe previamente, con la modificación de añadir ZnCl2 durante el procedimiento de reensamblaje. Brevemente, VLP purificadas se incubaron en un tampón que contenía EGTA y DTT y, en estas condiciones, las VLP se desagregaron completamente en estructuras que se asemejaban a capsómeros. A continuación, se añadió plásmido de ARNsh de E7-1 y la preparación se diluyó en un tampón que contenía 1% de DMSO y 5 mmol/l de CaCl2 con o sin ZnCl2 (10 nmol/l) a fin de replegar las VLP. La presencia de ZnCl2 incrementaba el reensamblaje de capsómeros en estructuras que se asemejaban a pseudoviriones. En presencia de ZnCl2, los capsómeros también se ensamblaban en estructuras tubulares de 24 nm de diámetro con longitudes que variaban de 120 a 280 nm. El papel del ZnCl2 en la producción de pseudoviriones que contienen un plásmido que codifica luciferasa se evaluó al comparar la capacidad de las preparaciones de pseudoviriones obtenidas con o sin ZnCl2 para transducir células 293FT. La actividad de luciferasa de 9,981 cps se obtuvo con pseudoviriones generados en presencia de ZnCl2, mientras que solamente era 845 cps con pseudoviriones obtenidos sin ZnCl2. Así. se observaba un incremento de 12 veces en la actividad de luciferasa cuando los capsómeros de L1 se reensamblaban en VLP en presencia de ZnCl2 (Fig. 2). Además, se investigó la capacidad de estos pseudoviriones de HPV para transducir células CaSki, C33-A y TC1. Estos pseudoviriones transducían las líneas celulares investigadas (Fig. 2). Sin embargo, se observaba un nivel superior de expresión de luciferasa en células TC1 (7.990 cps, recuentos por segundo) que en células CaSki (5.232 cps) o células C33 (4.016 cps). En ausencia de pseudoviriones, se observaba una actividad de luciferase de 57, 84, 51 y 41 cps en células 293FT, TC1, CaSki y C33, respectivamente.
La transducción de células CaSki mediante pseudoviriones de ARNsh de E6 y E7 inducía un incremento del silenciamiento génico y una inhibición del crecimiento celular
La eficacia de la transferencia génica de pseudoviriones en células se investigó usando pseudoviriones que contenían un plásmido que codifica proteína fluorescente verde. Ochenta por ciento de las células TC1 expresaban proteína fluorescente verde según se detectaba mediante citometría de flujo (datos no mostrados). Los presentes inventores evaluaron la eficacia de ARNshs de E6 y E7 al ensayar su capacidad para interferir con la expresión de proteína. Con este propósito, los presentes inventores obtuvieron en primer lugar los cADNs de longitud completa para E6 y E7 (y GAPDH como control) mediante PCR con transcripción inversa. Los resultados mostraban que el ARNm de E7 disminuía en presencia de ARNsh dirigido contra E7, obteniéndose un alto nivel de interferencia con la secuencia de Jiang, mientras que se observaba una disminución inferior con la secuencia de E7-2 y no se observaba disminución con ARNsh de control (Fig. 3A). Se obtuvieron resultados similares para la detección de mARN de E6 en células tratadas con ARNsh de E6. Se observó una ligera disminución en el mARN de E6 cuando las células se trataban con ARNsh de E7.
Debido a que E6 se expresa en células CaSki a niveles demasiado bajos para ser detectados mediante análisis de transferencia Western usando los anticuerpos disponibles, según se presenta por Gu y cols. (Cancer Gene Ther 2006; 13:1023-27) y Yamato y cols. (Cancer Gene Ther 2008; 15:140-53), la actividad de ARNsh de E6 se cribó basándose en su capacidad para restaurar la expresión de p53. Los resultados de los presentes inventores mostraban que el nivel de p53 detectado por transferencia Western se incrementaba después de la expresión de ARNsh de E6-1 a lo largo de 24 horas (Fig. 3B) y disminuía con el tiempo. En presencia de ARNsh de E7-1, E7-2 y E6-2, el incremento en la expresión de p53 era inferior que el observado con ARNsh de E6-1. No se detectó expresión de p53 cuando las células se trataban con ARNsh de LacZ. Estos resultados sugieren que el nivel de proteína E6 se reducía mediante el tratamiento con ARNsh y que p53 no solo se acumulaba sino que también era funcionalmente activa.
Para verificar si la inhibición de la expresión de E6 y E7 podía inducir una reducción en la viabilidad celular, después de 5 días de cultivo, se usó una prueba de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio, midiendo la absorbancia a 540 nm, en células CaSki y TC1 transfectadas y no transfectadas con ARNsh. Los hallazgos de los presentes inventores mostraban que el silenciamiento de E6 y E7 inducía una disminución en la viabilidad celular (Fig. 4). Esta reducción era mayor con ARNsh de E7 (70% de inhibición del crecimiento celular). No se observaba inhibición del crecimiento celular cuando células de cuello uterino negativas a HPV tales como C33-A se transfectaban con el mismo ARNsh, indicando que la inhibición del crecimiento celular por ARNshs de E6 y E7 era específica. La reducción en el crecimiento celular era similar para E6-1 y E6-2 y para ARNshs de E7-1 y E7-2.
La transducción de células TC1 mediante pseudoviriones de ARNsh de E6 y E7 no inducía la apoptosis
Se llevó a cabo un ensayo de apoptosis basado en el incremento de sensibilidad de ADN en células apoptóticas a la desnaturalización térmica para investigar si la muerte celular se debía a apoptosis. En este ensayo, el ADN se desnaturaliza al calentar en presencia de formamida y se tiñe con anticuerpo monoclonal F7-26 específico para ADNss. La citometría de flujo no revelaba un número significativamente incrementado de células apoptóticas con células TC1 transfectadas con ARNsh de E6-1, E6-2, E7-1 y E7-2 en comparación con células transfectadas con ARNsh de control. Para ensayar adicionalmente la existencia o ausencia de apoptosis, también se realizó un ensayo de caspasa que mide la actividad enzimática de caspasas 3 y 7 sobre células TC1 transducidas mediante pseudoviriones de ARNsh de E6 y E7. No se observó un incremento en la actividad de caspasa con ARNshs ni de E6 ni de E7. Los resultados sugerían que los ARNshs de E6 y E7 inducen la reducción en el crecimiento de células TC1 pero no a través de muerte celular apoptótica.
La transfección de células de TC1 in vitro mediante pseudoviriones de ARNsh de E6 y E7 inducía la reducción en el crecimiento tumoral en ratones
La eficacia de los pseudoviriones de ARNsh de E6 y E7 también se investigó in vivo usando el modelo de TC1/ratones. Se usaron pseudoviriones de HPV que codifican ARNsh de E6-1 y E7-1, VLP de HPV sola y un lentivirus que codifica ARNsh de E7-1 para transducir células TC1 in vitro. Después de 24 horas, células TC1 no transfectadas y transfectadas se inyectaron s.c. en ratones C57BL6.
Los ratones fueron sacrificados 21 días más tarde y los tumores extirparon y se pesaron. En ratones de control (simulación y VLP sola), el peso del tumor variaba de 1,09 a 2,12 g (media, 1,64 g). No se observó reducción en el peso del tumor con células TC1 transfectadas con ARNsh de E7-1 y Lipofectamine (media, 1,61 g). Se observó una reducción de 42% en el peso medio de los tumores con pseudoviriones de HPV de E6-1 (P < 0,10) y una reducción de 70% a 87% en el tamaño medio con el lentivirus los pseudoviriones de lentivirus de E7-1 y HPV de E7-1, respectivamente (P < 0,05 y P < 0,001; Fig. 5).
La transducción intratumoral de tumores de células TC1 mediante pseudoviriones de ARNsh de E7 inducía una reducción en el crecimiento tumoral en ratones
También se investigó la eficacia in vivo de los pseudoviriones que codifican ARNsh de E7 con respecto a su capacidad para reducir el crecimiento tumoral en ratones con tumores de células TC1. Se seleccionó para estos estudios ARNsh de E7-1 basándose en su eficacia in vitro. Los pseudoviriones de ARNsh de E7-1 se inyectaron directamente en los tumores cada 2 días a lo largo de 2 semanas. Después de 1 semana, no se observó reducción en el crecimiento tumoral en ratones tratado con ARNsh de E7-1 en comparación con los ratones de control (Fig. 6A). A continuación, se observó claramente una disminución en el crecimiento tumoral durante la segunda semana de tratamiento, con un peso medio del tumor de 1,05 g en ratones tratados con ARNsh de control y 0,49 g en ratones tratados con los pseudoviriones de ARNsh de E7-1 al final de la segunda semana (P = 0,045).
Ejemplo 2: Identificación de epítopos de conformación neutralizadores sobre proteína principal de la cápside de HPV 31 e implicaciones funcionales
El principal objetivo de este estudio era caracterizar la estructura antigénica y los mecanismos de neutralización de pseudoviriones de HPV31. Una de las cuestiones es la localización exacta de los epítopos que inducen anticuerpos neutralizadores de HPV y contribuyen a la protección contra la infección debido a la interacción con la cápside viral.
Está bien establecido ahora que los epítopos de conformación son responsables de la neutralización de la producción de anticuerpos (Christensen y cols., Virology 1994; 205:329-35; Rose y cols., J Gen Virol 1994; 75:2075-79; White y cols., J Virol 1998; 72:959-64; White y cols. J Virol 1999; 73:4882-89; Giroglou y cols. J Virol 2001; 75:1565-70). Debido a que los epítopos de HPVs neutralizadores dependen de la conformación, no se han caracterizado completamente su composición de aminoácidos y localización superficial.
Estos estudios son útiles en el diseño de vacunas y en la investigación de interacciones virus-célula. Además, una comprensión de la estructura antigénica del HPV es crucial para diseñar vectores de terapia génica derivados de HPV con inmunogenicidad reducida. Un requisito previo para generar estos vectores es una mayor comprensión de los determinantes virales que provocan la neutralización de respuesta inmunitarias, para diseñar vectores de pseudoviriones con eliminación o mutación con los epítopos de conformación responsables de la producción de anticuerpos neutralizadores. Estos vectores mutados con inmunogenicidad reducida permitirán la readministración de estos vectores sin una pérdida drástica de la eficacia transgénica debido a la inducción de anticuerpos neutralizadores contra el vector.
Materiales y métodos
Anticuerpos monoclonales para HPV31
Los MAbs para HPV31 usados en este estudio eran como los previamente producidos y caracterizados (Fleury y cols., Arch Virol 2006; 151:1511 -23; Fleury y cols., Clin Vaccine Immunol 2008; 15:172-75). Los MAb para H31.D24 reconocen un epítopo lineal común que se ha identificado con el bucle FG (aminoácidos 271-279) y los MAb para H31.F7 reconocen un epítopo de neutralización cruzada de conformación que se ha identificado con la parte N-terminal del bucle de FG (Fleury y cols., Arch Virol 2006; 151:1511-23). Otros trece MAbs reconocen epítopos neutralizadores de conformación específicos. Además, el anticuerpo monoclonal CamVir-1 (CV), que reconoce un epítopo lineal común sobre el bucle DE (Carpentier y cols., J Med Virol 2005; 77:558-65), se usó como control. MAbs investigados usando el método de exposición en la superficie de células bacterianas se purificaron de ascitis en bruto mediante precipitación salina con sulfato amónico (33% final), a continuación se dializaron contra solución salina tamponada con fosfato (PBS) seguido por cromatografía de afinidad sobre proteína AG/Sepharose (Pierce; Immunopure IgG purification kit).
Neutralización de pseudovirus
La capacidad neutralizadora de cada anticuerpo monoclonal se determinó previamente (Fleury y cols., Arch Virol 2006; 151:1511-23; Fleury y cols., Clin Vaccine Immunol 2008; 15:172-5). Además, los presentes inventores investigaron si la neutralización tenía lugar antes o después de la unión de los pseudoviriones a la superficie celular. Las pruebas se realizaron con pseudoviriones de HPV31 producidos en células 293FT y se realizaron ensayos de neutralización usando células Cos-7 cultivadas en medio de Eagle modificado de Dulbecco completo (Invitrogen, DMEM complementado con 10% de FCS, 100 lU/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina) se sembraron en placas de 96 pocillos y se incubaron durante 24 h a 37°C. Se realizaron ensayos que medían la neutralización antes de la unión de los pseudoviriones a la superficie celular al añadir los pseudoviriones de HPV31 previamente preincubados con MAbs a las células (100 pl) durante 1 h a 37°C. Se realizaron ensayos que medían la neutralización después de la unión de los pseudoviriones a la superficie celular al añadir pseudoviriones de HPV31 a células Cos-7 durante 1 h a 37°C. Después de tres lavados para retirar pseudoviriones no unidos, los MAbs se añadieron a 100 pl de DMEM. Para cada ensayo, el sobrenadante se retiró después de 3 h a 37°C y se añadieron 200 pl de DMEM completo. Después de 48 h más de incubación a 37°C, la infectividad se puntuó al medir la luciferasa expresada por células transfectadas usando el Firefly Luciferase assay kit (Interchim, Montlucon, Francia) y la expresión de luciferasa se cuantificó usando un luminómetro para microplacas Multiskan (Thermo-Fisher Scientific, Courtaboeuf, Francia). Se consideraba que los MAbs eran neutralizadores si la actividad de luciferasa se reducía en >80%. La inhibición de pseudovirus que se unían a la célula se puntuaba si los MAbs neutralizaban la pseudoinfección solamente cuando se añadían antes de la unión de los pseudoviriones a las células. Si los anticuerpos neutralizaban los pseudoviriones antes y después de su adición a células Cos-7, se consideraba que los MAbs neutralizaban los pseudoviriones a través de un mecanismo de ligazón a las células posterior.
Generación de proteínas L1 recombinantes y purificación de VLP
Se usó el sistema Bac-to-Bac (Invitrogen, Fisher-Scientific, Illkirch, Francia) para la expresión de las proteínas L1 de HPV en células de Spodoptera frugiperda (Sf21). Se generaron previamente baculovirus que codifican el gen L1 de HPV16, HPV31, HpV16 DC9 y HPV16 DC31 (con una eliminación C-terminal de 9 o 31 aminoácidos, respectivamente) (Touze y cols., FEMS Microbiol Lett 2000; 189:121-7; Touze y cols., J Clin Microbiol 1998; 36:2046-51). Los genes truncados de HPV31 DC9 y HPV 31 DC31 se amplificaron mediante PCR a partir de un gen 65 optimizado para el codón L1 de HPV31 de longitud completa usando cebadores directo (GGATCCCACCATGAGCCTGTGGAGACCCAGC, SEQ ID NO: 37) e inverso para DC9 (GGAAGCTTATGTGGTGG TGCTGGCGCTGGGGGC, SEQ ID NO: 38) y para DC31 (GCAAGCTT AGGCCTGCAGCAGGAACTTTCTGCCC, SEQ ID NO: 39), respectivamente. Los productos de PCR se clonaron en pCR TOPO 2.1 mediante clonación de TA. Los clones positivos se secuenciaron para verificar la ausencia de mutaciones no deseadas. A continuación, los genes L1 de HPV se clonaron en plásmido pFastBac1 previamente digerido mediante BamHI e HindIII. Se generaron baculovirus recombinantes que codifican los diferentes genes eliminados L1 usando el sistema Bac-to-Bac (Invitrogen) según las recomendaciones del fabricante. Células Sf21 mantenidas en medio de insecto de Grace (Invitrogen, Cergy Pontoise, Francia) complementado con 10% de suero de ternero fetal (FCS, Invitrogen) se infectaron con los respectivos baculovirus recombinantes y se incubaron a 27°C. Tres días después de la infección, las células se recogieron y las VLP se purificaron como se describe previamente. 29,40 Brevemente, las células se resuspendieron en PBS que contenía Nonidet P40 (0,5%), pepstatina A y leupeptina (1 pg/ml de cada uno, Sigma Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Francia) y se dejaron reposar durante 30 min a 4°C. A continuación, los lisados celulares se centrifugaron y las pellas se resuspendieron en PBS enfriada con hielo que contenía pepstatina A y leupeptina y a continuación se sometieron a ultrasonidos. A continuación, las muestras se cargaron en un gradiente de CsCl y se centrifugaron hasta el equilibrio (22 h, 27.000 rpm en un rotor SW28, 4°C). Se investigó la densidad de las fracciones del gradiente de CsCl mediante refractometría y la presencia de proteína L1 mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato sódico al 10% (SDS-PAGE) y tinción con azul de Coomassie. Las fracciones positivas se reunieron, se diluyeron en PBS y se nodulizaron en un rotor Beckman SW 28 (3 h, 28.000 rpm, 4°C). Después de la centrifugación, las VLP se resuspendieron en 0,15 mol/l de NaCl y se sometieron a ultrasonidos mediante una ráfaga de 5 s a 60% de potencia máximas. El contenido de proteína total se determinó usando el estuche MicroBCA (Pierce, Ozyme, Francia).
Se produjeron VLP del mutante HBc 263/264 de L1 de HPV31 en células 293 FT. Se obtuvo proteína L1 quimérica que codifica ADN mediante la mutagénesis de un gen L1 de HPV31 optimizado codónicamente usando un protocolo de PCR de dos etapas. Se realizaron PCRs solapadas para obtener la secuencia DPASRE de la proteína HBc en la posición 263/264 de la proteína L1 de HPV31. En la primera etapa, se generó un fragmento usando la secuencia de ADN de L1 de HPV31 optimizada como plantilla y 5' L1 -NheI (CC GCTAGCCACCATGAGCCTGTGGAGACCC, SEQ ID NO: 40) y 3' L1-DPASRE (CTCTCTGCTGGCGGGGTCGTTGAAGAAGT GCCGCACGAA, SEQ ID NO: 41) como cebadores. Otro fragmento se amplificó usando la secuencia de ADN de L1 de HPV31 optimizada como plantilla y 3'L1-EcoRI (CGGAATTCT ATCACTTCTTGGTTTTCTTCC, SEQ ID NO: 42) y 5'L1-DPASRE (GACCCCGCCAGCAGAGAGAGAAGCGGCACCGTGGGC GAG, SEQ ID NO: 43) como cebadores. Estos dos fragmentos solapados se usaron en la segunda etapa de PCR como plantillas de ADN usando los cebadores 5' L1-NheI y 3' L1-EcoRI. La secuencia de ADN resultante tenía una secuencia que codificaba HBc78-83 entra las bases de L1 263/264 y un sitio de restricción NheI en 5' y un sitio de restricción EcoRI en 3'. Para la expresión de proteína, el gen HBc 263/264 de L1 de HPV31 se clonó en el vector de expresión de mamífero pIRES (BDbiosciences, Clontech). Este plásmido de ADN (HBc 263/264-pIRES de L1 de HPV31) se preparó mediante lisis alcalina clásica y extracción con fenol/cloroformo y se usó para transfectar células 293 FT con Fugene6 (Roche Diagnostic, Meylan, Francia) según las instrucciones del fabricante. Las células se transfectaron con un total de 0,5 pg de ADN y 1 pl de Fugene6 por cm2 de superficie de cultivo. Las células 293FT se recogieron 44 h después de la transfección y las VLP se purificaron según se mencionó previamente.
El autoensamblaje de las diferentes proteínas L1 de HPV expresadas en VLP se investigó mediante microscopía electrónica. Con este propósito, las preparaciones de VLP se aplicaron a rejillas revestidas con carbono, se tiñeron negativamente con acetato de uranilo al 1,5% y se observaron a una ampliación nominal de 50.000 x con un microscopio electrónico JEOL 1010. Todas las micrografías electrónicas se tomaron a 30.000 x o 50.000 x.
Investigación de la competición de unión a VLP de MAbs para HPV31 mediante resonancia plasmónica superficial
Los análisis se realizaron con un Biacore 1000 (Biacore AB, Uppsala, Suecia) equipado con chips detectores CM3 (dextrano carboximetilado). Los chips detectores CM3 se trataron con 35 gl de 0,05 mol/l de hidrocloruro de 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida y 0,2 mol/l de N-hidroxisuccinimida a un caudal de 5 gl/min y a continuación las VLP de L1 de HPV31 (32 gg/ml en 35 gl de tampón de PBS) se acoplaron covalentemente a un caudal de 5 gl/min. Los grupos carboxilo residuales se bloquearon posteriormente mediante 50 gl de HCl de etanolamina de 1 mol/l (pH 8,5) a un caudal de 10 gl/min. Las VLP no unidas se eliminaron mediante la inyección de 5 gl de HCl-glicina (10 mmol/l, pH 2,2) a un caudal de 10 gl/min. Se usó un caudal de 20 gl/min para todos los análisis de interacción efectuados a temperatura ambiente. Se obtuvo la saturación en anticuerpos de las VLP de L1 de HPV31 unidas para cada MAb mediante tres inyecciones de 30 gl de fluido ascítico diluido 1:10 en PBS. La saturación en MAb se verificó mediante la inyección de 30 gl de sobrenadante de hibridoma del mismo MAb diluido 1:4 en PBS. A continuación, se estableció la competición al inyectar sucesivamente cinco sobrenadantes de hibridoma diferentes diluidos 1:4 en PBS (30 gl cada uno). A continuación, el biosensor se regeneró mediante tres inyecciones de 10 gl de HCl de 30 mmol/l y se realizó otro ciclo de saturación-competición sobre la misma celda de flujo acoplada a VLP. Se investigaron varios otros tampones de regeneración (incluyendo NaCl de 2 mol/l, NaOH de 10 mmol/l y HCl de 20, 25, 30 y 50 mmol/l). Se observó que el tampón seleccionado (HCl de 30 mmol/l) retiraba 100% de los anticuerpos unidos, no retiraba VLP del chip detector y no afectaba a la conformación de las VLP, debido a que los anticuerpos dirigidos a los epítopos de conformación todavía estaban unidos a VLP tan eficazmente con antes de tratamiento de regeneración.
Cartografía de epítopos usando exposición bacteriana en la superficie celular
El método de exposición bacteriana en la superficie celular usando el vector pFliTrx usa una biblioteca de péptidos 12-meros insertada en un dominio de tiorredoxina (TrxA) para constreñir los péptidos. Este dominio de tiorredoxina están insertado él mismo en la proteína flagelar bacteriana principal (FliC) que se va a exponer sobre la superficie de E. coli (Lu y cols., Biotechnology (NY) 1995; 13:366-72; James y cols., Science 2003; 299:1362-1367). La pFliTrx Random Peptide Display Library (Invitrogen, Cergy Pontoise, Francia) se obtuvo mediante la inoculación de 1 ml de la solución madre de biblioteca de péptidos en 50 ml de medio IMC (6 g/l de Na2HPO4, 3 g/l de KH2 PO4 , 0,5 g/l de NaCl, 1 g/l de NH4Cl, 0,2% de casaminoácido, 0,5% de glucosa, 1 mmol/l de MgCb) que contenían 100 gg/ml de ampiciina y a continuación se removió (225-250 rpm) durante la noche a 25°C. La expresión de los péptido se indujo al añadir 100 gg/m de triptófano a 1010 bacterias procedentes del cultivo nocturno en 50 ml de medio IMC que contenía 100 gg/ml de ampicilina y a continuación se removió a 25°C durante 6 h.
Para el cribado de la biblioteca contra anticuerpos anti-HPV31, 20 gg de MAb en 1 ml de agua estéril se revistieron sobre una placa de 60mm (Nunclon D, Nunc, ATGC, Marne-la-Valle'e, Francia) durante 1 h con agitación suave a 50 rpm en un agitador orbital. Después de lavar con 10 ml de agua estéril, se añadieron 10 ml de solución de bloqueo (medio IMC que contenía 100 gg/ml de ampicilina, 1% de leche en polvo baja en grasa, 150 mmol/l de NaCl, 1% de a-metilmanósido) y se incubaron durante 1 h bajo agitación (50 rpm). Después de decantar las solución de bloqueo, se añadieron 10 ml del cultivo de células bacterianas con 0,1 g de leche en polvo, 300 gl de NaCl de 5 mol/l, 500 gl de a-metilmanósido al 20% (concentración final: 1% de leche desnatada en polvo, 150 mmol/l de NaCl, 1% de ametilmanósido). Después de la agitación suave a 50 rpm durante 1 min y la incubación a temperatura ambiente durante 1 h, las placas se lavaron cinco veces (50 rpm durante 5 min) con 10 ml del medio IMC que contenía 100 gg/ml de ampicilina y 1% de a-metilmanósido. A continuación, las células bacterianas unidas se eluyeron en el volumen residual de solución de lavado al someter a turbulencia las placas durante 30 s. Se transfirieron a un matraz de cultivo de 50 ml y se hicieron crecer bajo agitación (225-250 rpm) a 25°C durante la noche. Este ciclo de tamizado se repitió cuatro veces más y el cultivo nocturno procedente del quinto tamizado se sembró en estrías sobre placas RMG (6 g/l de Na2HPO4 , 3 g/l de KH2 PO4, 0,5 g/l de NaCl, 1 g/l de NH4Cl, 2% de casaminoácido, 0,5% de glucosa, 1 mmol/l de MgCl2, 1,5% de agar) que contenían 100 gg/ml de ampicilina y se incubaron durante la noche a 30°C. De 24 a 30 colonias procedentes de la placa de RMG/ampicilina se inocularon cada una en 2 ml de medio RM (6 g/l de Na2HPO4, 3 g/l de KH2 PO4 , 0,5 g/l de NaCl, 1 g/l de NH4Cl, 2% de casaminoácido, 1% de glicerol, 1 mmol/l de MgCL) que contenía 100 gg/ml de ampicilina. Después de la incubación a 30°C durante la noche con agitación, el ADN se extrajo mediante la clásica minipreparación de ADN en fenol/cloroformo con lisis alcalina. El análisis de las secuencias nucleotídicas se realizó usando el cebador de secuenciación directo FliTrx. Las secuencias se hicieron pasar por un secuenciador de ADN ABI PRISM 3100 Avant (PerkinElmer, Courtaboeuf, Francia). Las secuencias se analizaron usando Dialign2 (Morgenstern y cols., Gioinformatics 1999; 15:211-18).
Detección de la reactividad de MAb contra VLP silvestres y mutantes mediante ELISA
Los pocillos de las microplacas (Maxisorp, Nunc) se revistieron con VLP. Después de la incubación a 4°C durante la noche y dos lavados con PBS-Tween 20 (0,1%), los pocillos se saturaron con PBS complementada con 1% de FCS durante 1 h a 37°C. Se incubaron pocillos duplicados (dos pruebas y un control) con MAbs diluidos en PBS 5X-Tween (1%)-FCS (10%) durante 1 h a 37°C. Después de cuatro lavados, se añadió a los pocillos Fc de anti-Ig de ratón caprina conjugada a peroxidasa (Sigma Aldrich) diluido 1:1.000 en PBS-Tween (1%)-FCS (10%) y se incubó durante 1 h a 37°C. A continuación, después de cuatro lavados, se añadieron 0,4 mg/ml de O-fenilen-diamina y 0,03% de peróxido de hidrógeno en citrato sódico de 25 mmol/l Na2HPO4 de 50 mmol/l. Después de 30 min, la reacción se detuvo con H2SO4 4 N y la absorbancia se leyó a 490 nm. Para el análisis de datos, los valores de la densidad óptica (OD) obtenidos en ausencia de los primeros anticuerpos se sustrajeron de los valores de OD de las muestras de prueba. Los datos presentados son las medias de tres a cuatro determinaciones.
Ensayos de inmunoabsorción con enzimas ligadas basados en heparina y ECM
La interacción entre VLP y heparina se probó usando un ensayo derivado de los ensayos de unión a heparina descritos por Giroglou y cols. (J Virol 2001; 75:1565-70) para VLP de HPV33. Las placas de microvaloración (Maxisorp, Nunc) se revistieron durante la noche a 4°C con 200 ng por pocillo de heparina-BSA (Sigma) o MatrigelVR (BD Biosciences, Le pont de Claix, Francia) Después de cuatro lavados con PBS que contenía 0,1% de Tween 20, los sitios de unión no específica se bloquearon mediante la incubación durante 1 h a 37°C con PBS más 1% de FCS. Después del lavado, se añadieron 200 ng/pocillo de VLP diluidas en PBS. Después de la incubación a 37°C durante 60 min y cuatro lavados, se añadieron MAbs anti-VLP de HPV31 diluidos 1:1000 en PBS, 0,1% de Tween 20 y 10% de FCS y se incubaron a 37°C durante 60 min. Después de 1 h de incubación a 37°C y cuatro lavados, los anticuerpos unidos se detectaron usando anticuerpo de ratón anti-IgG conectados covalentemente a peroxidasa de rábano picante. Después de 1 h de incubación a 37°C y cuatro lavados, se añadieron 100 gl de solución de sustrato que contenía O-fenilendiamina y H2O2. La reacción se detuvo después de 30 min mediante la adición de 100 gl de H2SO4 de 2 mol/l y la absorbancia se leyó a 492 nm con un lector de placas automático. La absorbancia de los pocillos de control sin VLP se sustrajo de los valores para los pocillos de prueba. Simultáneamente, una segunda placa se revistió con heparina-BSA o MatrigelVR. Después de la incubación y el lavado, se añadieron 200 ng/pocillo de VLP preincubadas durante 1 h a 37°C con MAbs diluidos 1:1000 en PBS, 0,1% de Tween 20 y 10% de FCS. Los anticuerpos unidos se detectaron con anticuerpos de ratón anti-IgG conectados covalentemente a peroxidasa de rábano picante como se describe anteriormente. la inhibición de la unión de VLP a heparina o Matrigel se calculó como la reducción en la OD observada entre añadir los MAbs antes de la interacción de VLP con heparina y después. Los resultados se expresan como el porcentaje de reducción en la OD.
Ensayos de unión de HS y ECM a VLP
Las placas de microvaloración (Maxisorp, Nunc) se revistieron con heparina-BSA según se describe previamente. Después de una etapa de bloqueo, se añadieron VLP diluidas en PBS. Tras la incubación a 37°C durante 60 min y dl lavado, se añadieron MAbs Can Vir1 diluidos 1:5000 en PBS, 0,1% de Tween 20 y 10% de FCS y se incubaron a 37°C durante 60 min. Los anticuerpos unidos se detectaron después de cuatro lavados usando anticuerpos de ratón anti-IgG conectados covalentemente a peroxidasa de rábano picante y a continuación se realizaron las pruebas como se menciona previamente en la prueba para la interacción entre heparina y MAbs. Los resultados se expresan como el valor de OD.
Visualización de epítopos de HPV31 mediante modelado por homología de proteína L1 de HPV31
La secuencia para proteína L1 de HPV31 (Genbank ID, P17388) se presentó como entrada a la herramienta de modelado Swiss-Model (swissmodel.expasy.org). Una búsqueda de plantilla basada en la similitud de secuencias identificaba L1 de HPV16 (código PDB 1DZL y 2R5H), L1 de HPV-35 (2R5J), L1 de HPV-11 (2R5K) y L1 de HPV-18 (2R5I) como posibles plantillas 3D. Debido a que la L1 de HPV31 es más similar a las secuencias de L1 de HPV16 y HPV35, los presentes inventores seleccionaron las correspondientes plantillas 3D (1DZL, 2R5H y 2R5J) para modelar la estructura de L1 de HPV31. El modelo de L1 de HPV31 se evaluó usando ANAOLEA (swissmodel.expasy.org/anolea/) y se encontró que era correcto para un análisis estructural adicional de localizaciones epitópicas. El pentámero L1 de HPV31 se reconstruyó con SwissPDBViewer usando el modelo de L1 de HPV31 y la información para simetrías no cristalográficas (matrices de transformación) de la VLP de HPV16 (1DZL) (Chen y cols., Mol Cell 2000; 5:557-67). Las coordenadas atómicas del pentámero para la VLP de L1 de HPV31 L1 se guardaron en formato PDB y se expusieron usando el programa PYMOL, una herramienta de visualización gráfica molecular para estructuras macromoleculares (pymol.org).
Resultados
Cartografía epitópica de MAbs de L1 de HPV31 usando resonancia plasmónica superficial
La cartografía epitópica se realizó usando 15 MAbs producidos contra proteína L1 de HPV31. Se probaron todas las competiciones entre estos MAbs. Por ejemplo [Fig. 7(a)], la competición epitópica se estableció al saturar VLP de L1 de HPV31 acopladas con MAb H31.F16 (fluido ascítico en bruto) y la saturación con MAb se verificó mediante la inyección de los mismos MAbs (sobrenadante de hibridoma). La unidad de resonancia (RU) baja que se producía después de la adición de MAb H31.F16 (-52 RU) probaba que se alcanzaba la saturación. Después de la saturación, había una disminución en la RU, debido a la disociación de MAb saturador y esta eta la razón de la RU negativa. A continuación, se estableció una competición de unión a MAb al inyectar sucesivamente MAbs H31.B18, H31.D7, H31.E16, H31.E17 y H31.F7 (sobrenadantes de hibridoma). Los MAbs H31.E16 y H31.F7 no se unían a VLP de L1 de HPV31 (-1 y -13 RU, respectivamente), sugiriendo que los epítopos reconocidos por estos dos MAbs eran similares, o muy próximos, al epítopo reconocidos por el MAb H31.F16. En contraste, se observaba una unión a VLP significativa usando los MAbs H31.B18, H31.D7 y H31.E17 (171, 523 y 69 RU, respectivamente), sugiriendo que estos anticuerpos reconocían epítopos que eran es de los reconocidos por el MAb H31.F16. A continuación, el biodetector se regeneró mediante tres inyecciones de 30 mmol/l de HCl. Este método se usó para todos los otros ensayos de competición.
Cada uno de los 15 MAbs investigados competía con al menos otros tres, pero ninguno de los MAbs competía con todos los otros MAbs. Se estableció un mapa epitópico usando estos resultados [Fig. 7(b)1 y los epítopos reconocidos por MAb H31.F7 tenían una posición central en este mapa. El epítopo reconocidos por este MAb ya se había identificado sobre el bucle FG de L1 (Carpentier y cols., J Med Virol 2005; 77:558-65; Fleury y cols., Arch Virol 2006; 1511-23). Los MAbs que compiten menos con los otros MAbs (H31.B18, H31.B1 y H31.H9) estaban localizados en la periferia del mapa epitópico.
Unión de MAbs para HPV31 a VLP de HPV31/HBc
La reactividad de MAbs se analizó usando el mutante de L1 de HPV31/HBc 263/264 y VLP de L1 de HPV31 wt para identificar si algunos de los epítopos neutralizadores estaban localizados en el bucle FG. Además de las VLP de L1 de HPV31 producidas previamente, los presentes inventores construyeron un mutante de L1 de HPV31 mediante la inserción del motivo del núcleo de la hepatitis B (HBc) DPASRE en la posición 263-264. La a VLP de todos los MAbs específicos de un tipo estaba afectada por la inserción del motivo HBc en la posición 263/264. Se debe apuntar que la reactividad del MAb H31.D24 no neutralizador, que reconocía un epítopo lineal localizado en la posición 271-279 (SVPTDLYIK, SEQ ID NO: 44), no estaba afectada por la inserción. La unión del MAb CamVir-1 que reconocía un epítopo lineal identificado fuera del bucle FG tampoco estaba afectada por la mutación introducida. El MAb H31.F7 neutralizador cruzadamente reaccionaba de forma similar con VLP wt tanto de HPV16 como de HPV31, pero estaba afectado por la inserción del motivo HBc en la posición 263/264.
Cartografía epitópica de 5 MAbs usando exposición en la superficie bacteriana
La cartografía epitópica usando bacterias para la exposición de bibliotecas peptídicas proporciona un nuevo enfoque para la cartografía epitópica de anticuerpos tanto monoclonales como policlonales (Rockberg y cols., Nat Methods 2008; 5:1039-45). Uno de estos sistemas, el sistema pFliTrx Bacterial Display, se usó para identificar epítopos de L1. La exposición en la superficie de células bacterianas usando el vector pFliTrx usa una biblioteca de péptidos 12-meros insertada en un dominio de tiorredoxina para constreñir los péptidos, permitiendo la exposición de epítopos de conformación. El propio dominio de tiorredoxina se inserta en la proteína flagelar bacteriana principal de E. coli para ser expuesto sobre la superficie de bacterias. MAbs de título alto purificados de fluido ascítico se revistieron sobre placas Nuclon D para el cribado de la biblioteca contra anticuerpos anti-HPV31 y se realizaron rondas de selección in vitro sobre MAbs unidos a las placas para la selección de bacterias que exponen péptidos que interactúan con los MAbs. Para cada ronda la biblioteca bacteriana se añadió a un plato de cultivo celular para la selección positiva. Las bacterias no unidas se separaron por lavado y las bacterias unidas se recuperaron. Después de cinco rondas, se seleccionaron clones individuales y el ADN se aisló para la secuenciación. Las secuencias se analizaron en primer lugar usando el programa Dialign2. Los péptidos que coincidían en una alta puntuación se seleccionaron y a continuación se alinearon usando Dialign2 con la secuencia de la proteína L1 de HPV31 de longitud completa. Las secuencias de L1 de HPV31 que coincidían en todos los péptidos seleccionados se retuvieron. En primer lugar, los presentes inventores usaron este sistema con el MAb H31.D24, que reconocía un epítopo lineal previamente identificado en la posición 271-279 (SVPTDLYIK, SEQ ID NO: 44) dentro del bucle FG de L1 de HPV31. Después de la selección por exposición bacteriana, 24 clones positivos se secuenciaron y se analizaron. Seis de los 24 péptidos seleccionados con MAb H31.D24 coincidían en cada F2 distinto y coincidían en la proteína L1 de HPV31 (véase la Fig. 8), estando la secuencia de consenso identificada en la posición 275-279 (DLIYK, SEQ ID NO: 46).
Por lo tanto, la exposición bacteriana se uso para investigar el epítopo de conformación neutralizador reconocido por el MAb H31.F7, que es reactivo cruzadamente con HPV16, 18 y 58 y ligeramente neutralizados para los tipos 16 y 31 de HPV. Veinticuatro clones positivos se seleccionaron mediante exposición bacteriana usando el MAb H31.F7. Cinco de los 24 péptidos seleccionados coincidían entre sí y coincidían en la secuencia 259-266 de la proteína L1 de HPV31 (RHFFNRSG, SEQ ID NO: 47). También se investigaron MAbs neutralizadores específicos del tipo (H31.F16, H31.H12 y H31.B1), que reconocían epítopos de conformación. Se seleccionaron clones positivos para cada MAb. Cinco péptidos seleccionados con MAb H31.F16, cinco con MAb H31.H12 y seis péptidos seleccionados con MAb H31.B1 coincidían entre sí y coincidían en la secuencia SGTVGESVP de proteína L1 de HPV31 (265-273) (SEQ ID NO: 48) para MAb H31.F16, la secuencia RSGTVG (264-269) (SEQ ID NO: 49) para MAb H31.H12 y la secuencia RSGTVGESV (264-272) (SEQ ID NO: 50) para MAb H31.B1.
Neutralización con MAb de pseudoviriones antes y después de la ligazón
Se ha mostrado que los anticuerpos específicos para HPV16 y HPV33 neutralizan antes o después de la ligazón celular a células diana (Selinka y cols., J Virol 2003; 77:12961-67; Day y cols., J Virol 2007; 81:8784-92). El mecanismo de neutralización viral mediante anti-MAbs para HPV31 se determinó mediante ensayos de neutralización, añadiéndose los MAbs bien antes de la adición de F3 los pseudoviriones a células COS-7 [Fig. 9(a)] o bien 1 h después de la ligazón celular [Fig. 9(b)]. Los seis MAbs [H31.B1, H31.C24, H31.G5, H31.E16, H31.F7 y H31.D7, Fig.9(b)] neutralizaban pseudoviriones de HPV31 al inhibir la ligazón celular debido a que se neutralizaban antes de la ligazón del virus pero no después de la unión del pseudovirus a la célula [Fig. 9(b)]. Los otros ocho MAbs neutralizaban pseudoviriones de HPV31 a través de un mecanismo posterior a la ligazón celular debido a que neutralizaban los pseudoviriones antes y después de la unión celular. Se debe apuntar que el mapa epitópico [Fig. 7(c)] obtenido mediante análisis por resonancia plasmónica superficial sugería una aglomeración de cinco de estos seis MAbs que neutralizaba pseudoviriones de HPV31 mediante inhibición de la ligazón celular.
Unión de VLP a HS y ECM: efectos de MAbs para HPV31 y eliminación C-terminal de L1
La inhibición de la unión de VLP a heparina mediante MAbs para HPV31 se investigó usando un ELISA en el que se añadían VLP antes de su unión a heparina revestida sobre placas de ELISA. Los resultados indicaban que el MAb para H31.D24 no neutralizador que reconocía un epítopo lineal inhibía fuertemente la unión de VLP a heparina, ya que solamente 6 de los 14 MAbs reconocían epítopos neutralizadores de confor-F4-mación [Fig. 10(a)]. El mapa epitópico obtenido mediante análisis por resonancia plasmónica superficial indicaba una aglomeración de algunos de los MAbs que inhibían la unión de VLP a heparina [Fig. 7(c)]. No había una correlación clara entre MAbs que neutralizaban los pseudoviriones antes de la ligazón a las células y los que inhibían la unión a to HS. Sin embargo, tres anticuerpos neutralizadores (H31.G5, H31.E16 y H31.D7) demostraban ambas capacidades (véase la Fig. 10). La inhibición de la unión de VLP a proteínas de ECM se investigó mediante ELISA usando MatrigelVR como un sustituto de ECM. Los resultados [Fig. 10(b)] indicaban la inhibición de la unión de VLP a proteínas de ECM (>50%) por todos los anticuerpos neutralizadores, con la excepción de H31.C24 (37% de inhibición). El anticuerpo no neutralizador H31.D24 no inhibía la unión de VLP a proteínas de ECM.
Para investigar adicionalmente la interacción de VLP con HPSGs, los presentes inventores usaron cuatro mutantes de eliminación C-terminal para el análisis de la unión de heparina a proteínas L1. Los mutantes de HPV16 D9 y HPV16 D31 con eliminaciones C-terminales de 9 y 31 aminoácidos, respectivamente, ya se habían producido, 44 y se produjeron de forma similar mutantes de L1 de HPV31D9 y HPV31D31 para los propósitos de este estudio. Estos mutantes de eliminación de HPV31 se autoensamblaban en VLP (véase la Fig. 7) como se observaba previamente para los correspondientes mutantes de eliminación de HPV16 44 y estas cuatro VLP eliminadas C-terminalmente unidas a heparina de un modo similar a VLP wt. Sin embargo, la unión a heparina se pierde cuando estas VLP se desnaturalizan, confirmando que la heparina se une a un motivo de conformación sobre VLP y que este motivo no está presente en la parte C-terminal de la proteína L1 (véase la Fig. 11). Como la infección de células diana por HPV es un proceso multifásico que implica HSPG, ECM y un receptor secundario desconocido, los presentes inventores investigaron los efectos de MAbs para HPV31 sobre la neutralización la unión ECM- VLP de HPV.
El epítopo reconocido por H31.D24 es un epítopo lineal y los epítopos reconocidos por los tres MAbs neutralizadores (H31.B1, H31.F16 y H31.H12) son de conformación, mientras que el MAb H31.B1 es parcialmente neutralizador cruzadamente y reactivo cruzadamente.
El epítopo reconocido por el MAb H31.F7, un MAb reactivo cruzadamente y parcialmente neutralizador cruzadamente, se identificó en la parte N-terminal del bucle FG de la proteína L1 de HPV31 en la posición 259-268 (RHFFNRSGTV, SEQ ID NO: 45) [Fig. 12, la estructura 3D de capsómero se reconstruyó con SwissPDBViewer usando el modelo de L1 de HPV31 y la información para simetrías no cristalográficas AQ6 de la VLP de HPV16 [código PDB: 1DZL, (Chen y cols., Mol Cell 2000; 5:557-67)]] y es principalmente F6 inaccesible procedente de la superficie del capsómero según el modelo de HPV31. Esto está de acuerdo con el hecho de que la región inicial del bucle FG evidenciaba estructuras idénticas entre tipos de HPV y con la hipótesis de Bishop y cols. 64 sobre el análisis estructural de proteínas L1, sugiriendo que esta región del bucle FG debe ser capaz de inducir reactividad cruzada entre tipos pero es escasamente antigénica y/o inaccesible.
Para HPV16 y HPV33, se ha mostrados que diversos bucles expuestos superficialmente de la proteína L1 contribuyen a la inducción de anticuerpos neutralizadores para epítopos identificados solamente en un bucle y epítopos para los que varios bucles contribuyen a la zona de unión, 15, 46, 47 y se ha sugerido que regiones no contiguas de L1 podrían contribuir a neutralizar epítopos reconocidos por MAbs. Los hallazgos de los presentes inventores estaban a favor de que los anticuerpos neutralizadores para HPV31 se dirigieran principalmente contra el bucle FG y el bucle FG solo contribuyera a la unión a anticuerpos neutralizadores. El hecho de que los bucles hipervariables de L1 estén en gran proximidad entre sí no descartaba la posibilidad de que mutaciones o inserciones en otros bucles afecten a los epítopos de conformación de FG según se observaba por Roth y cols. 47 Los presentes inventores observaron que el MAb H31.D24 reactivo cruzadamente que reconocía la secuencia DLYIK (SEQ ID NO: 44) (275-279) reducía drásticamente la capacidad de HPV31 para unirse a heparina, confirmando así el papel de la Lisina 278 en la unión a HS. Sin embargo, este anticuerpo no tenía efecto neutralizador sobre pseudoviriones de HPV31,41,65 y otros tres anticuerpos neutralizadores que reconocían epítopos de conformación conocidos por unirse a una secuencia situada en la parte N-terminal del bucle FG no tenían efecto o lo tenían limitado sobre la unión a heparina. Se ha mostrado que los MAbs H16.V5 y H16.E70 no bloquean interacciones con la superficie celular. Sin embargo, estos anticuerpos neutralizadores inhiben la unión del virus a ECM producida a partir de células HaCaT y neutralizan pseudoviriones a través de un mecanismo de ligazón celular posterior. 43 De acuerdo con esto, los presentes inventores observaron que los tres anticuerpos neutralizadores específicos del tipo no competían con HS con respecto a la unión a VLP y que sólo uno de ellos (H31.B1) neutralizaba mediante inhibición de la unión de las VLP a las células. Sin embargo, todos estos anticuerpos compiten con respecto a la unión a la ECM, en contraste con el MAb H31.D24 no neutralizador. Estos resultados sugieren que estos anticuerpos reconocían un epítopo en la proximidad de la aglomeración básica de conformación de lisina implicada en la unión de VLP de HPV16 a HS35. Se debe apuntar que la lisina más importante de la aglomeración estaba presente dentro del epítopo reconocidos por el MAb H31.D24. Además, la investigación de la neutralización anterior y posterior a la ligazón de pseudoviriones de HPV31 por MAbs revelaba que seis de los anticuerpos neutralizadores de HPV31 actuaban al evitar la unión a la superficie celular de las partículas virales y los otros ocho MAbs neutralizadores interferían con pseudoviriones al evitar su internalización. Los hallazgos de los presentes inventores indican que, para todo el grupo de MAbs, no había correlación entre la neutralización y la capacidad de los MAbs para unirse a HS. López y cols. 66 se presentó recientemente que anticuerpos anti-HPV detectados en una infección natural inhiben la unión de HPV16 a HS y observaron que aquellos con los títulos de neutralización más altos eran los que inhibían la unión a HS. En conclusión, los hallazgos de los presentes inventores mostraban que los MAbs neutralizadores de HPV31 reconocen epítopos de conformación localizados sobre el bucle FG de la proteína L1 de HPV31 y que actúan bien mediante el bloqueo de la ligazón a células diana o bien mediante la neutralización de la unión a células posterior. La determinación precisa de tres epítopos neutralizadores específicos del tipo mediante exposición en la superficie bacteriana confirmaba su localización en la parte central del bucle FG e identificaba un epítopo de conformación reactivo cruzadamente y parcialmente neutralizador cruzadamente en la parte N-terminal relativamente conservada del bucle FG. Los residuos de aminoácido expuestos a disolventes del bucle FG se distribuían sobre ambas caras de una hendidura formada a lo largo de un eje definido por Pro 273 a Leu 287 [Fig. 12]. Los hallazgos de los presentes inventores mostraban que la parte derecha de la hendidura contenía un epítopo no neutralizador lineal reconocidos por el MAb H31.D24. Este también es un punto clave para la unión a sulfato de heparano, explicando así por qué H31.D24 y HS compiten con respecto a la unión a esta región. Los epítopos neutralizadores de conformación identificados estaban todos localizados en la cara izquierda de la hendidura del bucle FG (véase la Fig. 12). El hecho de que los anticuerpos dirigidos contra estos epítopos no compitieran fuertemente con HS se puede explicar por las diferencias en los modos de unión de los MAb, como se describe previamente para MAbs dirigidos contra proteína L1 de BPV. 67 Sin embargo, algunos otros MAbs neutralizadores de HPV31 competían con la unión a HS, sugiriendo que bien estos MAbs tienen una inclinación diferente cuando se unen a sus respectivos epítopos, interfiriendo así con la unión a HS hasta un grado mayor o menor, o bien que están dirigidos contra residuos de aminoácido de ambas caras de la hendidura. El MAb H31.D24 se unía a las puntas de VLP y así apoya la hipótesis de que los epítopos no neutralizadores también están presentes sobre la superficie de partículas de HPV. Los resultados obtenidos indicaban el que bucle hipervariable FG de HPV31 es denso en epítopos neutralizadores y sugerían que los MAbs para HPV31 se unen a epítopos solapados pero distintos en la parte central del bucle FG, de acuerdo con la exposición del bucle FG sobre la superficie de VLP de HPV y confirmando así que los anticuerpos neutralizadores están situados principalmente el la punta y la corona del capsómero. Los resultados también apoyan y conforman que el bloqueo de la ligazón del virus a la ECM es un mecanismo de neutralización importante pero no el bloqueo de la ligazón del virus a HS.
Ejemplo 3: Generación de mutantes de L1 de HPV16/31
Los papilomavirus son virus de ADN pequeños sin envuelta y su cápside icosaédrica está constituida por las proteínas L1 y L2, que encapsidan un ADN bicatenario circular cerrado de aproximadamente 8 kpb. La cápside viral de 50-60 nm de diámetro contiene 72 pentámeros de la proteína principal L1 y de 12 a 72 copies de la proteína secundaria de la cápside L2. La inmunización con proteína L1 autoensamblada en partículas similares a virus (VLP) induce la producción de altos niveles de anticuerpos neutralizadores y confiere protección específica para el tipo y de larga duración, según se demuestra en modelos en animales (Breitburd y cols., J Virol 1995; 69:3959-63; Suzich y cols., PNAS 1995; 92:11553-57; Christensen y cols., J Virol 1996; 70:960-65). Las respuestas de anticuerpos típicamente son generadas contra epítopos encontrados en los bucles externos de la proteína L1 de la cápside viral presente sobre la superficie exterior de VLP (Christensen y cols., Virology 2001; 291:324-34; Sadeyen y cols., Virology 2003; 309:32-40; Orozco y cols., J Virol 2005; 79:9503-14; Yaegashi y cols., J Virol 1991; 65:1578-83). Los epítopos de la cápside neutralizadores son determinantes importantes para la protección inmunitaria HPVs mediada por anticuerpos y se han identificado epítopos tanto lineales como de conformación sobre la superficie de VLP de L1 de HPV y pseudoviriones (Yaegashi y cols., J Virol 1991; 65:1578-83; Volpers y cols., J Gen Virol 1995; 76:2661-67; Heino y cols., J Gen Virol 1995; 76:1141-53; Christensen y cols., Virology 1996; 224:477-86).
Se ha presentado que los residuos de L1 dentro del bucle FG de L1 de HPV16 y el bucle EF de L1 de HPV31 están implicados en la unión de anticuerpos neutralizadores (Sadeyen y cols., Virology 2003; 309:32-40; White y cols., J Virol 1999; 73:4882-89; Combita y cols., J Virol 2002; 76:6480-86; Carter y cols., J Virol 2003; 77:11625-32).
El objetivo de este estudio era investigar la inmunogenicidad de partículas quiméricas de HPV. Los presentes inventores sustituyeron el aminoácido en el bucle externo FG de la proteína de la cápside L1 que aloja los epítopos principales de HPV16 (aa256-294) por aminoácidos correspondientes del bucle FG de L1 de HPV31 (aa257-295) generando nanopartículas de HPV de L1 quiméricas que mantenían la secuencia silvestre global de HPV 16 L1 con solo 3 sustituciones similares a HPV31 (HPV-VLP X) o 7 sustituciones similares a HPV31 (HPV-VLP Y) en el bucle FG (Figura 13).
Las proteínas L1 quiméricas se produjeron y purificaron a partir de células de insecto Sf21 infectadas con baculovirus recombinantes. Las células de insecto Sf21 producían un buen rendimiento de las proteínas L1 quiméricas (2,5-3 mg/litro). Las proteínas quiméricas L1 HPV X y L1 HPV Y se ensamblaban de forma similar a L1 de HPV 16 silvestre en VLP. Las construcciones quiméricas que alojaban mutaciones además de los 7 intercambios realizados en VLP de HPV Y no se ensamblaban en VLP.
Para probar la infectividad de las VLP quiméricas, se ensayó su capacidad para transferir material genético a las células. HPV-VLP X y HPV-VLP Y y como un control VLP silvestre de HPV16 se disociaron y un plásmido indicador de luciferasa se añadió y se empaquetó en las VLP durante la reasociación. Las células COS-7 (células renales de mono verde africano, ATCC CRL-1651) se pusieron en contacto con VLP in vitro y se incubaron. Después de la incubación, el medio de cultivo se retiró, las células se lavaron y se sometieron a lisis en tampón de lisis de luciferasa. Según se muestra en la Figura 14, las VLP de HPV X e Y quiméricas retienen las capacidades infecciosas de VLP de HPV-16 silvestre.
Para probar la inmunogenicidad de la VLP quimérica, se inmunizaron ratones (diez por grupo) con HPV16, HPV31 y los dos HPV X e Y quiméricos. Según se muestra en la Figura 15, la inmunorreactividad de la quimera HPV-VLP es del mismo orden de magnitud que la reactividad cruzada entre HPV 16 y HPV31, que es mínima (al menos 2 logaritmos menor que una respuesta inmunitaria real). En ratones inmunizados con HPV16, los títulos de anticuerpo específico para HPV 16, según se miden mediante ELISA, son aproximadamente 2000 GMT, lo que se esperaba. Sorprendentemente, en ratones infectados con HPV-VLP X e Y, esencialmente no se encuentran anticuerpos específicos para HPV16, a pesar del hecho de que L1 HPV-VLP X e Y mantienen casi totalmente la secuencia de aminoácidos de HPV16 silvestre. Así, estas quimeras no producen anticuerpos específicos para HPV 16. Según se espera, en ratones infectados con HPV31, esencialmente no se pueden encontrar anticuerpos específicos para HPV16. Un hallazgo aún más sorprendente era que en ratones infectados con HPV-VLP X e Y, no se encuentran anticuerpos específicos para HPV31, a pesar del hecho de que el bucle FG de la quimera se asemeja al de HPV31, particularmente para el bucle FG de L1 HPV Y, que difiere del bucle FG de tipo HPV31 silvestre solo en un aminoácido (HPV 31 291T-N290 HPV16). Según se esperaba, en ratones infectados con HPV16, esencialmente no se pueden encontrar anticuerpos específicos para HPV31, aunque se observa una sólida respuesta para HPV31 (alrededor de 1900 GMT). De forma interesante, tampoco son detectables anticuerpos específicos para X e Y en ratones inmunizados con HPV 16 o HPV31, sugiriendo que esencialmente ni hay reactividad cruzada. Una reactividad cruzada moderada es detectable para X e Y en ratones inmunizados con X o Y (538 frente a 857 GMT para X e Y, respectivamente).
Los datos muestran que es posible diseñar vectores pseudoviriónicos con mutaciones que son virtualmente no reactivas cruzadamente con las especies de las que se derivan. Esta inmunogenicidad muy reducida permitirá la readministración de estos vectores sin una pérdida drástica de la eficacia del transgén debida a la inducción de anticuerpos neutralizadores contra el vector en individuos infectados con HPV.
Ejemplo 4: Inducción de anticuerpos neutralizadores contra HPV heterólogo mediante inmunización con pseudoviriones de HPV empaquetados con el gen de L2
La inmunización con L1 autoensamblada en partículas similares a virus (VLP) induce altos títulos de anticuerpos neutralizadores y confiere protección en animales contra una infección experimental homóloga [Breitburd y cols., J Virol 1995; 69(6):3959-63; Suzich y cols., PNAS 1995; 92(25):11553-7]. También se ha mostrado que la protección está mediada por anticuerpos neutralizadores dirigidos contra epítopos de conformación. Estos resultados han conducido al desarrollo industrial de vacunas contra tipos genitales de HPV. Estudios preclínicos han mostrado que los anticuerpos neutralizadores inducidos por VLP de L1 son predominantemente específicos del tipo [Roden y cols., J Virol 1994; 68(11):7570-4; Roden y cols., J Virol 1996; 70(9):5875-83]. Sin embargo, se han presentado bajos niveles de neutralización cruzada entre HPV6 y 11 y HPV 16 y 31 [Christensen y cols., Virology 1994; 205(1):329-35; White y cols., J Virol 1998; 72(2):959-64; Giroglou y cols., Vaccine 2001; 19(13-14):1783-93; Combita y cols., J Virol 2002; 76(13):6480-6] y niveles superiores entre HPV18 y 45 [McLaughlin-Drubin y cols., Virology 2003; 312(1 ):1 -7]. Los experimentos clínicos han mostrado que la respuesta inmunitaria está asociada con la protección contra infecciones por HPV16 y HPV18 y lesiones asociadas [Ault y cols., Lancet 2007; 369(9876):1861-8; Paavonen y cols., Lancet 2007; 369(9580):2161-70]. Las vacunas para HPV actuales que contienen VPLs de L1 promueven la generación de una fuerte respuesta de anticuerpos neutralizadores principalmente específica para el tipo. Los experimentos clínicos con vacunas para HPV16 y 18 también han revelado que la protección cruzada contra tipos de HPV se limita a tipos estrechamente relacionados. La protección contra HPV31 se establecía claramente para ambas vacunas y la protección contra la infección por HPV45 solamente para una vacuna [Paavonen y cois., Lancet 2007; 369(9580):2161-70; Brown y cois., J Infect Dis 2009; 199(7):926-35]. Como las vacunas para HPV autorizada solo eligen como diana dos de los 15 tipos de HPV de alto riesgo, se requieren estrategias adicionales para evitar la infección de otros tipos de HPV de alto riesgo.
La proteína L2 ha surgido como una posible vacunas profiláctica, puesto que la inmunización con L2 en modelos en animales de infección por papilomavirus induce anticuerpos neutralizadores cruzadamente que son capaces de mediar en una protección más amplia que las VLP de L1 [Roden y cols., J Virol 1994; 68(11):7570-4; Christensen y cols., Virology 1991; 181 (2):572-9; Yin y cols., Virology 1992; 187(2):612-9; Chandrachud y cols., Virology 1995; 211(1 ):204-8; Gaukroger y cols., J Gen Virol 1996; 77(7):1577-83; Campo y cols., Virology 1997; 234(2):261-6; Roden y cols., Virology 2000; 270(2):254-7; Embers y cols., J Virol 2002; 76(19):9798-805] y hallazgos preclínicos y clínicos [Gambhira y cols., Cancer Res 2006; 66(23):11120-4; Alphs y cols., PnAS 2008; 105(15):5850-5; Karanam y cols., Vaccine 2009; 27(7):1040-9] han confirmado que las vacunas de L2 inducen anticuerpos neutralizadores cruzadamente de amplio espectro. Sin embargo, la proteína L2 y los péptidos de L2 son menos inmunogénicos que las VLP de L1 y la incorporación de la proteína L2 en VPLs de L1 no incrementa la respuesta anti-L2 debido a la inmunodominancia de L1 [Roden y cols., Virology 2000; 270(2):254-7]. Esto sugiere que nuevas estrategias de vacunación han de investigar si esta vacuna basada en L2 es eficaz.
Los objetivos de este estudio eran investigar la posibilidad de incrementar la exposición de proteína L2 al sistema inmunitario para generar una vacuna para HPV de amplio espectro.
Materiales y métodos
Anticuerpos
El anticuerpo monoclonal CamVir-1 (BD Biosciences, Le Pont de Claix, Francia) se une a un epítopo lineal que se ha cartografiado entre los aminoácidos 203 a 209 de la proteína L1 de HPV-16 [Fleury y cols., Arch Virol 2006; 151 (8):1511 -23]. El MAb H16.V5 se dirige contra un epítopo de neutralización de conformación de la proteína L1 de HPV16 [Christensen y cols., Virology 1996; 223(1):174-84]. El inmunosuero de conejo anti-L2 de HPV16 fue proporcionado amablemente por Richard Roden. Se usó el anticuerpo para StrepTag II (conjugado a HRP) para detectar la presencia de péptido StepTaglI sobre VLP de HPV (Novagen, VWR, Fontenay sous Bois, Francia).
Líneas celulares
Células COS-7 (células renales de mono verde africano, ATCC CRL-1651) se hicieron crecer en medio de Eagle modificado de Dulbecco (Invitrogen, Illkirch, Francia) complementado con 10% de suero de ternero fetal (FCS) termoinactivado, 100 IU/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina y 1 mmol/l de piruvato sódico. La línea celular 293FT (Invitrogen) es una variante de crecimiento rápido de la línea celular 293 que expresa establemente TAg de SV40 y el gen de resistencia a neomicina procedente del plásmido pCMVPORT6AT.neo. Las células 293FT se hicieron crecer en medio de Eagle modificado de Dulbecco complementado como anteriormente más 1% de aminoácidos no esenciales y 500 pg/ml de G418. Las líneas celulares se hicieron crecer a 37°C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2.
Producción de VPLs de HPV18, HPV31 y HPV58 en células de insecto
Se produjeron VLP de L1/l2 de HPV58, VLP de L1/l2 de HPV31 y VLP de L1/l2 de HPV18 y se purificaron de células de insecto Sf21 infectadas con baculovirus recombinantes que codifican el gen tanto de L1 como de L2 según describieron previamente Touze y cols., J Clin Microbiol. 1998; 36(7):2046-51; Combita y cols., FEMS Microbiol Lett 2001; 204(1):183-8].
Producción y purificación de proteína de fusión de L2-estreptactina (L2SA)
La secuencia de la estrectactina (SA) con el codón de inicio [Voss y cols., Protein Eng 1997; 10(8):975-82] incluyendo los sitios de restricción aguas arriba (BamHI y SalI) y aguas abajo (HindIII) fue sintetizada por Geneart (Regensburg, Alemania) usando una utilización de codones adaptada para la expresión en Spodoptera frugiperda.
La secuencia de SA se clonó entre los sitios SalI e HindIII del vector de expresión pFastBacDual (Invitrogen) a fin de obtener el plásmido pFastBacDual SA. A continuación, el ORF de L2 de HPV16 se fusionó al extremo 5' del ORF de SA. Con este propósito, el ORF de L2ANLS de HPV16 (aminoácidos 12 a 442) se amplificó mediante PCR a partir de un plásmido que contenía una versión adaptada de codones de Homo sapiens del gen de L2 silvestre (FN297862) usando HPV16 L2 F y HPV16 L2A R. Se diseñó un cebador directo para introducir un sitio BamHI y una secuencia de Kozak aguas arribas desde el codón de inicio y el cebador inverso contenía un sitio de restricción SalI. A continuación, el producto de PCR se clonó mediante clonación TA en el vector pCR2.1 (Invitrogen). La ausencia de mutagénesis inducida por PCR no deseada se verificó a continuación mediante secuenciación. Los plásmidos tanto pCR2.1-16 L2ANLS como pFastBacDual SA se sometieron a restricción con BamHI y SalI y el gen de L2 se fusionó al gen de estreptactina a fin de generar el pFastBacDual-16 L2ANLS (L2SA).
Un baculovirus recombinante que codifica L2SA se generó usando el sistema Bac-to-Bac (Invitrogen) según las recomendaciones del fabricante. Células de insecto Sf21 se hicieron crecer a 27°C en medio SF900II complementado con penicilina, estreptomicina y anfotericina B (Invitrogen). Las células se infectaron a una m.o.i. de diez y se hicieron crecer durante cuatro días. Las células se separaron por raspado, se centrifugaron a 300xg y a continuación se resuspendieron en PBS IX que contenía 0,5% de Nonidet P40 y un cóctel antiproteasa (Roche, Meylan, Francia) y se incubaron sobre hielo durante 30 min. El lisado se centrifugó a 4°C durante 10 min a 12.000xg y el sobrenadante representaba la fracción citoplásmica. La pella, que representaba la fracción nuclear, se sometió a ultrasonidos (3 ráfagas, 15 s, Vibracell, Fischer Scientific, Francia). La expresión de la proteína L2SA se analizó mediante transferencia Western. Con este propósito, las proteínas se separaron mediante 12,5% SDS PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Protran BA83, Schleicher y Schuell, Mantes la Ville, Francia). La membrana se saturó durante la noche a 4°C en TNT (15 mmol/l de Tris, 140 mmol/l de NaCl, 0,05% de Tween 20) que contenía 5% de leche en polvo baja en grasa y a continuación se lavó tres veces con TNT-5% de leche. Las membranas se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente con anti-L2 policlonal de conejo, se diluyeron 1/1000 en TNT-5% de leche, a continuación se lavaron tres veces y se añadió anti-(Fc de IgG de ratón) caprino conjugado a fosfatasa alcalina (Sigma Aldrich) (1/2,500 en TNT-5% de leche). Después de la incubación durante 1 h a temperatura ambiente y tres lavados en TNT-5% de leche más dos lavados en TNT, las inmunotransferencias se desarrollaron usando el sistema de sustrato líquido BCIP/NBT (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Francia). La proteína L2SA se purificó mediante afinidad sobre iminobiotina inmovilizada según las instrucciones del fabricante (Pierce, Ozyme, Montigny le Bretonneux, Francia).
Producción de VLP de L1L2SA
El gen L1 16-StepTagII se construyó después de dos etapas de PCR usando cebadores que permitían la inserción de péptido de StepTagII (STII, WSHPQf Ek , SEQ ID NO: 12) [Schmidt y cols., Nat Protoc 2007; 2(6):1528-35] en la posición 140-141 del gen de la cápside de L1 de HPV 16 silvestre según se describía previamente [Sadeyen y cols., Virology 2003; 309(1):32-40]. En la primera etapa de PCR, se usaron For L116 STII/STII inverso y STII directo/L116 STII inv con un gen de L1 de HPV16 que presentaban una utilización de codones humanizados como plantilla. Los dos fragmentos solapados así obtenidos se fusionaron en una segunda etapa de PCR usando cebadores For L116 STII / L116 STII inv a fin de generar la secuencia de L1 16 StrepTagII (L1STII). El producto de PCR final se clonó y se secuenció como anteriormente y finalmente se clonó entre BamHI y HindIII del plásmido pFastBacDual para to generar un baculovirus recombinante.
Las VLP se purificaron de células de insecto infectadas mediante ultracentrifugación en un gradiente de CsCl. La unión de proteína L2SA a VLP de L1STII se obtuvo al mezclar VLP de L1STII con proteínas de fusión L2SA en el tampón de interacción (100 mmol/l de Tris HCl pH 8, Nacl 1 M, 0,25% de Triton X100). Para analizar las VLP quiméricas obtenidas (L1L2SA VLP), las VLP se nodulizaron mediante ultracentrifugación (60.000 rpm, 1 h) en un rotor SW-60 (Beckman) y a continuación se analizaron según la presencia de L2 y Strep-Tag mediante transferencia Western como anteriormente.
Producción de VLP de HPV 31 con el péptido de L2 de HPV31 (13-88) insertado en el bucle DE.
El epítopo de neutralización cruzada (aminoácidos 13-88) de la proteína L2 de HPV31 se seleccionó para la inserción con la proteína L1 [Pastrana y cols., Virology 2005; 337(2):365-72; Gambhira y cols., J Virol 2007; 81 (21):11585-92; Richards y cols., PNAS USA 2006; 103(5):1522-7]. La secuencia del gen de L1 de HPV 31 que contenía el sitio de restricción XhoI y SmaI en la posición 140-141 se construyó mediante dos etapas de PCR [Fleury et Clin Vaccine Immunol 2008; 15(1):172-5] a fin de insertar la secuencia del péptido L2 de HPV 31 13-88 (L213-88) usando pIRES31L1L2h. En la primera etapa de PCR, las partes 5' y 3' de HPV L1 31 se amplificaron usando L1h31 directo/L1 inverso y L1h31 inverso/L1 directo como cebadores. Estos dos fragmentos se usaron como plantilla en la segunda etapa de PCR usando L1h31 directo/L1h31 inverso como cebador. A continuación, este producto de PCR se clonó en pCR TOPO 2.1, se secuenció y se subclonó en plásmido pFastBacl previamente digerido mediante BamHI y HindIII. El ADN que codifica el fragmento 13-88 del gen de L2 de HPV 31 se amplificó a partir de los cebadores directo e inverso pIRES31L1L2h y L213-88 y se clonó como anteriormente. Tanto pCR 2.1 TOPO/ L213-88 como pFastBac1/ L1 se digirieron mediante XhoI/SmaI a fin de insertar la secuencia que codifica el péptido L2 de HPV. Se generó un baculovirus recombinante que codifica la proteína L1-L213-88 y las células de insecto se infectaron como anteriormente.
Tabla 5. Secuencia de oligonucleótidos usada
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Producción de pseudoviriones de HPV58 y HPV31
Se obtuvieron pseudoviriones de HPV31 y 58 usando un sistema celular con genes de cápside de HPV modificados codónicamemente [Bucki y cols., Methods Mol Med 2005; 119:445-62]. Brevemente, los genes de L1 y L2 de HPV 58 se diseñaron para contener los codones más frecuentemente usados encontrados en genes altamente expresados en Homo sapiens (FN178626 y FN178627, respectivamente). Los genes de L1 y L2 se clonaron en el vector de expresión bicistrónico de mamífero pIRES (BDBiosciences, Clontech). El gen de L1 se clonó entre los sitios de restricción NheI y EcoRI de MCS A aguas abajo del promotor IE de CMV. El gen de L2 se clonó posteriormente entre los sitios de restricción XbaI y NotI de MCS B de pIRES-L1. Plásmido de ADN que codifica luciferasa (pGL3 luc, Promega, Charbonniéres-les-Bains, Francia) o pIRES L2 ANLS usado para la producción de pseudoviriones se preparó mediante preparación clásica de ADN con fenol/cloroformo. El último plásmido contiene la secuencia de ADN que codifica los aminoácidos 12 a 442 de la L2 de HPV31 entre los sitios de restricción XbaI y NotI. Esta secuencia se amplificó por PCR a partir de un plásmido que contiene un gen de L2 de longitud completa de HPV31 adaptado codónicamente de Homo sapiens [Fleury y cols., Clin Vaccine Immunol 2008; 15(1): 172-5]. Para la generación de pseudoviriones en células 293FT, las células se transfectaron con 0,5 gg de ADN (0,25 gg de plásmido pGL3-Luc, o pCMV-GFP o pIRES-L2, 0,25 gg de plásmido L1L2) y 1 gl de Fugene6 (Roche) por cm2 de la superficie de cultivo. Las células se recogieron dos días después de la transfección y los pseudoviriones se purificaron como se describió previamente [Fleury y cols., Clin Vaccine Immunol 2008; 15(1): 172-5] y se almacenaron a -80°C hasta el uso. Las cantidades de pseudoviriones se determinaron mediante transferencia Western usando el anticuerpo CamVir-1 por comparación con concentraciones conocidas de VLP de tipos homólogos.
Producción de pseudoviriones de HPV 16 y 18
Se produjeron pseudoviriones de HPV16 y 18 mediante el método de desensamblaje-reensamblaje previamente publicado [Touze y cols., Nucleic Acids Res 1998; 26(5):1317-23] con algunas modificaciones [Bousarghin y cols., Mol Cancer Ther 2009; 8(2):357-65]. VLP de L1/L2 (100 gg) se incubaron en 50 mmol/l de tampón de Tris-HCl (pH 7,5) que contenía 20 mmol/l de DTT y 1 mmol/l de EGTA durante 30 min a temperatura ambiente. En esta fase, se añadió pGL3 luc (10 gg) a las VLP perturbadas. A continuación, la preparación se diluyó con concentraciones crecientes de CaCÍ2 (hasta una concentración final de 5 mmol/l) y en presencia de ZnCl210 nM. A continuación, los pseudoviriones se dializaron contra PBS IX durante la noche y se almacenaron a 4°C antes del uso.
Protocolo de inmunización.
Ratones BALB/c hembra de seis semanas de edad (CERJ Janvier, Le Genest St Isle, Francia) se inmunizaron intramuscularmente con las diferentes preparaciones de vacuna. Los ratones del grupo 1 recibían solución salina, los ratones de los grupos 2 a 5 recibían 10 pg proteína L2-SA de HPV 16 (L2SA), L1STN-L2SA (VLP de L1L2SA), HPV16 L1L2 (VLP de L1L2) con o sin hidróxido de aluminio, respectivamente. Los ratones de los grupos 6 y 7 recibían 1 o 10 pg de plásmido pIRES-HPV31 L2ANLS (ADN L2), respectivamente. Los ratones de los grupos 8 a 10 recibían VPLs de L1 de HPV31, L1-31 L213-88 de HPV31 (L1/L2(13-88)VLP), VLP de L1L2 de HPV31 (31 L1L2 VLP), respectivamente. Los ratones del grupo 11 recibían 10 pg de pseudoviriones de HPV31 que contenían plásmido de expresión de ORF2108-660 de HEV (HEV PsV). Los ratones de los grupos 12 y 13 recibían pseudoviriones de HPV58 que contenían plásmido de expresión de GFP (GFP PsV) y pseudoviriones de HPV58 empaquetados con plásmido HPV31L2ANLS (L2 PsV), respectivamente. La cantidad de proteína L1 se ajustó entre los diferentes VLP de L1L2 VLP y pseudoviriones mediante análisis por transferencia Western. Los ratones fueron inmunizados los días 0, 7 y 21. Dos semanas después de la última inyección, se recogieron muestras de suero y se almacenaron a -20°C. Todos los procedimientos con animales se realizaron según los protocolos aprobados y según las recomendaciones para el uso y cuidado apropiados de animales de laboratorio y los experimentos estaban aprobados por el comité regional de ética con animales (CREEA Centre Limousin).
Determinación de títulos de suero anti-HPV mediante ELISA
Se distribuyeron doscientos nanogramos de VLP en la mitad de los pocillos de una placa de 96 pocillos (Maxisorp, Nunc, ATGC, Marne-la-Vallée, Francia) y se incubaron a 4°C durante la noche. Después de dos lavados con PBS-Tween (0,1%), los pocillos se saturaron con PBS complementada con 1% de FCS durante 1 h a 37°C. Pocillos duplicados (uno de prueba y uno de control) se incubaron con diluciones dobles (partiendo de 1:25) de sueros de ratones en tampón de dilución (PBS 5X, 1% de Tween, 10% de FCS) durante 1 h a 45°C. Después de cuatro lavados, se añadió a los pocillos anti-(IgG de ratón) caprino conjugado a peroxidasa (específico de Fc) (Sigma Aldrich) diluido 1:1.000 en PBS - Tween (1%) - FCS (10%) y se incubó durante 1 h a 45°C. Después de cuatro lavados, se añadieron 0,4 mg/ml de o-fenilen-diamina y 0,03% de peróxido de hidrógeno en 25 mmol/l de citrato sódico y 50 mmol/l de Na2HPO4. Después de 30 min, la reacción se detuvo con H2SO4 4 N y la densidad óptica (OD) se leyó a 492 nm. Para el análisis de datos, los valores de OD obtenidos en ausencia de L2 se sustrajeron de los valores de OD de antígenos de prueba. Un resultado se consideraba positivo cuando la diferencia en Od entre los pocillos de prueba y control era mayor de 0,2. Losa títulos individuales representaban la recíproca de la última dilución de daba una diferencia de OD mayor de 0,2. Los valores para ratones individuales era las medias de duplicados. Se calcularon los títulos medios geométricos (GMTs) para cada grupo. A los animales sin títulos de anticuerpo detectables (<25) se les asignó un título de 1 para el cálculo de los GMTs. Para la detección de anticuerpos anti-L2, se realizó el mismo ELISA que anteriormente con la diferencia de que se añadió proteína L2SA purificada a cada pocillo de las placas Nunc en lugar de las VLP.
Detección de los motivos L1, L2 y Strep-Tag mediante ELISA.
La antigenicidad de L1 de VLP quiméricas y la presencia de motivos L2 o Strep-Tag sobre la superficie de las VLP se analizaron mediante ELISA. Los pocillos de las placas de microvaloración se revistieron a 4°C durante la noche con 200 ng de VLP. Los ELISAs se realizaron como anteriormente usando un anticuerpo monoclonal anti-StrepTagII o un anticuerpo anti-L2 policlonal para la investigación de la presencia del motivo StrepTagII y la proteína L2 sobre la superficie de las VLP, respectivamente, o anticuerpos monoclonales H16.V5 y H31.F16 para investigar la presencia de los epítopos de conformación de proteínas L1 de HPV 16 y HPV 31, respectivamente.
Ensayos de neutralización de pseudoviriones de HPV16, 18, 31 y 58
Se realizaron ensayos de neutralización mediante la inhibición de la pseudoinfección de células COS-7 mediante pseudoviriones que contienen el plásmido pGL3-luc. Las células COS-7 (104/pocillo) se sembraron en placas de 96 pocillos (TPP, ATGC). Después de 24 h de incubación a 37°C, las células se lavaron dos veces antes de la adición de mezcla de pseudoviriones/sueros diluidos. La cantidad de pseudoviriones se ajustó para obtener una actividad relativa de luciferasa de 0,2 RLU (Luminoskan Ascent, Thermo scientific, Courtaboeuf, Francia) (1:500 para HPV16, 1:50 para HPV 18, 1:800 para HPV31 y 1:10,000 para HPV 58) y 50 pl de pseudoviriones diluidos se mezclaron con 50 pl de sueros de ratones diluidos mediante dilución doble en DMEM incompleto de 1:25 a 1:51.200. Después de 1 h de incubación a 37°C, la mezcla se añadió a los pocillos. Después de 3 h a 37°C, se añadieron 100 pl de DMEM completo.
Después de la incubación a 37°C durante 48 h, se midió la expresión del gen de luciferasa (Firefly luciferase 1-step assay kit, Fluoprobes, Interchim, Montlugon, Francia). Los resultados se expresaron como el porcentaje de inhibición de actividad de luciferasa [Richards y cols., PNAS USA 2006; 103(5):1522-7]. Los datos presentados son las medias de 2 a 3 determinaciones realizadas por duplicado. Los títulos de neutralización se definieron como la recíproca de la dilución más alta de sueros de ratones que inducía al menos 50% de reducción en la actividad de luciferasa. Se calcularon los títulos medios geométricos para cada grupo. A los animales sin anticuerpos neutralizadores detectables se les asignó un título de 1 para el cálculo de los GMTs. Los anticuerpos neutralizadores para HPV-16 solo se investigaron en los grupos 10, 12 y 13.
Análisis estadístico
Los títulos de anticuerpos individuales y los títulos medios geométricos se compararon para evaluar ELISA y las respuestas neutralizadoras. Los resultados del grupo (10 animales por grupo) se compararon mediante la prueba de la t de Student usando el software XLStat (Addinsoft, Paris, Francia).
Resultados
Producción de partículas quiméricas de HPV31 L2 y HPV16 L2 y pseudoviriones de HPV58 que codifican L2
Los presentes inventores produjeron dos partículas de L1-L2 quiméricas para investigar el potencial de vacunas de L2 para proteger contra un amplio espectro de tipos de HPV. A fin de decorar el exterior de la cápside con L2, la primera se basaba en la interacción entre una proteína de VLP modificada con L1 de HPV 16 y una proteína L2 de HPV16 fusionada a estreptactina, una versión manipulada de la estreptavidina. Para conseguir esto, el péptido de StrepTaglI (WSHPQFEK, SEQ ID NO: 12), una secuencia que imita el bucle de unión de biotina, se insertó en el bucle DE entre las posiciones 140/141 de la proteína L1 para evitar el acoplamiento químico de biotina a VLP de L1 con el riesgo de acoplar la biotina a epítopos neutralizadores de L1. Cuando se expresaba en células de insecto Sf-21 usando baculovirus recombinantes y se purificaba sobre gradientes de CsCl, la proteína recombinante L1STII se autoensamblaba en partículas similares a virus con la misma apariencia y un rendimiento similar a la proteína L1 silvestre (Fig. 16). Los portaobjetos se teñían negativamente con acetato de uranilo y se observaban mediante microscopía electrónica de transmisión a una amplificación de 50.000x (barra=200 nm).
La segunda proteína L1/L2 quimérica contenía el péptido L2 de HPV31 (aa 13-88) insertado dentro del bucle DE de la proteína L1 de HPV31. Cuando se expresaba en células de insecto usando baculovirus recombinantes, la proteína recombinante L1 L2(13-88) no permitía la producción de VLP bien conformadas, pero daba como resultado principalmente agregados de proteínas y/o capsómeros (Fig. 16).
La antigenicidad para L1 de estas dos VLP quiméricas se investigó mediante ELISA usando MAbs anti-L1 dirigidos contra epítopos de conformación y lineales (Fig. 17). Los resultados indicaban que el epítopo de L1 de conformación reconocidos por H16.V5 sobre VLP de HPV16 L1STII quiméricas no resultaba afectado. Sin embargo, se observaba una reducción clara en la unión del MAb H31.F16 a VLP de HPV31 L1-L213-88 en comparación con la observada con VLP de L1 de HPV31. La presencia de StrepTaglI o péptido de L2 (13-88) sobre la superficie de las VLP también se investigó mediante ELISA usando un MAb dirigido contra la secuencia de StrepTagII o un anticuerpo anti-L2 policlonal, respectivamente. Los resultados obtenidos (Fig. 17) mostraba que las secuencias de StrepTagII y L2 estaban presentes sobre la superficie de las VLP quiméricas.
Además, se determinó la capacidad de VLP de L1STII para unirse a proteína L2SA al mezclar 5 gg de las VLP con 10 gg de proteína de fusión L2SA correspondiente a una relación de masas de 1/1 (una proteína L2SA/una proteína L1). La unión de L2SA a VLP de L1STII se analizó mediante la ultracentrifugación de las VLP complejadas seguida por la detección de proteína L2SA mediante transferencia Western. La detección de L2SA y VPs de L1STII en la pella de ultracentrifugación (Fig. 18) indicaba que la proteína L2SA se unía eficazmente a las VLP. La unión no se observaba cuando L2SA se mezclaba con VLP de HPV16 silvestre. La presencia de proteína L2 en las VLP de L1L2SA también se evidenciaba mediante ELISA (Fig. 17). Se produjeron pseudoviriones de HPV 58 empaquetados con un plásmido que codifica el gen L2ANLS de HPV--31 en células 293 FT. Su capacidad para transducir el gen L2 se investigó mediante infección de células COS-7. El análisis por transferencia Western de la expresión de proteína L2 indicaba que L2 se detectaba dos días después de la transducción (Fig. 18). A fin de descartar la posibilidad de que la L2 detectada en células COS-7 se debiera a la presencia de los pseudoviriones introducidos, las células COS-7 se transdujeron con pseudoviriones similares empaquetados con el gen de GFP. La presencia de L2 no se evidenciaba en estas condiciones (Fig. 18).
Respuesta inmunitaria anti-HPV16-L2 en ratones inmunizados con VLP quiméricas y pseudoviriones.
No se detectaban anticuerpos anti-L2 de HPV16 en ratones no inmunizados (grupo 1). En ratones que recibían la proteína L2SA (grupo 2), se observaba un GMT anti-L2 de 348 (Tabla 6). Se observaba un incremento en los niveles de anticuerpo anti-L2 en ratones inmunizados con las VLP de L1L2SA HPV16 y las VLP de L1L2 de HPV16 (grupos 3 y 4), con GMTs de 1.160 y 1.055 (p = 0,035 y p=0,05), respectivamente. La adición de hidróxido de aluminio como adyuvante a VLP de L1L2 de HPV16 (grupo 5) incrementaba adicionalmente el nivel de anticuerpos anti-L2 homólogos de un modo no significativo (p=0,247).
No se detectaban anti-L2 en ratones inmunizados con VLP de L1 de HPV31 (grupo 8), pero en todos los ratones inmunizados las VLP de L1L213-88 (grupo 9) con un GMT de 730 y un nivel superior en ratones inmunizados con las LIL2 VLP (grupo 10) con un GMT de 1.100 (p =0,189). Se detectaban anticuerpos anti-L2 a niveles similares en ratones inmunizados con pseudoviriones de control (grupo 11 y 12) con un GMT de 855 y 1.212 (p=0,459). Mediante comparación con estos pseudoviriones de control, el GMT de anti-L2 (2.600) era superior en ratones inmunizados con pseudoviriones que codifican L2 (p=0,001 y p=0,101, respectivamente).
Tabla 6:
Figure imgf000041_0001
Inducción de anticuerpos neutralizadores contra HPV18, HPV31 y HPV58
Ninguno de los ratones inmunizados con proteína L2SA de HPV16 o VLP de HPV16L1L2 (grupos 3 a 5) desarrollaba anticuerpos neutralizadores contra tipos de HPV heterólogos (HPV18, HPV31 y HPV58) (Tabla 6). Solo se detectaron niveles bajos de anticuerpos neutralizadores contra HPV31 (GMT 85) cuando se añadía hidróxido de aluminio a las VLP de HPV16 obtenidas mediante autoensamblaje de proteínas L1 y L2 (grupo 5).
En ratones inmunizados con VLP de L1 de HPV31 o L1L2 de HPV31 y PsV de HEV HPV31 (grupos 8, 10 y 11), se detectaban anticuerpos neutralizadores de HPV31 homólogos, con GMTs de 2.800, 3.400 y 5.198, respectivamente (Figura 19). Solo se observaban títulos bajos de anticuerpos neutralizadores para HPV58 en ratones que recibían VLP de L1L2 de HPV31 (grupo 10) y pseudoviriones de HPV31 que contenían el gen irrelevante de ORF2 de HEV (grupo 11). No se detectaban anticuerpos neutralizadores contra HPV18 en ningunos de los ratones de los grupos 8 a 11 que recibían preparaciones de vacuna de HPV31.
Se detectaron altos niveles de anticuerpos neutralizadores homólogos en ratones inmunizados con pseudoviriones de HPV58 (grupos 12 y 13) con GMTs de 4.650 y 5.382, respectivamente. Se detectaron bajos niveles de anticuerpos neutralizadores para HPV31 (GMT=50) en ratones inmunizados con pseudoviriones que codifican GFP y se observaba un incremento drástico en anticuerpos neutralizadores anti-HPV31 (con un GMT de 733) en ratones inmunizados con pseudoviriones de HPV58 que codifican la proteína L2 de HPV31. Solo se detectaban anticuerpos neutralizadores contra HPV18 en ratones inmunizados con PsV de L2 de HPV58, con un GMT de 400. Los ratones de los grupos 10, 12 y 13 también se investigaron con respecto a anticuerpos neutralizadores para HPV16. Los ratones inmunizados con VLP de L1L2 de HPV31 desarrollaban bajos niveles anticuerpos neutralizadores para HPV16, con un GMT de 40. No se detectaban anticuerpos neutralizadores para HPV16 en ratones inmunizados con

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una nanopartícula que comprende una proteína L1 de papilomavirus que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 que comprende las sustituciones de aminoácidos D273T, N285T y S288N.
2. La nanopartícula de acuerdo con la reivindicación 1, donde la nanopartícula comprende al menos un compuesto heterólogo.
3. La nanopartícula de acuerdo con la reivindicación 2, donde el al menos uno compuesto heterólogo comprende al menos un agente terapéutico.
4. La nanopartícula de acuerdo con la reivindicación 2, donde el al menos un compuesto heterólogo comprende al menos un agente médico.
5. La nanopartícula de acuerdo con la reivindicación 2, donde el al menos un compuesto heterólogo comprende al menos un agente anticanceroso.
6. La nanopartícula de acuerdo con la reivindicación 2, donde el al menos un compuesto heterólogo comprende al menos un agente de diagnóstico por imágenes.
7. La nanopartícula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde la nanopartícula es una nanopartícula autoensamblada.
8. La nanopartícula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende además la proteína L2 de la cápside de papilomavirus.
9. La nanopartícula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 comprende además las sustituciones de aminoácidos L260F, A264S, A266T y N270S.
10. La nanopartícula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 -9, para uso en terapia.
11. La nanopartícula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, para uso en el aporte de agentes anticancerosos y/o agentes antivirales.
12. La nanopartícula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para uso en un método, comprendiendo el método aportar la nanopartícula a un sujeto.
13. La nanopartícula para uso de acuerdo con la reivindicación 12, donde la nanopartícula se aporta al sujeto por vía tópica, vía subcutánea, vía intravenosa y/o vía parenteral.
14. Un sistema de aporte basado en partículas similares a virus (VLP) que comprende la nanopartícula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.
15. Una proteína L1 de papilomavirus que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 que comprende las sustituciones de aminoácidos D273T, N285T y S288N.
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