BR112013017489B1

BR112013017489B1 - "métodos para genotipagem de hpv de alto risco e para distinguir entre infecções por hpv 16, hpv 18 e hpv 45".

Info

Publication number: BR112013017489B1
Application number: BR112013017489-7A
Authority: BR
Inventors: Sameera RANGWALA; Lori Kobayashi; Tanya GAY
Original assignee: Qiagen Gaithersburg, Inc
Priority date: 2011-01-07
Filing date: 2012-01-09
Publication date: 2021-06-08
Also published as: EP2661508A2; WO2012094682A2; CA2823627A1; EP2661508B1; WO2012094682A3; US20120196274A1; JP2014501535A; AU2012204158B2; AU2012204158A1; CA2823627C; CN103517994A; BR112013017489A2

Abstract

INICIADORES E SONDAS DE ÁCIDO NUCLEICO ESPECÍFICOS PARA A REGIÃO E6/E7 DE UM GENOMA DE HPV DE ALTO RISCO, CONJUNTO DE INICIADORES, KIT PARA A DETECÇÃO DE HPV, BEM COMO MÉTODO PARA GENOTIPAGEM DE UM HPV DE ALTO RISCO. A presente invenção refere-se a ácidos nucleicos, ensaios e métodos para a detecção e quantificação de tipos de HPV de alto risco.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] O presente pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisório dos Estados Unidos N° 61/430.797, depositado em 7 de Janeiro de 2011, o qual é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] A presente invenção refere-se a ensaios, métodos, reagentes, sistemas e kits para determinação da presença de um ácido nucleico em uma amostra. Mais especificamente, a invenção refere-se à detecção, genotipagem e quantificação de um papiloma vírus humano de alto risco em uma amostra.

ANTECEDENTES

[0003] A infecção persistente com genótipos de papiloma vírus humano (Human Papilloma Virus - HPV) de alto risco (High Risk - HR) oncogênico está associada a um risco aumentado da presença de desenvolver displasia de alto grau ou carcinoma cervical, carcinoma vulvar ou vaginal. Há cerca de 18 tipos de HR-HPV que infectam a mucosa genital e são definidos como cancerígenos. Destes, HPV tipos 16, 18 e 45 estão associados a uma maior taxa de adenocarcinoma cervical. HPV tipos 16 e 18 respondem por 70% de todos os cânceres cervicais, sendo os tipos de HPV carcinogênico mais prevalentes e são alvo das novas vacinas contra o HPV.

[0004] É bem conhecido que programas de rastreio que utilizam rastreio molecular quanto à presença de HR-HPV, quer independentemente ou como um adjunto à testagem citológica, aprimoram a eficácia para padrão de processos de assistência. Além disso, testes que quantificam a carga viral podem também ser importantes, uma vez que foi mostrado que a carga aumentada de HPV se correlaciona com a progressão da doença em câncer cervical. No entanto, o valor prognóstico de cálculo da carga de DNA de HPV pode variar dependendo do tipo de infecção pelo HPV presente, uma vez que o comportamento biológico dos vários tipos de HR-HPV diferem.

[0005] Portanto, a carga de HR-HPV pode ser um marcador de risco dependente de tipo para carcinoma invasivo. Como tal, a capacidade de realizar genotipagem precisa de uma infecção pelo HPV e quantificar a carga viral seria uma ferramenta valiosa.

[0006] Infelizmente, a maioria dos métodos de rastreio de HR-HPV não fazem genotipagem de tipos de HPV individuais, mas antes detectam um grupo inteiro de HR-HPV. Há alguns ensaios com base em PCR para a genotipagem de tipos de HPV de alto risco com base em amplificação de uma porção da região L1 de vários genomas de HR- HPV. No entanto, testes que objetivam a região L1 são propensos a resultados falsos negativos porque parte do quadro de leitura aberta de L1 é perdida em um baixo percentual de eventos de integração no genoma humano. Como tal, uso de um programa de rastreio de HR- HPV com base em L1 pode resultar no retardo de monitoramento e tratamento de potenciais infecções por HPV de alto risco. Consequentemente, há uma necessidade por materiais e métodos para genotipagem e/ou quantificação precisas de uma infecção pelo HR-HPV com base em uma outra região do genoma de HPV que não L1 seria uma ferramenta valiosa.

SUMÁRIO

[0007] Composições, ácidos nucleicos, kits, ensaios e métodos descritos aqui se dirigem às deficiências descritas acima ao proporcionar ácidos nucleicos adaptados para detectar especificamente a região E6/E7 de tipos de HPV de alto risco.

[0008] Em um aspecto, um iniciador de ácido nucleico ou sonda específica para uma sequência-alvo na região E6/E7 de um genoma de HPV de alto risco em que: a. o referido iniciador de ácido nucleico ou sonda tem 80% ou mais de identidade em todo, através de todo seu comprimento, com a sequência-alvo e pelo menos uma sequência de ácido nucleico na região E6/E7 de um genoma de um subtipo do mesmo; e b. o referido iniciador de ácido nucleico ou sonda não hibridiza com um ácido nucleico derivado de um tipo diferente de HPV.

[0009] Em uma modalidade, o genoma de HPV de alto risco é selecionado do grupo que consiste em HPV 16, HPV 18 e HPV 45.

[00010] Em uma modalidade, o iniciador de ácido nucleico compreende, consiste essencialmente em ou consiste em uma sequência com cerca de 70% a 100% de identidade com uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 16 a SEQ ID NO: 21 e/ou um complemento das mesmas.

[00011] Em uma modalidade, a sonda de ácido nucleico compreende, consiste essencialmente em ou consiste em uma sequência com cerca de 70% a 100% de identidade com uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 21 e/ou um complemento do mesmo.

[00012] Em uma modalidade, o iniciador é capaz de amplificar uma porção da região E6/E7 do genoma de HPV 16, mas não uma região E6/E7 do genoma de HPV 18 ou HPV 45.

[00013] Em uma modalidade, o iniciador de ácido nucleico compreende, consiste essencialmente em ou consiste em SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou um complemento do mesmo.

[00014] Em uma modalidade, o iniciador é capaz de amplificar uma porção da região E6/E7 do genoma de HPV 18, mas não uma região E6/E7 do genoma de HPV 16 ou HPV 45.

[00015] Em uma modalidade, o iniciador de ácido nucleico compreende, consiste essencialmente em ou consiste em SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5.

[00016] Em uma modalidade, o iniciador é capaz de amplificar uma porção da região E6/E7 do genoma de HPV 45, mas não uma região E6/E7 do genoma de HPV 16 ou HPV 18.

[00017] Em uma modalidade, o iniciador de ácido nucleico compreende, consiste essencialmente em ou consiste em SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8.

[00018] Em uma modalidade, é proporcionado um conjunto de iniciadores que compreende pelo menos um iniciador de ácido nucleico que compreende, que consiste essencialmente em ou que consiste em uma sequência com cerca de 70% a 100% de identidade com uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 16 a SEQ ID NO: 21 e/ou um complemento das mesmas.

[00019] Em uma modalidade, o conjunto de iniciadores compreende, consiste essencialmente em ou consiste em pelo menos um par de iniciadores selecionados do grupo que consiste em: (a) um par de iniciadores capaz de amplificar uma porção da região E6/E7 do genoma de HPV 16, mas não uma região E6/E7 do Genoma do HPV 18 ou HPV 45; (b) um par de iniciadores capaz de amplificar uma porção da região E6/E7 do genoma de HPV 18, mas não de uma região E6/E7 do genoma de HPV 16 ou HPV 45 e (c) um par de iniciadores capaz de amplificar uma porção da região E6/E7 do genoma de HPV 45, mas não uma região E6/E7 do genoma de HPV 16 ou HPV 18.

[00020] Em uma modalidade, o conjunto de iniciadores compreende, consiste essencialmente em ou consiste em um par de iniciadores selecionados do grupo que consiste em: (a) um primeiro iniciador que tem cerca de 70% a 100% de identidade com SEQ ID NO: 1 e um segundo iniciador com cerca de 70% a 100% de identidade com SEQ ID NO: 2; (b) um primeiro iniciador que tem cerca de 70% a 100% de identidade com SEQ ID NO: 4 e um segundo iniciador com cerca de 70% a 100% de identidade com SEQ ID NO: 5; (c) um primeiro iniciador que tem cerca de 70% a 100% de identidade com SEQ ID NO: 7 e um segundo iniciador com cerca de 70% a 100% de identidade com SEQ ID NO: 8; (d) um primeiro iniciador que tem cerca de 70% a 100% de identidade com SEQ ID NO: 10 e um segundo iniciador com cerca de 70% a 100% de identidade com SEQ ID NO: 11; (e) um primeiro iniciador que tem cerca de 70% a 100% de identidade com SEQ ID NO: 16 e um segundo iniciador com cerca de 70% a 100% de identidade com SEQ ID NO: 17; (f) um primeiro iniciador que tem cerca de 70% a 100% de identidade com SEQ ID NO: 19 e um segundo iniciador com cerca de 70% a 100% de identidade com SEQ ID NO: 20.

[00021] O conjunto de iniciadores de acordo com a reivindicação 13 que compreende um par de iniciadores selecionados do grupo que consiste em: (a) um primeiro iniciador que consiste em SEQ ID NO: 1 e um segundo iniciador com cerca de 70% a 100% de identidade com SEQ ID NO: 2; ( b) um primeiro iniciador que consiste em SEQ ID NO: 4 e um segundo iniciador com cerca de 70% a 100% de identidade com SEQ ID NO: 5; (c) um primeiro iniciador que consiste em SEQ ID NO: 7 e um segundo iniciador com cerca de 70 % a 100% de identidade com SEQ ID NO: 8; (d) um primeiro iniciador que consiste em SEQ ID NO: 10 e um segundo iniciador com cerca de 70% a 100% de identidade com SEQ ID NO: 11; (e) um primeiro iniciador que consiste em SEQ ID NO: 16 e um segundo iniciador com cerca de 70% a 100% de identidade com SEQ ID NO: 17; (f) um primeiro iniciador que consiste em SEQ ID NO: 19 e um segundo iniciador com cerca de 70% a 100% de identidade com SEQ ID NO: 20.

[00022] Em outro aspecto, é proporcionado um kit para a detecção de HPV 16, 18 e/ou 45, o referido kit que compreende um iniciador de ácido nucleico ou sonda específica para uma sequência-alvo na região E6/E7 do genoma de HPV de alto risco, em que: a. o referido iniciador de ácido nucleico ou sonda tem 80% ou mais de identidade, através de todo seu comprimento, com a sequência-alvo e pelo menos uma sequência de ácido nucleico na região E6/E7 de um genoma de um subtipo do mesmo; e b. o referido iniciador de ácido nucleico ou sonda não hibridiza com um ácido nucleico derivado de um tipo diferente de HPV.

[00023] Em uma modalidade, o kit compreende, consiste essencialmente em ou consiste em pelo menos um iniciador de ácido nucleico e pelo menos uma sonda de ácido nucleico, em que: (a) o referido iniciador de ácido nucleico compreende, consiste essencialmente em ou consiste em uma sequência com cerca de 70% a 100% de identidade com uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 20 ou um complemento do mesmo;; e (b) a referida sonda de ácido nucleico compreende, consiste essencialmente em ou consiste em uma sequência com cerca de 70% a 100% de identidade com uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 21 ou um complemento das mesmas.

[00024] Em uma modalidade, o kit compreende, consiste essencialmente em ou consiste em um conjunto de iniciador e sonda para HPV 16, um conjunto de iniciador e sonda para HPV 18 e/ou um conjunto de iniciador e sonda para HPV 45.

[00025] Em uma modalidade, (a) o conjunto de iniciador e sonda para HPV 16 compreende: (i) um iniciador com cerca de 70% a 100% de identidade com uma sequência de SEQ ID NO: 1; (ii) um iniciador com cerca de 70% a 100% de identidade com uma sequência de SEQ ID NO: 2; e (iii) uma sonda com cerca de 70% a 100% de identidade com uma sequência de SEQ ID NO: 3; (b) o conjunto de iniciador e sonda para HPV 18 compreende: (i) um iniciador com cerca de 70% a 100% de identidade com uma sequência de SEQ ID NO: 4; (ii) um iniciador com cerca de 70% a 100% de identidade com uma sequência de SEQ ID NO: 5; e (iii) uma sonda com cerca de 70% a 100% de identidade com uma sequência de SEQ ID NO: 6; e (c) o conjunto de iniciador e sonda para HPV 45 compreende (i) um iniciador com cerca de 70% a 100% de identidade com uma sequência de SEQ ID NO: 7; (ii) um iniciador com cerca de 70% a 100% de identidade com uma sequência de SEQ ID NO: 8; e (iii) uma sonda com cerca de 70% a 100% de identidade com uma sequência de SEQ ID NO: 9.

[00026] Em uma modalidade, o kit compreende ainda um conjunto de iniciador e sonda de controle. Em uma modalidade, o conjunto de iniciador e sonda de controle compreende (a) um iniciador com cerca de 70% a 100% de identidade com uma sequência de SEQ ID NO: 16; (b) um iniciador com cerca de 70% a 100% de identidade com uma sequência de SEQ ID NO: 17; e (c) uma sonda com cerca de 70% a 100% de identidade com uma sequência de SEQ ID NO: 18.

[00027] Em outro aspecto, é proporcionado um método de genotipagem de um HPV de alto risco, o método que compreende: (a) hibridização de pelo menos um iniciador de ácido nucleico ou sonda de acordo com a reivindicação 1 a pelo menos uma porção de uma sequência-alvo em uma região E6/E7 de um primeiro genoma de HPV de alto risco;; e (b) detecção de hibridização do ácido nucleico na região E6/E7 do primeiro genoma de HPV de alto risco.

[00028] Em uma modalidade, o iniciador de ácido nucleico ou sonda compreende, consiste essencialmente em ou consiste em uma sequência com cerca de 70% a 100% de identidade com uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 16 a SEQ ID NO: 21 e/ou um complemento das mesmas.

[00029] Em uma modalidade: (a) um iniciador de ácido nucleico é hibridizado com a sequência alvo; e (b) a hibridização é detectada por meio de um método que compreende realização de uma reação de amplificação.

[00030] Em uma modalidade: (a) o HPV de alto risco é selecionado do grupo que consiste em HPV 16, HPV 18 e HPV 45;; e (b) a reação de amplificação gera um fragmento amplificado que corresponde a uma porção da região E6/E7 do genoma de HPV.

[00031] O método de acordo com a reivindicação 25, em que o iniciador de ácido nucleico tem cerca de 70% a 100% de identidade, através de todo seu comprimento, com uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8 ou um complemento das mesmas.

[00032] O método de acordo com a reivindicação 22, em que uma sonda de ácido nucleico é hibridizada com a sequência alvo, onde a referida sonda de ácido nucleico é opcionalmente marcada de forma detectável.

[00033] O método de acordo com a reivindicação 22, em que o referido método é realizado em um formato de PCR multiplex em tempo real.

[00034] O método de acordo com a reivindicação 28, em que o referido método é capaz de distinguir entre infecções pelo HPV 16, HPV 18 e HPV 45, o referido método que compreende: (a) fornecimento de uma amostra suspeita de compreender um HPV de alto risco; (b) contato da amostra com (i) um conjunto de iniciadores capazes de amplificar uma parte de uma sequência-alvo de uma região E6/E7 do genoma de HPV 16, mas não uma região E6/E7 do genoma de HPV 18 ou HPV 45; (ii) um conjunto de iniciadores capazes de amplificar uma parte de uma sequência-alvo de uma região E6/E7 do genoma de HPV 18, mas não uma região E6/E7 do genoma de HPV 16 ou HPV 45; (iii) um conjunto de iniciadores capazes de amplificar uma porção de uma sequência-alvo de uma região E6/E7 do genoma de HPV 45, mas não uma região E6/E7 do genoma de HPV 16 ou HPV 18; (iv) uma sonda de ácido nucleico marcada de forma detectável capaz de hibridizar com uma porção da sequência-alvo da região E6/E7 do genoma de HPV 16, mas não uma região E6/E7 do genoma de HPV 18 ou HPV 45; (v) uma sonda de ácido nucleico marcada de forma detectável capaz de hibridizar com uma porção da sequência-alvo da região E6/E7 do genoma de HPV 18, mas não uma região E6/E7 do genoma de HPV 16 ou HPV 45; e (vi) uma sonda de ácido nucleico marcada de forma detectável capaz de hibridizar com uma porção da sequência-alvo do região E6/E7 do genoma de HPV 45, mas não uma região E6/E7 do genoma de HPV 16 ou HPV 18, em que cada sonda de ácido nucleico tem um marcador detectável diferente; (c) realização de uma amplificação de ácido nucleico; e (d) detecção da presença ou ausência de cada marcador detectável.

[00035] Em outra modalidade, o método é realizado sobre uma plataforma que é capaz de reproduzir um método realizado pelo instrumento Rotor-Gene PCR da QIAGEN.

[00036] Em outra modalidade, o método não é afetado pela presença ou ausência de PreservCyt® (Hologic, Bedford, MA) e SurePatch™ (Becton Dickinson, Sparks MD).

[00037] Em outro aspecto, é fornecida uma composição que compreende um iniciador de ácido nucleico ou sonda, conforme descrito aqui, hibridizada com uma sequência-alvo na região E6/E7 de um genoma de HPV de alto risco.

[00038] Em uma modalidade, a composição compreende um genoma de HPV de alto risco selecionado do grupo que consiste em HPV 16, HPV 18 e HPV 45.

[00039] Em outra modalidade, a composição compreende um iniciador ou sonda que compreende, consiste essencialmente em ou consiste em uma sequência com cerca de 70% a 100% de identidade com uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 16 a SEQ ID NO: 21 e/ou um complemento das mesmas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00040] A Figura 1 ilustra a sensibilidade de ensaio do conjunto de iniciador/sonda para HPV exemplificativo.

[00041] A Figura 2 ilustra os resultados de um estudo de supressão multiplex de conjuntos de iniciador/sonda exemplificativos.

[00042] A Figura 3 ilustra detecções exemplificativas de HPV 16 em ensaios de detecção singleplex e multiplex.

[00043] A Figura 4 ilustra detecções exemplificativas de HPV 16 em ensaios de detecção singleplex e multiplex.

[00044] A Figura 5 ilustra detecções exemplificativas de HPV 16 usando ensaios de detecção singleplex e multiplex.

[00045] A Figura 6 ilustra os resultados de ciclização de laranja (ROX) em um ensaio multiplex exemplificativo e a detecção específica de HPV 16 a 103 cópias/reação e 105 cópias/reação.

[00046] A Figura 7 ilustra os resultados (valores CT) de ciclização de laranja (ROX) em um ensaio multiplex exemplificativo e a detecção de HPV 16.

[00047] A Figura 8 ilustra os resultados de ciclização de amarelo (HEX) em um ensaio multiplex exemplificativo e a detecção específica de HPV 18 a 103 cópias/reação e 105 cópias/reação.

[00048] A Figura 9 ilustra os resultados (valores CT) de ciclização de laranja (HEX) em um ensaio multiplex exemplificativo e a detecção de HPV 18.

[00049] A Figura 10 ilustra os resultados de ciclização de verde (FAM) em um ensaio multiplex exemplificativo e a detecção específica de HPV 45 a 103 cópias/reação e 105 cópias/reação.

[00050] A Figura 11 ilustra os resultados (valores CT) de ciclização de laranja (FAM) em um ensaio multiplex exemplificativo e a detecção de HPV 45.

[00051] A Figura 12 ilustra os resultados de ciclização de vermelho (Cy5) em um ensaio multiplex exemplificativo e a detecção específica de beta-globina como controle.

[00052] A Figura 13 ilustra os resultados (valores CT) de ciclização de laranja (Cy5) em um ensaio multiplex exemplificativo e a detecção de beta-globina de controle.

[00053] A Figura 14 ilustra os resultados de um ensaio multiplex exemplificativo e a detecção de HPV 16 a 5, 10, 100 e 103 cópias/reação.

[00054] A Figura 15 ilustra os resultados (valores CT) de ciclização de laranja (ROX) em um ensaio multiplex exemplificativo e a detecção de HPV 16 em diferentes cópias/reação.

[00055] A Figura 16 ilustra os resultados de um ensaio multiplex exemplificativo e a detecção de HPV 18 a 5, 10, 100 e 103 cópias/reação.

[00056] A Figura 17 ilustra os resultados (valores CT) de ciclização de amarelo (HEX) em um ensaio multiplex exemplificativo e a detecção de HPV em diferentes 18 cópias/reação.

[00057] A Figura 18 ilustra os resultados de um ensaio multiplex exemplificativo e a detecção de HPV 45 a 5, 10, 100 e 103 cópias/reação.

[00058] A Figura 19 ilustra os resultados (valores CT) de ciclização de verde (FAM) em um ensaio multiplex exemplificativo e a detecção de HPV em diferentes 45 cópias/reação.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[00059] A presente descrição inclui composições, métodos, reagentes, sistemas e kits para determinar rapidamente a presença de uma molécula de ácido nucleico em uma amostra e para quantificação da molécula de ácido nucleico alvo. As composições, métodos, reagentes, sistemas e kits podem ser usados para fins de diagnóstico clínico e/ou para caracterização de persistência viral de HPV ao nível de genótipo, a cinética da carga viral e/ou a probabilidade de recorrência da doença.

[00060] As composições, métodos, reagentes, sistemas e kits de acordo com a presente invenção proporcionam um teste eficaz para testagem inicial ou testagem de acompanhamento para genotipagem e/ou quantificação de tipos de HPV, tais como 16, 18 e/ou 45 . Por exemplo, os métodos incluem testagem de amostras não testadas, verificação da presença e/ou quantificação de HPV 16, 18 e/ou 45 em amostras positivas e verificação da ausência de HPV 16, 18 e/ou 45 em amostras negativas.

[00061] Uma vez que as cargas virais de HPV têm sido correlacionadas com a progressão da doença, por exemplo, câncer cervical, a carga viral de HPV pode ser um marcador de risco dependente do tipo para carcinoma invasivo. Assim, os métodos incluem quantificação e classificação da carga viral para diagnosticar e rastrear o risco de câncer, incluindo determinação da prioridade dos métodos de tratamento, etc.

[00062] Os métodos da presente invenção também incluem amostras de rastreio para deleções/mutações em L1, uma vez que E6 e E7 são, em alguns casos, as regiões alvo para determinar se um tipo de HPV específico está presente ou ausente.

[00063] O design multiplex da presente invenção poupa tempo e eluato de amostra quando comparado com testagem/genotipagem individual de tipos de HPV, tais como 16, 18 e/ou 45. Iniciadores e Sondas

[00064] Os iniciadores e sondas da presente invenção são capazes de objetivar genes nas regiões de E6 e E7 para os genótipos de HPV 16, 18 e 45. As regiões E6 e E7 são regiões alvo adequadas porque elas não são tão propensas a eventos mutagênicos durante integração quanto a região L1. Os iniciadores e as sondas são específicos para HPV 16, 18 e 45 e não exibem qualquer reatividade cruzada substancial entre si ou entre outros tipos de HPV. Os iniciadores e as sondas podem ser sensíveis em detecção da presença de HPV 16, 18 ou 45 com tão poucas quanto 5 cópias de sequência-alvo por reação presente.

[00065] Em modalidades, os iniciadores podem ter de cerca de 15 a 50 nucleotídeos de comprimento, tal como de cerca de 18 a 30, cerca de 20 a 26 ou cerca de 22 e 24 nucleotídeos. A título de exemplo e não como limitação, os iniciadores podem ter não mais do que 50 nucleotídeos de comprimento e não mais do que 30 nucleotídeos de comprimento e não mais do que 26 nucleotídeos de comprimento ou não mais do que 24 nucleotídeos de comprimento. As sondas podem ter de cerca de 15 a cerca de 60 nucleotídeos de comprimento, tal como de cerca de 18 a 40 anos, cerca de 20 a 35 ou cerca de 22 a 30. A título de exemplo e não como limitação, as sondas podem ter não mais do que 60 nucleotídeos de comprimento, não mais do que 40 nucleotídeos de comprimento e não mais do que 35 nucleotídeos de comprimento ou não mais do que 30 nucleotídeos de comprimento.

[00066] Iniciadores e sondas exemplificativos são apresentados nas Tabelas abaixo para cada um dos tipos de HPV 16, 18 e 45. Para o tipo 45, dois conjuntos de iniciadores e sonda são mostrados com o Conjunto # 1 (SEQ ID NOs 7-9) sendo uma modalidade preferida para análise multiplex. Nas tabelas abaixo, as sequências de sondas são conjugadas com um sinal sobre a extremidade 5' e um dissipador na extremidade 3'. Estas moléculas são mostradas abaixo (em negrito e sublinhado), mas elas não são parte da sequência de ácido nucleico representada pelas respectivas SEQ ID NOs.

[00067] Em algumas modalidades, um controle pode ser usado com os conjuntos de iniciador e sonda acima, por exemplo, um conjunto de iniciador e sonda de beta-globina pode ser usado com o sistema multiplex com um quarto sinal detectável. Qualquer controle adequado pode ser usado, contanto que ele não interfira com a detecção e quantificação dos conjuntos de iniciador e sonda exemplificados acima. Os conjuntos de iniciadores e sondas a seguir podem ser usados como controles, com o conjunto N° 1 sendo preferido para análise multiplex. Tabela 5 - Conjunto de Iniciador/Sonda para Beta-Globina # 1:

[00068] Os iniciadores e as sondas podem também incluir aqueles iniciadores e sondas com cerca de 70% a 100% de identidade e/ou homologia com iniciadores e sondas diferentes, tais como 75% ou mais, 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais e/ou 98% ou mais de identidade e/ou homologia. A título de exemplo e não de limitação, o iniciador e/ou sonda pode ter de 70% a 100% de identidade e/ou homologia com uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 16 a SEQ ID NO: 21. Como um exemplo adicional, a sonda pode ter 75% ou mais, 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais e/ou 98% ou mais de identidade e/ou homologia com uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 16 a SEQ ID NO: 21.

[00069] Em uma modalidade, um ácido nucleico que compreende uma sequência 3' terminal capaz de hibridizar com os nucleotídeos 695719 de SEQ ID NO: 13 ou o complemento da mesma é usado como um iniciador específico para E6/E7 de HPV 16. A título de exemplo e não de limitação, a sequência 3' terminal compreende ou consiste em uma sequência tendo 70% ou mais, 75% ou mais, 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais e/ou 98% ou mais de identidade e/ou homologia com os nucleotídeos 695 a 719 de SEQ ID NO: 13 ou o complemento da mesma. Como outro exemplo, o iniciador específico para E6/E7 de HPV 16 consiste em uma sequência tendo 70% ou mais, 75% ou mais, 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais e/ou 98% ou mais de identidade e/ou homologia com os nucleotídeos 695 a 719 de SEQ ID NO: 13 ou o complemento da mesma.

[00070] Em outra modalidade, um ácido nucleico que compreende uma sequência 3' terminal capaz de hibridizar com os nucleotídeos 811 a 834 de SEQ ID NO: 13 ou um complemento das mesmas é usado como um iniciador específico para E6/E7 de HPV 16. A título de exemplo e não de limitação, a sequência 3' terminal compreende ou consiste em uma sequência tendo 70% ou mais, 75% ou mais, 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais e/ou 98% ou mais de identidade e/ou homologia com os nucleotídeos 811 a 834 de SEQ ID NO: 13 ou o complemento da mesma. Como outro exemplo, o iniciador específico para E6/E7 de HPV 16 consiste em uma sequência tendo 70% ou mais, 75% ou mais, 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais e/ou 98% ou mais de identidade e/ou homologia com os nucleotídeos 811 a 834 de SEQ ID NO: 13 ou o complemento da mesma.

[00071] Em outra modalidade, uma sonda capaz de hibridizar com os nucleotídeos 751 a 775 de SEQ ID NO: 13 ou o complemento da mesma é usada como uma sonda. A título de exemplo e não de limitação, a sonda compreende ou consiste em uma sequência tendo 70% ou mais, 75% ou mais, 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais e/ou 98% ou mais de identidade e/ou homologia com os nucleotídeos 751 a 775 de SEQ ID NO: 13 ou o complemento da mesma.

[00072] Em uma outra modalidade, um conjunto de iniciadores específicos para E6/E7 de HPV 16 é fornecido que compreende: (a) um primeiro iniciador que compreende uma sequência 3' terminal capaz de hibridizar com o complemento dos nucleotídeos 695 a 719 de SEQ ID NO: 13; e (b) um segundo iniciador que compreende uma sequência 3' terminal capaz de hibridizar com os nucleotídeos 811 a 834 de SEQ ID NO: 13.

[00073] Em outra modalidade, um conjunto de iniciador/sonda específico para E6/E7 de HPV 16 é fornecido que compreende: (a) um primeiro iniciador que compreende uma sequência 3' terminal capaz de hibridizar com o complemento dos nucleotídeos 695 a 719 de SEQ ID NO: 13; (b) um segundo iniciador que compreende uma sequência 3' terminal capaz de hibridizar com os nucleotídeos 811 a 834 de SEQ ID NO: 13 e (c) uma sonda capaz de hibridizar com os nucleotídeos 751 a 775 de SEQ ID NO: 13 ou o complemento da mesma.

[00074] Em uma modalidade, um ácido nucleico que compreende uma sequência 3' terminal capaz de hibridizar com os nucleotídeos 724 a 747 de SEQ ID NO: 14 ou o complemento da mesma é usado como um iniciador específico para E6/E7 de HPV 18. A título de exemplo e não de limitação, a sequência 3' terminal compreende ou consiste em uma sequência tendo 70% ou mais, 75% ou mais, 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais e/ou 98% ou mais de identidade e/ou homologia com os nucleotídeos 724 a 747 de SEQ ID NO: 14 ou o complemento da mesma. Como outro exemplo, o iniciador específico para E6/E7 de HPV 18 consiste em uma sequência tendo 70% ou mais, 75% ou mais, 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais e/ou 98% ou mais de identidade e/ou homologia com os nucleotídeos 724 a 747 de SEQ ID NO: 14 ou o complemento da mesma.

[00075] Em uma outra modalidade, um ácido nucleico que compreende uma sequência 3' terminal capaz de hibridizar com os nucleotídeos 837 a 860 de SEQ ID NO: 14 ou um complemento das mesmas é usado um iniciador específico para E6/E7 de HPV 18. A título de exemplo e não de limitação, a sequência 3' terminal compreende ou consiste em uma sequência tendo 70% ou mais, 75% ou mais, 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais e/ou 98% ou mais de identidade e/ou homologia com os nucleotídeos 837-860 de SEQ ID NO: 14 ou o complemento da mesma. Como outro exemplo, o iniciador específico para E6/E7 de HPV 18 consiste em uma sequência tendo 70% ou mais, 75% ou mais, 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais e/ou 98% ou mais de identidade e/ou homologia com os nucleotídeos 837 a 860 de SEQ ID NO: 14 ou o complemento da mesma.

[00076] Em outra modalidade, uma sonda capaz de hibridizar com os nucleotídeos 748 a 773 de SEQ ID NO: 14 ou o complemento da mesma é usada como uma sonda. A título de exemplo e não de limitação, a sonda compreende ou consiste em uma sequência tendo 70% ou mais, 75% ou mais, 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais e/ou 98% ou mais de identidade e/ou homologia com os nucleotídeos 837-860 de SEQ ID NO: 14 ou o complemento da mesma.

[00077] Em outra modalidade, um conjunto de iniciadores específicos para E6/E7 de HPV 18 é fornecido que compreende: (a) um primeiro iniciador que compreende a sequência 3' terminal capaz de hibridizar com o complemento de nucleotídeos 724 a 747 de SEQ ID NO: 14;; e (b) um segundo iniciador que compreende uma sequência 3' terminal capaz de hibridizar com os nucleotídeos 837-860 de SEQ ID NO: 14.

[00078] Em uma outra modalidade, um conjunto de iniciadores específico para E6/E7 de HPV 18 é fornecido que compreende: (a) um primeiro iniciador que compreende a sequência 3' terminal capaz de hibridizar com o complemento de nucleotídeos 724 a 747 de SEQ ID NO: 14, ( b) um segundo iniciador que compreende uma sequência 3' terminal capaz de hibridizar com os nucleotídeos 837-860 de SEQ ID NO: 14 e (c) uma sonda capaz de hibridizar com os nucleotídeos 748 a 773 de SEQ ID NO: 14 ou o complemento da mesma.

[00079] Em uma modalidade, um ácido nucleico que compreende uma sequência 3' terminal capaz de hibridizar com os nucleotídeos 112 a 135 de SEQ ID NO: 15 ou o complemento da mesma é usado como um iniciador específico para E6/E7 de HPV 45. A título de exemplo e não de limitação, a sequência 3' terminal compreende ou consiste em uma sequência tendo 70% ou mais, 75% ou mais, 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais e/ou 98% ou mais de identidade e/ou homologia com os nucleotídeos 112 a 135 de SEQ ID NO: 15 ou o complemento da mesma. Como outro exemplo, o iniciador específico para E6/E7 de HPV 45 consiste em uma sequência tendo 70% ou mais, 75% ou mais, 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais e/ou 98% ou mais de identidade e/ou homologia com os nucleotídeos 112 a 135 de SEQ ID NO: 15 ou o complemento da mesma.

[00080] Em outra modalidade, um ácido nucleico que compreende uma sequência 3' terminal capaz de hibridizar com os nucleotídeos 208 a 231 de SEQ ID NO: 15 ou um complemento da mesma é usado um iniciador específico para E6/E7 de HPV 45. A título de exemplo e não de limitação, a sequência 3' terminal compreende ou consiste em uma sequência tendo 70% ou mais, 75% ou mais, 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais e/ou 98% ou mais de identidade e/ou homologia com os nucleotídeos 208 a 231 de SEQ ID NO: 15 ou o complemento da mesma. Como outro exemplo, o iniciador específico para E6/E7 de HPV 45 consiste em uma sequência tendo 70% ou mais, 75% ou mais, 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais e/ou 98% ou mais de identidade e/ou homologia com os nucleotídeos 208 a 231 de SEQ ID NO: 15 ou o complemento da mesma.

[00081] Em outra modalidade, uma sonda capaz de hibridizar com os nucleotídeos 136 a 165 de SEQ ID NO: 15 ou o complemento da mesma é usada como uma sonda. A título de exemplo e não de limitação, a sonda compreende ou consiste em uma sequência tendo 70% ou mais, 75% ou mais, 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais e/ou 98% ou mais de identidade e/ou homologia com os nucleotídeos 136-165 de SEQ ID NO: 15 ou o complemento da mesma.

[00082] Em outra modalidade, um conjunto de iniciadores específicos para E6/E7 de HPV 45 é fornecido que compreende: (a) um primeiro iniciador que compreende a sequência 3' terminal capaz de hibridizar com o complemento de nucleotídeos 112 a 135 de SEQ ID NO: 15;; e (b) um segundo iniciador que compreende uma sequência 3' terminal capaz de hibridizar com os nucleotídeos 208-231 de SEQ ID NO: 15.

[00083] Em outra modalidade, um conjunto de iniciadores específicos para E6/E7 de HPV 45 é fornecido que compreende: (a) um primeiro iniciador que compreende a sequência 3' terminal capaz de hibridizar com o complemento de nucleotídeos 112 a 135 de SEQ ID NO: 15, ( b) um segundo iniciador que compreende uma sequência 3' terminal capaz de hibridizar com os nucleotídeos 208 a 231 de SEQ ID NO: 15 e (c) uma sonda capaz de hibridizar com os nucleotídeos 136 a 165 de SEQ ID NO: 15 ou o complemento da mesma.

[00084] Em uma modalidade, um ácido nucleico que compreende uma sequência 3' terminal capaz de hibridizar com os nucleotídeos 402 a 425 de SEQ ID NO: 15 ou o complemento da mesma é usado como um iniciador específico para E6/E7 de HPV 45. A título de exemplo e não de limitação, a sequência 3' terminal compreende ou consiste em uma sequência tendo 70% ou mais, 75% ou mais, 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais e/ou 98% ou mais de identidade e/ou homologia com os nucleotídeos 402 a 425 de SEQ ID NO: 15 ou o complemento da mesma. Como outro exemplo, o iniciador específico para E6/E7 de HPV 45 consiste em uma sequência tendo 70% ou mais, 75% ou mais, 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais e/ou 98% ou mais de identidade e/ou homologia com os nucleotídeos 402 a 425 de SEQ ID NO: 15 ou o complemento da mesma.

[00085] Em outra modalidade, um ácido nucleico que compreende uma sequência 3' terminal capaz de hibridizar com os nucleotídeos 546 a 569 de SEQ ID NO: 15 ou um complemento da mesma é usado um iniciador específico para E6/E7 de HPV 45. A título de exemplo e não de limitação, a sequência 3' terminal compreende ou consiste em uma sequência tendo 70% ou mais, 75% ou mais, 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais e/ou 98% ou mais de identidade e/ou homologia com os nucleotídeos 546 a 569 de SEQ ID NO: 15 ou o complemento da mesma. Como outro exemplo, o iniciador específico para E6/E7 de HPV 45 consiste em uma sequência tendo 70% ou mais, 75% ou mais, 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais e/ou 98% ou mais de identidade e/ou homologia com os nucleotídeos 546 a 569 de SEQ ID NO: 15 ou o complemento da mesma.

[00086] Em outra modalidade, uma sonda capaz de hibridizar com os nucleotídeos 517 a 542 de SEQ ID NO: 15 ou o complemento da mesma é usada como uma sonda. A título de exemplo e não de limitação, a sonda compreende ou consiste em uma sequência tendo 70% ou mais, 75% ou mais, 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais e/ou 98% ou mais de identidade e/ou homologia com os nucleotídeos 517 a 542 de SEQ ID NO: 15 ou o complemento da mesma.

[00087] Em outra modalidade, um conjunto de iniciadores específicos para E6/E7 de HPV 45 é fornecido que compreende: (a) um primeiro iniciador que compreende a sequência 3' terminal capaz de hibridizar com o complemento de nucleotídeos 402 a 425 de SEQ ID NO: 15; e (b) um segundo iniciador que compreende uma sequência 3' terminal capaz de hibridizar com os nucleotídeos 546 a 569 de SEQ ID NO: 15.

[00088] Em outra modalidade, um conjunto de iniciadores específicos para E6/E7 de HPV 45 é fornecido que compreende: (a) um primeiro iniciador que compreende a sequência 3' terminal capaz de hibridizar com o complemento de nucleotídeos 402 a 425 de SEQ ID NO: 15; (b) um segundo iniciador que compreende uma sequência 3' terminal capaz de hibridizar com os nucleotídeos 546 a 569 de SEQ ID NO: 15; e (c) uma sonda capaz de hibridizar com os nucleotídeos 517 a 542 de SEQ ID NO: 15 ou o complemento da mesma.

[00089] Conforme usado aqui, as frases "iniciador específico para E6/E7 de HPV 16", "iniciador específico para E6/E7 de HPV 18" e "iniciador específico para E6/E7 de HPV 45" referem-se a iniciadores de ácido nucleico capazes de mediar a amplificação de uma porção da região E6/E7 do genoma de HPV do tipo indicado, mas que não é capaz de mediar a amplificação de uma porção da região E6/E7 do genoma de um tipo diferente de HPV.

[00090] Em uma modalidade, as sondas são concebidas para incluir um sinal detectável, tal como um sinal radioativo, de biotina ou fluorescente, adequado para detecção independente dos genótipos a serem testados. Qualquer sinal detectável adequado pode ser usado, por exemplo, HPV 16 pode ser marcado com ROX, uma molécula fluorescente laranja; HPV 18 pode ser marcado com HEX, uma molécula fluorescente amarela; HPV 45 pode ser marcado com FAM, uma molécula fluorescente verde; e o controle, beta-globina, pode ser marcado com Cy5, uma molécula fluorescente vermelha. Em modalidades, conforme mostrado nas tabelas acima, as sondas podem ser sondas TaqMan com um fluoroforo covalentemente ligado à extremidade 5' da sonda e um dissipador ligado à extremidade 3' da sonda. Quando o fluoroforo e dissipador estão em proximidade, qualquer fluorescência é inibida pelo dissipador. No entanto, quando a Taq polimerase estende o iniciador, a sonda é degradada pela atividade de exonuclease da polimerase, deste modo, liberando o fluoroforo da atividade de dissipação do dissipador. Qualquer combinação adequada de marcador e dissipador pode ser usada.

[00091] Em outra modalidade, a sonda é usada para gerar um híbrido de DNA:RNA para uso na captura híbrida. A tecnologia de captura de híbridos usa determinados anticorpos capazes de se ligar aos híbridos de DNA:RNA em vários métodos de purificação e detecção de ácidos nucleicos alvo específicos em uma amostra. Várias iterações do método de captura de híbridos são descritos, inter alia, nas Patentes Norte Americanas Nos 5.994.079, 6.027.897, 6.277.579, 6.686.151 e 7.439.016; Publicações de Patente Norte Americanas Nos 2006/0051809 A1, 2009/0162851 A1 e 2009-0298187 A1; e Publicação PCT N° WO 01/96608, cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua totalidade. O protocolo básico de captura de híbridos compreende: (1) hibridização de uma sonda de ácido nucleico com o ácido nucleico alvo para gerar um híbrido de DNA:RNA; (2) associação do híbrido de DNA:RNA com uma fase sólida para facilitar o isolamento do ácido nucleico alvo; e (3) detecção do híbrido de DNA:RNA. Em várias iterações, anticorpos anti-híbridos de DNA:RNA podem ser usados em qualquer uma da etapa (2) ou etapa (3). A título de exemplo e não de limitação, o anticorpo anti-híbrido de DNA:RNA pode ser ligado à fase sólida (covalentemente ou de outra forma), deste modo, mediando a "captura" do híbrido de DNA:RNA à fase sólida. Alternativamente, uma sonda de ácido nucleico ligada à fase sólida (covalentemente ou de outra forma) pode capturar o híbrido de DNA:RNA à fase sólida, o qual pode, então, ser detectado por um anticorpo anti-híbrido de DNA:RNA marcado de forma detectável.

Preparo de Amostras

[00092] Qualquer método de preparo de amostra adequado pode ser usado. Quando os métodos são usados para verificar ou quantificar um resultado positivo ou negativo, pode ser usada uma amostra do espécime já purificada. Quando os métodos são usados para fazer uma determinação/quantificação inicial de HPV 16, 18 e/ou 45, as amostras podem ser purificadas usando qualquer método de purificação de amostra adequado. Equipamento e Condições de PCR

[00093] Qualquer equipamento e condições de PCR adequados capazes de análise por PCR em tempo real pode ser usado para amplificar e detectar o produto de PCR alvo. Em modalidades, um Q- Rotor Gene, feito pela Qiagen, pode ser usado.

EXEMPLOS

[00094] Um Conjunto de Iniciador/Sonda para HPV 16 (SEQ ID NOs. 1-3), o Conjunto de Iniciador/Sonda para HPV 18 (SEQ ID NOs. 4-6) e Conjunto de Iniciador/Sonda para HPV 45 N° 1 (SEQ ID NOs. 7-9) foram avaliados em PCR em tempo real singleplex. A especificidade analítica contra ambos os tipos de HPV de alto risco (High Risk - HR) e baixo risco (Low Risk - LR) foi testada usando plasmídeos em um sistema limpo a 1E+7 cópias/ensaio. Tipos de HPV 6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 61, 66, 67, 68, 69, 71, 72, 73, 81, 82, 2, 3, 13, 30, 34, 44, 70 e 83 foram testados. Os resultados mostraram que os conjuntos de Iniciadores/Sonda eram específicos, respectivamente, para HPV 16, 18 e 45.

[00095] Os conjuntos de Iniciador/Sonda também foram testados contra possíveis substâncias de interferência, isto é, sangue, geléia anticoncepcional, espermicida, creme hidratante, anestésico para hemorróidas, óleo corporal, creme anti-fúngico, lubrificantes vaginais e spray feminino. Os resultados mostraram que estas substâncias não interferem com a especificidade dos conjuntos de Iniciadores/Sonda.

[00096] Os conjuntos de Iniciador/Sonda também foram testados contra 16 patógenos não-HPV conforme as recomendações do FDA.

[00097] O Conjunto de Iniciador/Sonda para HPV 16, Conjunto de Iniciador/Sonda para HPV 18 e Conjunto de Iniciador/Sonda para HPV 45 N° 1 foram verificados por meio de análise pelo BLAST. As sequências foram comparadas com todos os tipos de HPV mucosal correspondentes e todos os subtipos conhecidos de HPV 16, 18 e 45 no banco de dados NCBI. Nenhum subtipo conhecido de HPV 16, 18 e 45 produziu mais que 10% de combinação errônea. Todos os subtipos conhecidos tinham uma homologia maior do que 90%. Sequências com mais de 80% de homologia com os iniciadores e sondas para HPV 16, 18 e 45 são mostrados na Tabela 7. Tabela 7 - Sequências com mais de 80% de homologia com iniciadores e sondas para HPV 16, 18 e 45

Preparo de Amostras

[00098] As amostras foram purificadas usando um kit QIAamp Media MDx modificado, o qual é uma tecnologia de extração e purificação de ácidos nucleicos comercialmente disponível com base em absorção de gel de sílica em um formato de coluna. As etapas modificadas em relação ao protocolo padrão dependendo do tipo de espécime são mostradas abaixo na Tabela 8. Tabela 8 - Protocolo Modificado Dependendo do Tipo de Espécime

PCR em Tempo Real

[00099] As amostras purificadas foram, então, usadas com o Conjunto de Iniciador/Sonda para HPV 16, Conjunto de Iniciador/Sonda para HPV 18 e Conjunto de Iniciador/Sonda para HPV 45 N° 1, juntamente com o Conjunto de Iniciador/Sonda para beta-globina N° 1. A mistura e as condições do método de PCR são mostrados abaixo na Tabela 9. Tabela 9 - Mistura para PCR e Condições de Ciclagem

[000100] Sensibilidade do Ensaio: A faixa dinâmica de cada conjunto de iniciador/sonda multiplex para HPV 16, 18 e 45 foi determinada usando um modelo de plasmídeo. A faixa dinâmica foi determinada como sendo de pelo menos 6 magnitudes. Conforme ilustrado na Figura 1, um coeficiente de correlação (valor R2) de > 0,97 e eficiência de PCR de > 0,97 foi obtido consistentemente para HPV 16, 18 e 45 de 107 para 10 cópias de genoma/ensaio. Descobriu-se que valores Ct e LOD para cada iniciador/sonda de HPV eram comparáveis entre a detecção por ensaio singleplex e detecção por ensaio multiplex.

[000101] Especificidade de Ensaio: Cada par de iniciador/sonda foi testado em multiplex quanto à especificidade contra 27 tipos de HPV HR e LR a 1 x 107 cópias/ensaio de cada tipo de plasmídeo de HPV. Os resultados são mostrados abaixo nas Tabelas 10 e 11. Tabela 10: Especificidade de Ensaio para Tipos de HPV RH

*Iniciadores e sondas para HPV 18 detectaram, sem consistência, entrada de HPV 45 de 107 com valor Ct > 40 e detecção de > 5 cópias/ensaio. Tabela 11: Especificidade do Ensaio para Tipos de HPV LR Tipo Sonda HPV

[000102] Ensaio de Especificidade-Supressão/Inibição em Multiplex: Para testar a especificidade do ensaio multiplex, HPV 16, 18 e 45 foram diluídos 10 vezes de 10 cópias para 107 cópias. Estas diluições foram testadas em um pool de plasmídeo de HPV 16, 18 ou 45 + HPV 39, 43, 67 e 83 a 107 cópias/ensaio de cada tipo de HPV. Conforme ilustrado na Figura 2, a supressão de especificidade dos ensaios para cada um dos tipos de HPV alvo era mínima.

[000103] Desempenho da Amostra Clínica: Mais de 1000 espécimes cervicais que foram rastreados com HC2 e sofreram genotipagem GP PCR/LMX de meios STM, PC e SP foram testados no formato de ensaio multiplex. Os resultados de GP PCR são mostrados abaixo nas Tabelas 12-14. Tabela 12 - Resultados de Espécime MCT para GP PCR

Tabela 13 - Resultados de Espécimes PC para GP PCR

Tabela 14 - Resultados de Espécime SP para GP PCR

[000104] As Figuras 3-5 ilustram vários exemplos de detecção de HPV 16 em ensaios individuais e multiplex para vários tipos de amostras.

[000105] Cerca de 500 amostras foram testadas em singleplex e multiplex. Estes testes mostraram resultados comparáveis quando de genotipagem de espécimes positivos ou negativos para os tipos de HPV alvo (16, 18 e 45).

[000106] Amostras clínicas com múltiplas infecções de HPV sofreram genotipagem usando GP 5+/6+ LMX Genotyping, conforme descrito, por exemplo, na Patente Norte Americana N° 6.352.825, a descrição completa da qual é aqui incorporada por referência. Usando cerca de 25 μL de amostra, os conjuntos de iniciadores e sondas para HPV 16, 18 e 45 foram usados para detectar a presença ou ausência de HPV 16, 18 e 45. Os resultados são resumidos na Tabela 15 abaixo. Tabela 15 - Exemplos de Amostras Clínicas com Múltiplas Infecções

[000107] Ensaios 4-Plex: Iniciadores e sondas para beta-globina foram usados como um controle interno juntamente com os conjuntos de iniciador/sonda para HPV 16, 18 e 45. Várias amostras foram examinadas com os iniciadores e sondas 4-Plex. As amostras são resumidas na Tabela 16 a seguir. Tabela 16 - Amostras Examinadas com 4-Plex Para Testar a Especificidade

[000108] Os resultados de exame destas amostras são ilustrados nas Figuras 6-13. Os ensaios demonstraram que: • O canal laranja é específico apenas para amostras que contêm DNA de HPV 16 detectado pela sonda ROX; • O canal amarelo é específico apenas para amostras que contêm DNA de HPV 18, detectado pela sonda HEX; • O canal verde é específico apenas para amostras que contêm DNA de HPV 45 detectado pela sonda FAM; • O canal vermelho é específico apenas para a base clínica negativo +/- para o plasmídeo de HPV 16, 18 ou 45 detectado pela sonda Cy5.

[000109] Assim, a especificidade de cada canal para o fluoroforo selecionado no formato multiplex, incluindo os iniciadores e sondas de controle interno, foi demonstrada.

[000110] Além de especificidade, o ensaio 4-Plex demonstra sensibilidade na detecção da presença de HPV 16, 18 e/ou 45. As amostras listadas na Tabela 17 a seguir foram examinadas com os iniciadores e sondas 4-Plex. Tabela 17 - Amostras Examinadas com 4-Plex Para Testar a

[000111] Cada uma das diluições de amostras foram misturadas em um pool de eluato clínico negativo. Os resultados de exame destas amostras são ilustrados nas Figuras 14-19. Cada um dos conjuntos de iniciador/sonda demonstrou sensibilidade, sendo detectável em níveis de pelo menos 5 cópias/reação, na presença da base clínica HPV negativa. Sequenciamento de Amostras:

[000112] Das inúmeras amostras testadas anteriormente, 34 amostras (17 positivas por multiplex e 17 negativas por multiplex) foram sequenciadas. Todo sequenciamento de amostra correspondia aos dados de multiplex, assim, fornecendo verificação adicional da especificidade, sensibilidade e precisão do ensaio multiplex.

[000113] Será apreciado que várias das características e aspectos descritos acima e outros ou alternativas dos mesmos podem, desejavelmente, ser combinados em muitos outros sistemas ou aplicações diferentes. Também, várias alternativas, modificações, variações ou aprimoramentos presentemente imprevistos na mesma podem ser feitos subsequentemente por aqueles versados na técnica e também se destinam a ser abrangidos pelas reivindicações a seguir.

Claims

1. Método para genotipagem de um HPV de alto risco, caracterizado pelo fato de que compreende: a. hibridizar pelo menos um iniciador de ácido nucleico a pelo menos uma porção de uma sequência-alvo em uma região E6/E7 de um primeiro genoma de HPV de alto risco,; e b. detectar a hibridização do iniciador de ácido nucleico à região E6/E7 do primeiro genoma de HPV de alto risco, em que a hibridização é detectada por um método compreendendo realizar uma reação de amplificação e utilizar uma sonda de ácido nucleico; em que o HPV de alto risco é selecionado do grupo que consiste em HPV 16, HPV 18 e HPV 45; e em que (i) o conjunto de iniciadores e sonda de HPV 16 compreende: (a) um iniciador consistindo na sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, (b) um iniciador consistindo na sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2, e (c) uma sonda consistindo na sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3; (ii) o conjunto de iniciadores e sonda de HPV 18 compreendem: (a) um iniciador consistindo na sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4, (b) um iniciador consistindo na sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5, e (c) uma sonda consistindo na sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 6; e (iii) o conjunto de iniciadores e sonda de HPV 45 compreende: (a) um iniciador consistindo na sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 7, (b) um iniciador consistindo na sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 8, e (c) uma sonda consistindo na sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 9; ou (d) um iniciador consistindo na sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 10, (e) um iniciador consistindo na sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11, e (f) uma sonda consistindo na sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 12.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o iniciador de ácido nucleico faz parte de um conjunto de iniciadores compreendendo pelo menos um par de iniciadores selecionados do grupo que consiste em: a. um par de iniciadores para amplificar uma porção da região E6/E7 do genoma do HPV 16, mas não uma região E6/E7 do genoma do HPV 18 ou HPV 45; b. um par de iniciadores para amplificar uma porção da região E6/E7 do genoma do HPV 18, mas não uma região E6/E7 do genoma do HPV 16 ou HPV 45; e c. um par de iniciadores para amplificar uma porção da região E6/E7 do genoma do HPV 45, mas não uma região E6/E7 do genoma do HPV 16 ou HPV 18.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 a 2, caracterizado pelo fato de que a sonda de ácido nucleico é hibridizada com a sequência alvo, em que a sonda de ácido nucleico hibridiza com pelo menos uma porção de uma sequência alvo em uma região E6/E7 de uma genoma de HPV de risco, em que a sonda de ácido nucleico é específica para uma sequência alvo na região E6/E7 de um genoma de HPV de alto risco e em que a referida sonda de ácido nucleico tem i) pelo menos uma sequência de ácido nucleico na região E6/E7 de um genoma de um subtipo do mesmo e ii) a referida sonda de ácido nucleico não hibridiza com um ácido nucleico de um tipo diferente de HPV; em que a sonda de ácido nucleico é marcada de forma detectável.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que um iniciador e sonda de HPV 16 e um iniciador e sonda de HPV 18 e/ou iniciador e sonda de HPV 45 são usados para genotipagem.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que distingue entre infecções por HPV 16, HPV 18 e HPV 45.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o referido método é realizado em um formato de PCR multiplex em tempo real.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que compreende ainda o uso de um conjunto de iniciadores e sondas controle, que de preferência possui as seguintes características: a. é conjunto controle de iniciadores e sondas de beta globina; ou b. é um conjunto controle de iniciadores e sonda de beta globina, em que o referido conjunto controle de iniciadores e sonda compreende (i) um iniciador consistindo na sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 16, (ii) um iniciador consistindo na sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 17, e (iii) uma sonda consistindo na sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 18.