CN117987598A - 检测戊型肝炎病毒的引物对、试剂盒及方法 - Google Patents

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王文龙
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Abstract

本公开涉及一种检测戊型肝炎病毒的引物对、探针和试剂盒，属于生物核酸分子检测技术领域。基于本公开提供的引物和探针可以通过RT‑RAA‑LFD或qRT‑RAA两种方式进行戊型肝炎病毒的扩增，只需在恒温条件下短时间反应即可完成，整个反应过程对仪器设备要求低，耗时短，操作简单，成本低廉，结果可实现肉眼可视化，无需要依赖贵重的凝胶成像系统和电脑等设备，尤其适用于基层现场诊断、即时检测和微量检测。实现了戊型肝炎病毒的现场快速可视化检测。在兽医临床具有广泛的应用前景，也为保障动物源性食品安全提供技术支撑。

Description

检测戊型肝炎病毒的引物对、试剂盒及方法
技术领域
本公开属于生物核酸分子检测技术领域，具体涉及一种检测戊型肝炎病毒的引物对、探针和试剂盒。
背景技术
戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)是全球急性病毒性肝炎最常见的原因之一，HEV感染使全球公共卫生安全受到了威胁和挑战。戊型肝炎病毒是目前已知的五种肝炎病毒之一，病毒类学研究将其划归为戊型肝炎病毒科，其又可分为两个属，即正戊型肝炎病毒属(Orthohepevirus)和鱼戊型肝炎病毒属(Piscihepevirus)。目前研究较多的哺乳动物和禽类HEV均属于正戊型肝炎病毒属，其主要分为A-D 4个种。正戊肝病毒属A物种包含至少8个基因型。到目前为止，已经在家养和野生猪群中发现了四种基因型的HEV：HEV3和HEV4是人畜共患病原，可以感染人类和非灵长类动物。而HEV5和HEV6仅在野猪中发现。HEV3主要流行于欧洲、亚洲和美洲，HEV4主要发现于欧洲和亚洲，我国主要流行的是HEV4。
HEV3和HEV4作为人畜共患病原，在全国范围内广泛流行。可感染猪、鹿、牛、羊、猴等多种动物。例如，人食用生的或未熟的猪肉是食源性HEV从猪向人传播的重要途径。HEV在猪群中可以通过排泄物以及被其污染的饲料和饮水传播，其中粪口途径是猪HEV的主要传播途径。HEV在我国猪群中呈普遍流行的趋势，因此，需要直接接触猪、猪粪或污水的养猪场和屠宰场的从业人员感染人兽共患型HEV的风险会相对较高。
在健康人群中，大部分感染者表现为急性自限性肝炎，可自愈或仅出现消化道症状；但在输注污染的血液制品或接受器官移植的免疫力低下的人群或有基础肝病的老年人中，急性感染可能导致严重的暴发性肝炎(急性肝衰竭)，或发展为慢性肝炎，甚至出现肝硬化。一些患者还会出现肝外表现，包括神经系统、血液系统和肾脏疾病。因此，快速可靠地诊断和监测HEV将有助于保障动物源性食品安全和公共卫生。
目前，国内外已经建立了多种直接或间接检测HEV的免疫学和分子生物学方法，如免疫电镜(IEM)、间接免疫荧光(IFA)、免疫印迹(IB)、免疫组化(IHC)、免疫层析(ICA)、酶联免疫吸附实验(ELISA)等、反转录-巢式PCR(RT-nPCR)、荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)和环介导等温扩增等(LAMP)。这些方法虽然准确可靠，但存在以下缺点，如检测时间长，操作复杂，成本较高，对配套的反应仪器有严格要求，需要训练有素的专业人员，这阻碍了该技术在设备不足的基础实验室或资源有限的环境中应用。
因此，开发操作简单、便携且可视化、灵敏度高、特异性强的现场检测HEV的方法，对于预防和控制该疾病至关重要。
发明内容
为了解决上述至少一个技术问题，本公开提供了一种检测戊型肝炎病毒的引物对、探针和试剂盒。
根据本公开的第一方面，提供了一种检测戊型肝炎病毒的引物对，包括上游引物和下游引物，
所述上游引物包括如SEQ ID NO:1、3～7任一项所示核苷酸序列，或与其具有至少60％序列同一性的核苷酸序列中的任一项；
所述下游引物包括如SEQ ID NO:8～11所示核苷酸序列，或与其具有至少60％序列同一性的核苷酸序列中的任一项。
在一些实施方式中，所述上游引物包括如SEQ ID NO:6或7所示核苷酸序列，或与其具有至少60％序列同一性的核苷酸序列中的任一项；
所述下游引物包括如SEQ ID NO:10所示核苷酸序列，或与其具有至少60％序列同一性的核苷酸序列中的任一项。
在一些实施方式中，所述上游引物包括如SEQ ID NO:15～34或53所示核苷酸序列，或与其具有至少60％序列同一性的核苷酸序列中的任一项；
所述下游引物包括如SEQ ID NO:35～50或54所示核苷酸序列，或与其具有至少60％序列同一性的核苷酸序列中的任一项。
在一些实施方式中，所述上游引物包括如SEQ ID NO:15～34或53所示核苷酸序列，或与其具有至少60％序列同一性的核苷酸序列中的任一项；
所述下游引物包括如SEQ ID NO:35～40、42～46、49或54所示核苷酸序列，或与其具有至少60％序列同一性的核苷酸序列中的任一项。
在一些实施方式中，所述上游引物和/或所述下游引物包含简并碱基。
在一些实施方式中，所述同一简并碱基包括C或T。
在一些实施方式中，所述同一简并碱基包括A或G。
在一些实施方式中，所述上游引物和/或所述下游引物的至少一个核苷酸残基上连接有生物素。
在一些实施方式中，所述上游引物和/或所述下游引物的5'末端和/或3'末端的核苷酸残基上连接有生物素。
在一些实施方式中，所述下游引物包括如SEQ ID NO:55所示核苷酸序列，或与其具有至少60％序列同一性的核苷酸序列中的任一项。
根据本公开的第二方面，提供了一种检测戊型肝炎病毒的试剂盒，包括第一方面所述的引物对。
在一些实施方式中，所述试剂盒进一步包括探针，所述探针包括如SEQ ID NO:51(TTGTCTCRGCCAATGGCGAGCCGACWGTGAAACTTTACACATCAGT)或SEQ ID NO:52(TGTTTTACTCYCGCCCCGTTGTCTCRGCCAATGGCGAGCCGACAGT)所示核苷酸序列，或与其具有至少60％序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述探针包含简并碱基。
在一些实施方式中，所述同一简并碱基包括A或G。
在一些实施方式中，所述同一简并碱基包括A或T。
在一些实施方式中，所述同一简并碱基包括C或T。
在其中一些具体的实施方式中，所述探针的至少一个核苷酸残基上连接有荧光基团，3'末端连接有阻抑聚合酶延伸或扩增的阻断基团，所述探针在所述荧光基团和阻断基团之间插入四氢呋喃。
在一些更具体的实施方式中，所述探针在5'末端连接有荧光基团。
在一些更具体的实施方式中，所述探针在距5'末端至少30个核苷酸残基的位置的碱基替换为四氢呋喃。
在一些更具体的实施方式中，所述荧光基团包括FAM、TET、JOE、HEX、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、LC RED705、5-IAF、6-TET、BIS、荧光素-5-马来酰亚胺、5-FITC、磺胺罗丹明G、荧光素及其盐、6-FAM、6-TRITC、5-TAMRA、6-TAMRA、6-CR6G、5-FITC、5-FAM、6-FAM、罗丹明B、罗丹明6G、AMC、Cy3或Cy5中的任意一种。
在一些更具体的实施方式中，所述阻断基团包括羟甲基叠氮、C18、C12、ddNTP、RNA、PNA、磷酸基团或C3-spacer中任意一种。
在一些更具体的实施方式中，所述探针的至少一个胸腺嘧啶核苷酸残基上连接有荧光基团。
在一些更具体的实施方式中，所述探针包括如SEQ ID NO:57所示核苷酸序列，或与其具有至少60％序列同一性的核苷酸序列。
在一些更具体的实施方式中，所述试剂盒还包括侧向流动检测试纸条，所述侧向流动检测试纸条包括加样垫、质控C线和检测T线。
在另外一些具体的实施方式中，所述探针的至少一个核苷酸残基上连接有荧光基团，所述探针的至少一个核苷酸残基上连接有淬灭基团，3'末端连接有阻抑聚合酶延伸或扩增的阻断基团，所述探针在所述荧光基团和所述淬灭基团之间插入四氢呋喃。
在一些更具体的实施方式中，所述探针的至少一个胸腺嘧啶核苷酸残基上连接有荧光基团。
在一些更具体的实施方式中，所述探针的至少一个胸腺嘧啶核苷酸残基上连接有淬灭基团。
在一些更具体的实施方式中，所述探针上连接有荧光基团的核苷酸残基和连接有淬灭基团的核苷酸残基之间相隔1～30个核苷酸残基。
在一些更具体的实施方式中，所述探针上连接有荧光基团的核苷酸残基和连接有淬灭基团的核苷酸残基之间相隔1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸残基。
在一些更具体的实施方式中，所述探针在距5'末端至少30个核苷酸残基的位置的碱基替换为四氢呋喃。
在一些更具体的实施方式中，所述探针在距5'末端至少30个核苷酸残基的位置的碱基替换为四氢呋喃。
在一些更具体的实施方式中，所述荧光基团包括FAM、TET、JOE、HEX、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、LC RED705、5-IAF、6-TET、BIS、荧光素-5-马来酰亚胺、5-FITC、磺胺罗丹明G、荧光素及其盐、6-FAM、6-TRITC、5-TAMRA、6-TAMRA、6-CR6G、5-FITC、5-FAM、6-FAM、罗丹明B、罗丹明6G、AMC、Cy3或Cy5中的任意一种。
在一些更具体的实施方式中，所述淬灭基团包括：BHQ、EDANS、MGB、DABCYL。
在一些更具体的实施方式中，所述淬灭基团包括BHQ或BHQ-1。
在一些更具体的实施方式中，所述阻断基团包括羟甲基叠氮、C18、C12、ddNTP、RNA、PNA、磷酸基团或C3-spacer中任意一种。
在一些更具体的实施方式中，所述探针包括如SEQ ID NO:56所示核苷酸序列，或与其具有至少60％序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括逆转录酶、重组酶、聚合酶、单链结合蛋白、dNTP、DNA损伤修复活性的酶。
在一些实施方式中，DNA损伤修复活性的酶包括核酸内切酶或核酸外切酶。
在一些实施方式中，所述核酸内切酶包括核酸内切酶III或核酸内切酶IV。
在一些实施方式中，所述核酸内切酶包括核酸内切酶IV。
在一些实施方式中，所述核酸外切酶包括3'-5'核酸外切酶。
在一些实施方式中，所述3'-5'核酸外切酶包括核酸外切酶ExoIII。
在一些实施方式中，所述试剂盒包括质控品；
在一些实施方式中，所述质控品包括阳性质控品或阴性质控品；
在一些实施方式中，所述阳性质控品含有戊型肝炎病毒的核酸，所述阴性质控品不含有戊型肝炎病毒的核酸。
根据本公开的第三方面，提供了一种使用第一方面所述引物或第二方面所述试剂盒检测戊型肝炎病毒的方法。
在一些实施方式中，所述方法包括如下步骤：
1)提取待测样本的总RNA；
2)以所述总RNA为模版进行逆转录，得到cDNA产物，并使用所述试剂盒对cDNA产物进行重组酶辅助等温扩增反应，并使用所述试剂盒进行重组酶辅助等温扩增反应，得到扩增产物；
3)使用测流层析试纸条检测扩增产物，判断检测结果；
判断方法包括：质控C线和检测T线均出现条带，则实验有效，判定样品中含有戊型肝炎病毒；质控C线出现条带，而检测T线不出现条带，则实验有效，判定样品中不含有戊型肝炎病毒；质控C线不出现条带，则实验无效。
在一些实施方式中，每条引物的工作浓度包括0.2～0.5μM。
在一些实施方式中，每条引物的工作浓度包括但不限于0.2μM、0.3μM、0.4μM或0.5μM。
在一些实施方式中，每条引物的工作浓度包括0.4μM。
在一些实施方式中，每条探针的工作浓度包括0.1～0.3μM。
在一些实施方式中，每条探针的工作浓度包括但不限于0.1μM、0.11μM、0.12μM、0.13μM、0.14μM、0.15μM、0.16μM、0.17μM、0.18μM、0.19μM、0.20μM、0.21μM、0.22μM、0.23μM、0.24μM、0.25μM、0.26μM、0.27μM、0.28μM、0.29μM或0.3μM。
在一些实施方式中，每条探针的工作浓度为0.12μM。
在一些实施方式中，所述重组酶辅助扩增反应的温度包括30～42℃。
在一些实施方式中，所述重组酶辅助扩增反应的时间包括5～30分钟。
在一些实施方式中，所述重组酶辅助扩增反应的温度包括但不限于30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃或42℃。
在一些实施方式中，所述重组酶辅助扩增反应的时间包括但不限于5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、16分钟、17分钟、18分钟、19分钟、20分钟、21分钟、22分钟、23分钟、24分钟、25分钟、26分钟、27分钟、28分钟、29分钟或30分钟。
在一些实施方式中，所述重组酶辅助扩增反应的条件包括在39℃下恒温扩增15分钟。
在一些实施方式中，所述待测样本包括天然样本或标准品。
在一些实施方式中，所述待测样本包括组织样本或体液样本。
在一些实施方式中，所述体液样本包括：唾液、全血液、血清、血浆、粪便和它们的处理物；和/或，
所述组织样本包括肝脏组织、石蜡切片和它们的处理物。
在一些实施方式中，所述戊型肝炎病毒属于正戊肝病毒属A物种。
在一些实施方式中，所述戊型肝炎病毒包括HEV3和/或HEV4基因型。
在一些实施方式中，所述戊型肝炎病毒来自于哺乳动物。
在一些实施方式中，所述戊型肝炎病毒来自于人、猪、鹿、牛、羊或猴。
在一些实施方式中，所述戊型肝炎病毒来自于猪。
根据本公开的第四方面，提供了一种使用第一方面所述引物或第二方面所述试剂盒检测戊型肝炎病毒的的方法，包括如下步骤：
1)提取待测样本的总RNA；
2)以所述总RNA为模版进行逆转录，得到cDNA产物，并使用所述试剂盒对cDNA产物进行重组酶辅助扩增反应；
3)扩增反应同时收集信号，判断检测结果；
判断方法包括：若信号能够形成扩增曲线，或蓝光检测仪检测到信号，则判定样品中含有戊型肝炎病毒。
在一些实施方式中，每条引物的工作浓度包括0.2～0.5μM。
在一些实施方式中，每条引物的工作浓度包括但不限于0.2μM、0.3μM、0.4μM或0.5μM。
在一些实施方式中，每条引物的工作浓度包括0.4μM。
在一些实施方式中，每条探针的工作浓度包括0.1～0.3μM。
在一些实施方式中，每条探针的工作浓度包括但不限于0.1μM、0.11μM、0.12μM、0.13μM、0.14μM、0.15μM、0.16μM、0.17μM、0.18μM、0.19μM、0.20μM、0.21μM、0.22μM、0.23μM、0.24μM、0.25μM、0.26μM、0.27μM、0.28μM、0.29μM或0.3μM。
在一些实施方式中，每条探针的工作浓度包括0.12μM。
在一些实施方式中，所述重组酶辅助扩增反应的温度包括30～42℃。
在一些实施方式中，所述重组酶辅助扩增反应的时间包括5～30分钟。
在一些实施方式中，所述重组酶辅助扩增反应的温度包括但不限于30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃或42℃。
在一些实施方式中，所述重组酶辅助扩增反应的时间包括但不限于5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、16分钟、17分钟、18分钟、19分钟、20分钟、21分钟、22分钟、23分钟、24分钟、25分钟、26分钟、27分钟、28分钟、29分钟或30分钟。
在一些实施方式中，所述重组酶辅助扩增反应的条件包括在42℃下恒温扩增20分钟。
在一些实施方式中，所述戊型肝炎病毒属于正戊肝病毒属A物种。
在一些实施方式中，所述戊型肝炎病毒包括HEV3和/或HEV4基因型。
在一些实施方式中，所述戊型肝炎病毒来自于哺乳动物。
在一些实施方式中，所述戊型肝炎病毒来自于人、猪、鹿、牛、羊或猴。
根据本公开的第五方面，提供了第一方面所述引物对在制备检测待测样本中戊型肝炎病毒的试剂盒中的应用。
在一些实施方式中，所述待测样本包括天然样本或标准品。
在一些实施方式中，所述待测样本包括组织样本或体液样本。
在一些实施方式中，所述体液样本包括：唾液、血液、血清、血浆、粪便和它们的处理物；和/或，
所述组织样本包括组织及其处理物。
在一些实施方式中，所述组织样本包括肝组织样本。
在一些实施方式中，所述戊型肝炎病毒包括正戊肝病毒属A物种。
在一些实施方式中，所述戊型肝炎病毒包括HEV3和/或HEV4基因型。
在一些实施方式中，所述戊型肝炎病毒来自于哺乳动物。
在一些实施方式中，所述戊型肝炎病毒来自于人、猪、鹿、牛、羊或猴。
在一些实施方式中，所述戊型肝炎病毒来自于猪。
根据本公开的第六方面，提供了第一方面所述引物对、第二方面所述试剂盒、第三方面或第四方面所述方法在检测待测样本中戊型肝炎病毒中的应用。
在一些实施方式中，所述待测样本包括天然样本或标准品。
在一些实施方式中，所述待测样本包括组织样本或体液样本。
在一些实施方式中，所述体液样本包括：唾液、血液、血清、血浆、粪便和它们的处理物；和/或，
所述组织样本包括组织及其处理物。
在一些实施方式中，所述组织样本包括肝组织样本。在一些实施方式中，所述戊型肝炎病毒包括正戊肝病毒属A物种。
在一些实施方式中，所述戊型肝炎病毒包括HEV3和/或HEV4基因型。
在一些实施方式中，所述戊型肝炎病毒来自于哺乳动物。
在一些实施方式中，所述戊型肝炎病毒来自于人、猪、鹿、牛、羊或猴。
在一些实施方式中，所述戊型肝炎病毒来自于猪。
本公开的有益效果在于：
本公开所述检测戊型肝炎病毒的引物对、探针和试剂盒，能够针对戊型肝炎病毒进行基于重组酶聚合酶扩增技术结合侧向流动检测试纸条的RT-RAA-LFD或基于重组酶聚合酶扩增技术结合实时荧光定量的qRT-RAA两种方式的检测，适宜于现场快速可视化检测HEV ORF2基因，可实现对戊型肝炎病毒进行快速、高特异性、高灵敏性、更加简便的检测，从而克服现有检测技术中检测时间长，操作复杂，成本较高等缺陷。实现了戊型肝炎病毒的现场快速可视化检测。
基于本公开提供的引物和探针进行戊型肝炎病毒的扩增，只需在恒温条件下短时间反应即可完成，该方法反应快速，对仪器要求简单，仅需恒温装置即可完成核酸扩增过程，例如恒温水浴锅或便携式恒温仪，借助侧向流试纸条可以对检测结果进行肉眼判读，无需要依赖贵重的凝胶成像系统和电脑等设备，繁杂的实验步骤，对操作人员要求不高，降低了经济成本、人力成本和时间成本，尤其适用于基层现场诊断、即时检测和微量检测，在兽医临床具有广泛的应用前景，也为保障动物源性食品安全提供技术支撑。
附图说明
图1示出了本公开引物筛选示意图。其中，图1A为一筛引物在HEV ORF2基因中的相对位置，图1B为最佳下游引物的一筛结果，图1C为最佳上游引物的一筛结果，图1D为二筛引物在HEV ORF2基因中的相对位置，图1E为最佳上游引物的二筛结果，图1F为最佳下游引物的二筛结果。红色为本轮筛选中扩增效果最好的引物。
图2示出了本公开反应时间和反应温度的优化结果。其中，图2A为RT-RAA-LFD不同反应温度的结果，图2B为RT-RAA-LFD不同反应时间的结果，图2C-F为qRT-RAA不同反应温度的结果。
图3示出了本公开引物和探针的特异性分析结果。其中，图3A为RT-RAA-LFD的特异性检测结果；图3B和图3C分别为qRT-RAA使用蓝光检测仪和荧光定量检测仪的特异性检测结果。1-6依次为：猪戊型肝炎病毒、猪甲型流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、非洲猪瘟病毒、猪圆环病毒和阴性对照。
图4示出了本公开引物和探针的灵敏性分析结果。其中，图4A为RT-RAA-LFD的灵敏性检测结果，图4B和图4C分别为qRT-RAA使用蓝光检测仪和荧光定量检测仪的灵敏性检测结果，图4D为qRT-PCR的灵敏性检测结果。1：2.9×105拷贝数/μL，2：2.9×104拷贝数/μL，3：2.9×103拷贝数/μL，4：2.9×102拷贝数/μL，5：2.9×101拷贝数/μL，6：2.9×100拷贝数/μL，7：2.9×10-1拷贝数/μL，8：阴性对照。
具体实施方式
为使本公开的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本公开进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本公开，并不用于构成对本公开的任何限制。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。这样的结构和技术在许多出版物中也进行了描述。
HEV病毒颗粒为正二十面体，直径约为27～35nm，无囊膜，电镜下观察内部可见空心和实心两种不同形态：一种为内部透亮的不含完整基因的缺陷病毒颗粒；另一种内部致密的完整病毒颗粒。HEV基因组由单股正链RNA组成，全长约7.2kb。5'末端含有甲基鸟嘌呤帽子结构，3'末端带有polyA尾巴，一般包括3个部分重叠的开放阅读框(Openreadingframe,ORF)：ORF1(～5000nt)，ORF2(～1920nt)和ORF3(～340nt)，ORF2位于基因组的3'末端，编码病毒衣壳蛋白，其中含有重要的免疫表位。较之另外2个ORFs，ORF2的核苷酸序列比较保守。
重组酶辅助扩增(Recombinase-aid amplification，RAA)，是一种快速和特异性的多种病原体检测技术。RAA反应依赖三种关键(核心)蛋白：重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和DNA聚合酶。
本公开经过大批量的筛选，提供了用于检测戊型肝炎病毒的引物对以及探针，并在此基础上提供了基于RAA的戊型肝炎病毒检测方法。
所述引物对以及探针可以用于将重组酶辅助扩增技术，并和侧向流动试纸条结合检测戊型肝炎病毒。作为一个示例，可以将下游引物的5'末端用生物素进行标记，所使用的NFO探针的5'末端标记荧光基团(例如6-羧基荧光素，FAM)，3'末端进行封闭(例如磷酸化)以防止诱导聚合酶扩增非目的DNA，荧光基团和3'末端之间的至少一位核苷酸的碱基用四氢呋喃THF代替，只有当探针与DNA链互补结合后，核酸内切酶识别特异性位点THF并将其切除，核酸聚合酶沿此位点继续扩增延伸，最终形成既有探针标记物又有引物标记物的扩增产物。使用侧流层析试纸条检测扩增产物，产物中若存在含有双标记的扩增产物，则会在检测线上形成红色标记。通过免疫层析法对扩增结果进行肉眼可视的判读，整个反应简单快速，因为不需要高温循环，所以特别适合在有大量样品的非实验室检测场所使用。
或者也可以与实时荧光定量检测技术结合检测戊型肝炎病毒。作为一个示例，可以使用Exo探针配合核酸外切酶(exonuclease,exo)，该探针内部引入一个碱基模拟物四氢呋喃(etrahydrofuran abasic-site mimic,THF)的修饰位点，并在位点临近两侧分别偶联荧光基团和淬灭基团，当探针同靶序列杂交形成双链DNA时，核酸外切酶exo识别四氢呋喃修饰位点，对该位置进行剪切，使得荧光基团和淬灭基团分离，从而产生荧光信号，所述荧光信号被荧光定量检测仪或蓝光检测仪检测到，荧光定量检测仪就会检测出扩增曲线，或者蓝光检测仪检测到信号。
定义
除非另有定义，否则本发明使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。
除非上下文另有明确说明，否则本文所用的表述“一种”和“一个”包括复数指代。
本文所使用的表述“约”是如本领域的普通技术人员所理解的，并且根据其使用的背景而在一定范围内变化。如果本领域的普通技术人员根据其使用的上下文对该术语的使用不了解，则“约”将意味着特定值至多加上或减去10％。
在本公开中，术语“RNA”，全称”核糖核酸”(RiboNucleicAcid，缩写为RNA)是生物细胞内含有的四种生物大分子之一核酸的一种。RNA由核苷酸组成的大分子聚合物。核苷酸由碱基、核糖和磷酸构成。其中碱基有4种：腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、尿嘧啶(C)和胞嘧啶(C)。
在本公开中，术语“DNA”，全称”脱氧核糖核酸”(DeoxyriboNucleicAcid，缩写为DNA)是生物细胞内含有的四种生物大分子之一核酸的一种。DNA携带有合成RNA和蛋白质所必需的遗传信息，是生物体发育和正常运作必不可少的生物大分子。DNA由脱氧核苷酸组成的大分子聚合物。脱氧核苷酸由碱基、脱氧核糖和磷酸构成。其中碱基有4种：腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)。
在本公开中，术语“上游引物”，是沿着负链进行不间断延长的寡核苷酸；本发明中使用的术语“下游引物”，是沿着正链进行不间断延长的寡核苷酸。正链即有义链，也称编码链，一般位于双链DNA上端，方向从左到右为5'-3'，碱基序列和该基因mRNA基本相同；与该链结合的引物为下游引物；负链即无义链，也称非编码链，和正链互补，与该链结合的引物为上游引物。应理解，当正义链和反义链的指定发生互换时，对应的上游引物和下游引物命名也可随之互换。
在本公开中，术语“探针”是指能够通过一种或多种类型的化学键(通常通过互补的碱基配对，通常通过氢键形成)结合互补序列的靶核酸的寡核苷酸。根据杂交条件的严格性，探针可结合与探针序列缺少完全的互补性的靶序列。可能有任何数目的将干扰文中所述的靶序列与单链序列之间的杂交的碱基对。然而，如果突变的数目如此大，使得甚至在最不严格的杂交条件下也不发生杂交，则序列不是互补靶序列。探针可为单链，或者部分单链且部分双链。通过结构、组成和靶序列的性质描述探针的链型(strandedness)。探针可被例如链霉亲和素复合物后来结合的生物素直接标记或间接地标记。在一些实施方式中，术语“探针”包含寡核苷酸链，或与之互补的寡核苷酸链。
在本公开中，术语“序列同一性”是指两个多核苷酸之间的“序列同一性百分比”或“序列同一性百分比”，即在考虑到了为了两个序列的最佳比对而必须引入的添加或缺失(即，空位)的情况下，比较窗口内序列所共有的相同匹配位置的数量。匹配位置是其中在靶序列和参考序列中都存在相同核苷酸的任何位置。由于空位不是核苷酸，所以靶序列中存在的空位不计在内。同样，由于计入靶序列核苷酸，而不计来自参考序列的核苷酸，所以不计参考序列中存在的空位。至少60％序列同一性包括所述序列全长的至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％具有序列同一性的连续片段。
可以通过以下过程来计算序列同一性百分比：确定其中两个序列中都出现相同氨基酸残基或核酸碱基的位置数，以得到匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100，得到序列同一性百分比。序列的比较和两个序列之间序列同一性百分比的确定可使用易用于在线使用和下载的软件来完成。合适的软件程序可从各种来源获得，用于蛋白质和核苷酸序列的比对。确定序列同一性百分比的一个合适的程序是bl2seq，其为可从美国政府的国家生物技术信息中心BLAST网站(blast.ncbi.nlm.nih.gov)上获得的BLAST程序套件的一部分。Bl2seq使用BLASTN或BLASTP算法进行两个序列之间的比较。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。其它合适的程序是，例如，Needle、Stretcher、Water或Matcher、生物信息学程序的EMBOSS套件的一部分，并且也可在www.ebi.ac.uk/Tools/psa上从欧洲生物信息学研究所(EBI)获得。
在本公开中，术语“简并位点”是指其中某些位置并不由单个特定核苷酸定义的引物或探针核酸。因此，在这样一个简并位置，引物或探针序列可以是至少两种不同核苷酸中的任一个。
下面提供实施例和附图以帮助理解本公开。但应理解，这些实施例和附图仅用于说明本公开，但不构成任何限制。本公开的实际保护范围在权利要求书中进行阐述。应理解，在不脱离本公开精神的情况下，可以进行任何修改和改变。
实施例
本公开下述实施例中，所涉及到的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。本公开下述实施例中，qRT-RAA反应使用的DNA恒温快速扩增试剂盒(荧光型)WLE8202KIT和RT-RAA-LFD反应使用的DNA恒温快速扩增试剂盒(胶体金试纸条型)WLN8203KIT，均购自潍坊安普未来生物科技有限公司。
按照如下步骤制备表达HEV-3的ORF2的质粒：根据GenBank上HEV-3KernowC1/p6毒株(GenBank登录号：HQ709170.1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成ORF2基因，并插入到pUC57载体中，得到的重组质粒命名为pUC57-ORF2。
实施例1.猪戊型肝炎病毒的RT-RAA-LFD和qRT-RAA检测引物及探针设计与筛选
通过NCBI查到源自全球相关国家已公开的62条HEV3和62条HEV4的全基因组序列，利用MAGE X对这124株HEV全基因组序列进行比对分析，在保守程度较高的ORF2基因内设计引物和探针。
RT-RAA引物的设计遵循以下基本原则：
引物大小最小30bp，最大35bp；引物GC含量最小30％，最大70％；引物Tm最小50，最大100；最大允许的单核苷酸重复长度(例如“CCCCC”)设定为5；避免引物直接形成发夹结构，或引物二聚体的形成等。
设计得到7条上游引物F1～F7(SEQ ID NO：1～7)和7条下游引物R1～R7(SEQ IDNO：8～13)。
RT-RAA引物的筛选步骤如下：
为保证RAA扩增效率，需要对引物进行筛选。如表1和图1A所示，第一轮筛选中，先配合一个上游引物来筛查所有下游引物，并对所有下游引物的扩增性能进行评分，挑选最佳下游引物，然后使用它筛查所有上游引物。使用Image Lab软件的绝对定量分析工具对条带灰度值进行测量，结果如表3所示，筛选出灰度值最大，也就是条带最亮的引物，得到一对扩增良好的引物对F6/F7和R3电泳结果如图1B和图1C所示。
为了获得高灵敏度的引物组合需进行第二次引物筛选，在一筛的基础上，保持所选引物的长度不变，如图1D所示，以1个碱基的速度向前及向后移动其在模板上的位置，鉴于F6与F7对应的条带亮度相近，对二筛上游引物进行了改进，增加上游引物数量，覆盖至F6的5'末端的前3个碱基以及F7的3'末端的后3个碱基，设计的探针序列如表2所示，然后筛查其中哪个位置上的引物扩增产物的灰度值最大，也就是电泳条带最亮，结果如图1E～1F和表4所示，最终筛选出一对最适引物F7-3和R3-2。最后，在终引物对和探针中加入简并碱基以减少错配对的碱基数量，得到引物F、引物Rn和nfo探针用于试纸条RT-RAA检测，引物F、引物Re和exo探针用于荧光RT-RAA检测。
两轮筛选中，扩增体系使用DNA恒温快速扩增试剂盒(基础型)WLB8201KIT，结合上述引物对重组质粒pUC57-ORF2进行扩增。
表1.第一轮筛选引物序列
表2.第二轮筛选引物序列
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表3.两轮引物筛选的扩增产物的条带亮度值
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exo-探针(SEQ ID NO:56)是在SEQ ID NO:51(5'-TTGTCTCRGCCAATGGCGAGCCGACWGTGAAACTTTACACATCAGT-3')核苷酸序列的基础上，自5'末端起第28位碱基T标记荧光基团FAM，第31位碱基A被四氢呋喃THF代替，第34位碱基T标记淬灭基团BHQ1，3'末端进行C3-spacer阻断修饰得到的。
nfo-探针(SEQ ID NO:57)是在SEQ ID NO:52(5'-TGTTTTACTCYCGCCCCGTTGTCTCRGCCAATGGCGAGCCGACAGT-3')核苷酸序列的基础上，在5'末端标记荧光基团FA M，第31位碱基A被四氢呋喃THF替代，3'末端进行磷酸化修饰。
根据筛选出的最适引物和探针序列，设计了简并引物和探针，以减少错配对的碱基数量，如表4所示：
表4.引物和探针序列信息
其中，Y代表C/T，R代表A/G，W代表A/T。
实施例2.猪戊型肝炎病毒RT-RAA-LFD和qRT-RAA反应体系的建立
使用DNA恒温快速扩增试剂盒(胶体金试纸条型)WLN8203KIT试剂盒(安普未来)构建RT-RAA-LFD反应体系，所述RT-RAA-LFD反应体系(25μL)如表5所示，反应条件恒温39℃反应15分钟。
表5.RT-RAA-LFD反应体系
组分 用量
RAA冻干酶粉 15.0025μg
反应缓冲液A缓冲液(含质量百分浓度3％的聚乙二醇、Tris30mM) 14.70μL
无核酸酶水 4.25μL
10μM引物F 1.00μL
10μM引物Rn 1.00μL
10μMnfo-探针 0.30μL
DNA模版(重组质粒pUC57-ORF2) 2.50μL
反应缓冲液B缓冲液(含280mM醋酸镁) 1.25μL
总体积 25μL
使用DNA恒温快速扩增试剂盒(荧光型)WLE8202KIT(安普未来)构建qRT-RAA反应体系，对重组质粒进行检测，所述qRT-RAA反应体系(25μL)如表6所示，反应条件恒温42℃反应20分钟。
表6.qRT-RAA反应体系
组分 用量
RAA冻干酶粉 15.0025μg
反应缓冲液A缓冲液(含质量百分浓度3％的聚乙二醇、Tris30mM) 14.70μL
无核酸酶水 4.25μL
10μM引物F 1.00μL
10μM引物Re 1.00μL
10μMexo-探针 0.30μL
DNA模版(重组质粒pUC57-ORF2) 2.50μL
反应缓冲液B缓冲液 1.25μL
总体积 25μL
阴性对照中的模板加入去核酸酶水，阳性对照中的模板为重组质粒pUC57-ORF2。
将检测反应条件设置为：RT-RAA-LFD的检测反应条件为39℃恒温扩增15分钟；qRT-RAA的检测反应条件为42℃恒温扩增20分钟。
对于RT-RAA-LFD扩增产物，使用侧向试纸条对RT-RAA-LFD扩增产物进行可视化判读。
质控标准：阴性对照仅在质控线(C线)出现一条红色条带，而在检测线(T线)无红色条带出现，阳性对照出现两条红色条带，一条位于检测线(T线)，另一条位于质控线(C线)，则实验数据有效，否则实验结果为无效，需要重新检测。
结果描述及判定：待检样品在C线出现红色条带，T线无红色条带，样品判为阴性；待检测样品在T线和C线均出现红色条带，样品判为阳性。
对于qRT-RAA扩增产物，使用伯乐CFX96荧光定量PCR仪和天根生化科技有限公司的便携式TGreen Monitor蓝光电泳监测仪(OSE-470M)对qRT-RAA扩增产物进行可视化判读。
质控标准：阴性对照无扩增曲线或可视化结果为无色，且阳性对照出现扩增曲线或可视化结果为绿色，则实验数据有效，否则实验结果为无效，需要重新检测。
结果描述及判定：待检测样品无扩增曲线或可视化结果为无色，样品判为阴性；出现扩增曲线或可视化结果为绿色，样品判为阳性。
实施例3.猪戊型肝炎病毒RT-RAA-LFD和qRT-RAA反应条件的优化
本实施例提供RT-RAA-LFD检测猪戊型肝炎病毒的最优反应温度和时间的优化探究，步骤如下：
以上述重组质粒pUC57-ORF2为模板，利用实施例2所述RT-RAA-LFD反应体系(25.00μL)，分别在30、33、36、39和42℃进行RT-RAA-LFD扩增20分钟，以确定最佳的反应温度。在此基础上，以最佳的反应温度、相同的引物组合和探针以及反应体系，对质粒模板分别扩增0、5、10、15、20分钟，以确定最佳的反应时间。
如图2A所示，27℃的检测结果为阴性，39℃时检测线(T线)的亮度明显强于33℃和36℃的检测线，而与42℃时检测线的亮度相当，因此，选择39℃作为RT-RAA-LFD检测猪戊型肝炎病毒的最佳反应温度。如图2B所示，0分钟、5分钟和10分钟无或仅有模糊不清的检测线，而15和20分钟的检测线的亮度差异不大，因此，选择15分钟作为RT-RAA-LFD检测猪戊型肝炎病毒的最佳反应时间。
本实施例还提供qRT-RAA检测HEV的最优反应温度的优化探究，步骤如下：
以重组质粒pUC57-ORF2为模板，利用实施例2所述qRT-RAA反应体系(25.00μL)，分别在36、38、40和42℃进行qRT-RAA扩增25分钟，以确定最佳的反应温度。
如图2C～2F所示，在最短的时间内产生最强的荧光信号的反应温度是42℃，因此，选择42℃作为qRT-RAA检测猪戊型肝炎病毒的最佳反应温度。
实施例4.RT-RAA-LFD和qRT-RAA的引物对和探针的特异性检测
为了考察本公开方法的特异性，本实施例分别用猪戊型肝炎病毒(HEV)、猪甲型流感病毒(H1N1)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪圆环病毒(PCV)的核酸作为反应模板，并设置阴性对照，按照前述方法分别进行RT-RAA-LFD和qRT-RAA核酸扩增。其中HEV阳性粪便样品(HEV病毒，GenBankNo.MZ751061)由中国食品药品检定研究院梁春南老师馈赠，H1N1、PRRSV、ASFV和PCV来自北京市动物疫病预防控制中心流调的临床样本。用Trizol法提取HEV、H1N1和PRRSV的病毒RNA，根据iScript cDNA合成试剂盒1708891(美国伯乐公司)说明书将提取的RNA逆转录成cDNA，根据病毒基因组DNA提取试剂盒DP315(北京天根生化科技有限公司)说明书，提取ASFV和PCV的病毒DNA，分别进行RT-RAA-LFD和qRT-RAA核酸扩增。RT-RAA-LFD的检测反应条件为：39℃恒温扩增15分钟。qRT-RAA的检测反应条件为：42℃恒温扩增20分钟。
如图3A所示，RT-RAA-LFD的特异性分析显示，除了猪戊型肝炎病毒对应试纸条的检测线(T线)出现了特异性的条带之外，其他重要的猪病毒及阴性对照的T线均未出现条带。如图3B～3C所示，除了猪戊型肝炎病毒对应的试验组出现了正常荧光检测曲线和可视化的绿色荧光结果，其他病毒及阴性对照组均未出现扩增曲线且可视化结果为无色。结果表明，本公开所使用的RT-RAA-LFD和qRT-RAA的引物和探针均可以实现对猪戊型肝炎病毒的特异性检测，与其他重要的猪病毒不发生交叉反应。
实施例5引物对和探针的灵敏度检测
以10倍梯度稀释的重组质粒pUC57-ORF2为模板(对应HEV的拷贝数为2.9×105～2.9×10-1拷贝数/μL)，分别在RAA-LFD和qRAA最适条件下进行核酸扩增(RT-RAA-LFD的最适反应条件为：39℃恒温扩增15分钟。qRT-RAA的最适反应条件为：42℃恒温扩增20分钟)，并设置阴性对照。同时，设置实时荧光定量PCR方法进行平行检测与比对。
表7.实时荧光定量RT-PCR的引物探针序列
序列类型 引物名称 引物序列 SEQIDNO:
上游引物 HEV-F GGTGGTTTCTGGGGTGAC 58
下游引物 HEV-R AGGGGTTGGTTGGATGAA 59
探针 HEV-P FAM-TGATTCTCAGCCCTTCGC-BHQ 60
使用如表7所示引物探针进行实时荧光定量RT-PCR的方法如下：
反应体系包括25μL的反应体系使用康为世纪的GoldStar Probe Mixture，2×GoldStar Probe Mixture 12.5μL，DNA模版(重组质粒pUC57-ORF2)2μL，10μM上游引物0.5μL、10μM下游引物0.5μL、10μM探针0.5μL和灭菌水9μL。反应程序为95℃10min进行预变性，随后立即对DNA进行扩增，反应条件为95℃(15s)，60℃(1min)，40个循环。其中，以10倍梯度稀释的重组质粒pUC57-ORF2为DNA模板(对应HEV的拷贝数为2.9×105～2.9×10-1拷贝数/μL)。反应在伯乐CFX96荧光定量PCR仪上进行并检测荧光信号，形成扩增曲线。
如图4所示，本公开设计的RAA引物和探针组合能够保证检测时的灵敏性，根据实验结果，RT-RAA-LFD可检测至2.9×102拷贝数/μL，qRT-RAA与qPCR检测方法灵敏度水平一致，能够达到2.9×101拷贝数/μL，但qRT-RAA仅需20分钟。
综上所述，本公开中所述的RT-RAA-LFD和qRT-PCR方法可以实现对猪戊型肝炎病毒进行快速、特异、灵敏、可视化、简便地检测。该方法耗时短，操作简单，特异性强，灵敏性高，结果判断简便可靠。尤其适合在资源有限的环境、基层和现场即时检测和微量检测，可以真正实现便携式的快速核酸检测。
本公开的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本公开的技术方案做出的技术变形，均落入本公开的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测戊型肝炎病毒的引物对，其特征在于，包括上游引物和下游引物，
所述上游引物包括如SEQ ID NO:1、3～7任一项所示核苷酸序列，或与其具有至少60％序列同一性的核苷酸序列中的任一项；
所述下游引物包括如SEQ ID NO:8～11所示核苷酸序列，或与其具有至少60％序列同一性的核苷酸序列中的任一项。
2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，包括上游引物和下游引物，
所述上游引物包括如SEQ ID NO:15～34或53所示核苷酸序列，或与其具有至少60％序列同一性的核苷酸序列中的任一项；
所述下游引物包括如SEQ ID NO:35～50或54所示核苷酸序列，或与其具有至少60％序列同一性的核苷酸序列中的任一项。
3.根据权利要求1或2所述的引物对，其特征在于，所述上游引物和/或所述下游引物的至少一个核苷酸残基上连接有生物素；
优选地，所述上游引物和/或所述下游引物的5'末端和/或3'末端的核苷酸残基上连接有生物素。
4.一种检测戊型肝炎病毒的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1～3任一项所述的引物对。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包括探针，所述探针包括如SEQ IDNO:51或52所示核苷酸序列，或与其具有至少60％序列同一性的核苷酸序列。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的至少一个核苷酸残基上连接有荧光基团，3'末端连接有阻抑聚合酶延伸或扩增的阻断基团，所述探针在所述荧光基团和阻断基团之间插入四氢呋喃；
优选地，所述荧光基团包括FAM、TET、JOE、HEX、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、LCRED705、5-IAF、6-TET、BIS、荧光素-5-马来酰亚胺、5-FITC、磺胺罗丹明G、荧光素及其盐、6-FAM、6-TRITC、5-TAMRA、6-TAMRA、6-CR6G、5-FITC、5-FAM、6-FAM、罗丹明B、罗丹明6G、AMC、Cy3或Cy5中的任意一种；
优选地，所述阻断基团包括羟甲基叠氮、C18、C12、ddNTP、RNA、PNA、磷酸基团或C3-spacer中任意一种，
优选地，所述试剂盒还包括侧向流动检测试纸条，所述侧向流动检测试纸条包括加样垫、质控C线和检测T线。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的至少一个核苷酸残基上连接有荧光基团，所述探针的至少一个核苷酸残基上连接有淬灭基团，3'末端连接有阻抑聚合酶延伸或扩增的阻断基团，所述探针在荧光基团和淬灭基团之间插入四氢呋喃；
优选地，所述荧光基团包括FAM、TET、JOE、HEX、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、LCRED705、5-IAF、6-TET、BIS、荧光素-5-马来酰亚胺、5-FITC、磺胺罗丹明G、荧光素及其盐、6-FAM、6-TRITC、5-TAMRA、6-TAMRA、6-CR6G、5-FITC、5-FAM、6-FAM、罗丹明B、罗丹明6G、AMC、Cy3或Cy5中的任意一种；
优选地，所述淬灭基团包括BHQ、EDANS、MGB、DABCYL，更优选包括BHQ或BHQ-1；
优选地，所述阻断基团包括羟甲基叠氮、C18、C12、ddNTP、RNA、PNA、磷酸基团或C3-spacer中任意一种。
8.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括逆转录酶、重组酶、DNA聚合酶、单链结合蛋白、dNTP和/或DNA损伤修复活性的酶；
优选地，DNA损伤修复活性的酶包括核酸内切酶或核酸外切酶；
优选地，所述核酸内切酶包括核酸内切酶III或核酸内切酶IV，更优选包括核酸内切酶IV；
优选地，所述核酸外切酶包括3'-5'核酸外切酶，更优选包括核酸外切酶ExoIII。
9.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括质控品；
优选地，所述质控品包括阳性质控品或阴性质控品。
10.一种使用权利要求1～3任一项所述引物或权利要求4～9任一项所述试剂盒检测待测样本中戊型肝炎病毒的方法；
优选地，所述待测样本包括天然样本或标准品；
优选地，所述待测样本包括组织样本或体液样本；
优选地，所述体液样本包括：唾液、全血液、血清、血浆、粪便和它们的处理物；和/或，
所述组织样本包括肝脏组织、石蜡切片和它们的处理物；
优选地，所述戊型肝炎病毒包括正戊肝病毒属A物种；
优选地，所述戊型肝炎病毒包括HEV3和/或HEV4基因型；
优选地，所述戊型肝炎病毒来自于哺乳动物；
优选地，所述戊型肝炎病毒来自于人、猪、鹿、牛、羊或猴。
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