CN118147179A - 一种治疗肝癌用核酸分子、融合蛋白及mRNA疫苗 - Google Patents
一种治疗肝癌用核酸分子、融合蛋白及mRNA疫苗 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物医药领域，主要涉及一种开放阅读框至少包含：编码至少一个乙肝病毒X蛋白的基因，和编码至少一个T细胞表位肽的基因的核酸分子及其在制备药物中的应用。本发明主要解决的技术问题是针对HBV最小的开放阅读框编码乙肝病毒X蛋白(HBX)，提供一种治疗效果更优的治疗肝癌用免疫制剂。实验表明，包含T细胞表位肽的乙肝病毒X蛋白脂质纳米粒核酸疫苗能够有效延长肝癌小鼠的生存期，有临床开发价值，提示有良好的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及具有肝癌预防和/或治疗作用的核酸分子、融合蛋白及其疫苗和应用，尤其是mRNA疫苗。
背景技术
肿瘤是严重危害人类健康、危及生命的常见疾病，肝癌是常见的恶性肿瘤之一，从发现到死亡的时间一般不超过半年，已成为人类主要的死因之一。中国是肝癌发病大国，发病率和死亡率分别约占全球45％和47％，每年有超41万例新增患者。临床上，原发性肝癌患者中百分之九十以上是肝细胞癌(HCC)所引起。HBV感染是引起HCC发生发展的重要生物因素，而全球约有3.5亿人长期感染HBV。HCC患者基本都经历了“乙型肝炎、肝硬化、HCC”的发展过程。一般认为，乙肝病毒可以入侵肝细胞的细胞核内，整合到肝细胞的DNA上，导致肝细胞在分裂和复制的时候出现突变，突变后变成癌细胞。HBX蛋白被认为是一种在HBV诱导肿瘤形成过程中至关重要的蛋白。研究表明，HBX基因既能在细胞核内与多种转录因子相互作用(如AP-1、AP-2、核转录因子(NF)-κB和环磷酸腺苷(cAMP))，又能在胞质内影响各种信号转导通路(如蛋白激酶B(AKT)、Wnt/β-链蛋白(catenin)、NF-κB、Janus的非受体酪氨酸激酶(JAK)/信号传导及转录激活因子(STAT)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、Ras、Raf和应激活化蛋白激酶(SAPK)/c-Jun氨基末端激酶(JNK)等)。
mRNA疫苗是一种全新的疫苗，具有通用度高、效力高、构建快、容易扩大生产等优点，具有重要的临床价值和应用前景。mRNA肿瘤疫苗是将肿瘤抗原以mRNA形式导入患者体内，通过肿瘤抗原刺激患者体内T细胞，激活患者自身特异性细胞免疫的肿瘤治疗方法。目前，现有的mRNA肿瘤疫苗在增强抗原提呈效率和T细胞免疫应答方面仍需优化提升，尤其是在mRNA序列设计与合成、翻译效率与稳定性、抗原提呈效率、T细胞免疫应答强度等方面，以进一步提高抗肿瘤免疫治疗活性，加速临床转化。
现有文献公开将乙肝病毒X蛋白编码基因装载于腺病毒上，用于治疗肝癌及其肝癌并发症，但是病毒载体安全性有待进一步提高，部分产品疗效不显著，不良反应较多。而治疗HBV相关晚期肝癌预后不良临床缺口大，亟需进一步开发起效快速、长效表达、持久递呈抗原，且安全性更好的，针对HBV最小的开放阅读框编码乙肝病毒X蛋白(HBX)的免疫制剂，进而为肿瘤治疗提供新型策略。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提供了一种核酸分子、其对应载体、细胞，以及包含上述核酸分子、载体和细胞的药物组合物，该药物组合物可用于肝癌及其并发症的预防和/或治疗。
本发明提供一种开放阅读框至少包含表达乙肝病毒X蛋白，和至少一个T细胞表位肽的核酸序列的核酸分子，应用于核酸、蛋白及多肽疫苗、腺病毒载体及其他载体疫苗的免疫制剂开发，为肝癌临床治疗提供新型策略，具有临床开发价值和良好临床应用前景。
第一方面，本发明提供一种核酸分子。
所述核酸分子，其包含至少一个开放阅读框，所述开放阅读框至少包含：编码至少一个乙肝病毒X蛋白的基因，和编码至少一个T细胞表位肽的基因的核酸序列。
进一步地，所述乙肝病毒选自乙肝病毒基因型A、B、C、E、F、G、H之一。
进一步地，所述乙肝病毒选自乙肝病毒基因型C。
进一步地，所述T细胞表位肽任选自辅助T细胞表位肽P4、P2和P30的一种或多种，
所述辅助T细胞表位肽P4对应的氨基酸序列是GQIGNDPNRDIL(SEQ ID NO.57)，
所述辅助T细胞表位肽P2对应的氨基酸序列是QYIKANSKFIGITE(SEQ ID NO.1)，
所述辅助T细胞表位肽P30对应的氨基酸序列是FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(SEQ IDNO.58)。
在一些具体的实施方式中，所述T细胞表位肽任选自辅助T细胞表位肽P4、P2和P30的截短体或其延长体中的一种或多种，所述辅助T细胞表位肽的截短体或延长体具有与对应辅助T细胞表位肽相同或相似功能。
在一些具体的实施方式中，所述T细胞表位肽任选自与辅助T细胞表位肽P4、P2和P30的氨基酸序列具有至少80％序列一致性的多肽中的一种或多种，所述具有至少80％序列一致性的辅助T细胞表位肽具有与对应辅助T细胞表位肽相同或相似功能。
进一步地，所述T细胞表位肽是P2。
进一步地，所述乙肝病毒X蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.30或SEQ ID NO.31或SEQ ID NO.32或SEQ ID NO.33或SEQ ID NO.34或SEQ ID NO.35或SEQ IDNO.36或SEQ ID NO.37或SEQ ID NO.38或SEQ ID NO.39或SEQ ID NO.40或SEQ ID NO.41或SEQ ID NO.42或SEQ ID NO.43或SEQ ID NO.44或SEQ ID NO.45或SEQ ID NO.46或SEQ IDNO.47，或其截短体或其延长体，或与其氨基酸序列具有至少80％序列一致性的乙肝病毒X蛋白，所述乙肝病毒X蛋白的截短体或其延长体或具有至少80％序列一致性的乙肝病毒X蛋白具有与SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.30或SEQ ID NO.31或SEQ ID NO.32或SEQ ID NO.33或SEQ ID NO.34或SEQ ID NO.35或SEQ ID NO.36或SEQ ID NO.37或SEQ ID NO.38或SEQ IDNO.39或SEQ ID NO.40或SEQ ID NO.41或SEQ ID NO.42或SEQ ID NO.43或SEQ ID NO.44或SEQ ID NO.45或SEQ ID NO.46或SEQ ID NO.47对应蛋白相同或相似功能。
进一步地，所述T细胞表位肽与乙肝病毒X蛋白的连接包括插入连接、端部直接连接或通过linker连接。
根据本发明实施例，所述linker的氨基酸序列为GGGGS、(GGGGS)2、(GGGGS)3、(GGGGS)4、(GGGGS)5、(GGGGS)6、(GGS)10或(GSG)10中的至少一种。
在一些具体的实施方式中，所述核酸选自DNA、ASO、siRNA、miRNA、mRNA、circRNA、适配体中至少一种。
进一步地，所述核酸为mRNA。
本发明第二方面提供一种包含上述第一方面所述的核酸分子，所述核酸分子还包括E3配体元件；
进一步地，所述E3配体元件是E3泛素酶连接酶的结合或招募配体；
进一步地，所述E3泛素酶连接酶的结合或招募配体选自VHL(Von Hippel-Lindau)、MDM2、β-TrCP、Keap1或其截短体或其延长体中的一种或多种；
进一步地，所述Keap1，结合或招募配体对应的氨基酸序列是LDPETGEYL(SEQ IDNO.66)或与其同源性大于60％的序列；进一步地，所述β-TrCP，结合或招募配体对应的氨基酸序列是DRHDSGLDSM(SEQ ID NO.67)或与其同源性大于60％的序列；
进一步地，所述VHL，结合或招募配体对应的氨基酸序列是LAP(OH)YI(SEQ IDNO.68)或ALAPYIP(SEQ ID NO.2)中的至少一种，或与其同源性大于60％的序列；
进一步地，所述MDM2，结合或招募配体对应的氨基酸序列是ETFSDLWKLL(P53B)(SEQ ID NO.56)、TSFAEYWNLLSP(PMI)(SEQ ID NO.59)、LTFEHYWAQLTS(PDI)(SEQ IDNO.60)、TNWYANLEKLLR(DPMI-α)(SEQ ID NO.61)、TAWYANFEKLLR(DPMI-β)(SEQ ID NO.62)、DWWPLAFEALLR(DPMI-γ)(SEQ ID NO.63)、CNCKAPETALCARRCQQH(Apamin)(SEQ ID NO.64)或CNCKAPETFLCYWRCLQH(stingin)(SEQ ID NO.65)中的一种或多种，或与其同源性大于60％的序列；
进一步地，所述同源性大于60％的序列，优选为同源性大于80％的序列；最优选为同源性大于90％的序列；
进一步地，所述E3泛素酶连接酶的结合或招募配体与乙肝病毒X蛋白的连接包括插入连接、端部直接连接或通过linker连接；
进一步地，所述通过linker连接；所述linker元件包含GGGGS、(GGGGS)2、(GGGGS)3、(GGGGS)6、(GGS)10或(GSG)10序列中一种或多种；
在本发明第三方面，本发明提供包含上述第一方面、或第二方面所述核酸分子的核酸疫苗。
具体地，所述核酸疫苗，包含：上述的核酸分子，以及任选地药学上可接受的辅料或者辅助性成分。
根据本发明实施例，所述核酸疫苗为mRNA疫苗；所述辅助性成分为递送所述mRNA的纳米载体；和/或
所述辅料包括选自注射剂缓冲介质、冻干或冷冻保护剂中的至少之一。
在一些具体的实施方式中，所述纳米载体包括选自脂质体、纳米粒、微球、阳离子聚合物、纳米乳、胶束、核壳纳米粒和脂质纳米载体中的至少之一。
进一步地，所述纳米载体是采用以下至少一种脂质材料制备而成：
DOTAP、DOTMA、DOTIM、DDA、DC-Chol、CCS、diC14-脒、DOTPA、DOSPA、DTAB、TTAB、CTAB、DORI、DORIE及其衍生物、DPRIE、DSRIE、DMRIE、DOGS、DOSC、LPLL、DODMA、DDAB、Dlin-MC3-DMA、CKK-E12、C12-200、DSPC、DMG-PEG、DOPE、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱和胆固醇。
更进一步地，所述脂质材料：mRNA的质量比为(0.5～50)∶1，优选为(2～10)∶1。
根据本发明实施例，所述mRNA疫苗是采用微流控设备将所述mRNA和脂质材料进行混合自组装形成；或者
所述mRNA疫苗是通过将所述纳米载体与mRNA进行孵育形成的。
再一方面，本发明提供上述核酸疫苗的制备方法。
再一方面，本发明提供包含上述核酸分子的腺病毒载体疫苗。
具体地，所述腺病毒载体疫苗，包含：装载有所述核酸分子的腺病毒。
再一方面，本发明提供由上述核酸分子编码的蛋白。
再一方面，本发明提供一种包含上述蛋白的蛋白或多肽疫苗。
具体地，所述蛋白或多肽疫苗，将上述蛋白作为抗原成分。
进一步，包括药学上可接受的辅料或者辅助性成分。
进一步，包含免疫佐剂。
在具体的实施方式中，所述免疫佐剂包括选自弗氏不完全佐剂、完全弗氏佐剂、氢氧化铝佐剂、磷酸铝佐剂、乳佐剂、脂质体佐剂和微生物佐剂中的至少之一。
再一方面，本发明提供包含上述核酸分子的载体。
具体地，所述载体，携带所述核酸分子。
进一步地，所述载体为真核载体或原核载体。
在一些具体地实施方式中，所述载体包括选自质粒载体、腺病毒载体、慢病毒载体和腺相关病毒载体中的至少之一。
再一方面，本发明提供一种疫苗载体。
所述载体疫苗的活性成分是通过将所述的核酸分子装载到所述的载体得到的。
再一方面，本发明提供一种药物组合物。
具体的，所述药物组合物包括：所述核酸分子、所述核酸疫苗、依据所述的方法制备的核酸疫苗、所述的腺病毒疫苗、所述的蛋白、所述的蛋白或多肽疫苗或所述的载体疫苗中的一种或多种。
进一步的，所述的药物组合物包括药学上可接受的辅料。
再一方面，本发明提供上述活性成分在制备预防或治疗肝癌或肝癌并发症的药物中的用途。
具体地，所述核酸分子、所述核酸疫苗、依据所述的方法制备的核酸疫苗、所述的腺病毒疫苗、所述的蛋白、所述的蛋白或多肽疫苗或所述的载体疫苗、所述的药物组合物在制备预防或治疗肝癌或肝癌并发症的药物中的用途。
本发明前期动物实验结果表明，包含T细胞表位肽的乙肝病毒X蛋白作为肝癌治疗性疫苗抗原，能够有效延长肝癌小鼠的生存期，有临床开发价值，具有良好的临床应用前景。
根据本发明实施例，与传统免疫制剂相比，本发明的mRNA免疫制剂(包含T细胞表位肽的乙肝病毒X蛋白脂质纳米粒核酸疫苗)起效快速、长效表达、持久递呈抗原；体内自动降解，安全性好。
根据本发明实施例，与同类免疫制剂比较，本发明的mRNA免疫制剂抗肿瘤治疗活性更好，以非病毒载体递送mRNA，安全性也更好。
附图说明
图1实施例5免疫方案示意图；
图2Hepal6-HBX肝癌肿瘤模型小鼠生存期；
图3为小鼠体内抗肿瘤生长试验的给药过程中的小鼠体重变化图；
图4为小鼠体内肿瘤生长体积曲线图；
图5为IFN-γELISpot检测小鼠体内引起的细胞免疫响应的斑点图；
图6为IFN-γELISpot检测小鼠体内引起的细胞免疫响应的斑点统计结果柱状图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
在本文中，术语“(XXXX)n”表示n个XXXX相连接，X表示氨基酸。例如“(GGGGS)3”表示GGGGSGGGGSGGGGS。
在本文中，术语“片段”是指目标蛋白或多肽，以及具有N-末端(N端)或C-末端(C端)截短、和/或内部删除的目标蛋白或多肽。
在本文中，术语“同一性”、“同源性”或“相似性”均用于描述相对于参考序列的氨基酸序列或核酸序列时，采用通过常规的方法进行确定两个氨基酸序列或核酸序列之间的相同氨基酸或核苷酸的百分比，例如参见，Ausubel等，编著(1995)，Current Protocols inMolecular Biology，第19章(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)；和ALIGN程序(Dayhoff(1978)，Atlas of Protein Sequence and Structure 5：Suppl.3(National Biomedical Research Foundation，Washington，D.C.)。关于比对序列和测定序列同一性有很多算法，包括，Needleman等(1970)J.Mol.Biol.48：443的同源性比对算法；Smith等(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部同源性算法；Pearson等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444的相似性搜索方法；Smith-Waterman算法(Meth.Mol.Biol.70：173-187(1997)；和BLASTP，BLASTN，和BLASTX算法(参见Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)。利用这些算法的计算机程序也是可获得的，并且包括但不限于：ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件，或者WU-BLAST-2(Altschul等，Meth.Enzym.，266：460-480(1996))；或者GAP，BESTFIT，BLAST Altschul等，上文，FASTA，和TFASTA，在Genetics Computing Group(GCG)包，8版，Madison，Wisconsin，USA中可获得；和Intelligenetics，Mountain View，California提供的PC/Gene程序中的CLUSTAL。
在本文中，术语“载体”通常是指能够插入在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。
在本文中，术语“药物组合物”通常是指单位剂量形式，并且可以通过制药领域中熟知的方法的任何一种进行制备。所有的方法包括使活性成分与构成一种或多种附属成分的载体相结合的步骤。通常，通过均匀并充分地使活性化合物与液体载体、细碎固体载体或这两者相结合，制备组合物。
在本文中，术语“药学上可接受的辅料”均可包括任何溶剂、固体赋形剂、稀释剂或其他液体赋形剂等等，适合于特有的目标剂型。除了任何常规的辅料与本发明的化合物不相容的范围，例如所产生的任何不良的生物效应或与药学上可接受的组合物的任何其他组分以有害的方式产生的相互作用，它们的用途也是本发明所考虑的范围。
在本文中，术语“给药”指将预定量的物质通过某种适合的方式引入病人。本发明的核酸分子、核酸疫苗、载体、载体疫苗、多肽、抗体或抗原结合片段、重组蛋白、多特异性抗体、蛋白或多肽疫苗、偶联物或药物组合物可以通过任何常见的途径被给药，只要它可以到达预期的组织。给药的各种方式是可以预期的，包括腹膜注射、静脉注射、肌肉注射、皮下注射等等，但是本发明不限于这些已举例的给药方式。优选地，本发明的组合物采用静脉注射或肌肉注射方式被给药。
在本文中，所述linker元件包含以下核酸序列或由以下核酸序列组成，所述核酸序列为GGGGS、(GGGGS)2、(GGGGS)3、(GGGGS)4、(GGGGS)5、(GGGGS)6、(GGS)10或(GSG)10中的至少一种的编码核酸序列。
根据本发明的实施例，所述linker的氨基酸序列为GGGGS、(GGGGS)2、(GGGGS)3、(GGGGS)4、(GGGGS)5、(GGGGS)6、(GGS)10或(GSG)10中的至少一种。
示例性地，所述GGGGS、(GGGGS)3、(GGGGS)6、(GGS)10、(GSG)10的氨基酸序列如下所述。
GGGGS的氨基酸序列为：GGGGS(SEQ ID NO.9)；
(GGGGS)2的氨基酸序列为：GGGGSGGGGS(SEQ ID NO.48)
(GGGGS)3的氨基酸序列为：GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO.10)；
(GGGGS)6的氨基酸序列为：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO.11)；
(GGS)10的氨基酸序列为：GGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO.12)；
(GSG)10的氨基酸序列为：GSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSG(SEQ ID NO.13)。
需要说明的是，对于本文中所提及的核酸分子，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本文中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。另外，本申请中的核酸序列包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。
同时，本发明设计一系列的含有上述的开放阅读框的核酸分子。这些开放阅读框除含有编码乙肝病毒蛋白X抗原元件-(linker)-T细胞表位肽的编码区外，还可以包含或不包含信号肽序列编码区。
在一种实施方式中，所述信号肽氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO.14)：MKRELLCVLLLCGLAFPKL。
在一种实施方式中，所述信号肽氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO.15)：
MGVLLTQRTLLSLVLALLFPSMASM。
在一种实施方式中，所述信号肽氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO.16)：MKCLLYLAFLFIGVNC。
在一种实施方式中，所述信号肽氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO.17)：
METDTLLLWVLLLWVPGSTGD。
在一种实施方式中，所述信号肽氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO.18)：MGWSCIILFLVATATGVHS。
在一种实施方式中，所述信号肽氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO.19)：MRAWIFFLLCLAGRALA。
在一种实施方式中，所述信号肽氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO.20)：MAFLWLLSCWALLGTTFG。
在一种实施方式中，所述信号肽氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO.21)：MNLLLILTFVAAAVA。
在一种实施方式中，所述信号肽氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO.22)：MYRMQLLSCIALSLALVTNS。
在一种实施方式中，所述信号肽氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO.23)：MGVKVLFALICIAVAEA。
在一种实施方式中，所述信号肽氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO.24)：MKWVTFISLLFSSAYS。
在一种实施方式中，所述信号肽氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO.25)：MKTIIALSYIFCLVLG。
在一种实施方式中，所述信号肽氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO.26)：
MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAA。
在一种实施方式中，所述信号肽氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO.27)：MKPIFLVLLVVTSAYA。
在具体地实施方式中，信号肽序列和抗原编码区序列、linker序列、辅助T细胞表位肽可以分别以两条序列提供、也可以位于同一序列提供。
进一步的，上述核酸分子还可以含有5’端非翻译区、开放阅读框、3’端非翻译区依次连接。更进一步的，还可以含有启动子。通过启动子、5’端非翻译区、开放阅读框、3’端非翻译区依次连接的DNA模板，可以转录获得mRNA。转录过程可以通过现有的体外转录方法和相关试剂盒进行。更进一步的，上述核酸分子还可以含有polyA片段。
在一种实施方式中，启动子为T7或SP6启动子。
在一种实施方式中，5’端非翻译区的核苷酸序列如下所示(SEQ ID NO.49)：
AGGCAAAAATCAAAATCAATCATCATCACAACATCAACAATCAATCATCAACACATCATCAAGACAGCCACC。
在一种实施方式中，3’端非翻译区的核苷酸序列如下所示(SEQ ID NO.28)：
TGATGAGCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGCTGCGTCGAGAGCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGC。
在一种实施方式中，polyA的核苷酸序列如下所示(SEQ ID NO.29)：
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGTCTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA。
上述的核酸、蛋白或多肽可以作为活性成分，制备预防和/或治疗肝癌或肝癌并发症的药物或疫苗。一般来说，本领域技术人员可将上述的蛋白作为抗原活性成分制备蛋白或多肽疫苗。该疫苗以上述的蛋白作为抗原成分，以及药学上可接受的辅料或者辅助性成分。
制备疫苗时，经常会添加免疫佐剂以增强机体对疫苗的免疫响应。其中，所述的免疫佐剂为弗氏不完全佐剂、完全弗氏佐剂、氢氧化铝佐剂、磷酸铝佐剂、乳佐剂、脂质体佐剂、微生物佐剂等。
自然的，本领域在本发明记载的蛋白的基础上，容易得到上述蛋白的抗体。上述的抗体为多克隆抗体或单克隆抗体；优选为单克隆抗体。上述抗体还与偶联部分形成偶联物。进一步的，所述偶联部分为选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、载体蛋白或生物素中的一种或多种。可特异性结合前述的蛋白的抗体一方面可用于制备药物，另一方面可用于前述蛋白的相关免疫检测。
此外，本发明也包含了上述蛋白的编码基因。上述蛋白的编码基因一方面可以用于表达制备上述的蛋白或抗体外；另一方面还可以可操作地装载在表达载体中，进而可制备成载体疫苗或载体药物。表达载体可在质粒载体、腺病毒载体、慢病毒载体或腺相关病毒载体等常用载体中选择。当使用腺病毒载体时，一般采用复制缺陷型腺病毒载体。
比如，上述核酸分子为DNA时，其转录获得的mRNA可以与药学上可接受的辅料或者辅助性成分一起制备成mRNA疫苗。所述的辅助性成分可为运载所述mRNA的纳米载体。所述的纳米载体常用脂质纳米载体。比如采用以下至少一种原料制备而成的脂质纳米载体：DOTAP、DOTMA、DOTIM、DDA、DC-Chol、CCS、diC14-脒、DOTPA、DOSPA、DTAB、TTAB、CTAB、DORI、DORIE及其衍生物、DPRIE、DSRIE、DMRIE、DOGS、DOSC、LPLL、DODMA、DDAB、Dlin-MC3-DMA、CKK-E12、C12-200、DSPC、DMG-PEG、DOPE、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、胆固醇(Chol)。
优选的，制备纳米载体所用的脂质材料为两亲性脂质材料或阳离子脂质材料，这是因为这类脂质材料在酸性条件下表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电吸附作用将mRNA分子包裹入内，形成mRNA-脂复合物。mRNA-脂复合物能被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过膜的融合或细胞的内吞作用，将mRNA传递进入细胞再进一步表达，发挥疫苗的免疫作用。
一般来说，上述mRNA疫苗的制备可以采用微流控设备使mRNA和脂质材料自组装形成mRNA-脂复合物，或者制备好纳米载体后与mRNA进行孵育形成mRNA-脂复合物。
本发明所述的乙肝病毒X蛋白可以任选自乙肝病毒基因型A、B、C、E、F、G、H之一的乙肝病毒X蛋白序列。
优选乙肝病毒基因型C。
在一种实施方式中，本发明乙肝病毒X蛋白序列的氨基酸序列为(SEQ ID NO.3)：
AARLCCQLDPARDVLCLRPVGAESRGRPVSGPFGPLPSPSSSAVPADHGAHLSLRGLPVCAFSSAGPCALRFTSARSMETTVNAHQVLPKVLHKRTLGLSAMSTTDLEAYFKDCLFKDWEELGEEIRLKVFVLGGCRHKLVCSPAPCNFFPSA。
在一种实施方式中，本发明乙肝病毒X蛋白序列的氨基酸序列为(SEQ ID NO.30)：
MAARLCCQLDPARDVLCLRPVGAESRGRPVSGPFGPLPSPSSSAVPADHGAHLSLRGLPVCAFSSAGPCALRFTSARSMETTVNAHQVLPKVLHKRTLGLSAMSTTDLEAYFKDCLFKDWEELGEEIRLKVFVLGGCRHKLVCSPAPCNFFPSA。
在一种实施方式中，本发明乙肝病毒X蛋白序列的氨基酸序列为(SEQ ID NO.31)：
MAARLCCQLDPARDVLCLRPVGAESCGRPFSGSLGTLSSPSPSAVPTDHGAHLSLRGLPVCAFSSAGPCALRFTSARRMETTVNAHQILPKVLHKRTLGLSAMSTTDLEAYFKDCLFKDWEELGEEIRLKVFVLGGCRHKLVCAPAPCNFFTSA。
在一种实施方式中，本发明乙肝病毒X蛋白序列的氨基酸序列为(SEQ ID NO.32)：
MAARLYCQLDPSRDVLCLRPVGAESRGRPLSGPLGTLSSPSPSAVPADHGAHLSLRGLPVCAFSSAGPCALRFTSARCMATTVNAHQILPKVLHKRTLGLPAMSTTDLEAYFKDCVFKDWEELGEEIRLKVFVLGGCRHKLVCAPAPCNFFTSA。
在一种实施方式中，本发明乙肝病毒X蛋白序列的氨基酸序列为(SEQ ID NO.33)：
MAARVCCQLDPARDVLCLRPVGAESRGRPVSGPFGPLPSPSSSAVPADHGARLSLRGLPVCAFSSAGPCALRFTSARRMETTVNAHQVLPKVLHKRTLGLSAMSTTDLEAYFKDCLFKDWEELGEEIRLMVFVLGGCRHKLVCSPAPCNFFTSA。
在一种实施方式中，本发明乙肝病毒X蛋白序列的氨基酸序列为(SEQ ID NO.34)：
MAARVCCQLDPARDVLCLRPVGAESRGRPVSGPFGALPSPSSSAVPADHGAHLSLRGLPVCAFSSAGPCALRFTSARRMETTVNAHQVLPKVLHKRTLGLSAMSTTDLEAYFKDCVFKDWEELGEEIRLKVFVLGGCRHNFFTSA。
在一种实施方式中，本发明乙肝病毒X蛋白序列的氨基酸序列为(SEQ ID NO.35)：
MAARLCCQLDPARDVLCLRPVGAESRGRPVSGPLGSLSSSSPSAVPTDHGAHLSLRGLPVCAFSSAGPCALRFTSARRMETTVNAHQILPKILHKRTLGLSTMSTTDLEAYFKDCLFKDWEELGEEIRLKVFVLGGCRHKLVCAPAPCNFFTSA。
在一种实施方式中，本发明乙肝病毒X蛋白序列的氨基酸序列为(SEQ ID NO.36)：
MAARLYCQLDSSRDVLCLRPVGAESRGRPLAGPLGALSSPSPSAVPSDHGAHLSLRGLPVCAFSSAGPCALRFTSARCMETTVNAHQILPKVLHKRTLGLPAMSTTDLEAYFKDCVFKDWEELGEEIRLKVFVLGGCRHKLVFAPSSCNFFTSA。
在一种实施方式中，本发明乙肝病毒X蛋白序列的氨基酸序列为(SEQ ID NO.37)：
MAARLCCQLDPARDVLCLRPVGAESCGRPLSWSPGALPPPSPPSVPADDRAHLSLRGLPACAFSSAGPCALRFTSARRMETTVNAPQSLPTPLHKRTLGLSPRSTTWIEEYIKDCVFKDWEESGEELRLKVFVLGGCRHKLVCSPAPCNFFTSA。
在一种实施方式中，本发明乙肝病毒X蛋白序列的氨基酸序列为(SEQ ID NO.38)：
MAARVCCQLDPARDVLCLRPVGAESRGRPVSGPFGPLPSPSSSAVPADHGAHLSLRGLPVCAFSSAEPCALRLTSARRMETTVNAHQVLPKVLHKRTLGLSAMSTTDLEAYFKDCLFKDWEELGEEIRLKVWRL。
在一种实施方式中，本发明乙肝病毒X蛋白序列的氨基酸序列为(SEQ ID NO.39)：
MAARLCCQLDPARDVLCLRPVGAESRGRPFPGPLGALPPASPPVVPTDHGAHLSLRGLPVCAFSSAGPCALRFTSARRMETTVNAHGNLPKVLHKRTLGLSAMSTTDLEAYFKDCVFNEWEELGEEVRLKVFVLGGCRHKLVCSPAPCNFFTSA。
在一种实施方式中，本发明乙肝病毒X蛋白序列的氨基酸序列为(SEQ ID NO.47)：
MAARLCCQLDPTRDVLCLRPVGAESRGRPVSGPLGDLPSPSASPVPTIDRAHLSLRGLPVCAFSSAGPCALRFTSARRMETTVNTHMILPKVLHKRTLGLPAMSTIDLEAYFKDCLFKDWEELGEEIRLKVFVLGGCRHKLVCSPAPCNFFTSA。
在一种实施方式中，本发明乙肝病毒X蛋白序列的氨基酸序列为(SEQ ID NO.40)：
MAARLCCQLDPARDVLCLRPVGAESRGRPLPGPLGALPPASPPAVPSDHGAHLSLRGLPVCAFSSAGPCALRFTSARRMETTVNAHRNLPKVLHKRTLGLSAMSTTDLEAHFKDCVFTEWEELGEEIRLKVFVLGGCRHKLVCSPAPCNFFTSA。
在一种实施方式中，本发明乙肝病毒X蛋白序列的氨基酸序列为(SEQ ID NO.41)：
MAARLCCQLDPARDVLCLRPVGAESRGRPFSGPFGTLSSPSPSAVSTDHGAHLSLRGLPVCAFSSAGPCALRFTSARRMETTVNAHQFLPKVLYKRTLGLSVMSTTDLEAYFKDCLFKDWEELGEETRLMIFVLGGCRHKLVCAPAPCNFFTSA。
在一种实施方式中，本发明乙肝病毒X蛋白序列的氨基酸序列为(SEQ ID NO.42)：
MAARLCCQLDPARDVLCLRPVGAESCGRPVSGSLGGLSSPSPSAVPADHGAHLSLRGLPVCAFSSAGPCALRFTSARRMETTVNAHQILPKVLHKRTLGLSAMSTTDLEAYFKDCLFKDWEELGEEIRLKVFVLGGCRHKLVCVPAPCNFFTSA。
在一种实施方式中，本发明乙肝病毒X蛋白序列的氨基酸序列为(SEQ ID NO.43)：
MAARLCCQLDPARDVLCLRPVSAESCGRSVSGSLGDLSSPSPSAVPADHGAHLSLRGLPVCAFSSAGPCALRFTSARRMETTVNAHQILPKVLHKRTLGLSAMSTTDLEAYFKACLFKDWEELGEEIRLKIFVLGGCRHKLVCAPAPCNFFTSA。
在一种实施方式中，本发明乙肝病毒X蛋白序列的氨基酸序列为(SEQ ID NO.44)：
MAARLCCQLDPARDVLCLRPVGAESCGRPLSWSLGALPPSSPPAVPADDGSHLSLRGLPACAFSSAGPCALRFTSARRMETTVNAPWNLPTTLHKRTLGLSPRSTTWIEEYIKDCVFKDWEESGEELRLKVFVLGGCRHKLVCSPAPCNFFTSA。
在一种实施方式中，本发明乙肝病毒X蛋白序列的氨基酸序列为(SEQ ID NO.45)：
MAARMCCQLDPARDVLCLRPVGAESRGRPLPGPLGALPPSSASAVPADHGSHLSLRGLPVCSFSSAGPCALRFTSARRMETTVNAPWSLPTVLHKRTIGLSGRSMTWIEEYIKDCVFKDWEELGEEIRLKVFVLGGCRHKLVCSPAPCNFFTSA。
在一种实施方式中，本发明乙肝病毒X蛋白序列的氨基酸序列为(SEQ ID NO.46)：
MAARLCCQLDPARDVLCLRPVGAESRGRPFSGPLGALSSSSPPAVPTDHGAHLSLRGLPVCAFSSAGPCALRFTSARRMETTVNAHQFLPKVLHKRTLGLSAMSTTDLEAYFKDCLFKDWEELGEELRLKVFVLGGCRHKLVCAPAPCNFFTSA。
以下通过对实施例的描述对本发明进行进一步的详细描述。
实施例1小鼠肝癌肿瘤模型构建
采用慢病毒表达系统构建表达HBX基因的重组慢病毒载体，将其转染到小鼠肝癌细胞系Hepal-6中，构建稳定表达HBX的细胞株(Hepal6-HBX)。然后将2.5×106个Hepal6-HBX细胞接种至小鼠右侧皮下，构建小鼠肝癌肿瘤模型。
具体方法：C57BL/6小鼠适应性饲养1周后，将Hepal6-HBX细胞悬液密度调整至7×106cells/mL，吸取360μL皮下注射接种于C57BL/6小鼠右侧皮下。
实施例2HBX-TT mRNA转录载体模板构建
本实施例中的mRNA的转录模板DNA由启动子、5’端非翻译区、信号肽序列、辅助T细胞表位肽(TT)抗原编码区序列(HBX)、3’端非翻译区、Poly(A)依次连接，并连入质粒相应位置，测序验证序列正确，得到mRNA转录模板DNA。其中，信号肽序列和抗原编码区序列、linker序列、辅助T细胞表位肽可以分别以两条序列提供、也可以位于同一序列提供。
启动子为T7或SP6启动子。
本实施例TT选用T细胞表位肽P2，其氨基酸序列为(SEQ ID NO.1)：QYIKANSKFIGITE。
本实施例Linker的氨基酸序列为(SEQ ID NO.48)：GGGGSGGGGS。
本实施例HBX的氨基酸序列为(SEQ ID NO.30)：
MAARLCCQLDPARDVLCLRPVGAESRGRPVSGPFGPLPSPSSSAVPADHGAHLSLRGLPVCAFSSAGPCALRFTSARSMETTVNAHQVLPKVLHKRTLGLSAMSTTDLEAYFKDCLFKDWEELGEEIRLKVFVLGGCRHKLVCSPAPCNFFPSA。
本实施例信号肽的氨基酸序列为(SEQ ID NO.4)：MKRELLCVLLLCGLAFPKL。
本实施例TT选用T细胞表位肽P2，其DNA序列为(SEQ ID NO.5)：
CAGTACATCAAGGCCAACAGCAAGTTCATCGGCATCACCGAG。
本实施例Linker的DNA序列为(SEQ ID NO.6)：
GGAGGAGGAGGAAGTGGAGGAGGAGGCTCT。
本实施例HBX的DNA序列为(SEQ ID NO.7)：
ATGGCCGCCAGGCTGTGCTGCCAGCTGGACCCCGCCAGGGACGTGCTGTGCCTGAGGCCCGTGGGCGCCGAGAGCAGGGGCAGGCCCGTGAGCGGCCCCTTCGGCCCCCTGCCCAGCCCCAGCAGCAGCGCCGTGCCCGCCGACCACGGCGCCCACCTGAGCCTGAGGGGCCTGCCCGTGTGCGCCTTCAGCAGCGCCGGCCCCTGCGCCCTGAGGTTCACCAGCGCCAGGAGCATGGAAACCACCGTGAACGCCCACCAGGTGCTGCCCAAGGTGCTGCACAAGAGGACCCTGGGCCTGAGCGCCATGAGCACCACCGACCTGGAGGCCTACTTCAAGGACTGCCTGTTCAAGGACTGGGAGGAGCTGGGCGAGGAGATCAGGCTGAAGGTGTTCGTGCTGGGCGGCTGCCGGCACAAGCTGGTGTGCAGCCCCGCCCCCTGCAACTTCTTCCCCAGCGCCGGAGGAGGAGGAAGTGGAGGAGGAGGCTCT。
本实施例信号肽的DNA序列为(SEQ ID NO.8)：
ATGAAGAGGGAGCTGCTGTGCGTGCTGCTGCTGTGCGGCCTGGCCTTCCCCAAGCTG。
以乙肝病毒X蛋白-linker-T细胞表位肽P2作为抗原，构建和制备含有编码HBX蛋白的mRNA，制得HBX-TT mRNA。将抗原编码区连入质粒载体相应位置，并测序验证。
得到的HBX-TT mRNA序列经检测如下：
HBX+TT蛋白序列为(SEQ ID NO.50)：
MQYIKANSKFIGITEAARLCCQLDPARDVLCLRPVGAESRGRPVSGPFGPLPSPSSSAVPADHGAHLSLRGLPVCAFSSAGPCALRFTSARSMETTVNAHQVLPKVLHKRTLGLSAMSTTDLEAYFKDCLFKDWEELGEEIRLKVFVLGGCRHKLVCSPAPCNFFPSA
HBX+TT ORF序列为(SEQ ID NO.51)：
ATGCAGTACATCAAGGCCAACAGCAAGTTCATCGGCATCACCGAGGCCGCCAGGCTGTGCTGCCAGCTGGACCCCGCCAGGGACGTGCTGTGCCTGAGGCCCGTGGGCGCCGAGAGCAGGGGCAGGCCCGTGAGCGGCCCCTTCGGCCCCCTGCCCAGCCCCAGCAGCAGCGCCGTGCCCGCCGACCACGGCGCCCACCTGAGCCTGAGGGGCCTGCCCGTGTGCGCCTTCAGCAGCGCCGGCCCCTGCGCCCTGAGGTTCACCAGCGCCAGGAGCATGGAAACCACCGTGAACGCCCACCAGGTGCTGCCCAAGGTGCTGCACAAGAGGACCCTGGGCCTGAGCGCCATGAGCACCACCGACCTGGAGGCCTACTTCAAGGACTGCCTGTTCAAGGACTGGGAGGAGCTGGGCGAGGAGATCAGGCTGAAGGTGTTCGTGCTGGGCGGCTGCCGGCACAAGCTGGTGTGCAGCCCCGCCCCCTGCAACTTCTTCCCCAGCGCCTGA。
实施例3HBX-TT mRNA体外转录
将实施例2的HBX-TT mRNA转录模板DNA插入到pUC57载体中制备质粒DNA，参考《分子克隆实验指南(第四版)》、市售限制性内切酶和DNA纯化试剂盒产品使用说明书，对质粒DNA进行酶切，处理成线性化质粒DNA模板，然后纯化线性化质粒DNA模板。通过分光光度法和凝胶电泳检测质粒DNA及线性化DNA模板的浓度、纯度，通过电泳验证确认是否线性化完全。
选用RNA聚合酶、NTP以及帽子类似物等合成制备mRNA。根据试剂盒(诺唯赞TR101-02)操作指南进行前体mRNA的体外转录。具体如下：按剂量和顺序分别加入相关反应物至1.5mL离心管中，移液枪吸放3次或手指轻敲管底使混匀，简单离心使反应液收于管底。置37℃水浴中孵育4h后，加入1μL DNase，37℃孵化15min；再加入无核酸酶的水179μL，然后加入200μL的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)溶液进行mRNA的萃取。混匀之后以15000rpm的转速离心10min，然后取水相。然后加入200μL的5M醋酸铵溶液，4℃放置过夜进行mRNA的沉淀。然后取出在4℃、15000rpm离心10min，小心移去上清液。加入1mL 70％乙醇洗涤沉淀，4℃、15000rpm离心10min，小心移去上清液，风干沉淀。然后加20μL无核酸酶的水复溶即得mRNA溶液。
采用琼脂糖凝胶电泳或核酸片段分析仪检测mRNA的纯度。
实施例4HBX-TT mRNA脂质纳米粒的制备
采用微流控技术制备HBX-TT mRNA脂质纳米粒。制剂处方由Dlin-MC3-DMA、DOPE、Chol、DMG-PEG2000和HBX-TT mRNA组成，将Dlin-MC3-DMA和mRNA质量比设为12:1进行有机相和水相的配制。将Dlin-MC3-DMA、DOPE、Chol和DMG-PEG2000溶于无水乙醇中并以摩尔比45:10:43.5:1.5的比例配成一定体积的有机相，同时用RNase-Free水将HBX-TT mRNA配制成一定体积的水相，其中水相与有机相体积比为3:1，通过微流控纳米制剂仪一步制成负载有HBX-TT mRNA的LNP制剂，仪器参数设置如下：水相、有机相比例固定为3:1、流速固定为12mL/min。微流控初制剂以磷酸盐缓冲液(PBS)超滤除去乙醇，并控制最终制剂的mRNA浓度为0.1mg/mL，即得HBX-TT mRNA脂质纳米粒(HBX-TT)。
粒径及电位检测：量取一定体积的HBX-TT mRNA脂质纳米粒胶体溶液，用纯化水稀释10倍，于激光粒度分析仪中测定mRNA疫苗的粒径和电位(n＝3，即每个处方测定3次)。检测结果显示，制备得到的HBX-TT mRNA脂质纳米粒粒径均约为65nm，PDI均约为0.12，电位均约3mV，均一性良好。
包封率检测：采用Quant-iTTMRiboGreenTM试剂盒检测样品包封率为98％。
上述检测结果表明：制备得到的HBX-TT mRNA脂质纳米粒粒径小而均一，且包封率高。
实施例5HBX-IE mRNA脂质纳米粒的制备
(1)采用与上述实施例2相似的操作方法制备得到HBX-IE mRNA转录模板DNA；
本实施例中的mRNA的转录模板DNA由启动子、5’端非翻译区、信号肽序列、抗原编码区序列(HBX)、linker序列、E3泛素酶连接酶的结合或招募配体(IE)，3’端非翻译区、Poly(A)依次连接，并连入质粒相应位置，测序验证序列正确，得到mRNA转录模板DNA。
启动子为T7或SP6启动子。
本实施例IE选用MDM2对应的肽类配体P53B，其氨基酸序列为(SEQ ID NO.56)：ETFSDLWKLL。
本实施例Linker的氨基酸序列为(SEQ ID NO.48)：GGGGSGGGGS。
本实施例HBX的氨基酸序列为(SEQ ID NO.30)：
MAARLCCQLDPARDVLCLRPVGAESRGRPVSGPFGPLPSPSSSAVPADHGAHLSLRGLPVCAFSSAGPCALRFTSARSMETTVNAHQVLPKVLHKRTLGLSAMSTTDLEAYFKDCLFKDWEELGEEIRLKVFVLGGCRHKLVCSPAPCNFFPSA。
本实施例信号肽的氨基酸序列为(SEQ ID NO.4)：MKRELLCVLLLCGLAFPKL。
得到的HBX-IE mRNA序列经检测如下：
HBX+IE蛋白序列为(SEQ ID NO.52)：
MAARLCCQLDPARDVLCLRPVGAESRGRPVSGPFGPLPSPSSSAVPADHGAHLSLRGLPVCAFSSAGPCALRFTSARSMETTVNAHQVLPKVLHKRTLGLSAMSTTDLEAYFKDCLFKDWEELGEEIRLKVFVLGGCRHKLVCSPAPCNFFPSAGGGGSGGGGSETFSDLWKLL
HBX+IE ORF序列为(SEQ ID NO.53)：
ATGGCCGCCAGGCTGTGCTGCCAGCTGGACCCCGCCAGGGACGTGCTGTGCCTGAGGCCCGTGGGCGCCGAGAGCAGGGGCAGGCCCGTGAGCGGCCCCTTCGGCCCCCTGCCCAGCCCCAGCAGCAGCGCCGTGCCCGCCGACCACGGCGCCCACCTGAGCCTGAGGGGCCTGCCCGTGTGCGCCTTCAGCAGCGCCGGCCCCTGCGCCCTGAGGTTCACCAGCGCCAGGAGCATGGAAACCACCGTGAACGCCCACCAGGTGCTGCCCAAGGTGCTGCACAAGAGGACCCTGGGCCTGAGCGCCATGAGCACCACCGACCTGGAGGCCTACTTCAAGGACTGCCTGTTCAAGGACTGGGAGGAGCTGGGCGAGGAGATCAGGCTGAAGGTGTTCGTGCTGGGCGGCTGCCGGCACAAGCTGGTGTGCAGCCCCGCCCCCTGCAACTTCTTCCCCAGCGCCGGAGGAGGAGGAAGTGGAGGAGGAGGCTCTGAAACCTTCAGCGACCTGTGGAAGCTGCTGTGA。
(2)采用与实施例3和实施例4的相似操作，对上述HBX-IE mRNA体外转录以及脂质纳米粒的制备；得HBX-IE mRNA脂质纳米粒(HBX-IE)。
实施例6HBX-TT-IE mRNA脂质纳米粒的制备
采用上述实施例2～4、以及实施例5的方法，将辅助T细胞表位肽(TT)、E3泛素酶连接酶的结合或招募配体(IE)同时连接于包含抗原编码区序列(HBX)的转录模板DNA中；制备得到HBX-TT-IE mRNA脂质纳米粒：
得到的HBX-TT-IE mRNA序列经检测如下：
HBX+TT+IE蛋白序列为(SEQ ID NO.54)：
MQYIKANSKFIGITEAARLCCQLDPARDVLCLRPVGAESRGRPVSGPFGPLPSPSSSAVPADHGAHLSLRGLPVCAFSSAGPCALRFTSARSMETTVNAHQVLPKVLHKRTLGLSAMSTTDLEAYFKDCLFKDWEELGEEIRLKVFVLGGCRHKLVCSPAPCNFFPSAGGGGSGGGGSETFSDLWKLL
HBX+TT+IE ORF序列为(SEQ ID NO.55)：
ATGCAGTACATCAAGGCCAACAGCAAGTTCATCGGCATCACCGAGGCCGCCAGGCTGTGCTGCCAGCTGGACCCCGCCAGGGACGTGCTGTGCCTGAGGCCCGTGGGCGCCGAGAGCAGGGGCAGGCCCGTGAGCGGCCCCTTCGGCCCCCTGCCCAGCCCCAGCAGCAGCGCCGTGCCCGCCGACCACGGCGCCCACCTGAGCCTGAGGGGCCTGCCCGTGTGCGCCTTCAGCAGCGCCGGCCCCTGCGCCCTGAGGTTCACCAGCGCCAGGAGCATGGAAACCACCGTGAACGCCCACCAGGTGCTGCCCAAGGTGCTGCACAAGAGGACCCTGGGCCTGAGCGCCATGAGCACCACCGACCTGGAGGCCTACTTCAAGGACTGCCTGTTCAAGGACTGGGAGGAGCTGGGCGAGGAGATCAGGCTGAAGGTGTTCGTGCTGGGCGGCTGCCGGCACAAGCTGGTGTGCAGCCCCGCCCCCTGCAACTTCTTCCCCAGCGCCGGAGGAGGAGGAAGTGGAGGAGGAGGCTCTGAAACCTTCAGCGACCTGTGGAAGCTGCTGTGA
试验例7HBX-TT mRNA脂质纳米粒的肝癌效果
将实施例4制备的HBX-TT mRNA脂质纳米粒疫苗进行肝癌肿瘤模型小鼠生存期试验。
考察了本发明mRNA脂质纳米粒对肿瘤体积的影响：选择实施例1的雄性C57BL/6小鼠(肿瘤大小达到3×3mm3)，随机分组，每组7只，PBS对照组5只；考察实施例4制备的HBX-TTmRNA脂质纳米粒免疫肝癌肿瘤模型小鼠后，其抗肿瘤效果。
具体方法：
C57BL/6小鼠适应性饲养1周后，将稳定表达HBX的细胞株(Hepal6-HBX)细胞悬液密度调整至7×106cells/mL，吸取360μL皮下注射接种于C57BL/6小鼠右侧皮下。接种7天后按照实验设计(图1-免疫方案示意图)静脉或肌肉注射免疫小鼠，给药操作为：
对照组：PBS组/5只(筛选后)：50μL/只
疫苗组：WGv-021静脉给药组/7只：10μg/只
WGv-021肌肉给药组/7只：10μg/只
给药间隔：当肿瘤大小达到3×3mm3时，第一针给药，记为0天，给药间隔为每周1次，共3次；
首次给药当天，采用电子游标卡尺测量荷瘤小鼠肿瘤直径，之后每隔1天记录一次，按实验设计计算肿瘤体积，绘制得到荷瘤小鼠肿瘤期间生长体积-时间曲线图。
结果如图2所示，本实施例4制备得到的包括了TT表达HBX抗原的mRNA疫苗能够有效延长肝癌小鼠的生存期；与对照组PBS相比，WGv-021静脉组与WGv-021肌肉组肝癌小鼠生存期延长。
表明，本实施例4制备得到的HBX-TT mRNA脂质纳米粒疫苗能够有效延长肝癌小鼠的生存期。
在免疫治疗过程中，同步监测小鼠生理状况：
在整个治疗过程中，各组均呈现体重增加的趋势，未出现明显的体重下降，表明各制剂没有明显毒副作用，体内给药安全性良好。
本发明的HBX-TT mRNA脂质纳米粒免疫制剂，能够有效延长肝癌小鼠的生存期，安全性良好。
试验例8体内免疫激活试验
将实施例4得到的HBX-TT mRNA脂质纳米粒疫苗、实施例5得到的HBX-IE mRNA脂质纳米粒疫苗、实施例6得到的HBX-TT-IE mRNA脂质纳米粒疫苗进行小鼠免疫激活试验；
以实施例2的HBX mRNA的转录模板DNA(序列为(SEQ ID NO.7))，采用与实施例3和实施例4的相似操作，对HBX mRNA体外转录以及脂质纳米粒的制备；得HBX mRNA脂质纳米粒，以此为阳性对照HBX。
选择30只雄性C57BL/6小鼠，随机分成5组(G1～G5)，每组6只。其中G1为阴性对照组(Ctrl)，注射0.1mL/只的生理盐水(0.9％氯化钠注射液)；G2～G5分别为HBX、HBX+TT、HBX+IE、HBX+TT+IE mRNA制备的脂质纳米粒，给药量均为10μg/0.05mL/只。
给药途径为肌肉注射，给药次数总计4次，给药频率为每周1次。首次给药后开始，每周测量2次小鼠体重，以评价HBX系列mRNA脂质纳米粒的安全性。
末次给药结束后一周，将稳定表达HBX的细胞株(Hepal6-HBX)细胞悬液密度调整至7×106cells/mL，吸取360μL皮下注射接种于C57BL/6小鼠右侧皮下。植瘤后1周，采用游标卡尺测量荷瘤小鼠肿瘤直径，之后每周测量2次，按实验设计计算肿瘤体积，绘制得到荷瘤小鼠肿瘤期间生长体积-时间曲线图。
当有小鼠荷瘤直径超过20mm时，对所有动物进行安乐死，取小鼠脾脏，制备单细胞悬液，通过IFN-γELISpot检测细胞免疫的激活。
结果如下：
图3为小鼠体内抗肿瘤生长试验的给药过程中的体重变化图；
从图3可知，在整个给药过程中，HBX-TT、HBX-IE、HBX-TT-IE、阴性对照Ctrl组、阳性对照HBX组，均呈现体重增加的趋势，HBX-TT、HBX-IE、HBX-TT-IE制剂组未出现明显的体重下降，表明各本发明的加入辅助T细胞表位肽(TT)疫苗制剂、加入E3泛素酶连接酶的结合或招募配体(IE)疫苗制剂、加入两者的(TT-IE)疫苗制剂均没有明显毒副作用，体内给药安全性良好；
图4为小鼠体内肿瘤生长体积曲线图；
从图4可知，相对于各阴性对照Ctrl组、阳性对照HBX，本发明的加入辅助T细胞表位肽(TT)疫苗制剂、加入E3泛素酶连接酶的结合或招募配体(IE)疫苗制剂、加入两者的(TT-IE)制剂脂质纳米粒疫苗制剂均能够显著抑制肿瘤的生长，表现出优良的抗肿瘤活性；其中，HBX-TT-IE抑制肿瘤活性最强，肿瘤曲线显示，HBX-TT-IE给药后的肿瘤体积完全停止的增长；
图5为IFN-γELISpot检测小鼠体内引起的细胞免疫响应的斑点图；图6为IFN-γELISpot检测小鼠体内引起的细胞免疫响应的斑点统计结果柱状图；
从图5和图6可知，相对于阴性对照Ctrl组、阳性对照HBX，本发明的加入辅助T细胞表位肽(TT)疫苗制剂、加入E3泛素酶连接酶的结合或招募配体(IE)疫苗制剂、加入两者的(TT-IE)制剂脂质纳米粒疫苗制剂均显著产生特异性细胞毒性T细胞。有效激活了小鼠体内的细胞免疫响应；其中，HBX-TT-IE从图6中显示，免疫响应最强，远远高于阴性对照Ctrl组，是阳性对照组的4倍左右。表明具有显著的免疫激活效果，对肿瘤细胞杀伤力强。
需要说明的是，本说明书中描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例以及不同实施例的特征进行结合和组合。
Claims (30)
1.一种核酸分子，其包含至少一个开放阅读框，其特征在于，所述开放阅读框至少包含：编码至少一个乙肝病毒X蛋白的基因，和编码至少一个T细胞表位肽的基因的核酸序列；
其中，所述乙肝病毒选自乙肝病毒基因型A、B、C、E、F、G、H之一；
所述乙肝病毒选自乙肝病毒基因型C。
2.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述T细胞表位肽任选自辅助T细胞表位肽P4、P2和P30的一种或多种，
所述辅助T细胞表位肽P4对应的氨基酸序列是GQIGNDPNRDIL(SEQ ID NO.57)，
所述辅助T细胞表位肽P2对应的氨基酸序列是QYIKANSKFIGITE(SEQ ID NO.1)，
所述辅助T细胞表位肽P30对应的氨基酸序列是FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(SEQ IDNO.58)。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述T细胞表位肽任选自辅助T细胞表位肽P4、P2和P30的截短体或其延长体中的一种或多种，所述辅助T细胞表位肽的截短体或延长体具有与对应辅助T细胞表位肽相同或相似功能。
4.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述T细胞表位肽任选自与辅助T细胞表位肽P4、P2和P30的氨基酸序列具有至少80％序列一致性的多肽中的一种或多种，所述具有至少80％序列一致性的辅助T细胞表位肽具有与对应辅助T细胞表位肽相同或相似功能。
5.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述乙肝病毒X蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.30或SEQ ID NO.31或SEQ ID NO.32或SEQ ID NO.33或SEQ IDNO.34或SEQ ID NO.35或SEQ ID NO.36或SEQ ID NO.37或SEQ ID NO.38或SEQ ID NO.39或SEQ ID NO.40或SEQ ID NO.41或SEQ ID NO.42或SEQ ID NO.43或SEQ ID NO.44或SEQ IDNO.45或SEQ ID NO.46或SEQ ID NO.47，或其截短体或其延长体，或与其氨基酸序列具有至少80％序列一致性的乙肝病毒X蛋白，所述乙肝病毒X蛋白的截短体或其延长体或具有至少80％序列一致性的乙肝病毒X蛋白具有与SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.30或SEQ ID NO.31或SEQ ID NO.32或SEQ ID NO.33或SEQ ID NO.34或SEQ ID NO.35或SEQ ID NO.36或SEQ IDNO.37或SEQ ID NO.38或SEQ ID NO.39或SEQ ID NO.40或SEQ ID NO.41或SEQ ID NO.42或SEQ ID NO.43或SEQ ID NO.44或SEQ ID NO.45或SEQ ID NO.46或SEQ ID NO.47对应蛋白相同或相似功能。
6.根据权利要求1～5任一项所述的核酸分子，其特征在于，所述乙肝病毒X蛋白和所述T细胞表位肽的连接包括插入连接、端部直接连接或通过linker连接。
7.根据权利要求1～5任一项所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸选自DNA、ASO、siRNA、miRNA、mRNA、circRNA、适配体中至少一种。
8.根据权利要求7所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸为mRNA。
9.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子还包括E3配体元件；其中，所述E3配体元件是E3泛素酶连接酶的结合或招募配体；
优选地，所述E3泛素酶连接酶的结合或招募配体选自VHL(Von Hippel-Lindau)、MDM2、β-TrCP、Keap1或其截短体或其延长体中的一种或多种。
10.根据权利要求9所述的核酸分子，其特征在于，所述Keap1，结合或招募配体对应的氨基酸序列是LDPETGEYL(SEQ ID NO.66)或与其同源性大于60％的序列；所述β-TrCP，结合或招募配体对应的氨基酸序列是DRHDSGLDSM(SEQ ID NO.67)或与其同源性大于60％的序列；
所述VHL，结合或招募配体对应的氨基酸序列是LAP(OH)YI(SEQ ID NO.68)或ALAPYIP(SEQ ID NO.2)中的至少一种，或与其同源性大于60％的序列；
所述MDM2，结合或招募配体对应的氨基酸序列是ETFSDLWKLL(P53B)(SEQ ID NO.56)、TSFAEYWNLLSP(PMI)(SEQ ID NO.59)、LTFEHYWAQLTS(PDI)(SEQ ID NO.60)、TNWYANLEKLLR(DPMI-α)(SEQ ID NO.61)、TAWYANFEKLLR(DPMI-β)(SEQ ID NO.62)、DWWPLAFEALLR(DPMI-γ)(SEQ ID NO.63)、CNCKAPETALCARRCQQH(Apamin)(SEQ ID NO.64)或CNCKAPETFLCYWRCLQH(stingin)(SEQ ID NO.65)中的一种或多种，或与其同源性大于60％的序列。
11.根据权利要求10所述的核酸分子，其特征在于，所述同源性大于60％的序列，优选为同源性大于80％的序列；最优选为同源性大于90％的序列。
12.根据权利要求9所述的核酸分子，其特征在于，所述E3泛素酶连接酶的结合或招募配体与乙肝病毒X蛋白的连接包括插入连接、端部直接连接或通过linker连接。
13.一种核酸疫苗，其特征在于，包含：
权利要求1～12任一项所述的核酸分子，以及任选地药学上可接受的辅料或者辅助性成分。
14.根据权利要求13所述的核酸疫苗，其特征在于，所述核酸疫苗为mRNA疫苗；所述辅助性成分为递送所述mRNA的纳米载体；和/或
所述辅料包括选自注射剂缓冲介质、冻干或冷冻保护剂中的至少之一。
15.根据权利要求14所述的核酸疫苗，其特征在于，所述纳米载体包括选自脂质体、纳米粒、微球、阳离子聚合物、纳米乳、胶束、核壳纳米粒和脂质纳米载体中的至少之一。
16.根据权利要求15所述的核酸疫苗，其特征在于，所述纳米载体是采用以下至少一种脂质材料制备而成：
DOTAP、DOTMA、DOTIM、DDA、DC-Chol、CCS、diC14-脒、DOTPA、DOSPA、DTAB、TTAB、CTAB、DORI、DORIE及其衍生物、DPRIE、DSRIE、DMRIE、DOGS、DOSC、LPLL、DODMA、DDAB、Dlin-MC3-DMA、CKK-E12、C12-200、DSPC、DMG-PEG、DOPE、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱和胆固醇。
17.根据权利要求16所述的核酸疫苗，其特征在于，所述脂质材料：mRNA的质量比为(0.5～50)∶1，优选为(2～10)∶1。
18.根据权利要求16或17所述的核酸疫苗，其特征在于，所述mRNA疫苗是采用微流控设备将所述mRNA和脂质材料进行混合自组装形成；或者
所述mRNA疫苗是通过将所述纳米载体与mRNA进行孵育形成的。
19.一种腺病毒载体疫苗，其特征在于，包含：装载有权利要求1～12任一项所述的核酸分子的腺病毒。
20.一种蛋白，其特征在于，所述蛋白是由权利要求1～12任一项所述核酸分子编码形成的。
21.一种蛋白或多肽疫苗，其特征在于，包含：权利要求20所述的蛋白作为抗原成分。
22.根据权利要求21所述的蛋白或多肽疫苗，其特征在于，包含免疫佐剂。
23.根据权利要求22所述的蛋白或多肽疫苗，其特征在于，所述免疫佐剂包括选自弗氏不完全佐剂、完全弗氏佐剂、氢氧化铝佐剂、磷酸铝佐剂、乳佐剂、脂质体佐剂和微生物佐剂中的至少之一。
24.一种载体，其特征在于，携带权利要求1～12任一项所述核酸分子。
25.根据权利要求24所述的载体，其特征在于，所述载体为真核载体或原核载体。
26.根据权利要求24或25所述的载体，其特征在于，所述载体包括选自质粒载体、腺病毒载体、慢病毒载体和腺相关病毒载体中的至少之一。
27.载体疫苗，其特征在于，所述活性成分是通过将权利要求1～12任一项所述的核酸分子装载到权利要求24～26任一项所述的载体得到的。
28.一种药物组合物，其特征在于，包括：
权利要求1～12任一项所述核酸分子、权利要求13～18任一项所述核酸疫苗、权利要求19所述的腺病毒疫苗、权利要求20所述的蛋白、权利要求21～23任一项所述的蛋白或多肽疫苗或权利要求27所述的载体疫苗中的一种或多种。
29.根据权利要求28所述的药物组合物，其特征在于，进一步包括药学上可接受的辅料。
30.权利要求1～12任一项所述核酸分子、权利要求13～18任一项所述核酸疫苗、权利要求19所述的腺病毒疫苗、权利要求20所述的蛋白、权利要求21～23任一项所述的蛋白或多肽疫苗或权利要求27所述的载体疫苗、权利28～29任一项所述的药物组合物在制备预防或治疗肝癌或肝癌并发症的药物中的用途。
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