JP2019510089A - HBsAg及びHBcAgを発現する失活化全組換えハンセヌラ・ポリモルファ細胞によるB型肝炎治療ワクチン - Google Patents
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Abstract
Description
このため、HBVとcccDNAを完全に排除するために、より効果的な新規HBV治療用のB型肝炎ワクチンの開発が期待される。肝移植後の免疫拒絶反応が低い点からも明なように、ヒトの肝臓は免疫寛容器官である。B型肝炎ウイルス(HBV)はヒトの肝臓を感染するため、HBVに対する免疫寛容が肝臓の主な特徴である。HBV免疫寛容逆転は慢性B型肝炎患者(CHB)の免疫治療ワクチンを開発するための立脚点となる。HBV免疫寛容は、肝臓の部分的なanti−HBV免疫応答によりウイルスを効果的に排除できず、持続感染を引き起こすことに反映されているだけでなく、HBVの持続存在により全身免疫系がHBVに対して応答しないことを誘導し、たとえば、HBV寛容期にある患者がHBsAgワクチンに対して応答しないことにも反映されている。これは、現在の治療性ワクチンがCHB患者に対して効かない要因でもある。肝臓により誘導された免疫寛容及びその逆転メカニズムについての研究は、B型肝炎を治療するワクチンを開発するために、理論的根拠を提供している。
2014年に、米国Thomas H.Kingによって、「A Whole Recombinant Yeast−Based Therapeutic Vaccine that is comprised of heat−inactivated, whole recombinant Saccharomyces cerevisiae yeast cells expressing disease− related antigens」が報道されており、失活化、全組換え出芽酵母細胞で疾患関連抗原を発現させることを基礎にする治療性ワクチンである。該研究は、細胞内組換え発現タンパク質を抗原とし、出芽酵母細胞をアジュバントとする治療性ワクチンのプラットフォームを創成している。このプラットフォームでは、番号GS4774のB型肝炎治療性ワクチンがあり、他の発現HBV抗原は融合タンパク質としてのx−s−core抗原である。この酵母ベクターは複数種の抗原が入るMHCクラスIとクラスII抗原提示経路を提供し、強力なCD4+とCD8+細胞反応を刺激して、且つ免疫学的マウスモデルにおける抗原の寛容性を破壊できる。また、該酵母ベクターはインビボで中和されにくいため、繰り返して投与し、長期間の免疫圧力を付与し、慢性細胞内感染、たとえばHCVやHBVを理想的に排除することに好適である。
2003〜2005年に、米国の科学家によって、B型肝炎ウイルスによるチンパンジー感染についての一連の研究結果が報道されている。疾患制御メカニズムは肝細胞核HBVプールの共有結合閉環状DNA(cccDNA)である。IFN−γを発生させるHBV特異的CD8+T、すなわちCTL細胞は大量で肝内に入り、HBVを感染した肝細胞にターゲットするため、cccDNAの排除、肝細胞感染HBV逆転はともに肝臓CD8+T細胞により生産するIFN−γの取り込みなどに関連する。これら結果から分かるように、cccDNAの排除は、細胞免疫反応によって媒介される二段階の過程であり、ステップ1として、細胞を損傷せずに90%以上のcccDNA分子プールを減少させることで、HBV弛緩環状デオキシリボ核酸の前駆体を排除する。ステップ2として、この過程において破損されて感染された肝細胞を増加させて、免疫逆転をトリガーさせる。
2014年に、中国科技大学の曽筑天博士によって、水動力法でHBVを持続的にキャリアするマウスを構築してHBV慢性感染者の免疫寛容状態をシミュレートしたところ、IL−12前処理及びIL−12とHBsAg VLPワクチンとの同時注射との併用療法を見出し、IL−12によるワクチン療法と呼び、HBV全身的免疫寛容を効果的に逆転して、さらにHBVを排除できることが報道されている。HBVマウスにIL−12によるワクチン療法を施した後、リンパ節内の濾胞様ヘルパーT細胞(Tfh)及び胚中心B細胞(GC B)はいずれも著しく増幅し、これに応じて、脾臓細胞におけるHBsAg特異的IgG生成細胞も著しく増加し、大部分のマウスでは、治療後期に、血清に防御抗体anti−HBsが発生し、また、T細胞のインビトロでのHBsAg刺激に対する増殖能力も、IL−12とワクチンとの併用治療を受けた後に、著しく回復することが見られた。以上の結果から明らかなように、HBV寛容マウスは、IL−12併用治療過程において、外部からのHBsAgワクチンに対する応答が回復され、それによりHBVが誘導した全身性免疫寛容が逆転されることを示す。先行技術文献によれば、より高い治療効果を有するB型肝炎治療ワクチンを提供することは、従来技術において解決すべき課題となっている。
HBsAg及びHBcAgを発現する失活化全組換えハンセヌラ・ポリモルファ細胞によるB型肝炎治療ワクチンであって、組換えハンセヌラ・ポリモルファ細胞内で発現させるHBsAg及びHBcAgを抗原とし、19個のHBsAg特異的CTLエピトープ及び19個のHBcAg特異的CTLエピトープを含有し、熱失活化全組換えハンセヌラ・ポリモルファ細胞をアジュバントとすることを特徴とするB型肝炎治療ワクチンを提供する。
前記B型肝炎治療ワクチンにおいて、前記組換えハンセヌラ・ポリモルファが発現するHBsAgはadwサブタイプであり、前記組換えハンセヌラ・ポリモルファが発現するHBsAgのDNA配列はSEQ ID NO:1に示され、前記組換えハンセヌラ・ポリモルファが発現するHBsAgのアミノ酸配列はSEQ ID NO:2に示されることを特徴とする。
前記B型肝炎治療ワクチンにおいて、前記組換えハンセヌラ・ポリモルファが発現するHBcAgのDNA配列はSEQ ID NO:3 に示され、前記組換えハンセヌラ・ポリモルファが発現するHBcAgのアミノ酸配列はSEQ ID NO:4に示されることを特徴とする。
前記B型肝炎治療ワクチンにおいて、前記組換えハンセヌラ・ポリモルファが発現するHBsAgはウイルス様粒子構造であり、HBsAgをハンセヌラ・ポリモルファ脂質に挿入してなり、前記HBsAgにおける14個のシステインのうち9〜12個はジスルフィド結合を形成し、前記組換えハンセヌラ・ポリモルファが発現するHBcAgはウイルス様粒子構造であることを特徴とする。
前記B型肝炎治療ワクチンにおいて、失活化組換えハンセヌラ・ポリモルファの失活化条件は、失活化温度が52℃〜56℃、失活化時間が1時間〜3時間であることを特徴とする。
前記B型肝炎治療ワクチンにおいて、前記組換えハンセヌラ・ポリモルファが発現するHBsAgはVLQAGFFLL、PFVQWFVGL、FLLTRILTI、WYWGPSLYSI、SLNFLGGSPV、FLGGSPVCL、LYSIVSPF、LYSIVSPFI、PFIPLLPIF、LLLCLIFLL、LLCLIFLLV、LLDYQGMLPV、LVLLDYQGML、VLLDYQGML、WLSLLVPFV、LLVPFVQWFV、GLSPTVWLSA、SIVSPFIPLL、LLPIFFCLWVの合計19個のCTLエピトープを含有することを特徴とする。
前記B型肝炎治療ワクチンにおいて、前記組換えハンセヌラ・ポリモルファが発現するHBcAgはSFLPSDFF、FLPSDFFPSI、DFFPSIRDLL、FFPSIRDLL、SYVNVNMGL、SYVNVNMGLKI、YVNVNMG、YVNVNMGLK、WFHISCLTF、CLTFGRETV、VLEYLVSFGV、EYLVSFGVW、EYLVSFGVWI、AYRPPNAPI、AYRPPNAPIL、APILSTLPE、ILSTLPETTV、STLPETTVVRR、RGRSPRRRTPの合計19個のCTLエピトープを含有することを特徴とする。
前記B型肝炎治療ワクチンにおいて、前記B型肝炎治療ワクチンの剤型は、プレフィルド注射液剤、注射液剤又は凍結乾燥粉末注射剤から選ばれることを特徴とする。
前記B型肝炎治療ワクチンにおいて、HBsAg原液又はアルミアジュバントHBsAgのうちの1種をさらに含むことを特徴とする。
本発明は、SEQ ID NO:1に示されるDNA配列を含む組換えハンセヌラ・ポリモルファをさらに提供する。好ましくは、前記組換えハンセヌラ・ポリモルファのゲノムにSEQ ID NO:1に示されるDNA配列が組み込まれている。
本発明は、SEQ ID NO:3に示されるDNA配列を含む組換えハンセヌラ・ポリモルファをさらに提供する。好ましくは、前記組換えハンセヌラ・ポリモルファのゲノムにSEQ ID NO:3に示されるDNA配列が組み込まれている。
以上のいずれか1つの組換えハンセヌラ・ポリモルファの宿主であるハンセヌラ・ポリモルファ細胞株はHU−11であり、保蔵番号がCGMCC No.1218であり、前記宿主であるハンセヌラ・ポリモルファのオロチジン−5−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子が破壊されたDNA配列は、SEQ ID NO:5に示される。
同時に、HBcAgを生産可能な組換えハンセヌラ・ポリモルファの失活化細胞とHBsAgを生産可能な組換えハンセヌラ・ポリモルファの失活化細胞とを配合し、使用されているHBcAg(高免疫反応活性)の好ましいコード遺伝子は、C2遺伝子型、サブタイプという二つの代表配列AF100309.1と比較したところ、59−69位にあるILCWGELMNLAの合計11個のアミノ酸が欠失されている。低温電子顕微鏡による画像再構成技術によってHBcAg粒子構造を確定したところ、HBcAg二量体がそれぞれ4本のαヘリックスを含み、すなわち各HBcAgサブユニットが2つの長いαヘリックスで二量体インターフェースを形成し、そのうち、51〜78位のアミノ酸に位置する長いαヘリックスは、両端が50位と79位にある保存的Proにより制限されることを示している。二量体の内部に埋め込まれるため、CTLエピトープがない。αヘリックスはいわゆる3.6ヘリックスであり、それにおける各アミノ酸が100°回転し、3.6個のアミノ酸が360°回転し、元の51〜78位にある合計18個のアミノ酸が5回回転したαヘリックスを形成し、59〜69位にあるILCWGELMNLAの合計11個のアミノ酸が欠失された後、残りの7個のアミノ酸が2回回転したαヘリックスを形成する。HBcAg二量体インターフェースを形成する他方の長いαヘリックスは、82〜110位に位置するノット状αヘリックスであり、111位で終わり、Glyが変化しない。従って、本特許では、2つの長いαヘリックスで二量体インターフェースを形成することをほぼ変化させず、上記11個のアミノ酸が欠失されたHBcAgは、組換えハンセヌラ・ポリモルファ細胞においてもウイルス様粒子(VLP)として組み立てることができ、その熱安定性も維持できる。免疫反応の検出結果から明らかなように、上記アミノ酸を欠失した組換えハンセヌラ・ポリモルファHBcAgエンジニアリング菌株(HC−40−25、172個のアミノ酸)と、全長アミノ酸の組換えハンセヌラ・ポリモルファHBcAgエンジニアリング菌株(183個のアミノ酸)HC−43とを比較したところ、前者の免疫反応原性は後者の3倍以上である。本発明は、CTLエピトープ、発現配列及び組換えハンセヌラ・ポリモルファエンジニアリング菌株を最適化させる上で、組換えハンセヌラ・ポリモルファ細胞の失活化プロセスを最適化させ、ワクチンの治療効果及び安全性が確保される。
ハンセヌラ・ポリモルファ発現系は2つの主要素子を含む。
(1)外来遺伝子の効率的な発現を開始させるためのベクターシステム(プラスミド);(2)特定のスクリーニングマーカーを有する宿主細胞。
相同配列によって媒介される相同組み込みによってオロチジン−5−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(HURA3)が破壊された組換えハンセヌラ・ポリモルファ株HU−11(CGMCC No.1218)を構築する。該菌株は、中国国内及び国外で使用されている突然変異誘発により生じた従来の栄養要求性宿主菌株に比べて、遺伝的安定性が高く、突然変異復帰率が低いという特徴を有し、遺伝的形質転換及び組換え菌株のスクリーニングを容易にするとともに、野生型菌株の生理学的および生化学的特徴を保持し、組換え菌株の培養や外因性タンパク質の効率的な発現に有利し、高い工業応用価値がある。ハンセヌラ・ポリモルファ遺伝子が破壊された宿主菌HU11株のURA3遺伝子のDNAシーケンシング結果から明らかなように、遺伝子が破壊された結果、31位の塩基後に、GAAGTの5個の塩基が挿入されている。GAAGTの5個の塩基の挿入によりフレームシフト突然変異が発生する。フレームシフト突然変異により11位後の254個のコドンはすべて置換される。GAAGTの5個の塩基は同時に復帰突然変異を発生する確率が極めて小さく、実験によっても宿主菌HU11株の復帰突然変異率がゼロであることを確認した。このような「0」復帰突然変異率を有する宿主菌は、形質転換やスクリーニングに特に有利である。上記遺伝子ノックアウト技術によって構築されたURA3−栄養要求性宿主細胞株HU−11(CGMCC No.1218)については本特許権者は発明特許CN1651570Aとして出願した。宿主ハンセヌラ・ポリモルファ菌HU−11のオロチジン−5−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(HURA3)が破壊されたDNA配列はSEQ ID NO :5である。
本発明に係る組換えハンセヌラ・ポリモルファでは、B型肝炎表面抗原(HBsAg)を発現するDNA配列は、HBsAg adw2サブタイプに基づいて設計されるものであり、SEQ ID NO:1に示される。前記HBsAgのアミノ酸配列はSEQ ID NO:2である。
本発明に係る組換えハンセヌラ・ポリモルファでは、B型肝炎コア抗原(HBcAg)を発現するDNA配列はSEQ ID NO:3に示され、前記HBcAgのアミノ酸配列はSEQ ID NO :4である。
SEQ ID NO:1に示される配列に基づいてヌクレオチド配列(以下、略称HBsAg adw2遺伝子)を合成し、HBsAg adw2遺伝子プラスミドを含むグリセロール菌として構築し、シーケンシングして正確なプラスミドをEcoRI/BamHIで二重酵素消化させ、酵素消化産物からゲル抽出して、701bpの目的断片DNAを回収する。
酵素消化し、同定して正確なプラスミドpHMPT−02をEcoRI/BamHIで二重酵素消化させ、ゲル抽出して回収したベクターDNAを連結して、ハンセヌラ・ポリモルファの細胞内プラスミドpMPT−HBS−adwを得て、プラスミドpMPT−HBS−adwをE.coliCompetent Cell JM109(Code No.D9052)に熱形質転換して、平板にコーティングして菌体を一晩培養する。形質転換平板から単一コロニーを選択して、プラスミドDNAを抽出した後、EcoRI/BamHIで二重酵素消化させ、酵素消化結果から、すべて陽性クローンであることが分かった。シーケンシングした結果、プラスミドpMPT−HBS−adwの結果は正確である。
プラスミドpMPT−HBS−adwと同様な構築方法により、SEQ ID NO:3に示される配列に基づくプラスミドpMPT−HBCを構築する。pMPT−HBCプラスミドの物理マップは図2に示される。
組換えハンセヌラ・ポリモルファB型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)エンジニアリング菌株を構築するには、出願人が開発した細胞エレクトロポレーション技術を用いて、振幅1500V、容量22μf、時間定数3〜5msのRCパルスで1回電気穿孔し、pMPT−HBS−adwプラスミドを用いて、URA3−遺伝子をノックアウトしたHU−11株(CGMCC No.1218)のハンセヌラ・ポリモルファ細胞を形質転換する。MD選択培養用平皿から成長した単一コロニーの形質転換体を選択して、MD液体培地に移した後、連続継代培養し、adw2サブタイプHBsAg遺伝子及び対応した調節要素をマルチコピーにして、宿主であるハンセヌラ・ポリモルファ細胞の染色体に異種組み込む。千株余りの形質転換体の単一コロニーについて下記3つのステップのスクリーニングを行う。
(1)形質転換体の単一コロニーが大きく、細胞の成長速度が高いクローン株はマルチコピーの確率が高い。
(2)PCR技術によってHBsAg遺伝子と単一コピー数MOX(メタノールオキシダーゼ)遺伝子の電気泳動バンドの明るさを比較することによって、HBsAg遺伝子のコピー数を半定量的に決定する。
(3)メタノールで誘導して振盪フラスコ培養を72時間行った形質転換体の細胞が破砕した後に放出したHBsAgの発現レベルを検出する。
primer forward:5 ‘−TCAAAAGCGGTATGTCCTTCCACGT−’3
primer reverse:5 ‘−TACTGCTGCCAGTGCACGGTG−’3
エンジニアリング菌のHBsAg遺伝子の増幅産物の大きさは約800bp、ハンセヌラ・ポリモルファの単一コピー遺伝子のMOX遺伝子の増幅産物の大きさは約2000bpである。最終スクリーニングして得られた組換えハンセヌラ・ポリモルファのB型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)エンジニアリング菌株の番号はHS604−5である。
プラスミドpMPT−HBCを用いて、組換えハンセヌラ・ポリモルファHBsAg adw2サブタイプエンジニアリング菌株と同様な構築方法によって、構築してスクリーニングしたエンジニアリング菌株のPCR増幅産物の電気泳動写真は図3に示され、図3中、1はMarkerである。最終組換えハンセヌラ・ポリモルファHBcAgエンジニアリング菌株の番号はHBC−40−25である。
天壇生物社より提供したadw2サブタイプHBsAgB型肝炎表面抗原の凍結乾燥標準品10μgを希釈液で溶解して、1024ng/mL、512ng/mL、256ng/mL、128ng/mL、64ng/mL、32ng/mL、16ng/mL、8ng/mL、4ng/mL、2ng/mL、0ng/mL(希釈液)の合計11個の標準点に倍数希釈し、ラジオイムノアッセイキットでHBsAg反応を検出する。
組換えハンセヌラ・ポリモルファのエンジニアリング菌株についてパイロット規模発酵を行い、87時間発酵した後、10 OD600nm1mLをサンプリングし、ガラスビーズで細胞(細胞破砕率65%)を破砕した後、サンプルを200倍希釈して、標準品とともにラジオイムノアッセイキット反応に用い、γ−カウンターで自動的に作成したフィッティング曲線から得られるHBsAg抗原の発現量は126.9(ng/mL)である。それにより組換えハンセヌラ・ポリモルファの細胞内HBsAg抗原の発現量を算出する。
126.96(ng/mL)×200÷10×4.0×107×65%/mL=9.8μg/108細胞
同じ方法で組換えハンセヌラ・ポリモルファのHBcAgエンジニアリング菌株の発酵液の細胞内HBcAgVLPの発現量を測定したところ、8〜12μg/108細胞である。
近代分子生物学の中心的ルールは以下のとおりである。DNA━>RNA━>アミノ酸一次配列━>タンパク質分子の高次構造━>タンパク質分子機能;符号━>は決定を示す。
異なる遺伝子型のB型肝炎ウイルスコア抗原HBcAgのタンパク質分子は、183又は185個のアミノ酸残基から一次配列を構成し、さらにHBcAgの二次構造、三次構造及び四次構造を決定する。実験から分かるように、分離したB型肝炎ウイルス粒子、感染細胞内、組換え大腸菌及び組換え酵母菌から分離したHBcAgはいずれも、T=3型とT=4型の2種のサイズが異なる粒子として組み立てることができることが見出された。ここで、T=3型は、180個の分子量2lkDの同一タンパク質サブユニットすなわち90個のホモ二量体から構成され、直径が30nmであり、4表面に90個のスパイクを有し、T=4型は、240個の分子量21kDの同一タンパク質サブユニットすなわち120個のホモ二量体から構成され、直径が34nmであり、表面に120個のスパイクを有する。
HBC-40-25 HBC-17 HBC-31 HBC-36 HBC-39 HBC-41 HBC-51 35.21 5.83 5.64 5.64 6.34 8.99 5.75
HBC−40−25株の免疫反応原性は、ほかの6個の強陽性株の3倍以上である。
失活化組換えハンセヌラ・ポリモルファの最適な条件を決定するために、下記要件を満たす必要がある。(1)失活化組換えハンセヌラ・ポリモルファの生存率をできるだけ低下させる。(2)全組換えハンセヌラ・ポリモルファ細胞の構造を保持して、酵母細胞内の抗原が漏れないようにする。(3)抗原反応活性を低下させないように組換えハンセヌラ・ポリモルファの細胞内で発現させるHBsAgウイルス様粒子(VLP)とHBcAgウイルス様粒子(VLP)の熱安定性を維持する。失活化組換えハンセヌラ・ポリモルファ細胞におけるHBsAgとHBcAgウイルス様粒子(VLP)の熱安定性は最初に解決すべき問題である。このために、異なる温度(50℃、52℃、54℃、56℃及び58℃)、及び異なる時間(1h、2h及び3h)の組換えHBsAgとHBcAgハンセヌラ・ポリモルファの失活化試験を16群設計して、20℃を対照群とする。検出したところ、失活化温度、時間の上昇に伴い、細胞壁外層の溶解度が高まり、細胞の破砕率が増大し、細胞内HBsAgVLP抗原反応性については52℃、1hで倍増するピークが現われ、HBcAg抗原反応性については56℃、1hで倍増するピークが現れた。細胞外HBsAgとHBcAg抗原反応性は、失活化試験のすべての温度と時間の範囲で極めて低く、このことから、細胞内VLPが外部へ漏れず、失活化組換えハンセヌラ・ポリモルファ細胞の完全性が保持されていることが分かる。失活化細胞の生存率は、56℃、3hの条件で50,000分の1に低下する。それにより、失活化組換えハンセヌラ・ポリモルファ細胞の条件を最適化させるために根拠を提供している。
B型肝炎ウイルスによるチンパンジーの感染についての一連の研究結果から明らかなように、HBsAg特異的CTL T細胞は、HBVを感染した肝細胞にターゲットしてIFN−γを放出し、ステップ1として、肝細胞を損傷せずに90%以上のcccDNA分子プールを減少させ、ステップ2として、この過程において損傷されて感染された肝細胞を増加させ、免疫逆転をトリガーさせる。CTLエピトープの実験概要、予測及び特許発明などの3つの文献報道によれば、HBVカプシド抗原(Pre−S1−Pre−S2−HBsAg)の重複しないCTLエピトープは合計で23個である。本願では、HBsAgアミノ酸配列には、VLQAGFFLL、PFVQWFVGL、FLLTRILTI、WYWGPSLYSI、SLNFLGGSPV、FLGGSPVCL、LYSIVSPF、LYSIVSPFI、PFIPLLPIF、LLLCLIFLL、LLCLIFLLV、LLDYQGMLPV、LVLLDYQGML、VLLDYQGML、WLSLLVPFV、LLVPFVQWFV、GLSPTVWLSA、SIVSPFIPLL、LLPIFFCLWVの合計19個のCTLエピトープが含まれている。本願では、HBcAgアミノ酸配列には、SFLPSDFF、FLPSDFFPSI、DFFPSIRDLL、FFPSIRDLL、SYVNVNMGL、SYVNVNMGLKI、YVNVNMG、YVNVNMGLK、WFHISCLTF、CLTFGRETV、VLEYLVSFGV、EYLVSFGVW、EYLVSFGVWI、AYRPPNAPI、AYRPPNAPIL、APILSTLPE、ILSTLPETTV、STLPETTVVRR、RGRSPRRRTPの合計19個のCTLエピトープが含まれている。
実験から分かるように、一般的に分注した組換えB型肝炎治療ワクチン(酵母)プレフィルド注射液剤は、37℃で45日間放置した後の熱安定性実験からわかるように、ワクチンのインビトロ相対効力(RP)がいずれも要求を満たし、一般的に分注したB型肝炎治療ワクチンは、同一保存条件では、RPがいずれも要求を満たせない。プレフィルドシリンジに分注した組換えB型肝炎治療ワクチン(酵母)は、短時間内でコールドチェーン輸送に依存せずに、保存したり使用したりすることが可能である。
プレフィルドシリンジは、1ケースごとに1針あり、使用しやすく、使用方法やコツが容易に把握でき、使い捨て型注射器であるため、繰り返した使用が不能である。ワクチンを接種するときに、別途で注射器を準備する必要がないため、ガラス注射器を使用する場合、完全に消毒しないことによる伝染病の感染又は蔓延や不適な針先端部による接種効果への影響を避け、使い捨て型注射器の繰り返した使用のリスクを避ける。
プレフィルドシリンジに分注したB型肝炎治療ワクチンの完全な接種は、良好な総合的費用便益比を有する。
以下、実施例にて本発明についてさらに説明するが、下記実施例は説明するためのものであり、限定するものではなく、本発明の保護範囲は下記実施例により制限されない。
前記SEQ ID NO:1基づいて、pMPT−HBS−adwプラスミド(すなわち前記SEQ ID NO:1を含む発現ベクター)を構築した。プラスミドpMPT−HBS−adwの構築プロセスは以下の工程を含む。
設計したSEQ ID NO:1配列に基づいてHBsAg adw2遺伝子を合成し、HBsAg adw2遺伝子プラスミドを含むグリセロール菌を構築し、MC407B−16と命名した。
シーケンシングして正確なMC407B−16プラスミドをEcoRI/BamHIで二重酵素消化させ、酵素消化産物についてTaKaRa PCR Fragment Recovery Kit(Code No.D301)でゲル抽出して、701bpの目的断片DNAを回収して、Inset DNA6とした。
酵素消化し、同定して正確なプラスミドpHMPT−02をEcoRI/BamHIで二重酵素消化させ、ゲル抽出して回収して、ベクターDNAを得て、Vector DNA6とした。
MC407A+B+C+D−77プラスミドをそれぞれプライマーRV−M、M13−47、MC407P1、MC407P2、MC407P3、MC407P4、MC407P5、MC407P6、MC407P7、MC407P8、MC407P9、MC407BF11、MC407BR11でシーケンシングした結果、プラスミドpMPT−HBS−adwの結果は正確であることが分かった。
同じ方法によって、前記SEQ ID NO:3に基づいて、pMPT−HBCプラスミドを構築した。
組換えハンセヌラ・ポリモルファHBsAgエンジニアリング菌株の構築
組換えハンセヌラ・ポリモルファB型肝炎治療ワクチンの形質転換とスクリーニングを示す図から分かるように、組換えハンセヌラ・ポリモルファの形質転換とスクリーニングの過程は図5に示されるとおりである。
具体的に以下を含む。
1)細胞エレクトロポレーション法を用いて、pMPT−HBS−adwプラスミドで、宿主細胞であるURA3−栄養要求性ハンセヌラ・ポリモルファ細胞株HU−11(CGMCC No.1218)を形質転換した。選択培地(MD液体培地)で平皿により培養した。MD選択培養用平皿から成長した単一コロニー形質転換体を選択して、MD液体培地に移した後、連続継代培養し、adw2サブタイプHBsAg遺伝子及び対応した調節要素をマルチコピーにして、宿主であるハンセヌラ・ポリモルファ細胞の染色体に異種組み込んだ。
2)菌株スクリーニングは以下のステップを含む。
(1)ウラシル原栄養形質転換体の単一コロニーを選択する。
菌体の成長速度が高いコロニーを用いて、PCR技術によってHBsAg遺伝子のバンドの明るさを検出した後、コピー数の多いコロニーを選択して、選択培地を用いて単一コロニーを振盪フラスコ培養し、20〜400世代連続継代培養した。
(2)マルチコピーの異種組み込み形質転換クローン株をスクリーニングする。
ステップ(1)で継代培養した後、メタノールで72時間誘導培養し、ラジオイムノアッセイ(Radio immunoassay or radioimmunoassay、RIA)で形質転換体の細胞が破砕した後に放出するHBsAgの発現レベルを測定した。
(3)遊離プラスミドを除去した高コピー・高発現クローン株をスクリーニングする。
ステップ(2)でスクリーニングしたクローン株を、YPD完全培地で48時間培養した後、選択培養用平皿に移してクローン化培養を行い、定量的PCRによってHBsAg遺伝子のコピー数を検出し、RIAによってHBsAg発現レベルを検出した。
(4)ステップ(3)の検出結果に基づいて、遺伝的安定性に優れた組換えハンセヌラ・ポリモルファHBsAgエンジニアリング菌の初代菌株を選択した。
同じ方法によって、組換えハンセヌラ・ポリモルファHBcAgエンジニアリング菌株を構築してスクリーニングした。
主なプロセス過程及び操作ポイントは以下のとおりである
1)シード培地200mlで貯蔵菌種を解凍して、培地に接種し、2つの0.5L振盪フラスコに等分して、31℃で22時間培養して一次シードとした。
2)シード培地1600mlを用いて一次シードを二次シード培地に移して、6個の1L振盪フラスコに等分して、31℃で20時間培養して二次シードとした。
3)12L発酵培地をpH5.5に調整して30L発酵缶に投入し、二次シードを接種した後、30〜31℃で、グリセリン、メタノールの2種の炭素源で、成長、抑制解除及び誘導の3つの時期を経て、合計85〜96時間培養して、誘導を停止して2−3時間後、細胞を収穫した。凍結細胞をホモジネートした。
(1)成長時期における流加操作は、溶存酸素が有意に低下して、基礎培地が消費されたときに実施し始め、且つ、基礎培地の消費量の増加に伴い徐々に流加速度を向上させ、溶存酸素が戻る前の2〜3時間に流加を完成する。
(2)成長時期の後期に、溶存酸素の上昇をモニタリングして、溶存酸素の最低値を記録し、溶存酸素が70〜80%まで戻ったときに、流加を開始させて、抑制解除時期に入る。
(3)抑制解除時期の後期に、流加終了後、溶存酸素が戻り始める。溶存酸素が70〜80%まで戻ったときに、メタノールを流加して溶液を誘導し、メタノール濃度を3〜5‰に制御し、メタノール検出流加コントローラで流加速度を制御する。
細胞収穫時のメタノール残留を減少させるように、発酵終了前の2〜3時間に、メタノール流加を停止する。
1.塩化カルシウム溶液の調製
CaCl2 11.33gを正確に秤量して、洗浄した三角フラスコに投入し、適量の脱イオン水を加えて溶解した後、200mlに定容した。
下記試薬を正確に秤量した。
110℃で30分間高圧蒸気滅菌を行うことで、500ml三角フラスコを2個、1000ml三角フラスコを6個、100mlと500mlのメスシリンダーをそれぞれ1つ充填前に滅菌した。
クリーンベンチにおいて、無菌操作により滅菌したグリセリン水溶液をそれぞれ100ml秤取して、それぞれ滅菌後の2個の500ml三角フラスコに投入して、塩化カルシウム溶液1ml、微量元素溶液1ml、ビタミン溶液0.5ml、痕跡元素溶液0.25mlをそれぞれ加えて、加えた溶液を均一に振とうさせた。
クリーンベンチにおいて、無菌操作技術により滅菌後のグリセリン水溶液1600mlを秤取して、滅菌後の2000ml三角フラスコに投入して、塩化カルシウム溶液16ml、微量元素溶液16ml、ビタミン溶液8ml、痕跡元素溶液4mlをそれぞれ加えた。
試薬として、NH4H2PO4175g、MgSO4・7H2O 40g、KCl 44g、NaCl 4.4gを正確に秤量して、2000mlの脱イオン水に溶解した。
500ml小ビーカーにグリセリン520gを秤量して、消泡剤10mlを加えて、オンラインで滅菌し、次に、塩化カルシウム溶液175ml、微量元素溶液175ml、ビタミン溶液88ml、痕跡元素溶液44mlを加えた。
1000ml三角フラスコに、NH4H2PO4 87g、グリセリン260gを秤取して、脱イオン水を500ml加え、被覆した流加管路に加えて、110℃で30分間滅菌した。
5000ml三角フラスコに、グリセリン1800gを秤取して、脱イオン水660mlを加え、包まれた流加管路に加えて、110℃で30分間滅菌し、冷却後、無菌操作により濾過除菌した塩溶液540mlを加えた。
1000ml三角フラスコに、グリセリン400mlを秤取して、包まれた流加管路に加え、110℃で30分間滅菌し、冷却後、無菌操作によりメタノール1600mlを加えた。
HBsAgとHBcAgについては、同じ精製プロセスを用い、HBsAgを例にして、プロセスは以下のとおりである。
実施例3で得られた組換えハンセヌラ・ポリモルファHBsAgエンジニアリング菌株の発酵液について、細胞を収穫して細胞を洗浄し、詳細な精製ステップについては、以下の文献を参照すればよい。李津、孔艷.組換えB型肝炎治療ワクチンの生産プロセス。李津、兪詠霆、董徳詳編集:生物製薬装置及び分離精製技術.第1版.北京:化学工業出版社、2003:348−349.参照。さらに、上記収穫した細胞をホモジナイザーで破砕して、HBsAgを放出させ、0.22μmの微多孔ろ過器で濾過して、細胞破片を除去し、次に、300Kの限外ろ過器で限外ろ過して小分子不純物を除去し、シリカゲル吸着処理法によりHBsAgを抽出し、最後に、ブチルアガロース疎水性クロマトグラフィー方法で精製した。
失活化組換えハンセヌラ・ポリモルファ細胞の最適な条件試験
失活化組換えハンセヌラ・ポリモルファの最適な条件を決定するのに、以下の要求を満たす必要がある。
(1)失活化組換えハンセヌラ・ポリモルファの生存率をできるだけ低下させ、たとえば、5%より小さくする。
(2)完全な細胞構造を保持し、多価の失活化組換えハンセヌラ・ポリモルファのアジュバント活性作用を発揮させる。
(3)抗原性を低下させないように、組換えハンセヌラ・ポリモルファ細胞内で発現させたウイルス様粒子(VLP)の完全性を保持する。
以上の3つの点は失活化組換えハンセヌラ・ポリモルファにHBsAgとHBcAgを発現するプロセスの主な条件であり、ワクチンの製造及び検証規則を制定するために根拠を提供している。失活化組換えハンセヌラ・ポリモルファ細胞におけるウイルス様粒子(VLP)の熱安定性は最初に解決すべき問題である。
組換えハンセヌラ・ポリモルファHBsAgエンジニアリング菌(HS604−5株)細胞の培養は、発酵又は振盪フラスコ誘導培養を経た後、細胞を遠心法でリン酸塩緩衝液(PBS)において3回洗浄して、沈殿したハンセヌラ・ポリモルファを、体積を計算したPBSに懸濁させた。細胞をOD600nmでカウントして、PBSで10 OD600nm/ミリリットルに希釈し、試験管ごとに2ミリリットルとし、試験群ごとに、破砕試験管と非破砕試験管の2本を設置し、16個の試験群では、合計32本の細胞サンプル試験管を必要とした。
設定温度の水浴に入れて、所定時間にかけて組換えハンセヌラ・ポリモルファを失活化させた。
失活化組換えハンセヌラ・ポリモルファを、クロラムフェニコール含有完全培地を入れた寒天皿において37℃で3日間培養し、生存率をカウントした。
熱失活化ハンセヌラ・ポリモルファを4℃で貯蔵して、さらなる使用に供する。
1、斉小秋ら、全国人口のウイルス性B型肝炎の血清学的疫学調査の報告、2011年4月第1版、人民衛生出版社。
2、Bowen DG et.al,Intrahepatic immunity: a tale of two sites? Bowen DG et.al, Trends Immunol.2005 ,26(10):512−7.
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9、曽筑天、肝臓誘導全身性免疫寛容及びその逆転研究、中国科学技術大学博士論文、2014。
10、出願人:復旦大学、B型肝炎ウイルスの持続感染を抑制するワクチン、2009年、出願公布番号:CN102038948.A。
11、Florian K Bihl et.al, Simultaneous assessment of cytotoxic T lymphocyte responses against multiple viral infections by combined usage of optimal epitope matrices, anti− CD3 mAb T−cell expansion and”RecycleSpot”; Journal of Translational Medicine 2005,3:20 1−19。
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16、発明者 呉玉章ら等;治療用B型肝炎治療ワクチン又は薬品を生産するための免疫原及びその製造方法と用途;開示番号:CN1483736A。
17、▲とう▼小燕、ヒト全ゲノムB型肝炎ウイルス遺伝子(亜)型間組換え体についての研究、重慶医科大学博士論文、2012年5月。
Claims (16)
- HBsAg及びHBcAgを発現する失活化全組換えハンセヌラ・ポリモルファ細胞によるB型肝炎治療ワクチンであって、
組換えハンセヌラ・ポリモルファ細胞内で発現するHBsAg及びHBcAgを抗原とし、16〜21個のHBsAg特異的CTLエピトープ及び15〜21個のHBcAg特異的CTLエピトープを含有し、失活化全組換えハンセヌラ・ポリモルファ細胞をアジュバントとすることを特徴とするB型肝炎治療ワクチン。 - 前記組換えハンセヌラ・ポリモルファが発現するHBsAgはadwサブタイプであり、前記組換えハンセヌラ・ポリモルファが発現するHBsAgのDNA配列はSEQ ID NO:1に示されることを特徴とする請求項1に記載のB型肝炎治療ワクチン。
- 前記組換えハンセヌラ・ポリモルファが発現するHBsAgのアミノ酸配列はSEQ ID NO:2に示されることを特徴とする請求項2に記載のB型肝炎治療ワクチン。
- 前記組換えハンセヌラ・ポリモルファが発現するHBcAgのDNA配列はSEQ ID NO:3に示されることを特徴とする請求項1に記載のB型肝炎治療ワクチン。
- 前記組換えハンセヌラ・ポリモルファが発現するHBcAgのアミノ酸配列はSEQ ID NO:4に示されることを特徴とする請求項4に記載のB型肝炎治療ワクチン。
- 前記組換えハンセヌラ・ポリモルファが発現するHBsAgはウイルス様粒子構造で、HBsAgをハンセヌラ・ポリモルファ脂質に挿入してなり、前記HBsAgにおける14個のシステインのうち9〜12個はジスルフィド結合を形成し、前記組換えハンセヌラ・ポリモルファが発現するHBcAgはウイルス様粒子構造であることを特徴とする請求項1に記載のB型肝炎治療ワクチン。
- 失活化組換えハンセヌラ・ポリモルファの失活化条件は、失活化温度が52℃〜56℃、失活化時間が1時間〜3時間であることを特徴とする請求項1に記載のB型肝炎治療ワクチン。
- 前記組換えハンセヌラ・ポリモルファが発現するHBsAgはVLQAGFFLL、PFVQWFVGL、FLLTRILTI、WYWGPSLYSI、SLNFLGGSPV、FLGGSPVCL、LYSIVSPF、LYSIVSPFI、PFIPLLPIF、LLLCLIFLL、LLCLIFLLV、LLDYQGMLPV、LVLLDYQGML、VLLDYQGML、WLSLLVPFV、LLVPFVQWFV、GLSPTVWLSA、SIVSPFIPLL、LLPIFFCLWVの合計19個のCTLエピトープを含有することを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載のB型肝炎治療ワクチン。
- 前記組換えハンセヌラ・ポリモルファが発現するHBcAgはSFLPSDFF、FLPSDFFPSI、DFFPSIRDLL、FFPSIRDLL、SYVNVNMGL、SYVNVNMGLKI、YVNVNMG、YVNVNMGLK、WFHISCLTF、CLTFGRETV、VLEYLVSFGV、EYLVSFGVW、EYLVSFGVWI、AYRPPNAPI、AYRPPNAPIL、APILSTLPE、ILSTLPETTV、STLPETTVVRR、RGRSPRRRTPの合計19個のCTLエピトープを含有することを特徴とする請求項1、4、5のいずれか1項に記載のB型肝炎治療ワクチン。
- 前記組換えハンセヌラ・ポリモルファの宿主であるハンセヌラ・ポリモルファ細胞株は、HU−11であり、保蔵番号がCGMCC No.1218であり、前記宿主であるハンセヌラ・ポリモルファのオロチジン−5−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子が破壊されたDNA配列がSEQ ID NO:5に示されることを特徴とする請求項1に記載のB型肝炎治療ワクチン。
- 剤型が、プレフィルド注射液剤、注射液剤又は凍結乾燥粉末注射剤から選ばれることを特徴とする請求項1に記載のB型肝炎治療ワクチン。
- HBsAg原液又はアルミアジュバントHBsAgのうちの1種をさらに含むことを特徴とする請求項1に記載のB型肝炎治療ワクチン。
- SEQ ID NO:1に示されるDNA配列を含むことを特徴とする組換えハンセヌラ・ポリモルファ。
- ゲノムにSEQ ID NO:1に示されるDNA配列が組み込まれていることを特徴とする請求項13に記載の組換えハンセヌラ・ポリモルファ。
- SEQ ID NO:3に示されるDNA配列を含むことを特徴とする組換えハンセヌラ・ポリモルファ。
- ゲノムにSEQ ID NO:3に示されるDNA配列が組み込まれていることを特徴とする請求項10に記載の組換えハンセヌラ・ポリモルファ。
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