KR100370341B1

KR100370341B1 - B형간염백신

Info

Publication number: KR100370341B1
Application number: KR1019960704148A
Authority: KR
Inventors: 피터 카레이이아니스; 하워드 크리스토퍼 토마스
Original assignee: 임피리얼 컬리지 오브 사이언스 테크놀로지 앤드 메디신
Priority date: 1994-02-02
Filing date: 1995-02-02
Publication date: 2003-04-11
Also published as: CN1057774C; US5856084A; EP0741745A1; SG49631A1; ES2258767T3; DE69534617D1; EP0741745B1; ATE310014T1; AU1542695A; JP3812949B2; WO1995021189A1; MX9603182A; NZ278937A; CA2182375A1; CN1143373A; DE69534617T2; GB9401987D0; JPH09508284A; PL315784A1; AU693154B2

Abstract

B형 간염 바이러스 표면 항원의 항원성을 나타내는 변종과 소위 "회피 돌연변이체" HBsAg 단백질 또는 그 단편이 기술되는데, 여기에서 돌연변이체 단백질 또는 그 단편(mHBsAg)은 야생형 HBsAg 서열 위치(122) 하단에 적어도 2개의 아미노산이 삽입된 변성 'a' 결정인자를 포함한다. mHBsAg를 포함하는 백신, 항-mHBsAg 항체의 진단학적인 시험관내 검출용 키트 및 항-mHBsAg 항체를 포함하는 항체 제제가 제공된다.

Description

B형 간염 백신

본 발명은 B형 간염 바이러스 항원에 특이성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 DNA분자에 관한 것이다.

더 상세하게 본 발명은 여러 가지 B형 간염 바이러스에 대해 사람의 항체생성을 자극시키는 백신 조성물에 관한 것이다.

다른 항원형 B형 간염 비리온(virions) 게놈의 클론은 본 기술분야에서 잘 알려져 있다 (밀러(Miller)등). B형 간염 비리온으로서 감염된 환자로부터 격리가능한 데인(Dane) 입자는 약 42nm의 직경을 갖는다. 각각은 B형 간염 표면 항원(HBsAg), 캡시드(HBcAg), 내인성 폴리머라제와 DNA 게놈을 포함하는 엔벨로프(envelope)로 구성된다. 제 3폴리펩티드인 'e' 항원(HBeAg)은 B형 간염 바이러스로 만들어져서 혈청안에서 용해된 형태로 발견된다.

B형 간염 바이러스(HBV) 감염은 심각하고 만연된 문제이지만 질량 면역법에 사용되는 백신은 현재 널리 입수가능하다. HBV에 대해 상업적으로 이용 가능한 백신은 천연 또는 재조합 형태로 B형 간염 표면 항원(HBsAg)을 포함한다. 진정한(또는 야생) B형 간염 바이러스 표면 항원은 P24와 그것의 글리코실화된 유도체 GP28로 알려진 두 단백질로 이루어진 약 22nm의 입자로 감염된 개체의 플라스마로부터 회수될 수 있는데 두 단백질 모두 S단백질 코딩 서열 또는 HBV S-유전자로 알려진 HBV 게놈상의 226 아미노산 코딩 서열에 의해 암호화된다. (티오라이스(Tiollais)등(1985)). HBsAg를 암호화하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 완전한 아미노산 서열은 발렌수엘라(Valenzuela)등의Nature280 815, (1979)에 기술되었다. 뉴클레오티드와 아미노산 위치를 한정하기 위해 티오라이드 등에 의해 사용된 넘버링 시스템이 여기에 사용되었다.

백신 생산을 인해 S. cerevisiae에서 HBsAg 의 발현이 가능하도록 발현 벡터 상의 효모 프로모터의 조절하에서 HBV S-유전자 코딩서열을 삽입하는 것은Develop.Biol.Stondard54 125(1983) 에서 하포드(Harford)등,Nature298 347(1982)에서 발렌수엘라 (Valenzuela)등 및,J. Med. Virol25, 123(1988)에서 비터(Bitter)등(1988)에의해 기술되었다.Pichia Pastoris에서의 발현은Hansenula polymorpha(유럽공고번호 0299108)에서의 발현과 같이 그레그(Gregg) 등의Biotechology5 479 (1987)에 기술되었다 (유럽특허공고 번호 0226846참조).

백신은 유럽특허 공고번호 제 0278940호에 기술된 바와 같이 HBsAg 단백질을 포함하는 하이브리드 면역유전성 입자로부터 제조되었다. 이러한 면역유전성 입자는 예를들면 HBV 게놈상의 HBV-S 유전자의 바로 앞에 선행하는, 코딩서열에 의해 암호화된, 여기서 pre-S 코드 서열로 언급되는 HBsAg 전구 단백질의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 보통 pre-S 코딩서열은 163 아미노산을 코드화하고(ay HBV 아형의 경우) pre-S1 코딩서열과 pre-S2 코딩서열을 포함한다. 후자는 55 아미노산을 코드화하고 S단백질 코딩서열 바로앞에 선행한다. (유럽공고번호 EP-A-278940).

HBV-DNA의 표면 항원(S 항원)오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 세부분, pre-S1, pre-S2와 S로 나누어진다. 이것은 큰, 중간 그리고 주 단백질로 개념되는 HBV의 세 엔벨로프를 암호화한다. 주 단백질 HBsAg는 226 아미노산으로 구성되고 S-유전자에 의해 암호화된다. (티올라이스 등(l981), 티올라이스 등(1987) 및 라우(Lau)등), 3 엔벨로프 단백질 모두는 HBsAg 항원 부위를 함유하는데 HBsAg에 대한 일반적인 면역 측정법에 의해서 쉽게 검출된다. 이러한 측정법은 HBV감염을 진단하고 세계적으로 혈액공급자를 스크리닝하는데 광범위하게 사용된다. HBSAg 반응성은 'a' 결정인자로 정의된 아미노산 124-147로부터 친수성 부분의 구조적 형태에 좌우된다 (애쉬톤 릭카르트(Ashton-Rickardt)와 브라운 (Brown)등). 이것은 모든 HBV아형과 공통적이고 이것에 대한 항체는 어떤 아형으로 재감염되는 것을 보호한다.

높은 스트린젠트 콘트롤(stringent control)하에서 HBV 프로브와 교잡하는 HBV-DNA 서열은 혈청 HBsAg에 음성인 피검자의 간, 혈청과 혈액 단핵 세포에서 나타났다 (브레코트(Brechot) 등(1985)과 티어(Thier) 등). 돗트 블롯 교잡법 또는 폴리머라제 쇄 반응(PCR)을 사용하는 다른 실험실로부터의 최근 결과는 HBsAg 음성환자의 혈청에 HBV DNA 서열의 존재를 확인하고 있다. PCR기술의 발전은 많은 환자들에게서 매우 낮은 수준의 HBV 복제도 검출 가능하고 바이러스의 분리물에서 유전성 변종을 확인하는 많은 분리물의 서열화를 이루게 했다 (칼먼(Carman) 등 (1990) ; 브레코트(Brechot)등 (1991) ; 블룸(Blum) 등). HBV가 풍토병인 타이완과 사르디니아(Sardinia)에서는 HBsAg 음성인 건강한 혈액 공여자의 1.7%-0.3%가 그들의 혈청에서 돗트 블롯 교잡법에 의해 검출 가능한 HBV DNA를 가졌다. (라이(Lai)등 (1989)과 선(Sun) 등), 중국 본토에서 항-HB-양성인 사람에서 PCR을 사용한 분자유행병학 조사는 검출 불가능한 HBsAg를 갖는 HBV 캐리어의 존재를 나타내고 있는데 이는 중국 총 인구의 3%이다 (루오(Luo)등).

HBV의 항원성 아형은 혈청학상으로 정의되고 게놈 엔코딩 HBsAg의 부분에서 단일 염기 변화에 의해 발생되는 것으로 알려져 있다 (오카모토(Okamoto)등), 그러나, 현재 알려진 모든 항원성 아형은 HBsAg의 아미노산 124-147로 이루어진 'a' 결정인자를 포함한다. 'a' 결정인자에 대한 항체는 모든 아형에 대한 보호를 제공한다. 147위치의 시스테인과 142위치의 프롤린이 'a' 결정인자의 총 항원성을 나타내는데 중요하다는 것이 시험관내에서 돌연변이 유발에 의해 나타났다 (애쉬톤 릭카르트 등).

또한, 하워드 토마스(Howard Thomas)와 월리엄 칼먼(William Carman)은 WO91/l4703에서 HBV감염된 엄마에게서 태어난, 백신 주사한 아이에게서의 다양한 HBsAg 단편의 변종을 상세히 설명했다. 서열화는 HBsAg의 'a' 결정인자에서 145위치에 글리신예서 아르기닌으로 아미노산 변화를 가져오는 뉴클레오티드 587위치에 구아노신에서 아데노신으로 일부 돌연변이를 나타냈다. (칼멘(Carman) 등 (1990)참조). 유사한 HBV 돌연변이체만 활성적(백신) 또는 수동적(초면역성 글로블린)으로 유도된 체액성 면역 압력하의 숙주에서 복제가 일어난다고 보고되었다. (오까모토(Okamoto 등(1992) 과 맥마혼(McHahon) 등). 그러나, 이러한 환자들 중 일부의 혈청에서 통상적인 면역측정법에 의해 검출된 HBsAg와 항-HBs(백신 유도된)의 계속적인 존재는 돌연변이가 항원성의 완전한 손실을 가져오지는 않는다는 것을 암시한다. (칼먼 등(1990), 오까모토 등(1992)과 맥마흔 등).

임상적 및 유행병학적 관점에서는 표준평가에서, HBsAg 반응없이 피검자로부터 HBV의 분자특성을 조사하는 것이 더욱 중요하다. 항-HBs 뿐만 아니라 HBsAg 와 HBV-DNA에 양성이었던 일본인 환자로부터의 서열화 결과는 Pre-S2 부분의 아미노산 9-22가 삭제되는 반면에 pre-S2의 3 과 8위치에 있는 아미노산과 HBs의 'a' 결정인자 제 1루프의 126, 131과 133이 치환되었다는 것을 나타냈다.(모리야마(Moriyama) 등). 또다른 분리물로부터 추론된 아미노산 서열의 분석은 주 HBs, 단백질의 3, 53과 210위치에서 치환을 나타냈는데, 이들 모두는 공통의 'a' 결정인자 외부에 있어서 혈청에서 HBsAg의 부재를 확실시 설명할수 없다 (리앙(Liang) 등).

지난 10년 동안, B형 간염 바이러스의 몇 몇 추정상의 변종 또는 돌연변이체가 기술되어 왔다. 예를들면, 맥마혼 등은 항-HBsAg 모노클로날 항체로 처리된 간 이식환자에서 HBsAg의 도메인(DNA 서열분석에서 추출된)을 결합하는 모노클로날 세포 항체에서의 글리신을 아르기닌으로 치환하는 것을 설명했다 (B형 간염 바이러스의 분자 생물학에 관한Cold Spring Harbor Symposium, 1989년 9월).

칼먼 등에 의한 조사와 특허출원 WO94/26904에서는 2개의 특이 아미노산 즉 아스파라긴과 트레오닌이 HBsAg 서열의 122위치에 삽입된 변성 'a' 결정인자를 갖는 B형 간염 바이러스 돌연변이체가 기술되었다. 또한, 야생형 아르기닌이 글리신으로 치환되는, 145위치에서의 돌연변이가 아미노산 서열 리스트에 상세히 설명되었다. 또 다른 보고서에서, 2개의 등록된 B형 간염 백신 중 하나로 면역한 후 특이적 항체(항-HBs)의 존재에도 불구하고 바이러스성 복제가 나타나고 순환하는 B형 간염 표면 항원을 갖는 아이와 성인이 발견되었다 (자네티(Zanetti) 등). 모노클로날 세포 항체로의 HBsAg의 분석은 순환성 항원이 'a' 결정인자를 운반 하지 않거나 또는 이 결정인자가 방해받는 것으로 나타났다. B형 간염 바이러스 변종의 발생은 감염 유행 지역의 면역화와 연관된 유행병학적 압박감 때문에 나타난 것으로 결론 되었다. 그러나, 그 변종은 더 이상 특징화되지 않았다.

자네티 등의 연구로부터 현재 이용 가능한 B형 간염 백신의 큰 단점은 그들은 최소한 감염되기 쉬운 면역성 기질을 가진 숙주에서 중성화 면역성과 무관하게 돌연변이된 복제 감염성 바이러스인 '회피 돌연변이체'를 야기시킬 수 있다는 것임이 명백하다. 이러한 변종 바이러스는 명백하게 질병을 일으키는 능력을 가지며 전염성으로 나타나기도 한다. 따라서 변종 바이러스는 보통의 HBsAg에 기초한 백신에 의해 생성된 항체에 의해 효과적으로 중성화되지 않기 때문에 심각한 면역 문제를 발생시킨다. 다른 돌연변이가 HBV에서 설명되지만 변경된 항원성의 면에서 그들의 심각성은 불명백하다 (모리야마(Moriyama 등과 라이 등(1990)).

중국에서 HBV 감염의 유행지역에서 PCR을 사용한 최근 연구는 원인불명의 경화증, 만성 활성간염(CAH) 또는 만성 지속성 간염(CPH)인 HBsAg 음성 환자들 중 30-40%는 혈청 또는 간 조직에 복제 HBV-DNA를 갖는다고 제시하고 있다. (쟝(Zhang)등). 이러한 연구는 HBV 변종이 혈청에서 HBsAg가 검출불가능한 중국 주민에게도 존재한다는 것을 보여준다. 놀랍게도, 추정상 돌연변이체는 분자수준으로도 특징지워지지 않았다.

중국인 환자(즉 검출가능한 HBsAg가 없는 환자)로 부터의 분리물은 'a' 결정인자 바로 앞의 122 와 124 코돈 사이에 추가의 아미노산이 삽입되는 삽입 돌연변이체이다. 서열 변형은 알려진 HBV아형에서는 사전에 설명되지 않았었고 같은 지역으로부터 30명의 HBsAg 양성 중국인 환자에게서도 나타나지 않았다. 삽입이 발생한 부분은 HBsAg의 중요한 에피토프 영역이라는 것을 안 것은 흥미롭다. 삽입된 서열은 아형 결정인자(d)를 결정하는 코돈 122의 하단과 'a' 결정인자의 상반에서 발견된다. 코돈 122 위치 전후의 모든 뉴클레오티드와 아미노산서열은 야생형 HBV에서 상세히 설명된 것과 같다 (제6,7도). 어떤 이론에 연관성이 없음에도 본 발명자들은 이러한 돌변이가 'a' 결정인자와 'd' 아형의 에피토프에 영향을 주는 형태적 변화를 일으킨다고 믿는다. 하나의 있음직한 가능성은 아미노산의 삽입은 'a' 결정인자 두 루프 중 공간 조직화에 영향을 미침으로서 에피토프를 변화시킨다는 것이다. 또다른 가능성은 모노클로날항체에 의해 정의된(워터스(Waters)등 'a' 결정인자의 제 1루프는 보다 상단의 아미노산(기존에 생각했던 것보다)을 포함 할 수 있다는 것이다. 본 발명자들은 이러한 아미노산이 사전에 제시된 (워터스 등과 애쉬톤-리카르트(Ashton-Rickardt) 등) l24보다 122의 상단에 이황화물 브리지에 의해 형성된다고 제시한다. 삽입된 아미노산은 14에서 16 또는 17 아미노산까지 루프의 전장을 증가시키고 따라서 루프의 형태를 바꾸고 중성화 항체 결합을 방해한다.

본 발명에서, 본 발명자들은 혈청이 돗트 블롯 교잡법에 의해 HBV-DNA양성을 나타내지만 상업적인 폴리클로날 항체 계통의 면역측정법에 의해서는 HBsAg음성을 나타내는 중국인 환자로부터 분리된 HBV의 새로운 변종 또는 '회피 돌연변이체'를 기술한다. 또한, 본 발명은 이러한 새로 밝혀진 돌연변이체에 비효과적인 기존 HBV 백신과 연관된 단점을 극복 또는 적어도 완화시킨다.

본 발명은 HBV 엔벨로프 부분의 122위치 바로 하단에 적어도 2개의 아미노산 삽입을 갖는 HBV의 새로 확인된 돌연변이체의 특성화를 제공한다. 본 발명은 시험 샘플에서 돌연변이체 HBV의 존재를 측정하는 방법과 이러한 방법에 유용한 시제를 제공한다. 본 발명의 모든 목적은 HBsAg 게놈이 뉴클레오티드 519 하단의 적어도 6개의 뉴클레오티드의 삽입과 일치하는 HBsAg 서열의 122위치 하단에 적어도 두 개의 아미노산이 삽입된 'a'결정인자의 변성을 제공한다.

돌연변이체 HBV로부터 유도된 핵산 서열 또는 이들의 일부는 시험 샘플에서 돌연변이체 HBV의 존재를 측정하기 위한 프로브로서 유용하다. 서열은 또한 이러한 돌연변이체 HBV의 게놈(들)내에서 암호화된 돌연변이체 HBV항원의 이용가능한 폴리펩티드 서열을 만들고 표준 또는 시약의 과실 진단 시험과 백신 성분으로서 유용한 폴리펩타이드를 생성할 수 있게 한다. 이러한 폴리펩티드 서열내에 함유된 에피토프에 대향하여 있는 모노클로날 및 폴리클로날 항체는 항 바이러스성 제제의 스크리닝을 위한 치료제 뿐만 아니라 진단 시험, 및 핵산서열이 유도되는 돌연변이체 HBV의 분리에 유용하다.

돌연변이체 HBsAg는 원한다면 pre-S 서열을 포함할 수 있는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명에 따른 변종 HBsAg 단백질 또는 그 단편은 하기에서 "mHBsAg"로 약칭된다.

이러한 mHBsAg 돌연변이체는 '자연발생' 형태로 있는 것이 아니라 혈액생성물이 없는, 합성 또는 고도로 정제된 물질이다.

바람직하게는 본 발명에 설명된 이러한 돌연변이체는 전장 HBsAg 과 일치하고 122위치의 하단에 적어도 2개의 아미노산 잔기가 삽입 된 것을 제외하고는 야생형 HBsAg와 일치한다.

HBsAg 돌연변이체는 고도로 정제된 형태, 예를들면 75%이상의 순도가 바람직하고 90% 이상은 보다 바람직하며 95-100%순도가 가장 바람직하다.

본 발명의 또 다른 목적은 적당한 캐리어와 조합된, 면역 보호성 양 만큼의 이러한 HBsAg "회피 돌연변이체"를 포함하는 백신 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 아래에 설명된다.

본 발명의 mHBsAg와 백신은 바이러스성 HBsAg의 'a' 결정인자의 바로 위의 상단 부분(엔벨로프 부분)이 변성된, 상기에 정의된 '회피 돌연변이체'의 발생에 의해 나타난 문제를 극복하기 위해 사용된다. 특히, 본 발명의 백신은 122위치 하단에 적어도 2개의 아미노산이 삽입된 HBsAg아미노산 서열에서 변성된 HBV 엔벨로프 부분을 갖는 것으로 본 명세서에서 정의된 변종 HBV에 대한 보호 및 이것의 발생 또는 전염을 방지하는데 사용될 수 있는 잇점을 가진다.

따라서 상기 변종 HBV감염과 관련된 질병증상에 대하여 인간을 보호하는 방법이 제공되는데 이 방법은 본 발명에 따른 백신을 안전하고 효과적인 양으로 인간에게 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 또다른 목적은 치료 특히 예방에 사용하기 위한 mHBsAg를 제공하는 것이다.본 발명은 또한 상기 변종 HBV 감염과 관련된 질병 증상에 대해서 인간을 보호하기 위한 백신 조성물의 제조에 있어서의 mHBsAg의 용도를 제공한다.

기존 변종 HBV바이러스에 대해서 인간을 면역시키는데 사용될 때 백신에서 mHBsAg 서열은 정상적으로 조화를 이루고 또는 변종 HBV 바이러스의 mHBsAg 서열과 조화를 이루어 항원적으로 일치하게 된다.

바람직하게 본 발명의 mHBsAg에서 122위치 이후에 삽입된 아미노산 잔기는 그것이 6개 이상의 뉴클레오티드 삽입에 의해 유도될 수 있도록 한다. 여분의 아미노산을 암호화하는 삽입된 뉴클레오티드는 정상적인 HBsAg에 있는 코돈 123의 3개 뉴클레오티드 중 어떤것에도 영향을 미칠 수 있다.

이론상, 엔벨로프 단백질의 친수성을 변화시키는 어떤 돌연변이는 항원성과 변종 HBV의 출현을 바꿀 수 있다. 야생형 친수성과 이 지역내 돌연변이체의 친수성은 아주 다르다. 여기에 설명된 친수성의 감소는 종종 항원성의 손실과 서로 관계된다. 제 1루프에서 돌연변이체의 증가된 소수성은 엔벨로프의 지질에 있는 주 단백질의 변경된 단백질을 야기하므로서 형태상으로 큰 영향을 미친다.

본 발명의 바람직한 실시예에서 정상적인 HBsAg의 122위치 이후의 잔기는 'a' 결정인자의 친수성을 감소시킬 수 있다.

본 발명의 또다른 바람직한 실시예에서 mHBsAg는 122위치 하단에 적어도 2개 아미노산 잔기의 삽입을 제외하면 정상적인(야생) HBsAg S-단백질과 동일하다.

본 발명의 특히 바람직한 실시예에서 122위치 하단의 변성은 각각 아르기닌과 이후에 알라닌의 삽입이다. 또한, 아르기닌, 글리신 및 알라닌이 그 순서대로 l22위치 하단에 삽입되는 것이 바람직하다.

본 발명의 각 목적의 바람직한 특징은 필요한 변경을 가하여 서로의 목적과같다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 설명될 것이다. 실시예들은 첨부도면을 참고로 설명된다.

제 1도는 1번 환자로부터의 연속적인 혈청 아미노트랜스퍼라제(ALT) 수준을 나타낸 것이다. 정상적인 수준은 40 iμ/L 이하이다. 혈청 HBV 마커는 적정시간에의 다양한 흔적으로 측정된다. 1992년 8월에 HBV DNA는 PCR에 의해 발견되었지만 HBsAg와 다른 HBV마커는 검출되지 않았다.

제 2도는 혈청 B형 간염 바이러스 마커뿐만아니라 2번 환자로부터 연속적인 혈청 ALT수준을 나타낸 것이다. 약어로 w는 야생형(wild type) ; m은 돌연변이체(mutant)를 나타낸다.

제 3도는 표면 유전자 오픈 리딩 프레임(open reading frame), PCR과 서열화 프라이머의 위치 및 오버래핑(overlapping) 폴리머라제 오픈 리딩 프레임(P ORF)의 개략도 이다. 색칠된 원은 개시와 종료 코돈을 나타내는데 반해서 빗금친 부분은 'a' 결정인자(522-593 위치)와 관련된 삽입 돌연변이 다발범위(hot spot)를 나타낸다. 뉴클레오티드 넘버링은 본 분리물이 EcoRI 부위를 소유하지 않기 때문에 알려진 HBV DNA서열에서와 같이 가정의 EcoRI 부위에서부터 된다.

제 4도는 PCR 생성물의 직접적인 서열화를 따른 야생형(중앙)과 비교했을때 의 분리물 1과2(좌우)에 뉴클레오티드 삽입을 나타낸 방사선 사진이다. 화살표는 삽입점을 나타낸다.

제 5도는 야생형(adw)과 비교했을때의 분리물 1과2의 뉴클레오티드와 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 삽입된 서열은 밑줄이 그어져 있다.

제 6도는 mHBsAg 분리물 1의 완전한 뉴클레오티드 서열을 타나낸 것이다. 상부 서열은 표면 유전자의 서열화 돌연변이체 HBsAg 분리물의 'a' 결정인자를 나타내는 반면에 하부 서열은 야생형 서열을 나타낸다 (---)은 아미노산 삽입점을 나타낸다.

제 7도는 mHBsAg 분리물 2의 완전한 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이다. 상부 서열은 표면 유전자의 서열과 돌연변이체 HBsAg 분리물의 'a' 결정인자를 나타내는 반면에 아래 서열은 야생형 서열을 타나낸다. (---)은 아

점을 나타낸다

표 1은 폴리머라제 쇄 및 서열화 반응에 사용되는 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 나타낸 것이다.

표 2는 대조군으로 사용된 adw 야생형을 갖는 모노클로날 항체에 대한 1번 및 2번 환자로부터의 혈청 HBsAg의 양성/음성 결합 비율을 나타낸 것이다.

표 3은 사전에 알려진 야생형 서열(adw) 및 야생형과 같은 부분으로 부터의 중국인의 분리물과 비교했을 때의 돌연변이체 S유전자의 뉴클레오티드와 아미노산 서열의 동족관계를 나타낸 것이다.

HBV 돌연변이는 염기의 연속을 특징으로 하는 서열의 특정 지역에서 보다 일반적으로 발견된다. 연구경우에서 삽입은 4개 아데닌의 연속과 관련된다. 이 지역은 외관상 중국인 HBsAg 음성 HBV 캐리어로부터의 어떤 분리물에 삽입하기 위한 "돌연변이 다발범위"이다.

본 발명의 추가적인 목적에서는 mHBsAg 와 그들로부터 얻어지는 백신 조성물을 제조하는 방법이 제공된다.

mHBsAg는 펩티드 합성 또는 더욱 바람직하게는 재조합 DNA기술에 의하든지 간에 합성적으로 얻어지는 것이 바람직하다.

재조합 DNA분자 및 서열의 구축, 조작 및 검증은 본 기술분야에 잘 알려져있다. HBsAg의 HBV S 단백질을 변성시켜 본 발명의 mHBsAg를 얻기 위해 122위치 하단에 코돈 CGG와 GCA 또는 122위치 하단에 각각 아르기닌과 알라닌을 암호화하는 다른 세코돈 조합물을 삽입하는 것이 바람직하다. 선택적으로, 코돈 CAC, GGG 또는 GCG 또는 아르기닌, 글리신 및 알라닌을 각각 암호화하는 다른 세 코돈 조합물이 뉴클레오티드 122와 124위치 사이에 삽입될 수 있다.

서열의 적당한 변화를 이루기 위해서 몇몇 방법이 이용가능하다. 하나의 적당한 방법은 포스파이트 또는 포르포라미디트 화학물질에 의한, 바이러스 또는 이스트 코돈 빈도를 사용한 바람직한 코딩 서열의 완전히 새로운 합성이다.

DNA합성물은 상업적인 측면에서 몇몇 회사로부터 입수가능하다. 그러한 유전자 합성의 예는 여기에 참고로 도입된 DNA7:57l에서, 헤이덴(Hayden)과 만텍키(Mandecki) (l988)에 의해 기술되었다.

두 번째 방법은 HBV게놈을 이미 함유하는 벡터로부터의 적절한 제한 단편을 단일 스트랜드 벡터 상에서 클론한 후 봇트스타인(Botstein)과 쇼틀(Shortle)의Science229 1193(1982)에 설명된 바와같이 부위 특이적인 시험관내 돌연변이 유발을 이루는 것이다. pBR322상에서 클론된 ay 아형의 HBV게놈을 함유하는 재조합 플라스미드 pRIT10601을 포함하는E. ColiK12 균주 C600의 배양물은 부다페스트 조약에 의거하여 수탁번호 ATCC 39132로 어메리칸 타입 컬츄어 콜렉션 (American Type Culture Collection)에 l982년 6월 2일에 기탁되었다. 226 아미노산 HBsAg 단백질을 특이화하는 S-유전자를 코딩하는 서열 또는 Pre S 폴리펩티드를 코딩하는 보다 긴 서열은 표준 재조합 DNA기술에 의해 이러한 클론으로부터 절제될 수 있다.

하나의 적당한 제한 단편은 pRIT10601의 S-유전자 코딩부분으로부터 575bp XbaI-AccI단편이다. 시험관내 돌연변이 유발에 유용한 벡터 시스템도 상업적으로 이용가능하다. 그렇게 얻어진 돌연변이된 유전자 단편은 S-유전자에 재삽입된다.

세 번째 방법은 호(Ho) 등의 조정 77 51, (1989)에 설명된 바와같이 폴리머라제 쇄반응(PCR) 기술을 사용하여 바람직한 돌연변이 변화를 이루는 것이다.

각각의 경우에서 mHBsAg 코딩 서열은 어떤 적당한 숙주에서 적당한 프로모터의 조절하에 발현될 수도 있다.

mHBsAg를 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 발현 벡터는 신규한 것으로서 본 발명의 다른 목적을 이룬다. 상기 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 역시 본 발명 또는 다른 목적을 형성한다.

바람직한 형태로S. cerevisiae, Pichia pastoris또는Hansenula polymorpha가 숙주로 사용될 수도 있고 발현은 이스트 TDH3 프로모터(글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 유전자, 발렌수엘라(Valenzuela)등 1982 : 비터(Bitter)등 1988참조) 또는 PHO5(미야노하라 (Miyanohara) 등 1983), MOX, FMDH (EP-A-0299108 참조)와 AOX (EP-A-0226846 참조) 와 같은 이스트 프로모터의 조절하에서 이루어진다.

형질 전환된 숙주는 통상적인 수단에 의해 배양 또는 발효되어 mHBsAg가 추출되고 정제된다. 이스트 세포로부터 HBsAg에 의해 배양 또는 발효될 수 있다. 이스트 세포로부터 HBsAg 의 정제는 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 미합중국 특허 제 4,649,192 ; 4,638,294 ; 4,694,074 또는 4,738,926호 중 어떤것에 따라 수행될 수 있다. 본 발명의 mHBsAg 정제 역시 동일한 방법으로 수행된다.

mHBsAg를 포함하는 백신은 통상적인 기술에 의해 제조되는데 완충된 생리적 식염수에 알루미늄 하이드록사이드와 알루미늄 포스페이트를 포함하는 알려진 다양한 보조제 중 어떤 것이 혼합 또는 흡수된, 면역보호양 만큼의 mHBsAg을 함유한다 ; "면역호보적"이란 용어는 충분한 mHBsAg가 심각한 부작용없이 감염제에 대해서 보호하기 위해 충분한 보호항체 또는 세포 매개 면역 응답성을 유도하도록 투여된다는 것을 의미한다. 투여되는 mHBsAg 양은 백신이 보조제인지에 따라 좌우되는데 일반적으로 1-1000mcg 사이의 단백질을 함유한다. 1-200mcg 단백질이 되는 것이 바람직하고 또는 5-40mcg 단백질이 사용되는 것은 더욱 바람직하다. 투여되는 복용량과 투여 횟수는 환자의 항체역가 및 다른 반응의 관찰을 포함하는 표준 복용량 범위 연구로 결정될 수 있다.

mHBsAg 는 일반적인 HBsAg 나 백신 조성용 Pre S1 또는 Pre S2 폴리펩티드의 전부, 일부 또는 일부들을 포함하는 균질 또는 복합 HBsAg입자와 같은 다른 HBsAg 와 혼합될 수도 있다. 또한, 다른 유기체의 단백질로부터 에피토프를 운반하는 하이브리드 HBsAg 입자 및 이가 또는 다가 백신을 형성하는 다른 면역원과 혼합될 수도 있다. 백신 제조는 미합중국 메릴랜드 볼티모어에 소재하는 University Park Press 에서 볼러(Voller)등 (1987)에 의해 편집된 "Vaccines"에 기술되어 있다.

mHBsAg 는 변종 HBV 바이러스 감염 등에 대한 검출 키트에서 면역학적 시약으로 포함되기에 유용하다. 이것은 또한 공지의 방법에 의해 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 상승시키는데 사용될 수 있는데, 모노클로날 항체 중 어떤 것은 변종 항원에 특이적일 수 있고 정상적인 HBsAg를 인식할 수 없다.

본 발명의 또다른 실시예에서 돌연변이체 HBV항체와 그 복합체 그리고 폴리펩티드의 돌연변이체 HBV 특이적 에피토프에 대하여 상승된 항체를 함유하는 혈청과 면역학적으로 반응하는 폴리펩티드는 생물학적 시험 샘플에서 돌연변이체 HBV 항체의 존재 또는 바이러스 및/또는 바이러스성 항원의 존재를 검출하기 위한 면역 측정법에 유용하다.

이러한 면역 측정의 설계는 다양한데 본 기술분야에서 알려져 있다 ; 이러한 것들은 여기에 기술되었다. 면역측정법은 어떤 클론 함유 돌연변이체 HBV 핵산서열 또는 이러한 클론의 돌연변이체 HBV 핵산 서열로부터 유도된 복합 핵산서열 또는 이러한 클론의 핵산서열이 유도되는 돌연변이체 HBV게놈으로부터 유도되는 폴리펩티드와 같은 하나의 바이러스성 항원을 이용한다. 또는, 면역 측정법은 이러한 원으로부터 유도된 바이러스성 항원의 조합물을 사용할 수도 있다. 예를들어, 같은 바이러스성 항원에 대향하는 모노클로날 항체 또는 다른 바이러스성 항원에 대향하는 폴리클로날 항체를 사용할 수도 있다. 평가는 경쟁, 직접반응 또는 샌드위치형 평가에 기초한 것들을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 신호 생성 화합물 및 그들의 라벨로서의 라벨을 이용하는 평가의 예가 여기에 기술되었다. 또한 신호는 미합중국 특허출원 제 608,849 ; 070,647 ; 418,981 ; 및 687,785 호에 기술된 것과 같이 비오틴과 아비딘 효소라벨 또는 비오틴 항-비오틴 시스템에 의해 증폭될 수도 있다. 돌연변이체 HBV의 면역 우성부분으로부터의 에피토프를 포함하는 재조합 폴리펩티드는 감염된 개체의 생물학적 시험 샘플에서 바이러스성 항체를 검출하는데 유용할 수 있다. 항체는 비급성 감염과 급성 감염을 구별하는데 유용할 수 있다고 기대된다. 적당한 시약을 포함하는, 면역진단용으로 적절한 킷트가 적당한 용기에 돌연변이체 HBV 에피토프 또는 돌연변이체 HBV 에피토프에 대향하는 항체를 함유하는 본 발명의 플리펩티드를 포함하는 적당한 물질을, 평가의 수행을 위해 요구되는 잔여 시약 및 물질 그리고 적절한 평가안내서와 함께 팩케이징 하므로서 구성된다.

따라서, 본 발명의 바람직한 목적에서는 생물학적 배지에서의 항-mHBsAg항체 및 특히 백신화에 이은 중화 항체의 진단학적 시험관내 검출을 위한 킷트가 제공되는데 이 킷트는,

a) 본 명세서애 정의된 바와같은 mHBsAg ; 및

b) 항원-항체 반응을 검출하는데 적합한 수단을 포함하는 것으로 특징된다.

추가적인 목적으로 본 발명은 사람의 B형 간염 감염의 진단, 예방 또는 치료에 사용하기 위한 항-mHBsAg 항체를 포함하는 항체제제를 제공한다. 또한 B형 간염 감염을 예방 또는 치료하기 위해 효과적인 양의 그러한 항-mHBsAg항체로 인간을 치료하기 위한 방법이 제공된다.

이하 본 발명은 하기 실시예에 의해 설명된다.

l번 환자는 non-A, non-B 만성 간염의 6년 병력의 58세 남자이다. l992년 8월 HBV-DNA가 PCR에 의해 HBsAg와 다른 HBV 마커의 부존재하에서 발견되었다 (제 1도). 이 단계에서 환자는 간경화증에 걸렸었다.

2번 환자는 중국 남부 출신의 23세 여자로서 1993년 3월 일상적인 시험에서 약간 상승된 혈청 아미노트랜스퍼라제(ALT) 수준을 가졌고 HBsAg 와 HBeAg에 대해서는 양성, 면역글로블린(immunoglobulin)(Ig)M 과 IgG 항-HBs 모두에 대해서는 음성이었다. 1994년 1월 계속 검사에서 HBV-DNA는 계속 양성이었고 또한 항-HB에는 양성이었지만, HBsAg , HBeAg 와 항-HBs에는 음성이었다(제 2도).

두 환자 모두 C형 간염 바이러스(HCV)와 HCV-RNA에 대하여 음성이었다. 만성 간 질환 또는 간세포 암을 가진 30명의 HBsAg 양성 중국인 환자가 같은 부위에서 연구되었다.

혈청학적 조사

HBsAg, HBsAg, 총 항-HBc, IgM 항-HBs와 항-HBs를 상업적으로 이용가능한 효소 면역 측정법으로 시험했다 (미합중국, 일리노이, 노오쓰 시카고에 소재하는 애보트(Abbot,) 래버러토리즈), HBsAg 와 항-HBS 결과를 영국에서 확인했다.

모노클로날 항체 결합

'a' 결정인자를 결합하는 것으로 알려진 항-HBs 모노클로날 항체 한 패널을 'a' 결정인자 에피토프에서의 보다 특이적인 변화를 한정하는데 사용했다. 폴리스티렌 비드(Northumbria Biologicals, Northumberland, UK)를 항체 RFHBs-1, RFHBs-2와 RFHBs-7로 코팅하고, PH 7.2의 포스페이트 완충염에서 50% 갓출생한 송아지 혈청으로 1:2 희석된 혈청 샘플과 함께 배양했다. 결합된 HBsAg를 'AusRIA II' 키트(Abbott Diagnostics)로부터의¹²⁵I-항-HBs로 검출했는데, RFHBs-l과 RFHBs-2는 아미노산 서열 124-137을 포함하는 고리모양의 펩티드에 결합하고 RFHBs-7은 HBsAg의 아미노산 139-147부터의 고리형 펩티드에 결합한다.

간염마커

HBsAg, HBeAg, 총 항-HBC, IgM 항-HBc와 항-HBs를 효소 면역 측정법으로 시험했다 (North Chicago, IL, Abbott Loboratories).

돗트 블롯 교잡법

HBV-DNA를 웰러(Weller) 등의 J. Med Virol 9 273-280, (1982)에 기술된 방법의 변형을 이용하여 돗트 블롯 교잡법으로 검출했다.

HBV-DNA의 추출, PCR 과 직접서열화

혈청 50㎕를 68℃에서 2시간 동안 200㎕량의 0.5% 소듐 도데실 설페이트, 25mM 소듐 아세데이트, 2.5mM EDTA, 1mg/㎖ 프로테이나제 k (Boehringer Mannheim, Lewes, UK)의 존재하에서 소화시키고 두 페놀-클로로포름 추출을 두 클로로포름 추출에 이어 행한 다음 HBV-DNA를 에탄올로 침전시켰다. 70% 에탄올로 2회 세척후, DNA펠렛을 10㎕ 물에 재현탁시켰다.

추출된 HBV-DNA 5㎕를 PCR 증폭을 위한 템플레이트로 사용했다. 한 셋트의프라이머(adw 아형) 즉, PO5'(5'-TGCGGGTCACCATAT 2818-2833위치) 및 POL3 (5'-AAGGATCCAGTTGGC 1409-1395 위치) (표2)를 pre-S1, Pre-S2와 S유전자를 포함하는 l800bp 단편을 얻는데 사용했다 (제 3도). 또 다른 셋트의 프라이머, 즉, M3 (5'-CTGGGAGGAGTTGGGGGAGGAGATT, 1781-1755위치) 및 3C (5'-CTAACATTGAGATTCCCGAGA, 2460-2439 위치)를 Pre-C 와 C부위를 증폭하는데 사용했다. 같은 혈청샘플을 다른 프리머 세트를 사용하여 중국과 영국에서 독립적으로 분석했다.

PCR 생성물의 직접 서열화를 'fmol' 시퀀싱 키트로 수행했다 (Promega Co, Southampton, England). 서열화 프라이머(표1)를 37℃에서 10분동안 10유니트의 폴리뉴클레오티드 키나제 (Boehringer Mannheim)을 사용하여 10μL 양의 25μCi 32p-아데노신 트리포스파제(Amershan Internatichal, Amersham, UK)로 최종 라벨링했다. 1.5μL의 반응혼합물을 서열화 반응에 직접적으로 사용했다. 90μL의 PCR생성물을 같은 량의 소듐 아세테이트 및 2 배량의 4mol/L 이소프로판올로 실온에서 10분간 침전시키고, 10분동안 원심분리하여 펠렛화 한 후 70% 에탄올로 2번 세척했다. 20μL물에 재현탁시킨 후 DNA 9.5μL를 최종라벨링 된 프라이머와 5 Taq효소 (Promega Co.)를 갖는 반응 완충액에 첨가했다. 디데옥시 뉴클레오티드 말단 서열화를 제조자의 지시에 따라 수행했다. 사이클 서열화는 30라운드 동안 수행했다. 변성, 어닐링, 연장단계는 각각 30초, 30초 그리고 1분이었다.

S 유전자의 클로닝과 서열화

직접서열화 결과는 두 환자로부터의 첫번째 혈청(1993년 2월)이 야생형과 돌연변이체 바이러스 혼합의 증거를 갖는다는 것을 나타냈다. 이 혈청 샘플로 부터의PCR생성물과 2번 환자의 것을 직접적인 서열화 결과를 확인 하기 위해 pUCl9 벡터에서 클론했다. 증폭된 HBV-DNA의 뉴클로오티드 서열을 시쿼나제 DNA 시퀀싱 킷트로 측정했다 (Version 2.0, USB, Cambridge, England).

소수성 플롯(Plot)

야생형 및 변종 바이러스성 분리물로부터의 HBsAg 'a' 결정인자의 아미노산 122-137과 139 또는 140(삽입된 아미노산을 포함)을 각 프로시스(Prosis) 소프트웨어(Pharmacia, St. Albans, England)로 분석했다.

돗트 블롯 교잡법

두 개의 개별적인 경우에 대하여 PCR로 증폭한 후 1번 환자의 혈청에서 HBV-DNA를 검출가능했다. 2번 환자의 경우, 10μg/5μL 의 혈청에서 1993년 3월과 1993년 9월의 돗트 블롯 교잡법에 의해 HBV-DNA가 검출가능했다. 1.0㎍의 HBV-DNA가 2.3×10⁶HBV 게놈에 상당할 경우 이 환자의 혈청은 mL당 약 4.6×10⁷바이러스성 입자를 포함한 것으로 예상되었다. HBsAg는 두번째 샘플이 아닌 첫 번째 샘플에서 검출가능했다. 1994년 1월에는, HBV-DNA를 오직 PCR로만 검출가능으며, HBsAg는 그때까지 검출불가능했다.

모노클로날 항체 결합 연구

l번 환자, 2번 환자 및 대조군(adw)으로 사용된 HBsAg 양성환자에 있어서의 결합연구는 혈청의 HBsAg가 2번 환자의 3 모노클로날 항체 ah두에 결합하여 AusRIA II 키트로부터의 폴리클로날 항-HBs에 의해 검출될 수 있음을 나타냈다(표2).

Pre S-S 유전자와 Pre C/C부위의 시퀀싱.

S유전자는 각각 분리물 1에서는 687bp, 분리물 2에서는 690 그리고 야생형에서는 681bp로 이루어진다. 돌연변이체의 S뉴클레오티드와 아미노산서열을 같은 아형(adw)의 공개된 서열 및, 또한 같은 부위의 HBeAg-양성 캐리어로 부터의 야생형 균주(표3에 도시된)와 비교했다.

서열화 결과는 S유전자에서 삽입를 나타냈다(표4). 삽입된 서열은 분리물 1에서 코돈 122와 123사이의 두개의 추가적인 아미노산(Arg-Ala)을 암호화하고, 분리물 2에서 코돈 123과 124사이의 3개의 추가 아미노산(Arg-Gly-Ala)을 암호화한다 (제 5도). 이러한 삽입은 HBsAg의 'a' 결정인자 바로 전에서 발생한다. 이러한 삽입은 알려진 HBV아형의 공개된 서열에 기술되지 않았고 중국의 같은 지역에 사는 30명의 중국인 HBsAg 양성 환자로부터 얻은 동일 서열에는 없었다.

직접적인 서열결과는 서열을 클로닝함으로써 입증되었다. 2번 환자에서 취한 첫 번째 혈청의 10클론 중 8클론이 상기에 기술된 바와같이 동상(in-phase)의 삽입을 가지며, 그들중 2은 야생형인 반면에 두 번째 및 세 번째 샘플의 l5클론 모두는 변종이었다. 따라서, 2번 환자의 첫 번째 혈청은 야생형과 돌연변이체의 혼합의 증거를 갖는데 이것은 돌연변이체의 단계적인 발생을 나타내고, 이는 이후의 혈청이 우성 종이 된다는 것을 나타낸다. pre-S1, pre-S2 유전자에서 아미노산 삭제 또는 치환은 이전에 기술되지 않았다.

소수성 플롯.

이것은 야생형 'a' 결정인자의 아미노산 122-137에 대하여 -0,48, 분리물1에서의 아미노산 122-139에 대해서는 -0 그리고 분리물2에서의 아미노산 122-140에 대해서는 -0.89의 평균소수성 지수를 부여하는 카이트(Kyte)와 두리틀(Doolittle)의 방법에 의해 수행되었다. 그 결과, 돌연변이체 'a' 결정인자는 야생형 바이러스의 같은 부위보다 더 소수성을 나타냈다.

[표 1]

[표 2]

[표 3]

참고문헌

특허

Claims

야생형 HBV표면 항원(HBsAg)의 항원성에 비해 상이한 항원성을 나타내는 변형된 B형 간염 표면 항원 단백질(mHBsAg)에 있어서, 상기 단백질이 HBsAg서열의 코돈 122위치와 코돈 124 위치 사이에, 아르기닌, 알라닌 및 글리신으로 이루어진 그룹에서 선택된 2 개 이상의 아미노산이 삽입된, 항원적으로 변성된 엔벨로프 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 B형 간염 표면 항원 단백질.
제 1 항에 있어서, 코돈 l22위치와 코돈 124 위치 사이에 삽입된 아미노산 잔기들이 HBV엔벨로프 부위의 친수성을 감소시킬 정도인 것을 특징으로 하는 B형 간염 표면 항원 단백질.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 정상적인 HBsAg의 코돈 122 위치와 코돈 124 위치 사이에 삽입된 코돈이 아르기닌, 알라닌을 순서대로 암호화 하는 것을 특징으로 하는 B형 간염 표면 항원 단백질.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 정상적인 HBsAg의 코돈 122 위치와 코돈 124 위치 사이에 삽입된 코돈이 아르기닌, 글리신 및 알라닌을 순서대로 암호화하는 것을 특징으로 하는 B형 간염 표면 항원 단백질.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 코돈 122위치와 코돈 124 위치사이에 2 개 이상의 아미노산이 삽입된 것을 제외하고는 정상적인 HBsAg S-단백질과 동일한 것을 특징으로 하는 B형 간염 표면 항원 단백질.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 코돈 122위치와 코돈 124 위치 사이의 삽입은 아르기닌과 알라닌 순서로 되는 것을 특징으로 하는 B형 간염 표면 항원 단백질.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 코돈 122위치와 코돈 124 위치 사이의 삽입은 아르기닌, 글리신 및 알라닌의 순서로 되는 것을 특징으로 하는 B형 간염 표면 항원 단백질.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 코돈이 코돈 122 위치와 코돈 123 위치 사이에 삽입되는 것을 특징으로 하는 B 형 간염 표면 항원 단백질.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 코돈이 코돈 123 위치와 코돈 124 위치 사이에 삽입되는 것을 특징으로 하는 B 형 간염 표면 항원 단백질.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, mHBsAg가 Pre-S 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 B형 간염 표면 항원 단백질.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 순도가 75%이상인 것을 특징으로 하는 B형 간염 표면 항원 단백질.
제 1 항 내지 10 항 중 어느한 항에 따른 mHBsAg를 암호화하는 DNA서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제 12 항의 벡터로 형질전환된 것을 특징으로 하는 숙주.
적당한 캐리어 또는 보조제와 혼합된, 제 11 항에 청구된 바와같은 mHBsAg를 효과적인 양만큼 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 1 항 내지 11 항 중 어느 한 항에서와 같은 mHBsAg를 제조하는 방법에 있어서, 제 11 항에 따른 숙주를 적당한 배양배지에서 배양하고 요구되는 정도의 순도로 생성된 mHBsAg를 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 mHBsAg 제조방법.
HBV와 관련된 질병으로부터 인간을 보호하기 위한 백신의 제조에 사용하기 위한 제 1항 내지 11 항 중 어느 한 항에 따른 mHBsAg.
생물학적 배지에서 항-mHBsAg 항체의 진단학적 시험관내 검출을 위한 비트에 있어서,

(a) 제 1항 내지 10항 중 어느 한 항에 따른 mHBsAg ; 및

(b) 항원-항체 반응을 검출하는데 적합한 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
인간에게서 B형 간염 감염의 진단, 예방 또는 치료의 용도로 사용하기 위한, 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 정의된 바와같은 mHBsAg에 대한 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 제제.