AT625U1 - Peptid, welches mit anti-hbsag-antiserum kreuzreaktivität zeigt - Google Patents

Description

AT 000 625 Ul

Die Erfindung bezieht sich auf ein Peptid, welches mit anti-Hepatitis B-Oberflächenantigen (HBsAg) Antiserum Kreuzreaktivität zeigt.

Das Hauptprotein (oder S-Protein) des Hepatitis B-Oberilächenantigens (im folgenden HBsAg genannt) ist 226 Aminosäuren lang und weist eine gruppenspezifische

Determinante, welche auch 'a'-Determinante genannt ist, auf, die allen Subtypen des Hepatitis B-Virus (HBV) gemeinsam ist. Zusätzlich zu dieser gruppenspezifischen Determinante gibt es noch zwei Gruppen von gegenseitig ausschließenden Subtypen spezifischen Determinanten, u.zw. die d- oder y- oder die w- oder r-Determinante, sodaß es vier große Subtypen von Viren gibt, nämlich adw, adr, ayw und ayr. Untersuchungen haben gezeigt, daß eine Immunisierung ausschließlich mit dem Hauptprotein Menschen gegen HBV-Infektion schützen kann, was ein Zeichen dafür ist, daß das Protein Epitope aufweist, die für die Ausbildung von Schutzantikörpem notwendig sind. Weitere Beobachtungen zeigten, daß die Immunisierung mit dem Hauptprotein, welches einen bestimmten Subtyp von HBV repräsentiert, gegen die Infektion mit allen anderen Subtypen schützen kann, was ein Indiz dafür ist, daß die gruppenspezifische oder 'a'-Determinante eine wesentliche Rolle in der Ausbildung von Antikörpern spielt, die in Kreuzreaktionen Schutz geben. Es ist daher wesentlich, daß ein Peptid für einen Impfstoff gegen Hepatitis B eines oder mehrere der 'a'-Epitope von Hepatitis B Oberflächenantigen beinhalten muß.

Bei der Lokalisierung der 'a'-Determinante von HBsAg hat sich gezeigt, daß diese Determinante keine lineare Sequenz des Proteins darstellt. Vielmehr dürfte es sich dabei um ein Konformationsepitop handeln, was durch extensive intra- und intermolekulare Disulfidbrücken gebildet ist. Allerdings konnten zwei dieser Epitope an synthetischöl Peptiden lokalisiert werden, u.zw. handelt es sich dabei um die Aminosäurereste der Sequenz 122 - 137 und 139 - 147. Es wurde ein Peptid synthetisiert, welches den Sequenzbereich 124 -147 des HBsAg des Subtyps adw aufweist. Die genaue Sequenz dieses Peptids ist in Fig. 1 im Ein-Buchstabencode wiedergegeben. Die Sequenz beinhaltet 5 Cysteinreste, wobei je einer am Amino-und am Carboxy-Ende und eine Serie von drei aufeinanderfolgende Cysteinreste in den Positionen 137, 138 und 139 vorhanden sind. Nach dem Ablösen des geschützten Peptids von dem Trägerharz und der darauffolgenden Weiterverarbeitung zeigte das Peptid eine spontane Oligomerisierung, unter Bildung von 2 AT 000 625 Ul

Disulfidbrücken, wodurch eine heterogene Mischung von vervielfachten Formen mit einem Molekulargewicht in einem Bereich von 8-35 kDA auftraten. Dies wird durch Fig. 2 belegt. Dieses Peptid wird im folgenden mit OSP24-147] bezeichnet. Dieses Peptid OSp24 - 147] zeigt ein hohes Ausmaß an Kreuzreaktivität mit einem polyclonalen anü-HBsAg Antiserum, wogegen weder teilweise reduzierte trimere Formen des Peptids noch komplett reduzierte monomere Formen des Peptids irgendeine Kreuzreaktivät mit dem anti-HBsAg Antiserum zeigen. Dies geht aus dem Diagramm gemäß Fig. 3 hervor, in welchem die trimeren Formen mit TSP24-147] und die monomeren Formen mit MSP24-147] bezeichnet sind. Daraus läßt sich schließen, daß das Peptid OSP24-147] strukturbezogene disulfidabhängige Epitope beinhaltet, wie sie auch im nativen S-Protein vorhanden sind. Unter Verwendung von HBsAg Subtyp-spezifischen Antisera hat sich gezeigt, daß die HBsAg bezogenen Epitope, die von dem Peptid OSP24-147] gebildet werden, die gruppenspezifischen oder 'a’-Epitope von HBsAg darstellen.

Es sind bereits Peptide bekannt, welche die Aminosäuren [122-137] des Ges&mtpeptides enthalten. Bei diesen Peptiden handelt es sich um cyclische Peptide, so daß in der sterischen Konformation andere Sustanzen vorliegen. Weiters sind die Fargmente [99-121] des HBsAg bekannt, die zur Erzielung von Oligomeren speziell behandelt werden müssen.

Beim Erfindungsgegenstand oligomerisieren die Aminosöuren selbst spontan und bilden konformationsdisulfidabhängige gruppenspezifische Epitope von HBsAg. Dadurch wird eine hohe Wirksamkeit des Peptids erreicht, oligomere makromolekulare selbstaggregierende Formen in Lösung gebildet werden, die die quarternäre Struktur des nativedn Proteins vortäuschen.

Um ein wirksamer Kandidat Impfstoff zu sein, muß das Peptid OS[124-147] immunogen sein, d.h. es muß in der Lage sein, eine Antikörperantwort bei Fehlen eines Trägerproteins auszulösen. Um dies nachzuweisen, wurden Balb/c Mäuse und neuseeländische weiße Kaninchen mit dem Peptid OS [124-147] geimpft, wobei sowohl das komplette als auch das unvollständige Freudsche Adjuvanssystem verwendet wurde. Es wurden Antipeptid Antworten in beiden Wirten erhalten, was zeigte, daß das Peptid OS024-147] tatsächlich immunogen ist. Weiters zeigten sowohl die Mäuse als auch die 3 AT 000 625 Ul

Kaninchen Antisera, die mit diesem Peptid oder dem nativen HBsAg gleich gute Kreuzreaktion zeigen (siehe dazu Fig. 4), woraus hervorgeht, daß das Peptid OS [124-147] eine weitgehend genaue Replikation des nativen Epitops darstellt. Das Kaninchen Antipeptid-Antiserum zeigte Kreuzreaktionen mit einer Verschiedenheit von HBsAg Subtypen (siehe Tabelle 2), woraus hervorgeht, daß zumindest ein signifikanter Teil der Antikörper gegen das 'a'-Epitop gerichtet ist. Weiters hat sich gezeigt, daß Kaninchen Anti-OS[124-147]-Antisera infektiöse HepatitisB-Virusteilchen (Dane particles) in vitro immunpräzipitieren können (s. Fig. 5).

Um die Aminosäurensequenzen, die das HBsAg-verwandte ’a'-Epitop bilden, zu identifizieren, wurden neun Analoge zum Peptid OS [124-147] generiert. Diese Analogen wurden teilweise durch Substitution, Weglassung oder chemischer Modifikation einer Aminosäure in der Sequenz erhalten (siehe Fig. 6). Als Sonde für das 'a’-Epitop des Peptids OS[124-147] (Subtyp adw) wurde antiseraspezifisch für HBsAg des Subtyps ay verwendet, worauf gefunden wurde, daß die chemische Modifikation von entweder Methionin 133 oder Lysin 141 die Antikörperbindungskapazität bei wenigstens 80 % (Fig. 7) absenkte. Dies zeigt, daß beide sowohl Methionin 133 als auch Lysin 144 Einzelbestandteile des Epitops bilden, die das 'a'-Epitop von HBsAg darstellen. Dieses Methionin 133 - Lyin 141 zeigende 'a'-Epitop ist bis jetzt noch nirgends gefunden worden.

Um die Dominanz des 'a’-Epitops in der natürlichen Umgebung nachzuweisen, wurden humane Sera von 50 Peronen herangezogen, die gegen Hepatitis B geimpft waren. Diese Sera wurden auf ihre Reaktivität mit jedem der Analogen des Peptids OSP24-147] , wie in Fig. 6 gezeigt, getestet. Das Ergebnis wird in Fig. 8 wiedergegeben, woraus folgt, daß alle dieser 50 Sera in der Lage waren, das Peptid OSP24-147] zu erkennen, und daß jene 'a'-Epitope, die Methionin 133 und Lysin 141 aufweisen, die dominante Erkennungsstelle für 96 % (48 von 50 Sera) der Seraproben wiedergeben. Zusammengefaßt läßt das erkennen, daß Methionin 133 und Lysin 141 ein dominanter Bestandteil des Epitops ist, welches in HBsAg des Menschen vorhanden ist.

Aus den vorstehend beschriebenen Resultaten geht hervor, daß das Peptid OSp24-147] eine gruppenspezifische Determinante von HBsAg darstellt. Dieses 'a'-Epitop ist ein dominantes Epitop und wurde von allen 50 der überprüften menschlichen HBsAG 4 AT 000 625 Ul

Sera erkannt. Nachdem dargelegt wurde, daß das Peptid OSjT24-147] sowohl in Mäusen als auch in Kaninchen mit Freuds Adjuvans immunogen ist, läßt sich dieses System auf Menschen deshalb nicht anwenden, weil das Freud'sche Adjuvans aufgrund seiner extremen Giftigkeit in Menschen nicht anwendbar ist. Um also eine Vaccine zu erhalten, ist es notwendig, daß die Immunogenität des Peptids OS[124-147J in Alaun demonstriert wird, da Alaun das einzige zugelassene Adjuvans für den menschlichen Gebrauch ist. Zur Erzielung einer entsprechenden Antikörperantwort ist am Aminoterminus des Peptids ein Myristinsäurerest angefügt, wodurch eine größere Aggregation nach mycelartigen Zwischenwirkungen erreicht wird. Es zeigte das mit Myristinsäure versetzte Peptid eine quantitative Aggregation, was durch Sucrose-Dichte-Gradienten-Zentrifugierung bestimmt wurde. Auch zeigte das mit Myristinsäure versetzte Peptid immunogene Reaktion in zwei separaten Mäusestämmen und in Kaninchen (siehe dazu Tabelle 3).

Um Rückschlüsse auf den Menschen ziehen zu können, wurde das System auf Primaten (Rhesusaffen) ausgedehnt, um ein System, das dem menschlichen System ähnlicher ist, zu testen. Es wurden vier Affen in diesem Experiment getestet. Einer wurde mit handelsüblicher Hepatitis B Vaccine mit der normalen menschlichen Dosis von 20 /zg geimpft. Die übrigen Affen wurden mit 50 /zg, 250 /zg oder 500 μg des mit Myristinsäure versetzten Peptids OSP24-147], das am Alaun adsorbiert wurde, geimpft. Es wurde eine entsprechende Antikörperreaktion gefunden, wobei die Impfung ein Monat nachher aufgefrischt wurde (siehe dazu Tabelle 4). Dieses am Alaun adsorbierte, mit Myristinsäure versetzte Peptid OSP24-147] ist in Rhesusaffen hochimmunogen, u.zw. bei allen getesteten Dosen. Bei einer 50 /cg Dose war der erhaltene Antipeptid-Titer vergleichbar mit jenem des herkömmlich geimpften Affen. Hingegen zeigten die mit 250 /zg-Dosis immunisierten Affen eine zweifach höhere Antikörperantwort, und die mit 500 /zg-Dosis geimpften Affen sogar eine 13mal höhere Antikörperreaktion als die herkömmlich geimpften Affen. In all den vier genannten Affen waren wenigstens 80 % der Antipeptid OSP24-147] Antwort gegen das ’a'-Epitop bei Methionin 133 und Lysin 141 gerichtet. Eine vergleichbare Dosis von herkömmlicher Vaccine (20 /zg) oder myristiliertem Peptid OSP24-147] (50 /zg) ergibt im wesentlichen ein identisches Niveau von Antikörpern, die gegen das Methionin 133 -Lysin 141 abhängige ’a’-Epitop gerichtet ist, wogegen höhere Dosen dieses Peptids dazu 5 AT 000 625 Ul verwendet werden können, um eine signifikant höhere Antiköiperantwort zu erhalten. Das letztere kann dazu verwendet werden, um die Anzahl der nachzuimpfenden Dosen geringer zu halten, um einen entsprechenden Schutz gegen Hepatitis B zu erhalten.

Zur Erzielung einer mehrfach höheren Expression des 'a'-Epitops kann an der Stelle 144 die Aminosäure Asparagin durch Asparaginsäure ersetzt sein. Weiters hat sich gezeigt, daß, obwohl die Hauptmenge der Antikörper eine Antwort auf Peptid OS[124-147] gegen das 'a'-Epitop zeigen, eine geringere Anzahl der Antikörper auch gegen das Subtyp ’d'-Epitop gerichtet waren, welches am Aminoendteil des Peptides sitzt. Das Peptid OS 024-147] wurde von HBsAg des Subtyps adw abgeleitet.

Um nun zu einer Optimierung des Immunogens zu kommen, wurden zwei Peptide synthetisiert, u.zw. eines, das die 124-147 Sequenz des HBsAg des Subtyps adw, jedoch mit Asperaginsäure an der Stelle 144 zeigt, und ein anderes Peptid, das die Sequenz 124 -147 des HBsAg des Subtyps ayr aufweist. Beide geschützten Peptide, die auf Harz aufgepfropft waren, wurden mit Myristilsäureresten versehen und in equimolaren Mengen vermischt, wonach sie dann von dem Harz abgetrennt wurden, um ein Kooligomer von beiden Peptiden zu erhalten. Es wurde dadurch ein einziges Immunogen erhalten, das sowohl in optimierter Weise das 'a'-Epitop und zusätzlich noch beide Subtypen spezifischen 'd'- und ’y’-Epitope in den Aminoendteilen kodieren, u.zw. als individuelle Peptidkomponenten (siehe Fig. 10). Dieses Immunogen (Peptid OS[D/N-ayr]) kann zusätzlich zu der Anti-a Antwort auch Anti-d und Anti-y Antworten hervorrufen, die in einem breiten Spektrum von Subtyp indifferenten Anti-HBsAg Antworten resultieren, was einen besseren Effekt in der Neutralisierung von Hepatitis B-Virusinfektionen ergibt.

Herstellungsverfahren

Es wird eine Festphasenpeptidsynthese der Sequenz zwischen 124 und 147 des Hepatitis B Virus Oberflächenantigens (Subtyp adw) vorgenommen, wobei 4 Methylbenzhydrylaminharz als fester Träger verwendet wird. Die einzelnen Kupplungsreaktionen werden in Anwesenheit von einem vierfachen Überschuß von geschützten Aminosäuren vorgenommen, wobei Carbodiimid als Aktivator verwendet wird. Üblicherweise wird die Synthese in einem 0,5 mMol Maßstab durchgeführt, wobei 2 mMol 6 AT 000 625 Ul von jeder geschützten Aminosäure verwendet wird. 12 geschützte Aminosäuren werden bei der Synthese verwendet, nämlich Cystein, Threonin, Prolin, Alanin, Glutamin, Glycin, Asparagin, Serin, Methionin, Phenylalanin, Lysin und Asparaginsäure. Nach dem Peptidzusammenbau erfolgt sofort das Abtrennen vom festen Träger und die Abtrennung der Schutzgruppen der Aminosäureseitenketten, was bei einer Temperatur von unter 0°C mit Fluorwasserstoff erreicht wird, wobei 10%iges Thioanisol als Spülmittel verwendet wird. Nach dem Abtrennen des Harzes und dreimaligem Waschen mit Ethylacetat oder trockenem Ester wird das abgetrennte Peptid mit lmolarer Essigsäure extrahiert. Der Essigsäureextrakt wird dann gefroren und lyophilisiert, um ein rohes Produkt zu erhalten, welches in deionisiertem Wasser gelöst wird. Diese Lösung wird dann gründlich gegen deionisiertes Wasser dialysiert, u.zw. über einen Zeitraum von 24 h, wobei das Dialysierungsmittel wenigstens 5mal gewechselt wird und wobei eine Membran mit einer Molekulargewichtstrenngrenze von 1200 Daltons verwendet wird. Die dialysierte Lösung wird gefroren und lyophilisiert, um eine quantitative Gewinnung des Produktes zu ergeben.

Das erhaltene Produkt wird immunologischen Tests und Abwägungen unterzogen, um sicherzustellen, daß ein genaues Abbild der ‘a'-Determinante tatsächlich gebildet wurde. Es kann auch eine elektronenmikroskopische Überprüfung einer wässerigen Lösung dieses Produktes vorgenommen werden, um nachzuweisen, daß Hepatitis B Oberflächenantigen ähnliche Partikel vorliegen.

Tabelle 1 zeigt, daß Antisera, die für drei bestimmte Subtypen von Hepatitis B Oberflächenantigen spezifisch sind, in der Lage sind, das Oligomere Peptid OS[124-147] in einem großen Ausmaß zu erkennen: allerdings sind weder die teilweise reduzierte trimere Form (TS[124-147]) noch das komplett reduzierte Monomere (MSP24-147]) in der Lage, dieses zu erkennen. Das zeigt deutlich, daß das Hepatitis B Oberflächenantigen bezogene Epitop durch das Peptid OS[124-147] wiedergegeben ist, die gruppenspezifische "a"-Determinante aufweist und daß die Antigenität Disulfidbrücken-abhängig ist.

Es wurden dabei* HBsAg subtypspezifische Antisera (WHO Internationale Referenzstandard) für ihre Aktivität gegen die angeführten Peptide bei einer Verdünnung von 1 : 100 gescreent. Ein P/N Wert von größer als 2,0 wird als positiver Wert angenommen. 7 AT 000 625 Ul P/N ist das Postiv- (P) zu Negativ (N)-Verhältnis. P bedeutet den Absoiptionswert in einem ELISA-Test, der nach der Bindung des Antiköipers an OS und seinen abgeleiteten Peptiden oder HBsAg (d.h. für alle Testpeptide) erhalten wird. N bezeichnet den Absorptionswert, der bei gleicher Antikörperbindung für irgendein Peptid, d.h. eine Negativkontrolle, erhalten wird. P/N -Werte zeigen an, ob der Antikörper (z.B. anti-HsBAg) spezifisch mit den Testpeptidenbindet, im Gegensatz zu dem irrelevanten Peptid, das eine nichstspezifische Bindung ergibt. TABELLE 1

Subtyp des Antiserums OS [124-147] P/N TSP24-147] MS[124-147] ad 64,5 3,2 0,3 ay 54,0 5,4 0,5 ar 47,8 4,3 0,6

Um weiters das Potential des Peptids als eine Hepatitis B-Vaccine zu öbeiprüfen, wurden polygonale Kaninchenantisera, die gegen das Peptid OS[124-147] wirksam sind, auf ihre Kreuzreaktivität mit den internationalen Standard Hepatitis B-Oberflächenantigen Präparaten von sechs verschiedenen Subtypen gescreent.

Tabelle 2 zeigt die Resultate dieses Experiments, wobei ein paralleles Set von Versuchen mit polyclonalen Antihepatitis B-Oberflächenantigen Antisera als positive Kontrolle verwendet wurden. Antipeptid OSJ124-147] Antisera reagierten in vergleichbarem Ausmaß mit allen den sechs der getesteten Subtypen. Daraus ergibt sich, daß eine Immunisierung mit dem genannten Peptid OS [124-147] Antikörper produzieren wird, die in der Lage sind, alle Linien der Hepatitis B-Viren zu erkennen. Eine 1 : 500 Verdünnung von entweder Kaninchen Anti-OS [124-147] oder Pferdeanti-HBsAg wurden 8 AT 000 625 Ul für dieses Experiment verwendet. Die verschiedenen HBsAg-Subtypen, die verwendet wurden, sind in der Tabelle 2 angegegeben. 9 AT 000 625 Ul TABELLE 2

P/N HBsAg Subtyp mit Anti HBsAg mit Anti-OS[124-147] adw 10,6 6,3 ayw 18,2 4,7 ayr 5,9 4,7 ayw2 8,6 5,4 a2dw 12,2 6,7 adw2 9,9 7,9

Tabelle 3 zeigt die Immunogenität von mit Myristilsäure versetztem Peptid OSP24-147] in Alaun. Die in der Tabelle angegebenen Antipeptidtiter wurden nach einer ersten Immunisieirung, welche von einer Auffrischungsdose, die 4 Wochen später gegeben wird, gefolgt wurde, erhalten. Die Peptide, die an Alaun adsorbiert waren, sind als Immunogen verwendet worden, wobei die Dosis entweder 20 μξ pro Maus oder 200 /zg pro Kaninchen war.

Wirt Linie Mäuse Balb/c C57 Bl/6 Kaninchen NZW TABELLE 3

Nr. Anti-OS [124-147] (1/Titer) 1300 2500 1 8270 2 7970 3 20.800 10 AT 000 625 Ul

Tabelle 4 zeigt die Immunogenität von myristylisiertem Peptid OSp24-147] in Alaun am Rhesusaffen. Die Antipeptidtiter wurden nach einer ersten Immunisierung, welcher 1 Monat später eine Auffrischungsimpfung folgte, erhalten. TABELLE 4 Affe Nr. Immunogen Dosis Anti-OS [124-147] 0*g) (1/Titer) 1757 Vaccine 20 7200 745 OS [124-147] 50 7200 1442 OSP24-147] 250 17.000 1109 OSP24-I47] 500 95.000

Fig. 1 zeigt die Primärsequenz des Peptids OS[124-147] (Subtyp adw). Dazu wird der Einlettercode für die Aminosäuren benützt.

Fig. 2 gibt eine Polyamidgelelektrophorese des Peptides OS[124-147] und TS[124-147] wieder. Für diese Probe wurden 2 Mikrogramm von jedem Peptid in gleichem Volumen von mercaptoethanolfreiem Probepuffer gelöst und auf ein 18%iges Polyacrylamidgel aufgegeben. Die Sichtbarmachung erfolgte mit Silberfärbung. In der Figur zeigt die Linie 1 den Molekulargewichtsmarker, die Linie 2 das Peptid OSp24-147] und die Linie 3 das Peptid TS [124-147].

Fig. 3 gibt wieder, inwieweit ein Polyclonal-Anti HBsAg Antiserum das Peptid OS[124-147] erkennt, nicht jedoch das Peptid TS[124-147J oder das Peptid MS[124-147], Die Proben wurden in einem ELISA-Assay ausgeführt. Die Daten werden als P/N Verhältnisse wiedergegeben, wobei N die Absorbierung bedeutet, die mit einem irrelevanten Peptid erhalten werden. 11 AT 000 625 Ul

Fig. 4 veranschaulicht die Titrationsprofile von polyclonalen Anti-OS[124-147] Sera gegen HBsAg und Peptid.

Maus (A) oder Kaninchen (B) Antipeptid-Antisera wurden gegen Peptid OS[124-147] (o) oder natives HBsAg(o) in dem ELISA-Assay wiedergegeben. Die Daten wurden als P/N Verhältnisse angegeben, wobei N die Absorption bedeutet, welche mit einer 1 : 100 Verdünnung eines Preimmunserums gegen das entsprechende Antigen erhalten ist.

Fig. 5 gibt Anti-OS[124-147] Antikörper, die mit Danepartikel präzipitiert sind, wieder. Dabei wurden gereinigte Dane Partikel einer Immunpräzipitation entweder mit Kaninchen-Präimmunserum (Reihe a) oder Kaninchen Polyklonal-anti OS[124-147] Serum (Reihe 6) unterworfen. Die im Überstand (oben) enthaltene HBV-DNA bzw. das Protein A Pellet (Boden) wurde durch Tüpfelhybridisierung nachgewiesen.

Fig. 6 zeigt das Peptid OS[124-147] und seine Analogen. Die Stellen, wo entweder einzelne Aminosäuren weggelassen, substituiert oder modifiziert sind, wurden unterstrichen.

Fig. 7 veranschaulicht die Identifikation der Aminosäurereste, die in einem Anti-ay Bindungsassay verwendet werden. Das Peptid OS[124-147] und seine Analoge wurden separat in die Vertiefungen einer ELISA-Platte aufgebracht und die Reaktivität mit Meerschweinchen-Anti HBsAg (ay) mit einer Endverdünnung von 1 : 200 bestimmt. Die relative Antigenität (RA) gibt das Verhältnis der Absorption wieder, die für ein bestimmtes Analog gegenüber jenem von dem Grundpeptid nach Abzug des Hintergrundes erhalten wird.

Fig. 8 zeigt die Identifizierung von menschlichen Anti-HBsAg Antiköiper-Bindungsresten an Peptid OS [124-147]. Die kumulativen Resultate für 50 unabhängige Sera werden hier als Prozent der Gesamtanzahl von Proben wiedergegeben, welche die Reaktivität mit den Analogen relativ zum Stammpeptid OS[124-147] zeigen.

Fig. 9 gibt das Sucrose-Dichte-Gradientenprofil von mit Myristilsäure versetztem Peptid OS [124-147] wieder. 200 μ* von mit Myristilsäure versetztem Peptid OS[124-147] in 100 μϊ wurden auf eine 10-30 % Sucrosegradientlösung aufgebracht und 20 h mittels eines SF50.1 Rotors zentrifugiert. Am Ende wurden die Fraktionen gesammelt und der Prozentsatz an Sucrose 12 AT 000 625 Ul in jeder Fraktion durch Refraktometrie bestimmt. Der Anteil von Peptid, der in jeder Fraktion enthalten war, wurde durch Ninhydrintest bestimmt. Es ist dabei wesentlich, daß alle Peptide in die Gradientenlösung eingedrungen sind, wobei die Mehrheit bis am Boden abgesetzt wurde.

Fig. 10 gibt die primären Sequenzen von individuellen Komponenten Peptiden des Peptids OS[D/N-ayr] wieder, also von einem Copolymer aus zwei verschiedenen Peptiden, nämlich der Peptide OS[D/N] und OS [ayr], welche zusammen das angeführte Komponentenpeptid bilden.

Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß ein synthetisches Peptid gefunden wurde, welches die Sequenz zwischen den Resten 124-147 des Hepatitis B-Oberflächenantigens aufweist und sofort oligomerisiert, um ein konformes disulfid- und oligomeräbhängiges gruppenspezifisches oder ’a'Antigen Determinante des Hepatitis B Oberflächenantigens zu bilden. Eine Antigen Determinante ist eine Sequenz oder Struktur, die Antikörper erkennt. Daher ist eine Antigen Determinante des Hepatitis B Oberflächen Antigens jener Teil der Proteinsequenz, der tatsächlich durch die Antikörper bei Immunisierung oder Infektion mit HBV auftritt, erkannt wird. Die gruppenspezifische oder 'a'-Determinante sind jene antigenen Determinanten, die üblicherweise auf allen Stämmen des Virus (z.B. verschiedene Stämme von HBV oder HIV) vorhanden sind Im Falle von Hepatitis B sind diese gruppenspezifischen Determinanten als 'a'-Determinanten bekannt. Weiters wurde gezeigt, daß das Peptid OS [124-147] das korrespondierende Epitop des nativen Antigens mit hoher Präzision vortäuscht und einen dominanten Bestandteil des Epitops des Hepatitis B Oberflächenantigens bildet, wenn es in einem menschlichen Immunsystem eingebracht ist. Das Peptid OS [124-147] ist immunogen, sowohl in Mäusen als auch in Kaninchen und die gegen dieses Peptid gebildeten Antikörper sind in der Lage, eine Vielzahl von Hepatitis B Oberflächenantigen-Subtypen zu erkennen.

Schließlich formt das Peptid LOS [124-147] sphärische und tubuläre Aggregate in wässerigen Lösungen, die an die native Hepatitis B Oberflächenantigen-Teilchen erinnern.

Solcherart repräsentiert das Peptid OS[124-127] eine antigenische und strukturelle Vortäuschung von Hepatitis B Oberflächenantigen und. stellt ein Kandidat Vaccine für Hepatitis B dar, also ein Molekül, das potentiel als Vaccine verwendet werden kann. 13

Claims (7)

1. AT 000 625 Ul Ansprüche: 1. Peptid, welches mit anti-Hepatitis B-Oberflächenantigen (HBsAg) Antiserum Kreuzreaktivität zeigt und welches das ’a'-Epitop von HBsAg aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Oligomeres der Aminosäuresequenz CTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNC bzw. deren Analogen und Homologen, vorzugsweise mit einem Molekulargewicht von 8 -35 kDA ist.
2. 2. Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Analogen bzw. Homologen folgende Aminosäuresequenzen aufweisen Analoge des Peptids OS[124-147] (Subtyp adw) Peotid Seauenz OS CTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNC OS Δ A>“ CTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNC OSAQ>» CTTPA.GNSMFPSCCCTKPTDGNC OS[Nl3I—> A] CTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNC 0S[M133—Ox) (0) f CTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNC 0S[P135—>A] CTTPAQGNSMFASCCCTKPTDGNC 14 AT 000 625 Ul OS[Si»->A] OS[KW-»Me3 OS[P><2_>a] OS[Dw —> N] CTTPAQGNSMFPACCCTKPTDGNC (Mt) t CTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDCNC CTTPAQGNSMFPSCCCTKATDGNC CTTPAQGNSMFPSCCCTKPTÜGNC
3. 3. Peptid nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das 'a'-Epitop durch die Aminosäuren Methionin an der Stelle 133 und Lysin an der Stelle 141 bestimmt ist.
4. 4. Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das 'a'-Epitop an der Stelle 144 Asparaginsäure als Aminosäure aufweist.
5. 5. Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid außer dem ‘a'-Epitop noch zusätzliche Epitope des HBsAg, insbesondere das 'd‘- und/oder ’y'-Epitop, aufweist.
6. 6. Vaccine gegen Hepatitis B, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, zusammen mit Alaun als Adjuvans enthält, wobei am Amino-Terminus des Peptids ein Myristinsäurerest angefügt ist.
7. 7. Verwendung des Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 als Reagens in der Diagnose von Hepatitis B Virusinfektion. 15