AT625U1

AT625U1 - PEPTID, WHICH SHOWS CROSS REACTIVITY WITH ANTI-HBSAG ANTISERUM

Info

Publication number: AT625U1
Application number: AT0811694U
Authority: AT
Original assignee: United Nations Ind Dev Organiz
Priority date: 1992-09-01
Filing date: 1994-11-18
Publication date: 1996-02-26

Description

AT 000 625 UlAT 000 625 ul

Die Erfindung bezieht sich auf ein Peptid, welches mit anti-Hepatitis B-Oberflächenantigen (HBsAg) Antiserum Kreuzreaktivität zeigt.The invention relates to a peptide which shows cross-reactivity with anti-hepatitis B surface antigen (HBsAg) antiserum.

Das Hauptprotein (oder S-Protein) des Hepatitis B-Oberilächenantigens (im folgenden HBsAg genannt) ist 226 Aminosäuren lang und weist eine gruppenspezifischeThe main protein (or S protein) of the hepatitis B surface antigen (hereinafter referred to as HBsAg) is 226 amino acids long and has a group-specific

Determinante, welche auch 'a'-Determinante genannt ist, auf, die allen Subtypen des Hepatitis B-Virus (HBV) gemeinsam ist. Zusätzlich zu dieser gruppenspezifischen Determinante gibt es noch zwei Gruppen von gegenseitig ausschließenden Subtypen spezifischen Determinanten, u.zw. die d- oder y- oder die w- oder r-Determinante, sodaß es vier große Subtypen von Viren gibt, nämlich adw, adr, ayw und ayr. Untersuchungen haben gezeigt, daß eine Immunisierung ausschließlich mit dem Hauptprotein Menschen gegen HBV-Infektion schützen kann, was ein Zeichen dafür ist, daß das Protein Epitope aufweist, die für die Ausbildung von Schutzantikörpem notwendig sind. Weitere Beobachtungen zeigten, daß die Immunisierung mit dem Hauptprotein, welches einen bestimmten Subtyp von HBV repräsentiert, gegen die Infektion mit allen anderen Subtypen schützen kann, was ein Indiz dafür ist, daß die gruppenspezifische oder 'a'-Determinante eine wesentliche Rolle in der Ausbildung von Antikörpern spielt, die in Kreuzreaktionen Schutz geben. Es ist daher wesentlich, daß ein Peptid für einen Impfstoff gegen Hepatitis B eines oder mehrere der 'a'-Epitope von Hepatitis B Oberflächenantigen beinhalten muß.Determinant, which is also called 'a' determinant, which is common to all subtypes of the hepatitis B virus (HBV). In addition to this group-specific determinant, there are two groups of mutually exclusive subtypes of specific determinants, etc. the d or y or the w or r determinant so that there are four major subtypes of viruses, namely adw, adr, ayw and ayr. Studies have shown that immunization only with the main protein can protect people against HBV infection, which is a sign that the protein has epitopes that are necessary for the formation of protective antibodies. Further observations showed that immunization with the main protein, which represents a certain subtype of HBV, can protect against infection with all other subtypes, which is an indication that the group-specific or 'a' determinant plays an essential role in education of antibodies that protect in cross-reactions. It is therefore essential that a peptide for a hepatitis B vaccine must contain one or more of the 'a' epitopes of hepatitis B surface antigen.

Bei der Lokalisierung der 'a'-Determinante von HBsAg hat sich gezeigt, daß diese Determinante keine lineare Sequenz des Proteins darstellt. Vielmehr dürfte es sich dabei um ein Konformationsepitop handeln, was durch extensive intra- und intermolekulare Disulfidbrücken gebildet ist. Allerdings konnten zwei dieser Epitope an synthetischöl Peptiden lokalisiert werden, u.zw. handelt es sich dabei um die Aminosäurereste der Sequenz 122 - 137 und 139 - 147. Es wurde ein Peptid synthetisiert, welches den Sequenzbereich 124 -147 des HBsAg des Subtyps adw aufweist. Die genaue Sequenz dieses Peptids ist in Fig. 1 im Ein-Buchstabencode wiedergegeben. Die Sequenz beinhaltet 5 Cysteinreste, wobei je einer am Amino-und am Carboxy-Ende und eine Serie von drei aufeinanderfolgende Cysteinreste in den Positionen 137, 138 und 139 vorhanden sind. Nach dem Ablösen des geschützten Peptids von dem Trägerharz und der darauffolgenden Weiterverarbeitung zeigte das Peptid eine spontane Oligomerisierung, unter Bildung von 2 AT 000 625 UlThe localization of the 'a' determinant of HBsAg has shown that this determinant is not a linear sequence of the protein. Rather, it is a conformation epitope, which is formed by extensive intra- and intermolecular disulfide bridges. However, two of these epitopes could be localized on synthetic oil peptides, e.g. these are the amino acid residues of the sequence 122-137 and 139-147. A peptide was synthesized which has the sequence region 124-147 of the HBsAg of the subtype adw. The exact sequence of this peptide is shown in Fig. 1 in the one-letter code. The sequence contains 5 cysteine residues, one at the amino and one at the carboxy end and a series of three successive cysteine residues in positions 137, 138 and 139. After detachment of the protected peptide from the carrier resin and subsequent processing, the peptide showed spontaneous oligomerization, with the formation of 2 AT 000 625 Ul

Disulfidbrücken, wodurch eine heterogene Mischung von vervielfachten Formen mit einem Molekulargewicht in einem Bereich von 8-35 kDA auftraten. Dies wird durch Fig. 2 belegt. Dieses Peptid wird im folgenden mit OSP24-147] bezeichnet. Dieses Peptid OSp24 - 147] zeigt ein hohes Ausmaß an Kreuzreaktivität mit einem polyclonalen anü-HBsAg Antiserum, wogegen weder teilweise reduzierte trimere Formen des Peptids noch komplett reduzierte monomere Formen des Peptids irgendeine Kreuzreaktivät mit dem anti-HBsAg Antiserum zeigen. Dies geht aus dem Diagramm gemäß Fig. 3 hervor, in welchem die trimeren Formen mit TSP24-147] und die monomeren Formen mit MSP24-147] bezeichnet sind. Daraus läßt sich schließen, daß das Peptid OSP24-147] strukturbezogene disulfidabhängige Epitope beinhaltet, wie sie auch im nativen S-Protein vorhanden sind. Unter Verwendung von HBsAg Subtyp-spezifischen Antisera hat sich gezeigt, daß die HBsAg bezogenen Epitope, die von dem Peptid OSP24-147] gebildet werden, die gruppenspezifischen oder 'a’-Epitope von HBsAg darstellen.Disulfide bridges, which resulted in a heterogeneous mixture of multiplied forms with a molecular weight in the range of 8-35 kDa. This is evidenced by Fig. 2. This peptide is referred to below as OSP24-147]. This peptide OSp24 - 147] shows a high degree of cross-reactivity with a polyclonal anü-HBsAg antiserum, whereas neither partially reduced trimeric forms of the peptide nor completely reduced monomeric forms of the peptide show any cross-reactivity with the anti-HBsAg antiserum. This can be seen from the diagram according to FIG. 3, in which the trimeric forms are denoted by TSP24-147] and the monomeric forms by MSP24-147]. From this it can be concluded that the peptide OSP24-147] contains structure-related disulfide-dependent epitopes, as are also present in the native S protein. Using HBsAg subtype-specific antisera, it has been shown that the HBsAg-related epitopes, which are formed by the peptide OSP24-147], are the group-specific or 'a' epitopes of HBsAg.

Es sind bereits Peptide bekannt, welche die Aminosäuren [122-137] des Ges&mtpeptides enthalten. Bei diesen Peptiden handelt es sich um cyclische Peptide, so daß in der sterischen Konformation andere Sustanzen vorliegen. Weiters sind die Fargmente [99-121] des HBsAg bekannt, die zur Erzielung von Oligomeren speziell behandelt werden müssen.Peptides are already known which contain the amino acids [122-137] of the Ges & peptide. These peptides are cyclic peptides, so that other substances are present in the steric conformation. Furthermore, the colorations [99-121] of HBsAg are known, which have to be specially treated to achieve oligomers.

Beim Erfindungsgegenstand oligomerisieren die Aminosöuren selbst spontan und bilden konformationsdisulfidabhängige gruppenspezifische Epitope von HBsAg. Dadurch wird eine hohe Wirksamkeit des Peptids erreicht, oligomere makromolekulare selbstaggregierende Formen in Lösung gebildet werden, die die quarternäre Struktur des nativedn Proteins vortäuschen.In the subject matter of the invention, the amino acids themselves spontaneously oligomerize and form conformationally disulfide-dependent group-specific epitopes of HBsAg. As a result, the peptide is highly effective, oligomeric macromolecular self-aggregating forms are formed in solution, which simulate the quaternary structure of the native protein.

Um ein wirksamer Kandidat Impfstoff zu sein, muß das Peptid OS[124-147] immunogen sein, d.h. es muß in der Lage sein, eine Antikörperantwort bei Fehlen eines Trägerproteins auszulösen. Um dies nachzuweisen, wurden Balb/c Mäuse und neuseeländische weiße Kaninchen mit dem Peptid OS [124-147] geimpft, wobei sowohl das komplette als auch das unvollständige Freudsche Adjuvanssystem verwendet wurde. Es wurden Antipeptid Antworten in beiden Wirten erhalten, was zeigte, daß das Peptid OS024-147] tatsächlich immunogen ist. Weiters zeigten sowohl die Mäuse als auch die 3 AT 000 625 UlTo be an effective candidate vaccine, the peptide OS [124-147] must be immunogenic, i.e. it must be able to elicit an antibody response in the absence of a carrier protein. To demonstrate this, Balb / c mice and New Zealand white rabbits were vaccinated with the OS [124-147] peptide using both the complete and incomplete Freudian adjuvant systems. Antipeptide responses were obtained in both hosts, showing that the peptide OS024-147] is indeed immunogenic. Furthermore, both the mice and the 3 AT 000 625 Ul showed

Kaninchen Antisera, die mit diesem Peptid oder dem nativen HBsAg gleich gute Kreuzreaktion zeigen (siehe dazu Fig. 4), woraus hervorgeht, daß das Peptid OS [124-147] eine weitgehend genaue Replikation des nativen Epitops darstellt. Das Kaninchen Antipeptid-Antiserum zeigte Kreuzreaktionen mit einer Verschiedenheit von HBsAg Subtypen (siehe Tabelle 2), woraus hervorgeht, daß zumindest ein signifikanter Teil der Antikörper gegen das 'a'-Epitop gerichtet ist. Weiters hat sich gezeigt, daß Kaninchen Anti-OS[124-147]-Antisera infektiöse HepatitisB-Virusteilchen (Dane particles) in vitro immunpräzipitieren können (s. Fig. 5).Rabbit antisera which show an equally good cross-reaction with this peptide or the native HBsAg (see FIG. 4), from which it follows that the peptide OS [124-147] represents a largely accurate replication of the native epitope. The rabbit antipeptide antiserum showed cross-reactions with a variety of HBsAg subtypes (see Table 2), indicating that at least a significant proportion of the antibodies are directed against the 'a' epitope. Furthermore, it has been shown that rabbits can anti-OS [124-147] antisera infectious hepatitis B virus particles (Dane particles) immunoprecipitate in vitro (see Fig. 5).

Um die Aminosäurensequenzen, die das HBsAg-verwandte ’a'-Epitop bilden, zu identifizieren, wurden neun Analoge zum Peptid OS [124-147] generiert. Diese Analogen wurden teilweise durch Substitution, Weglassung oder chemischer Modifikation einer Aminosäure in der Sequenz erhalten (siehe Fig. 6). Als Sonde für das 'a’-Epitop des Peptids OS[124-147] (Subtyp adw) wurde antiseraspezifisch für HBsAg des Subtyps ay verwendet, worauf gefunden wurde, daß die chemische Modifikation von entweder Methionin 133 oder Lysin 141 die Antikörperbindungskapazität bei wenigstens 80 % (Fig. 7) absenkte. Dies zeigt, daß beide sowohl Methionin 133 als auch Lysin 144 Einzelbestandteile des Epitops bilden, die das 'a'-Epitop von HBsAg darstellen. Dieses Methionin 133 - Lyin 141 zeigende 'a'-Epitop ist bis jetzt noch nirgends gefunden worden.In order to identify the amino acid sequences that form the HBsAg-related 'a' epitope, nine analogs to the peptide OS [124-147] were generated. These analogs were obtained in part by substitution, omission or chemical modification of an amino acid in the sequence (see Fig. 6). As a probe for the 'a' epitope of peptide OS [124-147] (subtype adw), antiseraspecific for HBsAg of subtype ay was used, after which it was found that the chemical modification of either methionine 133 or lysine 141 had the antibody binding capacity at at least 80 % (Fig. 7). This shows that both methionine 133 and lysine 144 form individual components of the epitope, which are the 'a' epitope of HBsAg. This 'a' epitope showing methionine 133 - lyin 141 has not been found anywhere yet.

Um die Dominanz des 'a’-Epitops in der natürlichen Umgebung nachzuweisen, wurden humane Sera von 50 Peronen herangezogen, die gegen Hepatitis B geimpft waren. Diese Sera wurden auf ihre Reaktivität mit jedem der Analogen des Peptids OSP24-147] , wie in Fig. 6 gezeigt, getestet. Das Ergebnis wird in Fig. 8 wiedergegeben, woraus folgt, daß alle dieser 50 Sera in der Lage waren, das Peptid OSP24-147] zu erkennen, und daß jene 'a'-Epitope, die Methionin 133 und Lysin 141 aufweisen, die dominante Erkennungsstelle für 96 % (48 von 50 Sera) der Seraproben wiedergeben. Zusammengefaßt läßt das erkennen, daß Methionin 133 und Lysin 141 ein dominanter Bestandteil des Epitops ist, welches in HBsAg des Menschen vorhanden ist.In order to demonstrate the dominance of the 'a' epitope in the natural environment, human sera from 50 persons who had been vaccinated against hepatitis B were used. These sera were tested for reactivity with each of the analogs of peptide OSP24-147] as shown in FIG. 6. The result is shown in Fig. 8, from which it follows that all of these 50 sera were able to recognize the peptide OSP24-147] and that those 'a' epitopes which have methionine 133 and lysine 141 were the dominant Play the recognition site for 96% (48 of 50 sera) of the sera samples. In summary, this indicates that methionine 133 and lysine 141 are a dominant component of the epitope found in human HBsAg.

Aus den vorstehend beschriebenen Resultaten geht hervor, daß das Peptid OSp24-147] eine gruppenspezifische Determinante von HBsAg darstellt. Dieses 'a'-Epitop ist ein dominantes Epitop und wurde von allen 50 der überprüften menschlichen HBsAG 4 AT 000 625 UlThe results described above show that the peptide OSp24-147] is a group-specific determinant of HBsAg. This 'a' epitope is a dominant epitope and was identified by all 50 of the human HBsAG 4 AT 000 625 Ul examined

Sera erkannt. Nachdem dargelegt wurde, daß das Peptid OSjT24-147] sowohl in Mäusen als auch in Kaninchen mit Freuds Adjuvans immunogen ist, läßt sich dieses System auf Menschen deshalb nicht anwenden, weil das Freud'sche Adjuvans aufgrund seiner extremen Giftigkeit in Menschen nicht anwendbar ist. Um also eine Vaccine zu erhalten, ist es notwendig, daß die Immunogenität des Peptids OS[124-147J in Alaun demonstriert wird, da Alaun das einzige zugelassene Adjuvans für den menschlichen Gebrauch ist. Zur Erzielung einer entsprechenden Antikörperantwort ist am Aminoterminus des Peptids ein Myristinsäurerest angefügt, wodurch eine größere Aggregation nach mycelartigen Zwischenwirkungen erreicht wird. Es zeigte das mit Myristinsäure versetzte Peptid eine quantitative Aggregation, was durch Sucrose-Dichte-Gradienten-Zentrifugierung bestimmt wurde. Auch zeigte das mit Myristinsäure versetzte Peptid immunogene Reaktion in zwei separaten Mäusestämmen und in Kaninchen (siehe dazu Tabelle 3).Sera recognized. Since it has been demonstrated that the peptide OSjT24-147] is immunogenic in both mice and rabbits with Freud's adjuvant, this system cannot be applied to humans because Freud's adjuvant cannot be used in humans due to its extreme toxicity. Thus, in order to obtain a vaccine, it is necessary to demonstrate the immunogenicity of the OS [124-147J peptide in alum, since alum is the only approved adjuvant for human use. To achieve a corresponding antibody response, a myristic acid residue is added to the amino terminus of the peptide, as a result of which a greater aggregation after mycelium-like interactions is achieved. The myristic acid-added peptide showed a quantitative aggregation, which was determined by sucrose density gradient centrifugation. The myristic acid-added peptide also showed an immunogenic reaction in two separate mouse strains and in rabbits (see Table 3).

Um Rückschlüsse auf den Menschen ziehen zu können, wurde das System auf Primaten (Rhesusaffen) ausgedehnt, um ein System, das dem menschlichen System ähnlicher ist, zu testen. Es wurden vier Affen in diesem Experiment getestet. Einer wurde mit handelsüblicher Hepatitis B Vaccine mit der normalen menschlichen Dosis von 20 /zg geimpft. Die übrigen Affen wurden mit 50 /zg, 250 /zg oder 500 μg des mit Myristinsäure versetzten Peptids OSP24-147], das am Alaun adsorbiert wurde, geimpft. Es wurde eine entsprechende Antikörperreaktion gefunden, wobei die Impfung ein Monat nachher aufgefrischt wurde (siehe dazu Tabelle 4). Dieses am Alaun adsorbierte, mit Myristinsäure versetzte Peptid OSP24-147] ist in Rhesusaffen hochimmunogen, u.zw. bei allen getesteten Dosen. Bei einer 50 /cg Dose war der erhaltene Antipeptid-Titer vergleichbar mit jenem des herkömmlich geimpften Affen. Hingegen zeigten die mit 250 /zg-Dosis immunisierten Affen eine zweifach höhere Antikörperantwort, und die mit 500 /zg-Dosis geimpften Affen sogar eine 13mal höhere Antikörperreaktion als die herkömmlich geimpften Affen. In all den vier genannten Affen waren wenigstens 80 % der Antipeptid OSP24-147] Antwort gegen das ’a'-Epitop bei Methionin 133 und Lysin 141 gerichtet. Eine vergleichbare Dosis von herkömmlicher Vaccine (20 /zg) oder myristiliertem Peptid OSP24-147] (50 /zg) ergibt im wesentlichen ein identisches Niveau von Antikörpern, die gegen das Methionin 133 -Lysin 141 abhängige ’a’-Epitop gerichtet ist, wogegen höhere Dosen dieses Peptids dazu 5 AT 000 625 Ul verwendet werden können, um eine signifikant höhere Antiköiperantwort zu erhalten. Das letztere kann dazu verwendet werden, um die Anzahl der nachzuimpfenden Dosen geringer zu halten, um einen entsprechenden Schutz gegen Hepatitis B zu erhalten.In order to draw conclusions about humans, the system was extended to primates (rhesus monkeys) to test a system that is more similar to the human system. Four monkeys were tested in this experiment. One was vaccinated with commercial hepatitis B vaccine at the normal human dose of 20 / zg. The remaining monkeys were vaccinated with 50 / zg, 250 / zg or 500 μg of the myristic acid-added peptide OSP24-147], which was adsorbed on the alum. A corresponding antibody reaction was found, the vaccination being refreshed one month later (see Table 4). This peptide OSP24-147] adsorbed on the alum and mixed with myristic acid is highly immunogenic in rhesus monkeys, etc. with all tested cans. With a 50 / cg dose, the antipeptide titer obtained was comparable to that of the conventionally vaccinated monkey. In contrast, the monkeys immunized with a dose of 250 / zg showed a twice higher antibody response, and the monkeys vaccinated with a dose of 500 / zg even showed a 13 times higher antibody response than the conventionally vaccinated monkeys. In all of the four monkeys mentioned, at least 80% of the antipeptide OSP24-147] response was directed against the 'a' epitope in methionine 133 and lysine 141. A comparable dose of conventional vaccine (20 / zg) or myristilated peptide OSP24-147] (50 / zg) gives essentially an identical level of antibodies directed against the methionine 133-lysine 141 dependent 'a' epitope, whereas higher doses of this peptide can be used to 5 AT 000 625 ul to get a significantly higher antibody response. The latter can be used to reduce the number of doses to be vaccinated in order to obtain appropriate protection against hepatitis B.

Zur Erzielung einer mehrfach höheren Expression des 'a'-Epitops kann an der Stelle 144 die Aminosäure Asparagin durch Asparaginsäure ersetzt sein. Weiters hat sich gezeigt, daß, obwohl die Hauptmenge der Antikörper eine Antwort auf Peptid OS[124-147] gegen das 'a'-Epitop zeigen, eine geringere Anzahl der Antikörper auch gegen das Subtyp ’d'-Epitop gerichtet waren, welches am Aminoendteil des Peptides sitzt. Das Peptid OS 024-147] wurde von HBsAg des Subtyps adw abgeleitet.In order to achieve a multiple-higher expression of the 'a' epitope, the amino acid asparagine can be replaced by aspartic acid at position 144. Furthermore, it has been shown that although the majority of the antibodies show a response to peptide OS [124-147] against the 'a' epitope, a smaller number of antibodies were also directed against the subtype 'd'-epitope, which on Amino end part of the peptide sits. The peptide OS 024-147] was derived from HBsAg of the subtype adw.

Um nun zu einer Optimierung des Immunogens zu kommen, wurden zwei Peptide synthetisiert, u.zw. eines, das die 124-147 Sequenz des HBsAg des Subtyps adw, jedoch mit Asperaginsäure an der Stelle 144 zeigt, und ein anderes Peptid, das die Sequenz 124 -147 des HBsAg des Subtyps ayr aufweist. Beide geschützten Peptide, die auf Harz aufgepfropft waren, wurden mit Myristilsäureresten versehen und in equimolaren Mengen vermischt, wonach sie dann von dem Harz abgetrennt wurden, um ein Kooligomer von beiden Peptiden zu erhalten. Es wurde dadurch ein einziges Immunogen erhalten, das sowohl in optimierter Weise das 'a'-Epitop und zusätzlich noch beide Subtypen spezifischen 'd'- und ’y’-Epitope in den Aminoendteilen kodieren, u.zw. als individuelle Peptidkomponenten (siehe Fig. 10). Dieses Immunogen (Peptid OS[D/N-ayr]) kann zusätzlich zu der Anti-a Antwort auch Anti-d und Anti-y Antworten hervorrufen, die in einem breiten Spektrum von Subtyp indifferenten Anti-HBsAg Antworten resultieren, was einen besseren Effekt in der Neutralisierung von Hepatitis B-Virusinfektionen ergibt.In order to optimize the immunogen, two peptides were synthesized, e.g. one that shows the 124-147 sequence of HBsAg of the subtype adw but with asperic acid at position 144, and another peptide that has the sequence 124-147 of HBsAg of the subtype ayr. Both protected peptides grafted on resin were provided with myristile acid residues and mixed in equimolar amounts, after which they were separated from the resin to obtain a co-oligomer of both peptides. This resulted in a single immunogen which encodes both the 'a' epitope and, in addition, both subtypes specific 'd'and ’y’ epitopes in the amino end parts in an optimized manner, etc. as individual peptide components (see Fig. 10). This immunogen (peptide OS [D / N-ayr]) can, in addition to the anti-a response, also elicit anti-d and anti-y responses, resulting in a wide range of subtype indifferent anti-HBsAg responses, which has a better effect results in the neutralization of hepatitis B virus infections.

Herstellungsverfahrenproduction method

Es wird eine Festphasenpeptidsynthese der Sequenz zwischen 124 und 147 des Hepatitis B Virus Oberflächenantigens (Subtyp adw) vorgenommen, wobei 4 Methylbenzhydrylaminharz als fester Träger verwendet wird. Die einzelnen Kupplungsreaktionen werden in Anwesenheit von einem vierfachen Überschuß von geschützten Aminosäuren vorgenommen, wobei Carbodiimid als Aktivator verwendet wird. Üblicherweise wird die Synthese in einem 0,5 mMol Maßstab durchgeführt, wobei 2 mMol 6 AT 000 625 Ul von jeder geschützten Aminosäure verwendet wird. 12 geschützte Aminosäuren werden bei der Synthese verwendet, nämlich Cystein, Threonin, Prolin, Alanin, Glutamin, Glycin, Asparagin, Serin, Methionin, Phenylalanin, Lysin und Asparaginsäure. Nach dem Peptidzusammenbau erfolgt sofort das Abtrennen vom festen Träger und die Abtrennung der Schutzgruppen der Aminosäureseitenketten, was bei einer Temperatur von unter 0°C mit Fluorwasserstoff erreicht wird, wobei 10%iges Thioanisol als Spülmittel verwendet wird. Nach dem Abtrennen des Harzes und dreimaligem Waschen mit Ethylacetat oder trockenem Ester wird das abgetrennte Peptid mit lmolarer Essigsäure extrahiert. Der Essigsäureextrakt wird dann gefroren und lyophilisiert, um ein rohes Produkt zu erhalten, welches in deionisiertem Wasser gelöst wird. Diese Lösung wird dann gründlich gegen deionisiertes Wasser dialysiert, u.zw. über einen Zeitraum von 24 h, wobei das Dialysierungsmittel wenigstens 5mal gewechselt wird und wobei eine Membran mit einer Molekulargewichtstrenngrenze von 1200 Daltons verwendet wird. Die dialysierte Lösung wird gefroren und lyophilisiert, um eine quantitative Gewinnung des Produktes zu ergeben.A solid phase peptide synthesis of the sequence between 124 and 147 of the hepatitis B virus surface antigen (subtype adw) is carried out, 4 methylbenzhydrylamine resin being used as the solid support. The individual coupling reactions are carried out in the presence of a four-fold excess of protected amino acids, carbodiimide being used as an activator. Usually the synthesis is carried out on a 0.5 mmole scale, using 2 mmole 6 AT 000 625 µl of each protected amino acid. 12 protected amino acids are used in the synthesis, namely cysteine, threonine, proline, alanine, glutamine, glycine, asparagine, serine, methionine, phenylalanine, lysine and aspartic acid. After the peptide has been assembled, the solid support is immediately removed and the protective groups of the amino acid side chains are removed, which is achieved at a temperature of below 0 ° C. using hydrogen fluoride, 10% thioanisole being used as the rinsing agent. After the resin has been separated and washed three times with ethyl acetate or dry ester, the separated peptide is extracted with molar acetic acid. The acetic acid extract is then frozen and lyophilized to obtain a crude product which is dissolved in deionized water. This solution is then dialyzed thoroughly against deionized water, etc. over a period of 24 hours, the dialysing agent being changed at least 5 times and using a membrane with a molecular weight cut-off of 1200 daltons. The dialyzed solution is frozen and lyophilized to give a quantitative recovery of the product.

Das erhaltene Produkt wird immunologischen Tests und Abwägungen unterzogen, um sicherzustellen, daß ein genaues Abbild der ‘a'-Determinante tatsächlich gebildet wurde. Es kann auch eine elektronenmikroskopische Überprüfung einer wässerigen Lösung dieses Produktes vorgenommen werden, um nachzuweisen, daß Hepatitis B Oberflächenantigen ähnliche Partikel vorliegen.The product obtained is subjected to immunological tests and considerations to ensure that an exact image of the 'a' determinant has actually been formed. An electron microscopic examination of an aqueous solution of this product can also be carried out to demonstrate that particles similar to hepatitis B surface antigen are present.

Tabelle 1 zeigt, daß Antisera, die für drei bestimmte Subtypen von Hepatitis B Oberflächenantigen spezifisch sind, in der Lage sind, das Oligomere Peptid OS[124-147] in einem großen Ausmaß zu erkennen: allerdings sind weder die teilweise reduzierte trimere Form (TS[124-147]) noch das komplett reduzierte Monomere (MSP24-147]) in der Lage, dieses zu erkennen. Das zeigt deutlich, daß das Hepatitis B Oberflächenantigen bezogene Epitop durch das Peptid OS[124-147] wiedergegeben ist, die gruppenspezifische "a"-Determinante aufweist und daß die Antigenität Disulfidbrücken-abhängig ist.Table 1 shows that antisera, which are specific for three specific subtypes of hepatitis B surface antigen, are able to recognize the oligomeric peptide OS [124-147] to a large extent: however, neither the partially reduced trimeric form (TS [124-147]) the completely reduced monomer (MSP24-147]) was able to recognize this. This clearly shows that the hepatitis B surface antigen-related epitope is represented by the peptide OS [124-147], which has group-specific " a " determinants and that the antigenicity is dependent on disulfide bonds.

Es wurden dabei* HBsAg subtypspezifische Antisera (WHO Internationale Referenzstandard) für ihre Aktivität gegen die angeführten Peptide bei einer Verdünnung von 1 : 100 gescreent. Ein P/N Wert von größer als 2,0 wird als positiver Wert angenommen. 7 AT 000 625 Ul P/N ist das Postiv- (P) zu Negativ (N)-Verhältnis. P bedeutet den Absoiptionswert in einem ELISA-Test, der nach der Bindung des Antiköipers an OS und seinen abgeleiteten Peptiden oder HBsAg (d.h. für alle Testpeptide) erhalten wird. N bezeichnet den Absorptionswert, der bei gleicher Antikörperbindung für irgendein Peptid, d.h. eine Negativkontrolle, erhalten wird. P/N -Werte zeigen an, ob der Antikörper (z.B. anti-HsBAg) spezifisch mit den Testpeptidenbindet, im Gegensatz zu dem irrelevanten Peptid, das eine nichstspezifische Bindung ergibt. TABELLE 1HBsAg subtype-specific antisera (WHO international reference standard) were screened for their activity against the peptides mentioned at a dilution of 1: 100. A P / N value greater than 2.0 is assumed to be a positive value. 7 AT 000 625 Ul P / N is the positive (P) to negative (N) ratio. P means the absorption value in an ELISA test, which is obtained after the antibody has bound to OS and its derived peptides or HBsAg (i.e. for all test peptides). N denotes the absorption value which, for the same antibody binding, for any peptide, i.e. a negative control is obtained. P / N values indicate whether the antibody (e.g. anti-HsBAg) specifically binds to the test peptides, as opposed to the irrelevant peptide that results in non-specific binding. TABLE 1

Subtyp des Antiserums OS [124-147] P/N TSP24-147] MS[124-147] ad 64,5 3,2 0,3 ay 54,0 5,4 0,5 ar 47,8 4,3 0,6Antiserum subtype OS [124-147] P / N TSP24-147] MS [124-147] ad 64.5 3.2 0.3 ay 54.0 5.4 0.5 ar 47.8 4.3 0 , 6th

Um weiters das Potential des Peptids als eine Hepatitis B-Vaccine zu öbeiprüfen, wurden polygonale Kaninchenantisera, die gegen das Peptid OS[124-147] wirksam sind, auf ihre Kreuzreaktivität mit den internationalen Standard Hepatitis B-Oberflächenantigen Präparaten von sechs verschiedenen Subtypen gescreent.In order to further test the potential of the peptide as a hepatitis B vaccine, polygonal rabbit antisera, which are active against the peptide OS [124-147], were screened for their cross-reactivity with the international standard hepatitis B surface antigen preparations of six different subtypes.

Tabelle 2 zeigt die Resultate dieses Experiments, wobei ein paralleles Set von Versuchen mit polyclonalen Antihepatitis B-Oberflächenantigen Antisera als positive Kontrolle verwendet wurden. Antipeptid OSJ124-147] Antisera reagierten in vergleichbarem Ausmaß mit allen den sechs der getesteten Subtypen. Daraus ergibt sich, daß eine Immunisierung mit dem genannten Peptid OS [124-147] Antikörper produzieren wird, die in der Lage sind, alle Linien der Hepatitis B-Viren zu erkennen. Eine 1 : 500 Verdünnung von entweder Kaninchen Anti-OS [124-147] oder Pferdeanti-HBsAg wurden 8 AT 000 625 Ul für dieses Experiment verwendet. Die verschiedenen HBsAg-Subtypen, die verwendet wurden, sind in der Tabelle 2 angegegeben. 9 AT 000 625 Ul TABELLE 2Table 2 shows the results of this experiment using a parallel set of trials with polyclonal antihepatitis B surface antigen Antisera as a positive control. Antipeptide OSJ124-147] Antisera reacted to a comparable extent with all of the six of the subtypes tested. This means that immunization with the peptide OS [124-147] mentioned will produce antibodies which are able to recognize all lines of the hepatitis B virus. A 1: 500 dilution of either rabbit anti-OS [124-147] or horse anti-HBsAg, 8 AT 000 625 µl was used for this experiment. The different HBsAg subtypes that were used are given in Table 2. 9 AT 000 625 Ul TABLE 2

P/N HBsAg Subtyp mit Anti HBsAg mit Anti-OS[124-147] adw 10,6 6,3 ayw 18,2 4,7 ayr 5,9 4,7 ayw2 8,6 5,4 a2dw 12,2 6,7 adw2 9,9 7,9P / N HBsAg subtype with anti HBsAg with anti-OS [124-147] adw 10.6 6.3 ayw 18.2 4.7 ayr 5.9 4.7 ayw2 8.6 5.4 a2dw 12.2 6 .7 adw2 9.9 7.9

Tabelle 3 zeigt die Immunogenität von mit Myristilsäure versetztem Peptid OSP24-147] in Alaun. Die in der Tabelle angegebenen Antipeptidtiter wurden nach einer ersten Immunisieirung, welche von einer Auffrischungsdose, die 4 Wochen später gegeben wird, gefolgt wurde, erhalten. Die Peptide, die an Alaun adsorbiert waren, sind als Immunogen verwendet worden, wobei die Dosis entweder 20 μξ pro Maus oder 200 /zg pro Kaninchen war.Table 3 shows the immunogenicity of myristilic acid-added peptide OSP24-147] in alum. The antipeptide titers shown in the table were obtained after an initial immunization followed by a booster dose given 4 weeks later. The peptides adsorbed on alum have been used as immunogen, the dose being either 20 μξ per mouse or 200 / zg per rabbit.

Wirt Linie Mäuse Balb/c C57 Bl/6 Kaninchen NZW TABELLE 3Host line mice Balb / c C57 Bl / 6 rabbits NZW TABLE 3

Nr. Anti-OS [124-147] (1/Titer) 1300 2500 1 8270 2 7970 3 20.800 10 AT 000 625 UlNo. Anti-OS [124-147] (1 / titer) 1300 2500 1 8270 2 7970 3 20.800 10 AT 000 625 Ul

Tabelle 4 zeigt die Immunogenität von myristylisiertem Peptid OSp24-147] in Alaun am Rhesusaffen. Die Antipeptidtiter wurden nach einer ersten Immunisierung, welcher 1 Monat später eine Auffrischungsimpfung folgte, erhalten. TABELLE 4 Affe Nr. Immunogen Dosis Anti-OS [124-147] 0*g) (1/Titer) 1757 Vaccine 20 7200 745 OS [124-147] 50 7200 1442 OSP24-147] 250 17.000 1109 OSP24-I47] 500 95.000Table 4 shows the immunogenicity of myristylated peptide OSp24-147] in alum on the rhesus monkey. Antipeptide titers were obtained after an initial immunization followed by a booster 1 month later. TABLE 4 Monkey No. Immunogen Dose Anti-OS [124-147] 0 * g) (1 / titer) 1757 Vaccine 20 7200 745 OS [124-147] 50 7200 1442 OSP24-147] 250 17,000 1109 OSP24-I47] 500 95,000

Fig. 1 zeigt die Primärsequenz des Peptids OS[124-147] (Subtyp adw). Dazu wird der Einlettercode für die Aminosäuren benützt.Fig. 1 shows the primary sequence of the peptide OS [124-147] (subtype adw). The entry code for the amino acids is used for this.

Fig. 2 gibt eine Polyamidgelelektrophorese des Peptides OS[124-147] und TS[124-147] wieder. Für diese Probe wurden 2 Mikrogramm von jedem Peptid in gleichem Volumen von mercaptoethanolfreiem Probepuffer gelöst und auf ein 18%iges Polyacrylamidgel aufgegeben. Die Sichtbarmachung erfolgte mit Silberfärbung. In der Figur zeigt die Linie 1 den Molekulargewichtsmarker, die Linie 2 das Peptid OSp24-147] und die Linie 3 das Peptid TS [124-147].2 shows a polyamide gel electrophoresis of the peptides OS [124-147] and TS [124-147]. For this sample, 2 micrograms of each peptide were dissolved in the same volume of mercaptoethanol-free sample buffer and applied to an 18% polyacrylamide gel. The visualization was done with silver staining. In the figure, line 1 shows the molecular weight marker, line 2 the peptide OSp24-147] and line 3 the peptide TS [124-147].

Fig. 3 gibt wieder, inwieweit ein Polyclonal-Anti HBsAg Antiserum das Peptid OS[124-147] erkennt, nicht jedoch das Peptid TS[124-147J oder das Peptid MS[124-147], Die Proben wurden in einem ELISA-Assay ausgeführt. Die Daten werden als P/N Verhältnisse wiedergegeben, wobei N die Absorbierung bedeutet, die mit einem irrelevanten Peptid erhalten werden. 11 AT 000 625 Ul3 shows the extent to which a polyclonal anti HBsAg antiserum recognizes the peptide OS [124-147], but not the peptide TS [124-147J or the peptide MS [124-147]. The samples were analyzed in an ELISA assay executed. The data are presented as P / N ratios, where N is the absorption obtained with an irrelevant peptide. 11 AT 000 625 ul

Fig. 4 veranschaulicht die Titrationsprofile von polyclonalen Anti-OS[124-147] Sera gegen HBsAg und Peptid.Figure 4 illustrates the titration profiles of polyclonal anti-OS [124-147] sera against HBsAg and peptide.

Maus (A) oder Kaninchen (B) Antipeptid-Antisera wurden gegen Peptid OS[124-147] (o) oder natives HBsAg(o) in dem ELISA-Assay wiedergegeben. Die Daten wurden als P/N Verhältnisse angegeben, wobei N die Absorption bedeutet, welche mit einer 1 : 100 Verdünnung eines Preimmunserums gegen das entsprechende Antigen erhalten ist.Mouse (A) or rabbit (B) antipeptide antisera were expressed against peptide OS [124-147] (o) or native HBsAg (o) in the ELISA assay. The data were reported as P / N ratios, where N is the absorption obtained with a 1: 100 dilution of a preimmune serum against the corresponding antigen.

Fig. 5 gibt Anti-OS[124-147] Antikörper, die mit Danepartikel präzipitiert sind, wieder. Dabei wurden gereinigte Dane Partikel einer Immunpräzipitation entweder mit Kaninchen-Präimmunserum (Reihe a) oder Kaninchen Polyklonal-anti OS[124-147] Serum (Reihe 6) unterworfen. Die im Überstand (oben) enthaltene HBV-DNA bzw. das Protein A Pellet (Boden) wurde durch Tüpfelhybridisierung nachgewiesen.Figure 5 shows anti-OS [124-147] antibodies precipitated with Daneparticle. Purified Dane particles were subjected to immunoprecipitation with either rabbit preimmune serum (row a) or rabbit polyclonal-anti OS [124-147] serum (row 6). The HBV-DNA contained in the supernatant (above) or the protein A pellet (soil) was detected by spot hybridization.

Fig. 6 zeigt das Peptid OS[124-147] und seine Analogen. Die Stellen, wo entweder einzelne Aminosäuren weggelassen, substituiert oder modifiziert sind, wurden unterstrichen.Figure 6 shows the peptide OS [124-147] and its analogs. The places where either individual amino acids are omitted, substituted or modified have been underlined.

Fig. 7 veranschaulicht die Identifikation der Aminosäurereste, die in einem Anti-ay Bindungsassay verwendet werden. Das Peptid OS[124-147] und seine Analoge wurden separat in die Vertiefungen einer ELISA-Platte aufgebracht und die Reaktivität mit Meerschweinchen-Anti HBsAg (ay) mit einer Endverdünnung von 1 : 200 bestimmt. Die relative Antigenität (RA) gibt das Verhältnis der Absorption wieder, die für ein bestimmtes Analog gegenüber jenem von dem Grundpeptid nach Abzug des Hintergrundes erhalten wird.Figure 7 illustrates the identification of the amino acid residues used in an anti-ay binding assay. The peptide OS [124-147] and its analogs were applied separately to the wells of an ELISA plate and the reactivity with guinea pig anti HBsAg (ay) was determined at a final dilution of 1: 200. The relative antigenicity (RA) represents the ratio of the absorption obtained for a given analogue versus that of the base peptide after subtracting the background.

Fig. 8 zeigt die Identifizierung von menschlichen Anti-HBsAg Antiköiper-Bindungsresten an Peptid OS [124-147]. Die kumulativen Resultate für 50 unabhängige Sera werden hier als Prozent der Gesamtanzahl von Proben wiedergegeben, welche die Reaktivität mit den Analogen relativ zum Stammpeptid OS[124-147] zeigen.Figure 8 shows the identification of human anti-HBsAg antibody binding residues on peptide OS [124-147]. The cumulative results for 50 independent sera are shown here as a percentage of the total number of samples which show the reactivity with the analogs relative to the parent peptide OS [124-147].

Fig. 9 gibt das Sucrose-Dichte-Gradientenprofil von mit Myristilsäure versetztem Peptid OS [124-147] wieder. 200 μ* von mit Myristilsäure versetztem Peptid OS[124-147] in 100 μϊ wurden auf eine 10-30 % Sucrosegradientlösung aufgebracht und 20 h mittels eines SF50.1 Rotors zentrifugiert. Am Ende wurden die Fraktionen gesammelt und der Prozentsatz an Sucrose 12 AT 000 625 Ul in jeder Fraktion durch Refraktometrie bestimmt. Der Anteil von Peptid, der in jeder Fraktion enthalten war, wurde durch Ninhydrintest bestimmt. Es ist dabei wesentlich, daß alle Peptide in die Gradientenlösung eingedrungen sind, wobei die Mehrheit bis am Boden abgesetzt wurde.9 shows the sucrose density gradient profile of peptide OS [124-147] mixed with myristic acid. 200 μ * of myristilic acid-added peptide OS [124-147] in 100 μϊ were applied to a 10-30% sucrose gradient solution and centrifuged for 20 h using an SF50.1 rotor. At the end the fractions were collected and the percentage of sucrose 12 AT 000 625 ul in each fraction was determined by refractometry. The proportion of peptide contained in each fraction was determined by ninhydrin test. It is essential that all peptides have penetrated the gradient solution, the majority being deposited to the bottom.

Fig. 10 gibt die primären Sequenzen von individuellen Komponenten Peptiden des Peptids OS[D/N-ayr] wieder, also von einem Copolymer aus zwei verschiedenen Peptiden, nämlich der Peptide OS[D/N] und OS [ayr], welche zusammen das angeführte Komponentenpeptid bilden.FIG. 10 shows the primary sequences of individual components peptides of the peptide OS [D / N-ayr], that is to say of a copolymer of two different peptides, namely the peptides OS [D / N] and OS [ayr], which together form the Form listed component peptide.

Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß ein synthetisches Peptid gefunden wurde, welches die Sequenz zwischen den Resten 124-147 des Hepatitis B-Oberflächenantigens aufweist und sofort oligomerisiert, um ein konformes disulfid- und oligomeräbhängiges gruppenspezifisches oder ’a'Antigen Determinante des Hepatitis B Oberflächenantigens zu bilden. Eine Antigen Determinante ist eine Sequenz oder Struktur, die Antikörper erkennt. Daher ist eine Antigen Determinante des Hepatitis B Oberflächen Antigens jener Teil der Proteinsequenz, der tatsächlich durch die Antikörper bei Immunisierung oder Infektion mit HBV auftritt, erkannt wird. Die gruppenspezifische oder 'a'-Determinante sind jene antigenen Determinanten, die üblicherweise auf allen Stämmen des Virus (z.B. verschiedene Stämme von HBV oder HIV) vorhanden sind Im Falle von Hepatitis B sind diese gruppenspezifischen Determinanten als 'a'-Determinanten bekannt. Weiters wurde gezeigt, daß das Peptid OS [124-147] das korrespondierende Epitop des nativen Antigens mit hoher Präzision vortäuscht und einen dominanten Bestandteil des Epitops des Hepatitis B Oberflächenantigens bildet, wenn es in einem menschlichen Immunsystem eingebracht ist. Das Peptid OS [124-147] ist immunogen, sowohl in Mäusen als auch in Kaninchen und die gegen dieses Peptid gebildeten Antikörper sind in der Lage, eine Vielzahl von Hepatitis B Oberflächenantigen-Subtypen zu erkennen.In summary, it can be stated that a synthetic peptide was found which has the sequence between residues 124-147 of the hepatitis B surface antigen and immediately oligomerizes to provide a conformal disulfide and oligomer dependent group-specific or 'a' antigen determinant of the hepatitis B surface antigen form. An antigen determinant is a sequence or structure that recognizes antibodies. Therefore, an antigen determinant of the hepatitis B surface antigen is that part of the protein sequence that is actually recognized by the antibodies when immunized or infected with HBV. The group-specific or 'a' determinant are those antigenic determinants that are usually present on all strains of the virus (e.g. different strains of HBV or HIV). In the case of hepatitis B, these group-specific determinants are known as 'a' determinants. Furthermore, it was shown that the peptide OS [124-147] simulates the corresponding epitope of the native antigen with high precision and forms a dominant component of the epitope of the hepatitis B surface antigen when it is introduced into a human immune system. The peptide OS [124-147] is immunogenic, both in mice and in rabbits, and the antibodies raised against this peptide are able to recognize a large number of hepatitis B surface antigen subtypes.

Schließlich formt das Peptid LOS [124-147] sphärische und tubuläre Aggregate in wässerigen Lösungen, die an die native Hepatitis B Oberflächenantigen-Teilchen erinnern.Finally, the peptide LOS [124-147] forms spherical and tubular aggregates in aqueous solutions that are reminiscent of the native hepatitis B surface antigen particles.

Solcherart repräsentiert das Peptid OS[124-127] eine antigenische und strukturelle Vortäuschung von Hepatitis B Oberflächenantigen und. stellt ein Kandidat Vaccine für Hepatitis B dar, also ein Molekül, das potentiel als Vaccine verwendet werden kann. 13In this way the peptide OS [124-127] represents an antigenic and structural simulation of hepatitis B surface antigen and. is a candidate vaccine for hepatitis B, a molecule that can potentially be used as a vaccine. 13

Claims

AT 000 625 Ul Claims: 1. Peptide which shows cross-reactivity with anti-hepatitis B surface antigen (HBsAg) antiserum and which has the 'a' epitope of HBsAg, characterized in that it is an oligomer of the amino acid sequence CTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNC or its analogs and homologues, preferably with a molecular weight of 8-35 kDA.

2. Peptide according to claim 1, characterized in that the analogs or homologues have the following amino acid sequences. Analogs of the peptide OS [124-147] (subtype adw) Peotid Seauenz OS CTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNC OS Δ A > “CTTPAQGNSMFPSCCCTKPTD gtC OSAQ CTTPA.GNSMFPSCCCTKPTDGNC OS [Nl3I— > A] CTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNC 0S [M133-Ox) (0) f CTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNC 0S [P135— > A] CTTPAQGNSMFASCCCTKPTDGNC 14 AT 000 625 Ul OS [A] - OS > 2 >; a] OS [Dw - > N] CTTPAQGNSMFPACCCTKPTDGNC (Mt) t CTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDCNC CTTPAQGNSMFPSCCCTKATDGNC CTTPAQGNSMFPSCCCTKPTÜGNC

3. Peptide according to claim 1 or 2, characterized in that the 'a' epitope is determined by the amino acids methionine at position 133 and lysine at position 141.

4. Peptide according to one of claims 1 to 3, characterized in that the 'a' epitope has 144 aspartic acid as amino acid at the site.

5. Peptide according to one of claims 1 to 4, characterized in that the peptide has, in addition to the ‘a’ epitope, additional epitopes of HBsAg, in particular the ‘d’ and / or ’y’ epitope.

6. Vaccine against hepatitis B, characterized in that it contains a peptide according to one of claims 1 to 5, together with alum as an adjuvant, a myristic acid residue being added to the amino terminus of the peptide.

7. Use of the peptide according to one of claims 1 to 5 as a reagent in the diagnosis of hepatitis B virus infection. 15