JPS61258000A - ＨＢｓ抗原の免疫産生特性を有しＨＢｓ抗原により担持されたエピト−プに外来の抗原部位を担持する粒子及びかかる粒子産生用のベクタ−と動物細胞及びかかる粒子を含有する混合ワクチン産生用組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、多くの場合少なくとも大部分が実質的に球形
を成すポリペプチド粒子に係る。これら粒子は、Ｂ型ウ
イルス性肝炎のウィルスの表面抗原（しばしばｌｌＢｓ
Ａｇと略称され、より簡単にＨＢｓとも指称される）に
特有の免疫原性及び免疫特性を有しており、更に、通常
はＢ型肝炎ウィルスのＳ遺伝子によりコードされるポリ
ペプチドに外来のペプチド配列を少なくとも１つ含、む
。本発明は更に、上記種類のポリペプチド粒子を培地中
に分泌し得る組換体ＤＮＡ及び好ましくは動物由来の真
核細胞系に係る。

先ず、Ｂ型肝炎ウィルス（）ＩＢＶ）の慢性保菌者の血
清が、直径２２ｎｍの粒子又はフィラメントの形態の中
空ウィルスエンベロープを含み時には４２ｎｍの球形分
子の形態の完全感染ピリオンを含むことは周知であろう
。

中空エンベロープは慢性ウィルス保菌者の血清から精製
されＢ型肝炎のワクチンの製造に使用される。現在では
、別の方法を用い２２ｎｍの粒子を多量に採取すること
も可能である。粒子の主要タンバクをコードする遺伝子
（Ｓ遺伝子）の遺伝子操作によって、培養細胞系での該
粒子の産生（エム・エフ・デュボワ（Ｍ、Ｆ、Ｄｕｂｏ
ｉｓ）等（１９８０）、プロシーディンゲス・オブ・ナ
ショナル・アカデミツク・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）、米国、７７．４５４９−
４５５３）、酵母中での産生（ピー・バレンズエラ（Ｐ
４ａｌｅｎｚｕｅｌａ）等（１９８２）、ネイチュアー
（Ｎａｔｕｒｅ）、２９８．３４７−３５０）又は組換
体ウィルスによる産生（ジー・エル・スミス（Ｇ、Ｌ、
Ｓ＋ｎ１ｔｈ）等（ｔ９ｓａ）、ネイチュアー、３０２
．４９０−４９５）が可能になった。これら粒子の産生
方法の１つによれば、有効なプロモータの支配下でＳ遺
伝子を含む適当なベクターによって真核細胞を形質転換
し、形質転換細胞を培養し、予め溶解された細胞から又
は使用細胞系（例えばＶＥＲＯ型のサルの細胞）によっ
ては内部に粒子が分泌された細胞培地から産生粒子を回
収する。

これら粒子の構成に含まれるＳ遺伝子でコードされる主
要ポリペプチドは、２２６個のアミノ酸から構成され分
子、ｉ２５，４００ドルトンである。また、構成ポリペ
プチド中の幾つかの天然粒子が３４，０００ドルトンの
オーダの高い分子里をもつポリペプチドから成り、該ポ
リペプチドが前記主要ポリペプチドのポリペプチド配列
を含み、主要ポリペプチドと同じＣ末端を有し、更にＮ
末端の位置に５５個のアミノ酸から成る付加配列をもち
（エックス・スティップ（Ｘ、Ｓｔ　１ｂｂｅ）及びダ
ブリュー・エッチ・ゲルリッヒ（Ｗ、Ｈ，Ｇｅｒｌｉｃ
ｈ）等（１９８３）、ジャーナル・オブ・ヴイロロジイ
Ｕ、Ｖｉｒｏ１ｏｇｙ）、４６．６２Ｂ−６２８）。

Ｉこの付加配列がＢ型肝炎のゲノムのプレーＳ領域によ
ってコードされていることも判明した。Ｎ末端位置のこ
の付加配列は天然粒子においては極めて安定な様子では
なく従ってＨＢｓ粒子の構成及び凝集に重要な機能を果
たすようには見えない。ＨＢｓ粒子は公知の如く、タン
パク分解酵素に敏感でなく約１００個の前記主要ポリペ
プチドとその他の構成成分特に脂質成分とを含む有機集
合体から構成される。面記付加配列を含むより安定な粒
子を形成ポリペプチド総量の３５％に達し得る顕著な割
合で含む組成物を得る方法が最近公表された（エム・エ
ル・ミンエル（Ｍ、Ｌ、Ｍｉｃｈｅｌ）等（１９８４）
、プａ’）−ディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ
ツク・サイエンス、米国、８１．７７０８−７７１２）
。該方法は、真核細胞系特にヒト又は動物の培養細胞を
使用する。該細胞は、Ｂ型ウイルス性肝炎のウィルスの
ゲノムのＳ領域及びプレーＳ領域をコードするＤＮＡ配
列を内部に含むベクターによって外来性プロモータの直
接コントロール下で予め形質転換されている。使用され
るプロモータは、前記ベクターが組み込まれる真核細胞
特にヒト又は動物の細胞中で直接コントロール下の遺伝
子の転写を有効に開始させ得る能力を持つことがわかっ
ている。

前記ＤＮＡ配列に関しては、例えばギャリベール（Ｇａ
−１ｉｂｅｒｔ）等（１９７９）、ネイチュアー、２８
１巻、６４６−６５０ページの論文を参照するとよい。

使用される細胞系がサル由来の場合、ＳＶ４０ウィルス
由来のプロモータの使用が有利である。該プロモータが
サルの細胞中で隣接遺伝子の転写を有効に開始させる能
力を有することは公知である。

好ましくは、該プロモータがＳＶ４０ウィルスの「初期
」プロモータに対応する。このプロモータは通常は／Ｊ
％　Ｔ抗原（ｓｍａｌｌ　Ｔ　ａｎｔｉｇｅｎ）及び大
Ｔ抗原（ｌａｒｇｅ　Ｔａｎｔ　ｉｇｅｎ）の発現をコ
ントロールする。

Ｂ型肝炎ウィルスのエンベロープのポリペプチドのＮ末
端には天然の変異性があるので、このことから前記付加
配列の別々のタンパク断片が該Ｎ末端に置換し得、面記
主要ポリペプチドと融合し得ることは既に予想されてい
た。例えばバレンズエラ等は形質転換酵母中でハイブリ
ッドタンパクから形成された粒子を産生じた。該ハイブ
リッドタンパクは主として、前記主要タンパクのＮ末端
がヘルペスウィルスのＤグリコプロｉイシから得　　　
　□られた約１００個のアミノ酸を含む付加ボリペプチ
ドによって修飾されることによって構成される。

バレンズエラ等の報告によれば、この形質転換粒子はＢ
型肝炎ウィルスとヘルペスウィルスとの双方に対する抗
体を誘発し得る（ピー・バレンズエラ等（１９８２）、
ネイチュアー、２９８．３４７−３５０及びピー・バレ
ンズエラ等（１９８４）、酵母遺伝学及び分子生物学に
関する第１２回国際会議報告、ニシンバラ、（１９８４
）、】６）。

本発明の目的は、ＨＢｓ抗原の基本免疫原性を有してお
り更に好ましくは同じく免疫原性の別のペプチド配列を
１つ以上育するポリペプチド粒子、換言すれば、最適安
定度をもつ混合ワクチンの構成に使用され得るポリペプ
チド粒子を提供することであり、ＨＢｓ抗原の主要ポリ
ペプチド自体又は好ましくは主要グリコプロティン自体
が合成されるには常に前記別のペプチド配列の存在が必
要でありしかもこの別のペプチド配列の存在がＢ型肝炎
ウィルスのエンベロープの抗原に特有の特定構造に影響
を与えないことを特徴とする。

本発明の目的は更に、通常はＢ型肝炎ウィルスのゲノム
のプレーＳ領域によりコードされる付加配列を場合によ
っては含む前記タイプの粒子を提供することである。該
付加配列は、通常は、原形（ｉｎｔａｃｔ）状態である
が例えばバレンズエラ等の方法で修飾されることも勿論
可能である。但し、付加配列の原特性が維持されると、
本発明の修飾ポリペプチドにおいて免疫産生性の増進が
生じる。

本発明の粒子は、ＨＢｓ抗原の主要ポリペプチド特有の
アミノ酸配列を粒子がＨＢｓ抗原特有の構造を維持する
ために十分な割合で含んでおり、該粒゛子の特徴は主要
ポリペプチドが該主要ポリペプチドに外来のアミノ酸配
列を少なくとも１つ取り込んでいること、好ましくは主
要ポリペプチドの内部自体特に通常は前記粒子の外面に
露出した親水性領域の１つに免疫原部位のキャリヤーた
るアミノ酸を取り込んでいること、又は変形例として親
水性領域に属する１つ以上のアミノ酸が前記外来アミノ
酸配列によって置換されていることである。

特に外来アミノ酸配列は、ピー・チオレ（Ｐ、Ｔｉｏ−
１１ａｉｓ）等（１９８１）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ）、２１３巻、４０６−４１１ページの論文に示さ
れた以下の一般式をもつ主要ポリペプチドのアミノ酸３
２〜７４又はアミノ酸１１０〜１５６の領域の１つに挿
入され得る。

主要ペプチドの式の変異が生じ易いことも公知である。

特に構成アミノ酸の変異は、バレンズエラ等（１９８０
）（ｒ動物ウィルス遺伝学（Ａｎｔｍａｌ　Ｖｉｒｕｓ
Ｇｅｎｅｔ　１ｃｓ）　Ｊ及びビー・フィールズ（Ｂ、
Ｆｉｅｌｄｓ）、アール・ジャニッシｘ　（Ｒｌａｅｎ
ｉｓｃｈ）、シー・エフ・フォックス（Ｃ，Ｐ、Ｆｏｘ
）ｌ、アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒ
ｅｓｓ）、ニューＯヨーク、５７ページ）による観察で
は前記一般式の主要ラインより上方に存在し、パセック
（Ｐａｓｅｋ）等（ネイチュアー、（ロンドン）、２８
２．５７５（１９７９））による観察では前記主要ライ
ンの下方に存在する。

従ってより詳細には本発明は、実質的に球形のポリペプ
チド粒子を含有する（又はこれら粒子から形成される）
こと、該粒子の（全部でなくても）少なくとも大部分り
月ｌＢｓＡｇ抗原に特有の免疫特性又は免疫原性をらっ
こと、粒子のサイズが１８〜２５ｎｍ特に２０〜２２ｎ
ｍでありＣｓＣｌベースの濃度勾配で濃度１．２０〜１
．２２ｇ／ｍｉ）のゾーンで単離できる濃度をもちゾー
ン粒子とＨＢｃをも含めてｌｌＢｅ抗原が全く存在しな
い総純度レベルをもつこと、特に前記条件下で粒子中に
前記外来配列が存在することを特徴とするワクチン製造
用組成物を提供することである。

上記のごとく主要ポリペプチドの内部に挿入され得る外
来配列のサイズはかなりの程度に変更することが可能で
ある。例えば１００個又はそれ以上のアミノ酸を含むア
ミノ酸配列を導入し得る。しかし乍ら、外来ペプチド配
列のサイズがアミノ酸１６個より大きくないこと特に５
〜１６個例えば６〜１３個であるのが有利であり、特に
主要ポリペプチドに挿入される場合には主要ポリペプチ
ドから実質的に等しい数のアミノ酸を除去しないで挿入
できるのが有利である。即ち本発明によって得られる顕
著な結果は、本発明の修飾ポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列を含む適当なベクターによって予め形質転換さ
れた細胞を用いると本発明の修飾粒子が細胞系中に分泌
され得ることである。

従って本発明は勿論、上記粒子の組成に含まれろ前記修
飾ポリペプチドをコードするＤＮＡ組換体に係る。これ
らＤＮＡ組換体及び好ましくはこれら組換体を含み且つ
Ｓ領域をコードするＤＮＡ配列を含み場合によってはＢ
型ウイルス性肝炎のウィルスのゲノムのプレーＳ領域を
含むベクターの特徴は、前記主要ポリペプチドの親水性
領域に対応するＳ領域のゾーンの少なくとも１つにおい
て前記ＤＮＡ配列が前記外来配列をコードする少なくと
も１つのヌクレオチド配列によって局部的に修飾されて
いること、及び、Ｓ領域及び場合によってはプレーＳ領
域が組換体ＤＮＡ内部で外来性プロモータの直接コント
ロール下に維持され該プロモータについては、ベクター
が組み込まれる真核細胞特にヒトもしくは動物の真核細
胞中又は酵母中で直接コントロール下の遺伝子の転写を
有効に開始させる能力を持つことが既知であることであ
る。

使用される外来性プロモータは、通常はＢ型肝炎ウィル
スのゲノムのＳ遺伝子及びプレーＳ遺伝子に結合する「
内因性」プロモータとは異なっており即ち外来プロモー
タである。これら細胞がサル由来のとき、前記の如きＳ
Ｖ４０ウィルス由来のプロモータの使用が有利である。

本発明は上記特定プロモータの使用に限定はされない。

但し、ＨＢｓ抗原とｐ）ＩｓＡの受容体とに特有の本発
明のハイブリッドポリペプチドを形質転換細胞から産生
じ使用培地中に分泌させるには上記プロモータが特に有
利な結果を与える。また、例えば（タンパクＶＰＩ、　
ＶＰ２及びＶＰ３の発現をコントロールする）ＳＶ４０
の後期プロモータの使用も可能である。これらのプロモ
ータと種々の関連抗原をコードする遺伝子との相対位置
を知るためにはＳＶ４０ウィルスの制限マツプを参照す
るとよい。（プレー・トウーズ（Ｊ、Ｔｏｏｚｅ）編、
ＤＮＡ腫瘍ウィルス（ＤＮＡＴｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅ
ｓ）、コールド・スプリング拳ノ＼−ノく−・ラボラト
リイ、コールド・スプリング・ハーバ−、ニュー・ヨー
ク、１９８０．２〜５章）。

ＳＶ４０プロモータの代イつりに別のプロモータを使用
することら勿論可能である。但し、これらプロモータは
、前記Ｓ領域及び場合によってはプレーＳ領域をコード
する前記配列の使用細胞系への転写がプロモータのコン
トロール下で促進され、これら配列が該プロモータと共
に受容細胞のゲノムに取り込まれるようにする能力及び
／又はこのように形質転換された受容細胞がかなりの量
の本発明のハイブリッドポリペプチドを合成及び分泌で
きるようにする能力を持つこと又はもち得ることが知見
され、このように獲得した能力をこれら細胞由来の後続
世代に継承させるプロモータでなければならない。

本発明による細胞系が獲得した前記ポリペプチド合成特
性が少なくとも１０世代に４つたって各世代に継承され
たとき、前記形質転換細胞系が「安定」であるといって
よい。

使用可能な別のプロモータの例として、ポリオームの初
期プロモータ、種々のレトロウィルスのＬＴＲプロモー
タ又はアデノウィルスのＥＡプロモータがありまた又は
細胞由来の遺伝子の有効なプロモータがある。

公知のごとく、オリジンウィルスのゲノムから採取され
たプロモータは、好ましくは活性「配列」を伴っており
該活性配列は通常（そのコントロール下に正常に配置さ
れた遺伝子配列の転写方向に関して）プロモータに先行
している。活性配列の例は、サイエンス、１９８３．２
１９巻、６２６〜６３１ページ及びネイチャー、１９８
２．２９５巻、５６８〜５７２ページの論文を参照する
とよい。

好ましくは、前記Ｓ領域及びプレーＳ領域をコードする
前記ＤＩＩＡ配列が、プロモータとプレーＳ又はＳ配列
を正常に転写し得る活性配列とから成るＤＮＡ断片の直
後に配置されている。前記断片は特に、使用されるプロ
モータと活性配列とのタイプに応じて３００〜４００塩
基対を含む。

本発明は更に、前記の如きベクターによって形質転換さ
れ同じく前記の如き免疫原粒子を培地中に分泌し得る細
胞系に係る。

本発明の好ましい細胞系は、哺乳類の細胞特にＣＨＯま
たはＶＥＲＯ細胞から形成される。

本発明は更に、培養維持が可能なかかる細胞系の産生方
法に係る。該方法は、前記の如きベクターによる細胞系
の形質転換と本発明のハイブリッドタンパクをコードす
る配列を発現する培地の単離とを含む。

本発明の付加的特徴は本発明の基本原理を示す構造の具
体例を示す添付図面に基づく以下の記載より明らかにさ
れるであろう。

このプラスミドは（第１図）、 一天然ボリアデニル化部位（ＳＬＬＩ　Ｉ　（４３）〜
Ｂｇｌｌｌ（１９８４）断片）をらちＢａｍ１ｌ　ｌ　
（１４００）部位がＫｌｅｎｏｗ酵素による修復によっ
て除去されたＳ遺伝子をコードする部分（ビー・ンヤル
ネ（Ｐ、　Ｃｈａｒｎａｙ）等、１９７９ンと、 −ＳＶ４０の初期プロモータ（ＳＶ４０ウィルスのＰｖ
ｕ　ＩＩ（２５０）部位〜ＨｔｎｄＩ［Ｉ　（５１５４
）部位断片）の支配下にあるプロモータを伴わないＳ遺
伝子と、 −Ｉ）ＭＬ２（エム・ラスキ（Ｍ、Ｌｕ５ｋｙ）及びエ
ム・ボヅチャン（Ｍ、Ｂｏｔｃｈａｎ）、１９８１）の
大断片ＢａｍＨＩ　（３７５）　〜Ｓａｌ　ｌ　（６５
０）とを含む。

Ｓ遺伝子の断片は、ＢｇｌＩＩ末端の処でプラスミドｐ
ＭＬ２のＢａｍＨＩ末端に結合されている（ＢｇｌＩＩ
末端とＢａｍＨＩ末端とは互いｌに適合する）。逆にＳ
ｔｕ　Ｉ末端の処ではＳ遺伝子の断片は前記プロモータ
を含む５Ｙ４０ウイルスの断片の旧ｎｄｌ［Ｉ末端と結
合するために化学合成された旧ｎｄ１１１部位を含むヌ
クレオチド結合配列（リンカ−）によって修飾されてい
る。

最後にプラスミドｐＭＬ２から得られた断片の５ａｌＩ
末端は結合以萌にＳＶ４０ウィルス断片のＰｖｕＩ［（
平滑末端）で修復されている。

プ５　スミＦｌ）’ＬＡＳ　ｒ及Ｕ　ｐＬＡＳ　ＩＩこ
れらの２つのプラスミドは、ｐｓＫｓ１０４（シャピロ
（Ｓｈａｐｉｒｏ）等、１９８３）から得られた２４塩
基対のＤＮＡの１つ又は２つのＢａｍ１ｌｌ断片をプラ
スミド１）ＬＡＳの唯１つのＢａｍ１ｌ　Ｉ　（４８８
）部位に導入してプラスミドｐＬＡＳから得られる。Ｓ
遺伝子に挿入されて読み取りフェーズを変化させない８
個のアミノ酸をコードする２４個のヌクレオチドから成
るこの断片は制限酵素Ｐｓｔｌの１つの切断部位と制限
酵素旧ｎｄＩＩの２つの切断部位（Ｓａｌ　Ｉ　５Ａｃ
ｅ　Ｉ　）とを含む。

実施例［ 【 ＬＭＴＫ−細胞（クローンｌＤ、ｌＯ％の子ウシ血清と
４ｍＭのグルタミンとを加えたダルベツコ改質イーグル
培地（ＤＭＥＭ培地）で培養したチミジンキナーゼ欠失
のクローンＬ９２９から得られたマウスの細胞）を３種
のベクター（ｐＬＡＳ、　ｐＬＡＳＩ、ｐＬＡＳ　ＩＩ
　）のＤＮＡとネオマイシン耐性のアミノグリコンド−
３°−ホスホトランスフェラーゼＡＰ１１３’の遺伝子
（コルペール・ギャラパン（Ｃｏｌｂｅｒｔ−Ｇａｒａ
ｐｉｎ）等、１９８１）を含むプラスミドｐＷのＤＮＡ
とによってコトランスフェクトした（ウィグラー（Ｗｉ
ｇｌｅｒ）等、１９７９によって修正されたグラハム（
Ｇｒａｈａｍ）及びヴアン・デル・ニブ（Ｖａｎ　ｄｅ
ｒＥｂ）、１９７３の方法）。酵素Ａ　Ｐ　ＩＩ　３　
’を発現するトランスフェクト細胞を４００　ｌ！ｇ／
ｍｆｌのアミノグリコシドＧ４１８（コルペール・ギャ
ラパン等、１９８．１）の存在中で選択した。この選択
から得られたクローンについてＨＢｓタンパクの産生を
試験した。即ち、第１プラスミドのＤＮＡｌ０１１ｇと
プラスミドｐＷのＤＮＡ２μｇとを用いて５．１０５の
細胞ＬＭＴＫ−をコトランスフェクトした。

トランスフェクションの４日後に選択的Ｇ４１８培地を
加えた。

発生した生育可能なりローンを単離し培養し培地中での
ｌ１Ｂｓ抗原の産生能力を試験した。ラジオイムノテス
トＡＵＳＲＩＡ　ＩＩ　（アボット（Ａｂｏｔｔ）実験
所）を用いＨＢｓＡｇの存在を検出した。陽性のレスポ
ンスを与えた細胞クローンのうちでプラスミドｐＬＡＳ
。

ｐＬＡＳ　Ｉ　、ｐＬＡｓｆｆに対応する３つのクロー
ン（ＬＡＳ、　ＬＡＳ　Ｉ　５ＬＡＳＩＩ　）を特性決
定のために選択した。

培地中で検出された細胞クローン粒子の特性決定クロー
ンがコンフルエンスに達すると、細胞の栄養培地を交換
し４８時間沈澱させた。次に上滑を２００Ｏｒｐｍで清
澄化し遠心して粒子を沈降させた（スミス（Ｓｍｉｔｈ
）等、１９８３）。沈澱物をバッファに入れＣｓＣ１勾
配で沈澱させ遠心し収集して両分をＲ，１，Ａ（モリア
ーティ（Ｍｏｒｉａｒｔｙ）等、１９８１）で試験した
。修飾されたタンパクと非修飾タンパクとのＨＢｓＡｇ
活性が血清の精製粒子の濃度（ピロット（Ｐｉｌｌｏｔ
）等、１９８４）と同様の濃度１．１８〜１．２４ｙ／
ｃｍ’の間に唯１っのピークとして濃縮された。部分サ
ンプルをショ糖勾配で沈澱させた（モリアーティ等、１
９８１）。両分の収集後ｌｌＢｓＡｇ活性は３種のポリ
ペプチドで明らかに等しい沈降係数の唯１つのピークと
して沈降した。

グロスーベラード（Ｇｒｏｓｓ−Ｂｅｌｌａｒｄ）等（
１９７３）の方法でクローンＬＡＳＳＬＡＳＩ、ＬＡＳ
　ＩＩの細胞ＤＮＡを調製し制限酵素旧ｎｄ［［及びＰ
ｓｔｌで消化した。アガロースゲル電気泳動にかけ、切
断トランスレーションの方法（リグビー（Ｒｔｇｂｙ）
等、１９７７）でＳ遺伝子を含むＤＮＡ断片から製造し
た放射能プローブとハイブリダイズしたニトロセルロー
スシート（サザン、１９７５）にＤＮＡを移した。

レプリカをニトロセルロースでオートラジオグラフィー
にかけ３つのクローンに１つ以上の遺伝子が組み込まれ
たことを確認した。更に、Ｐｓｔ　Ｔ部位は細胞クロー
ンＬＡＳ　Ｉ及びＬＡＳ　ｎの修飾Ｓ遺伝子の処にのみ
存在していた。このＰｓｌｒ部位は使用Ｓ遺伝子の天然
配列（ビー・シャルネ等、１９７９）中には存在せず使
用プラスミドｐＬＡＳ　Ｉ及びｐＬＡＳ　ＩＩに挿入さ
れた外来ＤＮＡ断片中に存在していた。

コンフルエンスに達した細胞クローンをメチオニン（”
Ｓ）で４８時間ラベルし上清をＮＰ４００．５％の存在
中で、ウサギ抗ＨＢｓＡｇ抗体（ベージング（Ｂｅｈ　
−ｒｉｎｇ））とセファローズＡプロティン（ファルマ
シア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））とを順次用いて免疫沈降
させた。免疫沈降物を洗浄後、分子量ラベル（ファルマ
シア）の存在中でレムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）の方法（１
９７０）で１５％ポリアクリルアミドゲルに載せた。処
理し乾燥したゲルをオートラジオグラフィーに露光した
。

各上清毎に２つの主要バンドが生じた。この分子量は夫
々クローンＬＡＳでは２３０００及び２７０００であり
クローンＬＡＳ　Ｉでは２４７５０及び２８５００であ
りＬＡＳ［では２６０００及び２９０００である。

プラスミドｐＬＡＳはＬ細胞中でのＨＢｓＡｇの発現の
促進に有効である。更に、プラスミドｐＬＡＳ　ＩはＳ
遺伝子のコード領域に付加制限部位を含んでおりこれが
新しい配列の導入を容易にする。

細胞上滑中でＨＢｓＡｇ粒子に類似の構造をＲ，１，Ａ
。

により検出し得ることから、プラスミドｐＬＡＳ　Ｉ及
びｐＬＡＳ　Ｕによって誘発された構造がヒト血清粒子
の抗原性に類似の抗原性を少なくとも部分的に維持して
いると言うことができよう。８または１６個の使用アミ
ノ酸の挿入は、修飾ＨＢｓＡｇタンパクが細胞質からし
細胞の外部培地に向かって分泌されることを妨害しない
。Ｓ遺伝子への挿入にＢａｍＨ１部位の選択が有利であ
ることが判明した。これは、タンパクの主要親水性領域
の起点に相当しくビー・チオレ等、１９８１）、疎水性
配列に粒子の脂質膜との接触を惟持仕しめる。２２ｎｍ
の粒子の構造の原因となるｌｌＢｓＡｇ膜間領域の立体
配座は多分軽度の転位しか生じないであろう。

細胞クローンの上清を塩化セシウム及びショ糖勾配で分
析すると、使用した実験条件では修飾された構造と非修
飾構造との差が明確には示されなかった。

細胞ＤＮＡを分析すると、組み込まれたＳ遺伝子が使用
プラスミドに与えられた修飾を必ず含むことが判明した
。

免疫沈降後に確認されたタンパクは予想通りの分子量の
差を示した。しかし乍ら、修飾タンパクの測定分子量は
正確な分子量より大きがった（８ａａ断片の正確な分子
量は９５７である）。また、修飾はｔｌ　Ｂ　ｓ　Ａ　
ｇタンパクの部分的グリコシレージョンを必ず伴う。ポ
リアクリルアミドゲルで生じる２つのバンドはグリコジ
ル化ポリペプチドと非グリコジル化ポリペプチドとの夫
々の特有バンドである。

最もグリコジル化し易い残基アスパラギン１４６（マチ
ダ（Ｍａｃｈｉｄａ）等、１９８３）は主要抗原決定基
ａ（ピロット等、１９８４）に関与する配列に加わる。

従ってタンパクのこの部分の立体配座は修飾タンパクと
天然タンパクとの双方で比較的類似している。

実施例■ ジフテリア毒素の遺伝子（エム・カクゾレク（Ｍ。

Ｋａｃｚｏｒｅｋ）等、１９８３）を含むプラスミドｐ
ＴＤ１３４のＤＮＡを酵素Ｈａｅ　ＩＩＩで切断しヌク
レアーゼＢＡＬ３１で処理しＴ４　ＤＮＡリガーゼの存
在中でアダプターＢａｍＨＩと結合した。酵素ＢａｍＨ
Ｉで切断後、断片を同じ酵素で切断したプラスミド１）
ＳＫＳＬＯ５のＤＮＡと結合した（シャピロ等、１９８
３）。次にこのＤＮＡを用いて、大腸菌Ｅ。

ｃｏｌｔを形質転換した。コロニーをニトロセルロース
フィルターに移し溶解した。エンドヌクレアーゼＨａｅ
ｍでプラスミドｐＴＤ１３４を消化後アクリルアミドゲ
ルで精製した断片（ＨａｅｎＩ　５９７〜Ｈａｅｌｌｌ
　７４６断片）からの切断トランスレーションにより製
造した放射能プローブと前記ニトロセルロースフィルタ
ーとをハイブリダイズした。このプローブとハイブリダ
イズするコロニーのプラスミドをマキサム（Ｍａｘａｍ
）及びギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）の方法（マキサム
等、１９８０）で部分的に配列決定した。ジフテリア毒
素の遺伝子の２０１〜２３１のアミノ酸をコードするＢ
ａｍ１ｌ　Ｉ　−Ｂａｍ１ｌ　ｒ挿入断片（カクゾレク
等、１９８３）を含む断片を選択した。次にこの断片を
プラスミドｐＬＡＳのＢａｍＨＩ部位に再導入した。

新しいプラスミドｐＴＡＳを精製しマウスのし細胞にト
ランスフェクトした。実施例ｆの冒頭に記載の方法でＧ
４１８に耐性の細胞クローンを選択し上清中のＨＢｓＡ
ｇの存在を検査した。２ｏの被検クローンのうちに陽性
のクローンはなかった。

１０個のクローンの細胞をトリプシン処理しＰＢＳで２
回洗浄し、２５０ｕＩｌのトリス１０ｍＭ　ｐＨ７，４
、ＥＤＴＡＩｍＭ中での凍結融解サイクルを３回繰り返
して溶解させた。溶解物を２００Ｏｒｐｍで清澄化し検
査した。

クローンの全部の溶解物が［ｌＢｓＡｇを含有していた
。

同じ条件で１つのクローンを溶解した。部分サンプルを
ヒト血清（１，Ｐ、Ｐ、）から精製したＨＢｓＡｇ粒子
と非修飾粒子を産生する陽性１）ＬＡＳによってトラン
スフェクトされたクローン溶解物と並列に塩化セシウム
またはショ糖の勾配で沈降させた。ヒト血清の粒子と被
検溶解物のＨＢｓＡｇシグナルとの間にいかなる違いも
検出されなかった。このことは、たとえ分泌されなくて
も修飾タンパクは細胞溶解後に「天然」粒子の立体配座
と比較的類似した立体配座を有することを証明し得る。

ｌｌＢｓＡｇのＢａｍ１１１部位（ａａｌ１２〜１１３
）の処にジフテリア毒素の一部をコードする３２個のア
ミノ酸を挿入するとタンパクがＬ細胞で翻訳されたとき
タンパクは最早分泌されない。プラスミドｐＴＡＳでの
実験がこのことを証明した。しかし乍ら分泌されない粒
子の形態の修飾タンパクを検出し得るので、ＨＢｓＡｇ
を修飾し非分泌性の系（たとえば酵母）の中で発現さけ
ることは可能であると考えてよい。持続性をもつ特殊構
造が得られるのでタンパクの安定性が高くこのためタン
パクの精製が容易である。

実施例■ ｌ型ポリオウィルスのタンパクＶＰＩの１１のアミノ酸
（アミノ酸９３〜１０３）と酵素ＢａｍＨＩで認識され
る２つの部位とをコードする４７塩基対のＤＮＡ断片の
２つの鎖を自動合成装置（アプライド・バイオシステム
）を用い化学的方法で合成した。２つの鎖を変性ポリア
クリルアミドゲルで別々に精製しハイブリダイズした。

断片をエンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで切断しプラスミ
ドｐＬＡＳのＢａｍＨｒ部位に挿入した。

新しいプラスミドｐＰＡＰ（第２図）を部分的に配列決
定しくマキサム及びギルバート、１９８０）増殖して実
施例Ｉの冒頭に記載の方法でＬ細胞に導入した。

Ｇ４１８に耐性のクローンを単離し上清中のＨＢｓＡｇ
の存在を検査した。２０のうち１４のクローンが陽性で
あった。

２２ｎｍの粒子を精製するために、細胞クローンをＤＭ
ＥＭ中で培養し８日後に細胞上清を清澄化し４５％の硫
酸アンモニウム溶液　ｐＨ７，５を加えた。

沈澱物を遠心により収集し得られた粒子を１０ｍＭトリ
スＨＣＩ　　ｐＨ７，５，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍ
Ｍ　ＥＤＴＡ（ＴＮＥ）に溶解し同じバッファに透析し
た。

０．３１１１ｇ／−のＣｓＣ１を加えベックマンロータ
６０Ｔｉを用い４０ｋｒｐｍで４℃で７２時間遠心した
。

遠心後に１−の両分を収集しＨＢｓＡｇをＲＩＡで検査
した。

ＨＢｓＡｇを含む画分を合わせてベックマンロータ５０
Ｔｉを用い４７ｋｒｐｍで４℃で４８時間再度遠心した
。

上清から０．３３７の画分を再度収集しＨＢｓＡｇの存
在を再度検査した。

ＨＢｓＡＨの活性ピークに対応する両分を合わせてＴＮ
Ｅに透析し、ロータＳＷ４１を用い２８ｋｒｐｍで２４
時間遠心してＨＢｓＡｇを沈澱させた。

沈澱物を０．５ｍｌのＴＨＥに再度懸濁させ、６６％シ
ヨ糖０．５戒を含むＴＮＥ中で１０〜３０％（Ｗ／Ｗ）
ショ糖濃度勾配に入れた。

ロータＳＷ４１を用い３５ｋｒｐｍ及び４℃で４．５時
間遠心し上清から０．３３ＴＩｆ！の両分を収集した。

ＨＢｓＡｇの活性ピークに対応する画分を再度合わせて
ＴＮＥに透析した。精製エンベロープの粒子を、ＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析し銀で呈色試験
した。

タンパク濃度をバイオラッドの方法で決定した。

夫々ｐＰＡＰ及び１）ＬＡＳでトランスフェクトされた
細胞クローンの培地（ＰＡＰ、　ＬＡＳ）から精製され
た粒子は、ＣｓＣ１中でほぼ同じ濃度であった。これら
粒子は、ショ糖沈降試験ではヒトＨＢｓＡｇ粒子に比較
して有意な差を示さなかったが、直径のばらつきは大き
いよってあった。

粒子ＬＡＳ及びＰＡＰの夫々から得られた抗血清抗ＨＢ
ｓＡｇによって免疫沈降′したポリペプチドＨＩ３ｓＡ
ｇ及びＨＢｓ　Ｐｏ　１　ｉｏＡｇはグリコジル化した
形態と非グリコジル形態との双方で存在する。

ＨＢｓＡｇとＨＢｓ　Ｐｏ　Ｉ　ｉｏＡｇとの見掛は分
子量の１．５ｋＤａの差は挿入配列の分子量に一致する
。

これらの結果よりインサートがエンベロー、プ粒子の集
合に必要なタンパクと脂質との間の特異的相互作用を妨
害しないこと及び培地の細胞による粒子のグリコシレー
ジョンと分泌とを妨害しないことが判明した。　挿入さ
れたポリオウィルスの配列が粒子の表面に十分に露出し
ているかを確認しまた立体配座の変化が誘発されたかど
うかを検査するためにＩｆ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ粒子とＨＢ
ｓＰｏｌｉｏＡｇ粒子とのタンパク分解酵素に対する感
受性試験を実施した。

細胞クローン（ＬＡＳ、　ＰＡＰ）をコンフルエンスま
で培養しメチオニンを含まないＤＭＥＭで２回洗浄し４
ｍＭのグルタミンと１％の子ウシ血清とを加えた同じ培
地中で２時間インキュベートした。

２−１０’の細胞と、１Ｏｈｃｉ／ｒｒｆｌの”Ｓ−Ｍ
ｅｔ（１００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ、アマ−ジャム（Ａｍａ
ｒｓｈａｍ））とを含む新しい培地でインキュベーショ
ンを２４時間続行した。

３０／７ｇ／ｒｒＩＩの非ラベルＮｅｔの存在中で６時
間インキュベーション後に、培地の上清を２８ｋｒｐｍ
で４℃で２４時間遠心しくロータ５Ｗ４１）、次にＣｓ
Ｃｌ勾配（１，１〜１．６ｇ／ｃｍ３）で３５ｋｒｐｍ
で４℃で２４時間遠心してこの上清からエンベロープ粒
子を部分的に精製した。

０．５ｍｆの両分を収集しピークの両分をＰＢＳに透析
した。１００メの部分サンプルを５０メのトリプシンの
ＰＢＳ溶液（３００Ｉ！ｇ／ｍ１、ウオーシントン（ｌ
ｆｏｒｔｈｉｎｇ−ｔｏｎ））に任意に３％のβ−メル
カプトエタノールを加えた液と混合し３７℃で２時間イ
ンキュベートした。次に大豆トリプシンの阻害物質のＰ
ＢＳ溶液５０ｕＮ（３００ｑ／ｍ１７）（ウオーシント
ン）を添加した。反応容量をＰＢＳで４００ｔＩｌに増
加し１％のウシ血清アルブミンと１％のデオキシコール
酸ナトリウムと０．１％のＳＤＳとを添加し、ｌ：１０
０に希釈したヒトｌＢｓＡｇ粒子に対抗するウサギ抗血
清（ベーリング）の存在中で４℃で１晩免疫沈降させた
。次に等容量の２５ａ＋ＭトリスＨＣＩ　ｐＨ７，２と
２．５ｍＭ　ＥＤＴＡと２ｎ＋Ｍ　ＰＭＳＦとに再度懸
濁させた５０試のセファロ−スープロチインＡを加える
。

４℃で穏やかな攪拌を１時間維持しセファロースを１０
ｍＭ　トリスｌｌＣｌ　ｐＨ７，２と１５ｈ＋Ｍ　Ｎａ
Ｃｌと１％トリトンＸ−１００と０，１％ＳＤＳと１％
デオキシコール酸ナトリウムとによって３回洗浄し、１
２５ｍＭ　トリスＨＣｌｐＨ６，８によって２回洗浄す
る。

最後にゲル電気泳動用バッファ溶液４０Ｊ、１１中でセ
ファロースを沸騰させてタンパクを溶出する。

１５％ポリアクリルアミドゲルの電気泳動をレムリの方
法で実施した。

フルオログラフィーで処理し、ゲルを乾燥させ＝７０℃
でコダックＸＡＲ−５フィルムに露光した。

この結果ｌＢｓＡｇ粒子は非還元条件でトリプシンに極
めて耐性゛であるがＨＢｓＰｏｌｉｏＡｇは唯１つの部
位（または近傍の複数の部位）で完全に開裂され見掛は
分子ｌ　１７．４及び１４．３ｋＤａのポリペプチドを
産生ずる。

断片のサイズは挿入配列の開裂と適合する。

還元剤の存在下ではＨＢｓＡｇはＡｒｇ−１２２（ピー
ターソン（Ｐｅｒｅｒｓｏｎ）、Ｄ、Ｌ、）の処でのみ
開裂され１６．６及び１３．２ｋＤａの断片を産生ずる
が、ＨＢｓ　Ｐｏ　１　ｉｏＡｇは、１７．４及び１３
．２ｋＤａの２つの断片として開裂される。

このことは、非還元条件でＨＢｓ　Ｐｏ　ｌ　ｉｏＡｇ
から得られた１４．３ｋＤａの断片はＡｒｇ１２２を含
み１３．２ｋＤａの断片よりもＮ−末端の１０〜１２個
のアミノ酸だけ長いことを示しており、非還元条件での
ＨＢｓＰｏｌｉｏＡｇ粒子の開裂が挿入量、列の１つ以
上のＬｙｓ残基の処で生じることが確認された（第２図
）。

これらの結果は、挿入されたペプチド配列にタンパク分
解酵素が容易に接近すること即ち該ペプチド配列がエン
ベロープのハイブリッド分子の表面に露出していること
を示す。１型ポリオウイルス（マホニー（Ｍａｈｏｎｅ
ｙ））は、対応するペプチド配列の露出度が少ない構造
なので還元条件ではＬｙｓ残基がトリプシンと接近でき
ない（フリックス（Ｐｒｉｃｋｓ）等）。

ハイブリッドＨＢｓＰｏｌｉｏＡｇ粒子の別の可能な開
裂部位はトリプシンの接近が不可能であり、このことか
らＨＢｓＡｇ分子の該部分が極めて安定な構造に維持さ
れることが理解されよう。

しかし乍らＨＢｓの主要抗原領域ではある程度の立体配
座の変化が生じ得る。

このことは、［ｌＢｓＡｇ粒子を参照として用いたラジ
オイムノロシイを実施し５ＤＳ−ＰＡＧＥ後に銀の呈色
試験でタンパクを定量したときに、ｌｌＢｓＡｇ粒子と
抗■ＢｓＡｇ抗体との結合が減少（約１／２０）　して
いたことによって判明した。

異なる血清を用いてＨＢｓＡｇとＩＩＢｓＰｏｌｉｏＡ
ｇとの免疫沈降試験を実施すると、双方の粒子が抗１１
ＢｓＡｇ抗体と反応すること、及び、ｌｌＢｓ　Ｐｏ　
ｌ　ｉｏＡｇ粒子がポリオウィルスを中和するＣ３モノ
クロ一ナル抗体と挿入配列を含む合成オリゴペプチドに
対する異なる２種類の抗血清とによって特異的に免疫沈
降することが判明した。

ハイブリッド粒子の免疫特性を定量するために、マウス
をＨＢｓＡｇ又は［ＩＢｓＰｏｌｉｏＡｇ（表１）で免
疫し、マウス血清と免疫的に同等の腹水液を得るために
抗体を産生じない腫瘍形成細胞で腹腔組織内に腹水を産
生させた（アナツカ−（Ａｎａｃｋｅｒ）等）。

ＨＢｓＡｇをワクチン接種すると、ヒトＨＢｓＡｇ粒子
と反応する高い抗体価が得られた（マウスＮｏ、ｌ）。

しかし乍らｌｌＢｓ　Ｐｏ　ｌ　ｉＯＡｇで免疫したマ
ウスはＨＢｓ抗原に微弱な応答しか示さなかった（表１
ｂ１マウスＮｏ、　２及び４）。

このことは抗原決定基がハイブリッド分子中で部分的に
ねじれを生じるという観察と一致する。

他方、ポリオウィルスＶＰＩに挿入された配列は免疫的
に活性であり一１全部のマウスにおいて該配列のキャリ
ヤーたる合成ペプチドと１型ポリオウイルスの完全タン
パクＶＰＩ（ウェスタンプロット）とを認識する抗体を
誘発する（表１ｃ）。更に、得られた抗血清は感染性ウ
ィルスと熱変性ウィルスとの双方に対して特異的効力を
有する。このことは表１ｄの免疫沈降テストで示される
。更に全部の抗血清がポリオウィルスを中和する有意な
抗体価を有する（表１ｅ）。

予備的結果より、ＨＢｓＡｇ粒子がウサギにも免疫を獲
得させることが判明した。ｔｌＢｓＰｏｌｉｏＡｇを（
毎回１０〜４０．ｃ４１ずつ）２回注射すると４羽のう
ち３羽が感染性ポリオウィルスと共に免疫沈降する抗体
を有した。

ＨＢｓＰｏｌｉｏＡｇ粒子は、感染性ポリオピリオンと
熱変性ポリオピリオン（エミニ（Ｅｍｉｎｉ）等）とに
共通の少数エピトープを認識する中和抗体を出現させる
潜在能力をもつ。このことは、対応するアミノ酸配列の
抗体結合活性と免疫産生活性との少なくとも一部がＩＩ
ＢＹエンベロープ粒子の表面で発現することによって証
明される。

この短い配列はポリオウィルスのキャプシドにピークを
形成しくホーグル（Ｈｏｇｌｅ）等）その結果自律的構
造を有し得る。

１１ＢｓＰｏｌｉｏＡｇ粒子中でｌｌＢｓＡｇの近傍の
配列は更に、挿入されたポリオウィルスの安定性と適応
性とを維持し得るであろう。　ＨＢｓＡｇと）ＩＢｓ　
Ｐｏ　ｌ　ｉｏＡｇとの免疫特性試験を以下のごと〈実
施した。その結果を表１に示す。

（ａ）　　１ｉ７Ｊ記のごとく精製した２縄のＨＢｓＡ
ｇ（Ｎｏ、　１）又は３０ｕｇのＨＢｓＰｏｌｉｏＡｇ
（Ｎｏ、２〜４）を５０％の完全フロインドアジュバン
トのエマルジョンと共に生後８週間の１３ＡＬＢ／ｃマ
ウスにｍ腔内注射して免疫し２週間後に不完全フロイン
ドアジュバントを注射した。

３ｉ１間後にマウスのミエローマ細胞ｓｐ２１０−Ａｇ
１４（キュイラン（Ｃｏｕｉｌｌｉｎ）等）を注射し続
いてアジュバントを含まないブースター注射を実施した
。

マウスＮｏ、５を無抗原処置した。２週間後に腹水液を
採取し以下の手順で分析した。

（ｂ）　ＡＵ５ＡＢラジオイムノロシイテスト（アボッ
ト）で抗ＨＢｓＡｇ価を定量し国際単位（１，Ｕ、）で
示した。

（Ｃ）ポリオウィルスＶＰＩのアミノ酸９３〜１０４に
対応するペプチドへの結合をＥＬＩＳＡ法（ヴオラー（
ｖｏｌ−Ｉｅｒ）等）で定量した。

ウェルにこのペプチドを塗抹して（ＰＢＳ中０．５■）
１晩おき、空いた部位をＢＳＡでブロックした（０．０
５％のトウィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０を含むＰＢＳ中で
１％）。

０．０５％のトウィーン２ｏを含むＰＢＳ中で繰り返し
洗浄し、１％のＢＳＡと０．０５％のトウィーン２ｏと
を含むＰＢＳ中で腹水液を１＝８０に希釈し３７℃で２
時間インキュベートした。

ウェルを洗浄し、ペルオキシダーゼでラベルし１：１０
００に希釈したヤギ（ｃａｐｐｅｌｌ）の抗マウスＩｇ
Ｇ抗体を添加した。

洗浄後５ｈＭのクエン酸／燐酸バッファ　ｐＨ５に入れ
た０−フェニレンジアミン（メルク（Ｍｅｒｃｋ）、０
．５■／ＩＩｄｌ）を加えて１０分間室温に維持し、２
，５％のＩＩ、Ｓｏ、を加えて反応を停止させた。

陽性の血清はコントロール（Ｎｏ、　５）の３倍以上の
吸収価（ＤＯ）を示した。

（ｄ）　　１型ポリオウイルス（マホニー）を”５−Ｎ
ｅｔでラベルしＣｓＣ１勾配中で遠心して精製した。

感染性ピリオンを５６℃で１時間インキュベートして熱
変性ピリオンを調製した。

１５０ｍＭのＮａＣ１と５ｍＭのＥＤＴＡと５０ｍＭの
トリス　ｐＨ７，４と０．０２％のＮａＮ、と０．０５
％のＮｏｎ１ｄとＰ２Ｏとから成る溶媒中に、３５Ｓ　
−Ｍｅｔ　（エミ二等）でラベルした粒子１５０００ｃ
ｐｍを含む５０ｕｌの部分サンプルを、５０ＩＩＮのマ
ウス腹水液の存在下で３７℃で１時間及び４℃で１晩イ
ンキユベートした。

免疫複合体をブドウ球菌５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
　ａｕｒｅｕｓ（コーワン（Ｃｏｖａｎ）　Ｉ株）（ケ
スラー（Ｋｅｓｓｌｅｒ））によって沈降させその放射
能を試験した。表１ｄの数字は免疫沈降した放射能の値
を％で示す。

（ｅ）　　１００プラーク形成単位のｌ型ポリオウィル
ス（マホニー）を加えてＶｅｒｏ細胞の標準プラーク減
少テストを行って各血清を中和する抗体価を測定した。

３つの実験から得られた平均値の減少曲線から、５％の
プラーク減少を与える血清の希釈度の逆数（Ｌｏｇ２）
を算出した。

プラスミドｐＰＡＰで修飾された遺伝子に関する実験に
よれば、タンパクに挿入された外来配列が粒子の表面に
露出していることが判明した。外来性配列の初期立体配
座が変化したとき、より大きい構造を挿入するか又はｌ
ｌＢｓＡｇタンパクの幾つかの部分を欠失させるとこの
問題が解決できると考えるのが妥当である。別の挿入部
位の探求も勿論可能である。ＨＢｓＡｇの残基５０の処
（Ｓ遺伝子のＢａ１１部位）に８個のアミノ酸を挿入す
ると粒子の産生及び分泌が可能になる。

従って本発明により混合ワクチンが提供される。

ＨＢｓＡｇの抗原決定基に外来の抗原決定基の配列を挿
入すると、挿入配列が表面に露出しているときは、ＨＢ
Ｖウィルスの別の亜をに対する混合ワクチン、ウィルス
のコアの決定因子（ＨＢｃＡｇ、　ＨＢｅＡｇ）に対す
る混合ワクチン（ニー・エム・プリンス（Ａ。

Ｍ、Ｐｒ１ｎｃｅ）等、１９８３、ニス・イワーソン（
Ｓ、　Ｉｗａｒｓｏｎ）等、１９８４）、Ｂ型肝炎と同
じ集団（エイズ、ヘルペス）に関するウィルスの抗原決
定基に対する混合ワクチン及びその他のウィルス（ティ
ー・エム・シニック（Ｔ、Ｍ、５ｈｉｎｎｉｃｋ）等）
の抗原決定基に対する混合ワクチンを製造することが可
能になる。３型ポリオウイルス（Ｄ、Ｍ、Ａ、（、工ヴ
アンス（Ｅｖａｎｓ）等、１９８３）のＶＰＩタンパク
の主要抗原決定基に関与する８個のアミノ酸は、化学的
に合成されたＤＮＡ断片を介してＨＢｓＡｇタンパクに
挿入され得る。

また、この種の操作を用いて薬剤学的に重要な生物学的
に活性の配列を発現させることが可能である。　動物へ
パンダ（Ｈｅｐａｎｄａ）ウィルス（ビー・エルー？リ
オン（Ｐ、Ｌ、Ｍａｒｉｏｎ）等、１９８３）によって
産生ずる粒子も同じ条件で使用され得る。

このために本発明は選択された投与形態特に非経口投与
に適した薬剤ベヒクルと共に本発明の粒子を有効用量で
含むＢ型ウイルス性肝炎用ワクチン組成物に係る。用量
は特にタンパク３〜６塊／−であり例えばタンパク５ｑ
／ｄ（単位用量）である。

本明細書で参照した文献の目録を以下に添付する。

二Ｌ」（− −Ａｎａｃｋｅｒ、　　Ｒ，Ｌ、、　　Ｍｕｎｏｚ、　
　Ｊ、Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　旦ヱ、　　１１２
６−１１３２（１９６１）。

−Ｃａｔｔａｎｅｏ、　Ｒ，、Ｗｉｌｌ、　Ｈ，、Ｈｅ
ｒｎａｎｄｅｚ、　Ｎ、、　５ｃｈａｌｌｅｒ、　Ｈ。

（１９８３）　）ｉａｔｕｒｓ、　３５ｊ５．３３６−
３３８−−　Ｃｏ１ｈｅｒｅ−Ｇａｒａｐｌｎ、　Ｆ、
、　Ｈｏｒｏｃ！ｎ１ｃｅａｎｕ、　Ｆ、、　Ｋｏｕｒ
ｉｌｓｋｙ、　ｐ、。

Ｑａｒａｐｉｎ、　Ａ、Ｃ，（１９８１）　Ｊ、　Ｍｏ
１．　Ｂｉｏｌ、、　里、　１−１１１゜−Ｃｏｕｉｌ
ｌｉｎ、　　Ｐ、、　　Ｃｒａｌｎｉｃ、　　Ｒ，、Ｃ
ａｂａｕ、　　Ｎ、、　　Ｈｏｒｏｄｎｉｃｅａｎｕ、
　　ｉ’。

＆　Ｂｏｕｅ、　Ａ、　Ａｎｎ　Ｖｌｒｏｌ、　（工ｒ
ｕｓｔ、、　Ｐａ５ｔｅｕｒ）　患Ｅ、　３１５−３２
３（１９８２）。

−Ｄｕｂｏｌｓ、　Ｍ、Ｆ、、　Ｐｏｕｒｃｅｌ、　Ｃ
，、Ｒｏｕｓｓｅｔ、　Ｓ、、　Ｃｈａｎｙ、　ｃ、　
ｅｔＴｌｏｌｌａｉｓ、　Ｐ、　（１９８０）　Ｐｒｏ
ｃ、　Ｍａｌ、１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　ｕ
、　４５’１９−’＋５５３゜ −Ｅｍｉｎｉ、　Ｅ、Ａ、、　Ｂｒａｄｆｏｒｄ、　Ａ
、Ｊ、、　Ｗｉｍｍｅｒ、　Ｅ、　Ｎａｔｕｒｅ　座。

６９９−７０３　（１９８３）。

−Ｅｖａｎｓ、　Ｄ、Ｍ、Ａ、、　Ｍｉｎｏｒ、　Ｐ、
Ｄ、、　５ａｈｉｌｄ、　Ｑ、ｇ、、　Ａｌｍｏｎｄ、
　Ｊ、Ｗ。

（ｉ９ａ３）　Ｎａｔｕｒｌｍ、　１１６０−１１６２
゜−Ｐｒ１ｃｋｓ、　Ｃ，Ｅ、、　ｌｃｅｎｏｇｌｅ、
　Ｊ、Ｐ、、　Ｈｏｇｌｅ、　Ｊ、Ｍ、、　Ｊ、　Ｖｉ
ｒｏｌ。

５３、、８５６−８５９　（１９８５）。

−Ｏｒａｈａｍ、　Ｆ、Ｌ、、　Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ
、　Ａ、Ｊ、　（１９７３）　Ｖｌｒｏｌｏｇｙ。

シ！、　４５６゜ −Ｇｒｏｓｓ−Ｂｅｌｌａｒｄ、　Ｍ、、　０ｕｄｅｔ
、　Ｐ、、　Ｃｈａｔｎｂｏｎ、　？、　（１９７３）
Ｅｕｒｏｐ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　３３４．３２
゜−Ｈｏｇｌｅ　Ｊ、Ｍ、、　Ｃｈｏｗ、　Ｍ、、　Ｆ
ｉｌｍａｎ、　Ｄ、Ｊ、　３ｃｌｅｎｃｅ　２Ｑ。

１３５８−１３６５　（１９８５）。

−Ｈｏｌｌｌｎｇｅｒ、　Ｆ、Ｂ、、　５ａｎｃｈｅｚ
、　Ｙ、、　Ｔｒｏｉｓｉ、　Ｃ，ｊＤｒｅｓｓｍａｎ
。

Ｇ、Ｒ，Ｍｅｌｎｉｃｋ、　Ｊ、Ｌ、　（１９８１１）
　Ｔｈｅ　１９８１１　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　
Ｓｙｍｐｏ−ｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｖｉｒａｌ　）Ｉｅｐａ
ｔｉｔｉｓ　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓａｏ、υ３Ａ。

−Ｉｗａｒｓｏｎ、　Ｓ、、　Ｔａｂｏｒ、　Ｅ、、　
Ｔｈｏｍａｓ、　Ｈ，、５ｎｏｙ、　Ｐ、、　０ｅｒｅ
ｔｙ。

ＲＪ、　　（１９８１＋）　　Ｔｈｅ　　１９ｅｑ　　
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　
　ｏｎＨｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｖｉｒｕ＋ｓ、　Ｂａｎ　
Ｆｒａｎｃｌｓｃｏ、ＵＳＡ。

−Ｋａｃｚｏｒｅｋ、　Ｍ、、　Ｄｅｌｐｅｙｒｏｕｘ
、　Ｆ、、　Ｃｈｓｎｃｌｎｓｒ、　Ｎ、、　５ｔｒｅ
＠ｃｋ。

Ｒ，Ｅ、、　Ｍｕｒｐｈｙ、　Ｊ、Ｒ，、ＢＯｑｕ＠ｔ
、　Ｐ、、　Ｔｌｏｌｌｓｌｉｓ、　ｐ、　（１９１３
３ＬＳｃｉｅｎｃｓ　２２１．８５３−８５５゜−）Ｃ
ｅａａｌｅｒ、　Ｓ、Ｗ、　Ｊ、　Ｘｍｍｕｎｏｌ、ｍ
ｅ　１６ｘ７−１６２ｂ　（１９７５＞。

−Ｌａｅｙｎ＋ｎｌｉ、　Ｕ、に、　（１９７０）　Ｎ
ａｔｕｒｅ、　２２７．６８０−６８５゜−Ｌｕ５ｋｙ
、　Ｍ、、　Ｂｏｔｃｈａｎ、　Ｍ、　（１９８１）　
Ｎａｔｕｒｅ、　２３υ、７９゜−Ｍａａｈｉｄａ、　
　Ａ、、　　Ｋｉａｈｉｍｏｔｏ、　　Ｓ、、　　Ｏｈ
ｎｕｍａ、　　Ｈ，、Ｍｌｙａｍｏｔｏ、　　１．。

Ｂａｂａ、　Ｋ−、Ｏｄａ、　Ｋ、、　Ｎａｋａｍｕｒ
ａ、　Ｔ、、　Ｆｕｎａｔｓｕ、　Ｑ、、　Ｍｉｊａｋ
ａｗａ。

！、、　Ｍａｙａｍｉ、　Ｍ、　（１９８２）　ＭｏＬ
工ｍｍｕｎｏ１．　Ｊｌ、　１０Ｂ？−１０９３゜−Ｍ
ａｒｉｏｎ、　Ｐ、Ｌ、、　Ｋｎｉｇｈｔ、　Ｓ、Ｓ、
、　Ｆｅ１ｔｅｌｓｏｎ、　Ｍ、Ａ、、　０ｓｋｉｒｏ
。

Ｌ、８．、　Ｒｏｂｉｎａｏｎ、　Ｗ、Ｓ、　（１９８
３）　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、胆。

５３１Ｊ−５１１１゜ −Ｍａｘａｍ、　ｋ、、　Ｇ１１ｂｅｒｔ、　Ｗ、　（
１９８Ｇ）、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　６
５゜’１９９゜ −Ｍｉｃｈｅｌ、　Ｍ、Ｌ、、　Ｐｏｎｔｌｓｇｏ、　
Ｐ、、　５ｏｂｃｚａｋ、　ｅ、、　Ｍａｌｐｌｅｅｅ
。

Ｙ、、　　８ｔｒｓｅａｋ、　　Ｒ，Ｅ、、　　Ｔｌｏ
ｌｌａｉｓ、　　Ｐ、　　（１９８１１）、　　Ｐｒｏ
ｃ、　　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓａｉ、υ３Ａ　８１．７７０８−７７１
２゜−Ｍｏｒｉａｒｔｙ、　Ａ、Ｍ、、　Ｈｏｙｅｒ、
　Ｂ、Ｈ，、Ｗａｉ−Ｋｕｏ　５ｈｉｈ、　Ｊ、。

Ｑｅｒｉｎ、　Ｊ、Ｌ、、　Ｗａｎｅｒ、　Ｄ、Ｈ，（
１９８１）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ。

ＵＳＡ　ｆｉ。

−Ｎｅｕｒａｔｈ、　Ａ、Ｒ，、Ｋｅｎｔ、　Ｓ、Ｂ、
Ｈ，、５ｔｒｉｃｋ、　Ｎ、　（１９８！ｌ）　Ｔｈｅ
１９８１１　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙｍｐｏ
ｓｌｕｍ　ｏｎ　Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｖｉｒｕｓ、　
５ａｎＦｒａｎａｉｓｃｏ、　ＵＳＡ。

−Ｎｅｗｍａｒｋ、　Ｐ、　（１９８１１）、　Ｎａｔ
ｕｒｅ　胆ｓ　５１０−５１１゜−Ｐａ、５ｅｋｊ　Ｍ
、　　ｅｔ　　ａｌ、　　Ｎａｔｕｒｅ　　（Ｌｏｎｄ
ｏｎ）　　２８２−５７５　　（１９７９）。

−Ｐｅｔｅｒｓｏｎ、　　Ｄ、Ｌ、、　　Ｐａｕｌ、　
　Ｄ、Ａ、、　　Ｇａｖｉｌａｎｅｓ、　　Ｆ、、　　
Ａｃｈｏｒｄ。

Ｄ、Ｔ、、　ｉｎ：　Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｈｅｐ
ａｔｉｔｉｓ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　（ａｄ、　Ｃｈｉｓ
ａｒｉ。

Ｆ、Ｖ、）　３０−３９　（Ｍａｓｏｎ　Ｐｕｂｌｉｓ
ｈｉｎｇυ、Ｓ、Ａ、　Ｉｎｃ、　１９８１＋）。

−Ｐｉｌｌｏｔ、　Ｊ、、　Ｐｅｔｌｔ、　Ｍ、Ａ、　
（１９８１＋）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ。

旦、　５３−６０・ −Ｐｒ１ｎｃｅ、　Ａ、Ｍ、、　Ｖｎｅｋ、　Ｊ、、　
５ｔｅｐｈａｎ、　Ｗ、　（１９６３）　Ｄｅｖｅｌｏ
ｐ。

Ｂｉｏｌ、　５ｔａｎｄａｒｄ、　５３．１３−２２　
（３，、Ｋａｒｇｅｌ、　Ｂａ５ａｌ）。

−Ｒｌｇｂｙ、　Ｐ、Ｗ、Ｊ、、　Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ
、　Ｍ、、　Ｒｈｏｄｅｓ、　Ｃ，、Ｂｅｒｌ＜、　Ｐ
。

（１９７７）　Ｊ−Ｍｏ１−　Ｂｉｏｌ、　１す＊　２
３Ｌ−５ｈａｐｉｒｏ、　Ｓ、に、、　Ｃｈｏｕ、　Ｊ
、、　Ｒｌｃｈａｕｄ、　Ｆ、Ｖ、、　Ｃａ５ａｄａｂ
ａｎ。

Ｍ、Ｊ、　（１９８３）　Ｇｅｎｅ、　２５７．、、１
１−８２゜−Ｓｍ１ｔｈ、　Ｇ、Ｌ、、　Ｍａｃｋｅｔ
ｔ、　Ｍ、、　Ｍｏ５ｓ、　Ｂ、　（１９８３）　Ｎａ
ｔｕｒｅ。

王、　１！９Ｏ−Ｊ１９５− −５ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｅ、Ｍ、　（１９７５）　Ｊ、
　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　９．５０３−５１７゜−３ｔ
ｉｂｂｅ、　Ｗ、、　Ｇｅｒｌｉｃｈ、　Ｗ、　（１９
８３）　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒＶｉｒｏｌｏｇｙ皿、　
６２６−６２８゜ −Ｔｉｏｌｌａｉｓ、　Ｐ、、　Ｃｈａｒｎａｙ、　Ｐ
、、　Ｖｙａｓ、　（１，Ｎ、　（１９８１）　５ｃｉ
ｅｎｃｅＬ徨、旬０６Ｊ１１゜ −Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ、　Ｐ、、　Ｍｅｄｉｎａ、　
Ａ、、　Ｒｕｔ、ｔｅｒ、　Ｗ、Ｊ、　（１９８２）Ｎ
ａｔｕｒｅ、　２Ｊ３．３１１７−３５０゜−Ｖａｌｅ
ｎｚｕｅｌａ、　Ｐ、工ｎ　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　
ｏｆ’　ｔｈｅ　ＴｗｅｌｔｈＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ
ａｌ、Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　　ｏｎ　　Ｙｅａｓｔ　
　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　　ａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ、　Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ　１９８１１．１
６゜−Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅｒｆ’、　Ｓ、、　Ｗｙｃ
ｈｏｗｓｋｉ、　Ｃ，、Ｂｒｕｎｅａｕ、　Ｐ、ｊＢｌ
ｏｎｄｅｌ。

Ｂ、、Ｃｒａｉｎｉｃ、Ｒ，、Ｈｏｒｏｄｎｉｃｅａｎ
ｕ、　　Ｆ、、Ｇｉｒａｒｄ、　　Ｍ、　　（１９８３
ＬＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　３ａｉ、ＵＳ
Ａ　８０．５０８０−５０８１１゜−Ｖｏｌｌｅｒ、　
　Ａ、、　　Ｂｅｄｗｅｌｌ、　　Ｄ、Ｅ、　　＆　　
Ｂｅｒｌｅｔｔ、　　Ａ、　　Ａ　　Ｇｕｉｄｅｗｉｔ
ｈ　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　ｏｆ’　Ｍｉｃｒｏｐｌａｔ
ｅ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、　ｐ、１（Ｄｙｎａｔ
ｅｃｈ、　Ｇｕｅｒｎｅｓｅｙ　１９７９Ｌ−Ｗｉｇｌ
ｅｒ、　Ｈ，、Ｐｅ１ｌｉｃｅｒ、　Ａ、、　３１１ｖ
ｅｒｓｔｅｉｎ、　Ｓ、、　Ａｘｅｌ、　Ｒ，。

Ｕｒｌａｕｂ　Ｇ、、　Ｃｈａｓｉｎ、　Ｌ、　Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ
　ｆｌ。

１３７３−１３７６　（１９７９）。

（以下余白）

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明構造で使用されるプラスミドｐｌＡｓの
構造の概略図、第２図はｐＬＡＳに由来し更に１型ポリ
オウイルス（マホニー株）のタンパクの１１個のアミノ
酸の配列をコードする合成りＮＡ断片を含むプラスミド
ｐＰＡＰの構造の概略図である。

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. （１）ＨＢｓ抗原の主要ポリペプチドに特有のアミノ酸
   配列をＨＢｓ抗原に特有の構造を維持するに十分な割合
   で含む粒子であり、好ましくはそれ自体が免疫産生部位
   のキャリヤーたる主要ペプチドに外来の１つ以上のアミ
   ノ酸配列を主要ペプチドの内部特に通常は前記粒子の外
   面に露出した親水性領域の１つに取り込むか又は変形例
   として該親水性領域に属する１つ以上のアミノ酸が前記
   外来アミノ酸配列で置換されていることを特徴とする粒
   子。
2. （２）外来アミノ酸配列が、主要ポリペプチドのアミノ
   酸３２〜７４を含む領域に挿入されることを特徴とする
   特許請求の範囲第１項に記載の粒子。
3. （３）外来アミノ酸配列が、主要ポリペプチドのアミノ
   酸１１０〜１５６を含む領域に挿入されることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項に記載の粒子。
4. （４）外来ポリペプチド配列のサイズがアミノ酸１６個
   より大きくないこと、特にアミノ酸５〜１６個、より好
   ましくは６〜１３個であることを特徴とする特許請求の
   範囲第１項から第３項のいずれかに記載の粒子。
5. （５）更に、Ｂ型ウイルス性肝炎のウイルスのゲノムの
   プレーＳ領域によりコードされるポリペプチド配列を含
   むことを特徴とする特許請求の範囲第１項から第４項に
   のいずれかに記載の粒子。
6. （６）Ｂ型ウイルス性肝炎のウイルスのゲノムのＳ領域
   及び場合によってはプレーＳ領域をコードするＤＮＡ配
   列を含む組換体ＤＮＡであり、前記ＤＮＡ配列が前記主
   要ポリペプチドの親水性領域に対応するＳ領域のゾーン
   の少なくとも１つにおいて、前記外来配列をコードする
   少なくとも１つのヌクレオチド配列によって局部的に修
   飾されていること、及び、Ｓ領域と場合によってはプレ
   ーＳ領域とが組換体ＤＮＡの内部で外来性プロモータの
   直接コントロール下に維持されており該プロモータは、
   ベクターが組み込まれる真核細胞特にヒトもしくは動物
   の真核細胞中又は酵母中で直接コントロール下の遺伝子
   の転写を有効に開始せしめる能力が既知のプロモータで
   あることを特徴とする組換体ＤＮＡ。
7. （７）前記外来配列をコードするヌクレオチド配列が、
   ＨＢｓ抗原の構成中に含まれる主要ポリペプチドのアミ
   ノ酸３２〜７４をコードするＳ遺伝子の領域に局在する
   ことを特徴とする特許請求の範囲第６項に記載の組換体
   ＤＮＡ。
8. （８）前記外来配列をコードするヌクレオチド配列が、
   ＨＢｓ抗原の構成中に含まれる主要ポリペプチドのアミ
   ノ酸１１０〜１５６をコードするＳ遺伝子の領域に局在
   することを特徴とする特許請求の範囲第６項に記載の組
   換体ＤＮＡ。
9. （９）前記外来ヌクレオチド配列が１６個以下のアミノ
   酸特に６〜１３個のアミノ酸を含むポリペプチドをコー
   ドすることを特徴とする特許請求の範囲第６項から第８
   項のいずれかに記載の組換体ＤＮＡ。
10. （１０）前記外来性プロモータがＳＶ４０ウイルスのプ
    ロモータの１つから成ることを特徴とする特許請求の範
    囲第６項がら第９項のいずれかに記載の組換体ＤＮＡ。
11. （１１）特許請求の範囲第６項から第１０項のいずれか
    に記載の組換体ＤＮＡの外来性プロモータを認識し得る
    ヒトまたは動物宿主または酵母由来の細胞系であって、
    ゲノムに取り込まれた特許請求の範囲第６項から第１０
    項のいずれかに記載の組換体ＤＮＡを含むことを特徴と
    する細胞系。
12. （１２）ＳＶ４０ウイルスのプロモータを認識し得る細
    胞から形成されることを特徴とする特許請求の範囲第１
    １項に記載の細胞系。
13. （１３）特許請求の範囲第６項から第１０項のいずれか
    に記載の組換体ＤＮＡによって特にヒトまたは動物の細
    胞系を形質転換し、組換体ＤＮＡのプロモータが使用細
    胞宿主の種類に応じて選択されること、及び、前記のご
    とく形質転換された微生物を培養すること、及び、産生
    粒子を回収することを特徴とする特許請求の範囲第１項
    から第５項のいずれかに記載の粒子の産生方法。
14. （１４）主要ポリペプチドに取り込まれた外来配列が１
    ６個以下のアミノ酸を含むこと、及び、前記細胞宿主の
    培地に分泌された産生粒子を回収することを特徴とする
    特許請求の範囲第１３項に記載の方法。