JP2003286198A

JP2003286198A - 増殖因子等を提示するタンパク質中空ナノ粒子を用いる治療薬剤

Info

Publication number: JP2003286198A
Application number: JP2002097395A
Authority: JP
Inventors: Shunichi Kuroda; 俊一黒田; Katsuyuki Tanizawa; 克行谷澤; Akihiko Kondo; 昭彦近藤; Masakazu Ueda; 政和上田; Shoji Senoo; 昌治妹尾; Hidehiko Iwabuki; 秀彦岩蕗
Original assignee: Japan Science and Technology Corp
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2002-03-29
Filing date: 2002-03-29
Publication date: 2003-10-07
Also published as: EP1491215A1; WO2003082344A1; US20060165726A1; KR20040095331A

Abstract

(57)【要約】【課題】タンパク質中空ナノ粒子を用いる特定の細胞
または組織に特異的に作用する疾患治療用薬剤であっ
て、動物実験により実際に治療効果が認められた薬剤、
およびこの薬剤を用いる治療方法を提供する。【解決手段】増殖因子などが提示され、粒子形成能を
有するタンパク質（たとえば、本来の肝細胞に対する感
染能を欠失するように改変され、さらに増殖因子等を提
示するように改変されたＢ型肝炎ウィルス表面抗原タン
パク質）からなる中空ナノ粒子に、疾患治療用の細胞導
入物質（たとえば、癌治療用遺伝子である単純ヘルペス
ウィルス由来チミジンキナーゼ遺伝子）が包含されてな
る薬剤である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、増殖因子等を提示
するタンパク質中空ナノ粒子を用いた治療薬剤に関し、
より詳細には、粒子内部に疾患治療用の細胞導入物質を
包含し、この細胞導入物質を特定の細胞または組織内に
特異的に導入可能な薬剤に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】近年、医学の分野において、患部に直接
作用し、高い効果を示す副作用の少ない薬品の開発が盛
んに行われている。特に、ドラッグデリバリーシステム
（ＤＤＳ）と呼ばれる方法は、目的細胞、あるいは、目
的組織に対して特異的に薬剤等の有効成分を運搬し、目
的箇所で有効成分を作用させることのできる方法として
注目されている。

【０００３】また、最近の分子細胞生物学の分野におい
ても特定細胞への遺伝子導入は必要不可欠な技術として
盛んに研究されている。さらに、ヒトゲノム計画の進展
により各種疾患の遺伝的な背景が明らかになりつつある
現在、このような細胞および組織に対する特異性の高い
遺伝子導入法が確立されれば遺伝子治療の分野での応用
も可能となる。

【０００４】細胞に遺伝子を導入する方法としては、こ
れまでに、遺伝子を巨大分子化してエンドサイトーシス
によって遺伝子を取込ませる方法（リン酸カルシウム
法、リポフェクタミン法）や、電気パルス刺激により細
胞膜に穿孔を開け、遺伝子を流入させる方法（エレクト
ロポレーション法、遺伝子銃法）が知られており、いず
れも今日では分子生物学的実験において、一般的に実施
されている手法である。

【０００５】これらの方法は簡便であるが、細胞を直
接、物理的に傷つけ、遺伝子導入部位を外科的に露出さ
せる必要があるため、生体内部の細胞や組織には容易に
適用できない。また、１００％近い導入率を得ることは
難しい。

【０００６】一方、安全性の高い物質導入方法としては
リポソーム法が知られている。この方法は、細胞を傷つ
けることがないため、生体内部の細胞や組織にも適用す
ることが可能である。しかし、単純な脂質であるリポソ
ームに高度な細胞および組織特異性を付与することは困
難であり、さらに、in vivoでの遺伝子導入率は、要求
される値に比べてはるかに低いという問題がある。

【０００７】最近になって、ウィルスＤＮＡに目的の遺
伝子を組み込み、感染性ウィルスを生成して遺伝子導入
を行う技術が開発された。この方法は導入部位を露出す
る必要がなく、個体にも応用でき、導入効率も１００％
近い画期的な方法として注目されるが、ウィルスが広範
囲の細胞に非特異的に感染するため目的の細胞以外にも
遺伝子が導入されてしまうという重大な問題がある。ま
た、ウィルスゲノム本体が染色体に組み込まれ、将来予
期できぬ副作用を引き起こす可能性があるため、実際に
は疾病の初期治療等には用いられず、末期の患者に適用
されるに留まっているのが現状である。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】以上のような状況に鑑
み、本発明者らは、国際公開番号ＷＯ０１／６４９３０
の国際出願（以下、「国際出願ＷＯ０１／６４９３０」
という）において、粒子形成能を有するタンパク質に生
体認識分子が導入された中空ナノ粒子を用いて、目的と
する細胞や組織に、物質（遺伝子、タンパク質、化合物
等）を特異的かつ安全に運搬、導入するための方法を提
案しているが、この方法を用いつつ特定の細胞または組
織に対して特異的に作用する治療薬剤の開発等がさらな
る課題となっていた。

【０００９】本発明は、上記の課題に鑑みなされたもの
であり、その目的は、タンパク質中空ナノ粒子を用いた
特定の細胞または組織に特異的に作用する疾患治療用薬
剤であって、動物実験により実際に治療効果が認められ
た薬剤、およびこの薬剤を用いる治療方法を提供するこ
とにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意検討
を重ねた結果、ヒト扁平上皮癌を移植した実験動物に対
して、癌治療用遺伝子を包含し、増殖因子を提示したＢ
型肝炎ウィルス表面抗原粒子を静脈注射することによ
り、ヒト扁平上皮癌細胞に特異的に癌治療用遺伝子が導
入され、移植癌を治療する効果があることを見出し、本
発明を完成させるに至った。

【００１１】即ち、本発明に係る薬剤は、増殖因子など
の特定の細胞表面分子と結合する分子が提示され、粒子
形成能を有するタンパク質からなる中空ナノ粒子に、疾
患治療用の細胞導入物質が包含されてなる薬剤である。

【００１２】上記「粒子形成能を有するタンパク質」と
しては、たとえば本来の肝細胞に対する感染能を欠失す
るように改変され、さらに増殖因子などを提示するよう
に改変されたＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質を挙
げることができる。このタンパク質は、真核細胞で発現
させると、小胞体膜上に膜タンパク質として発現、蓄積
され、粒子として放出される。こうして得られた中空ナ
ノ粒子は、粒子表面に増殖因子などが提示されているの
で、特定の細胞に対して特異的に粒子内の物質を運搬す
ることができる。ここで、「特定の細胞」とは、例えば
増殖因子に対する受容体などを細胞表面に発現している
ため、その増殖因子と結合し、これにより上記中空ナノ
粒子内の物質が細胞内に導入される細胞をいう。

【００１３】従って、上記中空ナノ粒子に、疾患治療用
の物質（薬剤）を包含させることにより、特定の細胞ま
たは組織に対して特異的かつ効果的に作用する有効な治
療薬となる。

【００１４】上記「特定の細胞表面分子と結合する分
子」としては、上皮成長因子（ＥＧＦ）等の増殖因子
（換言すれば、成長因子）のほかに、インターロイキ
ン、インターフェロン、コロニー刺激因子、腫瘍壊死因
子、トランスフォーミング増殖因子β、血小板由来増殖
因子、エリスロポイエチン、Fas抗原、アクチビン、骨
形成因子、神経成長因子などが挙げられる。

【００１５】上記中空ナノ粒子内に包含させる細胞導入
物質としては、たとえば癌治療用の遺伝子を挙げること
ができる。癌治療用遺伝子として、単純ヘルペスウィル
ス由来チミジンキナーゼ（ＨＳＶ１ tk）遺伝子を包含
した薬剤を用いる場合は、後述の実施例に示すとおり、
別途ガンシクロビルを投与する。

【００１６】本発明の薬剤は、静脈注射という簡便な方
法で特定の細胞または組織における疾患を効果的に治療
することができ、従来の治療方法と大きく異なり、多量
の薬剤の投与あるいは遺伝子治療等における外科手術を
必要とせず、副作用の心配も極めて低く、そのまま臨床
応用可能なものである。

【００１７】本発明の治療方法は、本発明の薬剤を投与
することによる疾患の治療方法である。

【００１８】

【発明の実施の形態】本発明の薬剤を構成する中空ナノ
粒子は、粒子形成能を有するタンパク質に生体認識分子
（増殖因子などの特定の細胞表面分子と結合する分子）
を導入することによって、例えば増殖因子に対する受容
体などを発現している目的細胞あるいは目的組織に特異
的に物質を運搬することを可能とするものである。この
ような粒子形成能を有するタンパク質としては、種々の
ウィルスから得られるサブウィルス粒子を適用すること
ができる。具体的には、Ｂ型肝炎ウィルス（HepatitisB
Virus:ＨＢＶ）表面抗原タンパク質等が例示される。

【００１９】また、このような粒子形成能を有するタン
パク質からなるタンパク質粒子としては、真核細胞でタ
ンパク質を発現させることにより得られるものが挙げら
れる。つまり、真核細胞で粒子形成能を有するタンパク
質を発現させると、同タンパク質は、小胞体膜上に膜タ
ンパク質として発現、蓄積され、粒子として放出される
のである。このとき、真核細胞としては、酵母、昆虫細
胞、哺乳細胞等の動物細胞などが適用できる。

【００２０】本発明者らは、後述の実施例に示すとお
り、遺伝子組換え酵母で上記ＨＢＶ表面抗原Ｌタンパク
質を発現させることにより、発現されたＨＢＶ表面抗原
Ｌタンパク質から酵母由来の脂質二重膜に多数の同タン
パク質が埋め込まれた短径約２０ｎｍ、長径約１５０ｎ
ｍの楕円状中空粒子が形成されることを見出し、報告し
ている（J. Biol. Chem., Vol.267, No.3, 1953-1961,
1992）。このような粒子は、ＨＢＶゲノムを全く含まな
いので、ウィルスとしては機能せず、人体への安全性が
極めて高い。また、上記ＨＢＶ表面抗原Ｌタンパク質
を、本来の肝細胞に対する感染能を欠失するように改変
し、さらに例えば増殖因子を提示するように改変して発
現させた場合は、増殖因子を粒子表面に提示しているた
め、この増殖因子に対する受容体などを発現する細胞に
対して特異的に物質を運搬する運搬体としての効果も高
いのである。

【００２１】このように遺伝子組換え酵母を用いてタン
パク質粒子を形成する方法は、菌体内の可溶性タンパク
質から高効率で粒子が生産される点で好適である。

【００２２】一方、昆虫細胞は、酵母よりも高等動物に
近い真核細胞であるといえ、酵母では再現しきれない糖
鎖等の高次構造をも再現できる点で異種タンパク質の大
量生産において好ましい方法といえる。従来の昆虫細胞
の系はバキュロウイルスを用いた系で、ウィルス発現を
伴うものであったために、タンパク質発現に際して細胞
が死滅したり溶解したりした。その結果、タンパク質発
現を連続的に行ったり、死滅細胞から遊離したプロテア
ーゼによりタンパク質が分解したりするという問題があ
った。また、タンパク質を分泌発現させる場合には、培
地中に含まれる大量の牛胎仔血清が混入することで、折
角培地中に分泌されても精製が困難であった。しかし、
最近になって、バキュロウイルスを介さない昆虫細胞系
で、無血清培養可能なものがInvitrogen社により開発さ
れ、市販されている。従って、このような昆虫細胞を用
いれば、精製が容易で高次構造をも再現されたタンパク
質粒子が得られる。

【００２３】本発明のタンパク質中空ナノ粒子では、以
上のような種々の方法によって得られた粒子表面に増殖
因子などを提示する中空ナノ粒子に対して、種々の物質
（ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ぺプチド、および薬剤
等）を粒子内に導入することにより、その増殖因子に対
する受容体などを発現する特定の細胞または組織に極め
て高い特異性で物質を運搬、導入することが可能とな
る。

【００２４】もちろん、粒子形成能を有するタンパク質
は、上記の改変されたＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパ
ク質に限られるものではなく、粒子を形成することがで
きるタンパク質であれば、どのようなものでもよく、動
物細胞、植物細胞、ウィルス、菌類等に由来する天然タ
ンパク質や、種々の合成タンパク質等が考慮される。ま
た、例えばウィルス由来の抗原タンパク質等が生体内に
おいて抗体を惹起する可能性がある場合などは、改変し
て抗原性を減少させたものを粒子形成能を有するタンパ
ク質として用いてもよい。例えば、国際出願ＷＯ０１／
６４９３０に開示される抗原性を減少させたＢ型肝炎ウ
ィルス表面抗原タンパク質であってもよいし、同国際出
願に開示されるその他の改変型タンパク質（Ｂ型肝炎ウ
ィルス表面抗原タンパク質を、遺伝子操作技術を用いて
改変したタンパク質）であってもよい。

【００２５】粒子表面に提示させる増殖因子などの特定
の細胞表面分子と結合する分子としては、たとえば後述
の上皮成長因子（ＥＧＦ）のほかに、インターロイキ
ン、インターフェロン、コロニー刺激因子、腫瘍壊死因
子、トランスフォーミング増殖因子β、血小板由来増殖
因子、エリスロポイエチン、Fas抗原、アクチビン、骨
形成因子、神経成長因子などが好ましく用いられる。こ
れらは、目的とする細胞、あるいは組織に応じて適宜選
択される。

【００２６】本発明では、以上のとおりのタンパク質中
空ナノ粒子に、目的細胞または組織に導入したい物質
（細胞導入物質）を内包させることによって、細胞特異
性を有する物質運搬体が得られる。この物質運搬体に内
包される細胞導入物質とは、例えばＤＮＡ、ＲＮＡなど
の遺伝子、天然あるいは合成タンパク質、オリゴヌクレ
オチド、ぺプチド、薬剤、天然あるいは合成化合物な
ど、どのようなものであってもよい。

【００２７】具体的には、既に発明者らにより報告され
たヒトＲＮａｓｅ１（Jinno H, Ueda M, Ozawa S, Iked
a T, Enomoto K, Psarras K, Kitajima M, Yamada H, S
enoM Life Sci. 1996;58(21):1901-8）またはＲＮａｓ
ｅ３（別名ＥＣＰ：eosinophil cationic protein ；Ma
llorqui-Fernandez G, Pous J, Peracaula R, AymamiJ,
Maeda T, Tada H, Yamada H, Seno M, de Llorens R,
Gomis-Ruth FX, CollM; J Mol Biol. 2000 Jul 28;300
(5):1297-307.）等が適用される。

【００２８】これらのタンパク質は、細胞内外で作用し
細胞傷害活性を有するものであるが、これらのＲＮａｓ
ｅを本発明の物質運搬体（薬剤）に内包させて運搬する
ことにより、細胞外では無毒化する一方、細胞内だけで
作用させることができるので、より副作用の少ない新し
い癌治療方法として期待される。

【００２９】なお、上記細胞導入物質として、ほかに下
記表１に示すタンパク質あるいは当該タンパク質をコー
ドする遺伝子が挙げられ、さらに、癌疾患に有効なサイ
トカイン各種(インターフェロン各種、インターロイキ
ン各種など)、癌抑制遺伝子（ｐ５３等）等の治療遺伝
子も挙げることができる。

【００３０】

【表１】

【００３１】また、これらの細胞導入物質を上記の中空
ナノ粒子に導入する方法としては、通常の化学的、分子
生物学的実験手法で用いられる様々な方法が適用され
る。たとえば、エレクトロポレーション法、超音波法、
単純拡散法、あるいは電荷を有する脂質を用いる方法等
が好ましく例示される。

【００３２】そして、これらのタンパク質中空ナノ粒
子、あるいは物質運搬体を用いて、invivoあるいはin v
itroで細胞、または組織に特異的に物質を導入すること
が可能となる。さらには、上記のＲＮａｓｅを用いた例
のように、以上のとおりのタンパク質中空ナノ粒子や物
質運搬体を用いて、特定細胞または組織に物質を導入す
ることを各種疾患の治療法あるいは治療法の１ステップ
として行うことも可能になるのである。

【００３３】本発明の薬剤による治療効果については、
後述の実施例に示すとおり、動物実験により実際に確認
された。この実施例では、ヒト扁平上皮癌由来の細胞を
移植したヌードマウスに、単純ヘルペスウィルス由来チ
ミジンキナーゼ（ＨＳＶ１ tk）遺伝子を包含した本発
明の薬剤を投与し、さらにガンシクロビル(ganciclovi
r:GCV)を投与した後、移植した癌組織の大きさを観察す
ることにより治療効果を確認した。薬剤の投与は静脈内
投与により行ったが、投与方法としては、このほかに、
経口投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与等が挙げ
られる。

【００３４】以下、添付した図面に沿って実施例を示
し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明す
る。もちろん、この発明は以下の例に限定されるもので
はなく、細部については様々な態様が可能であることは
言うまでもない。

【００３５】

【実施例】以下の実施例において、ＨＢｓＡｇとは、Ｂ
型肝炎ウィルス表面抗原（Hepatitis B virus surface
Antigen）を示す。ＨＢｓＡｇは、ＨＢＶの外被タンパ
ク質であり、図１の摸式図に示すように、ＨＢｓＡｇに
は、Ｓタンパク質、Ｍタンパク質、Ｌタンパク質の３種
類がある。このうち、Ｓタンパク質は、３種のタンパク
質に共通した、重要な外被タンパク質であり、Ｍタンパ
ク質は、Ｓタンパク質のＮ末端側に５５アミノ酸（pre-
S2 peptide）が付加したものである。また、Ｌタンパク
質は、Ｍタンパク質のＮ末端側に、１０８もしくは１１
９アミノ酸（pre-S1 peptide）が付加したものである。

【００３６】ＨＢｓＡｇＬタンパク質のPre-S領域（pr
e-S1, pre-S2）は、ＨＢＶが肝細胞に結合する際に、そ
れぞれ重要な役割を担うことが知られている。Pre-S1
は、肝細胞に直接結合する部位を持ち、pre-S2は、血中
の重合アルブミンを介して肝細胞に結合する重合アルブ
ミンレセプターを有するのである。

【００３７】真核細胞でＨＢｓＡｇを発現させると、同
タンパク質は、小胞体膜上に膜タンパク質として発現、
蓄積される。ＨＢｓＡｇのＬタンパク質は、分子間で凝
集を起こし、小胞体膜を取り込みながら、出芽様式でル
ーメン側に粒子として放出される。

【００３８】以下の実施例では、ＨＢｓＡｇのＬタンパ
ク質を用いた。また、図２に以下の実施例に記載される
ＨＢｓＡｇ粒子の発現および精製操作の概略説明図を示
した。

【００３９】（実施例Ａ）遺伝子組換え酵母によるＨ
ＢｓＡｇ粒子の発現本発明者らによって報告されたJ.Biol.Chem., Vol.267,
No.3, 1953-1961, 1992記載の方法に基づいて、ｐＧＬ
ＤＬIIＰ３９−ＲｃＴを保持した遺伝子組換え酵母（Sa
ccharomyces Cerevisiae AH22R^-株）を、合成培地High-
Piおよび8S5N-P400中で培養し、ＨＢｓＡｇＬタンパク
質粒子を発現させた。（図２ａ〜ｃ）定常成長期（約７
２時間後）にある遺伝子組換え酵母から、Yeast Protei
n Extraction Reagent（Pierce Chemical Co.製）を用
いて、whole cell extractを準備し、ドデシル硫酸ナト
リウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ）を用いて分離して、銀染色によって試料中のＨ
ＢｓＡｇの同定を行った。

【００４０】これより、ＨＢｓＡｇは分子量約５２ｋＤ
ａのタンパク質であることが明らかとなった。

【００４１】（実施例Ｂ）ＨＢｓＡｇ粒子の遺伝子組
換え酵母からの精製（１）合成培地８Ｓ５Ｎ−Ｐ４００で培養された遺伝子
組換え酵母（湿重量２６ｇ）をbuffer A溶液（７．５Ｍ
尿素、０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１５
ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭＰＭＳＦ、０．１％Ｔｗｅｅ
ｎ８０）１００ｍｌに懸濁し、グラスビーズを用いてビ
ードビーター（BEAD-BEATER）にて酵母を破砕した。破
砕後、上清を遠心分離により回収した。（図２ｄ）（２）次に、上清を０．７５倍容の３３％（ｗ／ｗ）Ｐ
ＥＧ６０００と混合し、３０分間氷冷した。その後、遠
心分離（７０００ｒｐｍ、３０分間）を行い、ペレット
を回収した。同ペレットは、Ｔｗｅｅｎ８０を含まない
buffer A溶液中で再懸濁した。

【００４２】（３）再懸濁した液を、１０〜４０％の勾
配をかけたＣｓＣｌに重層し、２８０００ｒｐｍ、１６
時間の超遠心分離を行った。遠心分離後の試料を１２画
分に分け、ウェスタンブロット法（Western Blotting）
（１次抗体は、ａｎｔｉ−ＨＢｓＡｇモノクローナル抗
体）によりＨＢｓＡｇを含む画分を同定した。さらに、
ＨＢｓＡｇを含む画分をＴｗｅｅｎ８０を含まないbuff
er A溶液で透析した。

【００４３】（４）（３）で得られた透析液（１２ｍ
ｌ）を５〜５０％の勾配をかけたショ糖に重層し、２８
０００ｒｐｍ、１６時間の超遠心分離を行った。遠心分
離後、（３）と同様に、ＨＢｓＡｇを含む画分を同定
し、ＨＢｓＡｇを含む画分を尿素とＴｗｅｅｎ８０は含
まず、代わりに０．８５％のＮａＣｌを含むbuffer A溶
液で透析した。（（２）〜（４）：図２ｅ）（５）（４）と同様の操作を繰り返し、透析後の試料を
ウルトラフィルター（Ultra Filter）Ｑ２０００（ア
ドバンテック社製）を用いて濃縮し、使用する時まで４
℃にて冷蔵保存した。（図２ｆ）ＣｓＣｌ平衡遠心分離後のウェスタンブロット（３）の
結果から、ＨＢｓＡｇは、分子量５２ｋＤａでＳ抗原性
を有するタンパク質であることが分かった。最終的に、
培地２．５Ｌ由来、湿重量２６ｇの菌体から、約２４ｍ
ｇの精製ＨＢｓＡｇ粒子を得た。

【００４４】一連の精製過程における画分を銀染色ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥで解析した。また、精製により酵母由来の
プロテアーゼが除去されていることを確認するために、
（５）で得られたＨＢｓＡｇ粒子を３７℃で１２時間イ
ンキュベートした後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、銀染色
により同定を行った。

【００４５】その結果、酵母由来のプロテアーゼは、一
連の精製過程において完全に除去されていることが確認
された。

【００４６】（実施例Ｃ）生体認識分子提示用汎用型
ＨＢｓＡｇ粒子（ＨＢｓＡｇ−Ｎｕｌｌ粒子）の作製ＨＢｓＡｇ粒子はヒト肝細胞特異的に感染することがで
きるが、その高い感染性を担う同粒子表面に提示されて
いる肝細胞認識部位は、pre-S1領域の３から７７アミノ
酸残基に含まれていることが判明している（Le Seyec
J, Chouteau P,Cannie I, Guguen-Guillouzo C, Gripon
P., J. Virol. 1999, Mar; 73(3): 2052-7）。

【００４７】ここでは、ＨＢｓＡｇ粒子の粒子形成能を
保ちながら、肝細胞に対する高い感染能を欠失し、かつ
任意の生体認識分子を粒子表面に提示することができる
改変ＨＢｓＡｇ粒子（以下「ＨＢｓＡｇ−Ｎｕｌｌ粒
子」という）の作製法を記す。

【００４８】実施例Ａに記載されたｐＧＬＤＬIIＰ３９
−ＲｃＴプラスミドのヒト肝細胞認識部位をコードする
遺伝子領域を欠失させ、同時に制限酵素NotIサイト（gc
ggccgc）を挿入するために、配列番号１のオリゴヌクレ
オチドと配列番号２のオリゴヌクレオチドをＰＣＲ用プ
ライマーとして使用して、QuickChange^TMSite-Directe
d Mutagenesis Kit （Stratagene社）を用いたＰＣＲ法
をｐＧＬＤＬIIＰ３９−ＲｃＴプラスミドに対して行っ
た。

【００４９】具体的には、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと
してPfu DNA polymerase (Stratagene) を用い、ＰＣＲ
スケジュールは、９５℃３０秒間の変性、５５℃１分間
のアニーリング、６８℃３０分間の合成反応を３０回繰
り返した。その後、ＰＣＲ産物を制限酵素DpnIで処理
し、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、出現コロニーからベ
クターＤＮＡを抽出し、塩基配列から変異導入されたｐ
ＧＬＤＬIIＰ３９−ＲｃＴプラスミドを選抜した。（以
下、「ｐＧＬＤＬIIＰ３９−ＲｃＴ（ｎｕｌｌ）」とい
う）。

【００５０】実施例Ａ記載の方法で、ｐＧＬＤＬIIＰ３
９−ＲｃＴ（ｎｕｌｌ）プラスミドを形質転換し、合成
培地High-Pi及び8S5N-P400中で培養し、ＨＢｓＡｇ−Ｎ
ｕｌｌ粒子を発現させた。

【００５１】定常成長期（培養開始から７２時間後）に
ある遺伝子組換え酵母から、YeastProtein Extraction
Reagent （Pierce Chemical社製）を用いて菌体粗抽出
液を作製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離し、銀染色
並びに抗Ｓモノクローナル抗体（フナコシ社）を用いる
Western法によりＨＢｓＡｇ−Ｎｕｌｌの同定を行っ
た。

【００５２】これより、ＨＢｓＡｇ−Ｎｕｌｌは分子量
約４２ｋＤａのタンパク質であることが明らかになっ
た。

【００５３】さらに、実施例Ｂに記載の方法に従って、
培地２．５Ｌ由来の上記菌体（約２６ｇ）から、約３ｍ
ｇの精製ＨＢｓＡｇ−Ｎｕｌｌ粒子を得た。ＨＢｓＡｇ
の粒子構造のみを検出することができるAuszyme II EIA
キット（ダイナボット社）を用いて、ＨＢｓＡｇ粒子及
びＨＢｓＡｇ−Ｎｕｌｌ粒子のＳ抗原性（ＨＢｓＡｇの
粒子化度合い）を測定したところ、両者とも同等の値が
観察された。

【００５４】（実施例Ｄ）上皮成長因子（ＥＧＦ： E
pidermal Growth Factor）提示型ＨＢｓＡｇ粒子（ＨＢ
ｓＡｇ−ＥＧＦ粒子）の作製ＥＧＦ受容体は極めて多くの細胞が細胞表層に発現して
いることが知られており、特にある種の癌（食道癌、大
腸癌等）の憎悪に関係していることが分かっている。そ
こで、ＥＧＦ受容体を標的とするＨＢｓＡｇ粒子を作製
すれば、ＥＧＦ受容体を発現する癌組織に対する有効な
治療手段になると考えられる。

【００５５】ここでは、実施例Ｃ記載の方法によるＨＢ
ｓＡｇ−Ｎｕｌｌ粒子を基にした、ＥＧＦ提示型ＨＢｓ
Ａｇ粒子（ＨＢｓＡｇ−ＥＧＦ粒子）の作製法を記す。

【００５６】ヒト由来ＥＧＦ前駆体ｃＤＮＡ断片（Bell
GI, Fong NM, Stempien MM, Wormsted MA, Caput D, K
u LL, Urdea MS, Rall LB, Sanchez-Pescador R Nuclei
c Acids Res 1986 Nov 11;14(21):8427-46）を鋳型とし
て、成熟型ヒトＥＧＦ領域（５３アミノ酸残基）をコー
ドする遺伝子断片をＰＣＲ法により常法どおり増幅し
た。

【００５７】用いた２種類のＰＣＲプライマーは、セン
ス側が配列番号３のオリゴヌクレオチド、アンチセンス
側が配列番号４のオリゴヌクレオチドで、両方とも５’
末端側に制限酵素NotIサイト（gcggccgc）を有するよう
に設計した。

【００５８】ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動で分離し
た後、目的のｃＤＮＡを含むバンド（約１７０ｂｐ）を
回収し、TOPO TA Cloning kit（Invitrogen社）を用い
てpCR2.1-TOPOベクター（Invitrogen社）にサブクロー
ニングした。塩基配列を確認した後、制限酵素NotIで切
断して、約１７０ｂｐの目的ＤＮＡ断片を回収し、ｐＧ
ＬＤＬIIＰ３９−ＲｃＴ（ｎｕｌｌ）を制限酵素NotIで
開裂させたものとTaKaRaLigation kit ver.2（TaKaRa
社）を用いて閉環結合させ、大腸菌ＤＨ５αを形質転換
した。

【００５９】塩基配列解析により選抜を行い、挿入した
ＥＧＦ遺伝子がＨＢｓＡｇ遺伝子と読み取り枠が一致し
て融合したものを選抜し、プラスミドをｐＧＬＤＬＩＩ
Ｐ３９−ＲｃＴ−ＥＧＦと命名した。

【００６０】実施例Ａの方法に基づいて、ｐＧＬＤＬII
Ｐ３９−ＲｃＴ−ＥＧＦプラスミドを形質転換し、合成
培地High-Pi及び8S5N-P400中で培養して、ＨＢｓＡｇ−
ＥＧＦ粒子を発現させた。

【００６１】定常成長期（培養開始から７２時間後）に
ある遺伝子組換え酵母から、YeastProtein Extraction
Reagent (Pierce Chemical社製)を用いて、菌体粗抽出
液を作製し、SDS-PAGEを用いて分離して、銀染色並びに
抗ヒトＥＧＦポリクローナル抗体（Santa Cruz社）を用
いるWestern法によりＨＢｓＡｇ−ＥＧＦの同定を行っ
た。

【００６２】これより、ＨＢｓＡｇ−ＥＧＦは分子量約
５０ｋＤａのタンパク質であることが明らかになった。

【００６３】実施例Ｂに記載の方法に従って、培地２．
５Ｌ由来の上記菌体（約２６ｇ）から、約３ｍｇの精製
ＨＢｓＡｇ−ＥＧＦ粒子を得た。ＨＢｓＡｇの粒子構造
のみを検出することができるAuszyme II EIAキット（ダ
イナボット社）を用いて、ＨＢｓＡｇ粒子およびＨＢｓ
Ａｇ−ＥＧＦ粒子のＳ抗原性（ＨＢｓＡｇの粒子化度合
い）を測定したところ、両者とも同等の値が観察され
た。

【００６４】したがって、ＨＢｓＡｇ−ＥＧＦ粒子がＨ
ＢｓＡｇ粒子と同様に得られていることが示された。

【００６５】（実施例Ｅ）ＨＢｓＡｇ−ＥＧＦ粒子へ
のＨＳＶ１ tk遺伝子の封入（ＨＳＶ１ tk遺伝子を包含
したＨＢｓＡｇ−ＥＧＦ粒子の製造）次に、上記方法により作製したＨＢｓＡｇ−ＥＧＦ粒子
内へ、癌治療用遺伝子として単純ヘルペスウィルス由来
チミジンキナーゼ（ＨＳＶ１ tk）遺伝子を封入し、本
発明の薬剤としてのＨＳＶ１ t遺伝子を包含したkＨＢ
ｓＡｇ−ＥＧＦ粒子を製造した。

【００６６】上記ＨＳＶ１ tk遺伝子が導入された癌細
胞では、このＨＳＶ１ tk遺伝子が発現することにより
ガンシクロビル(ganciclovir:GCV)に対して感受性にな
り、ガンシクロビルが投与されると、強力な巻き添え効
果を惹起しつつ、癌細胞は死滅する。このように、ＨＳ
Ｖ１ tk遺伝子は、癌遺伝子治療に広く使用される遺伝
子の１つである。

【００６７】本実施例では、ＨＢｓＡｇ−ＥＧＦ粒子内
へＨＳＶ１ tk遺伝子を封入するため、ＨＳＶ１ tk遺伝
子を発現するInvivogen社製のベクターｐＧＴ65−ｈＩ
ＦＮ−αを使用し、この発現ベクターをエレクトロポレ
ーション法によりＨＢｓＡｇ粒子内に導入することによ
って、ＨＢｓＡｇ−ＥＧＦ粒子内にＨＳＶ１ tk遺伝子
が包含された粒子を作製した。具体的には、ＨＢｓＡｇ
−ＥＧＦ粒子中のＬタンパク質粒子５０μｇに対し、上
記発現ベクター１０μｇ導入した。またこのとき、ＰＢ
Ｓバッファーを使用し、エレクトロポレーションの条件
は、２２０Ｖ、９５０μＦで４ｍｍのキュベットを使用
して行った。

【００６８】（実施例Ｆ）ヒト扁平上皮癌を移植した
ヌードラットに対するＨＳＶ１ tk遺伝子を包含したＨ
ＢｓＡｇ−ＥＧＦ粒子による癌治療効果次に、上記方法により作製したＨＳＶ１ tk遺伝子を包
含したＨＢｓＡｇ−ＥＧＦ粒子のヒト扁平上皮癌に対す
る治療効果を実験動物により確認した。

【００６９】本実施例では、実験動物として日本クレア
から購入したヌードラット（系統：F344/NJcl-rnu/rn
u、性別：メス）を使用して担癌ラットを作製し、治療
効果を確認した。担癌ラットは以下の方法により作製し
た。まず、ヒト腫瘍株（ヒト肝臓癌由来細胞ＨｕＨ−７
（JCRB0403）、および陰性対照としてヒト大腸癌由来細
胞ＷｉＤｒ（ATCC CCL-218））を培養し、通常の方法で
集細胞して得た１×１０ ⁶細胞を、ＨＢＢＳ（HanksＢＢ
Ｓ；血清なし）と懸濁し、氷中保存した。細胞と等量の
ベクトン＆ディッキンソン社製のMatrigel（40234C）
を、得られた懸濁液と混合し、使用説明書どおりに使用
して、ヌードラットに腫瘍を生着させた。そして、生着
させた腫瘍が直径２〜３ｃｍ程度の固形癌になるまで約
３週間生育させて、担癌ラットを得た。

【００７０】その後、上記担癌ラットに、ＨＳＶ１ tk
遺伝子を包含したＨＢｓＡｇ−ＥＧＦ粒子１０μｇ（こ
の量はＨＢｓＡｇ−ＥＧＦ粒子（この粒子は８０％のタ
ンパク質、１０％の糖鎖、１０％のリン脂質からなる）
のタンパク質量を意味する）を尾静脈より投与した（静
脈注射した）。そして、静脈注射の５日後から、上記担
癌ラットに対し、浸透圧ポンプ（alzet osmotic pump;C
at番号2ML2）を用いてガンシクロビル（ＧＣＶ）を５０
ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの割合で投与した。上記浸透圧ポン
プは、ＧＣＶを含む薬液とともに上記担癌ラットの背中
皮下に移植した。このガンシクロビルの投与は、最大１
４日間行った。ガンシクロビル投与後、上記担癌ラット
の腫瘍組織の状態（大きさ）を経時的に観察した。具体
的には、ノギスで腫瘍部分の短径と長径とを測定し、腫
瘍容積近似式（長径×短径×短径／２）を計算して行っ
た。測定は、全てネズミ３連で行った。その結果を下記
の表２および図３に示す。

【００７１】

【表２】

【００７２】表２および図３に示すように、ヒト肝臓癌
由来の腫瘍組織（ＮＵＥ）では経時的な退縮は観察され
ず、治療効果は認められなかったのに対して、ヒト扁平
上皮癌由来の腫瘍組織（Ａ４３１）では経時的な退縮が
観察され、ＨＳＶ１ tk遺伝子を包含したＨＢｓＡｇ−
ＥＧＦ粒子によるヒト扁平上皮癌特異的な治療効果が認
められた。

【００７３】また、対照実験として、ＥＧＦ等の増殖因
子を提示していない前記のＨＢｓＡｇ−Ｎｕｌｌ粒子
（上記ＨＳＶ１ tk遺伝子を包含したもの）を同じヌー
ドラットに投与したところ、ランダムに遺伝子が導入さ
れてしまい、扁平上皮癌特異的な治療効果および肝癌特
異的な治療効果ともに認められなかった。

【００７４】このように、本発明に係る薬剤としての上
記ＨＳＶ１ tk遺伝子を包含したＨＢｓＡｇ−ＥＧＦ粒
子は、ヒト扁平上皮細胞に対して極めて高い特異性と効
率で遺伝子導入が可能であり、扁平上皮癌に対して実際
に治療効果があることが確認された。また、本実験によ
り、本発明の薬剤による扁平上皮癌等の疾患治療のため
のプロトコールを実験動物で確立することができた。

【００７５】

【発明の効果】以上のように、本発明に係る薬剤は、静
脈注射という簡便な方法で、特定の細胞または組織にお
ける疾患を特異的かつ効果的に治療することができ、従
来の遺伝子治療と大きく異なり、外科手術を必要とせ
ず、副作用の心配もきわめて低く、そのまま臨床応用可
能なものである。

【００７６】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Japan Science and Technology Corporation <120> Growth factors （or the like） presented protein hollow nano-parti cles for therapeutic drug <130> P023P02 <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> Synthesized Oligonucleotide <400> 1 cgacaaggca tgggaggcgg ccgcagccct caggctcag 39 <210> 2 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> Synthesized Oligonucleotide <400> 2 ctgagcctga gggctgcggc cgcctcccat gccttgtcg 39 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> Synthesized Oligonucleotide <400> 3 ggggcggccg catgaactct gattccg 27 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> Synthesized Oligonucleotide <400> 4 gggcggccgc cacgcagttc ccaccatttc 30

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施例におけるＨＢｓＡｇ遺伝子の各
タンパク質領域を表す概略摸式図である。１〜８は、表
面抗原における各部位の働きを示している。

【図２】本発明の実施例における遺伝子組換え酵母を用
いたＨＢｓＡｇ粒子の発現および精製操作を例示した概
略説明図である。（ａ）遺伝子組換え酵母の作製、
（ｂ）Ｈｉｇｈ−Ｐｉ培地における培養、（ｃ）８Ｓ５
Ｎ−Ｐ４００培地における培養、（ｄ）破砕、（ｅ）密
度勾配遠心分離、（ｆ）ＨＢｓＡｇ粒子。

【図３】本発明に係る薬剤について、実験動物で行った
治療効果を示すグラフである。

【符号の説明】

１粒子形成抑制部位２直接的なヒト肝細胞特異的レセプター３糖鎖１４間接的なヒト肝細胞特異的レセプター（重合ヒト
血清アルブミンレセプター）５膜貫通領域１６膜貫通領域２７糖鎖２８膜貫通領域３

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/02 // Ｃ０７Ｋ 14/02 Ａ６１Ｋ 37/02 ＺＮＭＣ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者上田政和東京都新宿区納戸町６ (72)発明者妹尾昌治岡山県岡山市門田文化町２−10−13 (72)発明者岩蕗秀彦大阪府茨木市豊川４−２−１Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA10 BA80 CA04 CA07 DA02 EA04 FA02 GA11 4C076 AA12 AA65 BB13 CC27 EE41H FF11 FF31 4C084 AA13 CA18 MA01 MA17 MA38 MA65 NA13 NA14 ZB262 4H045 AA30 BA10 BA41 CA02 DA50 DA86 EA20 FA72 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】増殖因子などの特定の細胞表面分子と結合
する分子が提示され、粒子形成能を有するタンパク質か
らなる中空ナノ粒子に、疾患治療用の細胞導入物質が包
含されてなる薬剤。
【請求項２】上記タンパク質は、改変されたＢ型肝炎ウ
ィルス表面抗原タンパク質であることを特徴とする請求
項１記載の薬剤。
【請求項３】上記細胞導入物質は、遺伝子であることを
特徴とする請求項１または２記載の薬剤。
【請求項４】上記遺伝子は、癌治療用の遺伝子であるこ
とを特徴とする請求項３記載の薬剤。
【請求項５】上記遺伝子は、単純ヘルペスウィルス由来
チミジンキナーゼ（ＨＳＶ１ tk）遺伝子であることを
特徴とする請求項４記載の薬剤。
【請求項６】静脈注射により人体に投与されることを特
徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項７】請求項１〜６のいずれか１項に記載の薬剤
を投与することによる疾患の治療方法。