ES2207177T3

ES2207177T3 - Proteinas nucleo de la hepatitis b estrategicamente modificas y sus derivados.

Info

Publication number: ES2207177T3
Application number: ES99906969T
Authority: ES
Inventors: Ashley J. Birkett
Original assignee: Apovia Inc
Current assignee: Apovia Inc
Priority date: 1998-02-12
Filing date: 1999-02-11
Publication date: 2004-05-16
Anticipated expiration: 2019-02-11
Also published as: BR9907855A; NZ506245A; JP4480268B2; CA2320488C; JP2002509700A; CN1300222A; KR100581991B1; IL137766A; DE69911175T2; DE69911175D1; AU2675399A; TR200002338T2; CZ20002819A3; CN100387622C; EP1054689A4; ID26669A; IL137766A0; US6231864B1; PT1054689E; CZ302092B6

Abstract

Un conjugado de una proteína del núcleo central de la hepatitis B modificada que contiene una proteína del núcleo central de la hepatitis B modificada unida de manera colgante a un hapteno, en el que la proteína del núcleo central de la hepatitis B modificada contiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de aminoácidos de la proteína del núcleo central de la hepatitis B de SEC ID Nº: 2, incluyendo los residuos de aminoácidos numerados como 10 a 140 y teniendo adicionalmente un inserto de una secuencia de aminoácidos en la región correspondiente a los residuos de aminoácidos numerados como 50 a 100, teniendo dicho inserto (i) de 1 a 40 residuos de aminoácidos de longitud y (ii) conteniendo dicho inserto un residuo de aminoácido químicamente reactivo, estando dicho hapteno unido de manera colgante al residuo de aminoácido químicamente reactivo en dicha proteína del núcleo central de la hepatitis B modificada.

Description

Proteínas núcleo de la hepatitis B estratégicamente modificadas y sus derivados.

Campo técnico

La presente invención está relacionada con la intersección de los campos de la inmunología y la producción de proteínas, y particularmente con proteínas transportadoras, y más particularmente con una proteína de la nucleocápsida de hepadnavirus modificada estratégicamente con un residuo de aminoácido químicamente reactivo insertado, con un conjugado de esa proteína de la nucleocápsida de hepadnavirus con un hapteno unido de manera colgante y con una partícula inmunogénica compuesta por esos conjugados.

Antecedentes de la invención

Se sabe que pueden producirse anticuerpos hacia una molécula pequeña mediante la utilización de una molécula de proteína inmunogénica grande como transportadora. La molécula pequeña que obtiene una inmunogenicidad incrementada por ser conjugada al transportador es denominada hapteno. El fenómeno de una molécula relativamente grande que potencia la inmunogenicidad de una entidad molecular pequeña a la que está unida es conocido en la técnica como "efecto transportador".

La porción de un inmunógeno reconocida por la célula T cooperadora (célula Th) es el determinante de la célula T o epítopo. La porción de un inmunógeno a la que se une un anticuerpo es el determinante de la célula B o epítopo. Los efectos transportadores pueden ser definidos como inmunidad hacia un determinante, el determinante "cooperador" o de células T (T_{h}), de un inmunógeno multideterminante que incrementa la respuesta inmune hacia otro determinante, el determinante de células B.

Actualmente está bien establecido que la mayoría de los inmunógenos requieren la cooperación de células T para inducir la producción de anticuerpos por las células B. Por tanto, las células T_{h}, mediante el reconocimiento de los determinantes cooperadores en el inmunógeno, ayudan a las células B a producir anticuerpos contra el inmunógeno.

Los determinantes antigénicos reconocidos por las células T cooperadoras (T_{h}) y por las células B deben estar asociados para formar una única entidad molecular, pero no tienen que estar unidos covalentemente. Ver, Russel y col., Nature, 280:147 (1979), Lamb y col., J. Immunol., 129:1465 (1982), Scherle y col., J. Exp. Med., 164:1114 (1986) y Lake y col., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 41:589 (1976). Algunos inmunógenos no requieren la ayuda de células T para inducir la formación de anticuerpos, éstos son antígenos independientes de T.

Una proteína relacionada con un patógeno puede ser remedada inmunológicamente mediante la producción de un polipéptido sintético cuya secuencia corresponda a la de un determinante del patógeno. Tales inmunógenos polipeptídicos están descritos por Sutcliffe y col., Nature, 287:801 (1980) y Lerner y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:3403 (1981).

Gerin y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:2365 (1983), mostraron una protección limitada de chimpancés frente al virus de la hepatitis B después de la inmunización con polipéptidos sintéticos unidos a un transportador que tenían secuencias de residuos de aminoácidos que correspondían a la secuencia de una porción determinante del HBsAg; en particular, los residuos 110-137 de la región "S" (superficie). Sin embargo, la proteína transportadora utilizada en esos estudios era la hemocianina de la lapa ojo de cerradura (KLH), un transportador dependiente de células T que no es adecuado para utilización en aplicaciones médicas a humanos debido a que es una fuente de irritación que conduce a una inflamación grave.

Las proteínas transportadoras estimuladoras de células T capaces de incrementar la inmunogenicidad de haptenos que no producen efectos colaterales inaceptables en sujetos humanos, son a menudo proteínas inmunogénicas naturales. Por ejemplo, el toxoide tetánico (TT) ha sido utilizado frecuentemente cuando se necesitaba un transportador adecuado para la administración a humanos. Sin embargo, la utilización del toxoide tetánico como transportador fue limitada debido a problemas con limitaciones de la dosificación y al riesgo de sensibilización al propio toxoide. Además, puede tener lugar una supresión de la respuesta al hapteno transportado específica de un epítopo en individuos ya inmunizados contra el tétanos.

La proteína de superficie de la hepatitis B ha sido propuesta como transportadora para epítopos heterólogos. Delpeyroux y col., Science, 233:472-475 (1986), describieron la utilización de la proteína de superficie del VHB (proteína S) como transportadora para un hapteno polipeptídico de poliovirus. Esos investigadores construyeron un vehículo de expresión de una proteína de ácido desoxirribonucleico (ADN) recombinante que producía una proteína de fusión, denominada HBsPolioAg, capaz de formar partículas que se asemejaban estrechamente a las partículas de HBsAg de 22 nanometros auténticas. La HBsPolioAg consta de la proteína S del VHB que tiene un inserto de una secuencia de 11 residuos de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 93-103 de la proteína de la cápsida VPI de poliovirus de tipo I (cepa Mahoney).

Las proteínas de la nucleocápsida de hepadnavirus han sido utilizadas como transportadoras de haptenos. Secuencias peptídicas inmunogénicas heterólogas insertadas internamente en el núcleo central de la hepatitis B, expresadas como partículas de fusión, producían respuestas inmunes muy intensas en animales inmunizados en ausencia de adyuvantes. B.E. Clarke y col., Vaccines, 91:313-318 (1991), F. Schödel y col., J. Virol., 66(1):106-114 (1992). Las Patentes de EE.UU. N^{os} 4.818.527, 4.882.145 y 5.143.726 y la EP-A1-0 421 635 describen la utilización del efecto transportador con la proteína de la nucleocápsida del virus de la hepatitis B para incrementar la inmunogenicidad de un hapteno polipeptídico ligado operativamente. Esas patentes describen la unión de un hapteno polipeptídico a la proteína de la nucleocápsida del virus de la hepatitis B a través de una cadena lateral de residuos de aminoácidos que se presenta de forma natural en la secuencia de la proteína de la nucleocápsida de la hepatitis B.

Las proteínas de la nucleocápsida de hepadnavirus están bastante bien estudiadas. Las SEC ID N^{os}: 1 y 2 son las secuencias de ADN y de aminoácidos de la proteína del núcleo central de la hepatitis B humana (HBc), subtipo ayw, según se describen en las Patentes de EE.UU. N^{os} 4.818.527, 4.882.145 y 5.143.726.

Otras secuencias de las proteínas de la nucleocápsida de hepadnavirus son también conocidas en la técnica, ver por ejemplo las SEC ID N^{os}: 3-13. Secuencias de proteínas adicionales del núcleo central de la hepatitis B están descritas en WO-A-9809649 y en la base de datos de la EMBL, número de entrada Q68008.

Existen razones para seleccionar proteínas de la nucleocápsida de hepadnavirus como transportadoras sobre otros transportadores utilizados en la técnica, tales como la hemocianina de la lapa ojo de cerradura (KLH), BCG, el toxoide tetánico y el toxoide de difteria. KLH, BCG, el toxoide tetánico y el toxoide de difteria no son particulados, mientras que las proteínas de la nucleocápsida de hepadnavirus tienden a agregarse en "partículas". Las partículas de HBc tienden a tener mayor inmunogenicidad que las partículas del antígeno de superficie de la hepatitis B
(HBsAg). D.R. Milich y col., Science, 234:1398-1401 (1986). HBc es un inmunógeno independiente de células T y a la vez dependiente de células T. Id. HBc es una de las proteínas más inmunogénicas conocidas. Casi todas las personas infectadas con hepatitis B desarrollan una potente respuesta inmune a la proteína del núcleo central. J.H. Hoofnagle, Semin. Liver Dis., 1(1):7-14 (1981). La HBc puede proporcionar sensibilidad universal, independientemente del fondo genético. Id. La HBc activa directamente a las células T. La HBc produce potentes respuestas de células T_{h}. La HBc es procesada y presentada eficazmente por las células presentadoras de antígeno. Debido a la inherentemente elevada inmunogenicidad de la HBc, típicamente no se requieren adyuvantes complejos, por ejemplo, es suficiente el común y barato alumbre.

La familia hepadnaviridae es una familia de virus animales con envoltura que tienen un núcleo central de ADN y que causan hepatitis B en humanos. Los hepadnaviridae no son responsables de la hepatitis A humana (un enterovirus de ARN de hebra sencilla), de la hepatitis C humana (familia Flaviridae de virus ARN de hebra sencilla), ni de la hepatitis D humana (un virus satélite de ARN de sentido negativo circular cerrado, el "virus delta", que requiere el virus de la hepatitis B para su replicación). La familia hepadnaviridae incluye virus de la hepatitis de otras especies, por ejemplo de la marmota de América, del pato, de la ardilla de tierra y de la garza, además del virus de la hepatitis B humano y de simio. Hepatitis B (HB) utilizado de aquí en adelante se refiere a la familia hepadnaviridae, a no ser que la discusión se esté refiriendo a un ejemplo específico.

Los monómeros de la proteína del núcleo central de la hepatitis B se autoensamblan en agregados estables conocidos como partículas de proteínas del núcleo central de la hepatitis B (partículas HBc). Por ejemplo, las partículas HBc humanas tienen 27 nanometros (nm) de diámetro. Conway y col., Nature, 386:91-94 (1997), describen la estructura de partículas HBc humanas a una resolución de 9 \ring{A}ngstroms, según se determinó a partir de micrografías crioelectrónicas. Bottcher y col., Nature, 386: 88-91 (1997), describen el plegamiento de polipéptidos para los monómeros de HBc humana, y proporcionan un esquema de numeración aproximado de los residuos de aminoácidos en los que se forman las regiones helicoidales alfa y sus regiones bucle de unión. Bottcher y col. proponen un bucle de 78 a 82 residuos aproximadamente de la proteína del núcleo central de la hepatitis B.

Utilizando péptidos sintéticos y anticuerpos monoclonales, la región del bucle inmunodominante de HBc fue mapeada para los residuos de aminoácidos 75 a 83 aproximadamente. G. Colucci y col., J. Immunol., 141:4376-4380 (1988). Otros trabajadores describieron dos epítopos lineales inmunodominantes en los residuos de aminoácidos 75 a 85 y 130 a 140. Salfeld y col., J. Virol., 63:798 (1989).

Mutantes por inserción de la proteína del núcleo central de la hepatitis B son todavía capaces de formar partículas del núcleo central cuando epítopos foráneos son clonados en la región del bucle inmunodominante de HBc. P. Pumpens y col., Intervirology, 38:63-74 (1995). Las proteínas de fusión de HBc forman partículas en sistemas de expresión procarióticos y eucarióticos. Id.

La capacidad para utilizar una proteína como transportadora de un hapteno ligado de manera colgante depende de varios factores que han sido estudiados con respecto a HBc. Cadenas laterales de aminoácidos químicamente reactivos, tales como lisina (K), ácido aspártico (D), ácido glutámico (E) y residuos de cisteína reducida (C), proporcionan grupos funcionales que pueden ser útiles para modificar polipéptidos.

La secuencia de la proteína del núcleo central de la hepatitis B tiene varias cadenas laterales de aminoácidos químicamente reactivos en la secuencia nativa. El núcleo central tiene tres grupos amino primarios, uno en el extremo amino, y dos residuos de lisina (K5 y K96), junto con cuatro residuos de cisteína (C48, C61, C107 y C183). Hay varios grupos de ácido carboxílico, D (2, 4, 22, 29, 32, 78, 83) y E (8, 14, 40, 43, 46, 64, 77, 113, 117, 145, 179) y el extremo carboxi.

Sin embargo, la partícula de proteínas del núcleo central de la hepatitis B nativa, no modificada, no presenta reactividad química apreciable de las cadenas laterales de aminoácidos en la secuencia nativa. La reactividad química de una cadena lateral de aminoácidos en una proteína depende de la naturaleza de la cadena lateral de aminoácidos y de su entorno en la proteína plegada.

Según se discute con detalle en la presente más adelante, se ha encontrado ahora que el problema de la baja reactividad de las cadenas laterales de aminoácidos de la proteína de la nucleocápsida de la hepatitis B nativa puede ser resuelto mediante la inserción en la secuencia de la proteína HBc de una cadena lateral de aminoácidos químicamente reactiva. Una partícula de proteínas del núcleo central de hepadnavirus estratégicamente modificada de la presente invención presenta una reactividad sustancialmente incrementada hacia la derivatización de las partículas de HBc con haptenos unidos químicamente, y proporciona una inmunogenicidad incrementada a esos haptenos ligados.

Estas proteínas HBc modificadas y sus derivados conjugados con un hapteno unido de manera colgante se discuten en la descripción que sigue.

Breve resumen de la invención

La presente invención se refiere a una proteína del núcleo central de la hepatitis B (HBc) estratégicamente modificada que está unida a un hapteno colgante a través de un residuo de aminoácido químicamente reactivo insertado en la secuencia de la HBc. La modificación de la HBc es una mutación por inserción de la proteína HBc de 1 a 40 residuos de aminoácidos de longitud, preferiblemente de 1 a 10 residuos de aminoácidos de longitud, e incluye un residuo de aminoácido químicamente reactivo al que está unido el hapteno.

El inserto es proporcionado a la región correspondiente a los residuos de aminoácidos 50 a 100 de la secuencia de la proteína del núcleo central de la hepatitis B mostrada en la SEC ID Nº: 2. La región de inserción preferida corresponde a la región del bucle inmunodominante de la proteína del núcleo central de la hepatitis B en el residuo de aminoácido 70 a 90, más preferiblemente la región del extremo del bucle en el aminoácido 78 a 82, y más preferiblemente en el aminoácido 78 hasta el aminoácido 80. Esta modificación es referida en la descripción como "estratégicamente modificada".

Tal residuo de aminoácido químicamente reactivo introducido se caracteriza porque tiene una cadena lateral químicamente reactiva que proporciona un grupo químico para ligar de manera colgante la HBc estratégicamente modificada al hapteno. Típicamente, el residuo de aminoácido químicamente reactivo es un residuo de lisina, cisteína o histidina o un residuo que contenga carboxilo tal como ácido aspártico o ácido glutámico, preferiblemente lisina o un residuo que contenga carboxilo, y muy preferiblemente lisina.

El hapteno unido al residuo de aminoácido químicamente reactivo es cualquier compuesto de interés para generar una respuesta inmune, y es típicamente un determinante de células B. Preferiblemente, el hapteno es un hapteno polipeptídico, un hapteno carbohidrato o un hapteno no peptídico/no sacarídico (químico). En una realización de la invención, el hapteno es un hapteno relacionado con un patógeno, tal como un determinante de células B de un patógeno.

En otra realización de un conjugado de la proteína del núcleo central de la hepatitis B estratégicamente modificada, la proteína del núcleo central de la hepatitis B estratégicamente modificada tiene también una secuencia de residuos de aminoácidos estimuladora de células T unida operativamente al extremo carboxi de la secuencia de aminoácidos del núcleo central de la hepatitis B. Preferiblemente, el hapteno y la secuencia de residuos de aminoácidos estimulante de células T están ambos relacionados con un patógeno, muy preferiblemente, ambos están relacionados con (proceden de) el mismo patógeno.

En la anterior realización de la invención, la respuesta a un epítopo de células B es reforzada proporcionando también el determinante de células T cooperadoras (T_{h}). En esta realización preferida de la invención, tal determinante de células T_{h} procede del mismo patógeno que el hapteno determinante de células B que está unido de manera colgante a la proteína del núcleo central de la hepatitis B estratégicamente modificada, con el fin de proporcionar una memoria de células T específicas del patógeno además de la memoria de células T específicas para el antígeno proteína del núcleo central de la hepatitis B.

Un conjugado de la proteína del núcleo central de la hepatitis B estratégicamente modificada contiene un hapteno que está unido de manera colgante a la proteína del núcleo central de la hepatitis B estratégicamente modificada. Examinada de modo diferente, puede considerarse que una proteína del núcleo central de la hepatitis B estratégicamente modificada anteriormente descrita tiene tres dominios unidos a péptidos, I, II y III (numerados consecutivamente desde el extremo amino). El Dominio I comprende una secuencia que corresponde a los residuos numerados 10 a 50 aproximadamente de la secuencia de aminoácidos de la proteína del núcleo central de la hepatitis B de la SEC ID Nº: 2, y preferiblemente corresponde a los residuos numerados 1 a 50 de esa secuencia. El Dominio II está unido al residuo carboxi terminal del Dominio I. El Dominio II corresponde a los residuos numerados 50 a 100 de la secuencia de aminoácidos de la proteína del núcleo central de la hepatitis B de la SEC ID Nº: 2. El Dominio III comprende una secuencia que está unida al residuo carboxi terminal del Dominio II. El Dominio III corresponde a los residuos numerados 100 a 140 aproximadamente de la secuencia de aminoácidos de la proteína del núcleo central de la hepatitis B, y preferiblemente corresponde a los residuos numerados 100 a 149 aproximadamente de esa secuencia.

En una realización de la invención discutida anteriormente, una proteína del núcleo central de la hepatitis B estratégicamente modifica tiene adicionalmente un Dominio IV exógeno a la HBc que está unido peptídicamente al residuo carboxi terminal del Dominio III para proporcionar una proteína de fusión. El Dominio IV es un epítopo de células T.

Una partícula de proteínas del núcleo central de la hepatitis B estratégicamente modificadas de la invención está compuesta por proteínas del núcleo central de la hepatitis B ensambladas, en la que una pluralidad de las subunidades son subunidades de proteína del núcleo central de la hepatitis B estratégicamente modificada. Se contempla también una partícula compuesta por una mezcla de subunidades de proteína del núcleo central de la hepatitis B estratégicamente modificada y otras subunidades de proteína del núcleo central de la hepatitis B.

Un conjugado de una partícula de proteínas del núcleo central de la hepatitis B estratégicamente modificadas contemplado está compuesto por subunidades de proteínas del núcleo central de la hepatitis B ensambladas, en el que una pluralidad de las subunidades son subunidades de proteína del núcleo central de la hepatitis B estratégicamente modificada. En esta realización, un hapteno está unido de manera colgante a una subunidad de proteína del núcleo central de la hepatitis B. Preferiblemente, el hapteno está relacionado con un patógeno. Igual que anteriormente, una secuencia de residuos de aminoácidos estimuladora de células T puede estar unida peptídicamente al residuo carboxi terminal de la secuencia correspondiente a la proteína del núcleo central de la hepatitis B. Preferiblemente, ese determinante de células T relacionado con un patógeno está relacionado con el mismo patógeno que el hapteno relacionado con un patógeno.

Un conjugado de partículas de proteínas del núcleo central de la hepatitis B estratégicamente modificadas de la invención tiene un hapteno unido de manera colgante. En una realización contemplada del conjugado de las partículas, la partícula está constituida por una mezcla de subunidades de proteína del núcleo central de la hepatitis B estratégicamente modificada que tienen haptenos unidos de manera colgante, y otras subunidades de proteínas del núcleo central de la hepatitis B. En una realización, de 0,1 aproximadamente a 0,5 aproximadamente de las subunidades de proteína del núcleo central de la hepatitis B estratégicamente modificada están unidas de manera colgante a un hapteno. Se contempla también un conjugado de partículas que está compuesto por una mezcla de subunidades de proteína del núcleo central de la hepatitis B estratégicamente modificada y otras subunidades de proteína del núcleo central de la hepatitis B.

Una proteína del núcleo central de la hepatitis B estratégicamente modificada anteriormente descrita de la invención incluye un inserto peptídico que contiene un residuo de aminoácido químicamente reactivo. Ese inserto puede ser, pero típicamente no lo es, un determinante antigénico de células B separado, aunque puede presentarse cierta inmunogenicidad del inserto para células B debido meramente a la colocación del inserto en la proteína o partícula de HBc. Tal inserto puede ser, y en algunas realizaciones es, un epítopo de células T. La colocación de un inserto en la región del bucle de la HBc disminuye enormemente la inmunogenicidad de la HBc y la antigenicidad de la molécula resultante.

Un inóculo de la invención contiene una cantidad inmunogénica del conjugado de la proteína del núcleo central de la hepatitis B estratégicamente modificada de la invención. Cuando el hapteno unido de manera colgante es un hapteno relacionado con un patógeno, el inóculo puede ser utilizado como una vacuna para proteger a un mamífero tratado con el inóculo de ese patógeno. Por tanto, en una realización de la invención, se utiliza un conjugado de una proteína del núcleo central de la hepatitis B estratégicamente modificada como una vacuna para proporcionar protección frente al patógeno del cual deriva el hapteno. Más preferiblemente, el inóculo está compuesto por el conjugado de las partículas de proteínas del núcleo central de la hepatitis B estratégicamente modificadas como inmunógeno.

La presente invención tiene varios beneficios y ventajas.

Un beneficio de una proteína HBc modificada contemplada es que la proteína puede ser derivatizada mientras está en la forma agregada de partículas de HBc.

Una ventaja de la invención es que la proteína HBc modificada presenta una reactividad química incrementada apreciablemente hacia la derivatización, en comparación con la utilización de la amina primaria N-terminal, por ejemplo.

Otro beneficio de una proteína HBc modificada contemplada es que la química de derivatización de tales cadenas laterales está bien estudiada, es sencilla y relativamente predecible.

Otra ventaja de una proteína HBc modificada contemplada es que incrementa la respuesta inmunológica al hapteno conjugado con el que es derivatizada.

Otro beneficio más de una proteína HBc modificada contemplada es que es poco probable que produzca efectos colaterales inmunológicos indeseables en humanos.

Más beneficios y ventajas adicionales de la invención serán obvios para el trabajador experto a partir de la discusión que sigue.

Breve descripción de las figuras

En la figura que constituye una porción de esta descripción, el Esquema 1 ilustra una secuencia de reacciones para ligar de manera colgante un hapteno a una partícula de proteínas del núcleo central de la hepatitis B estratégicamente modificadas (sm-HBc) utilizando sulfo-succinimidil-4-(N- maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC). La partícula de sm-HBc está representada como un recuadro que tiene un único grupo amino colgante (para claridad de la figura).

Descripción detallada de la invención A. Definiciones

El término "anticuerpo" se refiere a una molécula que es un miembro de una familia de proteínas glicosiladas llamadas inmunoglobulinas, que puede combinarse específicamente con un antígeno.

La palabra "antígeno" ha sido utilizada históricamente para designar una entidad que se une a un anticuerpo, y también para designar a la entidad que induce la producción del anticuerpo. Una utilización más actual limita el significado de antígeno a esa entidad que se une a un anticuerpo, mientras que se utiliza la palabra "inmunógeno" para la entidad que induce la producción del anticuerpo. Cuando una entidad discutida en la presente sea inmunogénica y antigénica, se hará referencia a la misma típicamente como un inmunógeno o un antígeno, de acuerdo con su utilidad deseada.

La palabra "hapteno" se utiliza para describir moléculas que son capaces de estimular una respuesta inmune (por ejemplo, la producción de anticuerpos) cuando están acopladas químicamente a una proteína transportadora. La palabra es utilizada a menudo en la técnica para pequeñas moléculas no antigénicas, pero en la presente, se refiere simplemente a la molécula que va a ser unida de manera colgante a la proteína transportadora, incluso si es antigénica o no es pequeña.

"Determinante antigénico" se refiere a la porción estructural real del antígeno que se une inmunológicamente a un sitio de combinación del anticuerpo o a un receptor de células T. El término es utilizado también de manera intercambiable con "epítopo".

El nombre "conjugado", según se utiliza en la presente, se refiere a una molécula formada a partir de un hapteno unido de manera colgante a un transportador a través de una cadena lateral de un residuo de aminoácido.

El término "sustitución conservadora", según se utiliza en la presente, indica que un residuo de aminoácido ha sido sustituido por otro residuo biológicamente similar. Ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen la sustitución de un residuo hidrofóbico tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro, o la sustitución de un residuo polar por otro tal como entre arginina y lisina, entre ácido glutámico y ácido aspártico o entre glutamina y asparragina, y similares. El término "sustitución conservadora" incluye también la utilización de un aminoácido sustituido en lugar de un aminoácido parental no sustituido, con la condición de que los anticuerpos producidos hacia tal polipéptido inmunorreaccionen también con el polipéptido correspondiente que tiene el aminoácido no sustituido.

El término "corresponde", en sus varias formas gramaticales, según es utilizado en relación con secuencias peptídicas, indica la secuencia peptídica descrita más o menos hasta tres residuos de aminoácidos en alguno de los extremos amino y carboxi o en ambos extremos, y que contiene solamente sustituciones conservadoras en residuos de aminoácidos particulares a lo largo de la secuencia polipeptídica.

"Epítopo" se refiere a esa porción de una molécula que se une específicamente a un receptor antigénico de células T o a un sitio de combinación de un anticuerpo. "Epítopo" y "determinante" son utilizados indistintamente.

Según se utiliza en la presente, el término "proteína de fusión" designa al menos dos secuencias de residuos de aminoácidos que no se encuentran normalmente unidas en la naturaleza, unidas operativamente extremo con extremo (cabeza con cola) mediante un enlace peptídico entre sus residuos de aminoácidos terminales respectivos.

La frase "hepatitis B", según se utiliza en la presente, se refiere en su contexto más amplio a cualquier miembro de la familia hepadnaviridae, una familia de virus animales que contienen ADN envuelto y que pueden producir hepatitis B en humanos.

La frase "HBc", según se utiliza en la presente, se refiere a proteínas estimuladoras de células T que tienen una secuencia de residuos de aminoácidos que corresponde a una secuencia de residuos de aminoácidos codificada por el gen de la proteína de la nucleocápsida del virus de la hepatitis B (VHB). Una proteína ejemplar bien conocida que existe de forma natural codificada por el gen de la nucleocápsida del VHB humano es la proteína del "núcleo central", subtipo ayw, que tiene las secuencias biológicas de las SEC ID N^{os}: 1 y 2. Galibert y col., Nature, 281:646 (1979). La proteína HBeAg, precursora de HBc, incluye la secuencia de la proteína del núcleo central de la hepatitis B y una secuencia "pre-núcleo central" en el extremo amino de la misma, según se muestra en las SEC ID N^{os}: 8 y 9 en el caso de un gen de la nucleocápsida de la hepatitis B de la ardilla de tierra. La secuencia de la proteína del núcleo central comienza en el aminoácido en posición 31 en la presente, correspondiendo así al residuo de aminoácido número 1 de la SEC ID Nº: 2. Se conocen en la técnica las secuencias de otras proteínas del núcleo central de la hepatitis B. La proteína del núcleo central del virus de la hepatitis B humana subtipo adr se proporciona en las SEC ID N^{os}: 3 y 4, y el subtipo adw está proporcionado en las SEC ID N^{os}: 5 y 6. Ono y col., Nucl. Acids Res., 11:1747 (1983). Se proporcionan también secuencias para la proteína del núcleo central de la hepatitis B de la marmota americana en la SEC ID Nº: 7 [Schödel y col., Adv. Viral Oncol., 8:73-102 (1989)], de la ardilla de tierra en las SEC ID N^{os}: 8 y 9, de la garza en las SEC ID N^{os}: 10 y 11 y del pato en las SEC ID N^{os}: 12 y 13. Para claridad, el sistema de numeración de aminoácidos mostrado en las SEC ID N^{os}: 1 y 2 con respecto a la proteína del núcleo central de la hepatitis B humana subtipo ayw se utiliza en la presente como referencia. Otras secuencias de HBc pueden ser alineadas con esa secuencia utilizando programas y protocolos estándar de alineación de secuencias biológicas para determinar los residuos de aminoácidos que "corresponden a la secuencia de la proteína del núcleo central de la hepatitis B de SEC ID Nº: 2", ver por ejemplo Schödel y col., Adv. Viral Oncol., 8:73-102 (1989).

Si se hace referencia a una porción polipeptídica de cualquiera de las proteínas codificadas por el gen de la nucleocápsida del VHB que existen de forma natural anteriormente descritas, esa referencia es explícita, ya sea manifestando por ejemplo que se hace referencia a una porción estimulante de células T de la proteína particular o designando explícitamente la porción particular de la secuencia, tal como mediante la indicación de las posiciones de los residuos de aminoácidos incluidos.

El término "inmunorreaccionar", en sus varias formas, significa unión específica entre un antígeno como ligando y una molécula que contiene un sitio de combinación de un anticuerpo tal como una porción Fab de un anticuerpo completo.

La frase "unido operativamente", según se utiliza en la presente, significa que el enlace no interfiere con la capacidad de cualquiera de los grupos unidos para funcionar según está descrito; por ejemplo, para funcionar como un determinante de células T o B.

La frase "unido de manera colgante" se refiere a un enlace sencillo, directo o a través de un puente, de una proteína HBc con otra molécula en otro lugar distinto de los extremos amino o carboxi. La frase se utiliza en la presente para describir el enlace entre un hapteno y una cadena lateral de un aminoácido químicamente reactiva de una proteína del núcleo central de la hepatitis B estratégicamente modificada.

"Ensamblaje macromolecular" se refiere a un agregado unido no covalentemente de subunidades de proteínas. Típicamente en esta invención, la subunidad de proteína es un monómero de una proteína del núcleo central de la hepatitis B estratégicamente modificada. Según se describe con más detalle en la presente más adelante, esos monómeros de proteínas del núcleo central se autoensamblan normalmente para formar "partículas del núcleo central" esféricas que tienen 90 ó 120 dímeros de proteínas del núcleo central (un total de 180 ó 240 subunidades de proteínas del núcleo central). Una partícula del núcleo central esférica es un ejemplo de un ensamblaje macromolecular.

La frase "relacionado con un patógeno", según se utiliza en la presente, indica un inmunógeno de células B o de células T que es capaz de inducir la producción de anticuerpos que inmunorreaccionan con un patógeno en forma nativa. Posteriormente en la presente se ilustran inmunógenos de células B y de células T relacionados con un patógeno ejemplares.

Las palabras "polipéptido" y "péptido" se utilizan indistintamente a lo largo de la especificación y designan una serie lineal de residuos de aminoácidos conectados uno a otro mediante enlaces peptídicos entre el grupo amino alfa y el grupo carboxi de aminoácidos adyacentes. Los polipéptidos pueden tener una variedad de longitudes, en sus formas neutras (no cargadas) o en formas que son sales, y pueden estar libres de modificaciones tales como glicosilación, oxidación de la cadena lateral o fosforilación, o pueden contener estas modificaciones. Es bien conocido en la técnica que las secuencias de residuos de aminoácidos contienen grupos ácidos y básicos, y que el estado de ionización particular presentado por el péptido depende del pH del medio circundante cuando la proteína está en solución, o del pH del medio del que se ha obtenido si la proteína está en forma sólida. Están también incluidas en la definición proteínas modificadas por sustituyentes adicionales unidos a las cadenas laterales de los aminoácidos, tales como unidades de glicosilo, lípidos o iones inorgánicos tales como fosfatos, además de modificaciones relacionadas con conversiones químicas de las cadenas, tales como la oxidación de grupos sulfhidrilo. Por tanto, el término "polipéptido", o sus términos equivalentes, tiene la intención de incluir la secuencia de residuos de aminoácidos apropiada referenciada, sometida a aquellas de las modificaciones precedentes que no destruyan su funcionalidad. Un péptido o polipéptido utilizado como hapteno contiene típicamente menos de 70 residuos de aminoácidos, y más típicamente contiene una cadena lineal de 5 aproximadamente a 40 residuos de aminoácidos aproximadamente, y más preferiblemente de 10 aproximadamente a 25 residuos aproximadamente. Se indica que un hapteno polipeptídico contemplado puede ser más largo de 70 residuos, pero tal polipéptido es más corto que la proteína existente de manera natural que comparte su secuencia.

La palabra "proteína" indica un polipéptido que tiene 70 o más residuos de aminoácidos aproximadamente, y es una entidad que existe de manera natural.

Las palabras "secretar" y "producir" son utilizadas a menudo indistintamente en la técnica, en lo que se refiere a las células de las que se obtienen moléculas de anticuerpo. Las células que producen anticuerpos pueden, sin embargo, no secretar esas moléculas a su entorno. En la presente, las moléculas de anticuerpo son secretadas y son obtenidas de la corriente sanguínea (anticuerpo humoral). No obstante, los anticuerpos son referidos generalmente como "producidos" de acuerdo con la frase utilizada en la técnica.

Todos los residuos de aminoácidos identificados en la presente están en la configuración natural o configuración L. De acuerdo con la nomenclatura estándar de polipéptidos [J. Biol. Chem., 243:3557-59 (1969)], las abreviaturas de los residuos de aminoácidos son como las mostradas en la Tabla de Correspondencia siguiente, Tabla 1.

TABLA 1 Tabla de correspondencia

	Símbolo
1 Letra	3 Letras	Aminoácido
Y	Tyr	L-tirosina
G	Gly	glicina
F	Phe	L-fenilalanina
M	Met	L-metionina
A	Ala	L-alanina
S	Ser	L-serina
I	Ile	L-isoleucina
L	Leu	L-leucina
T	Thr	L-treonina
V	Val	L-valina
P	Pro	L-prolina
K	Lys	L-lisina
H	His	L-histidina
Q	Gln	L-glutamina
E	Glu	ácido L-glutámico
Z	Glx	ácido L-glutámico o L-glutamina
W	Trp	L-triptófano
R	Arg	L-arginina
D	Asp	ácido L-aspártico
N	Asn	L-asparragina
B	Asx	ácido L-aspártico o L-asparragina
C	Cys	L-cisteína

B. Proteína del núcleo central de la hepatitis B estratégicamente modificadas

La presente invención contempla una proteína del núcleo central de hepadnaviridae ("HBc") estratégicamente modificada que tiene un residuo de aminoácido químicamente reactivo insertado para unirse de manera colgante con haptenos tales como polipéptidos y carbohidratos. La modificación estratégica de la invención es la inserción de 1 a 40 residuos de aminoácidos incluyendo un residuo de aminoácido químicamente reactivo en la secuencia de la proteína del núcleo central de la hepatitis B en la región correspondiente a los residuos de aminoácidos 50 a 100 de la secuencia de la HBc de SEC ID Nº: 2. Tal residuo de aminoácido químicamente reactivo introducido tiene una cadena lateral que proporciona un grupo funcional para unir de manera colgante un hapteno al transportador estratégicamente modificado.

Los hepadnaviridae tienen una nucleocápsida, o núcleo central, rodeada por una envoltura lipídica que contiene proteínas de superficie. La nucleocápsida es generalmente un agregado esférico de dímeros de proteínas del núcleo central ("antígeno del núcleo central", HBcAg). In vitro, la proteína del núcleo central de la hepatitis B se autoensambla para formar "partículas", armazones esféricos de simetría icosahédrica compuestos por 90 ó 120 dímeros de proteínas del núcleo central de la hepatitis B, por tanto de 180 ó 240 subunidades de proteína. Las partículas tienen 280 ó 310 \ring{A}ngstroms de diámetro aproximadamente, respectivamente. B. Bottcher y col., Nature, 386:88-91 (1997); J.F. Conway y col., Nature, 386:91-94 (1997).

Una proteína del núcleo central de la hepatitis B estratégicamente modificada contemplada, forma también un ensamblaje macromolecular. Tal partícula puede estar presente en la forma de 180 ó 240 subunidades de proteína, aunque no tiene que ser tal de 90 ó 120 dímeros.

Se ha descrito que proteínas del núcleo central híbridas con residuos de aminoácidos exógenos insertados en la región próxima al residuo de aminoácido 80 se ensamblan para formar armazones regulares, incluso con insertos tan grandes como de 46 aminoácidos de longitud. A.I. Brown y col., Vaccine, 9:595-601 (1991); F. Schödel y col., J. Virol., 66:106-114 (1992).

La secuencia de la proteína del núcleo central de hepadnaviridae utilizada como secuencia de referencia en la presente es la de la proteína del núcleo central de la hepatitis B humana, subtipo ayw, mostrada en las SEC ID N^{os}: 1 y 2. Se conocen otros subtipos del virus de la hepatitis B humana. Las SEC ID N^{os}: 3 y 4 son de HBc humana, subtipo adr, y las SEC ID N^{os}: 5 y 6 son de HBc subtipo adw. Están también publicadas las secuencias de varias proteínas del núcleo central de la hepatitis de animales. La secuencia biológica de la proteína del núcleo central de la hepatitis de pato está descrita en la presente como SEC ID N^{os}: 12 y 13; una porción del gen de la nucleocápsida de la hepatitis de la ardilla de tierra está en las SEC ID N^{os}: 8 y 9; el núcleo central de la hepatitis de marmota americana está en la SEC ID Nº: 7 y el núcleo central de la hepatitis de garza en las SEC ID N^{os}: 10 y 11. Proteínas ejemplares del núcleo central de la hepatitis B de animales han sido alineadas con la proteína del núcleo central de la hepatitis B humana por F. Schödel y col., Adv. Viral Oncology, 8:73-102 (1989).

i. Modificación estratégica de la proteína del núcleo central

La presente invención contempla un conjugado de una proteína del núcleo central de la hepatitis B estratégicamente modificada que contiene un hapteno que está unido de manera colgante a una proteína del núcleo central de la hepatitis B (HBc) estratégicamente modificada. La propia proteína del núcleo central de la hepatitis B estratégicamente modificada comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de aminoácidos de la proteína del núcleo central de la hepatitis B de SEC ID Nº: 2, incluyendo los residuos de aminoácidos numerados como 10 a 140 de esa secuencia. Esa secuencia de residuos de aminoácidos de HBc contiene adicionalmente un inserto de residuos de aminoácidos exógeno en la región correspondiente a los residuos de aminoácidos numerados como 50 a 100 desde el extremo amino de HBc, donde el inserto exógeno (i) tiene de 1 a 40 residuos de aminoácidos de longitud, y (ii) contiene un residuo de aminoácido químicamente reactivo. El hapteno está ligado de manera colgante a la proteína HBc estratégicamente modificada por medio de un residuo de aminoácido químicamente reactivo presente en el inserto.

Se prefiere que en la molécula de proteína HBc estratégicamente modificada estén presentes los residuos 1 a 10 de la SEC ID Nº: 2. Se prefiere además que cuando algún residuo esté ausente o sea eliminado de la posición 1 a 10, esos residuos sean eliminados de la secuencia y que los residuos restantes estén presentes en la secuencia. De este modo, si se contemplara una deleción de cinco residuos, los residuos eliminados serían numerados como 1-5, dejando presentes desde el residuo 6 hasta el extremo carboxi de HBc deseado, más el inserto.

Se prefiere de manera similar que los residuos numerados desde la posición 140 hasta la 149 de la SEC ID Nº: 2 estén presentes en una molécula de proteína HBc estratégicamente modificada. Según se indica en otra parte de la presente, la región de HBc numerada desde el 150 hasta el extremo carboxi contiene una pluralidad de residuos de arginina. Esos residuos se unen a ácidos nucleicos en la purificación de las partículas de HBc después de la expresión, y la secuencia que contiene esos residuos es preferiblemente omitida de una molécula de proteína HBc estratégicamente modificada. Igual que con el caso de los residuos de las posiciones 1 a 10, se prefiere que los residuos entre la posición 140 y la 149 estén presentes y ausentes correspondientemente de una manera secuencial. Por tanto, cuando el residuo carboxi terminal corresponde al residuo de la posición 146, los residuos de las posiciones 141-145 están también presentes y los de las posiciones 147-149 están ausentes. Muy preferiblemente, una secuencia de HBc contemplada es la mostrada en la SEC ID Nº: 2 desde la posición 1 hasta la posición 149, más la secuencia del inserto.

El inserto puede estar situado en la secuencia de HBc en la región de las posiciones numeradas como 50 a 100, según se ha indicado ya. Preferiblemente, el inserto está presente en la región correspondiente a los residuos de aminoácidos numerados como 70 a 90. Más preferiblemente, el inserto está presente en la región correspondiente a los residuos de aminoácidos numerados como 78 a 82. Muy preferiblemente, el inserto está situado en la región correspondiente a los residuos numerados como 78 a 80.

Una proteína del núcleo central de la hepatitis B estratégicamente modificada de la invención tiene de 1 a 40 residuos de aminoácidos insertados. Preferiblemente, el inserto tiene de 1 a 10 residuos de aminoácidos de longitud. El inserto contiene un residuo de aminoácido químicamente reactivo. Se contempla también la inserción de más de un residuo de aminoácido químicamente reactivo.

Se contempla que sean proporcionados sitios de endonucleasas de restricción en la construcción génica para la proteína de la hepatitis B estratégicamente modificada cerca de la región del inserto deseada. Los nucleótidos del sitio de la endonucleasa de restricción serán traducidos a aminoácidos después de la expresión, y ese efecto tiene cierta relación con la elección de la endonucleasa. Varias endonucleasas de restricción están disponibles comercialmente (por ejemplo, de Promega Corp., Madison, Wisconsin) y las secuencias de sus sitios de reconocimiento y los sitios de corte son bien conocidos en la técnica. El Ejemplo 1 describe tal construcción para una proteína del núcleo central de la hepatitis B estratégicamente modificada.

En una realización preferida, el inserto es un único residuo que es añadido como el residuo químicamente reactivo. En otras realizaciones preferidas, la utilización de enzimas de restricción y sus secuencias de reconocimiento hace que sean insertados de tres a cinco residuos aproximadamente, incluyendo el residuo químicamente reactivo deseado.

Un inserto conteniendo un residuo de aminoácido químicamente reactivo es insertado en la proteína del núcleo central de la hepatitis B nativa en una posición correspondiente a una posición de residuos de aminoácidos de 50 a 100. La región de inserción preferida en la proteína del núcleo central de la hepatitis B está en la región del bucle inmunodominante (residuos de aminoácidos 70 a 90), más preferiblemente en la región del bucle que corresponde a la posición desde el aminoácido 78 hasta el 82 de la proteína del núcleo central de la hepatitis B nativa. Muy preferiblemente, el inserto está situado en los residuos numerados como 78 a 80 de la SEC ID Nº: 2.

Según se utiliza en la presente, cuando se dice que el inserto está "en una posición", se indica que el extremo amino del inserto está unido mediante un enlace peptídico al extremo carboxi del residuo de aminoácido correspondiente de la secuencia de la proteína del núcleo central de la hepatitis B que tiene ese número de residuo de aminoácido. En otras palabras, el inserto sigue inmediatamente al residuo en esa posición indicada.

La inserción puede ser efectuada mediante métodos utilizados generalmente en la técnica. La manipulación genética, mediante un método basado en PCR, está ilustrada en los Ejemplos 1 y 5. Además, puede utilizarse mutagénesis dirigida a un sitio mediada por oligonucleótidos, según se discute en J. Sambrook y col., Molecular Cloning: a
laboratory manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 15.51-en adelante (1989), para añadir un codón mediante la hibridación de una secuencia de ADN deseada con un molde que añade un codón para un solo residuo, seguido por el relleno de la secuencia de ácido nucleico restante. Dawson y col., Science, 266: 776-779 (1994), describen un método para unir cadenas polipeptídicas en su esqueleto peptídico, de tal manera que podría crearse una fusión de fragmentos peptídicos.

El residuo de aminoácido químicamente reactivo puede estar en cualquier posición dentro del inserto. Preferiblemente, el residuo de aminoácido químicamente reactivo está en una posición que corresponde a los residuos de aminoácidos numerados como 70 a 90 del núcleo central nativo (tipo salvaje), y muy preferiblemente en la posición de los residuos 78 a 82. Por ejemplo, cuando un inserto de 10 residuos de aminoácidos de longitud es insertado en una posición correspondiente al residuo 73 de la proteína del núcleo central nativa, entonces el residuo de aminoácido químicamente reactivo está preferiblemente en la posición 5 a 9 del inserto. Cuando un inserto de 30 residuos de aminoácidos de longitud es insertado en una posición correspondiente al residuo 58 de la proteína del núcleo central nativa, el residuo de aminoácido químicamente reactivo está entonces preferiblemente en la posición 22 a 24 del inserto.

Un residuo de aminoácido químicamente reactivo introducido tiene una cadena lateral químicamente reactiva que proporciona un grupo funcional para derivatizar la HBc estratégicamente modificada (esto es, para conjugar un hapteno a la HBc modificada). Grupos funcionales útiles de la cadena lateral incluyen grupos amino epsilon, grupos carboxilo beta o gamma, grupos tiol (-SH) y anillos aromáticos (por ejemplo, tirosina e histidina). El residuo de aminoácido químicamente reactivo es típicamente un residuo de lisina, cisteína o histidina, o un residuo que contenga carboxilo tal como ácido aspártico o ácido glutámico. La lisina es un residuo de aminoácido químicamente reactivo particularmente preferido.

Se señala que la secuencia de residuos de aminoácidos de la proteína del núcleo central de la hepatitis B codificada por, y mostrada en, las SEC ID N^{os}: 1 y 2, respectivamente, tiene dos residuos endógenos consecutivos que contienen carboxilo, a saber, ácido glutámico (glu, E) y ácido aspártico (asp, D), en las posiciones 77 y 78. Sin embargo, la presente invención contempla la introducción de al menos un residuo de aminoácido químicamente reactivo exógeno, adicional. La Patente Europea Nº 385610 informa de que se obtuvieron resultados insatisfactorios en intentos para acoplar químicamente haptenos polipeptídicos a partículas de HBc. Se indica que esos intentos de acoplamiento estuvieron dirigidos hacia grupos amino y no hacia grupos carboxilo de las cadenas laterales de aminoácidos.

Además de la utilización de un residuo de aminoácido químicamente reactivo individual en el inserto tal como ácido aspártico o lisina, puede utilizarse sustancialmente cualquier secuencia de la longitud deseada que contenga un residuo de aminoácido químicamente reactivo. Insertos ejemplares de más de un solo residuo incluyen el epítopo VP2 de HRV-2 de células B discutido en B.E. Clarke y col., Vaccines, 91:313-318 (1991), la secuencia de Pre-S(1)27-53 de HBsAg discutida en F. Schödel y col., J. Virol., 66(1):106-114 (1992) y la secuencia de Pre-S(2)133-143 de HBsAg discutida en F. Schödel y col., Vaccines, 90:193-198 (1990). Puede utilizarse también como inserto un epítopo de células T apropiado discutido más adelante en la presente como un hapteno. Secuencias ejemplares incluyen las de las SEC ID N^{os}: 28, 32, 33, 34, 47, 48, 49, 50 y 55.

ii. Modificación adicional de la proteína del núcleo central

Se contempla también que una proteína del núcleo central de la hepatitis B estratégicamente modificada según se describió anteriormente tenga otras modificaciones. Las modificaciones contempladas del núcleo central estratégicamente modificado incluyen la naturaleza del inserto que contiene el residuo de aminoácido químicamente reactivo, el truncamiento del extremo amino, el truncamiento del extremo carboxi, una fusión en el extremo carboxi, la unión de un colgante a la región carboxi-terminal.

El inserto que contiene el residuo de aminoácido químicamente reactivo al que se conjuga el hapteno, puede tener una utilización además de proporcionar el residuo de aminoácido químicamente reactivo. Se contempla que un inserto conteniendo un residuo de aminoácido químicamente reactivo sea una secuencia de aminoácidos que estimule a las células T. Tal secuencia de aminoácidos estimuladora de células T es preferiblemente un epítopo de células T del mismo origen que el epítopo de células B que será el antígeno conjugado, por ejemplo, ambos procedentes de Mycobacterium tuberculosis. Epítopos ejemplares se discuten en la presente más adelante.

Puede elegirse también un inserto que contenga un residuo de aminoácido químicamente reactivo con el fin de conferir propiedades adicionales deseables, tales como la propiedad intensificadora de la estabilidad o la propiedad intensificadora de la solubilidad.

Una proteína del núcleo central de la hepatitis B estratégicamente modificada puede ser modificada químicamente mediante métodos bien conocidos en la técnica. Muchas de tales técnicas están descritas en Roger L. Lundblad,
Techniques in Protein Modification, CRC Press (Ann Arbor, Michigan: 1994). Tales modificaciones químicas son realizadas para incrementar o disminuir propiedades, por ejemplo, un grupo amino de lisina puede ser bloqueado para cambiar el punto isoeléctrico de la proteína, haciendo que la misma se separe de manera diferente en una resina cromatográfica de intercambio iónico.

Se contempla también que el extremo carboxi de la secuencia de la proteína del núcleo central esté truncado, preferiblemente corriente abajo hasta el residuo de aminoácido en posición 140 aproximadamente. La secuencia rica en arginina presente que comienza en el residuo 150 de la SEC ID Nº: 2 se une a ácidos nucleicos y puede dificultar la purificación y el manejo de la proteína del núcleo central expresada. En la SEC ID Nº: 2, los tramos ricos en arginina comienzan en la posición 150. Una proteína HBc estratégicamente modificada preferida tiene un residuo de valina (V) carboxi terminal de residuo 149.

iii. Producción de la proteína del núcleo central estratégicamente modificada

La modificación estratégica de la proteína del núcleo central de la hepatitis B se realiza típicamente mediante procesos conocidos en la técnica a nivel de ADN, por ejemplo mediante la inserción de los codones correspondientes a los aminoácidos que van a ser insertados. El gen manipulado es expresado posteriormente en un sistema conveniente conocido en la técnica, por ejemplo en un cultivo vírico en células inmortalizadas infectadas.

Los métodos para producir las proteínas HBcAg en general, y las proteínas del pre-núcleo central, el núcleo central y HBeAg en particular, son bien conocidos en la técnica. Los mismos métodos fueron adaptados fácilmente para el aislamiento de las partículas de proteínas del núcleo central modificadas de la invención. Además, HBcAg y HBeAg pueden ser producidas mediante una variedad de técnicas bien conocidas de ADN recombinante. Ver, por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 4.356.270 para Itakura y 4.563.423 para Murray y col., respectivamente. Esas técnicas de ADN recombinante pueden ser fácilmente adaptadas para producir las partículas de proteínas del núcleo central modificadas de la invención. Las proteínas del núcleo central modificadas pueden ser conjugadas con el hapteno antes o después de la formación de las partículas, preferiblemente después de la formación y purificación de las partículas de proteínas del núcleo central.

C. Conjugado de proteínas del núcleo central de la hepatitis B modificadas

Cualquier hapteno contra el que se desee la producción de anticuerpos puede ser ligado a una proteína del núcleo central de la hepatitis B estratégicamente modificada para formar un conjugado inmunogénico de la proteína del núcleo central de la hepatitis B estratégicamente modificada de esta invención. El hapteno de interés es típicamente un determinante de células B. El hapteno puede ser un polipéptido, un carbohidrato (sacárido), o un producto químico no polipéptido, no carbohidrato, tal como 2,4-dinitrobenceno.

Los métodos para unir operativamente haptenos individuales a una proteína o a un polipéptido a través de la cadena lateral de un residuo de aminoácido de la proteína o del polipéptido para formar un conjugado inmunogénico unido de manera colgante, por ejemplo un polímero polipeptídico de cadena ramificada, son bien conocidos en la técnica. Esos métodos incluyen la unión a través de uno o más tipos de grupos funcionales en varias cadenas laterales y tienen como resultado el que el esqueleto polipeptídico de la proteína transportadora es unido de manera colgante - -covalentemente (acoplado) al hapteno pero separado por al menos una cadena lateral.

Los métodos para unir proteínas transportadoras a haptenos utilizando cada uno de los grupos funcionales anteriores están descritos en Erlanger, Methods of Enzymology, 70:85 (1980), Aurameas y col., Scand. J. Immunol., Vol. 8, Suplemento 7, 7-23 (1978) y la Patente de EE.UU. Nº 4.493.795 para Nestor y col. Además, puede llevarse a cabo una reacción de acoplamiento dirigida a un sitio, según está descrito en Rodwell y col., Biotech., 3:889-894 (1985), a fin de que no disminuya sustancialmente la actividad biológica de los polipéptidos.

Además, como es bien conocido en la técnica, la proteína HBcAg y un hapteno polipeptídico pueden ser utilizados ambos en su forma nativa o bien su contenido de grupos funcionales puede ser modificado mediante succinilación de los residuos de lisina o mediante reacción con cisteína-tiolactona. Puede incorporarse también un grupo sulfhidrilo a la proteína transportadora o al conjugado por reacción de las funciones amino con 2-iminotiolano o con el éster N-hidroxisuccinimídico de 3-(3-ditiopiridil)propionato.

La proteína HBc o el hapteno pueden ser también modificados para incorporar un brazo separador, tal como hexametilén diamina u otras moléculas bifuncionales de tamaño similar, con el fin de facilitar la unión del colgante.

Hapteno polipeptídico. Los métodos para la unión covalente de un hapteno polipeptídico son extremadamente variados y son bien conocidos por los trabajadores expertos en las técnicas inmunológicas. Por ejemplo, siguiendo la Patente de EE.UU. Nº 4.818.527, se hace reaccionar m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida éster (ICN Biochemicals, Inc.) o succinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC, Pierce), con una proteína del núcleo central de la hepatitis B estratégicamente modificada para formar un transportador activado. Ese transportador activado se hace luego reaccionar con un polipéptido que contenga una cisteína terminal o al que se ha añadido un residuo de cisteína amino o carboxi-terminal adicional para formar un conjugado de la proteína del núcleo central de la hepatitis B estratégicamente modificada unido covalentemente. Como un ejemplo alternativo, el grupo amino de un hapteno polipeptídico puede hacerse reaccionar primeramente con N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP, Pharmacia), y ese polipéptido que contiene tiol puede hacerse reaccionar con el transportador activado después de la reducción. Por supuesto, pueden invertirse el resto que contiene azufre y el aceptor de Michael que contiene el doble enlace. Estas reacciones están descritas en la literatura del proveedor, y también en Kitagawa y col., J. Biochem., 79: 233 (1976) y en Lachmann y col., en 1986 Synthetic Peptides as Antigens, (Ciba Foundation Symposium 119), pp. 25-40 (Wiley, Chichester: 1986).

La Patente de EE.UU. Nº 4.767.842 describe varios modos de unión covalente entre un transportador y un polipéptido que son útiles en la presente. En un método, se hace reaccionar diisocianato de tolileno con el transportador en un solvente de tampón dioxano a cero grados C para formar un transportador activado. Posteriormente un hapteno polipeptídico es mezclado y reaccionado con el transportador activado para formar el conjugado de la proteína del núcleo central de la hepatitis B estratégicamente modificada unido covalentemente.

Son particularmente útiles un gran número de agentes heterobifuncionales que forman un enlace disulfuro en un extremo de un grupo funcional y un enlace peptídico en el otro, incluyendo N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP). Este reactivo crea un enlace disulfuro entre él mismo y un tiol en la proteína del núcleo central de la hepatitis B estratégicamente modificada o en el hapteno, por ejemplo un residuo de cisteína en un hapteno polipeptídico, y un enlace amida en la pareja de acoplamiento, por ejemplo el amino en una lisina u otro grupo amino libre en la proteína transportadora. Se conocen una variedad de tales agentes formadores de disulfuro/amida. Ver, por ejemplo, Immun. Rev. (1982) 62:185. Otros agentes de acoplamiento bifuncionales forman un tioéter en lugar de un enlace disulfuro. Muchos de estos agentes formadores de tioéter están disponibles comercialmente e incluyen ésteres reactivos del ácido 6-maleimidocaproico, del ácido 2-bromoacético, del ácido 2-yodoacético, del ácido 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxílico y similares. Los grupos carboxilo pueden ser activados mediante la combinación de los mismos con succinimida o con ácido 1-hidroxi-2-nitro-4-sulfónico, sal de sodio. El agente de acoplamiento particularmente preferido para el método de esta invención es succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) obtenido de Pierce Company, Rockford, Ill. La lista precedente no pretende ser exhaustiva, y pueden utilizarse claramente modificaciones de los compuestos mencionados, por ejemplo el sulfo-SMCC representado en la figura.

Un hapteno polipeptídico puede ser obtenido de una variedad de formas bien conocidas en la técnica. Pueden utilizarse fácilmente las técnicas habituales de síntesis peptídica. Por ejemplo, son útiles las técnicas recombinantes y basadas en PCR para producir péptidos más largos. Como las secuencias deseadas son normalmente relativamente cortas, es útil la síntesis química en fase sólida.

Según se discute más adelante, se conocen en la técnica secuencias de ADN que codifican una variedad de haptenos polipeptídicos. La secuencia que codifica péptidos de la longitud contemplada en la presente puede ser fácilmente sintetizada por técnicas químicas, por ejemplo mediante el método de fosfotriésteres de Matteucci y col., J. Am. Chem. Soc., 103:3185 (1981). Por supuesto, sintetizando químicamente la secuencia codificadora puede realizarse cualquier modificación deseada sustituyendo simplemente las bases que codifican la secuencia peptídica nativa por las bases apropiadas. Pueden proporcionarse posteriormente a la secuencia codificadora adaptadores apropiados y ligarla a vectores de expresión actualmente disponibles comúnmente en la técnica, y los vectores reguladores utilizados para transformar huéspedes adecuados con el fin de producir la proteína deseada.

Están actualmente disponibles varios de tales vectores y de tales sistemas de huéspedes adecuados. Por ejemplo, se proporcionan secuencias promotoras compatibles con huéspedes bacterianos en plásmidos que contienen sitios de restricción convenientes para la inserción de la secuencia codificadora deseada. Son típicos de tales vectores plasmídicos, por ejemplo, pUC8 y pUC13 que los tiene disponibles J. Messing, en la University of Minnesota (ver, por ejemplo, Messing y col., Nucleic Acids Res., 9:309 (1981)) o pBR322, disponible en New England Biolabs. Los promotores adecuados incluyen, por ejemplo, los sistemas de promotores de beta-lactamasa (penicilinasa) y lactosa (lac) (Chang y col., Nature, 198:1056 (1977)) y el sistema promotor de triptófano (trp) (Goeddel y col., Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980)). Los vectores de expresión resultantes son transformados en huéspedes bacterianos adecuados utilizando el método del cloruro de calcio descrito por Cohen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69:2110 (1972). Los transformantes con éxito pueden producir los fragmentos polipeptídicos deseados a niveles más elevados que los encontrados en las cepas que producen normalmente los pili intactos. Por supuesto, pueden utilizarse también células de levadura o de mamífero como huéspedes, empleando vectores y secuencias de control adecuados.

TABLA 2 Haptenos polipeptídicos

1

2

3

Hapteno Químico. Se utiliza la química relacionada para acoplar compuestos químicos a proteínas transportadoras. Típicamente, se designa en el compuesto químico un grupo funcional apropiado para el acoplamiento.

Anticuerpos hacia el compuesto hidroxihexanoato de 6-O-fosfocolina protegen contra Streptococcus pneumoniae. Randy T. Fischer y col., J. Immunol., 154: 3373-3382 (1995).

TABLA 3 Haptenos Químicos

Hapteno Químico	Cita
N-óxido de piperidina	Patente de EE.UU. Nº 5.304.252
fosfolactona o lactamida	Patente de EE.UU. Nº 5.248.611
complejos de iones metálicos	Patente de EE.UU. Nº 5.236.825
compuestos de anillos bicíclicos [2.2.1] o [7.2.2]	Patente de EE.UU. Nº 5.208.152
compuestos que contienen hidroxilo cargados iónicamente	Patente de EE.UU. Nº 5.187.086
análogos fosfonato de ésteres carboxilato	Patente de EE.UU. Nº 5.126.258
análogos de cocaína	Carrera y col., Nature 378:725 (1995)

Hapteno Carbohidrato. Existen muchos métodos conocidos en la técnica para acoplar proteínas transportadoras a polisacáridos. Pueden generarse grupos aldehído en el extremo reductor [Anderson, Infect. Immun., 39:233-238 (1983); Jennings y col., J. Immunol., 127:1011-1018 (1981); Poren y col., Mol. Immunol., 22:907-919 (1985)] o en el extremo terminal [Anderson y col., J. Immunol., 137:1181-1186 (1986); Beuvery y col., Dev. Bio. Scand., 65:197-204 (1986)] de un oligosacárido o de un polisacárido relativamente pequeño, que pueden ser unidos a la proteína transportadora mediante una aminación reductora.

Los polisacáridos grandes pueden ser conjugados mediante activación de los extremos [Anderson y col., J. Immunol., 137:1181-1186 (1986)], o por activación aleatoria de varios grupos funcionales a lo largo de la cadena polisacarídica [Chu y col., Infect. Immun., 40:245-256 (1983); Gordon, Patente de EE.UU. 4.619.828 (1986); Marburg, Patente de EE.UU. 4.882.317 (1989)]. La activación aleatoria de varios grupos funcionales a lo largo de la cadena polisacarídica puede conducir a un conjugado que esté altamente entrecruzado debido a enlaces aleatorios a lo largo de la cadena polisacarídica. La proporción óptima de polisacárido respecto a la proteína transportadora depende del polisacárido particular, de la proteína transportadora y del conjugado utilizado.

Ver, Dick y col., en Contributions to Microbiology and Immunology, Vol. 10, Cruse y col., eds. (S. Karger: 1989), pp. 48-114; Jennings y col., en Neoglycoconjugates: Preparation and Applications, Lee y col., eds. (Academic Press: 1994), pp. 325-371; Aplin y col., CRC Crit. Rev. Biochem., 10:259-306 (1981); y Stowell y col., Adv. Carbohydr. Chem. Biochem., 37:225-281 (1980) para revisiones detalladas de métodos de conjugación de un sacárido a proteínas transportadoras.

El propio carbohidrato puede ser se sintetizado por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo mediante síntesis enzimática de glicoproteínas según está descrito por Witte y col., J. Am. Chem. Soc., 119:2114-2118 (1997).

Varios oligosacáridos, sintéticos y semisintéticos, y naturales, se discuten en los párrafos siguientes como ejemplos de oligosacáridos que son haptenos contemplados para ser utilizados en la producción de un conjugado de una proteína del núcleo central estratégicamente modificada de la presente invención.

Un hapteno oligosacarídico adecuado para preparar vacunas para el tratamiento de Haemophilus influenzae tipo b (Hib) está compuesto por 2 a 20 repeticiones de D-ribosa-D-ribitol-fosfato (I, posteriormente), D-ribitol-fosfato-D-ribosa (II, posteriormente) o fosfato-D-ribosa-D-ribitol (III, posteriormente). Eduard C. Beuvery y col., EP-0 276 516-B1.

4

La Patente de EE.UU. 4.220.717 describe también un hapteno polirribosil ribitol fosfato (PRP) para Haemophilus influenzae tipo b.

Ellena M. Peterson y col., Infection and Immunity, 66(8): 3848-3855 (1998), describen un hapteno trisacarídico, \alphaKdo(2 8)\alphaKdo(2 4)\alphaKdo, que proporciona protección frente a Chlamydia pneumoniae. Chlamydia pneumoniae es una de las causas de las infecciones respiratorias humanas, variando desde faringitis hasta neumonía fatal. Kdo es ácido 3-desoxi-D-mano-oct-2-ulosónico.

Bengt Andersson y col., EP-0 126 043-A1, describen sacáridos que pueden ser utilizados en el tratamiento, profilaxis o diagnóstico de infecciones bacterianas causadas por Streptococci pneumoniae. Una clase de sacáridos útiles deriva del disacárido GlcNAc\beta1 3Gal. Andersson y col. encontraron también que la neolactotetraosilceramida era útil, la cual es Gal\beta1 4GlcNAc\beta1 3Gal\beta1 4Glc-Cer.

La Patente Europea Nº 0 157 899-B1 describe el aislamiento de polisacáridos de neumococos que son útiles en la presente invención. La tabla siguiente enumera los tipos de cultivo de neumococos que producen polisacáridos capsulares útiles como haptenos en la presente invención.

TABLA 4 Fuentes de Haptenos Polisacarídicos

Nomenclatura de Tipo Danés	Nomenclatura de EE.UU.	Número de Catálogo de la ATCC 1978
1	1	6301
2	2	6302
3	3	6303
4	4	6304
5	5
6A	6	6306
6B	26	6326
7F	51	10351
8	8	6308

TABLA 4 (continuación)

Nomenclatura de Tipo Danés	Nomenclatura de EE.UU.	Número de Catálogo de la ATCC 1978
9N	9	6309
9V	68
10A	34
11A	43
12F	12	6312
14	14	6314
15B	54
17F	17
18C	56	10356
19A	57
19F	19	6319
20	20	6320
22F	22
23F	23	6323
25	25	6325
33F	70

Moraxella (Branhamella) catarrhalis es una causa conocida de otitis media y sinusitis en niños y de infecciones del tracto respiratorio inferior en adultos. La porción del lípido A del antígeno de superficie lipooligosacarídico (LOS) de la bacteria es cortada en el enlace ácido 3-desoxi-D-mano-octulosónico-glucosamina. El producto de corte es tratado con álcali suave para eliminar los ácidos grasos unidos por éster, mientras que se conservan los ácidos grasos unidos por amida, para producir lipopolisacárido destoxificado (dLOS) de M. catarrhalis. El dLOS no es inmunogénico hasta que está unido a una proteína transportadora. Xin-Xing Gu y col., Infection and Immunity, 66(5):1891-1897 (1998).

Los estreptococos del grupo B (GBS) son una causa de sepsis, meningitis y enfermedades neurológicas relacionadas en humanos. Se sabe que los anticuerpos específicos hacia el polisacárido capsular protegen a los niños humanos de la infección. Jennings y col., Patente de EE.UU. 5.795.580. La unidad de repetición del polisacárido capsular de GBS de tipo II es: 4)-\beta-D-GlcpNAc-(1 3)-[\beta-D-Galp(1 6)]-\beta-D-Galp(1 4)-\beta-D-Glcp(1 3)-\beta-D-Glcp-(1 2)-[\alpha-D-NeupNAc(2 3)]-\beta-D-Galp-(1, en la que la porción entre paréntesis es una rama conectada a la subunidad que no está entre paréntesis que sigue inmediatamente. La unidad de repetición del polisacárido capsular de GBS de tipo V es: 4)-[\alpha-D-NeupNAc-(2 3)-\beta-D-Galp-(1 4)-\beta-D-Glcp NAc-(1 6)]-\alpha-D-Glcp-(1 4)-[\beta-D-Glcp-(1 3)]-\beta -D-Galp-(1 4)-\beta-D-Glcp-(1).

La Solicitud de Patente Europea Nº EU-0 641 568-A1, Dr. Helmut Brade, describe el método para obtener un antígeno con un patrón de bandas similar a una escalera a partir de Chlamydia trachomatis, pneumoniae y psittaci.

D. Conjugado de un hapteno relacionado con un patógeno a la HBc modificada

En una realización de la invención, el hapteno que es conjugado a la proteína HBc estratégicamente modificada es un determinante de células B de un patógeno. Se conocen en la técnica determinantes de células B de numerosos patógenos, y varios fueron ilustrados en las discusiones precedentes de haptenos polipeptídicos y carbohidratados.

En las realizaciones preferidas, el hapteno es un hapteno relacionado con un patógeno. La utilización como hapteno de una porción de una secuencia de proteínas de un patógeno o de una secuencia de carbohidratos de un patógeno tiene ventajas características sobre la exposición a un patógeno real, e incluso sobre la exposición a una versión pasiva o "destruida" del patógeno.

Haptenos relacionados con patógenos ejemplares de particular importancia derivan de bacterias tales como B. pertussis, S. typosa, S. paratyphoid A y B, C. diptheriae, C. tetani, C. botulinum, C. perfringens, B. anthracis, P. pestis, P. multocida, V. cholerae, N. meningitides, N. gonorrhea, H. influenzae, T. palladium y similares.

Otras fuentes ejemplares de haptenos relacionados con patógenos de particular importancia son virus tales como poliovirus, adenovirus, virus de la parainfluenza, virus del sarampión, de las paperas, virus respiratorio sincitial, virus de la influenza, virus de la encefalomielitis equina, virus del cólera del cerdo, virus Newcastle, virus de la viruela aviar, virus de la rabia, virus del moquillo felino y canino, virus de la glosopeda (FMDV), virus de la inmunodeficiencia humana y de simio y similares. Otras fuentes importantes de haptenos relacionados con patógenos incluyen rickettsias, tifus epidémico y endémico, los grupos de la fiebre manchada y similares.

Haptenos polipeptídicos relacionados con patógenos son bien conocidos en la técnica y se discuten en numerosas descripciones tales como las Patentes de EE.UU. N^{os} 3.149.036, 3.983.228 y 4.069.313; en Essential Immunology, 3ª Ed., de Roit, publicado por Blackwell Scientific Publications; en Fundamentals of Clinical Immunology, de Alexander y Good, publicado por W.B. Saunders; y en Immunology, de Bellanti, publicado por W.B. Saunders.

Haptenos relacionados con patógenos particularmente preferidos son aquéllos descritos en las Patentes de EE.UU. N^{os} 4.625.015, 4.544.500, 4.545.931, 4.663.436, 4.631.191, 4.629.783 y en la Publicación Internacional del Tratado de Cooperación para Patentes Nº WO87/02775 y Nº WO87/02892.

Pueden obtenerse anticuerpos que inmunorreaccionen con el virus de la hepatitis B mediante la utilización de HBc modificada conjugada con un hapteno polipeptídico que corresponda a la secuencia de una porción determinante de HBsAg; en particular, los residuos 110-137 de la región "S" (superficie) descrita en Gerin y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:2365 (1983).

Otro conjugado corresponde a los aminoácidos 93-103 de la proteína VPI de la cápsida de poliovirus de tipo 1 (PV1, cepa Mahoney), análogo al trabajo de Delpeyroux y col., Science, 233:472-475 (1986). Tal conjugado de HBc modificada proporciona anticuerpos que inmunorreaccionan con poliovirus. Otros haptenos potenciales procedentes de poliovirus de tipo 1, cepas Mahoney y Sabin, están descritos en la Patente Europea Nº 385610.

En las realizaciones preferidas, el hapteno es un hapteno relacionado con un patógeno que inmunorreacciona con, esto es, se une inmunológicamente a, anticuerpos inducidos por el patógeno. Más preferiblemente, el hapteno relacionado con un patógeno induce una respuesta de anticuerpos que proporciona protección frente a la infección por el patógeno.

Los métodos para determinar la presencia de anticuerpos hacia un inmunógeno en una muestra del organismo de un animal inmunizado son bien conocidos en la técnica. Los métodos para determinar la presencia de anticuerpos reactivos de manera cruzada y protectores son bien conocidos en la técnica.

En otra realización de la invención, la respuesta inmune hacia el determinante de células B es reforzada proporcionando también un determinante de células T.

Por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 4.882.145 describe polipéptidos que estimulan células T derivados de la proteína de la nucleocápsida del VHB. Se conocen en la técnica otros determinantes de células T y pueden ser utilizados como un determinante unido operativamente en una proteína o partícula HBc modificada contemplada.

En una realización particularmente preferida de la la invención, tal determinante de células T deriva del mismo patógeno que el determinante de células B que está conjugado a la HBc modificada. Los determinantes de células T de varios patógenos están descritos en la técnica.

Aunque se prefiere que los determinantes de células B y T deriven del mismo patógeno, no es necesario que procedan de la misma proteína de ese patógeno. Por ejemplo, el determinante de células B procedente de la proteína VP1 del virus de la glosopeda (FMDV) puede ser conjugado a una partícula de HBc modificada, en la que la proteína HBc es modificada adicionalmente teniendo un determinante de células T derivado de la proteína VP4 del FMDV.

El determinante adicional de células T puede ser introducido en una proteína HBc modificada a nivel genético, utilizando métodos bien conocidos, dentro de, o en un extremo de, la secuencia de la proteína HBc (extremos amino o carboxi), incluyéndolo como parte del ADN insertado para introducir el residuo de aminoácido químicamente reactivo, pero preferiblemente como una proteína de fusión en el extremo carboxi. Alternativamente, el determinante adicional de células T puede ser unido operativamente al determinante de células B conjugado o a la proteína HBc estratégicamente modificada.

Pueden encontrarse descripciones ejemplares que describen técnicas para manipular genéticamente una secuencia de ADN que puede ser utilizada para producir una proteína de fusión de la presente invención en: Patentes de EE.UU. N^{os} 4.428.941 para Galibert y col.; 4.237.224 para Cohen y col.; 4.273.875 para Manis; 4.431.739 para Riggs; 4.363.877 para Goodman y col., y Rodríguez y Tait, Recombinant DNA Techniques: An Introduction, The Benjamin-Cummings Publishing Co., Inc., Menlo Park, Calif. (1983).

E. Inóculos y vacunas

En otra realización más de la invención, una proteína o partícula HBc modificada conjugada a un hapteno (un conjugado de HBc) es utilizada como inmunógeno de un inóculo que induce la producción de anticuerpos que inmunorreaccionan con el hapteno, o como una vacuna para proporcionar protección contra el patógeno del cual deriva el hapteno.

Un inóculo o vacuna contemplados comprende un conjugado de HBcAg que está disuelto o dispersado en una composición diluyente farmacéuticamente aceptable que típicamente contiene también agua. Cuando se administra en una cantidad inmunogénica eficaz a un animal tal como un mamífero (por ejemplo, ratón, perro, cabra, carnero, caballo, bovino, mono, simio o humano) o un ave (por ejemplo, pollo, pavo, pato o ganso), un inóculo induce anticuerpos que inmunorreaccionan con el hapteno conjugado (ligado de manera colgante). Una vacuna es un tipo de inóculo en el que el hapteno está relacionado con un patógeno y los anticuerpos inducidos no sólo inmunorreaccionan con el hapteno, sino que también inmunorreaccionan con el patógeno o con la célula afectada, y neutralizan el patógeno o la célula afectada con los que inmunorreaccionan.

La preparación de inóculos y vacunas que contienen materiales proteináceos como ingredientes activos es también bien conocida en la técnica. Típicamente, tales inóculos o vacunas son preparados como formulaciones parenterales, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas; pueden prepararse también formas sólidas adecuadas para disolución en, o suspensión en, un líquido antes de la inyección. La preparación puede estar también emulsionada. El ingrediente activo inmunogénico está a menudo mezclado con ingredientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo. Son excipientes adecuados, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares, y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, un inóculo o vacuna puede contener pequeñas cantidades de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponantes de pH o adyuvantes que incrementen la eficacia inmunogénica de la composición.

Adyuvantes ejemplares incluyen adyuvante completo de Freund (ACF) que no se utiliza en humanos, adyuvante incompleto de Freund (AIF) y alumbre, que son materiales bien conocidos en la técnica y están disponibles comercialmente a partir de varias fuentes. También se contempla en la presente la utilización de adyuvantes de molécula pequeña.

Son ejemplos de un grupo de adyuvantes de molécula pequeña los denominados análogos de muramil dipéptido descritos en la Patente de EE.UU. Nº 4.767.842. Otro tipo de adyuvante de molécula pequeña descrito en la Patente de EE.UU. Nº 4.787.482 que es también útil en la presente, es una mezcla 4:1 en volumen de escualeno o escualano y Aracel^{TM} A (monooleato de manida).

Otro tipo más de adyuvante de molécula pequeña útil en la presente es un derivado 7-sustituido-8-oxo o 8-sulfoguanosina descrito en las Patentes de EE.UU. Nº 4.539.205, Nº 4.643.992, Nº 5.011.828 y Nº 5.093.318. De estos materiales, es particularmente preferida la 7-alil-8-oxoguanosina (loxorribina). Esta molécula ha demostrado ser particularmente eficaz en la inducción de una respuesta específica de un antígeno (inmunógeno).

Los inóculos y vacunas son administrados convencionalmente por vía parenteral, mediante inyección, por ejemplo, subcutánea o muscular. Formulaciones adicionales que son adecuadas para otros modos de administración incluyen supositorios y, en algunos casos, una formulación oral o una pulverización nasal. Para los supositorios, los aglutinantes y vehículos tradicionales pueden incluir, por ejemplo, polialcalén glicoles o triglicéridos; tales supositorios pueden ser formados a partir de mezclas que contengan el ingrediente activo en el rango de un 0,5% a un 10%, preferiblemente 1-2%. Las formulaciones orales incluyen excipientes utilizados normalmente tales como, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio y similares.

Una composición de inóculo o vacuna toma la forma de una solución, suspensión, tableta, píldora, cápsula, formulación de liberación mantenida o polvo, y contiene una cantidad inmunogénica de un conjugado de una proteína HBc estratégicamente modificada o de un conjugado de una partícula de proteínas HBc estratégicamente modificadas como ingrediente activo. En una composición típica, una cantidad inmunogénica del conjugado de una proteína HBc estratégicamente modificada, o del conjugado de una partícula de proteínas HBc estratégicamente modificadas, es de 50 \mug aproximadamente a 2 mg aproximadamente de ingrediente activo por dosis, y más preferiblemente de 100 \mug aproximadamente a 1 mg aproximadamente por dosis.

Los conjugados de partículas y proteínas pueden ser formulados en la vacuna como formas neutras o sales. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres del péptido) y que son formadas con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico o fosfórico, o con ácidos orgánicos tales como ácido acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres pueden derivar también de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxido de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y de bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína y similares.

Los inóculos o vacunas son administrados de una manera compatible con la formulación de dosificación, y en una cantidad tal que sean terapéuticamente eficaces e inmunogénicos. La cantidad a administrar depende del sujeto a tratar, de la capacidad del sistema inmune del sujeto para sintetizar anticuerpos y del grado de protección deseado. Las cantidades precisas de ingrediente activo requeridas para la administración dependen de la opinión del médico y son peculiares para cada individuo. Sin embargo, los rangos de dosificación adecuados son del orden de varios cientos de microgramos de ingrediente activo por individuo. Los regímenes adecuados para la administración inicial y las dosis de refuerzo son también variables, pero están tipificados por una administración inicial seguida en intervalos (semanas o meses) por una inyección posterior u otra administración.

Los inóculos de la invención pueden ser utilizados en un proceso para inducir anticuerpos en un animal huésped, comprendiendo las etapas de inoculación de dicho animal huésped con un inóculo. El inóculo utilizado en el proceso comprende una cantidad inmunogénica de un conjugado de una proteína del núcleo central de la hepatitis B estratégicamente modificada disuelta o dispersada en un diluyente farmacéuticamente aceptable. El conjugado de la proteína del núcleo central de la hepatitis B estratégicamente modificada utilizado en el proceso contiene un hapteno ligado de manera colgante a una proteína del núcleo central de la hepatitis B estratégicamente modificada. Preferiblemente, la proteína del núcleo central de la hepatitis B estratégicamente modificada están en forma de partículas. La proteína del núcleo central de la hepatitis B estratégicamente modificada contiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de aminoácidos de la proteína del núcleo central de la hepatitis B de SEC ID Nº: 2, incluyendo los residuos de aminoácidos numerados como 10 a 140 y teniendo adicionalmente un inserto en la región correspondiente a los residuos de aminoácidos numerados como 50 a 100, teniendo dicho inserto (i) de 1 a 40 residuos de aminoácidos de longitud, y (ii) conteniendo dicho inserto un residuo de aminoácido químicamente reactivo. El hapteno está ligado de manera colgante a la proteína del núcleo central de la hepatitis B estratégicamente modificada a través de dicho residuo de aminoácido químicamente reactivo. Preferiblemente, el hapteno está relacionado con un patógeno. El animal es mantenido durante un tiempo suficiente para inducir anticuerpos.

La invención está ilustrada por los ejemplos no limitantes siguientes.

Ejemplo 1 Construcción de un vector de expresión de una proteína del núcleo central de la hepatitis B modificada

Utilizando mutagénesis dirigida a un sitio, se introdujo un codón de lisina (TTT) entre los aminoácidos D78 y P79 del gen de HBc, junto con sitios para las endonucleasas de restricción EcoRI (GAATTC) y SacI (GAGCTC) con el fin de facilitar la inserción genética de otros codones para producir partículas de HBc híbridas estratégicamente modificadas. El inserto tenía por tanto una secuencia de residuos de aminoácidos GIQKEL, en la que GIQ es un artefacto del sitio de EcoRI y EL es un artefacto del sitio de SacI. La proteína del núcleo central de la hepatitis B estratégicamente modificada tenía por tanto 155 residuos de aminoácidos de longitud. A continuación se describe la construcción del plásmido de expresión pKK322-HBc155-K81.

Los cebadores oligonucleotídicos P1F (SEC ID Nº: 17) y P1R (SEC ID Nº: 18, en la hebra complementaria) fueron utilizados para amplificar el extremo 5' del gen de la HBc (bases 1-234, aminoácidos 1-78) e incorporar simultáneamente un sitio de restricción de NcoI (CCATGG) en el extremo 5' y un sitio de restricción de EcoRI (GAATTC) en el extremo 3' del producto amplificado. Los cebadores oligonucleotídicos P2F (SEC ID Nº: 19) y P2R (SEC ID Nº: 20, en la hebra complementaria) fueron utilizados para amplificar el extremo 3' del gen de la HBc (bases 232-450, aminoácidos 79-149) e incorporar simultáneamente un sitio de restricción de EcoRI (GAATTC) en el extremo 5', un sitio de restricción de SacI (GAGCTC) adyacente al mismo, un codón de lisina (AAA) insertado entre ellos y un sitio de restricción de HindIII (AAGCTT) en el extremo 3' del producto amplificado.

Los dos productos de PCR (que codifican los aminoácidos 1-78 y los aminoácidos 79-149) fueron cortados con EcoRI, ligados entre sí en sus salientes de EcoRI comunes, cortados con NcoI y HindIII y clonados en el plásmido de expresión pKK332 (Pharmacia) utilizando técnicas estándar. El plásmido resultante fue denominado pKK332-HBc-K81. Este plásmido puede ser utilizado para la expresión de una proteína HBc estratégicamente modificada que lleva una lisina en el bucle inmunodominante. La proteína HBc estratégicamente modificada expresada formaba partículas espontáneamente. La HBc estratégicamente modificada de este Ejemplo tenía por tanto un inserto correspondiente a la posición 78 de la HBc de la SEC ID Nº: 2, un residuo de lisina químicamente reactivo en una posición correspondiente a la posición 82 de la HBc de la SEC ID Nº: 2, y estaba truncada en una posición correspondiente a la posición 149 de la HBc de la SEC ID Nº: 2.

Ejemplo 2 Purificación de las partículas de proteínas del núcleo central de la hepatitis B modificadas

Las partículas de HBc estratégicamente modificada del Ejemplo 1 fueron expresadas en E. coli, típicamente E. coli BLR o BL21 de Novagen (Madison, Wisconsin) o en E. coli TB11 de Amersham (Arlington Heights, Illinois). Las E. coli transfectadas denominadas HBc155-K81, expresaban el plásmido pKK332-HBc-K81. Las partículas de HBc estratégicamente modificada fueron purificadas mediante cromatografía en Sefarosa CL-4B utilizando procedimientos establecidos. Como las partículas se purifican de una manera predecible, la monitorización de la elución de las partículas utilizando espectroscopía simple (DO_{280}), junto con análisis mediante SDS-PAGE para determinar la pureza de las fracciones individuales antes de agruparlas, fue suficiente para permitir la purificación rutinaria de partículas electroforéticamente puras con alto rendimiento (5-120 mg/l de cultivo celular). La estructura esférica de las partículas de proteínas del núcleo central de la hepatitis B estratégicamente modificadas era claramente visible en una micrografía electrónica.

Ejemplo 3 Acoplamiento químico de péptidos sintéticos y partículas de proteínas del núcleo central de la hepatitis B modificadas

El producto de partículas de proteínas del núcleo central de la hepatitis B estratégicamente modificadas del plásmido de expresión pKK332-HBc-K81 del Ejemplo 1 fue analizado para determinar su reactividad química en comparación con la partícula HBc149 del núcleo central de la hepatitis B truncada de "tipo salvaje" expresada y purificada de forma similar, que es idéntica a HBc155-K81 excepto en que carece del residuo de lisina introducido y de los cinco aminoácidos flanqueantes.

Péptidos sintéticos (haptenos) fueron conjugados químicamente a las partículas de HBc utilizando succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (SMCC), un reactivo de entrecruzamiento heterobifuncional soluble en agua. SMCC es reactivo hacia los grupos sulfihidrilo y hacia los grupos amino primarios, permitiendo la conjugación secuencial de péptidos sintéticos a las partículas de HBc cuyos grupos amino primarios habían sido previamente modificados con SMCC. Además, el brazo separador de 11,6 \ring{A}ngstroms proporcionado por SMCC ayuda a reducir el impedimento estérico entre el hapteno y la HBc transportadora, permitiendo de este modo eficacias de acoplamiento más elevadas.

Brevemente, las partículas HBc155-K81 y HBc149 se hicieron reaccionar separadamente con un exceso de 3 veces de SMCC sobre los grupos amino totales (grupos amino nativos o grupos amino nativos más el procedente del residuo de lisina del inserto) durante 2 horas a temperatura ambiente en fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5, para formar partículas de HBc activadas con maleimida. El SMCC no reaccionado fue eliminado mediante diálisis repetida frente a fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0. La derivatización de las partículas de HBc con SMCC tuvo como resultado un incremento mínimo del peso molecular que no fue detectable por SDS-PAGE. Sin embargo, el análisis mediante PAGE confirmó la integridad de las proteínas HBc antes de proceder a la etapa de conjugación con el péptido.

Se diseñaron péptidos sintéticos para ser acoplados a las partículas de HBc de tal manera que tuvieran residuos de cisteína N-terminales para permitir la conjugación direccional de haptenos peptídicos a la amina primaria de la cadena lateral del residuo de lisina introducido a través del sulfhidrilo de la cisteína del hapteno.

La Tabla 2 muestra los péptidos sintéticos derivados de enzimas del citocromo P-450 humano que fueron conjugados químicamente a partículas de HBc. Los péptidos sintéticos fueron disueltos en fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0, a una concentración de 10 mg/ml. Los péptidos sintéticos fueron añadidos posteriormente, gota a gota, en un exceso de 5 veces sobre los grupos amino totales, a partículas HBc155-K81 estratégicamente modificadas activadas con maleimida, y se dejaron reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas. Las partículas HBc149 activadas con maleimida se hicieron reaccionar con los dos péptidos 2D6 (206 y 206-C) como controles.

TABLA 5 Haptenos del citocromo P-450

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Ejemplo 4 Análisis de los conjugados de partículas de proteínas del núcleo central modificadas

Las partículas de HBc estratégicamente modificada unidas de manera colgante a los haptenos determinantes del citocromo P-450 del Ejemplo 3 fueron analizadas mediante SDS-PAGE e inmunotransferencias con el fin de determinar si los péptidos sintéticos se habían conjugado con éxito a la HBc. Las condiciones desnaturalizantes de la electroforesis disocian las partículas en sus subunidades constituyentes, monómeros de HBc. Como los monómeros de HBc tienen un peso molecular de 16.000 Da aproximadamente, era fácil resolver las partículas HBc155-K81 conjugadas químicamente a los péptidos 1A1 (289-302), 1A2 (291-302), 2D6 (263-277) o 3A4 (253-273), ya que esos péptidos tienen una masa molecular relativa de 2.000 Da aproximadamente y producen por tanto un incremento visible de la masa molecular de los monómeros de proteína HBc. A partir de las intensidades relativas de las bandas conjugadas y no conjugadas en SDS-PAGE, se reveló que el 50 por ciento aproximadamente de los monómeros de HBc155-K81 estaban unidos operativamente al hapteno, mientras que solamente el 5 por ciento aproximadamente de las partículas de HBc149 de "tipo salvaje" estaban ligadas al hapteno. El notable incremento en el éxito observado en la unión de manera colgante del hapteno a la proteína del núcleo central de la hepatitis B estratégicamente modificada, apoya la conclusión de que la unión observada tiene lugar a través de la lisina insertada, en oposición a un residuo de lisina que está también presente en el "tipo salvaje".

El desplazamiento de la movilidad de las partículas de HBc conjugadas a péptidos derivados de P-450 C-terminales más cortos (5 y 6-meros) no es tan pronunciado en la SDS-PAGE como el de los péptidos inhibidores más largos, pero desplazamientos de 700 Da aproximadamente eran claramente evidentes en los monómeros de HBc155-K81 acoplados con éxito. La proteína HBc155-K81 estratégicamente modificada presenta una capacidad notablemente incrementada para ligar de manera colgante un hapteno con respecto a las partículas de HBc149 de "tipo salvaje", que mostraban una conjugación mínima.

En el modelo de partículas del núcleo central planteado por Conway y col. de partículas icosahédricas de 180 ó 240 monómeros de proteína del núcleo central asociados [Nature, 386:91-94 (1997)], los dímeros de las regiones del bucle inmunodominante relativamente expuestas de los monómeros de proteína del núcleo central se proyectan desde la partícula de proteínas del núcleo central ensambladas hacia la solución como púas en una maza. Las "púas" están dispuestas espacialmente muy próximas sobre las partículas de HBc. La situación estratégica del residuo de lisina introducido en el extremo de la púa minimiza la propensión a restricciones estéricas en las reacciones para unir haptenos a la partícula de proteínas del núcleo central ensambladas. Un máximo del 50 por ciento de monómeros de HBc estratégicamente modificada fue conjugado con éxito a los péptidos sintéticos del citocromo P-450. Esa cantidad de unión colgante corresponde a una media de un hapteno unido por púa de la partícula de proteínas del núcleo central. Esta distribución propuesta de unión del hapteno a la partícula de HBc estratégicamente modificada está apoyada por resultados de PAGE bajo condiciones semidesnaturalizantes que disocian la partícula mientras mantienen la asociación de dímeros.

Las partículas HBc-2D6, preparadas mediante acoplamiento peptídico, fueron examinadas utilizando inmunotransferencias para confirmar la presentación del epítopo 2D6. Cuando fue sondada con antisueros anti-HBc, la partícula acoplada químicamente producía dos monómeros diferentes que representaban partículas con y sin el péptido 2D6. Solamente la banda superior del mismo mostraba transferencia de antisueros anti-2D6, confirmando de este modo la correlación entre el desplazamiento de la movilidad y la unión del péptido 2D6.

Ejemplo 6 Inserciones de lisina estratégicas

Para construir las partículas de HBc con residuos de lisina insertados en cualquier posición de la región del bucle inmunodominante expuesta a la superficie (aminoácidos 75-85), se utilizó PCR para amplificar los fragmentos 5' y 3' del gen de la HBc y se introdujo un único codón de lisina a través de los cebadores oligonucleotídicos. Los cebadores oligonucleotídicos y las secuencias de aminoácidos resultantes se muestran en las SEC ID N^{os}: 61-82. Las secuencias de "tipo salvaje" son las SEC ID N^{os}: 59-60.

Con el fin de generar insertos de lisina en las posiciones 75 a 84 (HBc-K75 hasta HBc-K84), los pares de fragmentos de PCR fueron digeridos con la endonucleasa de restricción MseI, que reconoce la secuencia AATT. El gen modificado fue restaurado ligando el cebador oligonucleotídico (que contenía la lisina) en el sitio de restricción de MseI conveniente situado en los nucleótidos 221-224. Para HBc-K85 (SEC ID N^{os}: 85-86) fue necesario generar dos fragmentos que fueron ligados en un sitio de restricción de XhoI común (CTCGAG) que no está presente en el gen de tipo salvaje, pero pudo ser introducido en la posición 239-244 sin alterar ningún aminoácido.

TABLA 6 Mutantes de HBc por inserción de lisina en el bucle inmunodominante

6

Para purificar las proteínas HBc estratégicamente modificadas, lisados celulares clarificados procedentes de una fermentación de 1 l fueron precipitados con sulfato de amonio al 45% y la pella resultante sometida a filtración en gel utilizando cromatografía en Sefarosa CL-4B (2,5 cm x 100 cm). La HBc particulada tiene una posición de elución característica cuando se analiza utilizando este tipo de columna, que era independiente de las inserciones de aminoácidos realizadas en la partícula. Las once partículas de HBc estratégicamente modificada generadas para este estudio fueron analizadas utilizando este procedimiento, y los perfiles de elución fueron medidos espectrofotométricamente a una absorbancia de 280 nm.

Tres de las construcciones (HBc-K75, HBc-K77 y HBc-K79) fueron producidas a niveles de entre 50 y 100 mg/l, lo cual es comparable con los rendimientos típicos para partículas de HBc de tipo salvaje, no modificadas, por ejemplo partículas HBc149. Cuatro de las construcciones (HBc-K76, HBc-K78, HBc-K81 y HBc-K82) fueron producidas a niveles relativamente bajos, de entre 1 y 20 mg/l. Finalmente, cuatro de las partículas (HBc-K80, HBc-K83, HBc-K84 y HBc-K85) fueron producidas a niveles considerados escasamente detectables (< 1 mg/l).

TABLA 7 Rendimientos de partículas de hbc que contenían lisina purificadas procedentes de una fermentación de 1 l

Partícula	Rendimiento (mg/l)
HBc-150(K75)	77
HBc-150(K76)	5
HBc-150(K77)	74
HBc-150(K78)	10
HBc-150(K79)	94
HBc-150(K80)	0
HBc-150(K81)	17
HBc-150(K82)	1
HBc-150(K83)	0
HBc-150(K84)	0
HBc-150(K85)	0

\vskip0.333000\baselineskip

<110> Birkett, Ashley J.

\hskip1cm

Immune Complex Inc.

\vskip0.333000\baselineskip

<120> Proteínas del Núcleo Central de la Hepatitis B Estratégicamente Modificadas y sus Derivados

\vskip0.333000\baselineskip

<130> SYN-101 4564/69529

\vskip0.333000\baselineskip

<140> PCT/US99/

\vskip0.333000\baselineskip

<141> 11-02-1999

\vskip0.333000\baselineskip

<150> 60/074537

\vskip0.333000\baselineskip

<151> 12-02-1998

\vskip0.333000\baselineskip

<160> 113

\vskip0.333000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.0

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 553

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Virus de la hepatitis B

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (1)..(549)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<300>

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<303> Nature

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<304> 281

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<306> 646-

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<307> 1979

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\vskip0.333000\baselineskip

<400> 1

7

8

800

80

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<210> 2

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<211> 183

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<212> PRT

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<213> Virus de la hepatitis B

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\vskip0.333000\baselineskip

<400> 2

9

90

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 3

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<211> 552

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Virus de la hepatitis B

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<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (1)..(549)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<300>

\vskip0.333000\baselineskip

<303> Nucleic Acids Res.

\vskip0.333000\baselineskip

<304> 11

\vskip0.333000\baselineskip

<306> 1747-

\vskip0.333000\baselineskip

<307> 1983

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\vskip0.333000\baselineskip

<400> 3

10

100

11

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<210> 4

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<211> 183

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<212> PRT

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<213> Virus de la hepatitis B

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\vskip0.333000\baselineskip

<400> 4

12

120

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<210> 5

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<211> 558

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<212> ADN

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<213> Virus de la hepatitis B

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<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (1)..(555)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<300>

\vskip0.333000\baselineskip

<303> Nucleic Acids Res.

\vskip0.333000\baselineskip

<304> 11

\vskip0.333000\baselineskip

<306> 1747-

\vskip0.333000\baselineskip

<307> 1983

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 5

13

130

14

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 185

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Virus de la hepatitis B

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 6

15

16

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 188

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Virus de la hepatitis B

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<300>

\vskip0.333000\baselineskip

<301> Schodel, Florian y col.

\vskip0.333000\baselineskip

<302> Virus de la Hepatitis B de Animales

\vskip0.333000\baselineskip

<303> Adv. Viral Oncol.

\vskip0.333000\baselineskip

<304> 8

\vskip0.333000\baselineskip

<306> 73-102

\vskip0.333000\baselineskip

<307> 1989

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

17

18

180

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 8

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<211> 654

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Virus de la hepatitis B

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (1)..(651)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<300>

\vskip0.333000\baselineskip

<302> Virus de la Hepatitis B de Animales

\vskip0.333000\baselineskip

<303> Adv. Viral Oncol.

\vskip0.333000\baselineskip

<304> 8

\vskip0.333000\baselineskip

<306> 73-102

\vskip0.333000\baselineskip

<307> 1989

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 8

19

20

200

21

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 217

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Virus de la hepatitis B

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 9

22

220

23

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 918

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Virus de la hepatitis B

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (1)..(915)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 10

24

240

25

250

26

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 305

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Virus de la hepatitis B

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 11

27

270

28

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 918

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Virus de la hepatitis B

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (1)..(915)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 12

29

290

30

31

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 305

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Virus de la hepatitis B

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 13

32

33

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Virus de la influenza

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala Pro Ile Gly Thr Cys Ser Ser Glu Cys}

\sac{Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val}

\sac{Asn Lys Ile Thr Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Virus de la influenza

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu}

\sac{Gly Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Virus de la influenza

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Lys Gln Thr Arg Gly Ile Phe Gly Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador de PCR del virus de la hepatitis B con un sitio de restricción de NcoI.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

ttgggccatg gacatcgacc tta

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador de PCR del virus de la hepatitis B con un sitio de restricción de EcoRI

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 18

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\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

gcggaattcc atcttccaaa ttaacaccca c

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador de PCR del virus de la hepatitis B con sitios de restricción de EcoRI y SacI y un codón de lisina insertado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

cgcgaattca aaaagagctc ccagcgtcta gagagaccta g

\hfill

41

\newpage

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador de PCR del virus de la hepatitis B con un sitio de restricción de HindIII

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

cgcaagctta aacaacagta gtctccggaa g

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Virus de la hepatitis B

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Gln Glu Lys Gln Leu Asp Glu Asn Ala Asn Val Gln Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Virus de la hepatitis B

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Ser Lys Lys Gly Pro Arg Ala Ser Gly Asn Leu Ile}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Virus de la hepatitis B

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Leu Thr Glu His Arg Met Thr Trp Asp Pro Ala Gln Pro Pro Arg}

\sac{Asp Leu Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.333000\baselineskip

<211> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<212> Virus de la hepatitis B

\vskip0.333000\baselineskip

<213> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Val Lys Arg Met Lys Glu Ser Arg Leu Glu Asp Thr Gln Lys His}

\sac{Arg Val Asp Phe Leu Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Streptococcus pneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<300>

\vskip0.333000\baselineskip

<310> EP-0 786 521-A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Leu Glu Glu Leu Ser Asp Lys Ile Asp Glu Leu Asp Ala Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Streptococcus pneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<300>

\vskip0.333000\baselineskip

<310> EP-0 786 521-A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Lys Lys Tyr Asp Glu Asp Gln Lys Lys Thr Glu Glu Lys Ala Ala}

\sac{Leu Glu Lys Ala Ala Ser Glu Glu Met Asp Lys Ala Val Ala Ala Val}

\sac{Gln Gln Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Cryptosporidium parvum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<300>

\vskip0.333000\baselineskip

<310> WO 98/07320

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Asp Lys Pro Ala Asp Ala Pro Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ala Glu}

\sac{Pro Ala Ala Glu Pro Ala Ala Gln Gln Asp Lys Pro Ala Asp Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Virus de la inmunodeficiencia humana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<300>

\vskip0.333000\baselineskip

<310> US 5.639.854

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Cys}

\newpage

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Virus de la inmunodeficiencia humana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<300>

\vskip0.333000\baselineskip

<310> WO 98/07320

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ile Thr Lys}

\sac{Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Virus de la glosopeda

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<300>

\vskip0.333000\baselineskip

<310> US 4.544.500

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Asn Gly Glu Cys Arg Tyr Asn Arg Asn Ala Val Pro Asn Leu Arg}

\sac{Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Val Ala Arg Thr Leu Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Corynebacterium diphtheriae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<300>

\vskip0.333000\baselineskip

<310> EP-0 399 011-B1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly}

\sac{Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Borrelia burgdorferi

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<300>

\vskip0.333000\baselineskip

<301> Bockenstedt, L.K. y col.

\vskip0.333000\baselineskip

<303> J. Immunol.

\vskip0.333000\baselineskip

<304> 157

\vskip0.333000\baselineskip

<305> 12

\vskip0.333000\baselineskip

<306> 5496-

\vskip0.333000\baselineskip

<307> (1996)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Glu Ile Lys Glu Gly Thr Val Thr Leu Lys Arg Glu Ile Asp Lys}

\sac{Asn Gly Lys Val Thr Val Ser Leu Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Borrelia burgdorferi

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<300>

\vskip0.333000\baselineskip

<301> Zhong, W. y col.

\vskip0.333000\baselineskip

<303> Eur. J. Immunol.

\vskip0.333000\baselineskip

<304> 26

\vskip0.333000\baselineskip

<305> 11

\vskip0.333000\baselineskip

<306> 2749-

\vskip0.333000\baselineskip

<307> 1996

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Leu Ser Lys Asn Ile Ser Lys Ser Gly Glu Val Ser Val Glu Leu}

\sac{Asn Asp Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Virus de la influenza A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<300>

\vskip0.333000\baselineskip

<301> Brumeanu, T.D.

\vskip0.333000\baselineskip

<303> Immunotechnology

\vskip0.333000\baselineskip

<304> 2

\vskip0.333000\baselineskip

<305> 2

\vskip0.333000\baselineskip

<306> 85-

\vskip0.333000\baselineskip

<307> (1996)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Ser Val Ser Ser Phe Glu Arg Phe Glu Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Virus de la influenza A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<300>

\vskip0.333000\baselineskip

<301> Brumeanu, T.D.

\vskip0.333000\baselineskip

<303> Immunotechnology

\vskip0.333000\baselineskip

<304> 2

\vskip0.333000\baselineskip

<305> 2

\vskip0.333000\baselineskip

<306> 85-

\vskip0.333000\baselineskip

<307> (1996)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Glu Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 142

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Yersinia pestis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<300>

\vskip0.333000\baselineskip

<301> Hill, J. y col.

\vskip0.333000\baselineskip

<303> Infect. Immun.

\vskip0.333000\baselineskip

<304> 65

\vskip0.333000\baselineskip

<305> 11

\vskip0.333000\baselineskip

<306> 4476-

\vskip0.333000\baselineskip

<307> (1997)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 36

34

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Haemophilus influenzae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<300>

\vskip0.333000\baselineskip

<310> EP-0 432 220-B1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Ser Ser Ser Asn Asn Asp Ala Ala Gly Asn Gly Ala Ala Gln Phe}

\sac{Gly Gly Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Haemophilus influenzae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<300>

\vskip0.333000\baselineskip

<310> EP-0 432 220-B1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Lys Leu Gly Thr Val Ser Tyr Gly Glu Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Haemophilus influenzae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<300>

\vskip0.333000\baselineskip

<310> EP-0 432 220-B1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Asp Glu Ala Ala Tyr Ser Lys Asn Arg Arg Ala Val Leu Ala Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<300>

\vskip0.333000\baselineskip

<310> WO 98/06851

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Asp Ile Glu Lys Asp Lys Lys Lys Arg Thr Asp Glu Gln Leu Gln}

\sac{Ala Glu Leu Asp Asp Lys Tyr Ala Gly Lys Gly Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<300>

\vskip0.333000\baselineskip

<310> WO 98/06851

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Asp Ile Glu Lys Asn Lys Lys Lys Arg Thr Glu Ala Glu Leu Gln}

\sac{Ala Glu Leu Asp Asp Lys Tyr Ala Gly Lys Gly Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<300>

\vskip0.333000\baselineskip

<310> WO 98/06851

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Asp Ile Glu Lys Lys Gly Lys Ile Arg Thr Glu Ala Glu Leu Leu}

\sac{Ala Glu Leu Asn Lys Asp Tyr Pro Gly Gln Gly Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Porphyromonas gingivalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<300>

\vskip0.333000\baselineskip

<304> 110

\vskip0.333000\baselineskip

<305> 2

\vskip0.333000\baselineskip

<306> 285-

\vskip0.333000\baselineskip

<307> 1997

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Val Ser Pro Lys Val Cys Lys Asp Val Thr Val Glu Gly Ser Asn}

\sac{Glu Phe Ala Pro Val Gln Asn Leu Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Porphyromonas gingivalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<300>

\vskip0.333000\baselineskip

<304> 110

\vskip0.333000\baselineskip

<305> 2

\vskip0.333000\baselineskip

<306> 285-

\vskip0.333000\baselineskip

<307> 1997

\newpage

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Ile Gln Ser Thr Trp Arg Gln Lys Thr Val Asp Leu Pro Ala Gly}

\sac{Thr Lys Tyr Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Trypanosoma cruzi

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<300>

\vskip0.333000\baselineskip

<304> 159

\vskip0.333000\baselineskip

<305> 9

\vskip0.333000\baselineskip

<306> 4444-

\vskip0.333000\baselineskip

<307> (1997)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser His Asn Phe Thr Leu Val Ala Ser Val Ile Ile Glu Ala Pro Ser}

\sac{Gly Asn Thr Cys}

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Trypanosoma cruzi

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<300>

\vskip0.333000\baselineskip

<310> WO 97/18475

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Ala Ala Ile Ala Pro Ala Lys Ala Ala Ala Ala Pro Ala Lys Ala}

\sac{Ala Thr Ala Pro Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Plasmodium falciparum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<300>

\vskip0.333000\baselineskip

<303> Int. Arch. Allergy Appl. Immunol.

\vskip0.333000\baselineskip

<304> 114

\vskip0.333000\baselineskip

<305> 1

\vskip0.333000\baselineskip

<306> 15-

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Val Gln Ile Pro Lys Val Pro Tyr Pro Asn Gly Ile Val Tyr Cys}

\newpage

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Plasmodium falciparum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<300>

\vskip0.333000\baselineskip

<303> Int. Arch. Allergy Appl. Immunol.

\vskip0.333000\baselineskip

<304> 114

\vskip0.333000\baselineskip

<305> 1

\vskip0.333000\baselineskip

<306> 15-

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Phe Asn His Tyr Tyr Thr Leu Lys Thr Gly Leu Glu Ala Asp Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Streptococcus sobrinus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<300>

\vskip0.333000\baselineskip

<303> Arch. Oral Biol.

\vskip0.333000\baselineskip

<304> 35

\vskip0.333000\baselineskip

<306> Suplemento 475-

\vskip0.333000\baselineskip

<307> (1990)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Pro Arg Pro Ile Tyr Glu Ala Lys Leu Ala Gln Asn Gln Lys Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Streptococcus sobrinus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<300>

\vskip0.333000\baselineskip

<303> Arch. Oral Biol.

\vskip0.333000\baselineskip

<304> 35

\vskip0.333000\baselineskip

<306> Suplemento 475-

\vskip0.333000\baselineskip

<307> (1990)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Lys Ala Asp Tyr Glu Ala Lys Leu Ala Gln Tyr Glu Lys Asp Leu}

\sac{Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Virus de la coriomeningitis linfocítica

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<300>

\vskip0.333000\baselineskip

<303> Proc. Natl. Acad. Sci. USA

\vskip0.333000\baselineskip

<304> 94

\vskip0.333000\baselineskip

<305> 7

\vskip0.333000\baselineskip

<306> 3314-

\vskip0.333000\baselineskip

<307> (1997)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Pro Gln Ala Ser Gly Val Tyr Met Gly Asn Leu Thr Ala Gln Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Shigella flexneri

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<300>

\vskip0.333000\baselineskip

<303> J. Biol. Chem.

\vskip0.333000\baselineskip

<304> 271

\vskip0.333000\baselineskip

<305> 52

\vskip0.333000\baselineskip

<306> 33670-

\vskip0.333000\baselineskip

<307> (1996)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Asp Arg Thr Leu Ile Glu Gln Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Virus respiratorio sincitial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<300>

\vskip0.333000\baselineskip

<304> 234

\vskip0.333000\baselineskip

<305> 1

\vskip0.333000\baselineskip

<306> 118-

\vskip0.333000\baselineskip

<307> 1997

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Plasmodium vivax

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<300>

\vskip0.333000\baselineskip

<303> Vaccine

\vskip0.333000\baselineskip

<304> 15

\vskip0.333000\baselineskip

<305> 4

\vskip0.333000\baselineskip

<306> 377-

\vskip0.333000\baselineskip

<307> 1997

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Asp Arg Ala Asp Gly Gln Pro Ala Gly Asp Arg Ala Asp Gly Gln}

\sac{Pro Ala Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Clostridium tetani

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<300>

\vskip0.333000\baselineskip

<303> Vaccine

\vskip0.333000\baselineskip

<304> 15

\vskip0.333000\baselineskip

<305> 4

\vskip0.333000\baselineskip

<306> 377-

\vskip0.333000\baselineskip

<307> 1997

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Entamoeba histolytica

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<300>

\vskip0.333000\baselineskip

<303> J. Exp. Med.

\vskip0.333000\baselineskip

<304> 185

\vskip0.333000\baselineskip

<305> 10

\vskip0.333000\baselineskip

<306> 1793-

\vskip0.333000\baselineskip

<307> 1997

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Glu Cys Ala Ser Thr Val Cys Gln Asn Asp Asn Ser Cys Pro Ile}

\sac{Ile Ala Asp Val Glu Lys Cys Asn Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Schistosoma japonicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<300>

\vskip0.333000\baselineskip

<303> Vaccine

\vskip0.333000\baselineskip

<304> 15

\vskip0.333000\baselineskip

<305> 1

\vskip0.333000\baselineskip

<306> 79-

\vskip0.333000\baselineskip

<307> 1997

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Leu Gln Ser Glu Ile Ser Leu Ser Leu Glu Asn Gly Glu Leu Ile}

\sac{Arg Arg Ala Lys Ser Ala Glu Ser Leu Ala Ser Glu Leu Gln Arg Arg}

\sac{Val Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Schistosoma mansoni

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<300>

\vskip0.333000\baselineskip

<303> Vaccine

\vskip0.333000\baselineskip

<304> 15

\vskip0.333000\baselineskip

<305> 1

\vskip0.333000\baselineskip

<306> 79-

\vskip0.333000\baselineskip

<307> 1997

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Leu Gln Ser Glu Ile Ser Leu Ser Leu Glu Asn Ser Glu Leu Ile}

\sac{Arg Arg Ala Lys Ala Ala Glu Ser Leu Ala Ser Asp Leu Gln Arg Arg}

\sac{Val Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 63

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sitio de la endonucleasa de restricción MseI insertado en la secuencia de la Hepatitis B de tipo salvaje en la posición 75

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (1)..(63)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 59

35

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp Leu}

\sac{Val Val Ser Tyr Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: K insertada en la posición del aminoácido 75 del núcleo central de la hepatitis B

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (1)..(39)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

gct acc tgg gtg ggt gtt aaa aat ttg gaa gat cca gcg tc

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Thr Trp Val Gly Val Lys Asn Leu Glu Asp Pro Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Thr Trp Val Gly Val Lys Asn Leu Glu Asp Pro Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: K insertada en la posición del aminoácido 76 del núcleo central de la hepatitis B

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (3)..(26)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

tt aat aaa ttg gaa gat cca gcg tct a

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\dddseqskip

\sa{Asn Lys Leu Glu Asp Pro Ala Ser}

\newpage

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Lys Leu Glu Asp Pro Ala Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: K insertada en la posición 77 del núcleo central del virus de la hepatitis B

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (3)..(26)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

tt aat ttg aaa gaa gat cca gcg tct a

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Leu Lys Glu Asp Pro Ala Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Leu Lys Glu Asp Pro Ala Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: K insertada en la posición 78 del núcleo central de la hepatitis B

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (3)..(32)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

tt aat ttg gaa aaa gat cca gcg tct aga gac

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Leu Glu Lys Asp Pro Ala Ser Arg Asp}

\newpage

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Leu Glu Lys Asp Pro Ala Ser Arg Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: K insertada en la posición del aminoácido 79 del núcleo central de la hepatitis B

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (3)..(35)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

tt aat ttg gaa gat aaa cca gcg tct aga gac cta g

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Leu Glu Asp Lys Pro Ala Ser Arg Asp Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 70

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Leu Glu Asp Lys Pro Ala Ser Arg Asp Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: K insertada en la posición del aminoácido 80 del núcleo central de la hepatitis B

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (3)..(38)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

tt aat ttg gaa gat cca aaa gcg tct aga gac cta gta g

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Leu Glu Asp Pro Lys Ala Ser Arg Asp Leu Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 72

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Leu Glu Asp Pro Lys Ala Ser Arg Asp Leu Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: K insertada en la posición del aminoácido 81 del núcleo central de la hepatitis B

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (3)..(41)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

tt aat ttg gaa gat cca gcg aaa tct aga gac cta gta gtc ag

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Leu Glu Asp Pro Ala Lys Ser Arg Asp Leu Val Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 74

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Leu Glu Asp Pro Ala Lys Ser Arg Asp Leu Val Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: K insertada en la posición del aminoácido 82 del núcleo central de la hepatitis B

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (3)..(44)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

tt aat ttg gaa gat cca gcg tct aaa aga gac cta gta gtc agt t

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Lys Arg Asp Leu Val Val Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 76

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Lys Arg Asp Leu Val Val Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: K insertada en la posición del aminoácido 83 del núcleo central de la hepatitis B

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (3)..(50)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

tt aat ttg gaa gat cca gcg tct aga aaa gac cta gta gtc agt tat

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Lys Asp Leu Val Val Ser Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

gtc

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

Val

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 78

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Lys Asp Leu Val Val Ser Tyr Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: K insertada en la posición del aminoácido 84 del núcleo central de la hepatitis B

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (3)..(50)

\newpage

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

tt aat ttg gaa gat cca gcg tct aga gac aaa cta gta gtc agt tat

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp Lys Leu Val Val Ser Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

gtc

\hfill

50

Val

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 80

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp Lys Leu Val Val Ser Tyr Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: K insertada en la posición del aminoácido 85 del núcleo central de la hepatitis B

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (3)..(31)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 81

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

c tcg aga gac cta aaa gta gtc agt tat gtc

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Arg Asp Leu Lys Val Val Ser Tyr Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 82

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Arg Asp Leu Lys Val Val Ser Tyr Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Plasmodium vivax

\newpage

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 83

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Arg Ala Ala Gly Gln Pro Ala Gly Asp Arg Ala Asp Gly Gln Pro}

\sac{Ala Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Virus de la influenza

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 84

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Asn Asn Pro His Arg Ile Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Virus de la influenza

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 85

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met}

\sac{Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Mycobacterium tuberculosis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 86

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Val Leu Glu Asp Pro Tyr Ile Leu Leu Val Ser Ser Lys Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Mycobacterium tuberculosis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 87

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Leu Val Ser Ser Lys Val Ser Thr Val Lys Asp Leu Leu Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Mycobacterium tuberculosis

\newpage

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 88

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Leu Pro Leu Leu Glu Lys Val Ile Gly Ala Gly Lys Pro Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Mycobacterium tuberculosis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 89

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Ile Leu Thr Gly Gly Gln Val Ile Ser Glu Glu Val Gly Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Mycobacterium tuberculosis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 90

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Ala Phe Asn Ser Gly Leu Glu Pro Gly Val Val Ala Glu Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Mycobacterium tuberculosis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 91

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Arg Arg Gly Leu Glu Arg Gly Leu Asn Ala Leu Ala Asp Ala Val}

\sac{Lys Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Mycobacterium tuberculosis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 92

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Lys Ile Gly Ala Glu Leu Val Lys Glu Val Ala Lys Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Mycobacterium tuberculosis

\newpage

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 93

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Leu Lys Arg Gly Ile Glu Lys Ala Val Glu Lys Val Thr Glu Thr}

\sac{Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Mycobacterium tuberculosis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 94

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Glu Asp Ala Val Arg Asn Ala Lys Ala Ala Val Glu Glu Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Virus de la leucemia felina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 95

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Asp Ile Ile Gly Asn Thr Trp Asn Pro Ser Asp Gln Glu Pro Phe}

\sac{Pro Gly Tyr Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 96

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Virus de la leucemia felina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 96

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Ile Gly Thr Val Pro Lys Thr His Gln Ala Leu Cys Asn Glu Thr}

\sac{Gln Gln Gly His Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 97

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Virus de la leucemia felina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 97

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Asn Tyr Ser Asn Gln Thr Asn Pro Pro Pro Ser Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 98

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Virus de la leucemia felina

\newpage

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 98

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Asp Ile Gln Ala Leu Glu Glu Ser Ile Ser Ala Leu Glu Lys Ser}

\sac{Leu Thr Ser Leu Ser Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 99

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Virus de la leucemia felina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 99

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Lys Leu Arg Glu Arg Leu Lys Gln Arg Gln Gln Leu Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 100

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Virus de la leucemia felina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 100

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Ser Gln Gln Gly Trp Phe Glu Gly Trp Phe Asn Lys Ser Pro Trp}

\sac{Phe Thr Thr Leu Ile Ser Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 101

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Virus de la leucemia felina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 101

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Val Met Thr Ile Thr Pro Pro Gln Ala Met Gly Pro Asn Leu Val}

\sac{Leu Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 102

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Virus de la leucemia felina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 102

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Gln Lys Pro Pro Ser Arg Gln Ser Gln Ile Glu Ser Arg Val Thr}

\sac{Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 103

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Virus de la leucemia felina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 103

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Arg Gly Leu Asp Ile Leu Phe Leu Gln Glu Gly Gly Leu Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 104

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Virus de la leucemia felina

\vskip0.333000\baselineskip

<214> 104

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Glu Gly Gly Leu Cys Ala Ala Leu Glu Glu Cys Gln Ile Gly Gly}

\sac{Leu Cys Ala Ala Leu Lys Glu Glu Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 105

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Fragmento del citocromo P-450

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<300>

\vskip0.333000\baselineskip

<303> Science

\vskip0.333000\baselineskip

<304> 228

\vskip0.333000\baselineskip

<306> 1436-1440

\vskip0.333000\baselineskip

<307> 1985

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 105

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 106

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Fragmento del citocromo P-450

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 106

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Met Gln Leu Arg Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 107

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Fragmento del citocromo P-450

\newpage

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 107

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Arg Phe Ser Ile Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 108

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Fragmento del citocromo P-450

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 108

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Ala Val Pro Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 109

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Fragmento del citocromo P-450

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 109

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Ile Pro Arg Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 110

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Fragmento del citocromo P-450

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 110

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Phe Ile Pro Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 111

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Fragmento del citocromo P-450

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 111

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Thr Val Ser Gly Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 112

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Fragmento del citocromo P-450

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 112

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Thr Leu Ser Gly Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 113

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Plasmodium knowlesi

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 113

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\sa{Gln Ala Gln Gly Asp Gly Ala Asn Ala Gly Gln Pro}

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Claims

1. Un conjugado de una proteína del núcleo central de la hepatitis B modificada que contiene una proteína del núcleo central de la hepatitis B modificada unida de manera colgante a un hapteno, en el que la proteína del núcleo central de la hepatitis B modificada contiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de aminoácidos de la proteína del núcleo central de la hepatitis B de SEC ID Nº: 2, incluyendo los residuos de aminoácidos numerados como 10 a 140 y teniendo adicionalmente un inserto de una secuencia de aminoácidos en la región correspondiente a los residuos de aminoácidos numerados como 50 a 100, teniendo dicho inserto (i) de 1 a 40 residuos de aminoácidos de longitud y (ii) conteniendo dicho inserto un residuo de aminoácido químicamente reactivo, estando dicho hapteno unido de manera colgante al residuo de aminoácido químicamente reactivo en dicha proteína del núcleo central de la hepatitis B modificada.

2. El conjugado de la proteína del núcleo central de la hepatitis B modificada de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el inserto está en la región correspondiente a los residuos de aminoácidos numerados como 70 a 90.

3. El conjugado de la proteína del núcleo central de la hepatitis B modificada de acuerdo con la reivindicación 1 o con la reivindicación 2, en el que el inserto está en la región correspondiente a los residuos de aminoácidos numerados como 78 a 82.

4. El conjugado de la proteína del núcleo central de la hepatitis B modificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el hapteno es un hapteno polipeptídico, un hapteno carbohidratado o un hapteno de naturaleza no peptídica/no sacarídica.

5. El conjugado de la proteína del núcleo central de la hepatitis B modificada de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el hapteno es un hapteno relacionado con un patógeno.

6. El conjugado de la proteína del núcleo central de la hepatitis B modificada de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la proteína del núcleo central de la hepatitis B modificada contiene además una secuencia de residuos de aminoácidos estimuladora de células T unida operativamente al extremo carboxi de dicha secuencia de aminoácidos de la hepatitis B.

7. El conjugado de la proteína del núcleo central de la hepatitis B modificada de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicha secuencia de residuos de aminoácidos estimuladora de células T está relacionada con el mismo patógeno que el hapteno relacionado con un patógeno unido de manera colgante.

8. Un conjugado de partículas de proteínas del núcleo central de la hepatitis B modificadas que comprende subunidades de proteínas del núcleo central de la hepatitis B ensambladas, en el que una pluralidad de las subunidades son conjugados de proteínas del núcleo central de la hepatitis B modificadas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. El conjugado de partículas de proteínas del núcleo central de la hepatitis B modificadas de acuerdo con la reivindicación 8, en el que de 0,1 a 0,5 de las subunidades están ligadas de manera colgante a un hapteno.

10. El conjugado de partículas de proteínas del núcleo central de la hepatitis B modificadas de acuerdo con la reivindicación 8, que tiene una pluralidad de subunidades de conjugados de proteínas del núcleo central de la hepatitis B modificadas que están ligadas de manera colgante a diferentes haptenos.

11. Un inóculo que comprende una cantidad inmunogénica de un conjugado de una proteína del núcleo central de la hepatitis B modificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o de un conjugado de partículas de proteínas del núcleo central de la hepatitis B modificadas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, disuelta o dispersada en un diluyente farmacéuticamente aceptable.

12. Un conjugado de una proteína del núcleo central de la hepatitis B modificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o un conjugado de partículas de proteínas del núcleo central de la hepatitis B modificadas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, para ser utilizado en terapia.

13. Utilización de un conjugado de una proteína del núcleo central de la hepatitis B modificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o de un conjugado de partículas de proteínas del núcleo central de la hepatitis B modificadas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en la fabricación de un medicamento para ser administrado a un animal huésped con el fin de inducir anticuerpos en dicho animal huésped.