LV15033B - Paņēmiens izvēlēta materiāla piešūšanai HBV core proteīna veidotajām nanodaļiņām - Google Patents

Description

Izgudrojums attiecas uz molekulāro bioloģiju, gēnu un proteīnu inženieriju, biotehnoloģiju, imunoloģiju, nanotehnoloģiju un biomedicīnu, konkrēti uz paņēmieniem tādu modificētu hepatīta B vīrusa core nanokonteineru iegūšanai, kas ļauj mērķtiecīgi novietot izvēlētos peptīdus un/vai oligonukleotīdus uz šādu nanokonteineru virsmas, neiespaidojot to attīrīšanas kvalitāti un iepakošanas spējas. Izgudrojums ir izmantojams vakcīnu, gēnu un zāļu terapijas un diagnostikas preparātu izveidošanai.

Tehnikas līmenis

Hepatīta B vīrusa (HBV) core (HBc) proteīna veidotās vīrusiem līdzīgās daļiņas (VLD) pieder pie veiksmīgākajiem un visvairāk pētītiem adresēto nanokonteineru modeļiem, kas tiek iegūti heterologās ekspresijas veidā (dažādu baktēriju, raugu, kukaiņu un augu šūnās) un spēj nodrošināt bioloģiskā materiāla ekspozīcijas un piegādes funkciju (1).

HBV gēns C kodē HBc monomēra proteīnu p21, kas inficētajos cilvēka hepatocītos pašasociējas ikosaedriskajos HBV nukleokapsīdos jeb HBc daļiņās, un iepako HBV DNS genomu un HBV polimerāzi (2), kā arī, iespējams, proteīnkināzi (3). Pašasociācijas process tiek ievadīts ar spontānu p21 proteīna dimēru izveidošanu (4), kas tālāk veido divus ikosaedru izomorfus ar 35 un 32 nm diametru (3,5). HBc daļiņu augstas izšķirtspējas telpiskā struktūra tika noteikta, pateicoties HBc proteīna spējai pašasociēties pēc HBV gēna C ekspresijas E.coli šūnās (6-9). Šādas rekombinantas HBc daļiņas satur divus

-2ikosaedriskus izomorfus ar triangulācijas skaitļiem T=4 un T=3 (10), kas sastāv attiecīgi no 240 un 180 HBc monomēriem (10,11). HBc daļiņu T=4 izomorfa telpiskā struktūra tika atšifrēta ar elektronu kriomikroskopiju (10,12,13) un rentgenstaru kristalogrāfiju [14], bet T=3 izomorfa struktūra tika rekonstruēta aprēķinu ceļā (11). Pierādīts, ka rekombinantās HBc daļiņas neatšķiras no HBc daļiņām no inficēto pacientu hepatocītiem, tajā skaitā pēc T=4 un T=3 izomorfu daudzuma attiecības (15). Tajā pašā laikā ir atrastas atšķirības RNSvai natīvo DNS- saturošo HBc daļiņu virsmas struktūrā (16). Pierādīts, ka natīvajos HBV virionos ir pārstāvēti tikai HBc daļiņu T=4 izomorfi (15,16).

Bez E.coli šūnām, HBc proteīns spēj efektīvi sintezēties un pašasociēties par HBc VLD tādās jaudīgās heterologās ekspresijas sistēmās kā baktērijās B.subtilis (17) un S.typhimurium (18), raugos S.cerevisiae (19,20) un P.pastoris (21,22), kukaiņu šūnās (2325) un augos (26-28).

HBc proteīna garums ir 183 aminoskābes (retāk, 185) un tas ir uzbūvēts no diviem neatkarīgiem domēniem: N-terminālā pašasociācijas (self-assembly, SA) domēna 1-140 un protamīnam līdzīga, ar arginīniem bagāta C-terminālā domēna (CTD) 150-183 (29). Abi domēni ir nodalīti ar „eņģes” peptīdu 141-149 (30), kas veic morfogēno funkciju un regulē nukleīnskābes iepakošanu (30,31). HBc proteīna SA domēns satur vairākus variablus un konservatīvus rajonus, kas sastāda attiecīgi imunoloģiskos B-šūnu epitopus un strukturālos elementus, kamēr CTD domēns un „eņģes” peptīds pieder pie visaugstāk konservētiem HBc rajoniem (32-34).

SA domēns 1-140 ir nepieciešamas un pietiekams HBc proteīna pašasociācijai - CTD domēna nošķelšana neatceļ HBc pašasociāciju (35-37) un neiespaido HBc proteīna spēju veidot T=4 izomorfus, bet turpmāka „eņģes” peptīda 141-149 saīsināšana noved pie T=3 izomorfu skaitliskās dominances pār T=4 izomorfiem (38,39). SA domēna pašasociācijas

-3spēja, reizē ar augsto kapacitāti svešu sekvenču akceptēšanā, tiek plaši izmantota himēro VLD izveidošanai uz HBc pamata (1,40,41), turklāt kā uz pilna gamma, tā ari uz Ctermināli īsināto HBc proteīna veidiem (42,43).

Galvenā CTD domēna funkcija ir pregenomiskās, 3,5 kb garās HBV mRNS iepakošana ar tālāku tās pārvēršanu par daļēji divpavedienu HBV DNS (44). Šim procesam ir nepieciešami sekojoši ar HBc daļiņām saistītie soļi: HBc piesaistīšanās pie kodola (45), disociācija un re-asociācija (46) un fosforilēšana un defosforilēšana (47-51), kam seko HBc daļiņu nobriešana, apvalkošana un izkļūšana no šūnas (2,52). CTD domēna nukleīnskābes saistošie saiti ir lokalizēti četros arginīna blokos (53). Būdams kustīgs bez izteiktas stingras otrējās struktūras, CTD domēns var parādīties kā HBc daļiņu iekšienē (54), tā arī uz to ārējās virsmas (55,56). Pēc jaunākiem datiem, būtiska CTD daļa ir eksponēta uz nenogatavojošos RNS-saturošo HBc daļiņu virsmas, kamēr nobriedušās DNS-saturošās daļiņās CTD ir noslēpts daļiņu iekšienē (57).

HBc, kā nanotehnoloģijās objekta, nanokonteineru funkcija tiek realizēta ar svešā bioloģiskā materiāla iepakošanu rekombinantajās HBc daļiņās in vivo (58) un in vitro (59). Līdzīgi natīvajām HBc daļiņām, kas selektīvi pako pregenomisko HBV mRNS (44), rekombinantās HBc VLD dod priekšroku vienpavediena RNS pakošanai, turklāt CTD rajona eliminēšana bloķē RNS pakošanu E.coli (35,36,60) un kukaiņu (37) šūnās. Tomēr HBc VLD piemīt zināma afinitāte arī pret DNS pakošanu (61), kaut arī zemāka par RNS pakošanas efektivitāti (62). In vitro, HBc VLD pako imunostimulējošās sekvences (ISS) CpG (63-66) vai citus īsus oligonukleotīdus (67), vienpavediena RNS, neatkarīgi no HBc VLD fosforilēšanas līmeņa (68,69), un mazākā mērā vienpavediena DNS un vēl mazāk divpavediena DNS (68), citus polianjonus (poliglutamātu un poliakrilskābi) un polikatjonus (polilizīnu un polietilēnimīnu) (68), kā arī magnētiskās nanodaļiņas (70).

-4HBc, kā nanotehnoloģijas objekta, ekspozīcijas un piegādes funkcija tiek realizēta ar svešu sekvenču izvietošanu uz HBc VLD virsmas. Šim mērķim parasti izvēlas visvairāk uz ārpusi izvirzīto HBc izaugumu - α-spirālo „matadatu” - galus, kam atbilst HBc aminoskābju atlikumu pozīcijas 76-81 ar tur novietoto galveno HBc imunodominances rajonu, t.s. MIR (major immunodominant regiori) jeb epitopa el rajonu (1,32,40). Pēc savas eksponēšanas pakāpes, nākošie aiz MIR ir HBc N-gals un aminoskābju atlikumu rajons 127-133 (t.s. epitops e2), tomēr MIR ir absolūtais līderis izveidoto ekspozīcijas un piegādes konstrukciju skaitā. Pastāv divi galvenie svešu sekvenču izvietošanas paņēmieni uz HBc VLD virsmas: ar (a) sapludināto gēnu konstruēšanu, t.i., rekombinanto HBc gēnu izveidošanu ar attiecīgajā HBc gēna vietā iebūvētām svešos proteīnu fragmentus kodējošām sekvencēm un (b) ķīmisku svešā bioloģiskā materiāla piešūšanu pie izveidotām HBc VLD. Kaut arī otrais variants ir daudz universālāks un tehnoloģiskāks par pirmo, tā izmantošana ir aizmetņa līmenī (71).

Izgudrojuma izpaušana

Izgudrojums attiecas uz jauna HBc ekspozīcijas un piegādes modeļa izveidošanu, kas ļautu svešā bioloģiskā materiāla (proteīnu un peptīdu, nukleīnskābju fragmentu) izvietošanu HBc daļiņu optimālajos, uz āru maksimāli izvirzītajos HBc proteīna rajonos, t.s. „matadatu” galos. Šim nolūkam izvēlētas četras pozīcijas uz HBc virsmas, kas ir maksimāli izvirzītas uz HBc-virsmas un kas atbilst aminoskābju atlikumiem Asn75, Glu77, Pro79 un Ile80, un ar gēnu inženierijas tehniku veikta to individuāla nomaiņa pret lizīna atlikumu - ar Četru modificēto HBc variantu iegūšanu. Jauniegūto HBV core proteīna veidoto nanodaļiņu «matadatu” posmu aminoskābju sekvences un to telpiskās struktūras

-5attēlotas atbilstoši 1. un 2. zīmējumā. Ieviestās oriģinālo aminoskābju nomaiņas uz lizīnu (K) izceltas un pasvītrotas. Izrādījās, ka visos četros gadījumos saglabājās augsts proteīna ekspresijas līmenis Escherichia coli biomasā un tā spēja pašsavākties ikosaedriskās struktūrās, morfoloģiski neatšķiramās no oriģinālām HBc daļiņām.

Visi četri modificētie HBc varianti: HBc-K75, HBc-K77, HBc-K79 un HBc-K80 pakļaujas agrāk izstrādātajām attīrīšanas shēmām un tādejādi ļauj izmantot agrāk apgūtos tehnoloģiskos risinājumus par HBc VLD attīrīšanu (72).

Lai varētu VLD izmantot kā nanokonteinerus mērķtiecīgai izvēlētā bioloģiskā materiāla iepildīšanai, ir nepieciešams atbrīvoties no to dabiskā pildījuma, kas izveidojas ekspresijas procesā. Viens no iespējamiem risinājumiem ir daļiņu pilnīga izjaukšana ar tai sekojošu pakošanu un rekonstrukciju no attīrīta proteīna. Iepriekš esam izstrādājuši citu risinājumu, kad HBc VLD dabiskais pildījums tika izšķelts ar sārma hidrolīzi un tika iegūtas tukšās daļiņas, morfoloģiski līdzīgas dabiskajām, un tika izstrādāta efektīva pakošanas metode (59). Izrādījās, ka visas četras jauniegūtās VLD ar uz lizīnu nomainītajām aminoskābēm arī var tikt atbrīvotas no dabiskā iekšējā nukleīnskābju pildījuma ar sārma hidrolīzi. Rezultātā var iegūt tukšas daļiņas, kuras spēj pakot mērķtiecīgi izvēlētu materiālu. Visus četrus modificētos HBc VLD produktus izdalījām no biomasas saskaņā ar agrāk aprakstīto metodi (72). Sagatavošana sārma hidrolīzei notika gēlfiltrējot caur Sephacryl HR S300 kolonu (1,5x60 cm) ar 0,1 M nātrija karbonāta, 2 mM DTT šķīdumu (3ml/h/frakciju). Apvienotā materiāla dialīzē pret 0,1 M nātrija ortofosfata, 0,65M nātrija hlorīda šķīdumu, pH 12 pie 37°C 18h, neitralizēšanas dialīzē pret tādu pašu šķīdumu ar pH 7,8 (pakošanas un refoldinga buferšķīdums), izgulsnēšanās ar amonija sulfātu un, visbeidzot, frakcionēšanas uz Sepharose CL 4B kolonas (2x60 cm) 20mM Tris-HCl, 5mM EDTA, 0,65 M NaCl pH 7,8 buferšķīdumā iegūst tukšas VLD HBc-K75, HBc-K77, HBc-K79,

-6HBc-K80 ar iznākumu līdz 5mg no lg ņemtās biomasas. Tukšās daļiņas tika raksturotas ar UV- adsorbcijas spektriem (attiecība A280/A260) un elektronu mikroskopā (EM). UVadsorbcijas spektri tika uzņemti uz NanoDrop ND-100 iekārtas (3.zTmējums). Ar vertikālajām līnijām iezīmēti mērījumi pie 260nm un 280 nm. Dabisko pildījumu saturošu kapsīdu spektru pārstāv HBc-K79 (A) ar attiecību A260/A280=l,45, bet tukšajām daļiņām HBc-K79 (B) un HBc-K80 (C) ir raksturīgs proteīnu spektrs ar adsorbcijas maksimumu pie 280 nm un attiecību A280/A260 attiecīgi 1,41 (B) un 1,33 (C). 4. zīmējumā parādīti elektonmikroskopijas attēli visiem četriem jaunizveidoto un no iekšējā satura atbrīvoto kapsīdu veidiem. Tātad, pakošanai un ārējai ķīmiskai „dekorēšanai”-piešūšanai sagatavotie materiāli saglabā savu nanodaļiņu struktūru.

Nukleīnskābes vai oligodezoksinukleotīdus (ODN) iepakojām jauniegūtajās tukšajās daļiņās saskaņā ar iepriekš izstrādāto paņēmienu (59). Pakošanas un ķīmiskās piešūšanas procesus raksturojām ar UV-spektriem, EM un elektroforēzi natīvajos agarozes gēlos (TAE, pH 8,3) ar etīdija bromīdu. Ķīmisko piešūšanu pie modifikācijā iegūtā lizīna -NEb grupas parādījām piešujot aptamēru sgc8 (73) 5’-Fam-ATC TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AAT ACT GTA CGG TTA GAT TTT TTT TTT-Thiol(C3)-3’, izmantojot Sulfo-KMUS reaģentu un tam atbilstošu protokolu (Pierce). Elektroforēze natīvajā 0,7% agarozes gēlā (5. zīmējums) ilustrē izmaiņas, kuras radās daļiņu pakošanas vai „dekorēšanas” dēļ. Tukšās daļiņas eksperimenta apstākļos elektriskā laukā praktiski neizkustētos no parauga uznešanas kabatas un nebūtu redzamas, jo nesatur nukleīnskābi. Divdesmit nukleobāzes gara oligodezoksinukleotīda 5’Fluo-TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT-3’ iepakošana rezultējās ar pakoto daļiņu HBc-K75 x ODN mazāku kustīgumu (5. zīmējums - 3) salīdzinot ar dabiski pildītajām daļiņām HBc-K75 VLD (5. zīmējums 1), bet papildus oligodezoksinukleotīda piešūšana pie daļiņām caur lizīna aminogrupām

-7noveda pie ātrāk migrējošu daļiņu HBc-K75 x sgc-8 izveidošanās (5. zīmējums - 2). Jāatzīmē, ka elektroforēze natīvajos agarozes gēlos vislabāk raksturo daļiņu kopējo lādiņu, un var novērot, ka jaunizveidotās lizīnus nesošas daļiņas kustās elektriskajā laukā lēnāk par oriģinālajām, jo lizīnu brīvās NH2 grupas pie pH 8,3 samazina daļiņu kustīgumu pret anodu (izoelektriskais punkts šīm aminoskābēm pl=9,74). Nukleīnskābju klātbūtne kā daļiņu iekšējais pildījums, vai kā mūsu gadījumā - piešūtais materiāls, spēcīgi palielina daļiņu kopējo negatīvo lādiņu un kustīgumu.

Literatūrā ir parādīts, ka šis aptamērs specifiski saistās pie T šūnām (73). Tas apstiprinājās arī mūsu pētījumā ar Jurkat šūnām, kad izmantojot plūsmas citometru (6. zīmējums) un fluorescento mikroskopu (7. zīmējums), novērojām efektīvu ķīmiskās piešūšanas produkta HBc-K75 x sgc8 mijiedarbību ar Jurkat (T limfocītu) šūnām lh pie +37°C (6. zīmējums 3 un 7A zīmējums), atšķirībā no atbilstošām kontrolēm - ar FITC iezīmētām daļiņām HBcK75-FITC (6. zīmējums - 2 un 7B zīmējums) un pašām Jurkat šūnām barotnē (6. zīmējums -1).

Tādejādi pierādījās, ka visi četri modificētie HBc varianti var tikt izmantoti kā nanokonteineri ar tādu pašu efektivitāti kā natīvās HBc VLD. Modificētie HBc varianti pakļaujas agrāk izstrādātajām pakošanas shēmām, un ļauj izmantot agrāk izstrādātos tehnoloģiskos risinājumus par HBc VLD pakošanu ar nukleīnskābju un proteīnu materiālu (59), kā arī ar magnētiskajām nanodaļiņām (70).

Realizējot ķīmiskas piešūšanas shēmas pie lizīna atlikumiem, visi četri modificētie HBc varianti uzrāda efektīvu bioloģiskā materiāla pievienošanu. Pateicoties optimāli izvēlētām modifikācijas (lizīna apmaiņu) vietām, piešūtais materiāls tiek eksponēts uz modificēto HBc daļiņu virsmas.

-8Atkarībā no piešūtā bioloģiskā materiāla, piemēram, peptīdu vai oligonukleotīdu, īpašībām un nanokonteineru pildījuma, šādi modificētie HBc nanokonteineri var tikt izmantoti kā vakcīnu prototipi vai kā gēnu un zāļu terapijas līdzekļi, kas ir adresēti uz noteiktām šūnām vai orgāniem un turpmāk izmantoti profilaktiskiem, diagnostiskiem vai terapeitiskiem mērķiem.

-9Citetas literatūras saraksts

1. Pushko P, Pumpens P, Grens E. Development of Virus-Like Particle Technology from Small Highly Symmetric to Large Complex Virus-Like Particle Structures. Intervirology. 2013;56(3): 141-165.

2. Kann, M. and Gerlich, W.H., Replication of hepatitis B virus, in Molecular Medicine of Virai Hepatitis,Harrison, T. J. and Zuckerman, A. J., Eds., John Wiley & Sons, New York, 1997, pp. 63—87.

3. Gerlich WH, Goldmann U, Miiller R, Stibbe W, Wolff W. Specificity and localization of the hepatitis B virus-associated protein kinase. J Virol. 1982 Jun;42(3):761-766.

4. Zhou S, Standring DN. Hepatitis B virus capsid pārticies are assembled from core-protein dimer precursors. Proc Nati Acad Sci USA. 1992 Nov 1 ;89(21): 10046-10050.

5. Cohen BJ, Richmond JE. Electron microscopy of hepatitis B core antigen synthesized in E. coli. Nature. 1982 Apr l5;296(5858):677-679.

6. Pasek M, Goto T, Gilbert W, Zink B, Schaller H, MacKay P, Leadbetter G, Murray K. Hepatitis B virus genes and their expression in E. coli. Nature. 1979 Dec 6;282(5739):575 -579.

7. Edman JC, Hallevvell RA, Valenzuela P, Goodman HM, Rutter WJ. Synthesis of hepatitis B surface and core antigens inE. coli. Nature. 1981 Jun 11;291(5815):503-506.

8. Borisova GP, Pumpen PP, Bychko W, Pushko PM, Kalis IaV, Dishler AV, Gren EJ, Tsibinogin W, Kukaine RA: Structure and expression in Escherichia coli celis of the core antigen gene of the human hepatitis B virus (HBV). (Article in Russian) Doki Akad Nauk SSSR 1984;279:1245-1249.

9. Nassal M. Total Chemical synthesis of a gene for hepatitis B virus core protein and its functional characterization. Gene. 1988 Jun 30;66(2):279-294.

10. Crowther RA, Kiselev NA, Bottcher B, Berriman JA, Borisova GP, Ose V, Pumpens P. Threedimensional structure of hepatitis B virus core pārticies determined by electron cryomicroscopy. Celi. 1994 Jun 17;77(6):943-950.

11. Roseman AM, Borschukova O, Berriman JA, Wynne SA, Pumpens P, Crowther RA. Structures of Hepatitis B Virus Cores Presenting a Modei Epitope and Their Complexes with Antibodies. J Mol Biol. 2012 Oct 12;423(l):63-78. doi: 10.1016/j.jmb.2012.06.032. Epub 2012 Jun 28.

12. Bottcher B, Wynne SA, Crowther RA. Determination of the fold of the core protein of hepatitis B virus by electron cryomicroscopy. Nature. 1997 Mar 6;386(6620):88-91.

13. Conway JF, Cheng N, Zlotnick A, Wingfield PT, Stahl SJ, Steven AC. Visualization of a 4-helix bundle inthe hepatitis B virus capsid by cryo-electron microscopy. Nature. 1997 Mar 6;3 86(6620):9194.

14. Wynne SA, Crowther RA, Leslie AG. The crystal structure of the human hepatitis B virus capsid. Mol Celi. 1999 Jun;3(6):771-780.

15. Kenney JM, von Bonsdorff CH, Nassal M, Fuller SD. Evolutionary conservation in the hepatitis B virus core structure: comparison of human and duck cores. Structure. 1995 Oct 15;3(10): 1009-1019.

16. Roseman AM, Berriman JA, Wynne SA, Butler PJ, Crowther RA. A structural modei for maturation ofthe hepatitis B virus core. Proc Nati Acad Sci USA. 2005 Nov l;102(44):15821-15826. Epub 2005 Oct 24.

17. Hardy K, Stahl S, Kiipper H. Production in B. subtilis of hepatitis B core antigen and a major antigen of foot and mouth disease virus. Nature. 1981 Oct 8;293(5832):481-483.

18. Schodel F, Milich DR, Will H. Hepatitis B virus nucleocapsid/pre-S2 fusion proteīns expressed in attenuated Salmonella for oral vaccination. J Immunol. 1990 Dec 15; 145(12):4317-4321.

19. Kniskem PJ, Hagopian A, Montgomery DL, Burke P, Dunn NR, Hofinann KJ, Miller WJ, Ellis RW. Unusually high-level expression of a foreign gene (hepatitis B virus core antigen) in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 1986;46(1):135-141.

20. Miyanohara A, Imamura T, Araki M, Sugavvara K, Ohtomo N, Matsubara K. Expression of hepatitis B virus core antigen gene in Saccharomyces cerevisiae: synthesis of two polypeptides translated from different initiation codons. J Virol. 1986 Jul;59(l): 176-180.

21. Rolland D, Gauthier M, Dugua JM, Foumier C, Delpech L, Watelet B, Letoumeur O, Amaud M, Jolivet M. Purification of recombinant HBc antigen expressed in Escherichia coli and Pichia pastoris: comparison of size-exclusion chromatography and ultracentrifugation. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 2001 Mar 25;753(l):51-65.

-1022. Freivalds J, Dislers A, Ose V, Pumpens P, Tars K, Kazaks A. Highly efficient production of phosphorylated hepatitis B core pārticies in yeast Piciņa pastoris. Protein Expr Purif. 2011 Feb;75(2):218-224.

23. Takehara K, Ireland D, Bishop DH. Co-expression of the hepatitis B surface and core antigens using baculovirus multiple expression vectors. J Gen Virol. 1988 Nov;69 (Pt 11):2763-77.

24. Lanford RE, Notvall L. Expression of hepatitis B virus core and precore antigens in insect celis and characterization of a core-associated kinase activity. Virology. 1990 May;176(l):222-233.

25. Hilditch CM, Rogers LJ, Bishop DH. Physicochemical analysis of the hepatitis B virus core antigen produced by a baculovirus expression vector. J Gen Virol. 1990 Nov;71 ( Pt 11):2755-2759.

26. Tsuda S, Yoshioka K, Tanaka T, Iwata A, Yoshikawa A, Watanabe Y, Okada Y. Application of the human hepatitis B virus core antigen from transgenic tobacco plants for serological diagnosis. Vox Sang. 1998;74(3):148-155.

27. Mechtcheriakova IA, Eldarov MA, Nicholson L, Shanks M, Skryabin KG, Lomonossoff GP. The use of virai vectors to producē hepatitis B virus core pārticies in plants. J Virol Methods. 2006

Jan;131(l):10-15.

28. Huang Z, Santi L, LePore K, Kilboume J, Amtzen CJ, Mason HS. Rapid, high-level production of hepatitis B core antigen in plant leaf and its immunogenicity in mice. Vaccine 2006 Mar 24;24(14):2506-2513.

29. Bimbaum F, Nassal M. Hepatitis B virus nucleocapsid assembly: primary structure requirements in the core protein. J Virol. 1990 Jul;64(7):3319-30.

30. Seifer M, Standring DN. A protease-sensitive hinge linking the two domains of the hepatitis B virus core protein is exposed on the virai capsid surface. J Virol. 1994 Sep;68(9):5548-5555.

31. Watts NR, Conway JF, Cheng N, Stahl SJ, Belnap DM, Steven AC, Wingfield PT. The morphogenic linker peptide of HB V capsid protein forms a mobile array on the interior surface. EMBO J. 2002 Mar l;21(5):876-884.

32. Pumpens P, Grens E. HBV core pārticies as a carrier for B cell/T celi epitopes. Intervirology. 2001;44(2-3):98-114.

33. Pumpens P, Grens E, Nassal M. Molecular epidemiology and immunology of hepatitis B virus infection - an update. Intervirology. 2002;45(4-6):218-232.

34. Chain BM, Myers R. Variability and conservation in hepatitis B virus core protein. BMC Microbiol. 2005 May 27;5:33.

35. Borisova GP, Kalis IaV, Pushko PM, Tsibinogin VV, Loseva Via, Ose VP, Stankevich EI, Dreimane Ala, Sniker DIa, Grinstein EE, Pumpen PP, Gren EJ. Genetically engineered mutants of the core antigen of the human hepatitis B virus preserving the ability for native self-assembly. Doki Akad Nauk SSSR. (Article in Russian) 1988;298(6): 1474-1478.

36. Gallina A, Bonelli F, Zentilin L, Rindi G, Muttini M, Milanesi G. A recombinant hepatitis B core antigen polypeptide with the protamine-like domain deleted self-assembles into capsid pārticies but fails to bind nucleic acids. J Virol. 1989 Nov;63(l 1):4645-4652.

37. Beames B, Lanford RE. Carboxy-terminal truncations of the HBV core protein affect capsid formation and the apparent size of encapsidated HBV RNA. Virology. 1993 Jun;194(2) :597-607.

38. Wingfield PT, Stahl SJ, Williams RW, Steven AC. Hepatitis core antigen produced in Escherichia coli: subunit composition, conformational analysis, and in vitro capsid assembly. Biochemistry. 1995 Apr 18;34(15):4919-4932.

39. Zlotnick A, Cheng N, Conway JF, Booy FP, Steven AC, Stahl SJ, Wingfield PT. Dimorphism of hepatitis B virus capsids is strongly influenced by the C-terminus of the capsid protein. Biochemistry. 1996 Jun 11;35(23):7412-7421.

40. Pumpens P, Ulrich R, Sasnauskas K, Kazaks A, Ose V, Grens E: Construction of novel vaccines on the basis of the virus-like pārticies: Hepatitis B virus proteīns as vaccine carriers; in Khudyakov Y (ed.): Medicīnai Protein Engineering. Boca Raton, London, New York, CRC Press, Taylor & Francis Group, 2008, pp 205-248.

41. Whitacre DC, Lee BO, Milich DR. Use of hepadnavirus core proteīns as vaccine platforms. Expert Rev Vaccines. 2009 Nov;8(l 1):1565-1573.

42. Skrastina D, Bulavaite A, Sominskaya I, Kovalevska L, Ose V, Priede D, Pumpens P, Sasnauskas K. High immunogenicity of a hydrophilic component of the hepatitis B virus preSl sequence exposed on the surface of three virus-like particle carriers. Vaccine. 2008 Apr 7;26(16):1972-1981. Epub 2008 Feb 26.

43. Sominskaya I, Skrastina D, Dislers A, Vasiljev D, Mihailova M, Ose V, Dreilina D, Pumpens P. Construction and immunological evaluation of multivalent hepatitis B virus (HBV) core virus-like

-11particles carrying HBV and HCV epitopes. Clin Vaccine Immunol. 2010 Jun;17(6):1027-1033. Epub 2010 Apr 21.

44. Nassal M. The arginine-rich domain of the hepatitis B virus core protein is required for pregenome encapsidation and productive virai positive-strand DNA synthesis but not for virus assembly. J Virol. 1992 Jul;66(7):4107-4116.

45. Kann M, Sodeik B, Vlachou A, Gerlich WH, Helenius A. Phosphorylation-dependent binding of hepatitis B virus core pārticies to the nuclear pore complex. J Celi Biol. 1999 Apr 5; 145(1):45-55.

46. Rabe B, Delaleau M, Bischof A, Foss M, Sominskaya I, Pumpens P, Cazenave C, Castroviejo M, Kann M. Nuclear entry of hepatitis B virus capsids involves disintegration to protein dimers followed by nuclear reassociation to capsids. PLoS Pathog. 2009 Aug;5(8):el000563. Epub 2009 Aug 28.

47. Machida A, Ohnuma H, Tsuda F, Yoshikawa A, Hoshi Y, Tanaka T, Kishimoto S, Akahane Y, Miyakawa Y, Mayumi M. Phosphorylation in the carboxyl-terminal domain of the capsid protein of hepatitis B virus: evaluation with a monoclonal antibody. J Virol. 1991 Nov;65(l 1):6024-6030.

48. Lan YT, Li J, Liao W, Ou J. Roles of the three major phosphorylation sites of hepatitis B virus core protein in virai replication. Virology. 1999 Jul 5;259(2):342-348

49. Le Pogām S, Chua PK, Newman M, Shih C. Exposure of RNA templates and encapsidation of spliced virai RNA are influenced by the arginine-rich domain of human hepatitis B virus core antigen (HBcAg 165-173). J Virol. 2005 Feb;79(3):1871-1887.

50. Perlman DH, Berg EA, O'connor PB, Costello CE, Hu J. Reverse transcription-associated dephosphorylation of hepadnavirus nucleocapsids. Proc Nati Acad Sci USA. 2005 Jun 21; 102(25):9020-9025. Epub 2005 Jun 10.

51. Lewellyn EB, Loeb DD. Serine phosphoacceptor sites within the core protein of hepatitis B virus contribute to genome replication pleiotropically. PLoS One. 2011 Feb 15;6(2):el7202.

52. Moses SE, Lim Z, Zuckerman MA. Hepatitis B virus infection: pathogenesis, reactivation and management in hematopoietic stem celi transplant recipients. Expert Rev Anti Infect Ther. 2011 Oct;9(10):891-899.

53. Hatton T, Zhou S, Standring DN. RNA- and DNA-binding activities in hepatitis B virus capsid protein: a modei for their roles in virai replication. J Virol. 1992 Sep;66(9):5232-41.

54. Machida A, Ohnuma H, Takai E, Tsuda F, Tanaka T, Naito M, Munekata E, Miyakawa Y, Mayumi M. Antigenic sites on the arginine-rich carboxyl-terminal domain of the capsid protein of hepatitis B virus distinct from hepatitis B core or e antigen. Mol Immunol. 1989 Apr;26(4):413-21.

55. Bundule MA, Bychko VV, Saulitis IuB, Liepinsh EE, Borisova GP, Petrovski IA, Tsibinogin W, Pumpen PP, Gren Eīa. C-terminal polyarginine tract of hepatitis B core antigen is located on the outer capsid surface. (Article in Russian) Doki Akad Nauk SSSR. 1990;312(4):993 -6.

56. Vanlandschoot P, Van Houtte F, Serruys B, Leroux-Roels G. The arginine-rich carboxy-terminal domain of the hepatitis B virus core protein mediates attachment of nucleocapsids to cell-surfaceexpressed heparan sulfate. J Gen Virol. 2005 Jan;86(Pt 1):75-84.

57. Meng D, Hjelm RP, Hu J, Wu J. A theoretical modei for the dynamic structure of hepatitis B nucleocapsid. Biophys J. 2011 Nov 16; 101(10):2476-2484. Epub 2011 Nov 15.

58. Strods, A., Argule, D., Cielens, I., Jackeviča, L. and Renhofa, R. (2012) Expression of GA coat protein-derived mosaic virus-like pārticies in Saccharomyces cerevisiae and packaging in vivo of mRNAs into pārticies. Proc. Latv. Acad. Sci., Section B 66,234—241.

59. Renhofa R, Ozols J, Ose-Klinklāva V, Pumpens P. Paņēmiens izvēlētā bioloģiskā materiāla iepakošanai hepatīta B vīrusa core pilna garumaproteīna kapsīdās. Latvijas patents, LV 14084 B, publicēts 20.04.2010.

60. Sominskaya I, Skrastina D, Petrovskis I, Dishlers A, Berza I, Mihailova M, Jansons J, Akopjana I, Stahovska I, Dreilina D, Ose V, Pumpens P. A VLP library of C-terminally truncated hepatitis B core proteīns: correlation of RNA encapsidation with a Thl/Th2 switch in the immune responses of mice. PLoS One, 2013 Sep 23;8(9):e75938. doi: 10.1371/joumal.pone.0075938.

61. Hatton T, Zhou S, Standring DN. RNA- and DNA-binding activities in hepatitis B virus capsid protein: a modei for their roles in virai replication. J Virol. 1992 Sep;66(9):5232-41.

62. Dhason MS, Wang JC, Hagan MF, Zlotnick A. Differential assembly of Hepatitis B Virus core protein on single- and double-stranded nucleic acid suggest the dsDNA-filled core is spring-loaded. Virology. 2012 Aug 15;430(l ):20-9. Epub 2012 May 16.

63. Stomi T, Ruedl C, Schwarz K, Schwendener RA, Renner WA, Bachmann MF. Nonmethylated CG motife packaged into virus-like pārticies inducē protective cytotoxic T celi responses in the absence of systemic side effects. J Immunol. 2004 Feb 1; 172(3): 1777-85.

-1264. Song S, Wang Y, Zhang Y, Wang F, He Y, Ren D, Guo Y, Sun S. Augmented induction of CD8+ cytotoxic T-cell response and antitumor effect by DCs pulsed with virus-like pārticies packaging with CpG. Cancer Lett. 2007 Oct 18;256(l):90-l00. Epub 2007 Jul 25.

65. Kazaks A, Balmaks R, Voronkova T, Ose V, Pumpens P. Melanoma vaccine candidates from chimeric hepatitis B core virus-like pārticies carrying a tumor-associated MAGE-3 epitope. Biotechnol J. 2008 Nov;3(l 1):1429-36.

66. Song S, Zhang K, You H, Wang J, Wang Z, Yan C, Liu F. Significant anti-tumour activity of adoptively transferred T celis elicited by intratumoral dendritic celi vaccine injection through enhancing the ratio of CD8(+) T cell/regulatory T celis in tumour. Clin Exp Immunol. 2010 Oct; 162(1):75-83. doi: 10.111 l/j,1365-2249.2010.04226.x.

67. Cooper A, Shaul Y. Recombinant virai capsids as an efficient vehicle of oligonucleotide delivery into celis. Biochem Biophys Res Commun. 2005 Feb 25;327(4):1094-9.

68. Newman M, Chua PK, Tang FM, Su PY, Shih C. Testing an electrostatic interaction hypothesis of hepatitis B virus capsid stability by using an in vitro capsid disassembly/reassembly system. J Virol.

2009 Oct;83(20):10616-26. Epub 2009 Aug 5.

69. Porterfield JZ, Dhason MS, Loeb DD, Nassal M, Stray SJ, Zlotnick A. Full-length hepatitis B virus core protein packages virai and heterologous RNA with similarly high Ievels of cooperativity. J Virol.

2010 Jul;84(14):7174-84. Epub 2010 Apr 28.

70. Renhofa R, Dišlers A, Ose-Klinklāva V, Ozols J, Pumpēns P. Magnētisko nanodaļiņu iepakošana HBV core proteīna veidotajās kapsīdās. Latvijas patents, LV 14304 B, publicēts 20.05.2011.

71. Jegerlehner A, Tissot A, Lechner F, Sebbel P, Erdmann I, Kundig T, Bāchi T, Stomi T, Jennings G, Pumpens P, Renner WA, Bachmaim MF. A molecular assembly system that renders antigens of choice highly repetitive for induction of protective B celi responses. Vaccine. 2002 Aug 19;20(25-26):31043112.

72. Renhofa R, Ozols J, Ose-Klinklāva V, Pumpēns P.Hepatīta B vīrusa core pilna garuma proteīna kapsīdu iegūšanas paņēmiens. Latvijas patents, LV 13958 B, publicēts 20.12.2009.

73. Shangguan D., Li Y., Tang Z., Cao Z.Ch., Chen H.W., Mallikaratchy P., Sefan K., Yang Ch.J., Tan W. Aptamers evolved from live celis as effective molecular probes for cancer study. Proc.Natl,Acad.Sci.USA, 2006 Aug 8;103(32):l 1838-11843.

Claims (5)

1. Pretenzijas

   1. Paņēmiens izvēlētā bioloģiskā materiāla izvietošanai uz modificētu hepatīta B core nanokonteineru virsmas, kas izveidoti ar hepatīta B vīrusa pilna garuma (183 aminoskābju atlikumi) core proteīnu, ar ķīmiskās piešūšanas tehnoloģiju, kas atšķiras ar to, ka modifikācija veikta šādā veidā:

   a. asparagīna atlikums 75 (Asn75) aizvietots ar lizīna atlikumu,

   b. glutamīnskābes atlikums 77 (Glu77) aizvietots ar lizīna atlikumu,

   c. prolīna atlikums 79 (Pro79) aizvietots ar lizīna atlikumu,

   d. izoleicīna atlikums 80 (Ile80) aizvietots ar lizīna atlikumu.
2. 2. Paņēmiens saskaņā ar 1. pretenziju, kas atšķiras ar to, ka modificētos HBc proteīnus ekspresējot E.coli šūnās tiek iegūtas HBc vīrusiem līdzīgās daļiņas.
3. 3. Paņēmiens saskaņā ar 1. un 2. pretenziju, kas atšķiras ar to, ka pēc to iekšējā pildījuma izšķelšanas ar sārma šķīdumu tiek saglabāta modificēto HBc vīrusiem līdzīgo daļiņu struktūra.
4. 4. Paņēmiens saskaņā ar jebkuru no 1. līdz 3. pretenzijai, kas atšķiras ar to, ka tukšās modificētās HBc vīrusiem līdzīgās daļiņās var iepakot bioloģisko materiālu - ribonukleīnskābes, oligodezoksinukleotīdus vai dezoksinuklemskābes.
5. 5. Paņēmiens saskaņā ar jebkuru no 1. līdz 4. pretenzijai, kas atšķiras ar to, ka bioloģiskais materiāls tiek ķīmiski piešūts uz modificēto HBc daļiņu virsmas pa lizīna atlikumiem.