CN100360556C - 乙型肝炎核心抗原的融合蛋白 - Google Patents
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Abstract
乙型肝炎病毒(HBV)的壳体由单一种类的、自动装配成颗粒的、称为核心抗原(HBcAg)的蛋白构成。该颗粒是高免疫原性的，且如果将该表位插入到所述颗粒的称为“e1环”的表面暴露区域，则能够将异源表位呈递给免疫系统。所述颗粒的结构构件是紧紧相联的HBcAg二聚体，在所述二聚体中，邻近的e1环是紧密并列的。因此提出：如果以单体核心蛋白的形式存在，则插入到e1环中的序列在构象上被限制在装配出的颗粒中。本发明试图通过共价连接核心蛋白为串联重复的形式，例如共价连接为二聚体形式，以便在每个拷贝中能独立地进行插入，从而来解决这个问题。对于将大序列插入到e1环中，这是特别有用的；因为它允许将这样的序列插入到每个串联重复之核心蛋白的仅一个重复中，从而在装配中减少潜在的构象冲突。另一方面，可以将不同的序列插入到串联重复的每个e1环中，如此增加HBcAg颗粒作为表位递送系统的的灵活性。
Description
本发明涉及乙型肝炎核心抗原的融合蛋白、含有所述蛋白的颗粒、编码所述蛋白的核酸分子、生产所述蛋白的方法、包含所述蛋白的药用组合物以及所述蛋白在预防和治疗接种中的运用。
发明背景
在发达国家和发展中国家，乙型肝炎都是健康保护的一个主要问题。乙型肝炎病毒(HBV)的感染能引起急性或慢性疾病，可能在一部分病例中导致肝细胞癌和死亡。该病毒是双层壳的，且其DNA被保护在一种称为核心抗原(HBcAg)的蛋白结构里。该核心被称为表面抗原或S抗原(HBsAg)的包膜蛋白包围。HBcAg是一种能被用作传递载体的不寻常抗原，所述传递载体将特定肽输送到免疫系统。已将该抗原用来呈递来自各种各样病毒和细菌病原体的表位给T辅助细胞、B淋巴细胞及细胞毒性淋巴细胞(CTL)；所述表位包括来自HBV表面抗原的表位、来自甲型肝炎病毒之包膜蛋白的表位以及来自丙型肝炎病毒之抗原的表位。有关综述，参见Ulrich等(1998)Advances in VirusResearch
50 141-182。
由于HBcAg蛋白的分子结构，使得该蛋白自动装配成颗粒，因此HBcAg是一种用于呈递表位的优良载体。每个颗粒或者由180个单体多肽拷贝形成，或者由240个单体多肽拷贝形成。在所述单体于宿主细胞中达到合适的浓度时，所述单体形成一种直径大约27nm的颗粒。结构研究表明：由残基68至残基90构成的区域内的氨基酸，在所述颗粒表面上形成一种突起结构，称为e1环。两个单体通过二硫键连接而形成一种二聚体突起，最为暴露的氨基酸位于位置80(在e1环的中心)。
EP-A-421635(The Wellcome Foundation Limited)描述了允许插入外源表位到e1环而不改变该蛋白形成颗粒之潜能的HBV核心基因的修饰。在这个位点的插入，允许在由所述蛋白二聚体形成的每个突起的尖端上，最大限度地暴露所插入的表位。由于每个颗粒有大约180个或240个单体拷贝，因而每个颗粒能够呈递180个或240个所关注(of interest)表位的拷贝。
发明概述
在形成核心颗粒之结构构件的HBcAg二聚体中，邻近的e1环是紧密并列的。有人提出：如果以单体核心蛋白的形式呈递，则插入到e1环中的序列在构象上被限制在装配出的颗粒中。本发明试图通过共价连接核心蛋白为串联拷贝的形式，例如共价连接为二聚体形式，以便在每个拷贝中能独立地进行插入，从而来解决这个问题。对于将大序列插入到e1环中，这是特别有用的；因为它允许这样的序列被插入到每个串联重复之核心蛋白的仅仅一个拷贝中，从而在装配中减少潜在的结象冲突。另一方面，可以将不同的序列插入到串联重复的每个e1环中，如此增加HBcAg颗粒作为表位呈递系统的灵活性。
因此，本发明提供一种包含HBcAg串联拷贝的蛋白。该蛋白通常是一种包含二个HBcAg拷贝的二聚体。可以将一种异源表位插入到一个或更多个HBcAg拷贝的e1环中。所述蛋白装配成颗粒；所述颗粒在其表面上呈递在e1环中插入的异源表位，并且在人和动物的预防接种和治疗接种方面是有用的。
发明详述
所述蛋白
本发明蛋白的基本构件是HBcAg，该HBcAg具有183个或185个氨基酸(aa)，所述氨基酸数取决于HBV的亚型。在SEQ ID No.2中显示了加上29个氨基酸前序列的、awy亚型之183个氨基酸的蛋白序列。成熟的HBcAg从位置30的Met残基延续到C-末端尽头的Cys残基，从位置1至29的序列是一种前序列。
所述蛋白通常仅包含构成一个二聚体的二个HBcAg拷贝，因为HBcAg二聚体形成核心颗粒的结构构件。但是，该蛋白可以包含另外的HBcAg拷贝。因此，该蛋白可包含2至8个拷贝或2至4个拷贝的HBcAg。使用多于二个的拷贝则增加所述系统的灵活性，例如，使用三个拷贝则允许三种不同的拷贝被插入到本发明蛋白中的三个e1环中，并因此扩大由本发明的蛋白所引起的免疫应答的范围。
通常以头尾相接方式将所述HBcAg单位连接在一起，即将一个单位的C-末端连接到邻近单位的N-末端上。可以通过共价键(例如肽键)直接连接所述的单位，但最好用一种接头连接它们，所述接头隔开相邻近的单位，且因此防止破坏邻近单位包装的任何问题。在下面讨论该接头的性质。
本发明蛋白中的一个或更多个HBcAg单位可以是天然全长的HBcAg。但是，通常至少有一个单位是HBcAg的修饰形式，例如，通过在e1环中插入一个异源表位而修饰的HBcAg。在按照本发明的二聚体中，可以修饰一个HBcAg单位，而另一单位可以是天然的HBcAg。
通常，选择任何修饰而使得不影响HBcAg的构象及其装配成颗粒的能力。在所述蛋白中的、对于保持该蛋白构象不重要的位点上，进行这样的修饰，例如，在e1环、C-末端和/或N-末端上。HBcAg的e1环可容许插入例如1至120个氨基酸，而不破坏该蛋白的颗粒形成能力。
可以通过取代、插入、缺失或延伸，来修饰HBcAg序列。插入、缺失或延伸的规模例如可以是1至200个氨基酸、3至100个氨基酸或6至50个氨基酸。在HBcAg序列长度的范围内，取代可涉及多达例如1、2、5、10、20或50个氨基酸的许多氨基酸。延伸可以发生在HBcAg的N-末端或C-末端。缺失可以发生在所述蛋白的N-末端、C-末端或在内部位点。可以在该蛋白序列中的任何位置进行取代。也可以在该蛋白序列中的任何点进行插入，但一般在该蛋白表面暴露的区域例如e1环中进行。插入的序列可携带异源表位。对于每个HBcAg单位，可进行多过一种的修饰。因此，进行末端延伸或缺失并且还进行内部插入，则是可能的。例如，可在C-末端进行截短而在e1环中可进行插入。
取代一般会是保守的，且可以例如按照下表进行；在该表中，在第二栏中的同一框中的氨基酸且最好是在第三栏中的同一行中的氨基酸，可以被相互取代。
| 脂肪族 | 非极性 | G A P |
| I L V | ||
| 极性不带电 | C S T M | |
| N Q | ||
| 极性带电 | D E | |
| K R | ||
| 芳香族 | H F W Y | |
优选本发明蛋白中的HBcAg序列的每个部分与天然HBcAg蛋白之相应序列具有至少70％的序列同一性，所述天然HBcAg蛋白例如具有SEQ ID No.2中所示序列的蛋白。更优选所述同一性为至少80％、至少90％、至少97％、至少98％或至少99％。测定蛋白序列(和核酸序列)同一性的方法是本技术领域众所周知的。例如，UWGCG软件包提供BESTFIT程序(Devereux等，(1984)Nucleic Acids Research 12，第387-395页)。类似的，可以用PILEUP和BLAST算法来排齐序列(例如，如同在Altschul S.F.(1993)J.Mol.Evol.36：290-300和Altschul S.F.等(1990)J.Mol.Biol.215：403-10中描述的)。
所述HBcAg的e1环是在位置68至90处，可以在这些位置之间的任何地方插入异源表位。优选在位置69至90、71至90或75至85的区域中插入表位。更优选的是在氨基酸残基79和80之间、或在残基80和81之间插入表位。当插入一种异源表位时，可以保留HBcAg的全序列；或者，可以缺失掉e1环序列的全部或部分，且用异源序列来取代。因此，可以用异源表位取代氨基酸残基69至90、71至90或75至85。在异源表位取代e1环序列的情况下，该表位通常不比它所取代的序列短。
HBcAg之C-末端的截短通常不会超过氨基酸144，因为如果进行任何进一步的截短，则颗粒可能不形成。因此，缺失的氨基酸可以包括例如氨基酸144至C-末端氨基酸(氨基酸183或185)、氨基酸150至C-末端氨基酸、氨基酸164至C-末端氨基酸或氨基酸172至C-末端氨基酸。HBcAg的C-末端结合DNA，且因此C-末端的截短，则减少或完全除去来自HBcAg及HBcAg杂种蛋白之制备物的DNA。
本发明的蛋白形成颗粒，所述颗粒最好类似由天然HBcAg形成的颗粒。本发明的颗粒一般直径至少为10nm的，例如，直径为10-50nm或直径为20-40nm，但最好其直径约为27nm(这是天然HBcAg颗粒的大小)。它们包含多个HBcAg单位，例如，从150个至300个单位，但通常将它们选定为大约180个或大约240个单位(这些是天然HBcAg颗粒中的单位数)。在本发明的蛋白为一种二聚体的情况下，这意味着所述颗粒中的蛋白单体数可以是从75到150，但通常是大约90或约120。
在邻近的HBcAg单位之间的接头一般是一条长度至少1.5nm(
)的氨基酸链，例如，1.5-10nm、1.5-5nm或1.5-3nm。它可以包含例如4至40个氨基酸或10至30个氨基酸，优选包含15到21个氨基酸。所述接头通常是柔性的。该接头中的氨基酸可包括例如甘氨酸、丝氨酸和/或脯氨酸，或者，例如可完全由甘氨酸、丝氨酸和/或脯氨酸组成。一种优选的接头包含一个或更多个的序列GlyGlySer(GGS)的重复。或者，所述接头可包含一个或更多个GlyPro(GP)二肽重复。所述重复数可以例如是从1至18，优选从3到12。在GGS重复的情况下，已发现使用5、6或7个重复，则允许形成颗粒。该接头可以相当于抗体的铰链区，有人认为这个铰链区在抗体的抗原结合域与尾域之间提供一个柔性接合点。
正如上面表明的，可以将一种异源表位插入到本发明蛋白中的一个或更多个HBcAg拷贝中，优选插入到e1环中。“异源”表位是一种正常情况下不位于其在HBcAg中所处位置的表位；它通常来自一种不同于HBcAg的蛋白，但是，它可以来自HBcAg中的不同的位置。所述表位包括一种引起免疫应答的氨基酸序列。该表位可以是构象表位或线性表位。它可以例如是在6至120个氨基酸、6至50个氨基酸或6至20个氨基酸的序列中。本发明的一个主要优点是本发明允许在大序列上携带的表位被插入到e1环中；例如在来自30至120个氨基酸、40至120个氨基酸或60至120个氨基酸的序列上。
本发明的蛋白可包含不止一种异源表位，例如多达2、3、5或8种异源表位，而在这种情况下，则所述的表位可以存在于相同或不同的HBcAg单位中。在每个HBcAg单位之中可以插入不止一个拷贝的表位，例如可插入2至8个拷贝。在本发明蛋白中有两个或更多个的异源表位的情况下，所述表位可以来自相同或不同的生物，且可以来自相同或不同的蛋白。
所述表位可以是一种T-细胞表位或B-细胞表位。如果它是一种T-细胞表位，则它可以是一种细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)表位或是一种T-辅助细胞(Th)表位(例如一种Th1或Th2表位)。在本发明一个优选的实施方案中，所述表位中的一种为T-辅助细胞表位且另一种是B-细胞表位或CTL表位。T-辅助细胞表位的存在增强对B-细胞表位或CTL表位的免疫应答。
表位的选择取决于所希望接种以预防的疾病。该表位例如可以来自一种病原生物、一种癌相关抗原或一种变应原。所述病原生物可以例如是一种病毒、一种细菌或一种原生动物。
其表位可以被插入的病原体的实例，包括甲型肝炎病毒(HAV)、HBV、HCV、流感病毒、口蹄疫病毒、脊髓灰质炎病毒、单纯疱疹病毒、狂犬病毒、猫白血病病毒、人免疫缺陷病毒1型(HIV1)、人免疫缺陷病毒2型(HIV2)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、人鼻病毒、登革病毒、黄热病毒、人乳头瘤病毒、呼吸道合胞病毒、恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)(疟疾的病因)以及细菌，所述细菌例如分枝杆菌属(Mycobacteria)、博德特氏菌属(Bordetella)、沙门氏菌属(Salmonella)、埃希氏菌属(Echerichia)、弧菌属(Vibrio)、嗜血菌属(Haemophilus)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、耶尔森氏菌属(Yersinia)和布鲁氏菌属(Brucella)。具体地讲，所述细菌可以是结核分枝杆菌(Mycobacteriatuberculosis)-结核病的病因、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)或副百日咳博德特氏菌(Bordetella parapertussis)-百日咳的病因、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)-几种动物物种中的沙门氏菌病的病因、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)-人伤寒的病因、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)-人类食物中毒的病因、猪霍乱沙门菌(Salmonella choleraesuis)-猪沙门氏菌病的病因、都柏林沙门氏菌(Salmonella dublin)-牛、尤是在新生小牛的系统性和腹泻性疾病的病因、大肠杆菌(Escherichia coli)-人类食物中毒的病因、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)-脑膜炎的病因、淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)-淋病的病因、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)-人类中从胃肠炎到致死性败血症性疾病之范围内的一系列疾病的病因以及流产布鲁菌(Brucella abortus)-牛中流产和不育的病因以及人类中称为波状热病症的病因。
供本发明之用的候选表位的实例包括来自下面抗原的表位：HIV抗原gp 120、gp 160、gag、pol、Nef、Tat以及Ref；疟疾抗原CS蛋白和子孢子表面蛋白2；流感抗原HA、NP和NA；疱疹病毒抗原EBVgp340、EBV gp85、HSV gB、HSV gD、HSV gH、HSV早期蛋白产物、巨细胞病毒gB、巨细胞病毒gH以及IE蛋白gP72；人乳头瘤病毒抗原E4、E6和E7；呼吸道合胞病毒抗原F蛋白、G蛋白以及N蛋白；百日咳博德特氏菌的百日咳毒素(pertactin)抗原；肿瘤抗原癌CEA、癌相关粘蛋白、癌P53、黑素瘤MPG、黑素瘤P97、MAGE抗原、癌Neu癌基因产物、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺相关抗原、ras蛋白、以及myc；以及家尘螨(house dust mite)变应原。
特别优选的表位是来自HBV的前S1区、前S2区、S区或核心抗原的那些表位。将整个前S1区和/或整个前S2区插入到HBcAg中是可能的，但通常仅插入所述区域之一的一部分。所插入的部分在长度方面一般为至少6个氨基酸，例如，从6至120个氨基酸、从20至80个氨基酸或从20至50个氨基酸。该插入片段可包含例如在前S1位置1-9、10-19、20-29、30-39、40-49、50-59、60-69、70-79、80-89、90-99、100-109或110-119的残基，或者可包含例如在前S2位置120-129、130-139、140-149、150-159、160-169或170-174的残基。特别优选的插入片段是前-S1残基20-47和前-S2残基139-174。
制备本发明的蛋白
一般用重组DNA技术来制造本发明的蛋白。本发明包括编码本发明蛋白的核酸分子(例如DNA或RNA)，例如一种表达载体。可以用操作核酸的已知技术来制备所述的核酸分子。一般而言，制备编码两个HBcAg单位的分开的两个DNA构成物，然后，通过重叠PCR，将其结合在一起。
通过在表达所述蛋白的条件下，培养含有编码该蛋白之核酸分子的宿主细胞，且回收所述的蛋白，则可生产本发明的蛋白。合适的宿主细胞包括例如大肠杆菌的细菌、酵母、哺乳动物细胞及其它真核细胞，所述其它真核细胞例如昆虫Sf9细胞。
按照本发明的、构成载体的核酸分子可以例如是质粒或病毒载体。它们可包含一个复制起始点、一个用于所述蛋白编码序列表达的启动子、一个例如增强子的启动子的调节物、一个转录终止信号、一个翻译起始信号和/或一个翻译终止信号。所述载体也可以包含一种或更多种选择标记基因，在细菌质粒的情况下例如一种氨苄青霉素抗性基因，或者，在哺乳动物载体的情况下例如新霉素抗性基因。可以在体外使用载体，例如，用于生产RNA或用来转化或转染宿主细胞。也可以使该载体适应于在体内使用；例如用于基因疗法的方法或DNA接种。
可挑选与所述表达载体设计用于的宿主细胞相容的启动子、增强子和其它调节表达的信号。例如，可使用原核启动子，特别是那些适合于用于大肠杆菌菌株(例如大肠杆菌HB101)的启动子。可以使用响应周围环境(例如厌氧条件)的变化而被诱导其活性的启动子。最好可使用htrA或nirB启动子。特别可使用这些启动子，在例如用作疫苗的一种减毒细菌中表达所述的蛋白。如果在哺乳动物细胞中进行本发明蛋白的表达，不论体外还是体内进行，则可以使用哺乳动物的启动子。也可以使用组织特异性启动子，例如肝细胞特异性启动子。同样可以使用病毒启动子，所述病毒启动子例如莫洛尼鼠类白血病病毒的长末端重复序列(MMLV LTR)、劳斯肉瘤病毒(RSV)的LTR启动子、SV40的启动子、人巨细胞病毒(CMV)的IE启动子、单纯疱疹病毒的启动子以及腺病毒的启动子。所有这些启动子在本技术领域中是容易得到的。
使用用于纯化蛋白的常规技术，可纯化按照本发明的蛋白。例如可以以纯化了的、纯的或分离的形式，提供所述的蛋白。为了用于疫苗，通常必须以高标准的纯度来提供该蛋白；例如，以它构成所述蛋白构成制剂中蛋白的80％以上、90％以上、95％以上或98％以上的标准提供。然而，可能理想的是将所述蛋白与最终的疫苗制剂中的其它蛋白混合。
预防疾病的接种
本发明蛋白的主要用途是作为治疗性或预防性疫苗。本发明包括一种包含本发明蛋白、一种本发明的颗粒或本发明核酸分子以及一种药学上可接受的载体或稀释剂的药用组合物(例如一种疫苗组合物)。
预防性接种的原理是在宿主中诱发免疫应答，以致于在该宿主中产生一种免疫学记忆。这意味着如果使宿主暴露于该致病性强的病原体，则该宿主发动一种有效的(保护性的)免疫应答，即一种灭活和/或杀死该病原体的免疫应答。本发明能够构成一种防备一系列疾病和病症的预防性疫苗的基础，所述疾病和病症例如HBV、HAV、HCV、流感性感冒、口蹄疫、脊髓灰质炎、疱疹、狂犬病、艾滋病、登革热、黄热病、疟疾、结核病、百日咳、伤寒、食物中毒、腹泻、脑膜炎及淋病。挑选本发明蛋白中的表位，以便与所述疫苗计划提供的保护所针对的疾病相称。
治疗性接种的原理是刺激宿主的免疫系统，以减轻或根除疾病或病症。有许多可能对治疗性接种敏感的疾病和病症，例如包括慢性HBV和慢性HCV的慢性病毒病、癌症以及变态反应；所述变态反应例如哮喘、特异性变态反应、湿疹、鼻炎及食物过敏反应。
如果被感染宿主的免疫系统没能清除掉病毒，则产生慢性病毒病；从而使该病毒可以在宿主中持续存在很长时期。可以运用本发明来诱导慢性感染个体的免疫系统，以便清除该病毒。例如，据认为患有慢性肝炎的患者有不适当的T-细胞反应，且激发适当的T-细胞反应则能清除该病毒。因此，为了用本发明治疗慢性病毒性肝炎，可以将T-细胞表位插入到本发明的蛋白中，所述T-细胞表位例如来自HBV之前S1区和前S2区的T-细胞表位。
类似地，在癌症的情况下，认为增强对肿瘤抗原的T-细胞应答可帮助免疫系统破坏该肿瘤。相信过敏性疾病至少部分是由于一种失衡的T-细胞反应所引起，在所述T-细胞反应中，炎性Th2反应超过拮抗性的Th1反应；且相信因此可通过增强Th1反应，来治疗过敏反应。按照本发明，通过使用包含一种激发Th1反应之异源表位的蛋白，可以实现这一点。
可供包含在本发明药用组合物中的合适载体和稀释剂，是等渗盐水溶液；例如磷酸缓冲盐溶液。该组合物通常会包含一种佐剂，例如氢氧化铝。可以以用于注射的液体形式来配制该组合物。所述组合物包含预防或治疗有效量的该蛋白、颗粒或核酸。一般而言，按体重计以0.1-200μg、优选1-100μg、更优选10-50μg的剂量，给予所述蛋白或颗粒。用本领域已知的技术，或使用本技术领域已知的载体，可直接给予作为裸露核酸构成物的本发明核酸。所给予的核酸量一般在1μg至10mg的范围内，优选从100μg至1mg的范围内。可以按单剂量方案，或可按多剂量方案，例如按2至32剂或按4至16剂，来给予该疫苗。上述的给予途径和给予的剂量仅仅作为一种指导，且该途径和剂量终究可以由医师自行处理。
实验部分
附图简述
图1：一种显示乙型肝炎病毒核心的连接的AB二聚体之可行性的假设模型。
图2：构建异源串联核心和同源串联核心的示意图。线条表示所述蛋白的一级结构。在HBcAg(氨基酸1-144)的装配域内，指出了e1环(黑色矩形)以及参与二聚体内接触(浅阴影)和二聚体间接触(黑色阴影)的区域。用+代表富含精氨酸的核酸结合域。以箭头形式表示引物(表1)。
图3：来自同源串联核心颗粒之蔗糖密度梯度分离部分的12％SDS-PAGE。
图4：具有一种包含5个GGS重复之接头的、异源串联核心颗粒的电子显微照片。
图5：显示异源串联核心在大肠杆菌中有效表达的蛋白质印迹。所述的核心分别包含作为接头的5个GGS重复、6个GGS重复、7个GGS重复(GGS5、GGS6和GGS7)。
图6：串联核心颗粒的冷冻电子显微镜术结果。图6(a)显示与天然颗粒(中间的颗粒)相比的串连核心颗粒(左边的颗粒)。图6(a)的右边部分显示串联核心颗粒中核心抗原的C-末端部分。图6(b)显示串联核心颗粒结构的一部分与天然颗粒相符合。
方法
HBV核心颗粒结构的研究暗示：或许可以使用至少1.5nm(
)的柔性接头来连接二聚体对中的二个蛋白，而不破坏其结构的完整性(图1)。因此，通过重叠PCR来制备构成物；在所述构成物中，上游的核心蛋白被截短到残基149，然后，借助于5、6或7个拷贝的GlyGlySer(GGS)重复序列，将其连接到一个下游拷贝上(图2)。该下游拷贝或者是全长的核心蛋白，或者在氨基酸149处被截短而除去富含Arg之C-末端区域。表1给出了用来构建各种各样串联的HBV核心的寡核苷酸序列。
将构成物克隆到ptrc99A表达载体中，且将其转化到大肠杆菌JM109中，并用IPTG诱导。然后，通过离心收获细胞，将其重悬浮PBS中，并超声处理二次。使含有所表达的可溶性串联核心之裂解液达到30％的硫酸铵饱和度，并通过离心收集沉淀的蛋白；将收集的蛋白重悬浮于PBS中，且对着磷酸缓冲盐溶液透析。将澄清的裂解液装填在15-45％的线性蔗糖梯度上，并在4℃以28,000rpm离心达4小时。从离心管的底部将梯度分级分离成2ml的等分试样，并通过SDS-PAGE和使用抗HBV核心蛋白的单克隆第一抗体(mAb 13)之蛋白质印迹，来分析它们。
把HBV核心颗粒的制备物点样在包碳载网上，用乙酸双氧铀将其负染色，并用透射电镜术观察。运用冷冻电子显微镜术来确定所述核心颗粒的结构。
表1：用于将串联的HBV核心基因克隆到ptrc99A中的寡核苷酸引物的序列
| 引物 | 序列(5’→3’) |
| 123456789 | GTTACCATGGACATTGACCCTTAT<sup>a</sup>GTCCATAGA(ACCACCAGA)<sub>5</sub>AACAACAGTAGTTTCCGGGTCCATAGA(ACCACCAGA)<sub>6</sub>AACAACAGTAGTTTCCGGGTCCATAGA(ACCACCAGA)<sub>7</sub>AACAACAGTAGTTTCCGGGTTGTT(GGTGGTTCT)<sub>5</sub>ATGGACATTGACCCTTATGTTGTT(GGTGGTTCT)<sub>6</sub>ATGGACATTGACCCTTATGTTGTT(GGTGGTTCT)<sub>7</sub>ATGGAGATTGACCCTTATTATGAAGCTTATGAGTCCAAGGA<sup>b</sup>TATGAAGCTTCCGTCGTCAAACAA<sup>b</sup> |
a NcoI限制酶切位点用粗体表示。
b HindIII限制酶切位点用粗体表示。
结果
具有5、6或7个GGS拷贝的串联HBV核心蛋白全都得以成功地表达，且显示它们以所期望的迁移率在聚丙烯酰胺凝胶中迁移。每种蛋白装配成核心颗粒，正如由其在蔗糖密度梯度中的沉降(图3)以及其在电子显微镜中的外观(图4)所证明的。所述颗粒保持了其抗原特性，正如由其在ELISA和蛋白质印迹方面的反应性(图5)所表明的。而且，在冷冻电子显微术方面，由串联核心蛋白所形成的颗粒结构与天然核心颗粒的结构是不能区别的(图6)。
序列表
<110>细胞技术药品欧洲有限公司(MEDEVA EUROPE LIMITED)
<120>乙型肝炎核心抗原的融合蛋白
<130>N79405A
<140>PCT/GB01/01607
<141>2001-04-09
<150>EP 00107118.2
<151>2000-04-07
<160>11
<170>PatentIn version 3.0
<210>1
<211>639
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(639)
<400>1
atg caa ctt ttt cac ctc tgc cta atc atc tct tgt tca tgt cct act 48
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1 5 10 15
gtt caa gcc tcc aag ctg tgc ctt ggg tgg ctt tgg ggc atg gac atc 96
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
20 25 30
gac cct tat aaa gaa ttt gga gct act gtg gag tta ctc tcg ttt ttg 144
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
35 40 45
cct tct gac ttc ttt cct tca gta cga gat ctt cta gat acc gcc tca 192
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
50 55 60
gct ctg tat cgg gaa gcc tta gag tct cct gag cat tgt tca cct cac 240
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65 70 75 80
cat act gca ctc agg caa gca att ctt tgc tgg ggg gaa cta atg act 288
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr
85 90 95
cta gct acc tgg gtg ggt gtt aat ttg gaa gat cca gcg tct aga gac 336
Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp
100 105 110
cta gta gtc agt tat gtc aac act aat atg ggc cta aag ttc agg caa 384
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
115 120 125
ctc ttg tgg ttt cac att tct tgt ctc act ttt gga aga gaa aca gtt 432
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
130 135 140
ata gag tat ttg gtg tot ttc gga gtg tgg att cgc act cct cca gct 480
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145 150 155 160
tat aga cca cca aat gcc cct atc cta tca aca ctt ccg gag act act 528
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
165 170 175
gtt gtt aga cga cga ggc agg tcc cct aga aga aga act ccc tcg cct 576
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
180 185 190
cgc aga cga agg tct caa tcg ccg cgt ogo aga aga tot caa tct cgg 624
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
195 200 205
gaa tct caa tgt tag 639
Glu Ser Gln Cys
210
<210>2
<211>212
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>2
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr
1 5 10 15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
20 25 30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
35 40 45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
50 55 60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65 70 75 80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr
85 90 95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp
100 105 110
Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
115 120 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
130 135 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145 150 155 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
165 170 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
180 185 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg
195 200 205
Glu Ser Gln Cys
210
<210>3
<211>81
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>3
gtccatagaa ccaccagaac caccagaacc accagaacca ccagaaccac cagaaccacc 60
agaaacaaca gtagtttccg g 81
<210>4
<211>90
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>4
gtccatagaa ccaccagaac caccagaacc accagaacca ccagaaccac cagaaccacc 60
agaaccacca gaaacaacag tagtttccgg 90
<210>5
<211>69
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>5
gttgttggtg gttctggtgg ttctggtggt tctggtggtt ctggtggttc tatggacatt 60
gacccttat 69
<210>6
<211>78
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>6
gttgttggtg gttctggtgg ttctggtggt tctggtggtt ctggtggttc tggtggttct 60
atggacattg acccttat 78
<210>7
<211>87
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>7
gttgttggtg gttctggtgg ttctggtggt tctggtggtt ctggtggttc tggtggttct 60
ggtggttcta tggacattga cccttat 87
<210>8
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>8
tatgaagctt atgagtccaa gga 23
<210>9
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>9
tatgaagctt ccgtcgtcaa acaa 24
<210>10
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>10
gttaccatgg acattgaccc ttat 24
<210>11
<211>72
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>11
gtccatagaa ccaccagaac caccagaacc accagaacca ccagaaccac cagaaacaac 60
agtagtttcc gg 72
Claims (18)
1.一种蛋白，该蛋白由乙型肝炎核心抗原HBcAg的串联拷贝组成，其中所述HBcAg拷贝中的一个或更多个在e1环中具有一个异源表位。
2.一种权利要求1的蛋白，所述蛋白是两个HBcAg拷贝的二聚体。
3.一种权利要求1的蛋白，其中所有的HBcAg拷贝都在e1环中具有异源表位。
4.一种权利要求3的蛋白，其中所有所述拷贝都在e1环中具有同样的异源表位。
5.一种权利要求3的蛋白，其中每个拷贝在e1环中具有一个不同的异源表位。
6.一种权利要求1的蛋白，其中所述异源表位或每个异源表位来自乙型肝炎病毒HBV的前S1区或前S2区。
7.一种权利要求1的蛋白，其中所述异源表位或每个异源表位位于e1环内的具有10至120个氨基酸残基的异源序列中。
8.一种权利要求1的蛋白，其中所述HBcAg拷贝中的一个或更多个在C-末端截短，以及其中所述截短不超过HbcAg的氨基酸144。
9.一种权利要求1的蛋白，其中HBcAg的所述串联拷贝用一个接头连接。
10.一种权利要求9的蛋白，其中所述接头包含序列GlyGlySer即GGS的多个拷贝。
11.一种权利要求10的蛋白，其中所述接头包含5、6或7个拷贝的序列GGS。
12.一种蛋白颗粒，所述颗粒由权利要求1-11中任一项的蛋白的多个拷贝装配而成。
13.一种核酸分子，所述核酸分子编码权利要求1至11中任一项的蛋白。
14.一种权利要求13的核酸分子，所述核酸分子为一种表达载体。
15.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求13的核酸分子。
16.一种用于生产权利要求1至11中任一项的蛋白的方法，所述方法包括：在所述蛋白得以表达的条件下，培养含有编码所述蛋白之核酸分子的宿主细胞；并回收所述的蛋白。
17.一种药用组合物，所述组合物包括权利要求1至11中任一项的一种蛋白、权利要求12的一种颗粒或权利要求13或14的一种核酸分子以及一种药学上可接受的载体或稀释剂。
18.权利要求1至11中任一项的一种蛋白、权利要求12中的一种颗粒或者权利要求13或14中的一种核酸分子用于生产用于人体或动物体抗HBV的预防接种或治疗接种的药物的用途。
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