JPH01500117A - 免疫増強作用系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３７、生又は死全細胞経ロワクチンである、請求の範囲第３６項に記載の全細胞 ワクチン。

３８、細胞膜又は細胞内容物から精製した請求の範囲第１７項に記載のハイブリ ッド蛋白から成るワクチン。

３９、免疫原と原核生物又は真核生物由来のｉｍｐの少なくとも１部から成る担 体とから少なくとも成るハイブリッド蛋白の生合成の遺伝情報を有する微生物で あって、その生成したハイブリッド蛋白が宿主細胞表面に表布するような微生物 の製造方法であって、その必要な遺伝情報を有する微生物を培養することから成 る前記製造方法。

４０、請求の範囲第３９項に記載の方法により作った微生物の細胞膜又は細胞内 容物から請求の範囲第１７項に記載のハイブリッド蛋白を精製することから成る サブユニットワクチンの製造方法。

４１、宿主に非経口、経口又は経腸投与する形態の担体と免疫原との複合体の製 造方法であって、該複合体を作りそしてこれを薬学的に許容される希釈剤に加え ることから成る前記製造方法。

４２、宿主に非経口、経腸又は経口投与するのに適した形態の、請求の範囲第１ 〜６項のいずれかに記載の複合体。

明　細　書 免疫増強作用系 改亙九１ 本発明は、その複合体を非経口的、経腸的又は経口的に投与するかどうかを問わ ず、免疫原に結合させた時に、該免疫原に対するその宿主の免疫応答を増強する ことのできる分子群に関するものである。

生立五Ｌ Ｅ、ｃｏｌｌ株をＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃ ｔｉｏｎ（１２３０１Ｐａｒｋｌａｕ＋ｎ　Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、 ＭＤ２０８５２．米［１１）にＩＱ７年３月２日付寄託した（ＡＴＣＣ６７３３ １）。

１１皮阪 病原体（細菌、ウィルス、寄生虫）の復襲から動物体を防御する目的で、該病原 体の全部又はそのサブユニットを使用して動物にワクチン投与して該宿主中に免 疫防御応答を誘発させることはしばしば推奨されることである。そのような抗原 性誘発作用に対する免疫応答は、免疫増強剤やアジュバントの併用投与により増 進されることが多い。このような作用剤の最も好ましいものはデボット型アジュ バント（例えばフロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバントお よびモンタニド）である。これらのアジュバントは、抗原注射後の抗体応答を、 抗原だけを注射した場合のレベルの約５０〜１００倍にも増加することができる 。

フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバントおよびモンタニド のようなアジュバントは抗原に対する免疫応答を著しく増強し得るけれども、こ れらにはいくつかの欠点がある。これを注射剤の形で抗原と一緒に使用すると、 注射部位に大きな組織障害が起ることがあり、そのような用途でこれらをヒト、 ベット又は食用動物に使用するのは満足なものではない、更に又、これらアジュ バントは経口又は経腸投与した場合には免疫増強剤として作用し得ない。

九吸α虱五 本発明は、その複合体を非経口的、経腸的又は経口的に投与するかどうかを問わ ず、免疫原に又はハブテンに化学的又は遺伝子的に結合させた時に、該免疫原又 はハブテンに対するその宿主の免疫応答を増強することのできる分子群に関する ものである。そしてこれらを使用した場合に、注射部位に大きな組織障害が発生 しない。

このような作用を有する分子群は膜蛋白の一般的性質を有するものとして定義す ることができるが、本文中に記載の具体例は特殊な型の膜蛋白、更に詳しくはグ ラム陰性細菌の外股蛋白由来のものである。引用した具体例として代表的なもの はＴｒａＴ蛋白であり、これはある種のＥ、ｃｏｌｌ株の外膜蛋白であって、こ れら菌株が血清により殺滅されることに対する抵抗性を有しているものである。

この種の別の蛋白としては、Ｅ、ｃｏｌｉ外膜蛋白ＯｍｐＡおよびＯｍｐＦがあ る。ＴｒａＴ、ＯｍｐＡ又はＯｎ＋ｐＦ（以下担体と称する）の定量をアジュバ ントなしでマウスに筋肉内注射すると、ＢＳＡ、フラゲリン又はヒツジＩｇＧの ような可溶性蛋白をフロイント不完全アジュバントと混合して注射した場合に匹 敵する程の抗体応答が誘発される。事実、これらの外膜蛋白により誘発される抗 体応答は、フロイント不完全アジュバント投与による限界増加量に相当するほど 高いものである。

又、ＴｒａＴ又はＯｍｐＡの経口投与により、抗Ｔ　ｒａＴ　（１／４０９６） 又は抗ＯｍｐＡ（１／８９２）血清抗体の有意力価が増加することも見出された 。

同様に、外股中にＴｒａＴを含有するＳａ！＋＊ｏｎｅｌｌａ又はＥ、ｃｏｌｌ を中程度の量（１０ｇ〜１０１°）投与すると抗ＴｒａＴ抗体の産生が増強され ることも見出された。

ハブテン（ジニトロフェノール、ＤＮＰ）、ペプチド（ｃｓｐ）又は蛋白（ウシ 血清アルブミン、ＢＳＡ）のＯｍｐＡ又はＴｒａＴとの共有結合も又ＤＮＰ、Ｃ ３Ｐ又はＢＳＡへの免疫応答を増強する作用を有する。

第１の態様として本発明は、担体分子と結合した免疫原から成る複合体であって 、この複合体を非経口的、経腸的又は経口的であるかどうかを問わず宿主に投与 した時に、該担体分子が該宿主の免疫原に対する免疫応答を増強する作用を有す るものであって、そして該免疫原が抗原又はハブテンのいずれかから成り、該担 体分子が原核生物又は真核生物由来の内存性膜蛋白から成るものである該複合体 を提供するものである。

好ましい態様として、担体分子はグラム陰性細菌の外膜蛋白Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌ ａ種である。

より好ましくは、担体分子はＥ、ｃｏｌｌ株の生産するＴｒａＴ蛋白又は外膜蛋 白ＯｍｐＡ又はＯｍｐＦである。

本発明のより好ましい免疫原としては、ＣＳＰ、ロタウィルス株由来のウィルス カプシド蛋白ＶＰ７および真核蛋白ミンアクチビンの全部又は１部が挙げられる 。

免疫原−担体複合体は、例えば適当な接合剤又は結合剤のいずれかを使用しての 接合、および担体および（又は）免疫原上の官能基の変成および（又は）反応か ら成る化学的方法により作ることができる。

従って本発明は、担体分子に結合した免疫原から成る複合体であって、該担体分 子が原核生物又は真核生物由来の内存性膜蛋白（ｉｍｐ）であり、そして該免疫 原が抗原又はハプテンのいずれかであり、そしてこの複合体を非経口的、経腸的 又は経口的であるかどうかを問わず宿主に投与した時に、該担体分子が該宿主の 免疫原に対する免疫応答を増強する作用を有するもの該複合体を製造する方法で あって、下記の工程、すなわち、（ａ）　免疫原と担体とを反応させて該複合体 を作る、（ｂ）　免疫原を化学的に変成して化学結合形成可能な少なくとも１個 の官能基を導入し、そしてこうして変成した免疫原と担体とを反応させて該複合 体を作る、 （ｅ）　担体を化学的に変成して化学結合形成可能な少なくとも１個の官能基を 導入し、そして免疫原と変成担体とを反応させて該複合体を作る、 （ｄ）　免疫原と担体とを化学的に変成して化学結合形成可能な官能基を導入し 、そして変成免疫原と変成担体とを反応させて該複合体を作る、 （ｅ）　免疫原と少なくとも１個の結合剤とを反応させ、そして結合免疫原と担 体分子とを反応させて該複合体を作る、（ｆ）　担体と少なくとも１個の結合剤 とを反応させ、そして免疫原と結合担体とを反応させて該複合体を作る、（ｇ） 　免疫原および担体を少なくとも１個の結合剤と反応させ、そして結合免疫原と 結合担体とを反応させて該複合体を作る、 工程の１つ又はそれ以上から成る、前記方法を提供するものである。

本発明の好ましい方法は、 （ｉ）　免疫原を化学的に変成して化学結合形成可能な少なくとも１個の官能基 を導入し、そして （ｉｉ）　変成免疫原と担体とを反応させて前記複合体を作る、工程から成るも のである。

結合剤はジスルフィド結合を含有していても良く、あるいは酸、塩基又は過よう 素酸塩により開裂可能なものであっても良い、このような結合剤の例としては、 Ｎ−（４−アジドフェニルチオ）フタルイミド、４．４′−ジチオビスフェニル アジド、ジチオビス−（スクシンイミジルプロピオネート）、ジメチル−３，３ ′−ジチオビスプロピオンイミデート・２ＨＣ１，３，３′−ジチオビス−（ス ルホスクシンイミジルプロピオネート）、エチル−４−アジドフェニル−１，４ −ジチオブチルイミデート・ＨＣＩ、Ｎ−スクシンイミジル−（４−アジドフェ ニル）−１゜３′−ジチオ−プロピオネート、スルホスクシンイミジル−２−（ ｍ−アジド−０−ニトロベンズアジド）−エチル−１，３’−ジチオプロピオネ ート、スルホスクシンイミジル−２−（ｐ−アジドサリチルアミド）−エチル− １，３′−ジチオプロピオネート、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジル ジチオ）プロピオネート、スルホスクシンイミジル−（４−アジドフェニルジチ オ）−プロピオネート、および２−イミノチオランが挙げられる。好ましい架橋 剤はジスクシンイミジルタートレートおよびビス−〔２−（スクシンイミジルオ キシカルボニルオキシ）−エチル〕スルホンである。

担体と免疫原との結合は、担体を免疫原の適当な基に結合させることによって適 当に行なうことができる。

例えば適当な接合剤又は結合剤のいずれかを使用しての化学的接合により免疫原 −担体複合体を形成する場合に、好ましい接合又は結合剤としては１−エチル− ３−（３−ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド、グｌレタルアルデヒド 、−一マレイミド安息香酸−−ヒドロキシスクシンイミドエステルスはＮ。

Ｎ、−ジシクロへキシルカルボジイミドが挙げられる。

又免疫原と担体分子との結合は、例えば免疫原をコードするＤＮＡを担体をコー ドするＤＮＡ配列中に挿入又はそれに付加することによる組換えＤＮＡ技術を使 用して行なうような、ハイブリッド蛋白分子の製造によっても行うことができる 。

従って本発明は、ハイブリッド蛋白分子を製造することから成る、担体分子と免 疫原との前記複合体の製造方法も提供する。

そして好ましい方法として、該ハイブリッド蛋白分子を、免疫原をコードするＤ ＮＡを担体をコードするＤＮＡ配列中に挿入又はそれに付加することによる組換 えＤＮＡ技術により製造する。

本発明は又、免疫原のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列に融合した、原核生 物又は真植生物由来の内存性膜蛋白の少なくとも１部をコードする配列として作 用するＤＮＡ配列から成る第１のＤＮＡ配列；又は天然、合成および半合成源を 含めてのいかなるものから得られたものでも良い、該第１のＤＮＡ配列とハイブ リダイズする第２のＤＮＡ配列；単−又は複数の塩基置換、除去、挿入および転 位を含めての変異による、該第１のＤＮＡ配列関連ＤＮＡ配列；又は前記ハイブ リッドＤＮＡ配列およびインサートのいずれかのコドンを発現時にコードするポ リペプチドと同様の免疫的又は生物学的活性を示すポリペプチドを発現時にコー ドするコドンの配列から成るＤＮＡ配列、から成るハイブリッドＤＮＡ配列を提 供するものである。

本発明の好ましいハイブリッドＤＮＡ配列は、免疫原のアミノ酸配列をコードす るＤＮＡ配列に結合したＴｒａＴ、０ｓｐＦ又はＯｍｐＡの少なくとも１部をコ ードするものであって、その生成ＴｒａＴ−（ＯｍｐＦ又はＯｍｐＡ）ハイブリ ッド蛋白が宿主細胞表面に析出しそして表覆するものである。

本発明は又、可動プロモーターに融合した本発明のハイブリッドＤＮＡ配列から 成る融合遺伝子を提供するものである０本発明において好ましいプロモーターは バクテリオファージラムダ（λ）のＰｔ、プロモーターである。

更に又本発明は、本発明のハイブリッドＤＮＡ配列とベクターＤＮＡとから成り 、そして該ベクターＤＮＡがプラスミド、バクテリオファージ、ウィルス又はコ スミドＤＮＡである、組換えＤＮＡ分子を提供するものである。

本発明の組換えＤＮＡ分子は好ましいものとして、ハイブリッドＤＮＡ配列と能 動的に結合した発現コントロール配列を含有するものである。

本発明の特に好ましい組換えＤＮＡ分子は、ｐＢＴＡ３７１、ｐＢＴＡ４３９、 ｐＢＴＡ４４９、ｐＢＴＡ４５０およびｐＢＴＡ５８６である。

又本発明は、本発明のハイブリッドＤＮＡ配列をクローニングベヒクル中に導入 することから成る、組換えＤＮＡ分子の製造方法もその範囲内に含むものである 。

好ましくは該方法は、クローニングベヒクル中に発現コントロール配列を導入す る工程を含むものである。

本発明は又、本発明の少なくとも１個の組換えＤＮＡ分子で形質転換した宿主を 提供するものである。

適当な宿主としてはＥ、ｃｏｌｉおよびＳａ１ｍｏｎｅｌｌａ種を挙げることが できる。

好ましい形質転換体はＡＴＣＣ６７３３１（又はＣＣＴ　ＣＣ８７０２６とも命 名）である。

又本発明は、本発明の組換えＤＮＡ分子を宿主中に導入することから成る、宿主 の形質転換方法もその範囲内に含むものである。

更に又別の態様として、本発明は宿主中への非経口注射として適用するか又は経 口又は経腸投与として適用して、体液性および粘膜性の両方の抗体応答を誘発す る、担体と免疫原とから成る複合体を提供する。

又本発明は、担体と免疫原との複合体を作りそしてこれを薬学的に許容される希 釈剤に加えることから成る、非経口的、経腸的又は経口的投与用形態として該複 合体の製造方法もその範囲内に含有するものである。

好ましくは本発明は、免疫系に授与するために細菌細胞表面に表布する本発明の ハイブリッド蛋白を含有して成る全細菌細胞ワクチンを提供するものである。こ の全細胞ワクチンは生又は死全細胞経ロワクチンのいずれでも良い、又別に、ハ イブリッド蛋白は細胞膜又は細胞内容物から精製しそして非経口、経腸又は経口 的投与用のサブユニットワクチンとして使用することもできる。

本発明は又、免疫原と原核生物又は真核生物由来のｉｍｐの少なくとも１部から 成る担体とから少なくとも成るハイブリッド蛋白の生合成の遺伝情報を有する微 生物であって、その生成したハイブリッドペプチドが宿主細胞表面に表布するよ うな微生物の製造方法を提供するものであり、該方法は、その必要な遺伝情報を 有する微生物を培養することから成るものである。サブユニットワクチンを製造 するために微生物を使用する場合には、細胞膜又は細胞内容物からのハイブリッ ドペプチドを精製する工程を更に付加すれば良い。

・　の、ｆ；日 第１図はアジュバントによる免疫応答の変化を示す、ＴｒａＴ（第１ａ図）およ びＢＳＡ（第１ｂ図）単独又はこれと種々のアジュバントを組合わせてウサギに 筋肉内注射した。第１ａ図および第１ｂ図において、ＴｒａＴおよびＢＳＡをＦ 、１．Ａと混合した場合を（△−△）、モンタニド８８８との場合を（・−・） 、アルヒドロゲルとの場合を（ローロ）、食塩水との場合を（Ｘ−Ｘ）で表わし な０食塩水とＴｒａＴ（Ｘ−ｘ）、Ｏｎ＋ｐＡ（Ｗ−■）およびＯｍｐＦ（○− Ｏ）との場合の抗体応答の比較を第１ｃ図に示した。

第２図はＴｒａＴおよびＯｍｐＡとの結合によるＤＮＰおよびＢＳＡに対する抗 体応答増強を示すものである。

筋肉内注射後の抗担体（第２ａ図）および抗ＤＮＰ抗体応答（第２ｂ図）を増強 する作用効果について、ＴｒａＴ（＋−＋）、Ｏ＋＊ｐＡ（Ｘ−Ｘ）およびＢＳ Ａ（マーマ）のジニトロフェニル化製剤を比較した。又ＴｒａＴ（・−・）およ びＯｗ＋ｐＡ（ＩＩ−■）単独を注射した場合に対する抗体応答も測定した。同 様に、ＢＳＡを食塩水注射液として（○−Ｏ）、ＦＩＡと混合して（マーマ）、 又はＴｒａＴ（−）又は０Ｌ１１ｐＡ（ローロ）と共有結合させて注射した場合 の抗ＢＳＡ応答を測定した（第２ｃ図）、これら接合体に対する抗ＴｒａＴおよ び抗ＯｍｐＡ応答は第２ａ図に示した。　ｉ＋＊ｐの免疫増強活性を、ＢＳＡを ＴｒａＴ（−）又はＯａ＋ｐＡ（ローロ）に共有結合させて注射した場合、これ をＴｒａＴ（ムーム）又は○ｌ１ｌｐＡ（−一■）と混合して注射した場合、又 はこれをＴｒａＴ（Δ−△）又はＯｍｐＡ（・−・）とは別の部位に注射した場 合について調べた（第２ｄ図）。

第３ａ図はプラスミドｐＢＴＡ４４９、ｐＢＴＡ４３９およびｐＢＴＡ３７１の 構築を示す。

第３ｂ図はＴｒａＴおよびＴ　ｒａＴ　−Ｖ　Ｐ　７融き蛋白発現の５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥおよびウェスタン分析である。

第３ｃ図はＴｒａＴ（レーン１）又はＴｒａＴ　−Ｖ　Ｐ　７　（レーン３）を 発現する細胞表面標識Ｅ、ｃｏｌｉおよびコントロール（レーン３ンのオートラ ジオグラフィーの結果を示す、細胞は＋２５Ｉおよびラクトパーオキシダーゼで 標識した。

第４ａ図はプラスミドｐＢＴＡ４５０およびｐＢＴＡ５８６の構築を示す。

第４ｂ図はｐＢＴＡ５８６から発現されたＴｒａＴミンアクチビンハイブリッド 蛋白（ＴｒａＴ　ＴＭ　Ｉ　Ｎ）のＳＤＳポリアクリルアミドゲルを示す。

第３および第４図において、Ａｐｒはアンピシリン耐性、ＣｌＩｒはクロラムフ ェニコール耐性、Ｈｇ＋は塩化水銀、Ｔｃはテトラサイクリン、ＶＦ６はＶＰ７ 構造遺伝子、ＴｒａＴはＴｒａＴ楕遣遺伝子、Ｔ　ｒａＴ　−Ｖ　Ｐ　７はＴｒ ａＴとＶＦ６の遺伝子融合体、Ｐ　はラムダバクテリオファージＰ　プロモータ ー領域を表わすシ又制限酵素において、ＡＩは層重を、ＡはＮ阻Ｉを、ＤはＤｒ ａＩを、ＢはＢａ＋ｍＨＩを、ＥはＥｃｏＲＩを、ＮはＮｄｅＩを、ＰｖはＰｖ ｕ［を、ＲＶははＢｃｏＲＶを、そしてＳｓはΣ’Ｊ−１である。

日　ｔ・めの　の′。

下記の実施例は本発明の好ましい態様を開示するものであるが、これらは本発明 の範囲を限定するものではない。

夫將匠り 発酵話中で３０℃でＭＥＢ培地中で成育させた。４２℃でＴｒａＴを２時間熱誘 導した後に細胞を採取した。細菌をアミコンＤＣＩＯＬＡ濃縮器中、０．１μの 中空繊維カートリッジを使用して２１に濃縮しな０次いで細胞を１０１の蒸留水 で洗浄してこれを８００ｘｌに再濃縮した０次に細菌スラリーを濃縮物から分離 し、これに２００＊１の１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２，５）を加え次に４ ０％ＥＴＯＨおよびＩＭＣａＣＪ２中の１０％セトリミド（シグマ社）を１１加 えることにより細胞から外膜蛋白（ＴｒａＴ、ＯＭｐＡおよび０ｌｌｌｐＦ）を 抽出した。抽出物を１晩室温に放置してから遠心分離（１７，０ＯＯｘＦＩ、２ ０分間）により細菌を除去した。

エタノールを５０％まで加え次いで遠心分離（４０，０ＯＯｘｌ？、１０分間） することにより上ずみからＴｒａＴおよびＯｍｐＦを析出させた０次いでエタノ ールを８０％まで加えることによってＯ＋＋＋ｐＡを最終上ずみから析出させた 。

イ　ンｔ　りロマトグーフイー ＯｍｐＦおよびＴｒａＴを含有する５０％エタノールペレットを０．５％ツビッ タージェント（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）を含有する２０＋ｗＭ酢酸ナトリウム 緩衝液（ｐＨ５，０）中に再懸濁させて、これを０．１％ツビッタージェントを 含有する２０ｍＭ＃酸ナトリやム緩衝液（ｐＨ５，０）で予じめ平衡化した。５ Ｘ５０ｃｍのＤＥＡＥセファロースカラム（ファルアシアファインケミカル社） 中に装填した。ＴｒａＴはカラム中を流れるのが見られ、そして結合０＋＋＋ｐ Ｆを、平衡緩衝液中の０〜１．０ＭＮａＣ１の直線傾斜を使用してカラムから溶 出した。　Ｌａｅｍｍｌｉの方法（Ｌａｅｍｍｌｉ、英国、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏ ｎｄ）２２７：６８０．１９７０；５ａｌｉｔ等、Ｊ　Ｅｘ　Ｍｅｄ、１５１ニ ア１６．１９８０）の変法を使用して５ＤＳ−ＰＡＧＥにより両分を分析し、そ して単離ＴｒａＴ又はＯａ＋ｐＦを含有する両分を集めてエタノール沈降法によ り濃縮した。

セファクリルＳ−３００クロマトグーフイーＯｍｐＡを含有する８０％エタノー ルペレットを２０ｍＭ）リス−ＨＣｆ（ｐＨ８，８）中の１％ＳＤＳ中に再懸濁 させた０両分を集め、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、そしてＯｍｐＡを含有す る両分を集めてエタノール沈降により濃縮した。

上記方法により精製した蛋白は、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより検査しそしてＴｓａｉ 、Ｃ，Ｍ、およびＦ　ｒａｓｃｈ、Ｃ、Ｅ　、の方法（Δ□リユ旦ｊヤ上ニー、 １１９．１１５．１９８２＞により銀着色することによりＬＰＳを含有しないこ とがわかった。

−のジニトロフェニル ＴｒａＴ、ＯｍｐＡおよびＯ＋＊ｐＦをＬ　１ｔｔｌｅおよびＥｉｓｅｎの方法 （Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｉ＋＊ｍｕｎｏｌｏ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅ＊ １ｓｔｒ　、Ｅ、　Ｄ。

Ｗｉｌｌｉａｍｓ、ＣＡおよびＣｈａｓｅ、Ｍ　、　Ｗ；　Ｉ　、１２８ページ 、ＡｃａｄｅｍｉｃＰ　ｒｅｓｓ社、ニューヨーク、１９６７）によりジニトロ フェニル化した。簡単に言うと、担体（ｐ）（９，５の０．１Ｍ炭炭酸塩型炭酸 塩緩衝液中）をＤＮＦＢの０．１Ｍ溶液（アセトン中）と室温で１晩反応させた 。次いで蛋白を広範囲に亘り結合緩衝液に対して透析した。

グル　ル　ルーヒト　ム ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（シグマケミカル社製、Ｓｔ。

Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓ、米国）を、Ａｕｒａｍｅｕｓ等（１９７８年）の二工程 グルタルアルデヒド法を使用して、ＴｒａＴ、ＯｍｐＡおよびＯｍｐＦと結合さ せた。簡単に言うと、ＢＳＡを０．２％グルタルアルデヒドと室温で２時間反応 させた０次いで蛋白を炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９，５）に対して１晩透析 し、そしてｏｍｐをＢ　Ｓ　Ａ　：ｏｍｐのモル比１：１の割合で加えて室温で ２４時間反応させた。ｆｉ後にエタノールアミン（シグマ社）を加えて最終濃度 ０．１Ｍ（１時間、室温）とし、次いで０．１Ｍ炭炭酸塩型炭酸塩緩衝液（ｐＨ ９，５）に対して４℃で１晩透析した。

疲乳援欠 １、免ｉ１ ニューシーラント白ウサギ（２〜２．５Ａｇ）に、０．５ｚｌの無菌生理食塩水 中の抗原を筋肉内注射した。

注射は０日日と３６日目に行った。毎週ウサギの耳の縦静脈から採血して、被覆 抗原としてのＴｒａＴ、ＯｍｐＡ　、　Ｂ　Ｓ　Ａ又はＤＮＰヒツジＩｇＧを使 用しての標準ＥＬＩＳＡによりその抗体力価を測定した。

２、マウス 雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（１８〜２２ｇ）をＡｎｉｍａｌ　Ｒｅ５ｏｕｒｃｅ ｓＣｅｎｔｒｅ　（Ｐｅｒｔｈ、西オーストラリア）から入手した。抗原の経口 又は筋肉内投与の前３〜４時間、全部のマウスを断食した。

これらのマウスに、特別に用意した給餌針を使用して、０．１Ｍ炭炭酸塩型炭酸 塩緩衝液（ｐＨ９，５）の０．５ｚｌ中の適当な濃度の抗原を給餌させた。同投 与量の抗原を０．１ｚｌの無菌生理食塩水の形で左後足に筋肉内注射した。経口 又は筋肉内投与のいずれかで抗原を投与する５匹のマウス群には０日日と１４日 目に２回の同じ抗原投与をした。１４日目と２１日目に、後部眼窩最から血液サ ンプル（約０．５ｚ１）を採った０次いでマウスをを椎脱臼により殺して、次の ようにして小腸の腸洗浄を行った。まず小腸を注意深くとり出して小量の洗浄緩 衝液（１，Ｏｚｌ、３０＋＋＋Ｍ）リス−ＨｅｌｐＨ８，８，０，９％ＮａＣｌ 、５０＋＋＋Ｍ　ＥＤＴＡ＋１．０％トウィーン２０）を先端を丸めな給餌針で 腸内腔中に導入した。腸を静かにもんで内容物を人さし指と親指を使ってしぼり 出した。こうして洗浄した腸を次いですばやく遠心分離して残片を除去しそして 次に分析に使用するまで一２０℃で保存した。血液サンプルは４℃で凝血させて から血清を除去しそして一２０℃で保存した。

、七ムイムノソルベントアッセイ　ＥＬＩＳＡ　エーイ抗体力価測定のためのＥ ＬＩＳＡは、Ｒｕｓｓｅ　ｌ　Ｉ−Ｊ　ｏｎｅｓ等の方法（止ユ旦」疫シ！ｄ、 １６０：１４６）、１９８４）により行なった。力価は抗血清希釈の逆数で表わ され、これは３７℃４５分後のＥＬＩＳＡの読み０．５を与えた。

夫１匠ｌ に　“にお番るアジュバントの 筋肉内注射した場合に自己アジュバント分子として作用するｉｍｐの強度を測定 した。ＴｒａＴ（第１ａ図×−×）又はＢＳＡ（第１ｂ図×−Ｘ）を単独注射し た場合に得られる抗体力価を、ＴｒａＴ（第１ａ図）又はＢＳＡ（第１ｂ図）を 色々なアジュバントと混合した場合に得られるものと比較した。

食塩水中のＴｒａＴを筋肉内投与すると免疫剤に対する血清抗体の高力価がすば やく誘発された（第１ａ図）。実際に、食塩水中でのＴｒａＴによる力価は、こ の抗原を例えばモンタニドやＦＩＡ（第１ａ図）のようなアジュバント中の注射 液の形で注射することにより４倍増加したにすぎなかった。これは可溶抗原ＢＳ Ａによって起る応答とは正反対のものである。この場合は食塩水中の形で投与し た抗原に対しては弱い抗体応答が起ったが、しかしこの抗原をＦＩＡ又はモンタ ニド（第１ｂ図）中の形での注射によると著しく６０〜１００倍に増加した。

同様に、食塩水中のみでの０ｎｐＡやＯｍｐＦの注射では高血清Ａｂ力価が誘発 された。実際に驚くべきことには、１００μｓのＴｒａＴ、ＯｍｐＡ又はＯｍｐ Ｆの注射により同様の抗体力価が誘発された（第１ｃ図）。

夾茄應」− （−ｉｍ　ム　のアジュバント　の； ＴｒａＴおよびＯｍｐＡについてその抗ハブテン（ＤＮＰ）および抗蛋白（ＢＳ Ａ）応答を増強する作用を試験した。この２つのｉｍｐを、ジニトロフルオロベ ンゼンを使用してＤＮＰで置換（実施例１参照）するか、又はＢＳＡと架橋した グルタルアルデヒド置換（実施例１参照）し、次いで筋肉内注射した。

ＤＮＰ又はＢＳＡとＴｒａＴ又はＯｍｐＡのいずれかとの結合は抗ｉｍｐ応答の 生成にはほとんど影響がなかった（第２ａ図対第１Ｃ図）。

しかしながら、ｉｍｐをジニトロフェニル化したものについては、これを食塩水 の形で注射した場合に、ＤＮＰ−ＢＳＡに対して見られた応答よりも約４〜１６ 倍も高い抗ＤＮＰ応答の増加となった（第２ｂ図）。同様に、ＢＳＡをＦＩＡ中 の形で投与した場合も抗ＢＳＡ応答は著しく増強された（第２ｃ図）、そして抗 ＢＳＡ応答におけるＴｒａＴ又はＯｍｐＡの免疫増強作用は、ＢＳＡをｉｍｐと 共有結合させた場合に最大であった。実際にＢＳＡとｉｍｐとを別の部位に注射 した場合には、ＢＳＡに対する第２応答は現に低下したく第２ｄおよび２ｃ図） 。

火１」ＩＶ ＴｒａＴに　る　応“に　しての１　の筋肉内又は経口のいずれかによりマウス に投与するＴｒａＴの投与量を増加していった場合の作用結果を試験した。

１群５匹のマウス群に、筋肉内注射又は経口給餌によりＴｒａＴの投与量を増加 しながら免疫付与した、マウスへの投与はＯ日日と１４日目に行なった。２１日 目にマウスを出血させ、殺し、腸内洗浄した。抗体力価はＥＬＩＳＡにより測定 した。

表１かられかるように、経口又は非経口に投与するＴｒａＴの投与量を増加する と、この投与量に対応して血清抗ＴｒａＴＡｂ応答も増加した。

しかし非経口投与の方が経口投与よりもより効果的であった。

０．１　２，０４８±　９００　−　−　６＋２　７±　４１　３．５６５±１ ．３００　７　±　２．６　９±　３　６ｔｈ　２２　１０．８０９±１．９０ ０　２　±　２１３土　５　５６土　８５　５．４０５±　４００１３．９±　 ９２４±　３　４２±　７１０　２８．５２６±７．２８０１２．０±　２１６ ±　４　１８±　５２５　２４．８３３±６．０４０　９．１±　３　６±　２ 　７±　４５０　４９．６６７±１３．０２０　９７±　２５　９±　５　１１ ±　６１００　６５．５３６＋１６．０００　６４±　３６＝Ｚｏｏ　１５０， ５６２４６４．０００　６７５±　４００　３２±２０１４±　７４００　８６ ．４７５±１９．０００　９７±　４５　６±　２　２４±１３大ｍΣ ＤＮＰ応“　の一体としてイ用　るｉｍの　用　果に関してのハブーン　の； ＴｒａＴ、ＯｍｐＡおよびＯｍｐＦを、実施例１のようにして色々な割合のＤ　 Ｎ　Ｐ　：ｉｍｐで置換した。１群５匹のマウス群に、０日日と１４日目にＤＮ Ｐ：担体複合体を５０μｓの投与量で筋肉内注射した。２１日目にマウスを出血 させて、Ａｂ力価をＥＬＩＳＡにより測定した。

ＤＮＰ対担体の置換割合を０．５：１〜４：１と増加させると抗ハブテン応答が 著しく増加した。１０：１より多く置換すると、抗ハブテン応答は減少するよう に見られた。

前二−−一」− 抗原　Ｗ換割合　経　路　抗体応答（血清ＩｇＧ）ＤＮＰ　ＴｒａＴ　Ｏ，５： １　１．ＩＩ（筋肉内）２１＋１３１：１　１．＋＋＋　３３７　ｔｈ７１２： １　１．ｌ１１１５５２　±　５３６４：１　１．ｓ　３１０４　±　９５４Ｄ ＮＰ−ｏｍｐ＾　０．５：１　ｉ、…　−−１：１　１．＋ｎ　８４　±　２０ ２：１　１．ａ＋　２５６　±　１０９４：１　１．論　７７６　±　１６４ ＤＮＰ−ｏｍｐＦ　Ｏ，５：１　１．＋＊　７　±４１：１　１．ｓ　４９　± 　１２ ２：１　１．ｓ　９７　ｔｈ’２８ ４：１　１．ｍ　３３７　±　１１５ 去１」Ｌ［ ＴｒａＴとの　ムに　る　Ｃ８Ｐ　＃の　生次の配列を有するＰユＭμ」−のス ポロゾイト周辺蛋白（Ｃ３Ｐ）抗原由来の合成ペプチドを用意し、このペプチド 抗原に対するＴｒａＴのアジュバント効果を調べた。

グルタルアルデヒド又はマレイミド安息香酸ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエス テル（ＭＢＳ）のいずれかを使用して、ＣＰＳ抗原とＴｒａＴとを結合させた。

こうして作った接合体を（ａ）０日日と２８日目にウサギに注射し、次いでこれ から３８日目に採血するか、又は（ｂ）５匹のマウス群に０日日と１４日目に注 射した。マウスは次いで２１日目に採血した。上記と同様にして抗体力価を測定 した。

グルタルアルデヒド又はＭＢＳのいずれかを使用してＴｒａＴと結合させたＣ８ Ｐ抗原でウサギ又はマウスに免疫付与した結果、該抗原をＢＳＡと結合してセン タニド中の形で注射した場合に匹敵する抗Ｃ８Ｐ応答の増強が見られた。

宍−Ｕ ＣＳＰ−ＴｒａＴ　Ｍ　Ｂ　Ｓ　ウサギ　２００　１２，４１７　１，０２４Ｃ ５Ｐ＋をン９：　Ｆ　−−−ウサギ　２００　２８　−−−Ｃ５Ｐ−ＢＳＡ＋　 グ／Ｌ／　９　ル　ウサギ　２００　−−−　２，３５３モシタニド　アルデヒ ド Ｃ５Ｐ−ＴｒａＴ　Ｍ　Ｂ　Ｓ　マウス　５０　３，５６６　１２８ｃｓｐ÷モ ンタニド　−ｍ−マウス　５０　−−−ヌし刺しρ［７− ＴｒａＴ−、４の遺−自・　− ＴｒａＴ蛋白にコードする遺伝子をＲプラスミドＲ１００（又はＲ６−５）上に 置き、そしてこの遺伝子のスクレオチド配列を決定した（Ｏｇａｔａ等、Ｊ　、 　Ｂａｅｔｅｒｉｏｌ、１５１：８１！３−８２７）。ＴｒａＴは外膜中にある オリゴマーリボ蛋白であり、これは同時に細胞表面に表布しそして内部構造のペ プチドグリカンと一体となっている。これらの事実を利用して、最初にＴｒａＴ を含有するＲ１００プラスミドの８．０ｋｂＥｃｏＲＩ断片を多コピープラスミ ドｐＢＲ３２９中にクローニングすることによりプラスミドベクターを構築した （第３ａ図）、更に不用な３ｋｂＢａｍＨＩ断片を除去してそしてＭ　１３ｐ８ の小さい平滑末端Ｈａｅｌ［［断片をＥｃｏＲＶ部位へ挿入することにより不活 性化してｐＢＴＡ４４９を作った。このベクタープラスミドは、ＴｒａＴの合成 を司さどる天然ＴｒａＴプロモーターを含有している。ＴｒａＴ（又は引き続き 構築されるＴｒａＴ−ハイブリッド蛋白）の発現は、弱いＴｒａＴ天然プロモー ターを強力なラムダバクテリオファージＰＬプロモーター（例えば第３ａ図にお けるプラスミドｐＢＴＡ４３９中又は第４＆図におけるプラスミドｐＢＴＡ５８ ６中）で置換することにより強めることができる。ＴｒａＴ遺伝子はＥｃｏＲＶ 部位（ｐＢＴＡ４４９に特有のもの）を含有しており、ここに外来ＤＮＡ配列を 挿入することができ、これによりＴｒａＴとそのコードする外来蛋白との融合体 を正しく細胞表面に放出しそして該細胞表面において外来蛋白分が表布できるよ うになる。

１例としてウィルスのカプシド蛋白（ＶＦ６）の遺伝子を使用してＴｒａＴ　− Ｖ　Ｐ　７ハイブリツド蛋白を作った。ＶＦ６はロタウィルスの構造蛋白であり 、そして精製ＶＰ蛋白に対して生成した抗体は細胞培養体中のウィルス伝染性と 効果的に中和する（Ｄｙａｌｌ　−Ｓｍ１ｔｈ等、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉ ａｒｒｈｏｅａ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｏｕｎｅｄ　ＳユＴｚｉｐｏｒｉ、１９８５年 ）、このようにほとんど発現形であるＶＰ７蛋白はロタウィルスワクチン中に混 入される第１候補物である。

ロタウィルスＮＣＤＶ　ＶＰ７遺伝子のＡｌｕＩ　ＰｕｕＩ　Ｉ制御断片をプラ スミドｐＢＴＡ４４９のＥｃｏＲＶ部位中に部位−ニングしそして引き続きＰＬ プロモーターで超発現させた（ｐＢＴＡ３７１、第３ａ図）０発現用にプラスミ ドｐＢＴＡＢ７１を使用して、ラムダの熱可変ＣＩリプレッサーを含有するＥ、 　ｅｏｌｉＫ　−１２株Ｎ４８３０（Ｊｏｙｃｅ等、ＰＮＡＳ８０．１８３０− １８３４．１９８３）を形質転換した。ｐＢＴＡ３７１で形質転換した細胞を１ ００μｇ／ｗｌのアンピシリンを添加したＨＥＢ培地（Ｍｏｔｔ等、Ｐ　Ｎ　Ａ 　Ｓ　８２．８Ｂ　−９２，１９８５）中３０℃で１晩生育させた。細胞をＭＥ Ｂ培地中で希釈し、３０℃で生育させて１．０のＯＤ　６００となった時に、予 熱（６５℃）したＭＥＢ培地を等１加えて温度を４２℃に平衡化した。４２℃で 更に４時間生育させてから、細胞を採取しそしてＴ　ｒａＴ　−Ｖ　Ｐ　７ハイ ブリツド蛋白が誘導されているかどうかを調べた。　Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｎ４８３ ０中には高レベルのＴｒａＴ　−Ｖ　Ｐ　７蛋白後合体の発現（全細胞蛋白の１ ０〜１５％、細胞あたりｓｏｏ、ｏｏｏコピー以上）が観察された。この複合体 の大部分は外膜画分中に存在していた（第３ｂ。

３ａ図）。

もう１つの例として、ＴｒａＴ蛋白コード配列の１部と真核蛋白コード配列ミン アクチビンの全部又は１部とのハイブリッドである蛋白の製造方法を以下に述べ る。

第４ａ図に示すように、プラスミドｐＢＴＡ４４０を足並■およびＤｒａＩで消 化して、１１１０ｂ、断片をアガロースゲルから単離した。この断片を、Ｅｃｏ ＲＶ創生ｐＢＴＡ４５０で消化したベクターｐＢＴＡ４４９にライゲートした０ 次いでｐ　Ｂ　Ｔ　Ａ　４５０を恒Ｉで消化し、そして精製２８００ｂｐ断片を 、ＡｕａＩで消化したプラスミドｐＬＫ５７にライゲートしてプラスミドｐＢＴ Ａ５８６を創生した。

これはラムダＰＬプロモーター支配下のミンアクチビンコード配列の１部を成す ものであり、ＴｒａＴ遺伝子の最初の８０アミノ酸のコード配列に融合していて 、そのアミノ酸の内の最初の２０個はＥ、ｃｏｌｉの外膜中に現われるハイブリ ッドとなるシグナル配列を構成するものである。このシグナル配列はＴｒａＴ蛋 白の正常表在位である外膜への移動中に開裂する。

プラスミドｐＢＴＡ５８６をＮ　４８３０のような適当な宿主中に形質転換して 、上記のような温度シフト下に誘発処理すると、第４ｂ図に見られるようにＴｒ ａＴ−ミンアクチビンハイブリッド蛋白が外膜画分中に現われる。

Ｋ１匠影 ＴｒａＴ　タ　に　る　のχロ 雌Ｃ５７Ｂ　１　／６５マウス（２０〜２５ｆＩ）に、外膜中にＴｒａＴを発現 する細菌（Ｅ、ｃｏｌｉ又はＳ　、ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのｇａｌＥ−変異株 ）を１０９〜１０１°個与えた。コントロール群にはＴｒａＴ蛋白のない同じ菌 株を与えた。１週間後にマウスから採血して上記した方法により抗ＴｒａＴ力価 を測定した。

結果を表■に逆数抗体力価として示した。これは１０匹のマウスの平均値である 。

民−ＩＶ １口　した　に　る　“ 抗ＴｒａＴ　抗ＯｍｐＡ ｕ　ＴｒａＴ　！ｆｉｎ　腸−１血　腸−Ｅ、ｃｏｌｉ　３　５．２　１４　２ ＋　３５０　１５　１１０　２ Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａ　−１２２ＮＤ　ＮＤ＋　６５０　６　ＮＤ　ＮＤ （ＮＤ）：試験せず 産−上のｆ　口　。

本発明はヒト、ベットおよび食用動物用のワクチンであっズそして一般に経口、 経腸又は非経口投与における抗原に対すン応答を増強し得るワクチンの製造用に 有用である。

て る ａ４４（刀イｒａｙ　＜−ｔｏｒｌｏ）抗濁切菊（−１０９１Ｑ） ＦＩＧＵＲＥ　３ａ、７’７又ミド渭１臥ＦＩＧＬＩＲＥ　３ａ、フ６り又ミド ＃菓”Ｊｉ　ＴＴａ、Ｔ　ＪｔＣＪｔＥＳＡ　１１　ｒ７１　＝２　ｊ’。

ＦＩＧＵＲＥ３Ｃ，Ｅ、ｃｏｈのＨｐｒ’ｅ、ｅａｌｔＱネｍ正書の副Ｊ訳文」 是出書 （特許法第１８４条の７） （第１項の規定による補正書） 昭和６２年１２月）７日

Claims (42)

【特許請求の範囲】
1. １．担体分子と結合した免疫原から成る複合体であって、この複合体を非経口的 、経腸的又は経口的であるかどうかを問わず宿主に投与した時に、該担体分子が 該宿主の免疫原に対する免疫応答を増強する作用を有するものであって、そして 該免疫原が抗原又はハプテンのいずれかから成り、該担体分子が原核生物又は真 核生物由来の内存性膜蛋白から成るものである該複合体。
2. ２．該担体分子がグラム陰性細菌の外膜蛋白である、請求の範囲第１項に記載の 複合体。
3. ３．該担体分子がＥ．ｃｏｌｉ又はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種の膜蛋白である、請 求の範囲第２項に記載の複合体。
4. ４．該膜蛋白がＥ．ｃｏｌｉ株により産生されるＴｒａＴ蛋白、外膜蛋白Ｏｍｐ Ａ又は外膜蛋白ＯｍｐＦである、請求の範囲第３項に記載の複合体。
5. ５．該膜蛋白が蛋白ＴｒａＴである請求の範囲第４項に記載の複合体。
6. ６．免疫原がＣＰＳ、ロタウイルス由来のウイルスカプシド蛋白ＶＰ７又はミン アクチビンの全部又は１部である、請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載の複 合体。
7. ７．担体と免疫原との結合が化学的方法によって行なわれるものである、請求の 範囲第１〜６項のいずれかに記載の複合体。
8. ８．該結合が接合剤又は結合剤のいずれかを使用する化学接合によるものである 、請求の範囲第７項に記載の複合体。
9. ９．該接合剤又は結合剤が１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル） カルボジイミド、グルタルアルデヒド、ｍ−マレイミド安息香酸ｎ−ヒドロキシ スクシンイミドエステル又はＮ，Ｎ１−ジシクロヘキシルカルボジイミドである 、請求の範囲第８項に記載の方法。
10. １０．該結合剤がジスルフィド結合を含有するか、又は酸、塩基又は過よう素酸 塩で開製可能なものである、請求の範囲第８項に記載の複合体。
11. １１．該結合剤がＮ−（４−アジドフェニルチオ）フタルイミド、４，４′−ジ チオビスフェニルアジド、ジチオビス−（スクシンイミジルプロピオネート）、 ジメチル−３，３′−ジチオビスプロピオンイミデート・２ＨＣｌ、３，３′− ジチオビス−（スルホスクシンイミジルプロピオネート）、エチル−４−アジド フェニル−１，４−ジチオブチルイミデート・ＨＣｌ、Ｎ−スクシンイミジル− （４−アジドフェニル）−１，３′−ジチオ−プロピオネート、スルホスクシン イミジル−２−（ｍ−アジド−Ｏ−ニトロベンズアジド）エチル−１，３′−ジ チオプロピオネート、スルホスクシンイミジル２−（ｐ−アジドサリチルアミド ）−エチル−１，３′−ジチオプロピオネート、Ｎ−スクシンイミジル−３−（ ２−ピリジルジチオ）プロピオネート、スルホスクシンイミジル−（４−アジド フェニルジチオ）−プロピオネート、２−イミノチオランジスクシンイミジルタ ートレートおよびビス−〔２−（スクシンイミジルオキシカルボニルオキシ）− エチル〕スルホンから選択したものである、請求の範囲第１０項に記載の複合体 。
12. １２．該結合剤が２−イミノチオランジスクシンイミジルタートレートおよびビ ス−〔２−（スクシンイミジルオキシ−カルボニルオキシ）−エチル〕スルホン である、請求の範囲第１１項に記載の複合体。
13. １３．担体分子と免疫原とを化学的方法により結合させることから成る、請求の 範囲第１〜１２項のいずれかに記載の複合体の製造方法。
14. １４．下記の工程、すなわち、 （ａ）免疫原と担体とを反応させて該複合体を作る、（ｂ）免疫原を化学的に変 成して化学結合形成可能な少なくとも１個の官能基を導入し、そして変成した免 疫原と担体とを反応させて該複合体を作る、 （ｃ）担体を化学的に変成して化学結合形成可能な少なくとも１個の官能基を導 入し、そして免疫原と変成担体とを反応させて該複合体を作る、 （ｄ）免疫原と担体とを化学的に変成して化学結合形成可能な官能基を導入し、 そして変成免疫原と変成担体とを反応させて該複合体を作る、 （ｅ）免疫原と少なくとも１個の結合剤とを反応させ、そして結合免疫原と担体 分子とを反応させて該複合体を作る、（ｆ）担体と少なくとも１個の結合剤とを 反応させ、そして免疫原と結合担体とを反応させて該複合体を作る、（ｇ）免疫 原および担体を少なくとも１個の結合剤と反応させ、そして結合免疫原と結合担 体とを反応させて該複合体を作る、 工程の１つ又はそれ以上から成る方法である、請求の範囲第１３項に記載の方法 。
15. １５．（ｉ）免疫原を化学的に変成して化学結合形成可能な少なくとも１個の官 能基を導入し、そして（ｉｉ）変成免疫原と担体とを反応させて該複合体を作る 、工程から成る方法である、請求の範囲第１４項に記載の方法。
16. １６．該結合が遺伝子的結合によるものである、請求の範囲第１〜６項のいずれ かに記載の方法。
17. １７．複合体がハイブリッド蛋白分子から成るものである、請求の範囲第１６項 に記載の複合体。
18. １８．組換えＤＮＡ技術によりハイブリッド蛋白分子を作ることから成る、請求 の範囲第１７項に記載の複合体の製造方法。
19. １９．免疫原をコードするＤＮＡを、担体をコードするＤＮＡ配列中に挿入する か又はこれに加えることにより複合体を作ることから成る、請求の範囲第１８項 に記載の方法。
20. ２０．免疫原のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列に融合し原核生物又は真核 生物由来の内存性膜蛋白の少なくとも１部をコードする配列として作用するＤＮ Ａ配列から成る第１のＤＮＡ配列；又は天然、合成および半合成源を含めてのい かなるものから得られたものでも良い、該第１のＤＮＡ配列とハイブリダイズす る第２のＤＮＡ配列；単一又は複数の塩基置換、除去、挿入および転位を含めて の変異による、該第１のＤＮＡ配列関連ＤＮＡ配列；又は前記ハイブリッドＤＮ Ａ配列およびインサートのいずれかのコドンを発現時にコードするポリペプチド と同様の免疫的又は生物学的活性を示すポリペプチドを発現時にコードするコド ンの配列から成るＤＮＡ配列、から成るハイブリッドＤＮＡ配列。
21. ２１．該ハイブリッドＤＮＡ配列が免疫原のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配 列に結合したＴｒａＴ、ＯｍｐＦ又はＯｍｐＡの少なくとも１部をコードするも のである、請求の範囲第２０項に記載のハイブリッドＤＮＡ配列。
22. ２２．該ハイブリッドＤＮＡ配列が、免疫原のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ 配列に結合したＴｒａＴの少なくとも１部をコードするものである、請求の範囲 第２１項に記載のハイブリッドＤＮＡ配列。
23. ２３．該ＤＮＡ配列が宿主細胞の表面に移動しそして表在することのできるＴｒ ａＴ、ＯｍｐＦ又はＯｍｐＡハイブリッド蛋白をコードするものである、請求の 範囲第２１又は２２項に記載のハイブリッドＤＮＡ配列。
24. ２４．可動プロモーターに融合した請求の範囲第２０〜２３項のいずれかに記載 のハイブリッドＤＮＡ配列から成る融合遺伝子。
25. ２５．プロモーターがバクテリオファージラムダ（λ）のＰＬプロモーターであ る、請求の範囲第２４項に記載の融合遺伝子。
26. ２６．請求の範囲第２０〜２５項に記載のハイブリッドＤＮＡ配列又は融合遺伝 子とベクターＤＮＡとから成る組換えＤＮＡ分子。
27. ２７．ベクターＤＮＡがプラスミド、バクテリオファージ又はウイルス又はコス ミド由来のものである、請求の範囲第２６項に記載の組換えＤＮＡ分子。
28. ２８．ハイブリッドＤＮＡ配列と作動可能に結合した発現コントロール配列を含 有して成る、請求の範囲第２７項に記載の組換えＤＮＡ分子。
29. ２９．組換えＤＮＡ分子ｐＢＴＡ３７１、ｐＢＴＡ４３９、ｐＢＴＡ４４９、ｐ ＢＴＡ４５０又はｐＢＴＡ５８６。
30. ３０．ベクターＤＮＡ中に請求の範囲第２０〜２７項のいずれかに記載のハイブ リッドＤＮＡ配列又は融合遺伝子を導入することから成る、請求の範囲第２６〜 ２９項のいずれかに記載の組換えＤＮＡ分子の製造方法。
31. ３１．該ベクターＤＮＡ中に更に発現コントロール配列を導入する工程を有して 成る、請求の範囲第３０項に記載の方法。
32. ３２．請求の範囲第２６〜２９項のいずれかに記載の組換えＤＮＡ分子の少なく とも１つで形質転換された宿主細胞から成る形質転換宿主。
33. ３３．宿主がＥ．ｃｏｌｉ又はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種である、請求の範囲第３ ２項に記載の形質転換宿主。
34. ３４．ＡＴＣＣ６７３３１。
35. ３５．請求の範囲第２６〜２９項のいずれかに記載の組換えＤＮＡ分子を宿主中 へ導入することから成る、宿主の形質転換方法。
36. ３６．免疫系に付与されるものである、細菌細胞表面に表在する請求の範囲第１ ６項に記載のハイブリッド蛋白から成る、全細菌細胞ワクチン。
37. ３７．生又は死全細胞経口ワクチンである、請求の範囲第３６項に記載の全細胞 ワクチン。
38. ３８．細胞膜又は細胞内容物から精製した請求の範囲第１７項に記載のハイブリ ッド蛋白から成るワクチン。
39. ３９．免疫原と原核生物又は真核生物由来のｉｍｐの少なくとも１部から成る担 体とから少なくとも成るハイブリッド蛋白の生合成の遺伝情報を有する微生物で あって、その生成したハイブリッド蛋白が宿主細胞表面に表在するような微生物 の製造方法であって、その必要な遺伝情報を有する微生物を培養することから成 る前記製造方法。
40. ４０．請求の範囲第３９項に記載の方法により作った微生物の細胞膜又は細胞内 容物から請求の範囲第１７項に記載のハイブリッド蛋白を精製することから成る サブユニットワクチンの製造方法。
41. ４１．宿主に非経口、経口又は経腸投与する形態の担体と免疫原との複合体の製 造方法であって、該複合体を作りそしてこれを薬学的に許容される希釈剤に加え ることから成る前記製造方法。
42. ４２．宿主に非経口、経腸又は経口投与するのに適した形態の、請求の範囲第１ 〜６項のいずれかに記載の複合体。