JP2633457B2 - ネコ科白血病ウイルス感染の予防方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明はネコ科白血病ウイルス
(felime leukemia virus)(ＦeＬＶ)疾患の免疫予防に関
する。

【０００２】

【従来の技術】ＦeＬＶ ＦeＬＶはネコ類において新生物疾患及び非新生物疾患
の両者を惹起する伝染性の発癌性ＲＮＡウイルスであ
る。ＦeＬＶ感染はネコ類における疾患関連死の主要な
原因である。ＦeＬＶの複製の過程でウイルスＲＮＡゲ
ノムのＤＮＡコピーが作られ、そして感染された細胞の
ＤＮＡ中に挿入される。組み込まれたＦeＬＶ ＤＮＡ
は、感染された細胞から放出される一層多くのウイルス
の複製をコードする。宿主の遺伝子との組換によってネ
コ科肉腫ウイルス(felime sarcomavirus)(ＦeＳＶ)が生
ずることによって、このウイルスは細胞形質転換を惹起
することができる。

【０００３】ＦeＬＶゲノムは、インターバルウイルス
蛋白質をコードするg ag遺伝子、ウイルスＲＮＡ依存Ｄ
ＮＡポリメラーゼ(逆転写酵素)をコードするpol遺伝
子、並びにウイルスエンベロープ蛋白質gp７０及びp１
５Ｅをコードするenv遺伝子から成る６０−７０Ｓ単鎖
ＲＮＡである。

【０００４】ウイルス干渉試験及び中和試験は、エンベ
ロープ抗原の３種類のサブグループ(Ａ、Ｂ及びＣと称
される)であって、類似しているがしかし相互に異な
り、そして３種類の認識されたＦeＬＶサブグループ(や
はりＡ、Ｂ及びＣと称される)を生じさせるものが存在
することを示した。

【０００５】ＦeＬＶに暴露されたネコの連命はＦeＬＶ
…特にＦeＬＶエンベロープ抗原に対するその免疫反応
に依存するであろう。研究は、暴露された集団の約４０
％が高力価の抗−ＦeＬＶエンベロープ抗体を示しそし
て免疫となり、約３０％が適切に反応せずそして持続的
に感染し、そして約３０％は感染せずそして免疫されな
いが感受性のままであることを示した。暴露された集団
の有意な部分が自然免疫を獲得するという事実は、研究
者をして、種々の物質をＦeＬＶに対するワクチンとし
て試みさせる。不活性化されたウイルスは高投与量でな
ければ効果的でないことが見出された。精製されたgp７
０もまた一般にワクチンとして効果的でないことが見出
された。殺された腫瘍細胞は白血病の予防には有効であ
るが、ウイルス血症に対してはそうでないことが報告さ
れている。ＦeＬＶに感染された細胞系(ＦＬ−７４)の
組織培養培地から得られる可溶性腫瘍細胞抗原も試みら
れ、そしてＦeＬＶウイルス感染の誘導を予防するため
に有効であることが見出された。

【０００６】微生物的に生産されたワクチン サイエンス(Ｓcience)(１９８１)２１４:１１２５−１
１２８及び英国特許出願ＧＢ２１０３６２２Ａは、口蹄
疫(foot−and−disease virus)(ＦＭＤＶ)ワクチンとし
て有用な微生物的に生産されるポリペプチドを記載して
いる。相補的ＤＮＡ(cＤＮＡ)断片が、キャプシド蛋白
質ＶＰ３をコードするＦＭＤＶゲノムの部分から調製さ
れた。これらのcＤＮＡ挿入部がトリプトファン(trp)プ
ロモーターを含有する細菌プラスミドに導入され、そし
てこの組換体プラスミドがコンピテントＥ．コリ(Ｅ．c
oli)を形質転換するために使用された。この組換体細菌
は、trpリーダー及びtrpＥ遺伝子の一部分によりコード
されるポリペプチドとＡＰ₃挿入部によりコードされる
ポリペプチドとから成る融合蛋白質を発現した。この融
合蛋白質は精製され、そして抗−ＶＰ₃抗体を結合する
その能力及び家畜におけるＦＭＤＶ感染を予防するその
能力についてイン−ビトロ及びイン−ビボにおいて試験
された。サイエンス(Ｓcience)(１９８１)２１９:６１
４−６２０は、狂犬病ウイルスゲノム由来の遺伝子の組
換体Ｅ．コリにおける発現による狂犬病ウイルスの表面
蛋白質の合成を記載している。

【０００７】ワクチン処理方法 エミニ等、ネイチュアー(Ｎature)(１９８１)３０４:６
９９−７０３は、ポリオウイルス由来の合成ペプチドに
対する免疫反応を相乗強化するために低い感染量より少
ない(subinfecfious)量及び保護量より少ない(subprote
ctive)量の生ポリオウイルスが使用され得ることを報告
している。あたかも、最初の合成ワクチンが免疫系を
“開始"(prime)し、そして次のウイルス性追加免疫(boo
st)が有効な液性反応(humoral response)における最初
に開始された免疫反応の増幅を可能にするかのようであ
る。他の研究者は、微生物的に生産された(組換体)ワク
チンを用いて同様の知見を報告している。これらは、ポ
リオウイルス及び肝炎Ｂウイルス(組換体によって開始
／生ウイルスによって追加免疫)、及び口蹄疫ウイルス
(組換体によって開始／殺されたウイルスによって追加
免疫)を包含する。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的はＦｅＬ
Ｖ感染の優れた予防方法を提供することにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、ポリペプチド
の免疫原的量をアジュバントと共に含んでなるワクチン
によりネコ科動物を免疫感作することよりなるネコ科白
血病ウイルス（ＦｅＬＶ）感染の予防方法であって、該
ポリペプチドが、ネコ科白血病ウイルスサブグループＢ
ｇｐ８５蛋白の２１０−２５０領域および４１５−４５
０領域に出現するネコ科白血病ウイルスのｇｐ８５エン
ベロープ蛋白質のアミノ酸配列の少なくとも部分と相同
なアミノ酸配列を含んで成り、そしてネコにおいて液性
反応を開始又は誘発する免疫原でありそしてネコ科白血
病ウイルス感染に対してネコを免疫するのに有用な、場
合によっては他の蛋白質との融合蛋白質として又はキャ
リヤー蛋白質と連結された共有結合体として存在する、
天然に存在するネコ科白血病ウイルスエンベロープ蛋白
でない微生物的に生産されたポリペプチドである； ことを特徴とする当該方法を提供するものである。

【００１０】また、ＦeＬＶの抗原決定基を規定するア
ミノ酸配列を含んで成り、そしてネコにおける液性反応
を誘発し又は開始するため、及びＦeＬＶ感染に対して
ネコを免疫するために有用なポリペプチドも記載する。
これらのポリペプチドは、(１)このようなアミノ酸配列
をコードするＦeＬＶ env ＤＮＡ配列を含有する組換
体ＤＮＡの微生物中での直接発現により、又は(２)小ポ
リペプチドの場合には常用のポリペプチド合成法により
製造することができる。精製されたgp７０蛋白質は有効
なＦeＬＶワクチンでなかったことを従来技術が報告し
ているから、これらのポリペプチドの免疫原性は予想さ
れない。

【００１１】微生物的に生産されるポリペプチドは、Ｆ
eＬＶのgp７０エンベロープ蛋白質のアミノ酸配列の少
なくとも一部分と相同なアミノ酸配列を含んで成り、そ
してネコにおいて液性反応を誘発又は開始し且つＦeＬ
Ｖ感染に対してネコを免疫する免疫原である。このよう
な蛋白質の１つの群は、抗原決定基を規定するネコ科白
血病ウイルスのgp７０エンベロープ蛋白質の部分に融合
したtrpＥ蛋白質の部分及びtrpリーダーペプチドの部分
を含んで成る、Ｅ．コリにより生産された融合蛋白質で
ある。この群のポリペプチドは、入手可能な分子クロー
ン化ＦeＬＶＤＮＡ配列からenv遺伝子の断片を単離し、
又はenv遺伝子断片を合成し、該断片を、プラスミドを
有するＥ．コリの発現を指令するＥ．コリtrp ＬＥ'配
列を複製可能なプラスミドに導入し、そして得られた形
質転換体を適切な細菌培養培地中で増殖せしめることに
より作られた。このポリペプチドは、細胞を溶解し、該
溶解物からＥ．コリエンドトキシンを除去し、そしてジ
スルフィド結合を開裂せしめる還元剤で前記溶解物を還
元することによってＥ．コリ細胞から取り出すことがで
きよう。次に、この物質を再酸化するのが好ましい。

【００１２】免疫原性であると同定されたgp７０蛋白質
の部分は、標準的ポリペプチド合成技法により合成し、
そして担体蛋白質と連結して有効なＦeＬＶ免疫原を製
造することができる。

【００１３】ポリペプチド、又はポリペプチドー担体蛋
白質共有結合体はワクチンとして使用するために適当な
アジュバント及び非経口ビークルと混合される。ネコに
これらのワクチンの免疫量を非経口的に投与することに
より、ネコをＦｅＬＶに対して免疫することができる。
これらは好ましくは免疫反応を開始するために使用さ
れ、そして次に殺されたウイルス又は感染量より少ない
量の生ウイルスにより追加免疫が行われる。

【００１４】微生物的に生産されたポリペプチドは幾つ
かの観点において天然ＦeＬＶエンベロープ蛋白質と異
なる。このポリペプチドの実質的な部分又はすべてが天
然ＦeＬＶgp７０蛋白質の配列と相同であろうが、ほと
んどの場合はそれは天然gp７０蛋白質のアミノ酸配列の
部分のみを含んで成るであろう。これらのポリペプチド
はまたp１５Ｅ蛋白質の部分を含有する。さらに、前記
相同な配列が微生物によって生産されるので、天然gp７
０のようにプロセシング(すなわちグリコシル化)されな
いであろう。融合蛋白質である具体例、例えばtrpＬＥ'
−gp７０融合蛋白質は、天然gp７０にとって外来性であ
るアミノ酸配列を含む。このようなポリペプチドの二次
構造及び三次構造は、グリコシル化の不存在又は外来性
アミノ酸配列の存在のために天然gp７０と異なるであろ
う。これらの相違は免疫的相違に反映されるであろう。

【００１５】融合蛋白質の好ましい群は、gp８５蛋白質
のおよそアミノ酸２１０及び２５０の間に存在するgp７
０蛋白質の親水性領域及びgp７０−p１５Ｅ連結部すな
わちおよそアミノ酸４１５及び４５０の間(gp８５分子
の仮定される出発部から数え始める)に存在する親水性
領域の少なくとも１つの全部又は実質的部分と相同であ
るアミノ酸のセグメントを含むポリペプチドである。

【００１６】ポリペプチドの特定の好ましい群は、次の
アミノ酸配列(アミノ酸の番号はＦeＬＶ−３のgp８５分
子の仮定される出発部から始まる)のいずれかの１又は
複数の反覆を含むポリペプチドである。 (a) met gly pro asn leu val leu pro asp gln lys pr
o pro ser (この配列はＧＡ ＦeＬＶ−Ｂのgp７０蛋白
質のアミノ酸２１３−２２６に存在する): (b) asp gln lys pro pro ser arg gln ser gln ile gl
n (この配列はＧＡＦeＬＶ−Ｂのgp７０蛋白質のアミノ
酸２２１−２３１に存在する）: (c) pro glu tyr val tyr thr his phe asp lys thr va
l arg leu (この配列はＳＴ ＦeＬＶ−Ｂのgp７０蛋白
質のアミノ酸４１７−４３０に存在する): 及び (d) asp lys thr val arg leu arg arg glu pro ile se
r leu (この配列はＳＴ ＦeＬＶ−Ｂのgp８５蛋白質の
アミノ酸４２５−４３７、すなわちgp７０蛋白質の最後
の８アミノ酸及びp１５Ｅ蛋白質の最初の５アミノ酸に
存在する)。

【００１７】好ましい微生物的に生産される融合蛋白質
に代わるものとして、上記のセグメント又は配列(１又
は複数の反覆)を合成し、そして適当な蛋白質担体に連
結して有効なＦeＬＶ免疫原を製造することができる。

【００１８】連結部位を与えるため、このセグメント又
は配列にシステインを加えることができる。レーナー
等、ＰＮＡＳ（１９８１）７８：３４０３−３４０７
は、小ポリペプチドを担体蛋白質に連結して免疫原を製
造する方法を記載している。他の連結法がカーチ（ｃｈ
ｕｒｃｈ）、Ｗ．Ｒ．等、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）（１９８
３）８０：２２５、Ｏ’スリバン、Ｍ．Ｊ．及びマーク
ス、Ｖ．、メソズ・イン・エンチモロジー（Ｍｉｔｈｅ
ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８１）７３：
１４７−１６６、及びエルランジャー、Ｂ．Ｆ．、メソ
ズ・イン・エンチモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８０）７０：８５−１０４に
記載されている。使用することができる担体蛋白質の例
は、キーホールリンペット（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐ
ｅｔ）ヘモシアニン、卵アルブミン、ブターチログロブ
リン、ウシ血清アルブミンである。ポリペプチドと担体
蛋白質との共有結合体を調製するための連結剤には、蛋
白質を連結するために使用される常用の架橋剤、例えば
アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−ジア
ゾ化ベンザジン、カルボジイミド、サクシンイミド、及
びイミデートが含まれる。

【００１９】この明細書において、ＦeＬＶ株ＧＡ及び
ＳＴ[これらの株のenv遺伝子のヌクレオチド配列及び推
定されるアミノ酸配列は出願人によりジャーナル・オブ
・ビロロギー(Ｊ．Ｖirol ．)(１９８４)４９: ６３０に
報告されている]、Ｅ．コリ形質転換体によるtrpＬＥ'
及びＦeＬＶ−ＧＡgp７０配列の融合蛋白質の発現、並
びにgp７０又はgp７０−p１５Ｅ連結配列に相同な抗原
ポリペプチドと抗体蛋白質との接合体の合成に言及して
具体的に例示される。しかしながら、他のＦeＬＶ株及
びサブグループのgp７０又はgp７０−p１５Ｅ配列に相
同な配列を含むポリペプチド、gp７０配列がtrpＬＥ'配
列以外のＤＮＡの発現に由来するポリペプチドに融合し
ている融合蛋白質、及びＥ．コリ以外の形質転換可能な
微生物、例えば他の細菌及び酵母又はウイルスによるポ
リペプチドの発現(これらの生物中で異種性遺伝子配列
を複製し、そして発現することができるベクターを使
用)を包含することが意図されることが評価されるであ
ろう。

【００２０】従って、例示によって次の例が与えられる
が、何らこの発明を限定することは意図されない。例に
おいて使用される略号は、ＤＴＴはジチオスレイトー
ル; ＡＴＰはアデノシントリホスフェート; dＴＴＰは
デオキシチミジントリホスフェート; ＳＤＳはドデシル
硫酸ナトリウム; ＳＤＳ−ＰＡＧＡはドデシル硫酸ナト
リウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動; ＥＤＴＡは
エチレンジアミン四酢酸; Ａcはアセテート、ＢＳＡは
ウシ血清アルブミン; ＥＬＩＳＡはエンザイムリンクド
イムノソルベントアッセイ; ＤＥＡＥはジエチルアミノ
エチル; ＡＢＴＳは２,２'−アジノ−ジ−(３−エチル
ベンズチアゾリンスルホン酸; ＨＦは弗化水素酸をそれ
ぞれ示す。

【００２１】例 一般的方法 核酸の操作において使用されるすべての酵素はニューイ
ングランドビオラブスもしくはベセスダリサーチラブス
のいずれかから入手し、又は製造者の推奨する方法によ
って調製した。ＤＮＡの消化及び連結、ゲル電気泳動に
よるＤＮＡ断片の単離、並びに細菌宿主の形質転換及び
選択のために使用される条件は組換ＤＮＡの分野におい
て当業者によく知られている標準的方法である。この発
明の実施において使用されるこれらの及び他の分子クロ
ーニング技法は、マニアチス等、“モレキュラー・クロ
ーニング: ア・ラボラトリー・マニュアル(Ｍolecular
Ｃloning: Ａ Ｌaboratory Ｍanual)" 、コールドスプ
リングハーバーラボラトリーズ(１９８２)に見ることが
できる。

【００２２】制限酵素によるＤＮＡの消化は、特に断ら
ない限り完全消化であり、そして３７℃にて１〜５ユニ
ット酵素／μgＤＮＡ、３０〜６０分を必要とする。幾
つかの消化は意図的に部分的であり、この場合各分子上
のすべての部位により少ない部位が消化される。これら
は一般に３７℃にて０.０５〜０.５ユニット酵素／μg
ＤＮＡ、１０〜６０分間で行われる。

【００２３】Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いる連結は、接着
末端の連結のためには０.１mＭ ＡＴＰ及び０.０１〜
０.０５weissユニットのリガーゼ／２０μl反応、又は
平滑末端の連結のためには１.０mＭ ＡＴＰ及び１.０
〜５.０weissユニットのリガーゼ／２０μl反応を含有
する６６mＭ Ｔris−ＨＣl(pＨ７.６)、６.６mＭ Ｍg
Ｃl₂ 、１０mＭ ＤＴＴ中で行われる。反応は１４℃に
て６〜１２時間行われる。分子間反応は、接着末端連結
のためには２０〜１５０μg／mlのベクターＤＮＡを必
要とし、そして平滑末端連結のためには１００〜２００
μg／mlのベクターＤＮＡを必要とする。挿入ＤＮＡに
おいてはベクターＤＮＡを超えて１〜２０倍過剰量が維
持される。分子内反応は１０〜２０μg／mlのベクター
ＤＮＡを必要とする。

【００２４】ＧＡ−ＦeＬＶ−Ｂの分子クローニング及
び特徴付け ムリンス等、ジャーナル・オブ・ビロロジー(Ｊ．Ｖiro
l．)(１９８１)３８:６８８により記載されているよう
にして、分子クローン化ＧＡ−ＦeＬＶ−Ｂプロウイル
スをファージラムダ中の組換体ＤＮＡの形で得た。要約
すれば、ＧＡ−ＦeＬＶ−Ｂに感染された細胞からのヒ
トゲノムＤＮＡがＥcoＲＩで消化され、そしてラムダ−
ファージシャロン４Ａに分子クローン化された。このよ
うな分子クローン化プロウイルスの１つ(ラムダＨＦ６
０)はトランスフェクションによりイヌＤ−１７０細胞
に導入された場合に感染性であることも著者によって示
された(ムリンス等、前掲)。次に、完全なプロウイルス
配列及びこのウイルスが組み込まれたフランキングヒト
配列を含むラムダＨＦ６０のＥcoＲＩ断片が細菌プラス
ミドpＫＣ７[ラオ及びロジャース、ジーン(Ｇene)(１９
７９)７:７９]のユニークＥcoＲＩ部位に分子クローン
化された。pＫＨＲ１と称する得られたプラスミド(Ａ．
ローチ及びＮ．ダビドソン)を図１に示す。分子クロー
ン化プロウイルスの方向付けが、ムリンス等ニュークレ
イック・アシズ・リサーチ(Ｎucl．Ａcids Ｒes．)(１
９８０)８: ３２８７に記載されているようにしてウイ
ルスＲＮＡゲノムに関して決定された。

【００２５】図２は、ＦeＬＶのenv遺伝子並びにgp７０
及びp１５Ｅ蛋白質をコードする配列の位置を示す。env
遺伝子はgp８５前駆体蛋白質をコードし、この蛋白質は
感染された細胞の膜に輸送され、そしてウイルスの出現
の際、成熟ウイルスエンベロープ蛋白質gp７０及びp１
５Ｅに切断される。gp７０蛋白質はウイルスが細胞受容
器に特異的に結合して感染を完成することに関与し、そ
して感染に対するウイルス中和抗体反応の生成に関与す
る多くの抗原決定基を含有することが知られている。

【００２６】ＦeＬＶ env遺伝子の位置を決定するため
に、分子クローン化ＧＡ−ＦeＬＶ−Ｂウイルスの３'部
分のヌクレオチド配列を決定した。標準的ＤＮＡ配列決
定法及びストラテジーを用いた[マキサム及びギルバー
ト、メソズ・イン・エンチモロジー(Ｍeth．Ｅnz．)(１
９８０)６５: ４９９; サンガー等、ＰＮＡＳ(１９７
７)７４: ５４６３; メッシング等、ニュークレイック
・アシズ・リサーチ(Ｎucl．Ａcids Ｒes．)(１９８
１)３０９を参照のこと]。ＧＡ−ＦeＬＶ−Ｂ env遺伝
子及びＬＴＲ領域のヌクレオチド配列、並びにenv遺伝
子生成物の推定アミノ酸配列を図３に示す。公知のネズ
ミ白血病ウイルスp７０及びp１５Ｅとの蛋白質配列の相
同性は、それぞれのＦeＬＶ蛋白質と得られるヌクレオ
チド配列との関連付けを可能にした、配列は、エルダ
ー、Ｊ．Ｈ．及びムリンス、Ｊ．Ｉ．ジャーナル・オブ
・ビロロジー(Ｊ．Ｖirology)(１９８３)４６: ８７１
−８８０により決定されたそれと同一である。

【００２７】ptＧＡ中間体の造成 ＦeＬＶ env抗原の発現を指令する細菌プラスミドはＦe
ＬＶ抗原を含む融合蛋白質の発現に関連する幾つかの要
素を含有する。図４に言及して、領域Ｉ及びＩＩはそれ
ぞれ、Ｅ．コリ−トリプトファンプロモーター／オペレ
ーター／リボゾーム結合部位の配列及びＥ．コリ trpＬ
Ｅ'蛋白質をコードする配列[蛋白質コード領域のＣ−末
端にＥcoＲＩ部位を導入するように変形されたＥ．コリ
trpΔＬＥ１４１３、ミオツァリ等、ジャーナル・オブ
・バクテリオロジー(Ｊ．Ｂac)(１９７８)１３３: １４
５７に由来する]を含有する。このtrpＬＥ'発現系はク
ライド等[サイエンス(Ｓcience)(１９８１)２１４: １
１２５、及びヨーロッパ特許出願Ｎo．８１３０１２２
７.５]によりすでに記載されている。trpＬＥ'のヌクレ
オチド配列を図９に示す。領域ＩＶは、ＦeＬＶ env蛋
白質の種々の領域をコードするＤＮＡを含有する。領域
ＩＩＩは合成オリゴヌクレオチドリンカーに由来し、こ
のリンカーは、必要な場合に、全融合蛋白質にわたって
翻訳リーディングフレームを維持するようにtrpＬＥ'配
列とＦeＬＶ配列とを融合するために使用される。

【００２８】この明細書に記載する細菌プラスミド造成
物 ptＧＡΔＡvaＩ、ptＧＡΔＡpaＩ、及びpt９:３−１
９は、ＦeＬＶgp７０の種々の領域を含有するこのよう
な融合蛋白質をコードする。これらのプラスミドは、図
５〜７に略図で示されるようにtrpＬＥ'に融合した完全
ＦeＬＶgp８５前駆体蛋白質の配列を含有する中間体プ
ラスミドptＧＡを介して造成された。このストラテジー
は、ＦeＬＶ env遺伝子のシグナルペプチド／gp７０連
結部に存在するＢalＩ制限部位を用いる。プラスミドp
ＫＨＲ１をＢalＩにより部分解(０.１〜１.０ユニット
／μg ＤＮＡ、１０〜３０分間、３７℃)し、そして次
にＥcoＲＩにより完全消化(１〜５ユニット／μg ＤＮ
Ａ、３０〜６０分間、３７℃)した。シグナルペプチド
／gp７０連結部３'側からgp８５配列を通って、そして
プロウイルスの３'末端に接するヒト配列中のＥcoＲＩ
部位で終わる目的の２.８kb断片をアガロースゲルでの
電気泳動により単離した。この断片を、アンピシリン耐
性遺伝子を含有するベクターpＢＲ３２２の２.９kb Ｂa
lＩ−ＥcoＲＩ断片に分子クローニングした。このベク
ター断片は、ＢalＩ及びＥcoＲＩ(ＢalＩ:１〜５ユニッ
ト／μg ＤＮＡ、３０〜６０分間、３７℃; ＥcoＲＩ:
上記の通り)で完全消化した後にアガロースゲル中での
電気泳動により単離しておいた。次に、上記のpＢＲ３
２２断片及びＦeＬＶgp８５断片を含有する連結混合物
(Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ: 接着末端ＥcoＲＩ部位の第１段
階連結のために、ベクター断片を超える１〜２０倍過剰
量のＦeＬＶ断片、１０〜１００μg／mlのベクター断
片、６６mＭ Ｔris−ＨＣl pＨ７.６、６.６mＭ ＭgＣl
₃ １０mＭ ＤＴＴ、０.１mＭ ＡＴＰ、０.０１〜０.０
５weissユニット／２０μl反応、１４℃にて４〜１２時
間; ＢalＩ末端の第２段階分子内平滑末端連結のため
に、１mＭ ＡＴＰ及び１.０〜５.０weissユニットのリ
ガーゼ／２０μl反応を含有する上記緩衝液中に１０〜
２０μg／mlのベクターに希釈し、そして１４℃にて１
２時間インキュベート)を用いてＥ．コリＫ１２株ＭＭ
２９４をアンピシリン耐性に形質転換した。誘導された
プラスミドをＥcoＲＩ及びＢalＩ制限部位の再生につい
て試験した。このようなプラスミドの１つをpＧＡenvと
称する(図５)。

【００２９】trpＬＥ'発現ベクターのＥcoＲＩ部位に、
適切なリーディングフレーム内に完全gp８５配列を分子
内クローニングすることを可能にするために、合成オリ
ゴヌクレオチドアダプターを使用した。プラスミド pＳ
ＹＣ７９中の合成オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配
列を図６に示す。ＢamＨＩ、ＳmaＩ／ＸmaＩ、ＥcoＲＩ
部位を含有するポリリンカーが２コピーの合成Ｅ．コリ
lac遺伝子オペレーター配列の両端に隣接する。このア
ダプターを含有するプラスミドは細菌宿主 lacオペロン
の誘導をもたらし、そしてそのためにこれらの細胞のコ
ロニーはＸ−galプレート上で青色表現型を示す。ptＧ
Ａプラスミドの造成におけるこのアダプターの使用を図
６に示す。プラスミドpＳＹＣ７９をＸmaＩにより消化
してポリリンカーを切断し、そしてその部位をＰolＩ
(Ｋlenow断片)によりフィル−インした(ＸmaＩ: １〜５
ユニット／μg、３０〜６０分間、３７℃; Ｋlenow酵
素:マニアチス等、前掲、３９４頁に記載されているよ
うにして修復反応を実施)。得られた小平滑末端アダプ
ター断片をポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製
した。プラスミドpＧＡ envをＢalＩで部分消化し(上
記)、そして精製されたアダプター断片に連結した[Ｔ４
ＤＮＡリガーゼ: 分子間平滑末端連結を上記(分子内)
のようにして、しかし２００μg／mlのベクター及び２
０〜１００倍のアダプターにおいて実施した]。この材
料を用いてＥ．コリＫ１２株 ＭＭ２９４をアンピシリ
ン耐性に、そしてＸ−galプレート上で青色表現型を示
すように形質転換した。得られたプラスミドをＥcoＲＩ
で分析して所望のＢalＩ部位における挿入を証明し、そ
してＨaeＩＩＩで分析してアダプター／ＢalＩ部位の連
結部の適切な融合を確認した。後者は連結部のＤＮＡ配
列決定により確認された。１つのこのようなプラスミド
をpＧＡenv−lacと称する(図６)。

【００３０】ＥcoＲＩにより消化(上記のように)した
後、得られるアダプター付ＦeＬＶgp８５配列含有pＧＡ
env−lacの２.８kb ＥcoＲＩ断片を電気泳動により単離
し、そしてやはりＥcoＲＩにより消化された(上記のよ
うに)ptrpＬＥ'に連結(Ｔ４ＤＮＡリガーゼ: 上記のよ
うな接着末端連結)した。プラスミドptrpＬＥ'、trpＬ
Ｅ'遺伝子のＡＴＧの２８５bp上流のＰvuＩＩ部位から
ＬＥ'遺伝子のＣ−末端に形成されたＥcoＲＩ部位まで
のＥ．コリtrpΔＬＥ１４１３オペロンの配列を含有す
る(このtrpΔＬＥ１４１３配列はヨーロッパ特許出願Ｎ
o．８１３０１２２７.５に記載されている)。このＰvu
ＩＩ−ＥcoＲＩ断片はpＢＲ３２２のＰv uＩＩ−ＥcoＲ
Ｉ断片に分子クローニングされているものである。図８
に示されている得られたプラスミドはアンピシリン耐性
を提供し、そしてtrpＬＥ'蛋白質断片をコードする。図
９はＬＥ'遺伝子及び推定されるアミノ酸配列を示す。p
trpＬＥ'ベクター及び２.８kb ＦeＬＶgp８５断片を含
有する連結混合を用いてＥ．コリＫ１２ ＭＭ２９４を
アンピシリン耐性及びＸ−galプレート上での白色表現
型に形質転換した。得られたプラスミドをＥcoＲＩで分
析して部位の再生を確認し、そしてＨindＩＩＩ及びＰv
uＩＩで分析して挿入されたＥ coＲＩ断片の方向を決定
した。正しい方向に挿入部を含有する１つのプラスミド
をptＧＡと称する。図７に示されるこのプラスミドは適
切なリーディングフレーム内にtrpＬＥ'発現ベクターに
融合したＦeＬＶgp８５配列を含有する。ptＧＡ中のtrp
ＬＥ'／gp７０連結部におけるヌクレオチド配列及び推
定されるアミノ酸配列を図１０に示す。このプラスミド
を、プラスミドptＧＡΔＡvaＩ、ptＧＡΔＡpa、及びpt
９:３−１９のその後の造成のための中間体として使用
した。

【００３１】ptＧＡΔＡvaＩの 造成 ptＧＡΔＡvaＩプラスミドは、ＦeＬＶgp７０のＣ−端
側半分とp１５ＥのＮ−端領域とに由来する約２４０個
のアミノ酸を含有するtrpＬＥ'融合蛋白質である。この
プラスミドは、図１１〜１２に概略示すようにしてptＧ
Ａから、中間体造成物ptＧＡＢalＩ−ＨindＩＩＩ(この
造成中においては、p１５Ｅをコードする配列中のユニ
ークＢalＩ部位と、pＨＫＲ１中に組み込まれたＦeＬＶ
プロウイルスの３'−末端に隣接する配列中のユニーク
ＨindＩＩＩ部位との間のptＧＡ配列が除去されている)
を介して誘導された。ptＧＡ ＢalＩ−ＨindＩＩＩは次
のようにして造成された。ptＧＡをＢalＩ及びＨindＩ
ＩＩにより消化し、そしてＨindＩＩＩ部位をＫlenow断
片により上記のようにして修復した。次にこの材料を連
結し(Ｔ４リガーゼ: 上記のような分子内平滑末端条件)
そしてＥ．コリをアンピシリン耐性に形質転換するため
に使用した。得られたコロニーのプラスミドをスクリー
ニングし、ＦeＬＶ配列を含有する２.８kb ＥcoＲＩ断
片からの１.０kbの除去を確実にした。翻訳はＨindＩＩ
Ｉ部位に遠位の配列中の終止コドンにおいて停止する。
次に、このプラスミドptＧＡ ＢalＩ−ＨindＩＩＩを使
用してptＧＡΔＡvaＩを形成した。

【００３２】プラスミドをＡvaＩで完全消化(ＡvaＩ:１
〜５ユニット／μg ＤＮＡ、３０〜６０分間、３７℃)
し、そしてＥcoＲＩで部分消化(ＥcoＲＩ: ０.０５〜
０.２ユニット／μg ＤＮＡ、１０〜３０分間、３７℃)
した。末端をＫlenow断片で修復し、そして約４kbのＡv
aＩ−部分ＥcoＲＩ断片をゲル電気泳動により単離し
た。次にこれを再環化(Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ: 上記のよ
うな分子内平滑末端条件)し、そしてこれを使用して
Ｅ．コリをアンピシリン耐性に形質転換した。誘導され
たコロニーのプラスミドを、trpＬＥ'−ＦeＬＶ配列連
結部における連結部位のＥcoＲＩ部位の再生についてス
クリーニングした。翻訳リーディングフレームはこの連
結部にわたって維持される。このプラスミドをptＧＡΔ
ＡvaＩと称する。

【００３３】ptＧＡΔＡpaＩの 造成 プラスミドptＧＡΔＡpaＩは、env遺伝子生成物のアミ
ノ酸１６７−２９３由来のgp７０の約１２０アミノ酸を
含有するtrpＬＥ'融合蛋白質をコードする。このプラス
ミドは、ptＧＡから、図１３〜１４に概略示すようにし
て、中間体造成物ptＧＡ ＲsaＩ(この造成物において
は、アミノ酸２９３−２９４のＲsaＩに遠位のgp７０コ
ード配列が除去されている)を介して誘導した。ptＧＡ
ＲsaＩを次のようにして造成した(図１３)。ptＧＡをＳ
maＩにより完全消化(ＳmaＩ:１〜５ユニット／μg ＤＮ
Ａ、３０〜６０分間、３７℃)し、そして次にＥcoＲＩ
により部分消化(ＥcoＲＩ: ０.０５〜０.２ユニット／
μg ＤＮＡ、１０〜３０分間、３７℃)し、そして約３.
４kbのベクター断片を単離した。次に、プラスミドptＧ
ＡをＥcoＲＩ(ＥcoＲＩ: １〜５ユニット／μg ＤＮ
Ａ、３０〜６０分間、３７℃)及びＲsaＩ(ＲsaＩ: １〜
５ユニット／μg ＤＮＡ、３０〜６０分間、３７℃)に
より完全消化し、そしてgp７０のアミノ−端側半分をコ
ードする配列を含有する７８０bp ＥcoＲＩ−ＲsaＩ断
片を単離した。この断片をベクターに連結(Ｔ４リガー
ゼ: ２段階法; 分子間接着末端、及び分子内平滑末端)
し、そしてこの混合物を用いてＥ．コリをアンピシリン
耐性にした。得られたプラスミドをＥcoＲＩを用いてス
クリーニングし、そして目的プラスミドをptＧＡΔＲsa
Ｉと称する。

【００３４】プラスミド ptＧＡΔＡpaＩを、ptＧＡΔ
ＲsaＩから、gp７０のアミノ−端からgp７０のアミノ酸
１７４−１７５をコードする配列におけるＡpaＩ部位ま
でをコードする配列を除去することにより誘導した。pt
ＧＡΔＡpaＩを次のようにして造成した(図１４)。プラ
スミドptＧＡＲsaＩをＥcoＲＩで部分分解(ＥcoＲＩ:
０.０５〜０.２ユニット／μg ＤＮＡ、１０〜３０分
間、３７℃)し、そして接着末端をＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ(Ｋlenow断片)を用いてヌクレオチドトリホスフェー
トの存在下で、上記のようにして修復した。次に、この
材料をＡvaＩにより完全消化(ＡvaＩ: １〜５ユニット
／μg ＤＮＡ、３０〜６０分間、３７℃)して３.７kbベ
クター断片を得た。この同じプラスミドptＧＡΔＲsaＩ
をさらにＡｐａＩにより完全消化（Ａp aＩ: １〜５ユニ
ット／μg ＤＮＡ、３０〜６０分間、３７℃)し、そし
て接着末端を上記のようにして修復した。次に、単離さ
れた２８０bp ＡpaＩ−ＡvaＩ断片を、前記の２段階法
によりベクターに連結し、そしてこの混合物を用いて
Ｅ．コリをアンピシリン耐性に形質転換した。形質転換
体を、ＥcoＲＩ／修復−ＡpaＩ／修復連結部におけるＥ
coＲＩの再生について、及び抗原の発現についてスクリ
ーニングした。修復されたＥcoＲＩ及びＡpaＩ部位の適
切な連結がtrpＬＥ'配列とＦeＬＶ配列とのイン−フレ
ーム(in−frame)融合をもたらす。目的のプラスミドをp
tＧＡΔＡpaＩと称する。

【００３５】pt９:３−１９の造 成 プラスミドpt９:３−１９は、ＦeＬＶ env抗原の抗原性
領域を構成するgp７０の１４アミノ酸を含有するtrpＬ
Ｅ'融合蛋白質をコードする。このドメインの位置は、
次のようにしてウイルス中和モノクローナル抗体を用い
てウイルスをマッピングすることにより決定された。Ｆ
Ｌ−７４ ＦeＬＶのgp７０及びp１５Ｅ蛋白質の複合体
[シュナイダー、Ｊ．等、ジャーナル・オブ・ビロロジ
ー(Ｊ．Ｖirology)(１９８０)３３: ５９７−６０５に
より記載されたようにして調製される]に対して向けら
れた抗体を分泌するハイブリドーマは、ルッツ、Ｈ．
等、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソズ(Ｊ．
Ｉmmun．Ｍethods)(１９８３)５６: ２０９−２２０に
より記載されているようにしてgp７０／p１５Ｅ複合体
で免疫されたマウスからの脾臓細胞から得られた。これ
らのモノクローナル抗体のサンプルは獣医ＵＣデービス
学校(ＵＣ Ｄavis Ｓchool of Ｖeterinary Ｍedicin
e)、医学部、ニールスペターソン博士から得られた。幾
つかのモノクローナル抗体を、ＣＣＣ cl．８１(Ｓ⁺,
Ｌ^-)細胞を用いるフォーカス形成試験においてＦeＬＶ
を中和する能力について試験した。cl．２５と称する１
つのgp７０モノクローナル抗体は、ＦＬ−７４ ＦeＬ
Ｖ−Ｂを除くすべてのＦeＬＶサブグループの試験され
たすべてのウイルスを中和することができた。この抗体
を用いて、このモノクローナル抗体による中和に関与す
るgp７０分子上の部位を決定した。

【００３６】この部位を決定するために使用した方法を
図１５に示す。pＫＨＲ１をＸhoＩ及びＥcoＲＩにより
消化した。完全２.０kbのエンベロープコード配列を含
有するこのプラスミドの３.１kb ＸhoＩ−ＥcoＲＩ断片
を単離し、そしてＭn＋⁺の存在下でＤＮアーゼＩで消化
して、分析用アガロースゲルのＥtＢr染色から判定した
場合に約５００〜７００bpの質量平均分子量にした。こ
れは末端−ラベル断片の分析に基づく約１００bpの数平
均分子量に相当する。ヌクレオチドトリホスフェートの
存在下でＤＮＡポリメラーゼ(Ｋlenow断片)で処理する
ことにより断片を平滑末端化し、そして過剰量の³²Ｐ−
ラベル合成ＥcoＲＩリンカー(５'−³²Ｐ−ＧＧＡＡＴＴ
ＣＣ)に連結した。ＥcoＲＩで消化した接着末端を形成
した後、断片をセルロース(ＣＦ−１１、ワットマン)上
で分画してリンカーモノマー及び残留トリホスフェート
を除去した。次にこの材料を、ファージ−シャロン１６
中のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のアミノ酸１００４−
１００５(Ｇlu−Ｐho)をコードするＥcoＲＩ部位に分子
クローン化した。シャロン１６ファージＤＮＡをあらか
じめＥcoＲＩで消化し、そして５'末端を細菌アルカリ
性ホスファターゼを用いて脱リン酸化しておくことによ
り挿入頻度を最大にした。ＥcoＲＩで消化されたファー
ジＤＮＡ及びＥc oＲＩアダプターを付された断片ＤＮＡ
を連結し、そしてステルンベルグ、Ｎ等、ジーン(Ｇen
e)(１９７７)１: ２５５−２８０により記載されている
ようにして連結混合物をイン−ビトロでパッケージし
た。約３０,０００の独立プラークが得られ、プローブ
としてもとのＸhoＩ−Ｅc oＲＩＦeＬＶ断片を用いるイ
ン−シチュ−プラークハイブリダイゼーションにより判
定した場合におよそ１０％が挿入部を含有していた。Ｘ
−galを含有するプレート上に増殖したプラークの染色
パターンもまた挿入頻度を示し、β−ガラクトシダーゼ
遺伝子内に挿入部を含有するファージは白色プラーク、
又はプラークの周縁に微かな青色の輪を示すプラークを
生成した。１０％のこのライブラリーを増幅し、そして
免疫スクリーニングにおいて使用した。

【００３７】cl．２５により認識される抗原決定基を含
有するβ−ガラクトシダーゼ融合蛋白質のＥ．コリでの
発現を検出する能力を評価するため、シャロン１６のＥ
coＲＩ部位にフレーム内に完全な成熟ＦeＬＶgp８５を
コードする配列が融合している組換体ファージ、シャロ
ン１６:ＧＡを造成した。合成ポリリンカーを用いて、
エンベロープシグナルペプチド／gp８５連結部をコード
する配列におけるＢalＩ部位を前記(ptＧＡ)のようにし
てＥcoＲＩ部位を形成するように、そしてβ−ガラクト
シダーゼのＥcoＲＩ部位とのイン−フレーム融合を可能
にするように適合させた。この実験からの非クローン化
ファージをcl．２５決定基の発現についてスクリーニン
グした。抗体によって同定されたファージの精製に続
き、免疫スクリーニングの反復及びＸ−galを用いる染
色の両方を行った。精製されたファージは予想されたＦ
eＬＶ配列を予想された方向に含有することが示され、
そしてさらにウエスタン分析においてcl．２５により検
出可能な融合蛋白質を生産することが示された(下記参
照のこと)。

【００３８】ランダムＤＮＡ断片ライブラリーの最初の
免疫スクリーニングを１００mmプレート当たり約１０³
のプラーク密度において行った。最も単純な仮定を用い
て、この実験においては２個プレート当たり１個の免疫
反応性プラークの予想に相当する。この予想はこれらの
最初のスクリーニングにおいて実現した。反復される免
疫スクリーニングのために１１個の免疫反応性プラーク
が選択された。試験のために選択された最初の１１プラ
ークの内１個を除くすべてが精製を可能にする相当に確
実なシグナルを与えた。Ｘ−gal染色パターンがこの方
法においても有用であった。免疫反応性及びＸ−gal染
色により判定した場合、精製されたファージは均一であ
った。

【００３９】免疫反応性ファージからＤＮＡを単離し、
そしてこれらの組換ファージの構造を制限エンドヌクレ
アーゼ分析により試験した。ファージＤＮＡをＥcoＲＩ
で消化することによって挿入断片を遊離せしめ、そして
ＤＮＡポリメラーゼＩ(Ｋlenow断片)を用いてdＴＴＰ及
び³²Ｐ−dＡＴＰによりＥcoＲＩ末端をラベルした。ポ
リアクリルアミドゲル分析は、すべての免疫反応性単離
物が同一であり、すべてが１個のユニーク５０bp Ｅco
ＲＩ断片を含有していることを示した。この知見は、ス
クリーニングにおいて使用された増幅されたライブラリ
ーの複雑さの考慮からの予想と一致する。

【００４０】免疫反応性に関与する５０bp断片のＤＮＡ
配列分析を促進するため、シャロン１６:９−３のＥco
ＲＩ挿入部位を含むファージＤＮＡの領域をプラスミド
pＵＣ１３[ビエイラ、Ｊ.及びメッシング、Ｊ．、未公
表、ベセスダ・リサーチ・ラブス・カタログ(１９８
３)]にサブクローニングした。β−ガラクトシダーゼ遺
伝子のアミノ酸をコードするユニークＳatＩ部位(図１
６)からＥcoＲＩ部位を通って、シャロン１６のlacオペ
ロン断片の後に位置するＰstＩ部位までの領域にわたる
断片。ＤＮＡ配列分析は、マクサム及びギルバートの化
学的配列決定法を用いて行われた。配列は、ＥcoＲＩク
ローニング部位の３'に隣接するＰvuＩＩ部位から読ま
れた。配列分析は、合成ＥcoＲＩリンカー配列を両端に
有するＧＡ−ＦeＬＶエンベロープ遺伝子の４３bpの挿
入部を示す。これはgp７０をコードするenv遺伝子の領
域のヌクレオチド６３５−６７８を示し、そしてβ−ガ
ラクトシダーゼ配列の上流および下流の両方と共にイン
−フレーム融合蛋白質を生じさせるように存在する。コ
ードされたgp７０断片(gp７０のアミノ酸２１３−２２
６)の配列を図１６に示す。配列中の大文字はＦeＬＶ配
列を示す。λ−シャロン１６:９−３ヌクレオチド配列
中の剣印はＴ→Ｃ変異を示す。cl．２５により認識され
る抗原決定基はこの１４アミノ酸領域に含まれている。

【００４１】この５０bp ＥcoＲＩ断片をptrpＬＥ'のＥ
coＲＩ部位に分子クローン化して第１３図に示すように
trpＬＥ'との融合蛋白質として抗原決定基の発現を得
た。サブクローニングプラスミドpＵＣ１３:９−３をＥ
coＲＩにより完全消化(ＥcoＲＩ:１〜５ユニット／μg
ＤＮＡ、３０〜６０分間、３７℃)してＥcoＲＩ−断片
を遊離せしめ、そしてＨaeＩＩＩで消化(ＨaeＩＩＩ:１
〜５ユニット／μg ＤＮＡ、３０〜６０分間、３７℃)
してpＵＣ１３ベクターを不活性化した。次に、この混
合物を、あらかじめＥcoＲＩにより完全消化されている
ptrpＬＥ'に連結(Ｔ４リガーゼ:分子間接着末端)し、そ
してこれを用いてＥ．コリをアンピシリン耐性に形質転
換した。形質転換体を、cl．２５を用いる発現された蛋
白質の免疫的分析によって(下記)抗原を検出することに
よって、cl．２５決定基の出現についてスクリーニング
した。幾つかの単離物は１個の挿入されたＥcoＲＩ断片
を示すサイズの抗原性融合蛋白質を含有することが見出
され、１個の単離物pt９:３−１９は２個の挿入部を含
有し、そして高度に抗原性であることが見出された。

【００４２】プラスミドptＧＡΔＡvaＩ、ptＧＡΔＡpa
Ｉ、及びpt９:３−１９により形質転換されたＥ．コリ
Ｋ１２株ＭＭ２９４−１のサンプルは、アメリカン・タ
イプ・カルチュア・コレクション(ＡＴＣＣ)、１２３０
１パークランウドライブ、ロックビレ、メリーランドに
寄託された。これらの寄託日及び寄託番号を下に記す。 サンプル 寄託日 ＡＴＣＣ受託番号 ptＧＡΔＡvaＩ １９８３年１２月２日 ３９５２８ ptＧＡΔＡpaＩ １９８３年１２月２日 ３９５２９ pt９:３−１９ １９８３年１２月２日 ３９５３０

【００４３】これらの寄託はブダペスト条約のもとにな
されており、そしてその規定に従って維持され、そして
入手可能にされるであろう。

【００４４】培養 trpＬＥ'融合プラスミドを含有するＥ．コリは、典型的
にはＭ９最小培地(マニアチス等、前掲)＋グルコース
(０.２％)、１μg／mlＢ₁、カザミノ酸(０.５％、木炭
処理)、トリプトファン(１００μg／ml)及びアンピシリ
ン(５０μg／ml)中で非誘導条件下で増殖せしめる。
Ｅ．コリ細胞はtrpＬＥ'融合蛋白質を発現するために種
々の方法により誘導され、この方にはa)増殖細胞をトリ
プトファンを欠く上記の培地に洗い込む方法、b)増殖細
胞を限定的なトリプトファン、例えば２〜５μg／mlを
含有する上記培地に洗い込む方法、又はc)例えば発酵槽
中で、増殖によってトリプトファンの供給が涸渇するよ
うに培養する方法が含まれる。幾つかの場合には、トリ
プトファンの存在下で細胞が部分的に誘導されることが
見出される。さらに、これらの細胞はしばしば誘導され
た条件下でよりも大きな比率の非分解誘導蛋白質を含有
していた。同様の結果が富培地での一夜培養においてし
ばしば得られる。

【００４５】trpＬＥ'融合蛋白 質の検出 上記の方法のいずれかによるtrpＬＥ'−ＦeＬＶ融合蛋
白質の誘導は、プラスミドを担持する細胞内での高屈折
性の粒子の出現をもたらす。これらの粒子は顕微鏡中で
相光学(１２５０Ｘ)を用いて観察することができ、そし
てＬＥ'融合蛋白質の合成に特徴的である。

【００４６】発現された蛋白質の特徴付け プラスミドを含有する細胞の蛋白質生成物をＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ[レムリＵ．Ｋ．, ネイチュアー(Ｎature)(１９
７０)２２７: ６８０]により分析した。誘導条件下又は
非誘導条件下で増殖した細胞を電気泳動に先立って超音
波処理し、そしてサンプル緩衝液中で煮沸した。図１８
は、ptＧＡΔＡvaＩ、ptＧＡΔＡpaＩ及びpt９:３−１
９プラスミドを含む細胞からの蛋白質生成物のクマーシ
ーブルー染色したゲルを示す。ptＧＡΔＡvaＩプラスミ
ドは予想される４６kd蛋白質をコードし、一層小さい分
解生成物が観察される。ptＧＡΔＡpaＩプラスミドは３
６kd蛋白質をコードし、一層小さい分解生成物が観察さ
れる。pt９:３−１９プラスミドは２５kd融合蛋白質を
コードする。

【００４７】これらの蛋白質生成物を、トウビン等、Ｐ
ＮＡＳ(１９７９)７６: ４３５０により最初に記載され
た方法の変法を用いてウエスタン分析により免疫的に分
析した。蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、そし
てこのパターンを固体支持体、例えばＣＮＢr活性化紙
に電気泳動的に移す。次に、この紙を特異的抗体、例え
ばＦeＬＶ gp７０に対する抗体と反応せしめ、抗体と反
応する蛋白質バンドを、例えば１２５Ｉ−ラベル−スタ
フィロコッカス・アウレウス(Ｓtaph．aureus)プロテイ
ンＡを用いて可視化する[イバリエ及びジョネス、アナ
リティカル・バイオケミストリー(Ａnal．Ｂiochem．)
(１９７９)９７: ２４]。cl．２５又はヤギ抗−ＦeＬＶ
gp７０抗体を用いて、第１４図において観察される蛋
白質生成物がＦeＬＶ'gp７０蛋白質配列を含有すること
が確認された。

【００４８】ＦeＬＶ抗原の精製 ptＧＡを含有する誘導された細胞からの屈折性粒子を遠
心分離により精製した。細胞を、５０mＭ Ｔris−ＨＣ
l、pＨ８.０、５mＭ ＥＰＴＡ、１５０mＭ ＮaＣl及び
０.２％ＮＰ−４０を含有する緩衝液中に懸濁し、そし
て超音波処理した。溶解物を低速心遠にかけ、ＦeＬＶ
抗原の粒子を主として含有するペレットを、再懸濁、超
音波処理及び遠心分離の数回のサイクルにより洗浄し
た。最終生成物は緩衝液に再懸濁することができ、又は
還元剤の存在下もしくは非存在下で１％ＳＤＳにより可
溶化することができる。

【００４９】抗原はさらに可溶化された全細胞溶解物か
ら調製された。誘導された細胞を５０mＭ Ｔris−ＨＣ
l、pＨ７、１０mＭ ＥＤＴＡ、５０mＭ ＤＴＴ及び２％
ＳＤＳを含有する緩衝液中で超音波処理する。溶解物を
短時間加熱(１００℃／５分)して蛋白質を十分に変性せ
しめ、そして不溶性破片を遠心分離により除去する。次
に、この溶解物をゲル濾過クロマトグラフィー(５０mＭ
ＮaＯＡc、pＨ５.５、０.５mＭ ＥＤＴＡ、２mＭ ＤＴ
Ｔ及び０.１％ＳＤＳを含有する緩衝液中セファクリル
Ｓ−２００)により画分し、そして２０kdのすべての画
分をプールしそして濃縮した。

【００５０】免疫に先立って、すべてのＳＤＳ含有サン
プルを最終ＳＤＳ濃度が０.１％になるまで透析する。
高い％のＳＤＳ中に可溶化した後、蛋白質は０.１％Ｓ
ＤＳ中に可溶である。

【００５１】約０.１〜２０mgの蛋白質を適当なアジュ
バント(完全フロインドアジュバント、不完全フロイン
ドアジュバント、水酸化アルミニウム、又は合成アジュ
バント)と混合し、そしてネコに接種するのに使用す
る。

【００５２】pg７０及びpg７０ −p１５Ｅ連結部配列の
合成及び担体蛋白質への連結 ＳＡＭ ＩＩ自動ペプチド合成機(ビオサーチ社、サンラ
ファエル、カリホルニア)を用いて次のポリペプチドを
合成した。ペプチドＩ Ｈ−cys asp lys thr val arg leu arg arg glu pro il
e ser leu−ＯペプチドＩＩ Ｈ−cys pro giu tyr val tyr thr his phe asp lys th
r val arg leu-ＯＨペプチドＩＩＩ Ｈ−eys met gly pro asn leu val leu pro asp gln ly
s pro pro ser −ＯＨペプチドＩＶ Ｈ−asp gln lys pro pro ser arg gln ser gln ile gl
u cys ser −ＯＨ

【００５３】これらのポリペプチドとウシ血清アルブミ
ン、キーホールリンペットヘモシアニン又はブタチログ
ロブリンとの接合体を次のようにして製った。１１mgの
Ｎ−マレイミド−６−アミノカプロイル−２'−ニトロ
−４'−スルホン酸ナトリウム塩を６mlの０.１Ｍホスフ
ェート、pＨ７.５、中２２mgの担体蛋白質の溶液に加え
る。１５分後、この溶液を０.１Ｍホスフェート、pＨ
６、中セファデックスＧ−２５カラム上でクロマトグラ
フ処理する。蛋白質含有画分をプールし、１８mgのポリ
ペプチドで処理する。反応を一夜行い、溶液を６ｌの水
に対して透析し、０.０１Ｎ ＮＨ₄ＯＨ中セファデック
スＧ−５０カラム上でクロマトグラフ処理し、凍結乾燥
し、そして分析する。

【００５４】約０.１〜２０mgの各接合体をアジュバン
トと混合し、試験動物を免疫するために使用する。

【００５５】前記の融合蛋白質及びペプチド−担体蛋白
質共有結合体をネコ及びモルモットにおいて次のように
してＦｅＬＶワクチンとして試験する。

【００５６】ネコの試験: 免疫原性及 び有効性 ポリペプチドによりワクチン処理されたネコの血清中に
おける抗−gp７０抗体及びＦeＬＶ中和抗体の存在を決
定することにより免疫原性を評価することができる。ワ
クチン処理されたネコに対するＦeＬＶの効果を観察す
ることによって免疫保護を評価することができる。

【００５７】若いＦeＬＶ不含ネコを使用する。免疫処
理に先立って０日目に採血しそして約２mlの血清をワク
チン処理前対照として集める。所定量のポリペプチド標
品を外大腿筋肉に筋肉内注射する。ネコを０日、２１日
及び４２日目に免疫し、そして７日、１４日、２１日、
２８日、３５日及び４２日目に採血して試験血清を得
る。

【００５８】免疫原性は抗ＦeＬＶ gp７０抗体のＥＬＩ
ＳＡ測定により次のようにして決定した。イムロンＩＩ
ミクロタイタープレート(ダイナテク)に精製されたＦe
ＬＶgp７０を３７℃にて３時間被覆する。１００μlの
被覆緩衝液(０.１Ｍ Ｎa₂ＣＯ₃、０.０２％ ＮaＮ₃、p
Ｈ９．６)中ウェル当たり５０ngの蛋白質を使用する。
次に、プレートを４℃にて一夜貯蔵する。数週間安定で
ある。プレートをＥＬＩＳＡ洗浄液(０.１５Ｍ ０.０５
％トウィーン２０)で３回洗浄し、そして１００μlの実
験動物血清を緩衝液３(緩衝液３＝０.１５Ｍ ＮaＣl、
０.００１Ｍ ＥＤＴＡ、０.０５Ｍ Ｔris−ＨＣl、pＨ
７.４、０.０５％トウィーン２０)中に希釈(通常１:５
０)し、gp７０を被覆したウェルに加え、そして３７℃
にて１時間インキュベートした。

【００５９】プレートをＥＬＩＳＡ洗浄液で３回洗浄
し、３７℃にて４５分間、ホースラディッシュに接合し
たラビット抗−ネコ抗体の緩衝液３中１:２００希釈物
１００μl／ウェルと反応せしめる。

【００６０】プレートをＥＬＩＳＡ洗浄液により３回洗
浄し、そして１００μlの基質溶液(５ml、０.０５Ｍク
エン酸、pＨ４、＋２０μlの２７.４５mg／mlＡＢＴＳ
＋２０μlの２％Ｈ₂Ｏ₂)と、バックグラウンド発色に対
するシグナルが適当になるまで反応せしめる。０.２Ｍ
ＨＦにより反応を停止し、そして４０５nmにおける光学
濃度を決定する。

【００６１】ネコ血清中のウイルス中和抗体をフォーカ
ス形成アッセイにより次のようにして決定する。クロー
ン８１細胞は不完全なネズミ肉腫ウイルスゲノムを含有
する。細胞にＦeＬＶが感染した後、非−不完全ＦeＬＶ
が肉腫ウイルスの発現、及びそれ故に形質転換された細
胞の表現形質の出現を可能にする。形質転換された細胞
は局所的に蓄積するため、フォーカスが出現する。使用
される方法はフィシンジャー等、ジャーナル・オブ・ビ
ロロギー(Ｊ．Ｖirol．)(１９７４)１４: １７７−１７
９からのものである。組織培養皿に、１５％の加熱不活
性化ウシ胎児血清及び５０μg／mlのゼンタマイシンを
補充したマッコイ５Ａ培地５ml中２×１０⁵ＣＣＣクロ
ーン８１(Ｓ＋Ｌ−)細胞を−１日目に接種する。皿を５
％ＣＯ₂加湿インキュベーター中で３７℃にてインキュ
ベートする。０日目に、細胞を１mlのＤＥＡＥ−デキス
トラン(２５μg／ml培地)で３７℃にて１時間処理す
る。細胞を２mlの培地で１回洗浄する。洗浄され処理さ
れた細胞に、小容量(０.２〜０.５ml)のウイルス含有ス
トックの２倍ごとの希釈物を３７℃にて６０分間、間欠
的にゆり動かしながら感染させる。培地(５ml)を皿に加
え、そして３７℃にてインキュベーションを続ける。培
地を１日、４日、８日、及び１２日後に交換する。１０
〜１４日後にフォーカスを計数する。

【００６２】ウイルス中和抗体の存在を、外来性補体の
存在下又は非存在下で、既知量のウイルスをネコ血清と
共にインキュベートした後の感染性ウイルス力価の低下
から決定する。ＣＣＣクローン８１(Ｓ＋Ｌ−)細胞を６
０mmの組織培養皿に、−１日目に、５mlの培地中皿当た
り２×１０⁵細胞で接種し、そして５％ＣＯ₂加湿インキ
ュベータ中３７℃にてインキュベートする。血清サンプ
ルを５６℃にて６０分間熱不活性化する。血清の１００
μlのアリコートを培地中に４倍ごとに逐次希釈する。
すべてのサンプル希釈物に、５０〜１００フォーカス誘
発ユニット(ＦＩＵ)を含有するように希釈されたストッ
クウイルス１００μlを加える。ウイルス−抗体混合物
の２重ウェルに、５０μlの１:１０希釈のラビット補体
１:５０最終希釈を加える。これらの反応物を３７℃に
て６０分間インキュベートする。８１細胞を１mlのＤＥ
ＡＥ−デキストラン(２５mg／ml培地中)で３７℃にて６
０分間処理し、２mlの培地で１回洗浄し、次に間欠的に
ゆり動かしながらウイルス−抗体混合物を３７℃にて６
０分間感染せしめる。培地(５ml)を加え、そして皿を３
７℃にて１０〜１４日間、１日、４日、８日、及び１２
日目に培地を交換しながらインキュベートする。フォー
カスを計数し、そして血清サンプルの中和力価を、イン
プットウイルスＦＩＵ力価の５０％の低下を生じさせる
血清希釈として決定する。

【００６３】免疫保護を、ＦeＬＶでチャレンジされた
ワクチン処理体における接続的ウイルス血症についての
ＥＬＩＳＡアッセイにより測定する。方法は次の通りで
ある。実質的な抗−gp７０抗体が出現した後、５×１０
⁶個の生ＦＦ６４／ＳＴ−ＦeＳＶで形質転換されたネコ
の線維芽細胞の皮下注射によりネコをチャレンジする。
ＦeＬＶコア−蛋白質p２７を認識する幾つかのマウスモ
ノクローナル抗体を使用して該蛋白質のレベルを測定す
るＥＬＩＳＡによりウイルス血症を毎週測定する(ルッ
ツ、Ｈ．等、前掲)。

【００６４】捕捉抗体（ｃａｔｃｈｉｎｇ ａｎｔｉｂ
ｏｄｙ）（幾つかのマウスモノクローナル抗−ｐ２７抗
体からのＩｇＧ画分のプール）を被覆緩衝液（０．１Ｍ
ＮａＣＯ_３）０．０２％ ＮａＮ_３、ｐＨ９．６）の
中に５μｇ／ｍｌに希釈した。イムロンＩＩミクロタイ
タープレート（ダイナテク）の各ウェルに１００μｌを
加え、そして３７℃にて３時間インキュベートし、次に
４℃にて一夜インキュベートする。被覆されたプレート
をＥＬＩＳＡ洗浄液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５
％トウィーン２０）で３回洗浄し、そして蒸留水で１回
洗浄する。密封しそして−２０℃で貯蔵する。サンプル
を０．１３％のトウィーン２０を含有する緩衝液３中に
１：４に希釈する。ｐＨを調製した後、ＢＳＡを０．１
％に添加する。被覆されそして洗浄されたプレートの２
重のウェルに１００ｌの希釈されたサンプルを加える。
精製されたｐ２７のスタンダード曲線、１００μｌの緩
衝液３＋０．１％トウィーン２０中０−５０ｍｇ／ウェ
ルを含む。３７℃にて６０分間インキュベートする。プ
レートをＥＬＩＳＡ洗浄液で３回洗浄する。特定の共有
結合体について決定されたように、接合した抗体（ホー
スラディッシュパーオキシダーゼに接合した２つのマウ
ス抗−ＦｅＬＶ ｐ２７抗体のプール）を希釈し、そし
て、１００μｌを各ウェルに加える。３７℃にて３０〜
６０分間インキュベートする。プレートをＥＬＩＳＡ洗
浄液で３回洗浄する。各ウェルに１００μｌの基質溶液
（５ｍｌ、０．０５Ｍクエン酸、ｐＨ４＋２０μｌの２
７．４５ｍｇ／ｍｌＡＢＴＳ＋２０μｌの２％Ｈ_２Ｏ）
を加え、そしてシグナル対バックグラウンドの比が適当
になるまで室温にてインキュベートする。１００μｌの
０．２Ｍ ＨＦにより反応を停止し、そして４０５ｎｍ
における光学濃度を決定する。ｐ２７の濃度をスタンダ
ード曲線から決定することができる。

【００６５】例に記載した蛋白質生成物は上記の試験に
より免疫原性及び免疫保護活性について評価することが
でき、そしてＦeＬＶ感染に対する効果的なワクチンで
あることが示される。

【００６６】モルモット試験：免疫原性及び有効性 モルモット（３５０〜４００ｇ、群当たり３動物）を次
のようにしてワクチン処理する。 ０日：ワクチン処理…完全フロインドアジュバント中
０．２ｍｇの共有結合体又は不完全フロインドアジュバ
ント中０．４ｍｇの融合蛋白質をＩＭ注射する。 １４日：増分追加免疫（ｉｎｅｒｅｍｅｎｔａｌ ｂｏ
ｏｓｔ）…不完全フロインドアジュバント中０．２ｍｇ
の接合体又は不完全フロインドアジュバント中０．４ｍ
ｇの融合蛋白質を注射する。 ２８日：最終追加免疫…下記のようにして調製した不活
性化ウイルス“１０ｍｌ相当”を注射する。Ｓｎｙｄｅ
ｒ−Ｔｈｏｉｌｅｎ（ＳＴ）ＦｅＬＶに感染したＦＦ６
４／２８０ネコ線維芽細胞を標準培地（改変イーグル培
地、Ｌ１５）＋１０％ウシ胎児血清（（ＦＣＳ）中でコ
ンフルエント単層まで増殖せしめた。次にＦＣＳを除去
し、そして培地のみと置き換えた。２４〜４８時間後に
上清を集め、そして限外濾過により約２００倍に濃縮し
た。ホルムアルデヒドを０．６重量％に加えてウイルス
を不活性化した。濃縮物のアリコート（０．０５ｍｌ）
を不完全フロインドアジュバントにより希釈し、そして
最終追加免疫として使用するために調製した。

【００６７】各注射から２週間後にモルモットから試験
血清を採取した。gp７０並びにペプチドＩ、ＩＩ、ＩＩ
Ｉ及びＩＶに対する抗体についての、血清の免疫原性試
験を、前記のＥＬＩＳＡ法を用いて行った。ウイルス中
和試験もさらにモルモットについて前記のフォーカス形
成アッセイ、並びにテラサキＰ．Ｉ., 及びマクレラン
ド、Ｊ．Ｄ., ネイチュアー(Ｎature)(１９６４)２０
４: ９９８−１０００に従って補体−依存抗体介在細胞
変性(Ｃ'ＤＡＣ)試験を用いて行った。Ｃ'ＤＡＣ試験
は、ラビット補体、並びに血清抗体結合及び補体細胞変
性のための標的細胞としてＦＬ７４(ＦeＬＶ感染)ネコ
細胞を用いた。

【００６８】これらの試験の結果を表１に示す。特に断
らない限り、カッコを付してない結果は最初のワクチン
処理後に採取した血清についてのものである。カッコ内
の結果は殺されたウイルスを注射した後に採取した血清
についてのものである。

【００６９】

【表１】

【００７０】免疫原性試験の結果は、すべてのワクチン
がgp７０に対する抗体を生成すること、及び殺されたウ
イルスの注射が抗−gp７０反応における有意な増加を生
じさせることを示している。(塩水／アジュバントでワ
クチン処理され、そして殺されたウイルスにより追加免
疫された対照は１回の追加免疫の後に大きな反応を示さ
ない。)殺されたウイルスによる追加免疫の後の補体依
存細胞変性において相関的な増加が観察された。

【００７１】この発明のポリペプチドは、ＦeＬＶに対
するネコの能動免疫のために使用される。このような用
途のために、このペプチドは通常、非経腸的注射のため
の医薬として許容される液体担体、例えば塩水、リンゲ
ル液、グルコース溶液、及びハンク溶液と共に製剤化さ
れるであろう。この明細書において、このような担体に
ついて使用する場合、“医薬として許容される"なる用
語は、この担体が非毒性であり、一般に不活性であり、
そして活性成分の機能に不都合な影響を与えないことを
意味する。好ましくは、製剤は１又は複数のアジュバン
ト(所望の免疫反応を相乗することができる化合物)、例
えば一般に使用される水及び油乳剤(例えば、フロイン
ドアジュバント)、アルム(硫酸カリウムアルミニウ
ム)、水酸化アルミニウム、リン酸カルシウム、及び合
成ポリヌクレオチドを含有するであろう。ワクチン処理
において使用される投与量及び投与方法は動物の年齢及
び重量、非経腸的投与の方法、及び製剤中でのアジュバ
ントの存在により非常に異なるであろう。個々の投与量
は一般に約０.１〜１０mgのポリペプチドの範囲であろ
う。示されているように、ワクチン注射は好ましくは免
疫反応を開始するために使用され、次に殺されたウイル
ス、又は感染量より少量の生ウイルスが注射される。ワ
クチン処理の後に、典型的には最初の１年を通して定期
的に、そしてその後に追加免疫接種が行われよう。この
明細書において使用する場合、“免疫原的量"なる語は
これらの投与量を含むことが意図される。

【００７２】ワクチンは任意の非経口的経路(静脈内、
動脈内、腹腔内、皮下、皮内、筋肉内、又は莢膜内)に
投与することができる。

【００７３】蛋白質化学、免疫学、組換ＤＮＡ技術、及
び／又は獣医学の分野における当業者にとって自明な、
この発明を実施するための上記の方法の変法は次の請求
の範囲にあると意図される。

【００７４】

【発明の効果】本発明により、ネコ科白血病ウイルス感
染の優れた予防方法が提供される。

【００７５】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 ｍｅｔ ｇｌｙ ｐｒｏ ａｓｎ ｌｅｕ ｖａｌ ｌｅｕ ｐｒｏ ａｓｐ
ｇｌｎ ｌｙｓ ｐｒｏ ｐｒｏ ｓｅｒ １ ５ １０

【００７６】配列番号：２ 配列の長さ：１２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 asp gln lys pro pro ser arg gln ser gln ile gln １ ５ １０

【００７７】配列番号：３ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 pro glu tyr val tyr thr his phe asp lys thr val arg leu １ ５ １０

【００７８】配列番号：４ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 asp lys thr val arg leu arg arg glu pro ile ser leu １ ５ １０

【００７９】配列番号：５ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 H-cys asp lys thr val arg leu arg arg glu pro ile ser leu-OH １ ５ １０

【００８０】配列番号：６ 配列の長さ：１５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 H-cys pro glu tyr val tyr thr his phe asp lys thr val arg leu-OH １ ５ １０ １５

【００８１】配列番号：７ 配列の長さ：１５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 H-cys met gly pro asn leu val leu pro asp glu lys pro pro ser-OH １ ５ １０ １５

【００８２】配列番号：８ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 H-asp gln lys pro pro ser arg glu ser gln ile glu cys ser-OH １ ５ １０

【図面の簡単な説明】

【図１】 例において使用されるＦeＬＶ−Ｂ env遺伝
子の分離源であるプラスミドpＫＨＲ１の略図である。

【図２】 例に記載される発現ベクターの造成において
使用される制限部位を示すenv遺伝子の拡大図を包含す
るＦeＬＶゲノムの略図である。

【図３】 ＦeＬＶのガードナー−アルンスタイン(Ｇ
Ａ)株のenv遺伝子のコード鎖のヌクレオチド配列、及び
これから推定されるアミノ酸配列である。

【図４】 例に記載されるtrpＬＥ'−ＦeＬＶ融合蛋白
質の発現系の構造の略図である。

【図５】 中間体プラスミドptＧＡの造成のための方法
の流れ図である。

【図６】 中間体プラスミドptＧＡの造成のための方法
の流れ図である。

【図７】 中間体プラスミドptＧＡの造成のための方法
の流れ図である。

【図８】 プラスミドptrpＬＥ'の略図である。

【図９】 trpＬＥ'ポリペプチドをコードするヌクレオ
チド配列及びこのポリペプチドの推定されるアミノ酸配
列である。

【図１０】 前記ヌクレオチド配列、及びプラスミドpt
ＧＡ中のtrpＬＥ'／gp７０連結部の推定されるアミノ酸
配列である。

【図１１】 プラスミドptＧＡΔＡvaＩの造成のための
方法の流れ図である。

【図１２】 プラスミドptＧＡΔＡvaＩの造成のための
方法の流れ図である。

【図１３】 プラスミドptＧＡΔＡpaＩの造成のための
方法の流れ図である。

【図１４】 プラスミドptＧＡΔＡpaＩの造成のための
方法の流れ図である。

【図１５】 gp７０分子の抗原決定基を同定する方法の
流れ図である。

【図１６】 図１５の方法により同定された抗原領域の
ヌクレオチド配列及び推定されるアミノ酸配列である。

【図１７】 プラスミドpt９:３−１９の造成のための
方法の流れ図である。

【図１８】 ptＧＡΔＡvaＩ、ptＧＡΔＡpaＩ、及びpt
９:３−１９の蛋白質生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の
電気泳動図である。

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ポリペプチドの免疫原的量をアジュバン
   トと共に含んでなるワクチンによりネコ科動物を免疫感
   作することよりなるネコ科白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）
   感染の予防方法であって、 該ポリペプチドが、ネコ科白血病ウイルスサブグループ
   Ｂｇｐ８５蛋白の２１０−２５０領域および４１５−４
   ５０領域に出現するネコ科白血病ウイルスのｇｐ８５エ
   ンベロープ蛋白質のアミノ酸配列の少なくとも部分と相
   同なアミノ酸配列を含んで成り、そしてネコにおいて液
   性反応を開始又は誘発する免疫原でありそしてネコ科白
   血病ウイルス感染に対してネコを免疫するのに有用な、
   場合によっては他の蛋白質との融合蛋白質として又はキ
   ャリヤー蛋白質と連結された共有結合体として存在す
   る、天然に存在するネコ科白血病ウイルスエンベロープ
   蛋白でない微生物的に生産されたポリペプチドである； ことを特徴とする当該方法。
2. 【請求項２】 さらに、殺されたＦｅＬＶ又は感染量よ
   り少量の生ＦｅＬＶの追加免疫接種を行うことよりなる
   請求項１項記載の方法。
3. 【請求項３】 該ワクチンが該共有結合体を含んでな
   り、該ポリペプチドが を含んでなる； ことを特徴とする請求項１記載の方法。