JPH0768266B2 - ネコ科白血病ウイルスワクチン - Google Patents
ネコ科白血病ウイルスワクチンInfo
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- JPH0768266B2 JPH0768266B2 JP59504369A JP50436984A JPH0768266B2 JP H0768266 B2 JPH0768266 B2 JP H0768266B2 JP 59504369 A JP59504369 A JP 59504369A JP 50436984 A JP50436984 A JP 50436984A JP H0768266 B2 JPH0768266 B2 JP H0768266B2
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 この発明は蛋白質化学、組換DNA技法、及びウイルス疾
患の免疫予防に関する。さらに詳しくは、この発明はネ
コ科白血病ウイルス（feline leukemia virus）（FeL
V）ワクチンとして有用な新規な蛋白質に関する。
患の免疫予防に関する。さらに詳しくは、この発明はネ
コ科白血病ウイルス（feline leukemia virus）（FeL
V）ワクチンとして有用な新規な蛋白質に関する。
背景技術 FeLV FeLVはネコ類において新生物疾患及び非新生物疾患の両
者を惹起する伝染性の発癌性RNAウイルスである。FeLV
感染はネコ類における疾患関連死の主要な原因である。
FeLVの複製の過程でウイルスRNAゲノムのDNAコピーが作
られ、そして感染された細胞のDNA中に挿入される。組
み込まれたFeLV DNAは、感染された細胞から放出される
一層多くのウイルスの複製をコードする。宿主の遺伝子
との組換によってネコ科肉腫ウイルス（feline sarcoma
virus）（FeSV）が生ずることによって、このウイルス
は細胞形質転換を惹起することができる。
者を惹起する伝染性の発癌性RNAウイルスである。FeLV
感染はネコ類における疾患関連死の主要な原因である。
FeLVの複製の過程でウイルスRNAゲノムのDNAコピーが作
られ、そして感染された細胞のDNA中に挿入される。組
み込まれたFeLV DNAは、感染された細胞から放出される
一層多くのウイルスの複製をコードする。宿主の遺伝子
との組換によってネコ科肉腫ウイルス（feline sarcoma
virus）（FeSV）が生ずることによって、このウイルス
は細胞形質転換を惹起することができる。
FeLVゲノムは、インターバルウイルス蛋白質をコードす
るgag遺伝子、ウイルスRNA依存DNAポリメラーゼ（逆転
写酵素）をコードするpol遺伝子、並びにウイルスエン
ベロープ蛋白質gp70及びp15Eをコードするenv遺伝子か
ら成る60−70S単鎖RNAである。
るgag遺伝子、ウイルスRNA依存DNAポリメラーゼ（逆転
写酵素）をコードするpol遺伝子、並びにウイルスエン
ベロープ蛋白質gp70及びp15Eをコードするenv遺伝子か
ら成る60−70S単鎖RNAである。
ウイルス干渉試験及び中和試験は、エンベロープ抗原の
３種類のサブグループ（A,B及びＣと称される）であっ
て、類似しているがしかし相互に異り、そして３種類の
認識されたFeLVサブグループ（やはりA,B及びＣと称さ
れる）を生じさせるものが存在することを示した。
３種類のサブグループ（A,B及びＣと称される）であっ
て、類似しているがしかし相互に異り、そして３種類の
認識されたFeLVサブグループ（やはりA,B及びＣと称さ
れる）を生じさせるものが存在することを示した。
FeLVに暴露されたネコの連命はFeLV…特にFeLVエンベロ
ープ抗原に対するその免疫反応に依存するであろう。研
究は、暴露された集団の約40％が高力価の抗−FeLVエン
ベロープ抗体を示しそして免疫となり、約30％が適切に
反応せずそして接続的に感染し、そして約30％は感染せ
ずそして免疫されないが感受性のままであることを示し
た。暴露された集団の有意な部分が自然免疫を獲得する
という事実は、研究者をして、種々の物質をFeLVに対す
るワクチンとして試みさせる。不活性化されたウイルス
は高投与量でなければ効果的でないことが見出された。
精製されたgp70もまた一般にワクチンとして効果的でな
いことが見出された。殺された腫瘍細胞は白血病の予防
には有効であるがウイルス血症に対してはそうでないこ
とが報告されている。FeLVに感染された細胞（FL−74）
の組織培養培地から得られる可溶性腫瘍細胞抗原も試み
られ、そしてFeLVウイルス感染の誘導を予防するために
有効であることが見出された。
ープ抗原に対するその免疫反応に依存するであろう。研
究は、暴露された集団の約40％が高力価の抗−FeLVエン
ベロープ抗体を示しそして免疫となり、約30％が適切に
反応せずそして接続的に感染し、そして約30％は感染せ
ずそして免疫されないが感受性のままであることを示し
た。暴露された集団の有意な部分が自然免疫を獲得する
という事実は、研究者をして、種々の物質をFeLVに対す
るワクチンとして試みさせる。不活性化されたウイルス
は高投与量でなければ効果的でないことが見出された。
精製されたgp70もまた一般にワクチンとして効果的でな
いことが見出された。殺された腫瘍細胞は白血病の予防
には有効であるがウイルス血症に対してはそうでないこ
とが報告されている。FeLVに感染された細胞（FL−74）
の組織培養培地から得られる可溶性腫瘍細胞抗原も試み
られ、そしてFeLVウイルス感染の誘導を予防するために
有効であることが見出された。
微生物的に生産されたワクチン サイエンス（Science）（1981）214:1125−1128及び英
国特許出願GB 2103622Aは、口蹄疫（foot−and−diseas
e virus）（FMDV）ワクチンとして有用な微生物的に生
産されるポリペプチドを記載している。相補的DNA（cDN
A）断片が、キャプシド蛋白質VP3をコードするFMDVゲノ
ムの部分から調製された。これらのcDNA挿入部がトリプ
トファン（trp）プロモーターを含有する細菌プラスミ
ドに導入され、そしてこの組換体プラスミドがコンピテ
ントE.コリ（E.coli）を形質転換するために使用され
た。この組換体細菌は、trpリーダー及びtrpE遺伝子の
一部分によりコードされるポリペプチドとAP3挿入部に
よりコードされるポリペプチドとから成る融合蛋白質を
発現した。この融合蛋白質は精製され、そして抗−VP3
抗体を結合するその能力及び家畜におけるFMDV感染を予
防するその能力についてイン−ビトロ及びイン−ビボに
おいて試験された。サイエンス（Science）（1981）21
9:614−620は、狂犬病ウイルスゲノム由来の遺伝子の組
換体E.コリにおける発現による狂犬病ウイルスの表面蛋
白質の合成を記載している。
国特許出願GB 2103622Aは、口蹄疫（foot−and−diseas
e virus）（FMDV）ワクチンとして有用な微生物的に生
産されるポリペプチドを記載している。相補的DNA（cDN
A）断片が、キャプシド蛋白質VP3をコードするFMDVゲノ
ムの部分から調製された。これらのcDNA挿入部がトリプ
トファン（trp）プロモーターを含有する細菌プラスミ
ドに導入され、そしてこの組換体プラスミドがコンピテ
ントE.コリ（E.coli）を形質転換するために使用され
た。この組換体細菌は、trpリーダー及びtrpE遺伝子の
一部分によりコードされるポリペプチドとAP3挿入部に
よりコードされるポリペプチドとから成る融合蛋白質を
発現した。この融合蛋白質は精製され、そして抗−VP3
抗体を結合するその能力及び家畜におけるFMDV感染を予
防するその能力についてイン−ビトロ及びイン−ビボに
おいて試験された。サイエンス（Science）（1981）21
9:614−620は、狂犬病ウイルスゲノム由来の遺伝子の組
換体E.コリにおける発現による狂犬病ウイルスの表面蛋
白質の合成を記載している。
ワクチン処理方法 エミニ等、ネイチュアー（Nature）（1981）304:699−7
03は、ポリオウイルス由来の合成ペプチドに対する免疫
反応を相乗強化するために低い感染量より少い（subinf
ccfious）量及び保護量より少い（subprotective）量の
生ポリオウイルスが使用され得ることを報告している。
あたかも、最初の合成ワクチンが免疫系を“開始”（pr
ime）し、そして次のウイルス性追加免疫（boost）が有
効な液性反応（humoral response）における最初に開始
された免疫反応の増幅を可能にするかのようである。他
の研究者は、微生物的に生産された（組換体）ワクチン
を用いて同様の知見を報告している。これらは、ポリオ
ウイスル及び肝炎Ｂウイルス（組換体によって開始／生
ウイルスによって追加免疫）、及び口蹄疫ウイルス（組
換体によって開始／殺されたウイルスによって追加免
疫）を包含する。
03は、ポリオウイルス由来の合成ペプチドに対する免疫
反応を相乗強化するために低い感染量より少い（subinf
ccfious）量及び保護量より少い（subprotective）量の
生ポリオウイルスが使用され得ることを報告している。
あたかも、最初の合成ワクチンが免疫系を“開始”（pr
ime）し、そして次のウイルス性追加免疫（boost）が有
効な液性反応（humoral response）における最初に開始
された免疫反応の増幅を可能にするかのようである。他
の研究者は、微生物的に生産された（組換体）ワクチン
を用いて同様の知見を報告している。これらは、ポリオ
ウイスル及び肝炎Ｂウイルス（組換体によって開始／生
ウイルスによって追加免疫）、及び口蹄疫ウイルス（組
換体によって開始／殺されたウイルスによって追加免
疫）を包含する。
発明の開示 この発明は、FeLVの抗原決定基を規定するアミノ酸配列
を含んで成り、そしてネコにおける液性反応を誘発し又
は開始するため、及びFeLV感染に対してネコを免疫する
ために有用なポリペプチドに関する。これらのポリペプ
チドは、（１）このようなアミノ酸配列をコードするFe
LV env DNA配列を含有する組換体DNAの微生物中での直
接発現により、又は（２）小ポリペプチドの場合には常
用のポリペプチド合成法により製造することができる。
精製されたgp70蛋白質は有効なFeLVワクチンでなかった
ことを従来技術が報告しているから、これらのポリペプ
チドの免疫原性は予想されない。
を含んで成り、そしてネコにおける液性反応を誘発し又
は開始するため、及びFeLV感染に対してネコを免疫する
ために有用なポリペプチドに関する。これらのポリペプ
チドは、（１）このようなアミノ酸配列をコードするFe
LV env DNA配列を含有する組換体DNAの微生物中での直
接発現により、又は（２）小ポリペプチドの場合には常
用のポリペプチド合成法により製造することができる。
精製されたgp70蛋白質は有効なFeLVワクチンでなかった
ことを従来技術が報告しているから、これらのポリペプ
チドの免疫原性は予想されない。
この発明の微生物的に生産されるポリペプチドは、FeLV
のgp70エンベロープ蛋白質のアミノ酸配列の少なくとも
一部分と相同なアミノ酸配列を含んで成り、そしてネコ
において液性反応を誘発又は開始し且つFeLV感染に対し
てネコを免疫する免疫原である。このような蛋白質の１
つの群は、抗原決定基を規定するネコ科白血病ウイルス
のgp70エンベロープ蛋白質の部分に融合したtrpE蛋白質
の部分及びtrpリーダーペプチドの部分を含んで成る、
E.コリにより生産された融合蛋白質である。この群のポ
リペプチドは、入手可能な分子クローン化FeLV DNA配列
からenv遺伝子の断片を単離し、又はenv遺伝子断片を合
成し、該断片を、プラスミドを有するE.コリの発現を指
令するE.コリtrp LE′配列を用いる複製可能なプラスミ
ドに導入し、そして得られた形質転換体を適切な細菌培
養培地中で増殖せしめることにより作られた。このポリ
ペプチドは、細胞を溶解し、該溶解物からE.コリエンド
トキシンを除去し、そしてジスルフィド結合を開裂せし
める還元剤で前記溶解物を還元することによってE.コリ
細胞から取り出すことができよう。次に、この物質を再
酸化するのが好ましい。
のgp70エンベロープ蛋白質のアミノ酸配列の少なくとも
一部分と相同なアミノ酸配列を含んで成り、そしてネコ
において液性反応を誘発又は開始し且つFeLV感染に対し
てネコを免疫する免疫原である。このような蛋白質の１
つの群は、抗原決定基を規定するネコ科白血病ウイルス
のgp70エンベロープ蛋白質の部分に融合したtrpE蛋白質
の部分及びtrpリーダーペプチドの部分を含んで成る、
E.コリにより生産された融合蛋白質である。この群のポ
リペプチドは、入手可能な分子クローン化FeLV DNA配列
からenv遺伝子の断片を単離し、又はenv遺伝子断片を合
成し、該断片を、プラスミドを有するE.コリの発現を指
令するE.コリtrp LE′配列を用いる複製可能なプラスミ
ドに導入し、そして得られた形質転換体を適切な細菌培
養培地中で増殖せしめることにより作られた。このポリ
ペプチドは、細胞を溶解し、該溶解物からE.コリエンド
トキシンを除去し、そしてジスルフィド結合を開裂せし
める還元剤で前記溶解物を還元することによってE.コリ
細胞から取り出すことができよう。次に、この物質を再
酸化するのが好ましい。
免疫原性であると同定されたgp70蛋白質の部分は、標準
的ポリペプチド合成技法により合成しそして担体蛋白質
と連結してて有効なFeLV免疫原を製造することができ
る。
的ポリペプチド合成技法により合成しそして担体蛋白質
と連結してて有効なFeLV免疫原を製造することができ
る。
ポリペプチド、又はポリペプチド−担体蛋白質接合体は
ワクチンとして使用するために適当なアジュバント及び
非経口ビークルと混合される。ネコにこれらのワクチン
の免疫量を非経口的に投与することにより、ネコをFeLV
に対して免疫することができる。これらは好ましくは免
疫反応を開始するために使用され、そして次に殺された
ウイルス又は感染量より少ない量の生ウイルスにより追
加免疫が行われる。
ワクチンとして使用するために適当なアジュバント及び
非経口ビークルと混合される。ネコにこれらのワクチン
の免疫量を非経口的に投与することにより、ネコをFeLV
に対して免疫することができる。これらは好ましくは免
疫反応を開始するために使用され、そして次に殺された
ウイルス又は感染量より少ない量の生ウイルスにより追
加免疫が行われる。
図面の簡単な説明 図面において： 第１図は例において使用されるFeLV−B env遺伝子の分
離源であるプラスミドpKHR1の略図である。
離源であるプラスミドpKHR1の略図である。
第２図は例に記載される発現ベクターの造成において使
用される制限部位を示すenv遺伝子の拡大図を包含するF
eLVゲノムの略図である。
用される制限部位を示すenv遺伝子の拡大図を包含するF
eLVゲノムの略図である。
第３図はFeLVのガードナー−アルンスタイン（GA）株の
env遺伝子のコード鎖のヌクレオヂド配列、及びこれか
ら推定されるアミノ酸配列である。
env遺伝子のコード鎖のヌクレオヂド配列、及びこれか
ら推定されるアミノ酸配列である。
第４図は例に記載されるtrpLE′−FeLV融合蛋白質の発
現系の構造の略図である。
現系の構造の略図である。
第５図は中間体プラスミドptGAの造成のための方法の流
れ図である。
れ図である。
第６図はプラスミドptrpLE′の略図である。
第７図はtrpLE′ポリペプチドをコードするヌクレオチ
ド配列及びこのポリペプチドの推定されるアミノ酸配列
である。
ド配列及びこのポリペプチドの推定されるアミノ酸配列
である。
第８図は前記ヌクレオチド配列、及びプラスミドptGA中
のtrpLE′/gp70連結部の推定されるアミノ酸配列であ
る。
のtrpLE′/gp70連結部の推定されるアミノ酸配列であ
る。
第９図はプラスミドptGAΔAvalの造成のための方法の流
れ図である。
れ図である。
第10図はプラスミドptGAΔApaIの造成のための方法の流
れ図である。
れ図である。
第11図はgp70分子の抗原決定基を同定する方法の流れ図
である。
である。
第12図は第11図の方法により同定された抗原領域のヌク
レオチド配列及び推定されるアミノ酸配列である。
レオチド配列及び推定されるアミノ酸配列である。
第13図はプラスミドpt9:3−19の造成のための方法の流
れ図である。
れ図である。
第14図はptGAΔAvaI、ptGAΔApaI、及びpt9:3−19の蛋
白質生成物のSDS−PAGE分析の電気泳動図である。
白質生成物のSDS−PAGE分析の電気泳動図である。
発明の実施態様 この発明の微生物的に生産されたポリペプチドは幾つか
の観点において天然FeLVエンベロープ蛋白質と異る。こ
のポリペプチドの実質的な部分又はすべてが天然FeLVgp
70蛋白質の配列と相同であろうが、ほとんどの場合それ
は天然gp70蛋白質のアミノ酸配列の部分のみを含んで成
るであろう。これらのポリペプチドはまたp15E蛋白質の
部分を含有する。さらに、前記相同な配列が微生物によ
って生産されるので、天然gp70のようにプロセシング
（すなわちグリコシル化）されないであろう。融合蛋白
質である具体例、例えばtrpLE′−gp70融合蛋白質は、
天然gp70にとって外来性であるアミノ酸配列を含む。こ
のようなポリペプチドの二次構造及び三次構造は、グリ
コシル化の不存在又は外来性アミノ酸配列の存在のため
に天然gp70と異るであろう。これらの相違は免疫的相違
に反映されるであろう。
の観点において天然FeLVエンベロープ蛋白質と異る。こ
のポリペプチドの実質的な部分又はすべてが天然FeLVgp
70蛋白質の配列と相同であろうが、ほとんどの場合それ
は天然gp70蛋白質のアミノ酸配列の部分のみを含んで成
るであろう。これらのポリペプチドはまたp15E蛋白質の
部分を含有する。さらに、前記相同な配列が微生物によ
って生産されるので、天然gp70のようにプロセシング
（すなわちグリコシル化）されないであろう。融合蛋白
質である具体例、例えばtrpLE′−gp70融合蛋白質は、
天然gp70にとって外来性であるアミノ酸配列を含む。こ
のようなポリペプチドの二次構造及び三次構造は、グリ
コシル化の不存在又は外来性アミノ酸配列の存在のため
に天然gp70と異るであろう。これらの相違は免疫的相違
に反映されるであろう。
融合蛋白質の好ましい群は、gp85蛋白質のおよそアミノ
酸210及び250の間に存在するgp70蛋白質の親水性領域及
びgp70−p15E連結部すなわちおよそアミノ酸415及び450
の間（gp85分子の仮定される出発部から数え始める）に
存在する親水性領域の少なくとも１つの全部又は実質的
部分と相同であるアミノ酸のセグメントを含むポリペプ
チドである。
酸210及び250の間に存在するgp70蛋白質の親水性領域及
びgp70−p15E連結部すなわちおよそアミノ酸415及び450
の間（gp85分子の仮定される出発部から数え始める）に
存在する親水性領域の少なくとも１つの全部又は実質的
部分と相同であるアミノ酸のセグメントを含むポリペプ
チドである。
ポリペプチドの特定の好ましい群は、次のアミノ酸配列
（アミノ酸の番号はFeLV−３のgp85分子の仮定される出
発部から始まる）のいずれかの１又は複数の反復を含む
ポリペプチドである。
（アミノ酸の番号はFeLV−３のgp85分子の仮定される出
発部から始まる）のいずれかの１又は複数の反復を含む
ポリペプチドである。
（ａ） met gly pro asn leu val leu pro asp gln ly
s pro pro ser（この配列はGA FeLV−Ｂのgp70蛋白質の
アミノ酸213−226に存在する）； （ｂ） asp gln lys pro pro ser arg gln ser gln il
e glu（この配列はGA FeLV−Ｂのgp70蛋白質のアミノ酸
221−231に存在する）； （ｃ） pro glu tyr val tyr thr his phe asp lys th
r val arg leu（この配列はST FeLV−Ｂのgp70蛋白質の
アミノ酸417−430に存在する）；及び （ｄ） asp lys thr val arg leu arg arg glu pro il
e sea leu（この配列はST FeLV−Ｂのgp85蛋白質のアミ
ノ酸425−437、すなわちgp70蛋白質の最後の８アミノ酸
及びp15E蛋白質の最初の５アミノ酸に存在する）。
s pro pro ser（この配列はGA FeLV−Ｂのgp70蛋白質の
アミノ酸213−226に存在する）； （ｂ） asp gln lys pro pro ser arg gln ser gln il
e glu（この配列はGA FeLV−Ｂのgp70蛋白質のアミノ酸
221−231に存在する）； （ｃ） pro glu tyr val tyr thr his phe asp lys th
r val arg leu（この配列はST FeLV−Ｂのgp70蛋白質の
アミノ酸417−430に存在する）；及び （ｄ） asp lys thr val arg leu arg arg glu pro il
e sea leu（この配列はST FeLV−Ｂのgp85蛋白質のアミ
ノ酸425−437、すなわちgp70蛋白質の最後の８アミノ酸
及びp15E蛋白質の最初の５アミノ酸に存在する）。
好ましい微生物的に生産される融合蛋白質に代るものと
して、上記のセグメント又は配列（１又は複数の反復）
を合成し、そして適当な蛋白質担体に連結して有効なFe
LV免疫原を製造することができる。
して、上記のセグメント又は配列（１又は複数の反復）
を合成し、そして適当な蛋白質担体に連結して有効なFe
LV免疫原を製造することができる。
連結部位を与えるため、このセグメント又は配列にシス
テインを加えることができる。レーナー等、PNAS（198
1）78:3403−3407は、小ポリペプチドを担体蛋白質に連
結して免疫原を製造する方法を記載している。他の連結
法がカーチ（church）、W.R.等、PNAS（USA）（1983）8
0:255、Ｏ′スリバン、M.J.及びマークス、V.、メソズ
・イン・エンチモロジー（Methods in Enzymology（198
1）73:147−166、及びエルランジャー、B.F.、メソズ・
イン・エンチモロジー（Methods in Enzymology（198
0）70:85−104に記載されている。使用することができ
る担体蛋白質の例は、キーホールリンペット（keyhole
limpet）ヘモシアニン、卵アルブミン、ブターチログロ
ブリン、ウシ血清アルブミンである。ポリペプチドと担
体蛋白質との接合体を調製するための連結剤には、蛋白
質を連結するために使用される常用の架橋剤、例えばア
ルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビスージアゾ
化ベンザジン、カルボジイミド、サクシンイミド、及び
イミデートが含まれる。
テインを加えることができる。レーナー等、PNAS（198
1）78:3403−3407は、小ポリペプチドを担体蛋白質に連
結して免疫原を製造する方法を記載している。他の連結
法がカーチ（church）、W.R.等、PNAS（USA）（1983）8
0:255、Ｏ′スリバン、M.J.及びマークス、V.、メソズ
・イン・エンチモロジー（Methods in Enzymology（198
1）73:147−166、及びエルランジャー、B.F.、メソズ・
イン・エンチモロジー（Methods in Enzymology（198
0）70:85−104に記載されている。使用することができ
る担体蛋白質の例は、キーホールリンペット（keyhole
limpet）ヘモシアニン、卵アルブミン、ブターチログロ
ブリン、ウシ血清アルブミンである。ポリペプチドと担
体蛋白質との接合体を調製するための連結剤には、蛋白
質を連結するために使用される常用の架橋剤、例えばア
ルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビスージアゾ
化ベンザジン、カルボジイミド、サクシンイミド、及び
イミデートが含まれる。
この発明はこの明細書において、FeLV株GA及びST〔これ
らの株のenv遺伝子のヌクレオチド配列及び推定される
アミノ酸配列は出願人によりジャーナル・オブ・ビロロ
ギー（J.Virol.）（1984）49:630に報告されている〕、
E.コリ形質転換体によるtrpLE′及びFeLV−GAgp70配列
の融合蛋白質の発現、並びにgp70又はgp70−p15E連結配
列に相同な抗原ポリペプチドと抗体蛋白質との接合体の
合成に言及して具体的に例示される。しかしながら、こ
の発明は他のFeLV株及びサブグループのgp70又はgp70−
p15E配列に相同な配列を含むポリペプチド、gp70配列が
trpLE′配列以外のDNAの発現に由来するポリペプチドに
融合している融合蛋白質、及びE.コリ以外の形質転換可
能な微生物、例えば他の細菌及び酵母又はウイルスによ
るポリペプチドの発現（これらの生物中で異種性遺伝子
配列を複製しそして発現することができるベクターを使
用）を包含することが意図されることが評価されるであ
ろう。
らの株のenv遺伝子のヌクレオチド配列及び推定される
アミノ酸配列は出願人によりジャーナル・オブ・ビロロ
ギー（J.Virol.）（1984）49:630に報告されている〕、
E.コリ形質転換体によるtrpLE′及びFeLV−GAgp70配列
の融合蛋白質の発現、並びにgp70又はgp70−p15E連結配
列に相同な抗原ポリペプチドと抗体蛋白質との接合体の
合成に言及して具体的に例示される。しかしながら、こ
の発明は他のFeLV株及びサブグループのgp70又はgp70−
p15E配列に相同な配列を含むポリペプチド、gp70配列が
trpLE′配列以外のDNAの発現に由来するポリペプチドに
融合している融合蛋白質、及びE.コリ以外の形質転換可
能な微生物、例えば他の細菌及び酵母又はウイルスによ
るポリペプチドの発現（これらの生物中で異種性遺伝子
配列を複製しそして発現することができるベクターを使
用）を包含することが意図されることが評価されるであ
ろう。
従って、例示によって次の例が与えられるが、なんらこ
の発明を限定することは意図されない。例において使用
される略号は、DTTはジチオスレイトール;ATPはアデノ
シントリホスフェート;dTTPはデオキシチミジントリホ
スフェート;SDSはドデシル硫酸ナトリウム;SDS−PAGEは
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳
電;EDTAはエチレンジアミン四酢酸;Acはアセテート、BS
Aはウシ血清アルブミン;ELISAはエンザイムリンクドイ
ムノソルベントアッセイ;DEAEはジエチルアミノエチル;
ABTSは2,2′−アジノ−ジ−（３−エチルベンズチアゾ
リンスルホン酸;HFは弗化水素酸をそれぞれ示す。
の発明を限定することは意図されない。例において使用
される略号は、DTTはジチオスレイトール;ATPはアデノ
シントリホスフェート;dTTPはデオキシチミジントリホ
スフェート;SDSはドデシル硫酸ナトリウム;SDS−PAGEは
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳
電;EDTAはエチレンジアミン四酢酸;Acはアセテート、BS
Aはウシ血清アルブミン;ELISAはエンザイムリンクドイ
ムノソルベントアッセイ;DEAEはジエチルアミノエチル;
ABTSは2,2′−アジノ−ジ−（３−エチルベンズチアゾ
リンスルホン酸;HFは弗化水素酸をそれぞれ示す。
例 一般的方法 核酸の操作において使用されるすべての酵素はニューイ
ングランドビオラブスもしくはベセスダリサーチラブス
のいずれかから入手し、又は製造者の推奨する方法によ
って調製した。DNAの消化及び連結、ゲル電気泳電によ
るDNA断片の単離、並びに細菌宿主の形質転換及び選択
のために使用される条件は組換DNAの分野において当業
者によく知られている標準的方法である。この発明の実
施において使用されるこれらの及び他の分子クローニン
グ技法は、マニアチス当、“モレキュラー・クローニン
グ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Clonin
g:A Laboratory Manual）”、コールドスプリングハー
バーラボラトリーズ（1982）に見ることができる。
ングランドビオラブスもしくはベセスダリサーチラブス
のいずれかから入手し、又は製造者の推奨する方法によ
って調製した。DNAの消化及び連結、ゲル電気泳電によ
るDNA断片の単離、並びに細菌宿主の形質転換及び選択
のために使用される条件は組換DNAの分野において当業
者によく知られている標準的方法である。この発明の実
施において使用されるこれらの及び他の分子クローニン
グ技法は、マニアチス当、“モレキュラー・クローニン
グ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Clonin
g:A Laboratory Manual）”、コールドスプリングハー
バーラボラトリーズ（1982）に見ることができる。
制限酵素によるDNAの消化は、特にことわりない限り完
全消化であり、そして37℃にて１〜５ユニット酵素／μ
gDNA、30〜60分を必要とする。幾つかの消化は意図的に
部分的であり、この場合各分子上のすべての部位より少
ない部位が消化される。これらは一般に37℃にて0.05〜
0.5ユニット酵素／μgDNA、10〜60分間で行われる。
全消化であり、そして37℃にて１〜５ユニット酵素／μ
gDNA、30〜60分を必要とする。幾つかの消化は意図的に
部分的であり、この場合各分子上のすべての部位より少
ない部位が消化される。これらは一般に37℃にて0.05〜
0.5ユニット酵素／μgDNA、10〜60分間で行われる。
T4DNAリガーゼを用いる連結は、接着末端の連結のため
には0.1mM ATP及び0.01〜0.05weissユニットのリガーゼ
/20μ反応、又は平滑末端の連結のためには1.0mM ATP
及び1.0〜5.0weissユニットのリガーゼ/20μ反応を含
有する66mM Tris−HCl（pH7.6）,6.6mM MgCl2,10mM DTT
中で行われる。反応は14℃にて６〜12時間行われる。分
子間反応は、接着末端連結のためには20〜150μg/mlの
ベクターDNAを必要とし、そして平滑末端連結のために
は100〜200μg/mlのベクターDNAを必要とする。挿入DNA
においてはベクターDNAを超えて１〜20倍過剰量が維持
される。分子内反応は10〜20μg/mlのベクターDNAを必
要とする。
には0.1mM ATP及び0.01〜0.05weissユニットのリガーゼ
/20μ反応、又は平滑末端の連結のためには1.0mM ATP
及び1.0〜5.0weissユニットのリガーゼ/20μ反応を含
有する66mM Tris−HCl（pH7.6）,6.6mM MgCl2,10mM DTT
中で行われる。反応は14℃にて６〜12時間行われる。分
子間反応は、接着末端連結のためには20〜150μg/mlの
ベクターDNAを必要とし、そして平滑末端連結のために
は100〜200μg/mlのベクターDNAを必要とする。挿入DNA
においてはベクターDNAを超えて１〜20倍過剰量が維持
される。分子内反応は10〜20μg/mlのベクターDNAを必
要とする。
GA−FeLV−Ｂの分子クローニング及び特徴付け ムリンス等、ジャーナル・オブ・ビロロジー（J.Viro
l.）（1981）38:688により記載されている様にして、分
子クローン化GA−FeLV−Ｂプロウイルスをファージラム
ダ中の組換体DNAの形で得た。要約すれば、GA−FeLV−
Ｂに感染された細胞からのヒトゲノムDNAがEcoRIで消化
され、そしてラムダーファージシャロン4Aに分子クロー
ン化された。このような分子クローン化プロウイルスの
１つ（ラムダHF60）はトランスフェクションによりイヌ
Ｄ−170細胞に導入された場合に感染性であることも著
者によって示された（ムリンス等、前掲）。次に、完全
なプロウイルス配列及びこのウイルスが組み込まれたフ
ランキングヒト配列を含むラムダHF60のEcoRl断片が細
菌プラスミドpKC7〔ラオ及びロジャース、ジーン（Gen
e）（1979）7:79〕のユニークEcoRI部位に分子クローン
化された。pKHR1と称する得られたプラスミド（A.ロー
チ及びN.ダビドソン）を第１図に示す。分子クローン化
プロウイルスの方向付けが、ムリンス等ニユークレイッ
ク・アシズ・リサーチ（Nucl.Acids Res.）（1980）8:3
287に記載されているようにしてウイルスRNAゲノムに関
して決定された。
l.）（1981）38:688により記載されている様にして、分
子クローン化GA−FeLV−Ｂプロウイルスをファージラム
ダ中の組換体DNAの形で得た。要約すれば、GA−FeLV−
Ｂに感染された細胞からのヒトゲノムDNAがEcoRIで消化
され、そしてラムダーファージシャロン4Aに分子クロー
ン化された。このような分子クローン化プロウイルスの
１つ（ラムダHF60）はトランスフェクションによりイヌ
Ｄ−170細胞に導入された場合に感染性であることも著
者によって示された（ムリンス等、前掲）。次に、完全
なプロウイルス配列及びこのウイルスが組み込まれたフ
ランキングヒト配列を含むラムダHF60のEcoRl断片が細
菌プラスミドpKC7〔ラオ及びロジャース、ジーン（Gen
e）（1979）7:79〕のユニークEcoRI部位に分子クローン
化された。pKHR1と称する得られたプラスミド（A.ロー
チ及びN.ダビドソン）を第１図に示す。分子クローン化
プロウイルスの方向付けが、ムリンス等ニユークレイッ
ク・アシズ・リサーチ（Nucl.Acids Res.）（1980）8:3
287に記載されているようにしてウイルスRNAゲノムに関
して決定された。
第２図は、FeLVのenv遺伝子並びにgp70及びp15E蛋白質
をコードする配列の位置を示す。env遺伝子はgp85前駆
体蛋白質をコードし、この蛋白質は感染された細胞の幕
に輸送され、そしてウイルスの出現の際、成熟ウイルス
エンベロープ蛋白質gp70及びp15Eに切断される。gp70蛋
白質はウイルスが細胞受容器に特異的に結合して感染を
完成することに関与し、そして感染に対するウイルス中
和抗体反応の生成に関与する多くの抗原決定基を含有す
ることが知られている。
をコードする配列の位置を示す。env遺伝子はgp85前駆
体蛋白質をコードし、この蛋白質は感染された細胞の幕
に輸送され、そしてウイルスの出現の際、成熟ウイルス
エンベロープ蛋白質gp70及びp15Eに切断される。gp70蛋
白質はウイルスが細胞受容器に特異的に結合して感染を
完成することに関与し、そして感染に対するウイルス中
和抗体反応の生成に関与する多くの抗原決定基を含有す
ることが知られている。
EeLV env遺伝子の位置を決定するために、分子クローン
化GA−FeLV−Ｂウイルスの３′部分のヌクレオチド配列
を決定した。標準的DNA配列決定法及びストラテジーを
用いた〔マキサム及びギルバート、メソズ・イン・エン
チモロジー（Meth.Enz.）（1980）65:499;サンガー等、
PNAS（1977）74:5463;メッシング等、ニュークレイック
・アシズ・リサーチ（Nucl.Acids Res.）（1981）309を
参照のこと〕。GA−FeLV−B env遺伝子及びLTR領域のヌ
クレオチド配列、並びにenv遺伝子生成物の推定アミノ
酸配列を第３図に示す。公知のネズミ白血病ウイルスp7
0及びp15Eとの蛋白質配列の相同性は、それぞれのFeLV
蛋白質と得られるヌクレオチド配列との関連付けを可能
にした。配列は、エルダー、J.H.及びムリンス、J.I.、
ジャーナル・オブ・ビロロジー（D.Virology）（1983）
46:871−880により決定されたそれと同一である。
化GA−FeLV−Ｂウイルスの３′部分のヌクレオチド配列
を決定した。標準的DNA配列決定法及びストラテジーを
用いた〔マキサム及びギルバート、メソズ・イン・エン
チモロジー（Meth.Enz.）（1980）65:499;サンガー等、
PNAS（1977）74:5463;メッシング等、ニュークレイック
・アシズ・リサーチ（Nucl.Acids Res.）（1981）309を
参照のこと〕。GA−FeLV−B env遺伝子及びLTR領域のヌ
クレオチド配列、並びにenv遺伝子生成物の推定アミノ
酸配列を第３図に示す。公知のネズミ白血病ウイルスp7
0及びp15Eとの蛋白質配列の相同性は、それぞれのFeLV
蛋白質と得られるヌクレオチド配列との関連付けを可能
にした。配列は、エルダー、J.H.及びムリンス、J.I.、
ジャーナル・オブ・ビロロジー（D.Virology）（1983）
46:871−880により決定されたそれと同一である。
ptGA中間体の造成 FeLV env抗原の発現を指令する細菌プラスミドはFeLV抗
原を含む融合蛋白質の発現に関連する幾つかの要素を含
有する。第４図に言及して、領域Ｉ及びIIはそれぞれ、
E.コリ−トリプトファンプロモーター／オペレーター／
リボゾーム結合部位の配列及びE.コリtrpLE′蛋白質を
コードする配列〔蛋白質コード領域のＣ−末端にEcoRI
部位を導入するように変形されたE.コリtrpΔLE1413、
ミオツァリ等、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー
（J.Bac）（1978）133:1457に由来する〕を含有する。
このtrp LE′発現系はクライド等〔サイエンス（Scienc
e）（1981）214:1125、及びヨーロッパ特許出願No.8130
1227.5〕によりすでに記載されている。
原を含む融合蛋白質の発現に関連する幾つかの要素を含
有する。第４図に言及して、領域Ｉ及びIIはそれぞれ、
E.コリ−トリプトファンプロモーター／オペレーター／
リボゾーム結合部位の配列及びE.コリtrpLE′蛋白質を
コードする配列〔蛋白質コード領域のＣ−末端にEcoRI
部位を導入するように変形されたE.コリtrpΔLE1413、
ミオツァリ等、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー
（J.Bac）（1978）133:1457に由来する〕を含有する。
このtrp LE′発現系はクライド等〔サイエンス（Scienc
e）（1981）214:1125、及びヨーロッパ特許出願No.8130
1227.5〕によりすでに記載されている。
trpLE′のヌクレオチド配列を第７図に示す。領域IV
は、FeLV env蛋白質の種々の領域をコードするDNAを含
有する。領域IIIは合成オリゴヌクレオチドリンカーに
由来し、このリンカーは、必要な場合に、全融合蛋白質
にわたって翻訳リーディングフレームを維持するように
trpLE′配列とFeLV配列とを融合するために使用され
る。
は、FeLV env蛋白質の種々の領域をコードするDNAを含
有する。領域IIIは合成オリゴヌクレオチドリンカーに
由来し、このリンカーは、必要な場合に、全融合蛋白質
にわたって翻訳リーディングフレームを維持するように
trpLE′配列とFeLV配列とを融合するために使用され
る。
この明細書に記載する細菌プラスミド造成物ptGAΔAva
I、ptGAΔApaI、及びpt9:3−19は、FeLVgp70の種々の領
域を含有するこのような融合蛋白質をコードする。これ
らのプラスミドは、第５図に略図で示されるようにtrpL
E′に融合した完全FeLVgp85前駆体蛋白質の配列を含有
する中間体プラスミドptGAを介して造成された。このス
トラテジーは、FeLV env遺伝子のシグナルペプチド/gp7
0連結部に存在するBalI制限部位を用いる。プラスミドp
KHR1をBalIにより部分解（0.1〜1.0ユニット／μg DN
A、10〜30分間、37℃）し、そして次にEocRIにより完全
消化（１〜５ユニット／μg DNA、30〜60分間、37℃）
した。シグナルペプチド/gp70連結部３′側からgp85配
列を通って、そしてプロウイルスの３′末端に接するヒ
ト配列中のEcoRI部位で終る目的の2.8kb断片をアガロー
スゲスでの電気泳動により単離した。この断片を、アン
ピシリン耐性遺伝子を含有するベクターpBR322の2.9kb
BalI−Eco RI断片に分子クローニングした。このベクタ
ー断片は、BalI及びEcoRI（BalI:1〜５ユニット／μg D
NA、30〜60分間、37℃;EcoRI:上記の通り）で完全消化
した後にアガロースゲル中での電気泳動により単離して
おいた。次に、上記のpBR322断片及びFeLVgp85断片を含
有する連結混合物（T4 DNAリガーゼ：接着末端EocRI部
位の第１段階連結のために、ベクター断片を超える１〜
20倍過剰量のFeLV断片、10〜100μg/mlのベクター断
片、66mM TrisHCl−pH7.6、6.6mM MgCl310mM DTT、0.1m
M ATP、0.01〜0.05weissユニット/20μ反応、14℃に
て４〜12時間;BalI末端の第２段階分子内平滑末端連結
のために、1mM ATP及び1.0〜5.0weissユニットのリガー
ゼ/20μ反応を含有する上記緩衝液中に10〜20μg/ml
のベクターに希釈し、そして14℃にて12時間インキュベ
ート）を用いてE.コリK12株MM294をアンピシリン耐性に
形質転換した。誘導されたプラスミドをEcoRI及びBalI
制限部位の再生について試験した。このようなプラスミ
ドの１つをpGAenvと称する（第５図パート１）。
I、ptGAΔApaI、及びpt9:3−19は、FeLVgp70の種々の領
域を含有するこのような融合蛋白質をコードする。これ
らのプラスミドは、第５図に略図で示されるようにtrpL
E′に融合した完全FeLVgp85前駆体蛋白質の配列を含有
する中間体プラスミドptGAを介して造成された。このス
トラテジーは、FeLV env遺伝子のシグナルペプチド/gp7
0連結部に存在するBalI制限部位を用いる。プラスミドp
KHR1をBalIにより部分解（0.1〜1.0ユニット／μg DN
A、10〜30分間、37℃）し、そして次にEocRIにより完全
消化（１〜５ユニット／μg DNA、30〜60分間、37℃）
した。シグナルペプチド/gp70連結部３′側からgp85配
列を通って、そしてプロウイルスの３′末端に接するヒ
ト配列中のEcoRI部位で終る目的の2.8kb断片をアガロー
スゲスでの電気泳動により単離した。この断片を、アン
ピシリン耐性遺伝子を含有するベクターpBR322の2.9kb
BalI−Eco RI断片に分子クローニングした。このベクタ
ー断片は、BalI及びEcoRI（BalI:1〜５ユニット／μg D
NA、30〜60分間、37℃;EcoRI:上記の通り）で完全消化
した後にアガロースゲル中での電気泳動により単離して
おいた。次に、上記のpBR322断片及びFeLVgp85断片を含
有する連結混合物（T4 DNAリガーゼ：接着末端EocRI部
位の第１段階連結のために、ベクター断片を超える１〜
20倍過剰量のFeLV断片、10〜100μg/mlのベクター断
片、66mM TrisHCl−pH7.6、6.6mM MgCl310mM DTT、0.1m
M ATP、0.01〜0.05weissユニット/20μ反応、14℃に
て４〜12時間;BalI末端の第２段階分子内平滑末端連結
のために、1mM ATP及び1.0〜5.0weissユニットのリガー
ゼ/20μ反応を含有する上記緩衝液中に10〜20μg/ml
のベクターに希釈し、そして14℃にて12時間インキュベ
ート）を用いてE.コリK12株MM294をアンピシリン耐性に
形質転換した。誘導されたプラスミドをEcoRI及びBalI
制限部位の再生について試験した。このようなプラスミ
ドの１つをpGAenvと称する（第５図パート１）。
trpLE′発現ベクターのEcoRI部位に、適切なリーディン
グフレーム内に完全gp85配列を分子内クローニングする
ことを可能にするために、合成オリゴヌクレオチドアダ
プターを使用した。プラスミドpSYC79中の合成オリゴヌ
クレオチドのヌクレオチド配列を第５図パート２に示
す。BamHI、SmaI/XmaI、EcoRI部位を含有するポリリン
カーが２コピーの合成E.コリlac遺伝子オペレーター配
列の両端に隣接する。このアダプターを含有するプラス
ミドは細菌宿主lacオペロンの誘導をもたらし、そして
そのためにこれらの細胞のコロニーはＸ−galプレート
上で青色表現型を示す。ptGAプラスミドの造成における
このアダプターの使用を第５図パート２に示す。プラス
ミドpSYC79をXmaIにより消化してポリリンカーを切断
し、そしてその部位をPolI（Klenow断片）によりフィル
−インした（XmaI:1〜５ユニット／μｇ、30〜60分間、
37℃;Klenou酵素：マニアチス等、前掲、394頁に記載さ
れているようにして修復反応を実施）。得られた小平滑
末端アダプター断片をポリアクリルアミドゲル電気泳動
により精製した。プラスミドpGAenvをBalIで部分消化し
（上記）、そして精製されたアダプター断片に連結した
〔T4 DNAリガーゼ：分子間平滑末端連結を上記（分子
内）のようにして、しかし200μg/mlのベクター及び20
〜100倍のアダプターにおいて実施した〕。この材料を
用いてE.コリK12株MM294をアンピシリン耐性に、そして
Ｘ−galプレート上で青色表現型を示すように形質転換
した。得られたプラスミドをEcoRIで分析して所望のBal
I部位における挿入を証明し、そしてHaeIIIで分析して
アダプター/BalI部位の連結部の適切な融合の確認し
た。後者は連続部のDNA配列決定により確認された。１
つのこのようなプラスミドをpGAenv−lacと称する（第
５図パート２）。
グフレーム内に完全gp85配列を分子内クローニングする
ことを可能にするために、合成オリゴヌクレオチドアダ
プターを使用した。プラスミドpSYC79中の合成オリゴヌ
クレオチドのヌクレオチド配列を第５図パート２に示
す。BamHI、SmaI/XmaI、EcoRI部位を含有するポリリン
カーが２コピーの合成E.コリlac遺伝子オペレーター配
列の両端に隣接する。このアダプターを含有するプラス
ミドは細菌宿主lacオペロンの誘導をもたらし、そして
そのためにこれらの細胞のコロニーはＸ−galプレート
上で青色表現型を示す。ptGAプラスミドの造成における
このアダプターの使用を第５図パート２に示す。プラス
ミドpSYC79をXmaIにより消化してポリリンカーを切断
し、そしてその部位をPolI（Klenow断片）によりフィル
−インした（XmaI:1〜５ユニット／μｇ、30〜60分間、
37℃;Klenou酵素：マニアチス等、前掲、394頁に記載さ
れているようにして修復反応を実施）。得られた小平滑
末端アダプター断片をポリアクリルアミドゲル電気泳動
により精製した。プラスミドpGAenvをBalIで部分消化し
（上記）、そして精製されたアダプター断片に連結した
〔T4 DNAリガーゼ：分子間平滑末端連結を上記（分子
内）のようにして、しかし200μg/mlのベクター及び20
〜100倍のアダプターにおいて実施した〕。この材料を
用いてE.コリK12株MM294をアンピシリン耐性に、そして
Ｘ−galプレート上で青色表現型を示すように形質転換
した。得られたプラスミドをEcoRIで分析して所望のBal
I部位における挿入を証明し、そしてHaeIIIで分析して
アダプター/BalI部位の連結部の適切な融合の確認し
た。後者は連続部のDNA配列決定により確認された。１
つのこのようなプラスミドをpGAenv−lacと称する（第
５図パート２）。
EcoRIにより消化（上記のように）した後、得られるア
ダプター付FeLVgp85配列含有pGAenv−lacの2.8kb EcoRI
断片を電気泳動により単離し、そしてやはりFcoRIによ
り消化された（上記のように）ptrpLE′に連結（T4 DNA
リガーゼ：上記のような接着末端連結）した。プラスミ
ドptrpLE′は、trpLE′遺伝子のATGの285bp上流のPvuII
部位からLE′遺伝子のＣ−末端に形成されたEcoRI部位
までのE.コリtrpΔLE1413オペロンの配列を含有する
（このtrpΔLE1413配列はヨーロッパ特許出願No.813012
27.5に記載されている）。このPvuII−EcoRI断片はpBR3
22のPvuII−EcoRI断片に分子クローニングされているも
のである。第６図に示されている得られたプラスミドは
アンピシリン耐性を提供し、そしてtrpLE′蛋白質断片
をコードする。第７図はLE′遺伝子及び推定されるアミ
ノ酸配列を示す。ptrpLE′ベクター及び2.8kb FeLVgp85
断片を含有する連結混合を用いてE.コリK12 MM294をア
ンピシリン耐性及びＸ−galプレート上での白色表現型
に形質転換した。得られたプラスミドをEcoRIで分析し
て部位の再生を確認し、そしてHindIII及びPvuIIで分析
して挿入されたEcoRI断片の方向を決定した。正しい方
向に挿入部を含有する１つのプラスミドをptGAと称す
る。第５図パート３に示されるこのプラスミドは適切な
リーディングフレーム内にtrpLE′発現ベクターに融合
したFeLV gp85配列を含有する。ptGA中のtrpLE′/gp70
連結部におけるヌクレオチド配列及び推定されるアミノ
酸配列を第８図に示す。このプラスミドを、プラスミド
ptGAΔAvaI、ptGAΔApa、及びpt9:3−19のその後の造成
のための中間体として使用した。
ダプター付FeLVgp85配列含有pGAenv−lacの2.8kb EcoRI
断片を電気泳動により単離し、そしてやはりFcoRIによ
り消化された（上記のように）ptrpLE′に連結（T4 DNA
リガーゼ：上記のような接着末端連結）した。プラスミ
ドptrpLE′は、trpLE′遺伝子のATGの285bp上流のPvuII
部位からLE′遺伝子のＣ−末端に形成されたEcoRI部位
までのE.コリtrpΔLE1413オペロンの配列を含有する
（このtrpΔLE1413配列はヨーロッパ特許出願No.813012
27.5に記載されている）。このPvuII−EcoRI断片はpBR3
22のPvuII−EcoRI断片に分子クローニングされているも
のである。第６図に示されている得られたプラスミドは
アンピシリン耐性を提供し、そしてtrpLE′蛋白質断片
をコードする。第７図はLE′遺伝子及び推定されるアミ
ノ酸配列を示す。ptrpLE′ベクター及び2.8kb FeLVgp85
断片を含有する連結混合を用いてE.コリK12 MM294をア
ンピシリン耐性及びＸ−galプレート上での白色表現型
に形質転換した。得られたプラスミドをEcoRIで分析し
て部位の再生を確認し、そしてHindIII及びPvuIIで分析
して挿入されたEcoRI断片の方向を決定した。正しい方
向に挿入部を含有する１つのプラスミドをptGAと称す
る。第５図パート３に示されるこのプラスミドは適切な
リーディングフレーム内にtrpLE′発現ベクターに融合
したFeLV gp85配列を含有する。ptGA中のtrpLE′/gp70
連結部におけるヌクレオチド配列及び推定されるアミノ
酸配列を第８図に示す。このプラスミドを、プラスミド
ptGAΔAvaI、ptGAΔApa、及びpt9:3−19のその後の造成
のための中間体として使用した。
ptGAΔAvaIの造成 ptGAΔAvaIプラスミドは、FeLVgp70のＣ−端側半分とp1
5EのＮ−端領域とに由来する約240個のアミノ酸を含有
するtrpLE′融合蛋白質である。このプラスミドは、第
９図に概略示すようにしてptGAから、中間体造成物ptGA
BalI−HindIII（この造成中においては、p15Eをコード
する配列中のユニークBalI部位と、pHKR1中に組み込ま
れたFeLVプロウイルスの３′−末端に隣接する配列中の
ユニークHindIII部位との間のptGA配列が除去されてい
る）を介して誘導された。ptGA BalI−HindIIIは次のよ
うにして造成された。
5EのＮ−端領域とに由来する約240個のアミノ酸を含有
するtrpLE′融合蛋白質である。このプラスミドは、第
９図に概略示すようにしてptGAから、中間体造成物ptGA
BalI−HindIII（この造成中においては、p15Eをコード
する配列中のユニークBalI部位と、pHKR1中に組み込ま
れたFeLVプロウイルスの３′−末端に隣接する配列中の
ユニークHindIII部位との間のptGA配列が除去されてい
る）を介して誘導された。ptGA BalI−HindIIIは次のよ
うにして造成された。
ptGAをBalI及びHindIIIにより消化し、そしてHindIII部
位をKlenow断片により上記のようにして修復した。次の
この材料を連結し（T4リガーゼ：上記のような分子内平
滑末端条件）そしてE.コリをアンピシリン耐性に形質転
換するために使用した。得られたコロニーのプラスミド
をスクリーニングし、FeLV配列を含有する2.8kb EcoRI
断片からの1.0kbの除去を確実にした。翻訳はHindIII部
位に遠位の配列中の終止コドンにおいて停止する。次
に、このプラスミドptGA BalI−HindIIIを使用してptGA
ΔAvaIを形成した。プラスミドをAvaIで完全消化（Ava
I:1〜５ユニット／μg DNA、30〜60分間、37℃）し、そ
してEocRIで部分消化（EcoRI:0.05〜0.2ユニット／μg
DNA、10〜30分間、37℃）した。末端をKlenow断片で修
復し、そして約4kbのAvaI−部分EcoRI断片をゲル電気泳
動により単離した。次にこれを再環化（T4 DNAリガー
ゼ：上記のような分子内平滑末端条件）し、そしてこれ
を使用してE.コリをアンピシリン耐性に形質転換した。
誘導されたコロニーのプラスミドを、trpLE′−FeLV配
列連結部における連結部位のEcoRI部位の再生について
スクリーニングした。翻訳リーディングフレームはこの
連結部にわたって維持される。このプラスミドをptGAΔ
AvaIと称する。
位をKlenow断片により上記のようにして修復した。次の
この材料を連結し（T4リガーゼ：上記のような分子内平
滑末端条件）そしてE.コリをアンピシリン耐性に形質転
換するために使用した。得られたコロニーのプラスミド
をスクリーニングし、FeLV配列を含有する2.8kb EcoRI
断片からの1.0kbの除去を確実にした。翻訳はHindIII部
位に遠位の配列中の終止コドンにおいて停止する。次
に、このプラスミドptGA BalI−HindIIIを使用してptGA
ΔAvaIを形成した。プラスミドをAvaIで完全消化（Ava
I:1〜５ユニット／μg DNA、30〜60分間、37℃）し、そ
してEocRIで部分消化（EcoRI:0.05〜0.2ユニット／μg
DNA、10〜30分間、37℃）した。末端をKlenow断片で修
復し、そして約4kbのAvaI−部分EcoRI断片をゲル電気泳
動により単離した。次にこれを再環化（T4 DNAリガー
ゼ：上記のような分子内平滑末端条件）し、そしてこれ
を使用してE.コリをアンピシリン耐性に形質転換した。
誘導されたコロニーのプラスミドを、trpLE′−FeLV配
列連結部における連結部位のEcoRI部位の再生について
スクリーニングした。翻訳リーディングフレームはこの
連結部にわたって維持される。このプラスミドをptGAΔ
AvaIと称する。
ptGAΔApaIの造成 プラスミドptGAΔApaIは、env遺伝子生成物のアミノ酸1
67−293由来のgp70の約120アミノ酸を含有するtrpLE′
融合蛋白質をコードする。このプラスミドは、ptGAか
ら、第10図に概略示すようにして、中間体造成物ptGA R
saI（この造成物においては、アミノ酸293−294のRsaI
に遠位のgp70コード配列が除去されている。を介して誘
導した。ptGA RsaIを次のようにして造成した（第10図
パート１）。ptGAをSmaIにより完全消化（SmaI:1〜５ユ
ニット／μg DNA、30〜60分間、37℃）し、そして次にE
ocRIにより部分消化（EcoRI:0.05〜0.2ユニット／μg D
NA、10〜30間、37℃）し、そして約3.4kbのベクター断
片を単離した。次に、プラスミドptGAをEcoRI（EcoRI:1
〜５ユニット／μg DNA、30〜60分間、37℃）及びRsaI
（RsaI:1〜５ユニット／μg DNA、30〜60分間、37℃）
により完全消化し、そしてgp70のアミノ−端側半分をコ
ードする配列を含有する780bp EcoRI−RsaI断片を単離
した。この断片をベクターに連結（T4リガーゼー:2段階
法；分子間接着末端、及び分子内平滑末端）し、そして
この混合物を用いてE.コリをアンピシリン耐性にした。
得られたプラスミドをEcoRIを用いてスクリーニング
し、そして目的プラスミドをptGAΔRsaIと称する。
67−293由来のgp70の約120アミノ酸を含有するtrpLE′
融合蛋白質をコードする。このプラスミドは、ptGAか
ら、第10図に概略示すようにして、中間体造成物ptGA R
saI（この造成物においては、アミノ酸293−294のRsaI
に遠位のgp70コード配列が除去されている。を介して誘
導した。ptGA RsaIを次のようにして造成した（第10図
パート１）。ptGAをSmaIにより完全消化（SmaI:1〜５ユ
ニット／μg DNA、30〜60分間、37℃）し、そして次にE
ocRIにより部分消化（EcoRI:0.05〜0.2ユニット／μg D
NA、10〜30間、37℃）し、そして約3.4kbのベクター断
片を単離した。次に、プラスミドptGAをEcoRI（EcoRI:1
〜５ユニット／μg DNA、30〜60分間、37℃）及びRsaI
（RsaI:1〜５ユニット／μg DNA、30〜60分間、37℃）
により完全消化し、そしてgp70のアミノ−端側半分をコ
ードする配列を含有する780bp EcoRI−RsaI断片を単離
した。この断片をベクターに連結（T4リガーゼー:2段階
法；分子間接着末端、及び分子内平滑末端）し、そして
この混合物を用いてE.コリをアンピシリン耐性にした。
得られたプラスミドをEcoRIを用いてスクリーニング
し、そして目的プラスミドをptGAΔRsaIと称する。
プラスミドptGAΔApaIを、ptGAΔRsaIから、gp70のアミ
ノ−端からgp70のアミノ酸174−175をコードする配列に
おけるApaI部位までをコードする配列を除去することに
より誘導した。ptGAΔpaIを次のようにして造成した
（第10図パート２）。プラスミドptGARsaIをEcoRIで部
分分解（EcoRI:0.05〜0.2ユニット／μg DNA、10〜30分
間、37℃）し、そして接着末端をDNAポリメラーゼＩ（K
lenow断片）を用いてヌクレオチドトリホスフェートの
存在下で、上記のようにして修復した。次に、この材料
をAvaIにより完全消化（AvaI:1〜５ユニット／μg DN
A、30〜60分間、37℃）して3.7kbベクター断片を得た。
この同じプラスミドptGAΔRsaIをさらにApaIにより完全
消化（PpaI:1〜ユニット／μg DNA、30〜60分間、37
℃）し、そして接着末端を上記のようにして修復した。
次に、単離された280bp ApaI−AgaI断片を、前記の２段
階法によりベクターに連結し、そしてこの混合物を用い
てE.コリをアンピシリン耐性に形質転換した。形質転換
を、EcoRI/修復−ApaI/修復連結部におけるEcoRIの再生
について、及び抗原の発現についてスクリーニングし
た。修復されたEcoRI及びApaI部位の適切な連結がtrpL
E′配列とFeLV配列とのイン−フレーム（in−frame）融
合をもたらす。目的のプラスミドをptGAΔApaIと称す
る。
ノ−端からgp70のアミノ酸174−175をコードする配列に
おけるApaI部位までをコードする配列を除去することに
より誘導した。ptGAΔpaIを次のようにして造成した
（第10図パート２）。プラスミドptGARsaIをEcoRIで部
分分解（EcoRI:0.05〜0.2ユニット／μg DNA、10〜30分
間、37℃）し、そして接着末端をDNAポリメラーゼＩ（K
lenow断片）を用いてヌクレオチドトリホスフェートの
存在下で、上記のようにして修復した。次に、この材料
をAvaIにより完全消化（AvaI:1〜５ユニット／μg DN
A、30〜60分間、37℃）して3.7kbベクター断片を得た。
この同じプラスミドptGAΔRsaIをさらにApaIにより完全
消化（PpaI:1〜ユニット／μg DNA、30〜60分間、37
℃）し、そして接着末端を上記のようにして修復した。
次に、単離された280bp ApaI−AgaI断片を、前記の２段
階法によりベクターに連結し、そしてこの混合物を用い
てE.コリをアンピシリン耐性に形質転換した。形質転換
を、EcoRI/修復−ApaI/修復連結部におけるEcoRIの再生
について、及び抗原の発現についてスクリーニングし
た。修復されたEcoRI及びApaI部位の適切な連結がtrpL
E′配列とFeLV配列とのイン−フレーム（in−frame）融
合をもたらす。目的のプラスミドをptGAΔApaIと称す
る。
pt9:3−19の造成 プラスミドpt9:3−19は、FeLVenv抗原の抗原性領域を構
成するgp70の14アミノ酸を含有するtrpLE′融合蛋白質
をコードする。このドメインの位置は、次のようにして
ウイルス中和モノクローナル抗体を用いてウイルスをマ
ッピングすることにより決定された。FL−74 FeLVのgp7
0及びp15E蛋白質の複合体〔シュナイダー、J.等、ジャ
ーナル・オブ・ビロロジー（J.Virology）（1980）33:5
97−605により記載されたようにして調製される〕に対
して向けられた抗体を分泌するハイブリドーマは、ルッ
ツ、H.等ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソズ
（J.Immun.Methods）（1983）56:209−220により記載さ
れているようにしてgp70/p15E複合体で免疫されたマウ
スからの脾臓細胞から得られた。これらのモノクローナ
ル抗体のサンプルは獣医UCデービス学校（UC Davis Sch
ool of Veterinary Medicine）、医学部、ニールスぺタ
ーソン博士から得られた。幾つかのモノクローナル抗体
を、CCC cl.81（S+,L-）細胞を用いるフォーカス形成試
験においてFeLVを中和する能力について試験した。cl.2
5と称する１つのgp70モノクローナル抗体は、FL−74 Fe
LV−Ｂを除くすべてのFeLVサブグループの試験されたす
べてのウイルスを中和することができた。この抗体を用
いて、このモノクローナル抗体による中和に関与するgp
70分子上の部位を決定した。
成するgp70の14アミノ酸を含有するtrpLE′融合蛋白質
をコードする。このドメインの位置は、次のようにして
ウイルス中和モノクローナル抗体を用いてウイルスをマ
ッピングすることにより決定された。FL−74 FeLVのgp7
0及びp15E蛋白質の複合体〔シュナイダー、J.等、ジャ
ーナル・オブ・ビロロジー（J.Virology）（1980）33:5
97−605により記載されたようにして調製される〕に対
して向けられた抗体を分泌するハイブリドーマは、ルッ
ツ、H.等ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソズ
（J.Immun.Methods）（1983）56:209−220により記載さ
れているようにしてgp70/p15E複合体で免疫されたマウ
スからの脾臓細胞から得られた。これらのモノクローナ
ル抗体のサンプルは獣医UCデービス学校（UC Davis Sch
ool of Veterinary Medicine）、医学部、ニールスぺタ
ーソン博士から得られた。幾つかのモノクローナル抗体
を、CCC cl.81（S+,L-）細胞を用いるフォーカス形成試
験においてFeLVを中和する能力について試験した。cl.2
5と称する１つのgp70モノクローナル抗体は、FL−74 Fe
LV−Ｂを除くすべてのFeLVサブグループの試験されたす
べてのウイルスを中和することができた。この抗体を用
いて、このモノクローナル抗体による中和に関与するgp
70分子上の部位を決定した。
この部位を決定するために使用した方法を第11図に示
す。pKHR1をXhoI及びEcoRIにより消化した。完全2.0kb
のエンベロープコード配列を含有するこのプラスミドの
3.1kb XhoI−EcoRI断片を単離し、そしてMn++の存在下
でDNアーゼＩで消化して、分析用アガロースゲルのEtBr
染色から判定した場合に約500〜700bpの質量平均分子量
にした。これは末端−ラベル断片の分析に基く約100bp
の数平均分子量に相当する。ヌクレオチドトリホスフェ
ートの存在下でDNAポリメラーゼ（Klenow断片）で処理
することにより断片を平滑末端化し、そして過剰量の32
P−ラベル合成EcoRIリンカー（５′−32P−GGAATTCC）
に連結した。EcoRIで消化して接着末端を形成した後、
断片をセルロース（CF−11、ワットマン）上で分画して
リンカーモノマー及び残留トリホスフェートを除去し
た。次にこの材料を、ファージ−ジャロン16中のβ−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子のアミノ酸1004−1005（Glu−Ph
e）をコードするEcoRI部位に分子クローン化した。シャ
ロン16ファージDNAをあらかじめEcoRIで消化し、そして
５′末端を細菌アルカリ性ホスファターゼを用いて脱リ
ン酸化しておくことにより挿入頻度を最大にした。EcoR
Iで消化されたファージDNA及びEcoRIアダプターを付さ
れた断片DNAを連結し、そしてステルンベルグ、Ｎ等、
ジーン（Gene）（1977）１:255−280により記載されて
いるようにして連結混合物をイン−ビトロでパッケージ
した。約30,000の独立プラークが得られ、プローブとし
てもとのXhoI−EcoRI FeLV断片を用いるイン−シチュ−
プラークハイブリダイゼーションにより判定した場合に
およそ10％が挿入部を含有していた。Ｘ−galを含有す
るプレート上に増殖したプラークの染色パターンもまた
挿入頻度を示し、β−ガラクトシダーゼ遺伝子内に挿入
部を含有するファージは白色プラーク、又はプラークの
周縁にかすかな青色の輪を示すプラークを生成した。10
％のこのライブラリーを増幅し、そして免疫スクリーニ
ングにおいて使用した。
す。pKHR1をXhoI及びEcoRIにより消化した。完全2.0kb
のエンベロープコード配列を含有するこのプラスミドの
3.1kb XhoI−EcoRI断片を単離し、そしてMn++の存在下
でDNアーゼＩで消化して、分析用アガロースゲルのEtBr
染色から判定した場合に約500〜700bpの質量平均分子量
にした。これは末端−ラベル断片の分析に基く約100bp
の数平均分子量に相当する。ヌクレオチドトリホスフェ
ートの存在下でDNAポリメラーゼ（Klenow断片）で処理
することにより断片を平滑末端化し、そして過剰量の32
P−ラベル合成EcoRIリンカー（５′−32P−GGAATTCC）
に連結した。EcoRIで消化して接着末端を形成した後、
断片をセルロース（CF−11、ワットマン）上で分画して
リンカーモノマー及び残留トリホスフェートを除去し
た。次にこの材料を、ファージ−ジャロン16中のβ−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子のアミノ酸1004−1005（Glu−Ph
e）をコードするEcoRI部位に分子クローン化した。シャ
ロン16ファージDNAをあらかじめEcoRIで消化し、そして
５′末端を細菌アルカリ性ホスファターゼを用いて脱リ
ン酸化しておくことにより挿入頻度を最大にした。EcoR
Iで消化されたファージDNA及びEcoRIアダプターを付さ
れた断片DNAを連結し、そしてステルンベルグ、Ｎ等、
ジーン（Gene）（1977）１:255−280により記載されて
いるようにして連結混合物をイン−ビトロでパッケージ
した。約30,000の独立プラークが得られ、プローブとし
てもとのXhoI−EcoRI FeLV断片を用いるイン−シチュ−
プラークハイブリダイゼーションにより判定した場合に
およそ10％が挿入部を含有していた。Ｘ−galを含有す
るプレート上に増殖したプラークの染色パターンもまた
挿入頻度を示し、β−ガラクトシダーゼ遺伝子内に挿入
部を含有するファージは白色プラーク、又はプラークの
周縁にかすかな青色の輪を示すプラークを生成した。10
％のこのライブラリーを増幅し、そして免疫スクリーニ
ングにおいて使用した。
cl.25により認識される抗原決定基を含有するβ−ガラ
クトシダーゼ融合蛋白質のE.コリでの発現を検出する能
力を評価するため、シャロン16のEcoRI部位にフレーム
内に完全な成熟FeLV gp85をコードする配列が融合して
いる組換体ファージ、シャロン16:GAを造成した。合成
ポリリンカーを用いて、エンベロープシグナルペプチド
/gp85連結部をコードする配列におけるBalI部位を前記
（ptGA）のようにしてEcoRI部位を形成するように、そ
してβ−ガラクトシダーゼのEcoRI部位とのイン−フレ
ーム融合を可能にするように適合させた。この実験から
の非クローン化ファージをcl.dt決定基の発現について
スクリーニングした。抗体によって同定されたファージ
の精製に続き、免疫スクリーニングの反復及びＸ−gal
を用いる染色の両方を行った。精製されたファージは予
想されたFeLV配列を予想された方向に含有することが示
され、そしてさらにウエスタン分析においてcl.25によ
り検出可能な融合蛋白質を生産することが示された（下
記参照のこと）。
クトシダーゼ融合蛋白質のE.コリでの発現を検出する能
力を評価するため、シャロン16のEcoRI部位にフレーム
内に完全な成熟FeLV gp85をコードする配列が融合して
いる組換体ファージ、シャロン16:GAを造成した。合成
ポリリンカーを用いて、エンベロープシグナルペプチド
/gp85連結部をコードする配列におけるBalI部位を前記
（ptGA）のようにしてEcoRI部位を形成するように、そ
してβ−ガラクトシダーゼのEcoRI部位とのイン−フレ
ーム融合を可能にするように適合させた。この実験から
の非クローン化ファージをcl.dt決定基の発現について
スクリーニングした。抗体によって同定されたファージ
の精製に続き、免疫スクリーニングの反復及びＸ−gal
を用いる染色の両方を行った。精製されたファージは予
想されたFeLV配列を予想された方向に含有することが示
され、そしてさらにウエスタン分析においてcl.25によ
り検出可能な融合蛋白質を生産することが示された（下
記参照のこと）。
ランダムDNA断片ライブラリーの最初の免疫スクリーニ
ングを100mmプレート当り約103のプラーク密度において
行った。最も単純な仮定を用いて、この実験においては
２個プレート当り１個の免疫反応性プラークの予想に相
当する。この予想はこれらの最初のスクリーニングにお
いて実現した。反復される免疫スクリーニングのために
11個の免疫反応性プラークが選択された。試験のために
選択された最初の11プラークの内１個を除くすべてが精
製を可能にする相当に確実なシグナルを与えた。Ｘ−ga
l染色パターンがこの方法においても有用であった。免
疫反応性及びＸ−gal染色により判定した場合、精製さ
れたファージは均一であった。
ングを100mmプレート当り約103のプラーク密度において
行った。最も単純な仮定を用いて、この実験においては
２個プレート当り１個の免疫反応性プラークの予想に相
当する。この予想はこれらの最初のスクリーニングにお
いて実現した。反復される免疫スクリーニングのために
11個の免疫反応性プラークが選択された。試験のために
選択された最初の11プラークの内１個を除くすべてが精
製を可能にする相当に確実なシグナルを与えた。Ｘ−ga
l染色パターンがこの方法においても有用であった。免
疫反応性及びＸ−gal染色により判定した場合、精製さ
れたファージは均一であった。
免疫反応性ファージからDNAを単離し、そしてこれらの
組換ファージの構造を制限エンドヌクレアーゼ分析によ
り試験した。ファージDNAをEcoRIで消化することによっ
て挿入断片を遊離せしめ、そしてDNAポリメラーゼＩ（K
lenow断片）を用いてdTTP及び32P−dATPによりEcoRI末
端をラベルした。ポリアクリルアミドゲル分析は、すべ
ての免疫反応性単離物が同一であり、すべてが１個のユ
ニーク50bp EcoRI断片を含有していることを示した。こ
の知見は、スクリーニングにおいて使用された増幅され
たライブラリーの複雑さの考慮からの予想と一致する。
組換ファージの構造を制限エンドヌクレアーゼ分析によ
り試験した。ファージDNAをEcoRIで消化することによっ
て挿入断片を遊離せしめ、そしてDNAポリメラーゼＩ（K
lenow断片）を用いてdTTP及び32P−dATPによりEcoRI末
端をラベルした。ポリアクリルアミドゲル分析は、すべ
ての免疫反応性単離物が同一であり、すべてが１個のユ
ニーク50bp EcoRI断片を含有していることを示した。こ
の知見は、スクリーニングにおいて使用された増幅され
たライブラリーの複雑さの考慮からの予想と一致する。
免疫反応性に関与する50bp断片のDNA配列分析を促進す
るため、シャロン16:9−３のEcoRI挿入部位を含むファ
ージDNAの領域をプラスミドpUC13〔ビエイラ、Ｊ及びメ
ッシング、J.、未公表、ベセスダ・リサーチ・ラブス・
カタログ（1983）〕にサブクローニングした。β−ガラ
クトシダーゼ遺伝子のアミノ酸をコードするユニークSs
tI部位（第12図）からEcoRI部位を通って、シャロン16
のlacオペロン断片の後に位置するPstI部位までの領域
にわたる断片。DNA配列分析は、マクサム及びギルバー
ドの化学的配列決定法を用いて行われた。配列は、EcoR
Iクローニング部位の３′に隣接するPvuII部位から読ま
れた。配列分析は、合成EcoRIリンカー配列を両端に有
するGA−FeLVエンベロープ遺伝子の43bpの挿入部を示
す。これはgp70をコードするenv遺伝子の領域のヌクレ
オチド635−678を示し、そしてβ−ガラクトシダーゼ配
列の上流及び下流の両方と共にイン−フレーム融合蛋白
質を生じさせるように存在する。コードされたgp70断片
（gp70のアミノ酸213−226）の配列を第12図に示す。配
列中の大文字はFeLV配列を示す。λ−シャロン16:9−３
ヌクレオチド配列中の検印はＴ→Ｃ変異を示す。cl.25
により認識される抗原決定基はこの14アミノ酸領域に含
まれている。
るため、シャロン16:9−３のEcoRI挿入部位を含むファ
ージDNAの領域をプラスミドpUC13〔ビエイラ、Ｊ及びメ
ッシング、J.、未公表、ベセスダ・リサーチ・ラブス・
カタログ（1983）〕にサブクローニングした。β−ガラ
クトシダーゼ遺伝子のアミノ酸をコードするユニークSs
tI部位（第12図）からEcoRI部位を通って、シャロン16
のlacオペロン断片の後に位置するPstI部位までの領域
にわたる断片。DNA配列分析は、マクサム及びギルバー
ドの化学的配列決定法を用いて行われた。配列は、EcoR
Iクローニング部位の３′に隣接するPvuII部位から読ま
れた。配列分析は、合成EcoRIリンカー配列を両端に有
するGA−FeLVエンベロープ遺伝子の43bpの挿入部を示
す。これはgp70をコードするenv遺伝子の領域のヌクレ
オチド635−678を示し、そしてβ−ガラクトシダーゼ配
列の上流及び下流の両方と共にイン−フレーム融合蛋白
質を生じさせるように存在する。コードされたgp70断片
（gp70のアミノ酸213−226）の配列を第12図に示す。配
列中の大文字はFeLV配列を示す。λ−シャロン16:9−３
ヌクレオチド配列中の検印はＴ→Ｃ変異を示す。cl.25
により認識される抗原決定基はこの14アミノ酸領域に含
まれている。
この50bp EcoRI断片をptrpLE′のEcoRI部位に分子クロ
ーン化して第13図に示すようにtrpLE′との融合蛋白質
として抗原決定基の発現を得た。サブクローニングプラ
スミドpUC13:9−３をEcoRIにより完全消化（EcoRI:1〜
５ユニット／μg DNA、30〜60分間、37℃）してEcoRI−
断片を遊離せしめ、そしてHaeIIIで消化（HaeIII:1〜５
ユニット／μg DNA、30〜60分間、37℃）してpUC13ベク
ターを不活性化した。次に、この混合物を、あらかじめ
EcoRIにより完全消化されているptrpLE′に連結（T4リ
ガーゼ：分子間接着末端）し、そしてこれを用いてE.コ
リをアンピシリン耐性に形質転換した。形質転換体を、
cl.25を用いる発現された蛋白質の免疫的分析によって
（下記）抗原を検出することによって、cl.25決定基の
出現についてスクリーニングした。幾つかの単離物は１
個の挿入されたEcoRI断片を示すサイズの抗原性融合蛋
白質を含有することが見出され、１個の単離物pt9:3−1
9は２個の挿入部を含有し、そして高度に抗原性である
ことが見出された。
ーン化して第13図に示すようにtrpLE′との融合蛋白質
として抗原決定基の発現を得た。サブクローニングプラ
スミドpUC13:9−３をEcoRIにより完全消化（EcoRI:1〜
５ユニット／μg DNA、30〜60分間、37℃）してEcoRI−
断片を遊離せしめ、そしてHaeIIIで消化（HaeIII:1〜５
ユニット／μg DNA、30〜60分間、37℃）してpUC13ベク
ターを不活性化した。次に、この混合物を、あらかじめ
EcoRIにより完全消化されているptrpLE′に連結（T4リ
ガーゼ：分子間接着末端）し、そしてこれを用いてE.コ
リをアンピシリン耐性に形質転換した。形質転換体を、
cl.25を用いる発現された蛋白質の免疫的分析によって
（下記）抗原を検出することによって、cl.25決定基の
出現についてスクリーニングした。幾つかの単離物は１
個の挿入されたEcoRI断片を示すサイズの抗原性融合蛋
白質を含有することが見出され、１個の単離物pt9:3−1
9は２個の挿入部を含有し、そして高度に抗原性である
ことが見出された。
プラスミドptGAΔAvaI、ptGAΔApaI、及びpt9:3−19に
より形質転換されたE.コリK12株MM294−１のサンプル
は、アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション
（ATCC）、12301パークラウンドライブ、ロックビレ、
メリーランドに寄託された。これらの寄託日及び寄託番
号を下に示す。 サンプル 寄 託 日 ATCC受託番号 ptGAΔAvaI 1983年12月２日 39528 ptGAΔApaI 1983年12月２日 39529 pt9:3−19 1983年12月２日 39530 これらの寄託はブダペスト条約のもとになされており、
そしてその規定に従って維持され、そして入手可能にさ
れるであろう。
より形質転換されたE.コリK12株MM294−１のサンプル
は、アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション
（ATCC）、12301パークラウンドライブ、ロックビレ、
メリーランドに寄託された。これらの寄託日及び寄託番
号を下に示す。 サンプル 寄 託 日 ATCC受託番号 ptGAΔAvaI 1983年12月２日 39528 ptGAΔApaI 1983年12月２日 39529 pt9:3−19 1983年12月２日 39530 これらの寄託はブダペスト条約のもとになされており、
そしてその規定に従って維持され、そして入手可能にさ
れるであろう。
培養 trpLE′融合プラスミドを含有するE.コリは、典型的に
はM9最小培地（マニアチス等、前掲）＋グルコース（0.
2％）、１μg/mlB1、カザミノ酸（0.5％、木炭処理）、
トリプトファン（100μg/ml）及びアンピシリン（50μg
/ml）中で非誘導条件下で増殖せしめる。E.コリ細胞はt
rpLE′融合蛋白質を発現するために種々の方法により誘
導され、この方にはａ）増殖細胞をトリプトファンを欠
く上記の培地に洗い込む方法、ｂ）増殖細胞を限定的な
トリプトファン、例えば２〜５μg/mlを含有する上記培
地に洗い込む方法、又はｃ）例えば醗酵槽中で、増殖に
よってトリプトファンの供給が涸掲するように培養する
方法が含まれる。幾つかの場合には、トリプトファンの
存在下で細胞が部分的に誘導されることが見出される。
さらに、これらの細胞はしばしば誘導された条件下でよ
りも大きな比率の非分解誘導蛋白質を含有していた。同
様の結果が富培地での一夜培養においてしばしば得られ
る。
はM9最小培地（マニアチス等、前掲）＋グルコース（0.
2％）、１μg/mlB1、カザミノ酸（0.5％、木炭処理）、
トリプトファン（100μg/ml）及びアンピシリン（50μg
/ml）中で非誘導条件下で増殖せしめる。E.コリ細胞はt
rpLE′融合蛋白質を発現するために種々の方法により誘
導され、この方にはａ）増殖細胞をトリプトファンを欠
く上記の培地に洗い込む方法、ｂ）増殖細胞を限定的な
トリプトファン、例えば２〜５μg/mlを含有する上記培
地に洗い込む方法、又はｃ）例えば醗酵槽中で、増殖に
よってトリプトファンの供給が涸掲するように培養する
方法が含まれる。幾つかの場合には、トリプトファンの
存在下で細胞が部分的に誘導されることが見出される。
さらに、これらの細胞はしばしば誘導された条件下でよ
りも大きな比率の非分解誘導蛋白質を含有していた。同
様の結果が富培地での一夜培養においてしばしば得られ
る。
trpLE′融合蛋白質の検出 上記の方法のいずれかによるtrpLE′−FeLV融合蛋白質
に誘導は、プラスミドを担持する細胞内での高屈折性の
粒子の出現をもたらす。これらの粒子は顕微鏡中で相光
学（1250X）を用いて観察することができ、そしてLE′
融合蛋白質の合成に特徴的である。
に誘導は、プラスミドを担持する細胞内での高屈折性の
粒子の出現をもたらす。これらの粒子は顕微鏡中で相光
学（1250X）を用いて観察することができ、そしてLE′
融合蛋白質の合成に特徴的である。
発現された蛋白質の特徴付け プラスミドを含有する細胞の蛋白質生成物をSDS−PAGE
〔レムリU.K.,ネイチュアー（Nature）（1970）227:68
0〕により分析した。誘導条件下又は非誘導条件下で増
殖した細胞を電気泳動に先立って超音波処理し、そして
サンプル緩衝液中で煮沸した。第14図は、ptGAΔAvaI、
ptGAΔApaI及びpt9:3−19プラスミドを含む細胞からの
蛋白質生成物のクマーシーブルー染色したゲルを示す。
ptGAΔAvaIプラスミドは予想される46kd蛋白質をコード
し、一層小さい分解生成物が観察される。ptGAΔApaIプ
ラスミドは36kd蛋白質をコードし、一層小さい分解生成
物が観察される。pt9:3−19プラスミドは25kd融合蛋白
質をコードする。
〔レムリU.K.,ネイチュアー（Nature）（1970）227:68
0〕により分析した。誘導条件下又は非誘導条件下で増
殖した細胞を電気泳動に先立って超音波処理し、そして
サンプル緩衝液中で煮沸した。第14図は、ptGAΔAvaI、
ptGAΔApaI及びpt9:3−19プラスミドを含む細胞からの
蛋白質生成物のクマーシーブルー染色したゲルを示す。
ptGAΔAvaIプラスミドは予想される46kd蛋白質をコード
し、一層小さい分解生成物が観察される。ptGAΔApaIプ
ラスミドは36kd蛋白質をコードし、一層小さい分解生成
物が観察される。pt9:3−19プラスミドは25kd融合蛋白
質をコードする。
これらの蛋白質生成物を、トウビン等、PNAS（1979）7
6:4350により最初に記載された方法の変法を用いてウエ
スタン分析により免疫的に分析した。蛋白質をSDS−PAG
Eにより分離し、そしてこのパターンを固体支持体、例
えばCNBr活性化紙に電気泳動的に移す。次に、この紙を
特異的抗体、例えばFeLV gp70に対する抗体と反応せし
め、抗体と反応する蛋白質バンドを、例えば125I−ラベ
ル−スタフィロコッカス・アウレウス（Staph.aureus）
プロテインＡを用いて可視化する〔イバリエ及びジェネ
ス，アナリティカル・バイオケミストリー（Anal.Bioch
em.）（1979）97:24〕。cl.25又はヤギ抗−FeLV gp70抗
体を用いて、第14図において観察される蛋白質生成物が
FeLV′gp70蛋白質配列を含有することが確認された。
6:4350により最初に記載された方法の変法を用いてウエ
スタン分析により免疫的に分析した。蛋白質をSDS−PAG
Eにより分離し、そしてこのパターンを固体支持体、例
えばCNBr活性化紙に電気泳動的に移す。次に、この紙を
特異的抗体、例えばFeLV gp70に対する抗体と反応せし
め、抗体と反応する蛋白質バンドを、例えば125I−ラベ
ル−スタフィロコッカス・アウレウス（Staph.aureus）
プロテインＡを用いて可視化する〔イバリエ及びジェネ
ス，アナリティカル・バイオケミストリー（Anal.Bioch
em.）（1979）97:24〕。cl.25又はヤギ抗−FeLV gp70抗
体を用いて、第14図において観察される蛋白質生成物が
FeLV′gp70蛋白質配列を含有することが確認された。
FeLV抗原の精製 ptGAを含有する誘導された細胞からの屈折性粒子を遠心
分離により精製した。細胞を、50mM Tris−Hcl,pH8.0,5
mM EPTA,150mM NaCl及び0.2％NP−40を含有する緩衝液
中に懸濁し、そして超音波処理した。溶解物を低速心遠
にかけ、FeLV抗原の粒子を主として含有するペレット
を、再懸濁、超音波処理及び遠心分離の数回のサイクル
により洗浄した。最終生成物は緩衝液に再懸濁すること
ができ、又は還元剤の存在下もしくは非存在下で１％SD
Sにより可溶化することができる。
分離により精製した。細胞を、50mM Tris−Hcl,pH8.0,5
mM EPTA,150mM NaCl及び0.2％NP−40を含有する緩衝液
中に懸濁し、そして超音波処理した。溶解物を低速心遠
にかけ、FeLV抗原の粒子を主として含有するペレット
を、再懸濁、超音波処理及び遠心分離の数回のサイクル
により洗浄した。最終生成物は緩衝液に再懸濁すること
ができ、又は還元剤の存在下もしくは非存在下で１％SD
Sにより可溶化することができる。
抗原はさらに化溶化された全細胞溶解物から調製され
た。誘導された細胞を50mM Tris−HCl,pH7,10mM EDTA,5
0mM DTT及び２％SDSを含有する緩衝液中で超音波処理す
る。溶解物を短時間加熱（100℃/5分）して蛋白質を十
分に変性せしめ、そして不溶性破片を遠心分離により除
去する。次にこの溶解物をゲル過クロマトクラフィー
（50mM NaOAc,pH5.5,0.5mM EDTA,2mM DTT及び0.1％SDS
を含有する緩衝液中セファクリルＳ−200）により画分
し、そして20kdのすべての画分をプールしそして濃縮し
た。
た。誘導された細胞を50mM Tris−HCl,pH7,10mM EDTA,5
0mM DTT及び２％SDSを含有する緩衝液中で超音波処理す
る。溶解物を短時間加熱（100℃/5分）して蛋白質を十
分に変性せしめ、そして不溶性破片を遠心分離により除
去する。次にこの溶解物をゲル過クロマトクラフィー
（50mM NaOAc,pH5.5,0.5mM EDTA,2mM DTT及び0.1％SDS
を含有する緩衝液中セファクリルＳ−200）により画分
し、そして20kdのすべての画分をプールしそして濃縮し
た。
免疫に先立って、すべてのSDS含有サンプルを最終SDS濃
度が0.1％になるまで透析する。高い％のSDS中に可溶化
した後、蛋白質は0.1％SDF中に可溶である。
度が0.1％になるまで透析する。高い％のSDS中に可溶化
した後、蛋白質は0.1％SDF中に可溶である。
約0.1〜20mgの蛋白質を適当なアジュバント（完全フロ
インドアジュバント、不完全フロインドアジュバント、
水酸化アルミニウム、又は合成アジュバント）と混合
し、そしてネコに接種するのに使用する。
インドアジュバント、不完全フロインドアジュバント、
水酸化アルミニウム、又は合成アジュバント）と混合
し、そしてネコに接種するのに使用する。
pg70及びpg70−p15E連結部配列の合成及び担体蛋白質へ
の連結 SAM II自動ペプチド合成機（ビオサーチ社，サンラファ
エル，カリホルニア）を用いて次のポリペプチドを合成
した。
の連結 SAM II自動ペプチド合成機（ビオサーチ社，サンラファ
エル，カリホルニア）を用いて次のポリペプチドを合成
した。
ペプチドＩ Ｈ−cys asp lys thr val arg leu arg arg glu pro il
e ser leu−OH ペプチドII Ｈ−cys pro glu try val try thr his phe asp lys th
r val arg leu−OH ペプチドIII Ｈ−cys met gly pro san leu val leu pro asp glu ly
s pro pro ser−OH ペプチドIV Ｈ−asp gln lys pro pro ser arg gln sea gln ile gl
u cys ser−OH これらのポリペプチドとウシ血清アルブミン、キーホー
ルリンペットヘモシアニン又はブタチログロブリンとの
接合体を次のようにして製った。11mgのＮ−マレイミド
−６−アミノカプロイル−２′−ニトロ−４′−スルホ
ン酸ナトリウム塩を6mlの0.1Mホスフェート、pH7.5,中2
2mgの担体蛋白質の溶液に加える。15分後、この溶液を
0.1Mホスフェート,pH6,中セファデックスＧ−25カラム
上でクロマトグラフイ処理する。蛋白質含有画分をプー
ルし、18mgのポリペプチドで処理する。反応を一夜行
い、溶液を６の水に対して透析し、0.01N NH4OH中セ
ファデックスＧ−50カラム上でクロマトグラフ処理し、
凍結乾燥し、そして分析する。
e ser leu−OH ペプチドII Ｈ−cys pro glu try val try thr his phe asp lys th
r val arg leu−OH ペプチドIII Ｈ−cys met gly pro san leu val leu pro asp glu ly
s pro pro ser−OH ペプチドIV Ｈ−asp gln lys pro pro ser arg gln sea gln ile gl
u cys ser−OH これらのポリペプチドとウシ血清アルブミン、キーホー
ルリンペットヘモシアニン又はブタチログロブリンとの
接合体を次のようにして製った。11mgのＮ−マレイミド
−６−アミノカプロイル−２′−ニトロ−４′−スルホ
ン酸ナトリウム塩を6mlの0.1Mホスフェート、pH7.5,中2
2mgの担体蛋白質の溶液に加える。15分後、この溶液を
0.1Mホスフェート,pH6,中セファデックスＧ−25カラム
上でクロマトグラフイ処理する。蛋白質含有画分をプー
ルし、18mgのポリペプチドで処理する。反応を一夜行
い、溶液を６の水に対して透析し、0.01N NH4OH中セ
ファデックスＧ−50カラム上でクロマトグラフ処理し、
凍結乾燥し、そして分析する。
約0.1〜20mgの各接合体をアジュバンドと混合し、試験
動物を免疫するために使用する。
動物を免疫するために使用する。
前記の融合蛋白質及びペプチド−担体蛋白質接合体をネ
ク及びモルモットにおいて次のようにしてFeLVワクチン
として試験する。
ク及びモルモットにおいて次のようにしてFeLVワクチン
として試験する。
ネコの試験：免疫原生及び有効性 ポリペプチドによりワクチン処理されたネコの血清中に
おける抗−gp70抗体及びFeLV中和抗体の存在を決定する
ことにより免疫原性を評価することができる。ワクチン
処理されたネコに対するFeLVの効果を観察することによ
って免疫保護を評価することができる。
おける抗−gp70抗体及びFeLV中和抗体の存在を決定する
ことにより免疫原性を評価することができる。ワクチン
処理されたネコに対するFeLVの効果を観察することによ
って免疫保護を評価することができる。
若いFeLV不含ネコを使用する。免疫処理に先立って０日
目に採血しそして約2mlの血清をワクチン処理前対照と
して集める。所定量のポリペプチド標品を外大腿筋肉に
筋肉内注射する。ネコ０日、21日及び42日目に免疫し、
そして７日、14日、21日、28日、35日及び42日目に採血
して試験血清を得る。
目に採血しそして約2mlの血清をワクチン処理前対照と
して集める。所定量のポリペプチド標品を外大腿筋肉に
筋肉内注射する。ネコ０日、21日及び42日目に免疫し、
そして７日、14日、21日、28日、35日及び42日目に採血
して試験血清を得る。
免疫原性は抗FeLV gp70抗体のELISA測定により次のよう
にして決定した。イムロンIIミクロタイタープレート
（ダイナテク）に精製されたFeLV gp70を37℃にて３時
間被覆する。100μの被覆緩衝液（0.1M Na2CO3,0.02
％NaN3,pH9.6）中ウエル当り50ngの蛋白質を使用する。
次に、プレートを４℃にて一夜貯蔵する。数週間安定で
ある。プレートをELISA洗浄液（0.15M0.05％トウィーン
20）で３回洗浄し、そして100μの実験動物血清を緩
衝液３（緩衝液３＝0.15M NaCl,0.001M EDTA,0.05M Tri
s−HCl,pH7.4,0.05％トウィーン20）中に希釈（通常1:5
0）し、gp70を被覆したウエルに加え、そして37℃にて
一時間インキュベートした。
にして決定した。イムロンIIミクロタイタープレート
（ダイナテク）に精製されたFeLV gp70を37℃にて３時
間被覆する。100μの被覆緩衝液（0.1M Na2CO3,0.02
％NaN3,pH9.6）中ウエル当り50ngの蛋白質を使用する。
次に、プレートを４℃にて一夜貯蔵する。数週間安定で
ある。プレートをELISA洗浄液（0.15M0.05％トウィーン
20）で３回洗浄し、そして100μの実験動物血清を緩
衝液３（緩衝液３＝0.15M NaCl,0.001M EDTA,0.05M Tri
s−HCl,pH7.4,0.05％トウィーン20）中に希釈（通常1:5
0）し、gp70を被覆したウエルに加え、そして37℃にて
一時間インキュベートした。
プレートをELISA洗浄液で３回洗浄し、37℃にて45分
間、ホースラディッシュに接合したラビット抗−ネコ抗
体の緩衝液３中1:200希釈物100μ／ウエルと反応せし
める。
間、ホースラディッシュに接合したラビット抗−ネコ抗
体の緩衝液３中1:200希釈物100μ／ウエルと反応せし
める。
プレートをFLISA洗浄液により３回洗浄し、そして100μ
の基質溶液（5ml,0.05Mクエン酸,pH4,＋20μの27.4
5mg/ml ABTS＋20μの２％H2O2）と、バックグラウン
ド発色に対するシグナルが適当になるまで反応せしめ
る。0.2M HFにより反応を停止し、そして405nmにおける
光学濃度を決定する。
の基質溶液（5ml,0.05Mクエン酸,pH4,＋20μの27.4
5mg/ml ABTS＋20μの２％H2O2）と、バックグラウン
ド発色に対するシグナルが適当になるまで反応せしめ
る。0.2M HFにより反応を停止し、そして405nmにおける
光学濃度を決定する。
ネコ血清中のウイルス中和抗体をフォーカス形成アッセ
イにより次のようにして決定する。クローン81細胞は不
完全なネズミ肉腫ウイルスゲノムを含有する。細胞にFe
LVが感染した後、非−不完全FeLVが肉腫ウイルスの発
現、及びそれ故に形質転換された細胞の表現形質の出現
を可能にする。形質転換された細胞は局所的に蓄積する
ため、フォーカスが出現する。使用される方法はフィシ
ンジャー等、ジャーナル・オブ・ビロロギー（J.Viro
l.）（1974）14:177−179からのものである。組織培養
皿に、15％の加熱不活性化ウシ胎児血清及び50μg/mlの
ゼンタマイシンを補充したマッコイ5A培地5ml中２×105
CCCクローン81（Ｓ＋Ｌ−）細胞を−１日目に接種す
る。皿を５％CO2加湿インキュベーター中で37℃にてイ
ンキュベートする。０日目に、細胞を1mlのDEAE−デキ
ストラン（25μg/ml培地）で37℃にて１時間処理する。
細胞を2mlの培地で１回洗浄する。洗浄され処理された
細胞に、小容量（0.2〜0.5ml）のウイルス含有ストック
の２倍ごとの希釈物を37℃にて60分間、間欠的にゆり動
かしながら感染させる。培地（5ml）を皿に加え、そし
て37℃にてインキュベーションを続ける。培地を１日、
４日、８日、及び12日後に交換する。10〜14日後にフォ
ーカスを計数する。
イにより次のようにして決定する。クローン81細胞は不
完全なネズミ肉腫ウイルスゲノムを含有する。細胞にFe
LVが感染した後、非−不完全FeLVが肉腫ウイルスの発
現、及びそれ故に形質転換された細胞の表現形質の出現
を可能にする。形質転換された細胞は局所的に蓄積する
ため、フォーカスが出現する。使用される方法はフィシ
ンジャー等、ジャーナル・オブ・ビロロギー（J.Viro
l.）（1974）14:177−179からのものである。組織培養
皿に、15％の加熱不活性化ウシ胎児血清及び50μg/mlの
ゼンタマイシンを補充したマッコイ5A培地5ml中２×105
CCCクローン81（Ｓ＋Ｌ−）細胞を−１日目に接種す
る。皿を５％CO2加湿インキュベーター中で37℃にてイ
ンキュベートする。０日目に、細胞を1mlのDEAE−デキ
ストラン（25μg/ml培地）で37℃にて１時間処理する。
細胞を2mlの培地で１回洗浄する。洗浄され処理された
細胞に、小容量（0.2〜0.5ml）のウイルス含有ストック
の２倍ごとの希釈物を37℃にて60分間、間欠的にゆり動
かしながら感染させる。培地（5ml）を皿に加え、そし
て37℃にてインキュベーションを続ける。培地を１日、
４日、８日、及び12日後に交換する。10〜14日後にフォ
ーカスを計数する。
ウイルス中和抗体の存在を、外来性補体の存在下又は非
存在下で、既知量のウイルスをネコ血清と共にインキュ
ベートした後の感染性ウイルス力価の低下から決定す
る。CCCクローン81（Ｓ＋Ｌ−）細胞を60mmの組織培養
皿に、−１日目に、5mlの培地中皿当り２×105細胞で接
種し、そして５％CO2加湿インキュベータ中37℃にてイ
ンキュベートする。血清サンプルを56℃にて60分間熱不
活性化する。血清の100μのアリコートを培地中に４
倍ごとに逐次希釈する。すべてのサンプル希釈物に、50
〜100フォーカス誘発ユニット（FIU）を含有するように
希釈されたストックウイルス100μを加える。ウイル
ス−抗体混合物の２重ウエルに、50μの1:10希釈のラ
ビット補体1:50最終希釈を加える。これらの反応物を37
℃にて60分間インキュベートする。81細胞を1mlのDEAE
−デキストラン（25mg/ml培地中）で37℃にて60分間処
理し、2mlの培地で１回洗浄し、次に間欠的にゆり動か
しながらウイルス−抗体混合物を37℃にて60分間感染せ
しめる。培地（5ml）を加え、そして皿を37℃にて10〜1
4日間、１日、４日、８日、及び12日目に培地を交換し
ながらインキュベートする。フォーカスを計数し、そし
て血清サンプルの中和力価を、インプットウイルスFIU
力価の50％の低下を生じさせる血清希釈として決定す
る。
存在下で、既知量のウイルスをネコ血清と共にインキュ
ベートした後の感染性ウイルス力価の低下から決定す
る。CCCクローン81（Ｓ＋Ｌ−）細胞を60mmの組織培養
皿に、−１日目に、5mlの培地中皿当り２×105細胞で接
種し、そして５％CO2加湿インキュベータ中37℃にてイ
ンキュベートする。血清サンプルを56℃にて60分間熱不
活性化する。血清の100μのアリコートを培地中に４
倍ごとに逐次希釈する。すべてのサンプル希釈物に、50
〜100フォーカス誘発ユニット（FIU）を含有するように
希釈されたストックウイルス100μを加える。ウイル
ス−抗体混合物の２重ウエルに、50μの1:10希釈のラ
ビット補体1:50最終希釈を加える。これらの反応物を37
℃にて60分間インキュベートする。81細胞を1mlのDEAE
−デキストラン（25mg/ml培地中）で37℃にて60分間処
理し、2mlの培地で１回洗浄し、次に間欠的にゆり動か
しながらウイルス−抗体混合物を37℃にて60分間感染せ
しめる。培地（5ml）を加え、そして皿を37℃にて10〜1
4日間、１日、４日、８日、及び12日目に培地を交換し
ながらインキュベートする。フォーカスを計数し、そし
て血清サンプルの中和力価を、インプットウイルスFIU
力価の50％の低下を生じさせる血清希釈として決定す
る。
免疫保護を、FeLVでチャレンジされたワクチン処理体に
おける接続的ウイルス血症についてのFLISAアッセイに
より測定する。方法は次の通りである。実質的な抗−gp
70抗体が出現した後、５×106個の生FF64/ST−FeSVで形
質転換されたネコの線維芽細胞の皮下注射によりネコを
チャレンジする。FeLVコア−蛋白質p27を認識する幾つ
かのマウスモノクローナル抗体を使用して該蛋白質のレ
ベルを測定するELISAによりウイルス血症を毎週測定す
る（ルッツ,H.等，前掲）。
おける接続的ウイルス血症についてのFLISAアッセイに
より測定する。方法は次の通りである。実質的な抗−gp
70抗体が出現した後、５×106個の生FF64/ST−FeSVで形
質転換されたネコの線維芽細胞の皮下注射によりネコを
チャレンジする。FeLVコア−蛋白質p27を認識する幾つ
かのマウスモノクローナル抗体を使用して該蛋白質のレ
ベルを測定するELISAによりウイルス血症を毎週測定す
る（ルッツ,H.等，前掲）。
捕捉抗体（catching antibody）幾つかのマウスモノク
ローナル抗−p27抗体からのIgG画分のプール）を被覆緩
衝液（0.1M NaCO3,0.02％NaN3,pH9.6）中に５μg/mlに
希釈した。イムロンIIミクロタイタープレート（ダイナ
テク）の各ウエルに100μを加え、そして37℃にて３
時間インキュベートし、次に４℃にて一夜インキュベー
トする。被覆されたプレートをELISA洗浄液（0.15M NaC
l,0.05％トウィーン20）で３回洗浄し、そして蒸留水で
１回洗浄する。密封しそして−20℃で貯蔵する。サンプ
ルを0.13％のトウィーン20を含有する緩衝液３中に1:4
に希釈する。pHを調整した後BSAを0.1％に添加する。被
覆されそして洗浄されたプレートの２重のウエルに100
の希釈されたサンプルを加える。精製されたp27のス
タンダード曲線、100μの緩衝液３＋0.1％トウィーン
20中０−50ng/ウエルを含む。37℃にて60分間インキュ
ベートする。プレートをFLISA洗浄液で３回洗浄する。
特定の接合体について決定されたように、接合した抗体
（ホースラディッシュパーオキシダーゼに接合した２つ
のマウス抗−FeLV p27抗体のプール）を希釈し、そして
100μを各ウエルに加える。37℃にて30〜60分間イキ
ュベートする。プレートをELISA洗浄液で３回洗浄す
る。各ウエルに100μの基質溶液（5ml,0.05Mクエン
酸,pH4＋20μの27.45mg/ml ABTS＋20μの２％H2O）
を加え、そしてシグナル対バックグラウンドの比が適当
になるまで室温にてインキュベートする。100μの0.2
M HFにより反応を停止し、そして405nmにおける光学濃
度を決定する。p27の濃度をスタンダード曲線から決定
することができる。
ローナル抗−p27抗体からのIgG画分のプール）を被覆緩
衝液（0.1M NaCO3,0.02％NaN3,pH9.6）中に５μg/mlに
希釈した。イムロンIIミクロタイタープレート（ダイナ
テク）の各ウエルに100μを加え、そして37℃にて３
時間インキュベートし、次に４℃にて一夜インキュベー
トする。被覆されたプレートをELISA洗浄液（0.15M NaC
l,0.05％トウィーン20）で３回洗浄し、そして蒸留水で
１回洗浄する。密封しそして−20℃で貯蔵する。サンプ
ルを0.13％のトウィーン20を含有する緩衝液３中に1:4
に希釈する。pHを調整した後BSAを0.1％に添加する。被
覆されそして洗浄されたプレートの２重のウエルに100
の希釈されたサンプルを加える。精製されたp27のス
タンダード曲線、100μの緩衝液３＋0.1％トウィーン
20中０−50ng/ウエルを含む。37℃にて60分間インキュ
ベートする。プレートをFLISA洗浄液で３回洗浄する。
特定の接合体について決定されたように、接合した抗体
（ホースラディッシュパーオキシダーゼに接合した２つ
のマウス抗−FeLV p27抗体のプール）を希釈し、そして
100μを各ウエルに加える。37℃にて30〜60分間イキ
ュベートする。プレートをELISA洗浄液で３回洗浄す
る。各ウエルに100μの基質溶液（5ml,0.05Mクエン
酸,pH4＋20μの27.45mg/ml ABTS＋20μの２％H2O）
を加え、そしてシグナル対バックグラウンドの比が適当
になるまで室温にてインキュベートする。100μの0.2
M HFにより反応を停止し、そして405nmにおける光学濃
度を決定する。p27の濃度をスタンダード曲線から決定
することができる。
例に記載した蛋白質生成物は上記の試験により免疫原性
及び免疫保護活性について評価することができ、そして
FeLV感染に対する効果的なワクチンであることが示され
る。
及び免疫保護活性について評価することができ、そして
FeLV感染に対する効果的なワクチンであることが示され
る。
モルモット試験：免疫原性及び有効性 モルモット（350〜450g,群当り３動物）を次のようにし
てワクチン処理する。
てワクチン処理する。
０日：ワクチン処理…完全フロインドアジュバント中0.
2mgの接合体又は不完全フロインドアジュバント中0.4mg
の融合蛋白質をIM注射する。
2mgの接合体又は不完全フロインドアジュバント中0.4mg
の融合蛋白質をIM注射する。
14日：増分追加免疫（incremental boos）…不完全フロ
インドアジュバンド中0.2mgの接合体又は不完全フロイ
ンドアジュバント中0.4mgの融合蛋白質を注射する。
インドアジュバンド中0.2mgの接合体又は不完全フロイ
ンドアジュバント中0.4mgの融合蛋白質を注射する。
28日：最終追加免疫…下記のようにして調製した不活性
化ウイルス“10ml相当”を注射する。Snyder−Theilen
（ST）FeLVに感染したFF64/280ネコ線維芽細胞を標準培
地（改変イーグル培地、L15）＋10％ウチ胎児血清（FS
C）中でコンフルエント単層まで増殖せしめた。次にFCS
を除去し、そして培地のみと置き代えた。24〜48時間後
に上清を集め、そして限外過により約200倍に濃縮し
た。ホルムアルデヒドを0.6重量％に加えてウイルスを
不活性化した。濃縮物のアリコート（0.05ml）を不完全
フロインドアジュバントにより希釈し、そして最終追加
免疫として使用するために調製した。
化ウイルス“10ml相当”を注射する。Snyder−Theilen
（ST）FeLVに感染したFF64/280ネコ線維芽細胞を標準培
地（改変イーグル培地、L15）＋10％ウチ胎児血清（FS
C）中でコンフルエント単層まで増殖せしめた。次にFCS
を除去し、そして培地のみと置き代えた。24〜48時間後
に上清を集め、そして限外過により約200倍に濃縮し
た。ホルムアルデヒドを0.6重量％に加えてウイルスを
不活性化した。濃縮物のアリコート（0.05ml）を不完全
フロインドアジュバントにより希釈し、そして最終追加
免疫として使用するために調製した。
各注射から２週間後にモルモットから試験血清を採取し
た。gp70並びにペプチドI,II,III及びIVに対する抗体に
ついての、血清の免疫原計試験を、前記のELISA法を用
いて行った。ウイルス中和試験もさらにモルモットにつ
いて前記のフォーカス形成アッセイ、並びにテラサキP.
I.,及びマクレランド,J.D.,ネイチュアー（Nature）（1
964）204:998−1000に従って補体−依存抗体介在細胞変
性（Ｃ′DAC）試験を用いて行った。Ｃ′DAC試験は、ラ
ビット補体、並びに血清抗体結合及び補体細胞変性のた
めの標的細胞としてFL74（FeLV感染）ネコ細胞を用い
た。
た。gp70並びにペプチドI,II,III及びIVに対する抗体に
ついての、血清の免疫原計試験を、前記のELISA法を用
いて行った。ウイルス中和試験もさらにモルモットにつ
いて前記のフォーカス形成アッセイ、並びにテラサキP.
I.,及びマクレランド,J.D.,ネイチュアー（Nature）（1
964）204:998−1000に従って補体−依存抗体介在細胞変
性（Ｃ′DAC）試験を用いて行った。Ｃ′DAC試験は、ラ
ビット補体、並びに血清抗体結合及び補体細胞変性のた
めの標的細胞としてFL74（FeLV感染）ネコ細胞を用い
た。
これらの試験の結果を表に示す。特にことわらない限
り、カッコを付してない結果は最初のワクチン処理後に
採取した血清についてのものである。カッコ内の結果は
殺されたウイルスを注射した後に採取した血清について
のものである。
り、カッコを付してない結果は最初のワクチン処理後に
採取した血清についてのものである。カッコ内の結果は
殺されたウイルスを注射した後に採取した血清について
のものである。
免疫原性試験の結果は、すべてのワクチンがgp70に対す
る抗体を生成すること、及び殺されたウイルスの注射が
抗−gp70反応における有意な増加を生じさせることを示
している。（塩水／アジュバントでワクチン処理され、
そして殺されたウイルスにより追加免疫された対照は１
回の追加免疫の後に大きな反応を示さない。）殺された
ウイルスによる追加免疫の後の補体依存細胞変性におい
て相関的な増加が観察された。
る抗体を生成すること、及び殺されたウイルスの注射が
抗−gp70反応における有意な増加を生じさせることを示
している。（塩水／アジュバントでワクチン処理され、
そして殺されたウイルスにより追加免疫された対照は１
回の追加免疫の後に大きな反応を示さない。）殺された
ウイルスによる追加免疫の後の補体依存細胞変性におい
て相関的な増加が観察された。
この発明のポリペプチドは、FeLVに対するネコの能動免
疫のために使用される。このような用途のために、この
ペプチドは通常、非経腸的注射のための医薬として許容
される液体担体、例えば塩水、リンゲル液、グルコース
溶液、及びハンク溶液と共に製剤化されるであろう。こ
の明細書において、このような担体について使用する場
合、“医薬として許容される”なる用語は、この担体が
非毒性であり、一般に不活性であり、そして活性成分の
機能に不都合な影響を与えないことを意味する。好まし
くは、製剤は１又は複数のアジュバンド（所望の免疫反
応を相乗することができる化合物）、例えば一般に使用
される水及び油乳剤（例えば、フロイドドアジュバン
ト）、アルム（硫酸カリウムアルミニウム）、水酸化ア
ルミニウム、リン酸カルシウム、及び合成ポリヌクレオ
チドを含有するであろう。ワクチン処理において使用さ
れる投与量及び投与方法は動物の年齢及び重量、非経腸
的投与の方法、及び製剤中でのアジュバントの存在によ
り非常に異るであろう。個個の投与量は一般に約0.1〜1
0mgのポリペプチドの範囲であろう。示されているよう
に、ワクチン注射は好ましくは免疫反応を開始するため
に使用され、次に殺されたウイルス、又は感染量より少
量の生ウイルスが注射される。ワクチン処理の後に、典
型的には最初の１年を通して定期的に、そしてその後に
追加免疫接種が行われよう。この明細書において使用す
る場合、“免疫原的量”なる語はこれらの投与量を含む
ことが意図される。
疫のために使用される。このような用途のために、この
ペプチドは通常、非経腸的注射のための医薬として許容
される液体担体、例えば塩水、リンゲル液、グルコース
溶液、及びハンク溶液と共に製剤化されるであろう。こ
の明細書において、このような担体について使用する場
合、“医薬として許容される”なる用語は、この担体が
非毒性であり、一般に不活性であり、そして活性成分の
機能に不都合な影響を与えないことを意味する。好まし
くは、製剤は１又は複数のアジュバンド（所望の免疫反
応を相乗することができる化合物）、例えば一般に使用
される水及び油乳剤（例えば、フロイドドアジュバン
ト）、アルム（硫酸カリウムアルミニウム）、水酸化ア
ルミニウム、リン酸カルシウム、及び合成ポリヌクレオ
チドを含有するであろう。ワクチン処理において使用さ
れる投与量及び投与方法は動物の年齢及び重量、非経腸
的投与の方法、及び製剤中でのアジュバントの存在によ
り非常に異るであろう。個個の投与量は一般に約0.1〜1
0mgのポリペプチドの範囲であろう。示されているよう
に、ワクチン注射は好ましくは免疫反応を開始するため
に使用され、次に殺されたウイルス、又は感染量より少
量の生ウイルスが注射される。ワクチン処理の後に、典
型的には最初の１年を通して定期的に、そしてその後に
追加免疫接種が行われよう。この明細書において使用す
る場合、“免疫原的量”なる語はこれらの投与量を含む
ことが意図される。
ワクチンは任意の非経口的経路（静脈内、動脈内、腹腔
内、皮下、皮内、筋肉内、又は莢膜内）に投与すること
ができる。
内、皮下、皮内、筋肉内、又は莢膜内）に投与すること
ができる。
蛋白質化学、免疫学、組換DNA技術、及び／又は獣医学
の分野における当業者にとって自明な、この発明を実施
するための上記の方法の変法は次の請求の範囲内にある
と意図される。
の分野における当業者にとって自明な、この発明を実施
するための上記の方法の変法は次の請求の範囲内にある
と意図される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 特開 昭58−109427（ＪＰ，Ａ) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇ ｙ，Ｖｏｌ．46，Ｎｏ．３，（1983）, Ｐ．871−880 Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕ ｎｏｌ．，Ｖｏｌ．171，Ｎｏ．４, （1983），Ｐ．233−242
Claims (12)
- 【請求項１】ネコ科白血病ウイルスサブグループBgp85
蛋白の210−250領域および415−450領域に出現するネコ
科白血病ウイルスのgp85エンベロープ蛋白質のアミノ酸
配列の少なくとも部分と相同なアミノ酸配列を含んで成
り、そしてネコにおいて液性反応を開始又は誘発する免
疫原でありそしてネコ科白血病ウイルス感染に対してネ
コを免疫するのに有用な、場合によっては他の蛋白質と
の融合蛋白質として又はキャリヤー蛋白質と連結された
接合体として存在する、天然に存在するネコ科白血病ウ
イルスエンベロープ蛋白でない微生物的に生産されたポ
リペプチド。 - 【請求項２】前記アミノ酸配列が、gp85分子のおよそア
ミノ酸210と250との間、及びおよそアミノ酸415と450と
の間に存在するgp70蛋白質の親水性領域の少なくとも１
つと相同である請求の範囲第１項に記載のポリペプチ
ド。 - 【請求項３】前記gp85エンベロープ蛋白質がネコ科白血
病ウイルスGA株又はST株に由来する請求の範囲第２項記
載のポリペプチド。 - 【請求項４】前記gp70エンベロープ蛋白質のアミノ酸配
列の部分が、 （ａ） met gly pro asn leu val leu pro asp gln ly
s pro pro ser; （ｂ） asp gln lys pro pro ser arg gln ser gln il
e glu; （ｃ） pro glu tyr val tyr thr his phe asp lys th
r val arg leu;又は （ｄ） asp lys thr val arg leu arg arg glu pro il
e sea leu; である請求の範囲第１項記載のポリペプチド。 - 【請求項５】アミノ酸配列がポリペプチド中で反復して
いる請求の範囲第４項記載のポリペプチド。 - 【請求項６】E. コリにより生産される融合蛋白質であ
って、 （ａ）E. コリートリプトファンリーダーペプチドと部
分及びトリプトファンＥ蛋白質の部分［（ｂ）に融合し
ている］と、 （ｂ）ネコ科ウイルスのgp85エンベロープ蛋白質のアミ
ノ酸配列の少なくとも部分と相同なアミノ酸配列とを含
んで成り、ネコにおける液性反応を開始又は誘発する免
疫原でありそしてネコ科白血病ウイルス感染に対してネ
コを免疫するのに有用である、E.コリにより生産される
請求の範囲第１項に記載の融合蛋白質。 - 【請求項７】前記gp85エンベロープ蛋白質のアミノ酸配
列の部分が、 （ａ）met gly pro asn leu val leu pro asp gln lys
pro pro ser; （ｂ）asp gln lys pro pro ser arg gln ser gln ile
glu; （ｃ）pro glu tyr val tyr thr his phe asp lys thr
val arg leu;又は （ｄ）asp lys thr val arg leu arg arg glu pro ile
sea leu; である請求の範囲第６項記載の融合蛋白質。 - 【請求項８】前記蛋白質がプラスミドptGAΔAvaI,ptGA
ΔApaI、又はpt9:9−19の発現の生産物である請求の範
囲第６項記載の融合蛋白質。 - 【請求項９】前記ポリペプチドが、次のアミノ酸配列： （ａ）Ｈ−cys asp lys thr val arg leu arg arg glu
pro ile ser leu−OH; （ｂ）Ｈ−cys pro gle tyr val tyr thr his phe asp
lys thr val arg leu−OH; （ｃ）Ｈ−cys met gly pro asn leu val leu pro asp
glu lys pro pro ser−OH;又は （ｄ）Ｈ−asp gly lys pro pro ser arg gln ser gln
ile glu cys ser−OH; を含んで成る請求の範囲第１項記載の接合体。 - 【請求項１０】次の式： （ａ）Ｈ−cys asp lys thr val arg leu arg arg glu
pro ile ser leu−OH; （ｂ）Ｈ−cys pro gle tyr val tyr thr his phe asp
lys thr val arg leu−OH; （ｃ）Ｈ−cys met gly pro asn leu val leu pro asp
glu lys pro pro ser−OH;又は （ｄ）Ｈ−asp gly lys pro pro ser arg gln ser gln
ile glu cys ser−OH; で表される配列を含んで成る請求の範囲第１項記載のポ
リペプチド。 - 【請求項１１】天然に存在するネコ科白血病ウイルスエ
ンベロープ蛋白でないポリペプチドの免疫原的量をアジ
ュバントと共に含んで成るネコ科白血病ウイルスワクチ
ンであって； 前記ポリペプチドが、ネコ科白血病ウイルスサブグルー
プBgp85蛋白の210−250領域および415−450領域に出現
するネコ科白血病ウイルスのgp85エンベロープ蛋白質の
アミノ酸配列の少なくとも部分と相同なアミノ酸配列を
含んで成り、そしてネコにおいて液性反応を開始又は誘
発する免疫原でありそしてネコ科白血病ウイルス感染に
対してネコを免疫するのに有用な、場合によっては他の
蛋白質との融合蛋白質として又はキャリヤー蛋白質と連
結された接合体として存在する、微生物的に生産された
ポリペプチドである； ことを特徴とする前記ワクチン。 - 【請求項１２】免疫原量の前記接合体を含んで成るワク
チンであって、前記ポリペプチドが次のアミノ酸配列： （ａ）Ｈ−cys asp lys thr val arg leu arg arg glu
pro ile ser leu−OH; （ｂ）Ｈ−cys pro gle tyr val tyr thr his phe asp
lys thr val arg leu−OH; （ｃ）Ｈ−cys met gly pro asn leu val leu pro asp
glu lys pro pro ser−OH;又は （ｄ）Ｈ−asp gly lys pro pro ser arg gln ser gln
ile glu cys ser−OH; を含んで成ることを特徴とする、請求の範囲第11項に記
載のワクチン。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US55990383A | 1983-12-09 | 1983-12-09 | |
| US06/612,003 US4701416A (en) | 1983-12-09 | 1984-05-18 | Feline leukemia virus vaccine plasmids for fusion protein of the gp70 envelope protein of FELV |
| US612003 | 1984-05-18 | ||
| PCT/US1984/001963 WO1985002625A1 (en) | 1983-12-09 | 1984-11-29 | Feline leukemia virus vaccine |
| US559903 | 1995-11-17 |
Related Child Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1111966A Division JPH0767391B2 (ja) | 1983-12-09 | 1989-05-01 | ネコ科白血病ウイルス抗原をコードする遺伝子を含有するプラスミド及び該プラスミドを含有する宿主 |
| JP5161425A Division JP2633457B2 (ja) | 1983-12-09 | 1993-06-30 | ネコ科白血病ウイルス感染の予防方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61500662A JPS61500662A (ja) | 1986-04-10 |
| JPH0768266B2 true JPH0768266B2 (ja) | 1995-07-26 |
Family
ID=27072196
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59504369A Expired - Lifetime JPH0768266B2 (ja) | 1983-12-09 | 1984-11-29 | ネコ科白血病ウイルスワクチン |
| JP1111966A Expired - Lifetime JPH0767391B2 (ja) | 1983-12-09 | 1989-05-01 | ネコ科白血病ウイルス抗原をコードする遺伝子を含有するプラスミド及び該プラスミドを含有する宿主 |
| JP5161425A Expired - Lifetime JP2633457B2 (ja) | 1983-12-09 | 1993-06-30 | ネコ科白血病ウイルス感染の予防方法 |
Family Applications After (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1111966A Expired - Lifetime JPH0767391B2 (ja) | 1983-12-09 | 1989-05-01 | ネコ科白血病ウイルス抗原をコードする遺伝子を含有するプラスミド及び該プラスミドを含有する宿主 |
| JP5161425A Expired - Lifetime JP2633457B2 (ja) | 1983-12-09 | 1993-06-30 | ネコ科白血病ウイルス感染の予防方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4701416A (ja) |
| EP (1) | EP0164403B1 (ja) |
| JP (3) | JPH0768266B2 (ja) |
| AU (1) | AU577557B2 (ja) |
| CA (1) | CA1334387C (ja) |
| DE (1) | DE3484991D1 (ja) |
| HK (1) | HK173996A (ja) |
| WO (1) | WO1985002625A1 (ja) |
Families Citing this family (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4701416A (en) * | 1983-12-09 | 1987-10-20 | Cetus Corporation | Feline leukemia virus vaccine plasmids for fusion protein of the gp70 envelope protein of FELV |
| JPS60169498A (ja) * | 1984-02-10 | 1985-09-02 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 成人ｔ細胞白血病ウイルス抗原ペプチド誘導体 |
| US5152982A (en) * | 1984-03-26 | 1992-10-06 | Chiron Corporation | Compositions and methods for FeLV vaccination |
| US4663436A (en) * | 1984-04-24 | 1987-05-05 | Scripps Clinic And Research Foundation | Leukemia-associated virus immunogen, vaccine and assay |
| US4794168A (en) * | 1984-04-24 | 1988-12-27 | Scripps Clinic And Research Foundation | Leukemia-associated virus immunogen, vaccine and assay |
| US4876089A (en) * | 1984-09-06 | 1989-10-24 | Chiron Corporation | Feline leukemia virus protein vaccines |
| EP0173997A1 (en) * | 1984-09-06 | 1986-03-12 | Chiron Corporation | Feline leukemia virus protein vaccines and their preparation |
| WO1986003224A1 (en) * | 1984-11-29 | 1986-06-05 | Scripps Clinic And Research Foundation | Polypeptides and antibodies related to deglycosylated viral glycoproteins |
| AU607399B2 (en) * | 1985-09-09 | 1991-03-07 | Cetus Corporation | Infectious recombinant virus vaccine for feline leukemia |
| US4734362A (en) * | 1986-02-03 | 1988-03-29 | Cambridge Bioscience Corporation | Process for purifying recombinant proteins, and products thereof |
| PT84976B (pt) * | 1986-05-30 | 1990-02-08 | Cambridge Bioscience Corp | Metodo para a producao de antigenios de virus de leucemia felina contendo polipeptideos recombinantes |
| US5352449A (en) * | 1986-05-30 | 1994-10-04 | Cambridge Biotech Corporation | Vaccine comprising recombinant feline leukemia antigen and saponin adjuvant |
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| US5736378A (en) * | 1991-09-12 | 1998-04-07 | The Scripps Research Institute | Molecular cloning and characterization of the feline immunodeficiency virus isolate PPR |
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| US5837686A (en) * | 1991-11-25 | 1998-11-17 | Peptide Therapeutics Limited | Peptides and antibodies for treatment of rheumatoid arthritis |
| GB9210337D0 (en) * | 1992-05-14 | 1992-07-01 | Univ Court Of The University O | Feline leukaemia virus vaccine |
| US5643756A (en) * | 1992-08-28 | 1997-07-01 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Fusion glycoproteins |
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