JP2581943B2 - 免疫増強作用系 - Google Patents

免疫増強作用系

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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明はその複合体を非経口的、経腸的又は経口的に
投与するかどうかを問わず、免疫原に結合させた時に、
該免疫原に対するその宿主の免疫応答を増強することの
できる分子群に関するものである。
株の寄託 E,coli株をAmerican Type Culture Collection（1230
1 Parklawn Drive,Rockville,MD20852,米国）に1987年
３月２日付寄託した（ATCC 67331）。
背景技術 病原体（細菌、ウイルス、寄生虫）の復襲から動物体
を防御する目的で、該病原体の全部又はそのサブユニッ
トを使用して動物にワクチン投与して該宿主中に免疫防
御応答を誘発させることはしばしば推奨されることであ
る。そのような抗原性誘発作用に対する免疫応答は、免
疫増強剤やアジュバントの併用投与により増進されるこ
とが多い。このような作用剤の最も好ましいものはデポ
ット型アジュバント（例えばフロイント完全アジュバン
ト、フロイント不完全アジュバントおよびモンタニド）
である。これらのアジュバントは、抗原注射後の抗体応
答を、抗原だけを注射した場合のレベル約50〜100倍に
も増加することができる。
フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジ
ュバントおよびモンタニドのようなアジュバントは抗原
に対する免疫応答を著しく増強し得るけれども、これら
にはいくつかの欠点がある。これを注射剤の形で抗原と
一緒に使用すると、注射部位に大きな組織障害が起るこ
とがあり、そのような用途でこれらをヒト、ペット又は
食用動物に使用するのは満足なものではない。更に又、
これらアジュバントは経口又は経腸投与した場合には免
疫増強剤として作用し得ない。
発明の開示 本発明は、その複合体を非経口的、経腸的又は経口的
に投与するかどうかを問わず、免疫原に又はハプテンに
化学的又は遺伝子的に結合させた時に、該免疫原又はハ
プテンに対するその宿主の免疫応答を増強することので
きる分子群に関するものである。そしてこれらを使用し
た場合に、注射部位に大きな組織障害が発生しない。
このような作用を有する分子群はTraT蛋白であり、こ
れはある種のE.coli株の外膜蛋白であって、これら菌株
が血清により殺滅されることに対する抵抗性を有してい
るものである。この種の別の蛋白としては、E.coli外膜
蛋白OmpAおよびOmpFがある。TraT,OmpA又はOmpF（以下
担体と称する）の定量をアジュバントなしでマウスに筋
肉内注射すると、BSA、フラゲリン又はヒツジIgGのよう
な可溶性蛋白をフロイント不完全アジュバントと混合し
て注射した場合に匹敵する程の抗体応答が誘発される。
事実、これらの外膜蛋白により誘発される抗体応答は、
フロイント不完全アジュバント投与による限界増加量に
相当するほど高いものである。
又、TraT又はOmpAの経口投与により、抗TraT（1/409
6）又は抗OmpA（1/892）血清抗体の有意力価が増加する
ことも見出された。
同様に、外膜中にTraTを含有するSalmonella又はE.co
liを中程度の量（109〜1010）投与すると抗TraT抗体の
産生が増強されることも見出された。
ハプテン（ジニトロフェノール,DNP）、ペプチド（CS
P）又は蛋白（ウシ血清アルブミン、BSA）のOmpA又はTr
aTとの共有結合も又DNP、CSP又はBSAへの免疫応答を増
強する作用を有する。
第１の態様として本発明は、抗原及びハプテンの中か
ら選択される免疫原が、該免疫原と共有結合的に付加さ
れたときにアジュバントとして機能し且つE.coliあるい
はSalmonellaの菌株によって生成されるTraTタンパク
質、外膜タンパク質OmpA、外膜タンパク質OmpF及びそれ
らのタンパク質のうちの１つの一部の中から選択される
担体分子と、共有結合した複合体であって、該複合体が
非経口的、経腸的又は経口的であるかどうかを問わず宿
主に投与されたとき、該担体分子が該宿主の免疫原に対
する免疫応答を増強する作用を有することを特徴とする
複合体を提供するものである。
本発明のより好ましい免疫原としては、CSP、ロタウ
イルス株由来のウイルスカプシド蛋白VP7および真該蛋
白ミンアクチビンの全部又は１部が挙げられる。
免疫原−担体複合体は、例えば適当な接合剤又は結合
剤のいずれかを使用しての接合、および担体および（又
は）免疫原上の官能基の変成および（又は）反応から成
る化学的方法により作ることができる。
従って本発明は、抗原及びハプテンの中から選択され
る免疫原が、該免疫原と共有結合的に付加されたときに
アジュバントとして機能し且つE.coliあるいはSalmonel
laの菌株によって生成されるTraTタンパク質、外膜タン
パク質OmpA、外膜タンパク質OmpF及びそれらのタンパク
質のうちの１つの一部の中から選択される担体分子と、
共有結合した複合体であって、該複合体が非経口的、経
腸的又は経口的であるかどうかを問わず宿主に投与され
たとき、該担体分子が該宿主の免疫原に対する免疫応答
を増強する作用を有することを特徴とする複合体を製造
する方法であって、下記の工程、すなわち、 （ａ）免疫原と担体とを反応させて該複合体を作る、 （ｂ）免疫原を化学的に変成して化学結合形成可能な少
なくとも１個の官能基を導入し、そしてこうして変成し
た免疫原と担体とを反応させて該複合体を作る、 （ｃ）担体を化学的に変成して化学結合形成可能な少な
くとも１個の官能基を導入し、そして免疫原と変成担体
とを反応させて該複合体を作る、 （ｄ）免疫原と担体とを化学的に変成して化学結合形成
可能な官能基を導入し、そして変成免疫原と変成担体と
を反応させて該複合体を作る、 （ｅ）免疫原と少なくとも１個の結合剤とを反応させ、
そして結合免疫原と担体分子とを反応させて該複合体を
作る、 （ｆ）担体と少なくとも１個の結合剤とを反応させ、そ
して免疫原と結合担体とを反応させて該複合体を作る、 （ｇ）免疫原および担体を少なくとも１個の結合剤と反
応させ、そして結合免疫原と結合担体とを反応させて該
複合体を作る、 工程の１つ又はそれ以上から成る、前記方法を提供する
ものである。
本発明の好ましい方法は、 （ｉ）免疫原を化学的に変成して化学結合形成可能な少
なくとも１個の官能基を導入し、そして （ii）変成免疫原と担体とを反応させて該複合体を作
る、 工程から成るものである。
結合剤はジスルフィド結合を含有していても良く、あ
るいは酸、塩基又は過よう素酸塩により開裂可能なもの
であっても良い。このような結合剤の例としては、Ｎ−
（４−アジドフェニルチオ）フタルイミド、4,4′−ジ
チオビスフェニルアジド、ジチオビス−（スクシンイミ
ジルプロピオネート）、ジメチル−3,3′−ジチオビス
プロピオンイミデート・2HCl、3,3′−ジチオビス−
（スルホスクシンイミジルプロピオネート）、エチル−
４−アジドフェニル−1,4−ジチオブチルイミデート・H
Cl、Ｎ−スクシンイミジル−（４−アジドフェニル）−
1,3′−ジチオ−プロピオネート、スクホスクシンイミ
ジル−２−（ｍ−アジド−０−ニトロベンズアジド）−
エチル−1,3′−ジチオプロピオネート、スルホスクシ
ンイミジル−２−（ｐ−アジドサリチルアミド）−エチ
ル−1,3′−ジチオプロピオネート、Ｎ−スクシンイミ
ジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート、ス
ルホスクシンイミジル−（４−アジドフェニルジチオ）
−プロピオネート、および２−イミノチオランが挙げら
れる。好ましい架橋剤はジスクシンイミジルタートレー
トおよびビス−〔２−（スクシンイミジルオキシカルボ
ニルオキシ）−エチル〕スルホンである。
担体と免疫原との結合は、担体を免疫原の適当な基に
結合させることによって適当に行なうことができる。
例えば適当な接合剤又は結合剤のいずれかを使用して
の化学的接合により免疫原−担体複合体を形成する場合
に、好ましい接合又は結合剤としては１−エチル−３−
（３−ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド、グ
ルタルアルデヒド、ｍ−マレイミド安息香酸ｍ−ヒドロ
キシスクシンイミドエステル又はN,N1−ジシクロヘキシ
ルカルボジイミドが挙げられる。
又免疫原と担体分子との結合は、例えば免疫原をコー
ドするDNAを担体をコードするDNA配列中に挿入又はそれ
に付加することによる組換えDNA技術を使用して行なう
ような、ハイブリッド蛋白分子の製造によっても行うこ
とができる。
従って本発明は、ハイブリッド蛋白分子を製造するこ
とから成る、担体分子と免疫原との前記複合体の製造方
法も提供する。そして好ましい方法として、該ハイブリ
ッド蛋白分子を、免疫原をコードするDNAを担体をコー
ドするDNA配列中に挿入又はそれに付加することによる
組換えDNA技術により製造する。
本発明は又、免疫原のアミノ酸配列をコードするDNA
配列に融合した、原核生物又は真核生物由来の内在性膜
蛋白の少なくとも１部をコードする配列として使用する
DNA配列から成る第１のDNA配列；又は天然、合成および
半合成源を含めてのいかなるものから得られたものでも
良い。該第１のDNA配列とハイブリダイズする第２のDNA
配列；単一又は複数の塩基置換、除去、挿入および転位
を含めての変異による、該第１のDNA配列関連DNA配列；
又は前記ハイブリッドDNA配列およびインサートのいず
れかのコドンを発現時にコードするポリペプチドと同様
の免疫的又は生物学的活性を示すポリペプチドを発現時
にコードするコドンの配列から成るDNA配列、から成る
ハイブリッドDNA配列を提供するものである。
本発明の好ましいハイブリッドDNA配列は、免疫原の
アミノ酸配列をコードするDNA配列に結合したTraT、Omp
F又はOmpAの少なくとも１部をコードするものであっ
て、その生成TraT−（OmpF又はOmpA）ハイブリッド蛋白
が宿主細胞表面に析出しそして表在するものである。
本発明は又、可動プロモーターに融合した本発明のハ
イブリッドDNA配列から成る融合遺伝子を提供するもの
である。本発明において好ましいプロモーターはバクテ
リオファージラムダ（λ）のPLプロモーターである。
更に又本発明は、本発明のハイブリッドDNA配列とベ
クタ−DNAとから成り、そして該ベクターDNAがプラスミ
ド、バクテリオファージ、ウイルス又はコスミドDNAで
ある、組換えDNA分子を提供するものである。
本発明の組換えDNA分子は好ましいものとして、ハイ
ブリッドDNA配列と能動的に結合した発現コントロール
配列を含有するものである。
本発明の特に好ましい組換えDNA分子は、pBTA371、pB
TA439、pBTA449、pBTA450およびpBTA586である。
又本発明は、本発明のハイブリッドDNA配列をクロー
ニングベヒクル中に導入することから成る、組換えDNA
分子の製造方法もその範囲内に含むものである。
好ましくは該方法は、クローニングベヒクル中に発現
コントロール配列を導入する工程を含むものである。
本発明は又、本発明の少なくとも１個の組換えDNA分
子で形質転換した宿主を提供するものである。
適当な宿主としてはE.coliおよびSalmonella種を挙げ
ることができる。
好ましい形質転換体はATCC67331（又はCCTCC87026と
も命名）である。
又本発明は、本発明の組換えDNA分子を宿主中に導入
することから成る、宿主の形質転換方法もその範囲内に
含むものである。
更に又別の態様として、本発明の宿主中への非経口注
射として適用するか又は経口又は経腸投与として適用し
て、体液性および粘膜性の両方の抗体応答を誘発する、
担体と免疫原とから成る複合体を提供する。
又本発明は、担体と免疫原との複合体を作りそしてこ
れを薬学的に許容される希釈剤に加えることから成る、
非経口的、経腸的又は経口的投与用形態として該複合体
の製造方法もその範囲内に含有するものである。
好ましくは本発明は、免疫系に授与するために細菌細
胞表面に表在する本発明のハイブリッド蛋白を含有して
成る全細菌細胞ワクチンを提供するものである。この全
細胞ワクチンは生又は死全細胞経口ワクチンのいずれで
も良い。又別に、ハイブリッド蛋白は細胞膜又は細胞内
容物から精製しそして非経口、経腸又は経口的投与用の
サブユニットワクチンとして使用することもできる。
本発明は又、免疫原と原核生物又は真核生物由来のim
pの少なくとも１部から成る担体とから少なくとも成る
ハイブリッド蛋白の生合成の遺伝情報を有する微生物で
あって、その生成したハイブリッドペプチドが宿主細胞
表面に表在するような微生物の製造方法を提供するもの
であり、該方法は、その必要な遺伝情報を有する微生物
を培養することから成るものである。サブユニットワク
チンを製造するために微生物を使用する場合には、細胞
膜又は細胞内容物からのハイブリッドペプチドを精製す
る工程を更に付加すれば良い。
図面の簡単な説明 第１図はアジュバントによる免疫応答の変化を示す。
TraT（第1a図）およびBSA（第1b図）単独又はこれと種
々のアジュバントを組合わせてウサギに筋肉内注射し
た。第1a図および第1b図において、TraTおよびBSAをF.
I.Aと混合した場合を（△−△）、モンタニド888との場
合を（●−●）、アルヒドロゲルとの場合を（□−
□）、食塩水との場合を（×−×）で表わした。食塩水
とTraT（×−×）、OmpA（■−■）およびOmpF（○−
○）との場合の抗体応答の比較を第1c図に示した。
第２図はTraTおよびOmpAとの結合によるDNPおよびBSA
に対する抗体応答増強を示すものである。
筋肉内注射後の抗担体（第2a図）および抗DNP抗体応
答（第2b図）を増強する作用効果について、TraT（＋−
＋）、OmpA（×−×）およびBSA（▼−▼）のジニトロ
フェニル化製剤を比較した。又TraT（●−●）およびOm
pA（■−■）単独を注射した場合に対する抗体応答も測
定した。同様に、BSAを食塩水注射液として（○−
○）、FIAと混合して（▼−▼）、又はTraT（▽−▽）
又はOmpA（□−□）と共有結合させて注射した場合の抗
BSA応答を測定した（第2c図）。これら結合体に対する
抗TraTおよび抗OmpA応答は第2a図に示した。impの免疫
増強活性を、BSAをTraT（▽−▽）又はOmpA（□−□）
に共有結合させて注射した場合、これをTraT（▲−▲）
又はOmpA（■−■）と混合して注射した場合、又はこれ
をTraT（△−△）又はOmpA（●−●）とは別の部位に注
射した場合について調べた（第2d図）。
第3a図はプラスミドpBTA449、pBTA439およびpBTA371
の構築を示す。
第3b図はTraTおよびTraT−VP7融合蛋白発現のSDS−PA
GEおよびウエスタン分析である。
第3c図はTraT（レーン１）又はTraT−VP7（レーン
３）を発現する細胞表面標識E.coliおよびコントロール
（レーン３）のオートラジオグラフィーの結果を示す。
細胞は125Iおよびラクトパーオキシダーゼで標識した。
第4a図はプラスミドpBTA450およびpBTA586の構築を示
す。
第4b図はpBTA586から発現されたTraTミンアクチビン
ハイブリッド蛋白（TraT TMIN）のSDSポリアクリルアミ
ドゲルを示す。
第３および第４図において、Aprはアンピシリン耐
性、Cmrはクロラムフェニコール耐性、Hg+は塩化水銀、
Tcはテトラサイクリン、VP7はVP7構造遺伝子、TraTはTr
aT構造遺伝子、TraT−VP7はTraTとVP7の遺伝子融合体、
PLはラムダバクテリオファージPLプロモーター領域を表
わす。又制限酸素において、AlはAluIを、ＡはAuaIを、
ＤはDraIを、ＢはBamHIを、ＥはEcoRIを、ＮはNdeIを、
PvはPvuIIを、RVははEcoRVを、そして、SsはSsplであ
る。
発明を実施するための最良の形態 下記の実施例は本発明の好ましい態様を開示するもの
であるが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。
実施例１ TraT、OmpAおよびOmpFの単離 E.Coli（プラスミドpBTA439を含有する株BTA1352）を
発酵器中で30℃でMEB培地中で成育させた。42℃でTraT
を２時間熱誘導した後に細胞を採取した。細菌をアミコ
ンDCIOLA濃縮器中、0.1μの中空繊維カートリッジを使
用して２濃縮した。次いで細胞を10の蒸留水で洗浄
してこれを800mlに再濃縮した。次に細菌スラリーを濃
縮物から分離し、これに200mlの1M酢酸ナトリウム緩衝
液（pH2.5）を加え次に40％ETOHおよび1MCaCl2中の10％
セトリミド（シグマ社）を１加えることにより細胞か
ら外膜蛋白（TraT、OmpAおよびOmpF）を抽出した。抽出
物を１晩室温に放置してから遠心分離17,000xg、20分
間）により細菌を除去した。
エタノールを50％まで加え次いで遠心分離（40,000x
g、10分間）することにより上ずみからTraTおよびOmpF
を析出させた。次いでエタノールを80％まで加えること
によってOmpAを最終上ずみから析出させた。
イオン交換クロマトグラフィー OmpFおよびTraTを含有する50％エタノールペレットを
0.5％ツビッタージェント（Zwittergent）を含有する20
mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）中に再懸濁させて、
これを0.1％ツビッタージェントを含有する20mM酢酸ナ
トリウム緩衝液（pH5.0）で予じめ平衡化した。５×50c
mのDEAEセファロースカラム（ファルアシアファインケ
ミカル社）中に装填した。TraTはカラム中を流れるのが
見られ、そして結合OmpFを、平衡緩衝液中の０〜1.0MNa
Clの直線傾斜を使用してカラムから溶出した。Laemmli
の方法（Laemmli、英国、Nature（Lond）227:680、197
0;Salit等、J,Exp,Med,151:716、1980）の変法を使用し
てSDS−PAGEにより画分を分析し、そして単離TraT又はO
mpFを含有する画分を集めてエタノール沈降法により濃
縮した。
セファクリルＳ−300クロマトグラフィー OmpAを含有する80％エタノールペレットを20mMトリス
ーHCl（pH8.8）中の１％SDS中に再懸濁させた。画分を
集め、SDS−PAGEにより分析し、そしてOmpAを含有する
画分を集めてエタノール沈降により濃縮した。
上記方法により精製した蛋白は、SDS−PAGEにより検
査しそしてTsai,C.M.およびFrasch,C.E.の方法（Anal,B
iochem、119;115,1982）により銀着色することによりLP
Sを含有しないことがわかった。
担体のジニトロフェニル化 TraT、OmpAおよびOmpFをLittleおよびEisenの方法（M
ethods in Immunology and Immunochemistry,E.D.Willi
ams,CAおよびChase,M.W;I,128ページ,Academic Press
社、ニューヨーク、1967）によりジニトロフェニル化し
た。簡単に言うと、担体（pH9.5の0.1M炭酸塩／重炭酸
塩緩衝液中）をDNFBの0.1M溶液（アセトン中）と室温で
１晩反応させた。次いで蛋白を広範囲に亘り結合緩衝液
に対して透析した。
グリタルアルデヒド結合 ウシ血清アルブミン（BSA）（シグマケミカル社製、S
t,Louis,Miss,米国）を、Aurameus等（1978年）の二工
程グルタルアルデヒド法を使用して、TraT、OmpAおよび
OmpFと結合させた。簡単に言うと、BSAを0.2％グルタル
アルデヒドと室温で２時間反応させた。次いで蛋白を炭
酸塩／重炭酸塩緩衝液（pH9.5）に対して１晩透析し、
そしてompをBSA:ompのモル比1:1の割合で加えて室温で2
4時間反応させた。最後にエタノールアミン（シグマ
社）を加えて最終濃度0.1M（１時間、室温）とし、次い
で0.1M炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（pH9.5）に対して４℃
で１晩透析した。
抗原投与 1.ウサギ ニュージーランド白ウサギ（２〜2.5kg）に、0.5mlの
無菌生理食塩水中の抗原を筋肉内注射した。
注射は０日目と36日目に行った。毎週ウサギの耳の縦
静脈から採血して、被覆抗原としてのTraT、OmpA、BSA
又はDNPヒツジIgGを使用しての標準ELISAによりその抗
体力価を測定した。
2.マウス 雌C57BL/6Jマウス（18〜22g）をAnimal Resources Ce
ntre（Perth、西オーストラリア）から入手した。抗原
の経口又は筋肉内投与の前３〜４時間、全部のマウスを
断食した。これらのマウスに、特別に用意した給餌針を
使用して、0.1M炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（pH9.5）の0.5
ml中の適当な濃度の抗原を給餌させた。同投与量の0.1m
lの無菌生理食塩水の形で左後足に筋肉内注射した。経
口又は筋肉内投与のいずれかで抗原を投与する５匹のマ
ウス群には０日目と14日目に２回の同じ抗原投与をし
た。14日目と21日目に、後部眼窩業から血液サンプル
（約0.5ml）を採った。次いでマウスを脊椎脱臼により
殺して、次のようにして小腸の腸洗浄を行った。まず小
腸を注意深くとり出して小量の洗浄緩衝液（1.0ml、30m
Mトリス−HClpH8.8、0.9％NaCl、50mM EDTA＋1.0％ト
ウィーン20）の先端を丸めた給餌針で腸内腔中に導入し
た。腸を静かにもんで内容物を人さし指と親指を使って
しぼり出した。こうして洗浄した腸を次いですばやく遠
心分離して残片を除去しそして次に分析に使用するまで
−20℃で保存した。血液サンプルは４℃で凝血させてか
ら血清を除去しそして−20℃で保存した。
酸素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA、エライ
サ） 抗体力価測定のためのELISAは、Russell−Jones等の
方法（J.Exp,Med,160:1467,1984）により行なった。力
価は抗血清希釈の逆数で表わされ、これは37℃45分後の
ELISAの読み0.5を与えた。
実施例２ 内存性膜蛋白に対する抗体応答におけるアジュバントの
効果 筋肉内注射した場合に自己アジュバント分子として作
用するimpの強度を測定した。TraT（第1a図×−×）又
はBSA（第1b図×−×）を単独注射した場合に得られる
抗体力価を、TraT（第1a図）又はBSA（第1b図）を色々
なアジュバントと混合した場合に得られるものと比較し
た。
食塩水中のTraTを筋肉内投与すると免疫剤に対する血
清抗体の高力価がすばやく誘発された（第1a図）。実際
に、食塩水中でのTraTによる力価は、この抗原を例えば
モンタニドやFIA（第1a図）のようなアジュバント中の
注射液の形で注射することにより４倍増加したにすぎな
かった。これは可溶抗原BSAによって起る応答とは正反
対のものである。この場合は食塩水中の形で投与した抗
原に対しては弱い抗体応答が起ったが、しかしこの抗原
をFIA又はモンタニド（第1b図）中の形での注射による
と著しく60〜100倍に増加した。
同様に、食塩水中のみでのOmpAやOmpFの注射では高血
清Ab力価が誘発された。実際に驚くべきことには、100
μｇのTraT、OmpA又はOmpFの注射により同様の抗体力価
が誘発された（第1c図）。
実施例３ 免疫原−imp複合体のアジュバント作用の試験 TraTおよびOmpAについてその抗ハプテン（DNP）およ
び抗蛋白（BSA）応答を増強する作用を試験した。この
２つのimpを、ジニトロフルオロベンゼンを使用してDNP
で置換（実施例１参照）するか、又はBSAと架橋したグ
ルタルアルデヒド置換（実施例１参照）し、次いで筋肉
内注射した。
DNP又はBSAとTraT又はOmpAのいずれかとの結合は抗im
p応答の生成にはほとんど影響がなかった（第2a図対第1
c図）。
しかしながら、impをジニトロフェニル化したものに
ついては、これを食塩水の形で注射した場合に、DNP−B
SAに対して見られた応答よりも約４〜16倍も高い抗DNP
応答の増加となった（第2b図）。同様に、BSAをFIA中の
形で投与した場合も抗BSA応答は著しく増強された（第2
c図）。そして抗BSA応答におけるTraT又はOmpAの免疫増
強作用は、BSAをimpと共有結合させた場合に最大であっ
た。実際にBSAとimpとを別の部位に注射した場合には、
BSAに対する第２応答は現に低下した（第2dおよび2c
図）。
実施例４ TraTに対する免疫応答に関して投与量の作用 筋肉内又は経口のいずれかによりマウスに投与するTr
aTの投与量を増加していった場合の作用結果を試験し
た。
１群５匹のマウス群に、筋肉内注射又は経口給餌によ
りTraTの投与量を増加しながら免疫付与した、マウスへ
の投与は０日目と14日目に行なった。21日目にマウスを
出血させ、殺し、腸内洗浄した。抗体力価はELISAによ
り測定した。
表１からわかるように、経口又は非経口に投与するTr
aTの投与量を増加すると、この投与量に対応して血清抗
TraTAb応答も増加した。
しかし非経口投与の方が経口投与よりもより効果的で
あった。
実施例５ 抗DNP応答用の担体として作用するimpの作用効果に関し
てのハプテン密度の試験 TraT、OmpAおよびOmpFを、実施例１のようにして色々
な割合のDNP:impで置換した。１群５匹のマウス群に、
０日目と14日目にDNP:担体複合体を50μｇの投与量で筋
肉内注射した。21日目にマウスを出血させて、Ab力価を
ELISAにより測定した。
DNP対担体の置換割合を0.5:1〜4:1と増加させると抗
ハプテン応答が著しく増加した。10:1より多く置換する
と、抗ハプテン応答は減少するように見られた。
実施例６ TraTとの結合による抗CSP応答の発生 次の配列を有するP,falciparumのスポロゾイト周辺蛋
白（CSP）抗原由来の合成ペプチドを用意し、このペプ
チド抗原に対するTraTのアジュバント効果を調べた。
グルタルアルデヒド又はマレイミド安息香酸ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミドエステル（MBS）のいずれかを使
用して、CPS抗原とTraTとを結合させた。こうして作っ
た接合体を（ａ）０日目と28日目にウサギに注射し、次
いでこれから38日目に採血するか、又は（ｂ）５匹のマ
ウス群に０日目と14日目に注射した。マウスは次いで21
日目に採血した。上記と同様にして抗体力価を測定し
た。
グルタルアルデヒド又はMBSのいずれかを使用してTra
Tと結合させたCSP抗原でウサギ又はマウスに免疫付与し
た結果、該抗原をBSAと結合してモンタニド中の形で注
射した場合に匹敵する抗CSP応答の増強が見られた。
実施例７ TraT−免疫原蛋白複合体の遺伝的構築 TraT蛋白にコードする遺伝子をＲプラスミドR100（又
はR6−５）上に置き、そしてこの遺伝子のスクレオチド
配列を決定した（Ogata等、J.Bacteriol,151:819〜82
7）。TraTは外膜中にあるオリゴマーリポ蛋白であり、
これは同時に細胞表面に表在しそして内部構造のペプチ
ドグリカンと一体となっている。これらの事実を利用し
て、最初にTraTを含有するR100プラスミドの6.0kbEcoRI
断片を多コピープラスミドpBR329中にクローニングする
ことによりプラスミドベクターを構築した（第3a図）。
更に不用な3kbBamHI断片を除去してそしてM13p8の小さ
い平滑末端HaeIII断片をEcoRV部位へ挿入することによ
り不活性化してpBTA449を作った。このベクタープラス
ミドは、TraTの合成を司さどる天然TraTプロモーターを
含有している。TraT（又は引き続き構築されるTraT−ハ
イブリッド蛋白）の発現は、弱いTraT天然プロモーター
を強力なラムダバクテリオファージPLプロモーター（例
えば第3a図におけるプラスミドpBTA439中又は第4a図に
おけるプラスミドpBTA586中）で置換することにより強
めることができる。TraT遺伝子はEcoRV部位（pBTA449に
特有のもの）を含有しており、ここに外来DNA配列を挿
入することができ、これによりTraTとそのコードする外
来蛋白との融合体を正しく細胞表面に放出しそして該細
胞表面において外来蛋白分が表在できるようになる。
１例としてウイルスのカプシド蛋白（VP7）の遺伝子
を使用してTraT−VP7ハイブリッド蛋白を作った。VP7は
ロタウイルスの構造蛋白であり、そして精製VP蛋白に対
して生成した抗体は細胞培養体中のウイルスと効果的に
中和する（Dyall−Smith等、Infectious Diarrhoea in
the young ed,S,Tzipori,1985年）。このようにほとん
ど発現形であるVP7蛋白はロタウイルスワクチン中に混
入される第１候補物である。
ロタウイルスNCDV VP7遺伝子のAluI PuuII制御断片
をプラスミドpBTA449のEcoRV部位中にクローニングしそ
して引き続きPLプロモーターで超発現させた（pBTA37
1、第3a図）。発現用にプラスミドpBTA371を使用して、
ラムダの熱可変CIリプレッサーを含有するE.coliK−12
株N4830（Joyce等、PNAS80、1830−1834、1983）を形質
転換した。pBTA371で形質転換した細胞を100μg/mlのア
ンピシリンを添加したHEB培地（Mott等、PNAS82、88−9
2、1985）中30℃で１晩成育させた。細胞をMEB培地中で
希釈し、30℃で生育させて1.0のOD600となった時に、予
熱（65℃）したMEB培地を等量加えて温度を42℃に平衝
化した。42℃で更に４時間生育させてから、細胞を採取
しそしてTraT−VP7ハイブリッド蛋白が誘導されている
かどうかを調べた。E.coli N4830中には高レベルのTraT
−VP7蛋白複合体の発現（全細胞蛋白の10〜15％、細胞
あたり500,000コピー以上）が観察された。この複合体
の大部分は外膜画分中に存在していた（第3b,第3c
図）。
もう１つの例として、TraT蛋白コード配列の１部と真
核蛋白コード配列ミンアクチビンの全部又は１部とのハ
イブリッドである蛋白の製造方法を以下に述べる。
第4a図に示すように、プラスミドpBTA440をSspIおよ
びDraIで消化して、1100bp断片をアガロースゲルから単
離した。この断片を、EcoRV創生pBTA450で消化したベク
ターpBTA449にライゲートした。次いでpBTA450をAuaIで
消化し、そして精製2800bp断片を、AuaIで消化したプラ
スミドpLK57にライゲートしてプラスミドpBTA586を創生
した。これはラムダPLプロモーター支配下のミソアクチ
ビンコード配列の１部を成すものであり、TraT遺伝子の
最初の80アミノ酸のコード配列に融合していて、そのア
ミノ酸の内の最初の20個はE.coliの外膜中に現われるハ
イブリッドとなるシグナル配列を構成するものである。
このシグナル配列はTraT蛋白の正常表在位である外膜へ
の移動中に開裂する。
プラスミドpBTA586をN4830のような適当な宿主中に形
質転換して、上記のような温度シフト下に誘発処理する
と、第4b図に見られるようにTraT−ミンアクチビンハイ
ブリッド蛋白が外膜画分中に現われる。
実施例８ TraTを外膜中に発現する菌株の経口投与 雌C57B1/65マウス（20〜25g）に、外膜中にTraTを発
現する細菌（E.coli又はS,typhimuriumのgalE−変異
株）を109〜1010個与えた。コントロール群にはTraT蛋
白のない同じ菌株を与えた。１週間後にマウスから採血
して上記した方法により抗TraT力価を測定した。
結果を表IVに逆数抗体力価として示した。これは10匹
のマウスの平均値である。
産業上の利用可能性 本発明はヒト、ペットおよび食用動物用のワクチンで
あってそして一般に経口、経腸又は非経口投与における
抗原に対する応答を増強し得るワクチンの製造用に有用
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:42） (72)発明者 ラッセル―ジョーンズ，グレゴリー・ジ ョン オーストラリア国 ニユー・サウス・ウ エールズ 2068、ミドル・クーベ、グリ ーンフィールド・アヴェニュー 23 (56)参考文献 特開 昭59−141523（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−51793（ＪＰ，Ａ)

Claims (14)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】抗原及びハプテンの中から選択される免疫
    原が、該免疫原と共有結合的に付加されたときにアジュ
    バントとして機能し且つE.coliあるいはSalmonellaの菌
    株によって生成されるTraTタンパク質、外膜タンパク質
    OmpA、外膜タンパク質OmpF及びそれらのタンパク質のう
    ちの１つの一部の中から選択される担体分子と、共有結
    合した複合体であって、該複合体が非経口的、径腸的又
    は経口的であるかどうかを問わず宿主に投与されたと
    き、該担体分子が該宿主の免疫原に対する免疫応答を増
    強する作用を有することを特徴とする複合体。
  2. 【請求項２】該担体分子が、TraTタンパク質あるいはそ
    の一部である請求の範囲第１項に記載の複合体。
  3. 【請求項３】免疫原がCSP、ロタウイルス由来のウイル
    スカプシド蛋白VP7又はミンアクチビンの全部又は一部
    である、請求の範囲第１又は２項のいずれかに記載の複
    合体。
  4. 【請求項４】免疫原がCSPである、請求の範囲第３項に
    記載の複合体。
  5. 【請求項５】担体と免疫原との結合が化学的方法によっ
    て行なわれるものである、請求の範囲第１〜４項のいず
    れかに記載の複合体。
  6. 【請求項６】該結合が接合剤又は結合剤のいずれかを使
    用する化学接合によるものである、請求の範囲第５項に
    記載の複合体。
  7. 【請求項７】該接合剤又は結合剤が１−エチル−３−
    （３−ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド、グ
    ルタルアルデヒド、ｍ−マレイミド安息香酸ｎ−ヒドロ
    キシスクシンイミドエステル又はN,N1−ジシクロヘキシ
    ルカルボジイミドである、請求の範囲第６項に記載の複
    合体。
  8. 【請求項８】該結合剤がジスルフィド結合を含有する
    か、又は酸、塩基又は過よう素酸塩で開裂可能なもので
    ある、請求の範囲第６項に記載の複合体。
  9. 【請求項９】該結合剤がＮ−（４−アジドフェニルチ
    オ）フタルイミド、4,4′−ジチオビスフェニルアジ
    ド、ジチオビス−（スクシンイミジルプロピオネー
    ト）、ジメチル−3,3′−ジチオビスプロピオンイミデ
    ート・2HC1、3,3′−ジチオビス−（スルホスクシンイ
    ミジルプロピオネート）、エチル−４−アジドフェニル
    −1,4−ジチオブチルイミデート・HC1、Ｎ−スクシンイ
    ミジル−（４−アジドフェニル）−1,3′−ジチオプロ
    ピオネート、スルホスクシンイミジル−２−（ｍ−アジ
    ド−Ｏ−ニトロベンズアミド）エチル−1,3′−ジチオ
    プロピオネート、スルホスクシンイミジル−２−（ｐ−
    アジドサリチルアミド）−エチル−1,3′−ジチオプロ
    ピオネート、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジ
    ルジチオ）プロピオネート、スルホスクシンイミジル−
    （４−アジドフェニルジチオ）−プロピオネート、２−
    イミノチオラン−ジスクシンイミジルタートレートおよ
    びビス−〔２−（スクシンイミジルオキシカルボニルオ
    キシ）−エチル〕スルホンから選択したものである、請
    求の範囲第８項に記載の複合体。
  10. 【請求項１０】該結合剤が２−イミノチオランジスクシ
    ンイミジルタートレートあるいはビス−〔２−（スクシ
    ンイミジルオキシカルボニルオキシ）エチル〕スルホン
    である、請求の範囲第９項に記載の複合体。
  11. 【請求項１１】抗原及びハプテンの中から選択される免
    疫原が、該免疫原と共有結合的に付加されたときにアジ
    ュバントとして機能し且つE.coliあるいはSalmonellaの
    菌株によって生成されるTraTタンパク質、外膜タンパク
    質OmpA、外膜タンパク質OmpF及びそれらのタンパク質の
    うちの１つの一部の中から選択される担体分子と、共有
    結合した複合体であって、該複合体が非経口的、経腸的
    又は経口的であるかどうかを問わず宿主に投与されたと
    き、該担体分子が該宿主の免疫原に対する免疫応答を増
    強する作用を有することを特徴とする複合体における担
    体分子と免疫原とを化学的方法により結合させることか
    ら成る、複合体の製造方法。
  12. 【請求項１２】下記の工程、すなわち、 （ａ）免疫原と担体とを反応させて該複合体を作る、 （ｂ）免疫原を化学的に変成して化学結合形成可能な少
    なくとも１個の官能基を導入し、そして変成した免疫原
    と担体とを反応させて該複合体を作る、 （ｃ）担体を化学的に変成して化学結合形成可能な少な
    くとも１個の官能基を導入し、そして免疫原と変成担体
    とを反応させて該複合体を作る、 （ｄ）免疫原と担体とを化学的に変成して化学結合形成
    可能な官能基を導入し、そして変成免疫原と変成担体と
    を反応させて該複合体を作る、 （ｅ）免疫原と少なくとも１個の結合剤とを反応させ、
    そして結合免疫原と担体分子とを反応させて該複合体を
    作る、 （ｆ）担体と少なくとも１個の結合剤とを反応させ、そ
    して免疫原と結合担体とを反応させて該複合体を作る、 （ｇ）免疫原および担体を少なくとも１個の結合剤と反
    応させ、そして結合免疫原と結合担体とを反応させて該
    複合体を作る、 工程の１つ又はそれ以上から成る方法である、請求の範
    囲第11項に記載の方法。
  13. 【請求項１３】（ｉ）免疫原を化学的に変成して化学結
    合形成可能な少なくとも１個の官能基を導入し、そして （ii）変成免疫原と担体とを反応させて該複合体を作
    る、 工程から成る方法である、請求の範囲第12項に記載の方
    法。
  14. 【請求項１４】該結合が遺伝子的結合によるものであ
    る、請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載の複合体。
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