PT91316B - Processo para a preparacao de vectores recombinantes e de particulas hbsag recombinantes hibridas tendo as caracteristicas morfologicas do antigenio hbsag contendo uma sequencia imunogenica que induz anticorpos neutralizantes dirigidos contra hiv ou susceptivel de ser reconhecida por tais anticorpos - Google Patents
Processo para a preparacao de vectores recombinantes e de particulas hbsag recombinantes hibridas tendo as caracteristicas morfologicas do antigenio hbsag contendo uma sequencia imunogenica que induz anticorpos neutralizantes dirigidos contra hiv ou susceptivel de ser reconhecida por tais anticorpos Download PDFInfo
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Description
Processo para a preparação de vectores recombinantes e de partículas HBsAg recombinantes híbridas tendo as características morfológicas do antigénio HBsAg contendo uma sequência imunogénica que induz anticorpos neutralizantes dirigidos contra HIV ou susceptivel de ser reconhecida por tais anticorpos
A presente invenção diz respeito a partículas recombinantes híbridas tendo as características morfológicas' do antigénio HBsAg comportando sequências de aminoácidos imunogénicas que induzem anticorpos neutra 1izantes dirigidos contra os retrovírus da família de HIV ou capazes de ser reconhecidos por tais anticorpos.
A presente invenção diz igualmente respeito aos ácidos nucleicos recombinantes ou vectores recombinantes, compor
-2tando as inserções formadas pelos ácidos nucleicos recombinantes híbridos, eventualmente sob o controlo de um promotor reconhecido pelas polimerases de um hospedeiro celular eucariota, comportando estes ácidos nucleicos recombinantes a informação genética requerida para tornar este hospedeiro celular eucariota apto a produzir as partículas híbridas recombinantes referidas antes. A presente invenção tem igualmente por objecto hospedeiros celulares eucariotas transformados pelos vectores recombinantes anteriores.
A presente invenção proporciona, por intermédio das partículas recombinantes referidas antes, novos meios de prevenção contra a SIDA ou contra os sintomas precursores da SIDA especia 1mente dos síndromas 1infoadenopáticos (5LA).
A presente invenção diz mais particularmente respeito às partículas recombinantes deste tipo que têm a capacidade de induzir a formação de anticorpos neutra 1 izantes em relação aos retrovírus HIV e à sua aplicação para a preparação de composições vacinantes para lutar contra uma infecção devida a um retrovírus HIV.
A presente invenção tem igualmente por objecto péptidos e polipeptidos adequados, tendo propriedades imunogénicas protectoras contra a SIDA, particularmente polipeptidos do invólucro de um retrovírus HIV ou SIV para a realização das partículas recombinantes referidas antes.
A presente invenção diz igualmente respeito aos ácidos nucleicos que codificam para estes péptidos e polipeptidos, assim como aos vectores que os contêm.
-3A presente invenção diz igualmente respeito à utilização dos meios acima referidos para realizar o diagnóstico in Vitro de uma infecção devida a HIV.
Sabe-se agora gue agentes etiológicos responsáveis pelo desenvolvimento de síndromas de 1info adeηopatias (SLA) precedem muitas vezes o desenvolvimento do síndroma da imunodeficiência adguirida (SIDA).
Designou-se por HIV (abreviatura inglesa de Human Immuηodeficiency virus) vários retrovírus humanos susceptíveis em certas condições, de provocar um SLA, eventualmente substituído por um síndroma de imunodeficiência adquirida (SIDA) no homem.
Assim, um primeiro vírus denominado LAV-1 ou HIV —1 foi isolado e descrito no pedido de patente de invenção inglesa N2 83/24.800 e no pedido de patente de invenção europeia N^: 84/401.834 de 14/09/84. Este vírus foi igualmente descrito por E. Darre Sinoussi e colab. em Science, 220, n? 45-99, 20, páginas 868-871 .
Variantes deste vírus HIV-1 designadas por LAV ELI e LAV MAL, foram igualmente isoladas, caracterizadas e descritas no pedido de patente de invenção europeia n? 84/401.834.
isolamente e a caracterização de retrovírus pertencentes a uma classe distinta e tendo apenas um parentesco imunológico reduzido com as anteriores foram descritos no pedido de patente de invenção europeia rD 87/400.151.4 publicada sob o n5 239.425. Estes retrovírus, que foram reagrupados sob a designa-4ção de HIV-2, foram isolados em vários doentes africanos apresentando sintomas de uma 1infoa denopatia ou de SIDA.
estudo destes retrovírus HIV, o isolamento e a análise das suas sequências nuc1eotídicas , assim como a caracterização das suas proteínas antigénicas permitiu efectuar estudos comparativos entre as diferentes estirpes obtidas ao nivel do seu parentesco ou, pelo contrario, das suas especificidades tanto estruturais como funcionais.
Estes retrovírus HIV-1 e HIV-2 foram iguaimente estudados em comparação com um retrovírus de origem simiana (designado pela abreviatura SIV ou STLV-III), permitindo este estudo demonstrar um parentesco imunológico entre as proteínas e glicoproteínas do retrovírus HIV-2 e das suas variantes e das do retrovírus SIV. A g1icoproteίna do invólucro do retrovírus SIV reage imunologicamente com anticorpos dirigidos contra a gIicoproteína do invólucro do retrovírus HIV-2 e vice-versa. Em contrapartida as g1icoproteínas do invólucro do retrovírus SIV ou do retrovírus HIV-2 não dão lugar a reacções imunológicas cruzadas com as gli— coproteínas do invólucro do retrovírus HIV-1.
Os estudos realizados sobre a estrutura dos antigénios de superfície destes retrovírus levaram os inventores a interessar-se mais especia 1mente pelas propriedades imunogénicas dos diferentes péptidos e polipeptidos pertencentes a estes antigénios, particularmente pelas g1icoproteίnas de invólucro, ou pelas g1icoproteίnas transmembranares destes retrovírus.
Diferentes péptidos e polipéptidos característicos
-5cujas sequências estão contidas nas estruturas peptídicas destas g1icoproteínas , quer provenientes directamente destes retrovírus, quer sintetizadas por via química, aprtewUan uma imunogenicidade relativamente fraca.
No âmbito da presente invenção os inventores pesquisaram e definiram meios susceptíveis reforçar a imunogenicidade desses péptidos ou polipéptidos derivados das g1icoproteínas de invólucro ou das g1icoproteίnas membranares de HIVs ou elaboradas a partir do conhecimento das suas respectivas sequências, ou ainda de sequências funcionalmente próximas, em particular para os tornar aptos a induzir in vivo a formação de anticorpos neutralizantes em relação a um ou vários retrovírus do tipo HIV.
Mais precisamente, os inventores orientaram os seus trabalhos para a elaboração de uma estrutura biológica mista em que um dos elementos é constituído pelos referidos péptidos ou polipétidos, o outro por partículas com propriedades imunogénicas e imunológicas essenciais do antigênio de superfície (frequentemente designado pela abreviatura HBsAg ou ainda mais simplesmente HBs) do vírus da hepatite B.
Partículas com as propriedades morfológicas e imunogénicas essenciais do antigênio HBsAg natural e produzidas pela expressão do gene S do vírus da hepatite B nas células eucariotas, foram descritas na patente de invenção europeia N^0038765 depositada a 22 de Abril de 1981. Recorda-se brevemente que estas partículas HBs têm uma dimensão aproximada de 17 a 25, nomeadamente 22nm de diâmetro. Foram igualmente descritas no artigo científico correspondente de M.F. DUBOIS e colab. /TProc. Natl. Acad. Sei.,
-6USA, 77, 1980, 4549-4553 /.
Partículas semelhantes foram obtidas em leveduras (P. VALENZUELA e colab., Nature , 298 , 1 982 , 347-350 ) ou por intermédio de vírus recombinantes (G.L. SMITH E colab. Nature,
302, 1983, 490-495).
Om método para produzir estas partículas compreende a transformação de células eucariotas pelo vector apropriado contendo o gene S sob a dependência de um promotor eficaz nestas células eucariotas, a cultura das células transformadas e a recuperação das partículas produzidas, quer a partir das células previamente lisadas, quer a partir do meio de cultura, quando as partículas aí tiverem sido excretadas pelas linhas de células utilizadas (particularmente no caso da utilização de linhas de células de macaco, de hamster, de murganho etc.) polipéptido maior das partículas HBs, codificado pelo gene S tem um peso molecular (PM) de cerca de 25400 daltons. Este peso molecular é da ordem de 27000 daltons quando a proteína maior está sob a forma glicosilada.
No âmbito da presente invenção, os inventores interessaram-se igualmente pela preparação de proteínas de PM superior (da ordem de 34000 daltons), contendo não somente a sequência ρo 1ipéptidica do referido polipéptido maior codificado para a região S, tendo a mesma extremidade C-terminal que o polipéptido maior e, além disso, uma sequência suplementar de 55 aminoácidos em posição N-terminal (STIBBE X. e GERLICH W.H., J. Viroloqy , 46 , 1983, 626-628) codificada pela região pré-S2 do genoma da hepatite
B. Os inventores estudaram, igualmente, partículas resultantes
-7da transcrição das regiões 5, pré-Sl e pré-S2 (o conjunto destes dois domínios chama-se região pré-S).
As proteínas recombinantes acima referidas juntam-se em partículas com um tamanho aproximado de 22nm.
A presente invenção resulta da conjunção em uma entidade comum de factores que concorrem para o resultado pretendido, a saber:
1) um suporte constituído por partículas HBsAg que comportam vários sítios epitópicos T e B, cuja imunogenicidade protecto ra é adquirida, quando eles não foram modificadas (e quando as suas proteínas de superfície compreendem a sequência de aminoácidos codificada pela região pré-S do genoma do vérus da hepatite B),
2) um epitopo T imunogénio derivado de uma glicoproteína de invólucro de HIV,
3) um epitopo B, pertencente igualmente a uma glicoproteína do invólucro de HIV e de acordo com o processo de preparação da presente invenção,
4) com vantagem um sítio de ligação ao receptor CD4 de linfócitos T4. Este sítio, em combinação com os factores anteriores, participará na indução in vivo dos anticorpos neutralizadores contra HIV e na indução de uma resposta celular, acompanhada de uma acção bloqueadora dos anticorpos formados, desde que eles sejam dirigidos contra um sítio de fixação do vírus.
objectivo fixado pelos inventores foi atingido graças à preparação de partículas híbridas recombinantes com as características morfológicas essenciais das partículas de HBsAg e comportando, aflorando à superfície destas partículas, o essencial da sequência de aminoácidos (S) codificada pela região S e eventualmente, a totalidade ou parte da sequência de aminoácidos codificada pela região pré-S do genoma do vírus da hepatite B, a montante da referida sequência de aminoácidos S, sendo estas partículas recombinantes caracterizadas pelo facto de comportarem também, uma sequência de aminoácidos imunogénia que induz anticorpos neutralizadores em relação a um retrovírus da família HIV, ou susceptível de ser reconhecida por esses anticorpos, comportando esta sequência pelo menos um epítopo susceptível de ser reconhecido pelos linfócitos B, pelo menos um epítopo susceptível de ser reconhecido pelos linfócitos T, sendo esta sequência imunogénica, quer inserida na sequência de aminoácidos pré-S, quer substituída toda ou parte da proteína pré-S.
híbridas sítio de
De modo particularmente vantajoso, as partículas recombinantes acima referidas comportam, além disso, um ligação ao receptor CD4 de linfécitos T4 humanos.
A presente invenção diz igualmente respeito a um vector recombinante para a transformação ulterior de células competentes, quando aptas a produzir tais partículas.
vector recombinante de acordo com a presente invenção comporta um fragmento de ácido nucleico que corresponde à região S e eventualmente à totalidade ou a parte da região pré-S do antigénio maior da superfície do vírus da hepatite B e que per-9mite, quando introduzido em um hospedeiro celular eucariota competente, induzir a produção de partículas com as características morfológicas essenciais do antigénio HBsAg, e que comporta uma sequência de aminoácidos caracteristica da proteína 5 do antigénio HBsAg, na altura da cultura do hospedeiro celular assim transformado e, de preferência, a excrecão destas partículas no meio de cultura, sendo este vector recombinante caracterizado pelo facto de :
- comportar também uma sequência nucleotídica exógena que codifica para uma sequência de aminoácidos imugénica que induz anticorpos neutralizadores em relação a um retrovírus da família de HIV ou susceptível de ser reconhecida por esses anticorpos, comportando, pelo menos, um epítopo susceptível de ser reconhecido pelos linfócitos B e, pelo menos, um epítopo susceptível de ser reconhecido pelos linfócitos T, e
- a referida sequência nucleotídica exógena ser quer inserida na dita região pré-S, quer substituir a totalidade ou parte da dita região pré-S.
A sequência nucleotídica exógena codifica, com vantagem, para uma sequência de aminoácidos imunogénica tal como se definiu antes e que comporta, além disso, um sítio de ligação ao receptor CDA .
Num modo de realização preferido do vector recombinante, o fragmento de ácido nucleico correspondente à região S e eventualmente a toda ou parte da região pré-S coloca-se sob o controlo de um promotor reconhecido pelas polimerases de um hospedeiro
celular eucariota.
A incorporação das sequências características de HIV na região pré-S ( ou a substituição parcial ou total desta região pré-S pelas referidas sequências características) permite simultaneamente a expressão e a exposição das sequências resultantes de HIV à superfície das partículas que conservaram as características essenciais das partículas HBsAg e nestas uma conformação que permita a conservação da sua imuηogenicidade natural e a sua amplificação, ao ponto de as tornar aptas a induzir in vivo a formação de anticorpos neutra1izadores face a um retrovírus HIV.
Recorre-se, com vantagem, a vectores recombinantes comportando sequências nuc1eotídicas exógenas resultantes de HIV, escolhidas de entre as que apresentam um grande grau de conservação no seio de diferentes isolados de retrovírus HIV.
comprimento das sequências nucleotídicas inseridas no encadeamento nucleotídico que comporta a região S e eventualmente a totalidade ou parte da região pré-S deve ser compatível com a manutenção das propriedades estruturais e conformacionais (morfológicas) essenciais das partículas HBs. Este comprimento depende numa certa medida da parte eliminada da região pré-S a título indicativo.... mas não limitativo.... este comprimento corresponde a uma sequência de 5 a 100 resíduos aminoácidos.
comprimento da sequência inserida pode em certas formas de realização da presente invenção exceder a da sequência eliminada.
Numm modo de realização preferido dos vectores recombinantes de acordo com a presente invenção, a sequência
Mlhg nucleotídica exógena é inserida na fase de leitura apropriada na região pré-S (ou a montante do gene S) sob o controlo de um promotor resultante do SVAO.
Num modo de realização particular da presente invenção, o ácido nucleico recombinante é caracterizado pelo facto de a sequência nucleotídica exógena (resultante de HIV) ser substituída na maior parte, se não a totalidade, da região pré-S2.
Em outros termos, a região pré-S2 que subsiste depois da inserção da referida sequência nucleotídica exógena está praticamente completamente eliminada, estando então a sequência nucleotídica exógena directamente intercalada entre a região S e a região pré-Sl. Por sequência nucleotídica exógena, entende-se as sequências cujas definições foram dadas nas páginas anteriores assim como as que serão exemplificadas a seguir. Entram, contudo, no âmbito da presente invenção vectores transformados susceptiveis de favorecer a integração no fragmento de ãcido nucleico HBs, das referidas sequências nuc 1 eotídicas exógenas.
Vectores recombinantes particularmente adaptados à expressão das sequências nuc 1 eotídicas exógenas no quadro das propriedades pretendidas resultam da combinação de um vector de expressão conhecido de HBsAg, designado por pSVS (ver para este assunto a referência 11) e de uma sequência exógena, resultante de HIV-2 transportada por um vector de clonagem M13tgl3O.
Um tal vector resulta da inserção da sequência exógena na região pré-S2 de HBsAg (vector pM25 que contém a sequência pré-Sl) ou da substituição de uma parte da região pré-S pela se-12quência exógena (pSV25 na qual a região pré-51 foi eliminada). Estes dois vectores, não limitativos das possibilidade de realização da presente invenção, contêm uma sequência nucleotídica exógena caracteristica da glicoproteína externa do invólucro de HIV-1 obtida mediante clonagem e designada por clone 8. Está representada na figura 6.
Outras construções podem ser obtidas substituindo a seguência de HIV-1 anteriormente referida pelas seguências nucleotídicas de HIV-2 ou de SIV correspondentes, ou ainda por sequências modificadas, imuπo 1 ogicamente equivalentes, capazes, contudo, de produzir in vivo anticorpos neutralizadores dirigidos contra um retrovírus HIV.
A titulo de exemplo, as sequências inseridas de modo preferido nos encadeamentos de nucleótidos anteriormente referidos são as sequências nuc 1 eo t í d i ca s que codificam para uma das seguintes sequências de aminoácidos:
X1 CHIRQI INTWHKVGKNVYLPPREGDLTC Z-,
X2 CHIKQIINTWHKVGRNVYLPPREGEL5C Z2
X3 CR IKQF I NMWQEVGKAMYAPΡISGQIRC Z3 em que os pares Xj , Z j ; X2, Z2 e X-j , Z-5 representam quer grupos
COOH ou NH2, quer sequências de aminoácidos normalmente respectivamente associados às partes centrais correspondentes das sequências referidas antes nas g1icoproteίnas dos retrovírus SIV, HIV-2, HIV-1 que normalmente os contêm: estas sequências comportam particularmente, no total, até 100 aminoácidos.
'-13Outras sequências nucleótidicas igualmente preferidas são as que codificam para as sequências de aminoácidos seguintes :
RGEFLYCKMNWFLNWVEDRSLTTQKPKERHKRNYVPCHIRQIINTWHKVGKNVYLP
PREGDLTCNSTVTSLIANINWTDG;
RGEELYCNMTWELNWIENKTHRNYAPCHIKQIINTWHKVGRNVYLPPREGELSCNS
TVTSIIANIDWQNN;
GGEEEYCNSTQLFNSTWENSTWSTEGSNNTEGSDTITLPCRIKQFINMWQEVGKAM
YAPPISGQIRCSSNITGLLLTRDGGNN;
Num modo de realização particular das partículas anteriormente referidas, a sequência de aminoácidos exógena é inserida na sequência peptídica codificada pela região pré-S2 do genoma do vírus da hepatite B, ou substitui toda ou parte desta sequência peptídica.
De preferência, as partículas híbridas recombinantes contêm uma sequência de aminoácidos exógena escolhida entre as que foram já indicadas como exemplos preferidos:
Xj CHIRQI I ΝTWHKVGKNVYLΡPREGDLTC Zx
X2 CHIKQIINTWHKVGRNVYLΡPREGELSC Z2
X3 CRIKQFINMWQEVGKAMYAPPISGQIRC Z3
Estas sequências particulares apresentam características funcionais interessantes, particularmente pelo facto de conterem em uma sequência comum resultante de HIV um sítio de ligação aos linfócitos T e receptores CD4 e um epítopo T muito próximos um do outro.
-14·
Uma extensão da aplicação da presente invenção consiste na preparação de um vector recombinante exógeno característico de uma g1icoproteína do invólucro de HIV mas desprovida da sequência que codifica para o sítio de ligação ao receptor CD4. Uma tal sequência exógena inserida na região pré-S definida antes pode conduzir de modo interessante à formação de partículas híbridas recombinantes capazes de apresentar 'a sua superfície epítopos susceptíveis de ser reconhecidos pelos linfócitos B e pelos linfócitos T e capazes, respectivamente, de contribuir para a indução de anticorpos ou de uma resposta celular.
Sequências de aminoácidos exógenos preferidas da presente invenção, contêm sequências peptídicas, respectivamente, características dos vírus SIV, HIV-2, HIV-1 e têm as seguintes sequências
RGEFLYCKMNWFLNWVEDRSL TTQKPKERHKRNYVPCHIRQ11NTWHKVGKNVYLP
PREGDLTCNSTVTSLIANINWTDG
RGEELYCNMTWELNWIENKTHRNYAPCHIKQIINTWHKVGRNVYLPPREGELSCNS
TVTSIIANIDWQNN
GGEFFYCNSTQLENSTWENSTWSTEGSNNTEGSDTITL PCR IKQEINMWQEVGKAM
YAPPISGQIRCSSNITGLLLTRDGGNN
Outras sequências peptídicas exógenas podem estar abrangidas pelo âmbito da presente invenção desde que as propriedades pretendidas para as partículas recombinantes e que foram anteriormente definidas sejam respeitadas.
Os péptidos e polipeptidos imunogénicos característicos de HIV ou de SIV que estão compreendidos no âmbito da presente invenção podem ser obtidos por síntese, de acordo com as técnicas descritas na patente de invenção norte-americana n? 4629783 concedida a 16 de Dezembro de 1986 à Firma GENETIC SYSTEMS.
Outros métodos cujo osprincipios estão resumidos a seguir poderão ser utilizados.
Um princípio de síntese é por exemplo fazer contactar uma fase sólida na qual se liga a sequência do péptído e uma fase líquida contendo dissolventes e reagentes. Em cada passo a separação entre o péptído em crescimento e os reagentes faz-se mediante simples filtrações e lavagens.
Inicia 1mente, o suporte sólido que transporta um grupo reactivo reage com o grupo carboxilo de um aminoácido introduzido com o seu grupo -NH2 bloqueado (protegido por exemplo pelo _t-butiloxi- -carbonilo), para formar uma ligação covalente. Após desprotecção da função aminada (por exemplo mediante lavagem com um ácido tal como 0 ácido trif1uoroacético), introduz-se um segundo aminoácido protegido para se obter mediante acoplamento a primeira ligação peptídica. 0 segundo aminoácido, que fornece 0 segundo amino-acilo da sequência, é acoplado, a partir do resíduo amino-acilo C-terminal, à função amina desprotegida do primeiro aminoácido C-terminal da cadeia. De preferência, a função carboxilo deste segundo aminoácido é activada, por exemplo, pela dicic10-hexi1carbodiimida. Mediante uma sequência de reacções, desprotecções e acoplamentos, a síntese progride do resíduo C- em direcção ao resíduo N-terminal. Quando a sequência pretendida está completa, o péptído desliga-se da fase sólida, mediante uma reacção específica de corte da ligação péptido-resina inicialmente for1 6
mada .
De acordo com um outro modo de realização da presente invenção, recorrer-se-à à técnica de síntese em solução homogénea descrita por HOUBENWEYL na obra intitulada Méthode der Orqanischen Chemie (Método da Química Orgânica) editada por E. WUNSCR, vol. 15-1 e II, THIEME, Stuttgart, 1974.
Este método de síntese consiste em se condensar sucessivamente dois a dois os aminoacilos sucessivos na ordem requerida, ou em se condensar aminoacilos e fragmentos previamente formados e contendo já vários aminoacilos na ordem apropriada ou ainda vários fragmentos previamente assim preparados, entendendo-se que se terá o cuidado de proteger previamente todas as funções reactivas transportadas por estes aminoacilos ou fragmentos, com excepção das funções amina de um e carboxilo de outro, ou vice -versa, que devem normalmente intervir na formação das ligações peptídicas, nomeadamente após activação da função carboxilo, de acordo com os métodos bem conhecidos na síntese dos péptidos. Como variante poder-se-à recorrer a reacções de acoplamento com recurso a reagentes de acoplamentos clássicos, do tipo carbodiimida , tais como, por exemplo, a 1 -eti13-(3-dimeti1aminopropi1)-carbodiimida. Quando o aminoacilo utilizado tem uma função ácida suplementar (particularmente no caso do ácido glutâmico), estas funções serão, por exemplo, protegidos por grupos éster _t-butílico.
A presente invenção pedeiro celular transformado por um que foram anteriormente descritos e expressão da inserção contida neste refere-se igualmente a um hosvector recombinante entre os competentes para assegurar a vector recombinante.
A titulo de exemplo, a expressão da partícula híbrida recombinante HIV-HBs pode ser assegurada em diferentes tipos celulares por vectores plasmidicos ou virais, por exemplo os pox vírus (do tipo do vírus da vacina, os adenovírus, os báculo vírus). As técnicas de infecção ou de transferência, consoante se trate de vírus ou de plasmideo, são bem conhecidas dos especialistas na matéria. Poder-se-à para isso reportar-se à patente de invenção francesa n9 245.136 ou ao pedido de patente de invenção europeia publicada com o n? 265.785.
A título de exemplo de hospedeiros celulares adaptja d os para a realização da presente invenção, meneionar-se-à células eucariotas de mamíferos, por exemplo células CHO, ou ainda leveduras por exemplo Sacchoromyces cerevisiae.
Os processos de transformação utilizados para se obter a expressão da inserção do vector ( e da evidência do produto da expressão) são clássicos, como se verifica dos Exemplos que se seguem.
Por outro lado, a presente invenção diz, respeito a uma composição vacinante contra infecções devidas a um retrovírus HIV, caracterizada pelo facto de compreender como ingrediente activo, partículas recombinantes híbridas tais como as descritas nas páginas anteriores, em associação com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
A administração destas composições a um paciente poder-se-à fazer utilizando doses contendo entre cerca de 5 e
-18cerca de 20 fjpp de partículas recombinantes híbridas purificadas por dose. Estas doses serão, por exemplo, administradas três vezes com um mês de intervalo.
A presente invenção diz igualmente respeito a um processo para a preparação de um vector recombinante, caracterizado pelos seguintes passos;
- recombinação genética i n vitro , eventualmente sob o controlo de um promotor reconhecido pelas polimerases de um hospedeiro celular eucariota apropriado, por um lado, de uma sequência nucleotídica exógena que codifica para uma sequência de aminoácidos imunogénica, induzindo anticorpos neutra 1iza dores face a um retrovírus da família HIV ou susceptível de ser reconhecida por esses anticorpos, comportando esta sequência exógena pelo menos um epítopo susceptível de ser reconhecido pelos linfócitos B e pelo menos um epítopo susceptível de ser reconhecido pelos linfócitos T, e, por outro lado, um encadeamento de nucleótidos correspondente à região S e eventua 1mente a toda ou parte da região pré-S do genoma do vírus da hepatite B e
- recuperação do vector recombinante formado que comporta os elementos anteriormente definidos.
Um processo semelhante pode ser aplicado para se obter a formação de um vector recombinante anteriormente definido, no qual a sequência exógena inserida codifica para uma sequência de aminoácidos comportando, além disso, um sítio de ligação ao receptor CD4.
A recuperação do vector recombinante pode efectuar-se mediante processos conhecidos, particularmente por hibridação selectiva com, por um lado, sondas nuc1eotídicas características das sequências correspondentes do genoma de um retrovírus HIV, por outro lado, com sondas características da região S do genoma do vírus da hepatite B.
A presente invenção diz igualmente respeito a composições para o diagnóstico i n vitro de uma infecção devida a HIV mediante detecção da presença de anticorpos neutralizadores em um meio biológico de um paciente. Tais composições compreendem partículas híbridas recombinantes que exprimem à sua superfície um ou vários dos polipéptidos ou péptidos de HIV-1 ou HIV-2 ou SIV, ou uma mistura destas partículas híbridas recombinantes.
A presente invenção diz igualmente respeito à utilização destas partículas híbridas recombinantes para realizar um teste de diagnóstico in vitro da presença de anticorpos resultantes de uma infecção causada por HIV, caracterizada pelo facto de :
- se fazer contactar um meio biológico de um paciente com partículas recombinantes híbridas,
- se fazer a detecção do produto da reacção eventualmente formado, a saber, um complexo antigénio - anticorpo .
Os meios para a génio-anticorpo são osconhecidos dos meadamente a marcação radioactiva. composição das partículas híbridas detecção do complexo antiespecialistas na matéria, no0 teste poderá, de acordo com a recombinantes, ser aplicado para
o diagnóstico selectivo de HIV—1 ou HIV-2, ou para o diagnóstico não selectivo graças à utilização de composições contendo partículas que exprimem à sua superfície sequências de HIV-1 e de HIV-2 ou uma sequência característica dos dois vírus simultaneamente.
A presente invenção diz igualmente respeito a um processo para o diagnóstico in vitro de uma infecção devida a HIV, caracterizado pelo facto de compreender os seguintes passos;
- contacto entre uma composição definida antes e um meio biológico de um paciente susceptível de conter anticorpos neutralizadores contra HIV,
- detecção da formação de um eventual complexo antigénio-ant icorpo .
Por meio biológico entende-se toda a amostra susceptível de conter anticorpos, tal como o soro de um paciente.
A presente invenção diz ainda respeito a um processo para a produção das partículas híbridas recombinantes definidas antes, caracterizado pelo facto de compreender os seguintes passos:
- transformação de um determinado hospedeiro celular com um vector recombinante tal como descrito antes, em que o promotor eventualmente presente no vector é reconhecido pelas polimerases do hospedeiro celular transformado, cultura do hospedeiro celular num meio apropriado e
-21recuperação das partículas formadas, mais particularmente as excretadas no meio de cultura. Estas partículas são, então, caracterizáυeis não somente pelas suas características morfológicas e pela sua reactividade imunológica com anticorpos anti-HBs, mas igualmente pela sua aptidão para serem reconhecidas pelos anticorpos antiHIV correspondentes ou para induzir esses anticorpos.
A presente invenção diz igualmente respeito à utilização dos fragmentos imunogénicos de aminoácidos descritos antes, sós ou em misturas, como antigénios de imuno-ensaios para a detecção in vitro de anticorpos, em particular de anticorpos neutralizadores, particularmente a seguir à vacinação.
A presente invenção diz, portanto, igualmente respeito a um método de doseamento in vitro da presença de anticorpos dirigidos contra um retrovírus do tipo HIV, em particular para o doseamento de anticorpos neutralizadores a seguir à vacinação, caracterizado pelo facto de compreender os seguintes passos:
- contacto dos fragmentos imunogénicos de aminoácidos descritos, marcados de modo a permitir o doseamento ulterior, com o meio biológico a testar, em condições apropriadas para permitir a reacção entre os ditos fragmentos e o meio,
- doseamento dos referidos fragmentos gue reagiram com o meio.
A presente invenção diz igualmente respeito a um conjunto (Kit) de diagnóstico in vitro de anticorpos anti-HIV, em um meio biológico, em particular de anticorpos neutraliza-22dores a seguir à vacinação, caracterizado pelo facto de compreender:
- fragmentos imunogénicos de aminoácidos tais como os descritos antes,
- meios adaptados para a revelação da reacção antigénio-anticorpo .
Os meios de revelação consistem, por exemplo, em anticorpos capazes de reconhecer o conjugado formado entre os antigénios e os anticorpos do meio biológico.
Outras características e vantagens particulares da presente invenção aparecerão nos exemplos que se seguem e que sao ilustrados pelas figuras.
MATERIAIS E MÉTODOS
Construção de vector
M13tgl30 é um vector de clonagem derivado do bacteriófago M13. De acordo com o descrito por KIENY e colab.
(14), contém na sequência 5' do gene que codifica para a betaga 1 actosidase , 11 sítios únicos de restrição constituindo um po 1 iadapta dor ( po 1 y1inker ) (ver figura 1). A inserção de fragmentos de ADN exógeno neste polylinker pode ser detectada pela ausência de colaboração por X-gal. A selecção das placas azuis mediante hibridação i n situ permite a detecção dos fragmentos de
ADN inseridos em fase.
vector de expressão de HBsAg, pSVS (11) foi
Ζ -23 <
modificado para lhe inserir o segmento EcoRI - Sall do ADN de M13tgl3O gue contém 10 sítios de restrição entre os sítios EcoRI e Xhol da região pré-S2 do genoma do vírus da hepatite B também designado por HBV (abreviatura inglesa de Hepatitis B virus).
A fusão entre os sítios de restrição Sall e Xhol restaura o quadro de leitura na região pré-S2. A região pré-Sl do vector resultante pM2S foi eliminada em seguida. 0 vector obtido foi designado por p5V2S. Nesta construção, a fusão entre o ADN clonado e o gene S adjacente 'a região pré-S2 é colocado sob o controlo directo do promotor precoce de SV40.
Utilizando meios análogos, obteve-se designado por pSVS XL mediante recombinação entre pSVS nível dos sítios Xhol e Smal respectivamente.
um vector e pM2S ao
Transferência das células animais
Células do ovário de hamster chinês dhfr-(CHQ) do clone DXB11(15) foram mantidas sob a forma de monocamada em um meio Ham Γ12 completado com 10?ó de soro fetal de bovino. As células foram transferidas utilizando o método do fosfato de cálcio descrito na referência (16) com um chogue de glicerol 6 horas mais tarde (Parker e colab., 1979). Uma co-transferência com o vector pSV2 dhfr de acordo com o princípio referido na referência (17) permite a selecçao dos clones estáveis gue exprimem as proteínas de fusão com HbsAg (também chamadas proteínas recombinantes ) . A amplificação das seguências transformadas foi obtida procedendo a uma cultura celular na presença de concentrações crescentes de metotrexato (Μ Τ X) (18).
s<
-24Produção e purificação das partículas recombinantes de HIV-HBsAg.
Ciones estáveis exprimindo as partículas recombinantes de HBsAg foram cultivados até à confluência e foram alimentados de três em três ou de quatro em quatro dias com um meio de cultura que continha apenas 5% de soro fetal de bovino. Os sobrenadantes de culturas celulares foram recuperados, clarificados e as partículas de HBsAg foram concentradas mediante precipitação com sulfato de amónio e purificadas com duas tomas em um gradiente isopienico de CsCl seguido por um gradiente de velocidade em sacarose de 0 a 20%.
Imuno-manchas
Submeteu-se cerca de 1 yig de partículas recombinantes purificadas à ebulição em um tampão de Laemmeli, separou-se mediante electroforese em gel de ρo 1iacri1amid a do deci1-su1fato de sódio a 12,5% (NaDodSO^) e electrotransferiu-se sobre filtros de nitroce 1u1ose (SCHLEICHER & SCHULL).
As proteínas imobilizadas sobre os filtros reagiram com os diferentes anti-soro seguintes: a-p49a (19), anti-soro anti-péptido de coelho específico de HBsAg, 18/7 (20) anticorpos específicos da região pré-Sl de HBV e um anti-soro dirigido contra as regiões da GP160 de HIV-1 (figura 2) obtido a partir de coelhos utilizando péptidos sintetizados ligados com uma sero-albumina bovina (BSA : abreviatura inglesa de bovine serum albumine) ou a hemocianina de limpet Keyhole (abreviatura inglesa: KLH).
-25As proteínas imunoreactivas finais foram eliminadas por anticorpos anti-coelho ou por imunoglobulinas de murganhos conjugados com a peroxidade (AMERSHAM) e foram reveladas com diaminobenzidina .
Imunizações e determinações da produção de anticorpos
Imunizou-se coelhos duas ou três vezes, com um mês de intervalo, mediante injecção intradérmica de cerca de de partículas recombinantes de HBsAg purificadas (quadro 1) no adjuvante completo de Freund. Os soros obtiveram-se 30 dias depois da última injecção.
Estes anti-soros foram testados para conhecer o seu nível de produção de anticorpos, pelo método ELISA (Enzyme Linked Immunoabsorbent Assay), utilizando, em fase sólida, partículas HBsAg derivadas do plasma (Hevac B.Pasteur, produzido por Pasteur Vaccins France) ou péptidos sintéticos característicos de HIV (ver figura 2). Os péptidos sintéticos foram fornecidos pelo Dr. ROCHAM (UA. 553, CNRS MARSEILLE). Todos os antigênios foram utilizados a uma concentração de 1 yttg/ml sobre placas de m i c r o t i t u i a ç ã o (EALCON Probind) e os testes ELISA foram realizados de acordo com o descrito por CHARBIT e colab. (21).
Ensaios dos anticorpos neutra 1izadores
Para demonstrar a actividade neutralizadora dos anticorpos contidos nos soros, utilizou-se linfócitos estimulados do sangue periférico humano (PBL). Estas células foram utilizadas pela sua sensibilidade à infecção com HIV. Foram utilizadas diferentes amostras de um isolado LAVBRU descrito por MONTAGNlER e colab. (22) como inoculo de vírus. Pré-incubou-se cada diluição de soro com um volume igual de inoculo virai durante 1 hora a 37°C Em seguida, adicionou-se a mistura a uma quantidade de 4.10^ PBL humanos em um meio RPMI 16-40 completado com 10% de soro fetal de bovino contendo 20 U . / m 1 de interleucina, 2,2 yttg/ml de polibreno e 25 U./ml de soro anti-interferão.
Depois de 1 hora de incubação a 37°C, as células foram lavadas e cultivadas em meios RPMI completos. Os sobrena dantes foram retirados duas vezes por semana e as mesmas diluições dos soros testados foram adicionadas nos novos meios as duas primeiras vezes. Congelou-se os sobrenadantes a -70°C e ensaiaram-se para conhecer a sua actividade de transcriptase inversa (actividade RT) (23) .
RESULTADOS
Clonagem dos fragmentos do gene do invólucro de HIV 1 um vector de expressão eucariota de HBsAg
A clonagem realizou-se em dois passos:
Num primeiro passo, construiu-se um banco genómico de expressão, no bacteriófago M13tgl30 e transferiu-se os fragmentos de ADN seleccionados no vector de expressão do HBsAg. 0 bacteriófago M13tgl30 e um vector de clonagem e de sequenciação comportando ao nível do quinto codão do gene lacZ de E.coli, um polylinker (poliadaptador) com 11 sítios de restrição únicos. Clonou-se fragmentos de ADN do genoma de HIV cortados ao acaso e comportando 50 a 1000 pares de bases nos sítios Smal e EcorV do bacteriófago M13tgl30 (figura 1). A hibridação in si tu e a sequenciação permitiram localizar precisamente o fragmento clonado na região que codifica para o invólucro de HIV 1.
Os fragmentos de HIV seleccionados foram transferidos no vector de expressão de HBsAg, p5V25 (figura 1). 0 pSV2S é obtido por modificação de um vector de expressão pSVS anteriormente descrito na parte Materiais e métodos. 0 pSVS comporta a sequência de SV40 que contém a origem da replicação, os promotores tardio e precoce, o activador e os sítios de iniciação de ARNm. Encontram-se na vizinhança imediata do promotor precoce, sequências de HBV que contêm a região genómica pré-S2, o gene S, e uma sequência que permite a ρo 1iadeni1 ação do ARN mensageiro do HBsAg. No vector pSV2S, a parte da região pré-S2 foi eliminada e substituída pelo ρo 1iadaptador M13tgl30. Nesta constru ção, o po1iadaptador permite a inserção de um fragmento de ADN em fase com a região pré-S2 e o gene 5. Assim, qualquer fragmento clonado no quadro de leitura correcto do gene LacZ no bacteriófago M13tgl30 pode ser facilmente transferido em fase com o gene S no vector de expressão pSV2S.
Um outro derivado de pSVS é o vector pSVS XL , no qual o adaptador M13tgl30 permite facilmente a inserção em fase de uma sequência exógena na região pré-S2. Nesta construção, os antigénios pré-Sl e pré-S2 são expressos de modo adjacente com o antigénio estranho.
Entre os fragmentos correspondentes ao invólucro de HIV e obtidos no banco, três foram estudados em pormenor clone ng 2 contém uma inserção de HIV formada por 52 pares de bases (pb) (nucleótidos 6440 a 6491), situada na parte média na sequência que codifica para a GP 120 (figura 2). Cobre uma região conservada entre os diferentes isolados de HIV1 ( 3 ) .
clone ng 8. contém uma inserção de HIV de 252 pares de bases (nucleótidos 6915 a 7166), que corresponde à parte sub-carboxitermina 1 da proteína GP120 (figura 2). Esta região está relativamente bem conservada entre os diferentes isolados e apresenta uma homologia com a região constante da cadeia pesada da imuηog1 obu1ina (referência 24). Além disso, uma parte do fragmento de ADN codifica para um domínio implicado na ligação da proteína GP120 ao receptor do vírus, a molécula CD4 (referência 2 5).
clone ng 6. contém uma inserção de HIV que comporta 55 pares de bases (nucleótidos 7306 a 7360) situado numa região que codifica para a parte amino-terminal da proteína transmembranar GP41. Esta região é conservada nos isolados de HIV e partilha uma homologia com a proteína de fusão de outros vírus (26) .
Expressão das proteínas de fusão HIV-HBV nas células transferidas.
Os vectores de expressão de HBsAG que contêm os fragmentos do gene do invólucro de HIV-1 foram utilizados para transferir células CHO. Os clones estáveis que exprimem HBsAg, detectados por um teste RIA específico para a proteína maior do invólucro de HBV foram separados para detectar a expressão do gene heterólogo. Foram em seguida caracterizados mediante análise de acordo com o método dito Northern blot e observou-se o ARN mensageiro híbrido. As partículas segregadas foram em seguida purificadas a partir do sobrenadante de cultura celular mediante um processo utilizado para as partículas de HBsAg (11). As partículas recombinantes HIV-HBsAg têm aproximadamente a mesma densidade em um gradiente Cscl que as partículas nativas. As proteínas das partículas recombinantes foram separadas mediante electroforese em gel de po1iacri1amida NaDodSOg, transferidas sobre filtros de nitroce1u1 ose e testadas com anti-soros obtidos a partir de coelho e dirigidos contra o péptido sintético que corresponde quer à partícula HBsAg, quer aos determinantes do invólucro de HIV (figura 3 ) .
Foram observados os seguintes resultados: Partícula recombinante nS. 2: além da proteína maior HBsAg e da proteína correspondente sob a forma glicosilada GP26, o soro anti-p49a revelou 4 bandas no intervalo compreendido entre 27 000 e 32 000 daltons correspondente à proteína média (figura 3A, linha 1). As 4 bandas são igualmente fortemente reveladas por um soro dirigido contra o péptido de HIV1 homólogo (pep 5) (figura 3A, linha 1). Isto demonstrou que a partícula recombinante HBsAg nS 2 comporta um determinante estranho. As quantidades de proteínas média e maior são praticamente as mesmas. A proteína média fundida está presente sob quatro formas, em função da glico30 silação das regiões de HBV ( 1 sítio de g1icosi1ação) e de HIV (2 s í t ies poss í ve is de g 1 i c o s i 1 a ç ã o ) .
Partícula recombinante n- 8: o soro anti-p49a revelou uma proteína maior de HBsAg sob duas formas (P22 e GP26) assim como bandas que correspondem a um peso molecular compreendido entre 37 000 e 46 000 (figura 3B, linha 1). Soros dirigidos contra dois péptidos homólogos n^.6 e n^7 revelaram a mesma repartição de proteínas pesadas (figura 3B, linhas 2 e 3) demonstrando a presença de um determinante de HIV nas partículas. A quantidade de proteína média fundida é menos importante que a quantidade de proteína maior. A proteína de 37 Kd corresponde à proteína de fusão não glicosilada e as proteínas de maior peso molecular correspondem 'as formas glicosiladas (5 sítios possíveis de glicosilação na parte HIV).
Os soros anti-péptid os revelaram igualmente uma proteína de 67 Kd que corresponde à sero-albumina co-purifica da .
Partícula recombinante n° 6: o soro anti-p49a revelou uma proteína maior HBsAg e sua contraparte glicosilada mas não revelou proteína média (figura 30 , linha 1). Observou-se um tripleto de bandas de elevados pesos moleculares; foi igualmente revelada por um anticorpo monoclonal contra o antigénio pré-S1 (figura 30, linha 2). 0 tamanho destas proteínas é compatível com o da grande proteína HBsAg, que comporta o péptido estranho nas suas formas glicosilada e não glicosilada.
Resposta imunitária humoral às partículas recombinantes HBsAg.
Imunizou-se coelhos duas ou três vezes com um mês de intervalo, com cada uma das partículas recombinantes HBsAg anteriormente referidas, em um adjuvante de Freund completo (ver Materiais e Métodos). A especificidade da resposta imunitária foi determinada por um teste ELISA utilizando partículas derivadas do plasma e diferentes péptidos correspondentes de HIV —1 . Testou-se igualmente anti-soros contra péptidos pré-S2 (sequência de aminoácidos da proteína do invólucro de HBV compreendida entre os números 120 e 145, inclusivé) (Quadro 1).
Todos os coelhos desenvolveram anticorpos contra partículas HBsAg nativas, a diferentes níveis. A resposta mais fraca foi obtida para o recombinante ηθ 9, o que se pode explicar pelo tamanho relativamente grande do antigénio estranho (84 aminoácidos) que pode entrar em competição com os determinantes HBsAg ou dissimu1á-1 os. Pelo contrário, a melhor resposta dirigida contra o péptido estranho foi obtida com este recombinante ηθ g, o que sugere, neste caso, uma apresentação predominante dos antigénicos HIV em relação aos determinantes antigénicos de HBsAg.
Nos recombinantes ηθ 2 e ηθ 6, os antigénios exógenos pertencentes a HIV são menores e de tamanho comparável (18 aminoácidos e 20 aminoácidos). As respostas dirigidas contra os péptidos observados nos dois casos são mais fracas que as dirigidas contra as partículas HBsAg nativas. A proporção de proteína de fusão em relação à proteína maior nativa é elevada no recombinante ηθ 2 (ver figura 3). Estes resultados sugerem uma fraca imunogenicidade da sequência inserida neste recombinante.
Uma resposta com os péptidos pré-52 obtém-se unicamente para o recombinante n26 resultante da expressão no vector pSV XL (figura 1). Anti-soros de dois outros coelhos imunizados com partículas obtidas por expressão no vector pSV2S são negativos e servem de controlo.
Neutralização da infecção devida a HIV in vitro pelos soros imuno-dirigidos contra as partículas recombinantes n^8.
Imunizou-se coelhos com partículas recombinantes HIV-HBsAg e testou-se os soros para avaliar a sua capacidade para neutralizar o isolado LAV-1gp^ (24). Estudou-se a infecção virai nos linfócitos do sangue periférico graças à actividade de transcriptase inversa (RT) durante três a quinze dias. 0 ensaio realizado baseou-se na redução da actividade RT na presença de soro imune, sendo o resultado comparado com o resultado obtido na presença de soro pré-imune do mesmo coelho.
Neste teste, os anticorpos não podem neutralizar eficazmente o vírus se estiverem presentes quantidades saturantes de viriões infecciosos.
Por este motivo, os testes rea 1izaram-se a partir dos diferentes anti-soros diluídos (1:50) para neutralizar as diferentes amostras de vírus (figura 4A, 4B, 4C). 0 soro do coelho imunizado com a partícula recombinante n^.8 neutralizou integra 1mente a infectividade virai do vírus menos infeccioso (figura 4) e observou-se uma diminuição da actividade RT de 95°í a 63% e 35?; quando se aumentou a infectividade da amostra virai (figura 4D). Isto mostra que a capacidade de neutralização dos anti-soros é função da quantidade de vírus.
Anti-soros correspondentes às partículas recombinantes n2.6 deram uma fraca neutralização com uma pequena concentração de vírus, mas não se pôde detectar uma redução da actividade RT com o anti-soro de coelho imunizado com o recombinante n?. 2, mesmo para uma baixa concentração de vírus.
isolados de Η IV1 tração constante dirigidos contra
Além disso, a neutralização de diferentes foi examinada mediante utilização de uma concende vírus com uma diluição variável dos anti-soros a partícula recombinante n9.8.
A figura 5 mostra uma redução de cidade infecciosa do isolado LAV^^ com uma diluição parada com o soro pré-imune.
50% da capade 1:50 comA actividade neutra 1izante deste anti-soro contra o isolado zairense de HIV 1 foi igualmente demonstrada: observou-se um efeito neutralizante de 50% para uma diluição de 1:25, sobre LAVgpj (3) (figura 5).
DISCUSSÃO
A g1icoproteίna interna do invólucro de HIV1 , GP120, à partida interessante pela sua capacidade para induzir uma resposta imunitária protectora em relação a HIV, contém regiões conservadas, e outras regiões variáveis entre os diferentes isolados de HIV. As seguências conservadas no interior dos domínios constantes poderiam corresponder a regiões de seguências com uma importância funcional potencial. Como o demonstram os re34 sultados apresentados vadas do invólucro de forma de proteínas de superfície da hepatite adiante, estas diferentes regiões conserHIV1 foram escolhidas e expressas sob a fusão com a proteína média do antigénio de
B .
A partícula HBsAg apresenta boas propriedades imunogénicas , de acordo com dois aspectos explorados pelos inventores:
i) é um polímero de alto peso molecular gue comporta 'a sua superfície numerosas cópias de determinantes antigénicos;
ii) comporta igualmente epítopos T gue podem ser úteis no reconhecimento de epítopos B estranhos pelo sistema imunitário (27) .
Entre as três diferentes regiões conservadas de HIV estudadas antes, uma de entre elas (clone n^S) está ligada ao sítio de ligação CD4 (25), uma outra (clone n^ó) poderá estar implicada no processo de fusão (26) e a terceira (clone n^2) não está ligada a nenhuma actividade biológica conhecida.
As partículas recombinantes HIV-HBsAg obtidas mediante fusão destes determinantes antigénicos com o produto do gene da região pré-S2 foram estudadas mediante utilização de anticorpos dirigidos contra péptidos homólogos sintéticos. Análises de marcha de Western permitiram demonstrar a presença de determinantes antigénicas HIV sobre as partículas e a provável glicosilação das proteínas de fusão. As proporções de proteína de fusão e de proteína nativa maior observadas nas diferentes partículas recombinantes são variáveis. Para o recombinante n^8, a proteína de fusão é aparentemente menos abundante, o gue pode
- 35 estar ligado ao tamanho relativamente importante da sequência estranha inserida. 0 tamanho de origem do produto de tradução pré-S2 de HBV é de 55 aminoácidos enquanto a construção da proteína de fusão aumenta este tamanho até 111 aminoácidos. 0 tamanho da proteína a fundir poderia contrariar a sua inserção nas partículas de HBsAg.
Para os recombinantes n96 e n92, a proporção entre a proteína de fusão e a proteína maior é comparável à observada entre a proteína média e a proteína maior nas partículas obtidas mediante transferência do vector de expressão pSVS das partículas HBsAg de origem (11).
A imunogenicidade das partículas recombinantes HIV-HBsAg foi anteriormente referida. A resposta humoral é dirigida contra duas regiões antigénicas e mostra que os epitopos estranhos estão presentes de modo eficaz à superfície das partículas
A actividade biológica dos anticorpos foi testada quando do ensaio de neutralização in Vitro . Epitopos neutralizantes e não-neutra 1izantes foram postos em evidência nas proteínas do invólucro de HIV. Anticorpos dirigidos contra os recombinantes n98 têm um efeito neutra 1izante potencial sobre o isolado HIV (LAVddi.) utilizado na origem para fabricar proteínas de fusão. Um efeito menor foi observado quando os anticorpos reagiram com um isolado de HIV1 diferente (LAV. A inserção de HIV utilizada no recombinante η^θ cobre duas regiões relativamente bem conservadas entre os diferentes isolados de ΗIV1 , estando estas duas regiões separadas por uma região hipervariável característica do isolado. Nesta região CEASE e colab. identificaram um epitopo de célula T (30)
Além disso, experiências com recurso a anticorpos monoclonais dirigidos contra a GP120 assim como experiências de mutagénese in vitro permitiram identificar uma sequência importante para a interacção com o receptor CD4 (25). Sabe-se igualmente que uma proteína de fusão foi produzida em E . coli que comportava uma sequência sobreposta em parte à sequência anterior utilizada e era capaz de levar à formação de anticorpos neutra 1izadores e a uma resposta imunitária celular (31). No sistema HBsAg, as proteínas de fusão podem ser glicosiladas normaimente, o que pode ser um elemento importante para a produção de anticorpos tendo uma forte afinidade para epitopos e capazes de bloquear a interacção da proteína do invólucro de HIV e do receptor CD4. Além disso, o determinante antigénico de HIV parece melhor exposto à superfície das partículas que na proteína virai nativa GP. A menor eficácia da neutralização observada com o isolado zairense pode ser atribuída à variação da sequência de aminoácidos de cerca de 30% numa região determinante para a interacção entre o vírus e o receptor CD4 (25).
Os anticorpos dirigidos contra os recombinantes ng.2 e ng.6 foram igualmente ensaiados em experiências de neutralização. As sequências de HIV que comportam o recombinante ng.2 não induziram anticorpos neutra 1iza dores quando destas experiências. Uma resposta imunitária fraca dos animais utilizados ou uma fraca imuηogenicid ade da região implicada no recombinante ng. 2 poderia explicar este resultado. A parte amino-terminal da GP41 poderia estar implicada no processo de fusão e em consequência
- 37 na neutralização virai.
Testou-se igualmente o efeito potencial dos anticorpos obtidos mediante imunização com o recombinante n^.ó em relação à infectividade de HIV1. 0 efeito neutra1izador é fraco e a inibição da formação das Sincitia não é completa. Este resultado poderia ser atribuído ao tamanho limitado da inserção de HIV.
Os inventores realizaram, portanto, um sistema potencialmente capaz de permitir a apresentação dos determinantes antigénicos estranhos do invólucro de HIV, permitindo este sistema, além disso, a produção de anticorpos neutra 1iza dores dirigidos contra uma região da proteína do invólucro que apresentaria sob a forma nativa propriedades imunogénicas fracas ou não estaria presente à superfície nesta proteína nativa.
Por outro lado, a justaposição de determinantes antigénicos de HBV e de HIV à superfície da mesma partícula imu nogénica pode permitir a realização de vacinas polivalentes.
IMUNIZAÇÃO DE MACACOS COM PAR1ICULA5 HIV/HBsAq
As partículas obtidas de acordo com o processo anteriormente descrito mediante fusão com uma sequência de 84 aminoácidos (AA 384 a 472) da glicoproteína exterior do invólucro de HIV-1 no interior da parte pré-S2 da proteína central HBsAg foram utilizadas num teste em macacos para testar a produção de anticorpos neutralizadores .
Para demonstrar que estas partículas híbridas induzem uma resposta humoral assim como uma resposta imune mediada
i pelas células T, em relação a HIV, em primatas, imunizou-se macacos quer com partículas híbridas, quer com partículas HBsAg nativas.
Imunizou-se dois macacos com partículas purificadas HIV/HBsAg, mediante 3 injecções sub-cutâneas com um mês de intervalo. Estes macacos receberam, em seguida, um reforço, (rappel) por duas vezes, três meses mais tarde. Imunizou-se um macaco controlo com A doses de partículas HBsAg nativas, de acordo com o mesmo protocolo. Colheram-se amostras de sangue em cada animal, antes e depois de cada imunização. A resposta imune humoral é seguida por meio de um teste ELISA (figura 7) utilizando quer as partículas nativas HBsAg quer os péptidos sintéticos homólogos de HIV (Pêptido 6:AA 373-398, pêptido 7:AA 421-441, ver figura 3) sobre a fase sólida.
Os títulos anti-HBs apresentaram um pico 3 semanas depois da terceira dose de vacina e em seguida uma queda. Um segundo pico dos títulos observou-se depois da imunização de reforço (rappel), excepto no macaco Mac S cujo título de anticorpos permaneceu constante após a quarta injecção e aumentou lentamente depois da quinta injecção. Anticorpos anti-HIV foram detectados mediante um teste ELISA utilizando os dois péptidos.
Os títulos atingiram um nível máximo três semanas depois da segunda injecção (Mac H) ou depois da segunda injecção (Mac S) e desceram, em seguida, lentamente. Contudo, a resposta anti-HIV parece atingir um patamar depois da segunda injecção.
Do mesmo modo que para os títulos anti-HBs, detectou-se um efeito de reforço (rappel) da 4^ dose com o soro
de Mac H .
No macaco controlo Mac A imunizado com partículas nativas HBsAg, detectou-se um título de anticorpos anti-HBs elevado depois da 3§ injecção com um aumento depois da dose de reforço (rappel). Não se detectou nenhum anticorpo anti-HIV fazendo reagir os péptidos de HIV com um qualquer dos soros deste animal de controlo.
Estes estudos demonstram que a imunização com duas doses das partículas híbridas parece suficiente para estabelecer uma memória imunológica e que as doses de reforço (rappel) são necessárias para manter o título elevado da resposta imune.
Para determinar se uma resposta imune por intermédio das células T em relação às duas partes da partícula híbrida podia ser detectada em macacos vacinados, testou-se linfócitos do sangue periférico (PBL) em relação à sua capacidade para proliferar e para incorporar timidina 3H em resposta a uma estimulação com partículas HBsAg nativas ou com partículas HIV/ /HBsAg assim como de HIV purificado inactivado por aquecimento. Como controlo interno da proliferação dos PBL, utilizou-se uma concanavalina A mitogénica. Os PBL de cada macaco foram isolados antes da imunização e 21 dias depois da segunda e da terceira injecção, assim como antes e depois do rappel com as partículas HBsAg. Cultivaram-se em um meio só ou em um meio estimulado durante 4 dias com HBsAg ou Con A e durante 5 dias com HIV —1 .
As curvas de resposta características das doses, obtidas 21 dias depois da primeira dose de vacina, estão !' representadas na figura 8. Os PBL de Mac H incorporam 8 vezes mais timidina em resposta à estimulação com uma concentração óptima de partículas HIV/HBsAg e 6 vezes mais em resposta à estimulação com partículas HBsAg nativas que PBL não estimulados. Logo que são estimulados com a concentração óptima de HIV, os PBL de Mac H incorporam 5 vezes mais timidina ^H que os PBL estimulados com o meio só. 0 macaco Mac A de controlo foi testado em relação à sua resposta proliferativa em PBL 21 dias depois da 3-. injecção com as partículas nativas HBsAg. Os PBL de Mac A proliferam em resposta à estimulação quer com as partículas HBsAg nativas, quer com as partículas HBsAg híbridas, mas não proliferam em resposta a uma estimulação com HIV, qualquer que seja a concentração utilizada.
Testou-se a resposta pro1iferativa dos PBL aos imunozomas obtidos com as g1icoproteίnas purificadas rgp160 ou gp 160 nativas. Os PBL de Mac H isolados 3 meses depois da última injecção são estimulados com HIV-1 purificado ou com imunozomas gp160 mediante utilização de diferentes doses (Quadro 1). Pelo contrário, as gp160 recombinantes produzidas em um sistema de vacina não induzem resposta pro 1iferativa . Os PBL de Mac A colhidos 57 dias depois da última injecção não proliferam quando são estimulados com um antigénio qualquer. Estes resultados demonstram que a maturação do fragmento gp120 no antigénio particular da presente invenção está mais próximo da maturação da glicoproteina unida no virião ou nas formas imunozomas que sob a forma monomérica.
A proliferação específica do PBL em resposta
q HBsAg ou ao HIV foi igualmente seguida o protocolo de imunização.
para cada animal durante
A figura 9 resume os resultados da proliferação linfocitária em resposta 'a estimulação com HIV/HBsAg, com HBsAg ou com HIV. Testou-se várias concentrações de cada antigénio e mediu-se as respostas nos 45 e 55 dias. Nos macacos, o pico de proliferação é obtido no 45. dia mediante utilização de HBsAg a uma concentração óptima de 250 ng/ml e nos 55. e 65. dias com HIV utilizando uma concentração óptima de 500 ng/ml. A resposta proliferativa máxima às partículas híbridas HIV/HBsAg e às partículas HBsAg observou-se depois da segunda injecção e é sempre superior à resposta obtida depois da estimulação com partículas nativas HBsAg para os 2 macacos imunizados com as partículas híbridas.
A resposta de Mac H é melhor em relação a HBsAg que a resposta de Mac S quer ao nível B (ver figura 7) quer ao nível T. A resposta pro 1iferativa depois da terceira imunização é mais fraca que depois da segunda injecção. Contudo, é encontrada uma boa proporção de células que reagem com o antigénio, 3 meses depois da terceira injecção (Mac Η). A imunização de rappel induz um ligeiro crescimento da resposta pro 1iferativa dos PBL. Observa-se uma diferença importante entre a resposta pro 1iferativa a HIV dos PBL para os dois macacos. Os PBL de Mac S proliferam de modo significativo somente depois da terceira injecção e depois das doses de rappel enquanto os PBL de Mac H proliferam de modo significativo à estimulação HIV num momento qualquer depois da imunização.
Como se observou com HBsAg, a resposta proliferativa a HIV aumenta muito pouco com o rappel mas persiste ao mesmo nível 3 meses depois da última injecção (Mac H). Em consequência, o protocolo de imunização pode ser adaptado modificando a dose de reforço (rappel).
A resposta dos PBL de Mac S a HIV e a HBsAg é menor e perde-se 3 meses depois da última injecção provavelmente devido à pequena quantidade de células que reagem aos antigénios induzida pela vacinação destes animais.
A comparação da resposta pro 1iferativa em relação a todos os antigénios testados mostra que os PBL são estimulados da mesma forma por HIV ou por HBsAg nativa (Mac H). 0 índice de estimulação (SI) é comparável, excepto no 522. dia, em que aparece um número significativamente mais elevado de células T específicas de HBsAg. Estes resultados demonstram que a resposta imune a HIV e a HBsAg mediada pelas células é induzida nos macacos depois da vacinação com partículas híbridas HIV/HBsAg e que a cinética desta resposta varia em função do animal.
Utilizando a partícula HBs que comporta um fragmento da g1icoproteίna de invólucro gp12O de HIV (AA384-472) que contém o sítio de ligação CD4, obtiveram-se anticorpos, assim como uma resposta das células T dirigida contra as duas partes da proteína de fusão (HBsAg e HIV).
As partículas HBsAg constituem um bom veículo para a apresentação dos epitopos de HIV e permitem a indução nos macacos imunizados de uma resposta humoral, assim como de uma resposta imune mediada pelas células T, em relação a um domínio funcional da proteína de invólucro gp12O.
Outras características e propriedades da presente invenção aparecerão nas figuras que se seguem cujas legendas são apresentadas a seguir:
LEGENDAS DAS FIGURAS
- Figura 1
Vector da expressão e de clonagem dos fragmentos do géne do invólucro de HIV. M13tg130 é um vector de clonagem dos fragmentos de ADN de HIV. A região sombreada representa a parte N-terminal do gene da -ga 1 actosidade . Nesta região, encontra-se um adaptador que apresenta múltiplos sítios de clonagem
| Ei : | EcoRI, sm: | Sam | I , Ss : |
| Xb : | Xba I, H: | Hind | III, B |
| pM25 , pS V 2 5 e | pSVS | XL são | |
| XR: Xho | I . | ||
| - Figura | 2 |
PSVS ,
Representação esquemática da sequência de aminoácidos dos fragmentos do invólucro de HIV fundidos com HBsAg 0 sistema de numeração é o dado por ALIZON e colab. no artigo citado sob a referência (3). Os pontos e as setas correspondem, respectivamente, aos sítios potenciais de glicosilação e as cisteínas conservadas. As sequências dos 4 péptidos representam as regiões conservadas entre os isolados de HIV1 e de HIV2.
Figura 3
Análise de mancha de Western das partículas recombinantes de HBsAg. As partículas recombinantes n9.2 (A), n^.8 (b), n^.6 (c), reagiram com: um soro anti-p49a diluído a 1:500 (linhas A1, B1,C1), um anti-soro anti-péptido 5 (linha A2), um anti-soro anti-péptido 6 (linha B2), um anti-soro anti-péptido 7 (linha B3) a uma diluição de 1:25 e a uma diluição de 1:200 de um anticorpo monoclonal 18/7 (linha 02). Os tamanhos são dados em kilodaltons .
- Figura 4
Ensaio de neutralização: a cinética da neutralização in vitro das diferentes amostras de vírus (A, B, C) por um anti-soro diluído a 1:50 obtido depois da imunização de um coelho com o recombinante n^.8 (0 0) ou com um soro pré-imune (0-0). A actividade da transcriptase inversa determiηou-se mediante incorporação de /3H/ timidina trifosfato (em cpm). No gráfico D, cada ponto representa a percentagem de inibição RT para A, B, C calculada como se segue.
Cpm teste RT sobre cultura com soro imune
X 100 cpm teste RT sobre cultura com soro pré-imune
- Figura 5
Neutralização de HIV coelho dirigido contra o recombinante n? nha contínua) e imune (linha a ponteado) com um soro imune de
8. Soros pré-imune (liforam testados para conhecer a neutralização do vírus em culturas celulares, utilizando
5
dois isolados diferentes UAV^^ (círculos) ^AV^^j (triângulos). A actividade da transcriptase inversa mediu-se após 7 a 10 dias nos sobrenadantes de culturas celulares.
- figura 6
Sequências das proteínas do invólucro das proteínas do invólucro dos retrovírus SIV , HIV-2, HIV-1.
Nesta figura os traços de união que aparecem nas sequências têm como único objectivo permitir o alinhamento das sequências. Estes traços de união não têm, portanto, significado científico.
- figura 7 : Doseamento dos anticorpos em macacos imunizados com partículas híbridas HbsAq (S-H) ou partículas nativas HBsAg (A).
Mac S e H receberam uma injecção com partículas purificadas HIV/HBsAg, numa dose de 10 n,g ou 15 xcg , respec-
| tivamente | , aos 0, 242, 709, 167° | e 2039 dias | . Mac | A | recebeu | uma |
| injecção | de uma dose de 15 y^g de | partículas | HBsAg | derivadas | de | |
| um plasma | purificado aos 0, 212, | 439 e 1652 | dias. | A | primeira | dose |
foi dada com o adjuvante completo de Ereund,as doses seguintes com o adjuvante incompleto de Ereund. Mas 5 e H receberam a quarta dose sem adjuvante.
As amostras de soros obtidas em diferentes momentos depois da injecção foram diluídas em série e testadas para a presença de anticorpos específicos de HBsAg ou de HIV utilizando o método ELISA. Os títulos são expressos pelo inverso da diluição do soro que dá um valor de absorção 3 vezes superior ao valor obtido com o soro pré-imune. Cada ponto é a média de 4 determinações .
- Figura 8 : Estimulação antiqénica dos linfócitos.
Os PBL foram isolados mediante centrifugação com Ficoll Hypaque a partir de sangue heparinizado , de Mac H (imunizado 3 vezes com HIV/HBsAg) ou Mac A £ imunizado 3 vezes com HBsAg (Controlo)_7.
Os PBL foram suspensos a 1,5x10^ células/ml em um meio RPMI 16-40 completado com 10?; de soro AB humano inactivado pelo calor. Depositou-se 0,1 ml em triplicado em cavidades de fundo redondo de placas com 96 cavidades. Os PBL foram estimulados com 0,1 ml de ΗIV — 1 purificado em um gradiente de sacarose com partículas HBsAg purificadas em 2 gradientes sucessivos de cloreto de césio. Cada antigénio foi testado para diferentes concentrações. Quatro e cinco dias depois da estimulação, cada cavidade de PBL foi marcada com timidina ^H-T 1 ^cCi durante 6 horas, as células foram colhidas e determinou-se a timidina incorporada, mediante contagem de cintilação.
- Figura 9 : Seguimento da resposta p r o 1 i f e r a t i v a dos PBL dos macacos .
Os linfócitos foram colhidos antes da imunização e depois da segunda e da terceira imunização, antes e depois do rappel no dia indicado na figura. As setas indicam os dias de imunização dos animais. Seguiu-se a capacidade dos linfócitos para incorporar a timidina em resposta a um antigénio e-xógeno como se indica na figura 8 e calculou-se o índice de estimulação (S.I.) dividindo o número de cpm da timidina 3H incorporada pelas células estimuladas pelo número de cpm incorporado pelas células não estimuladas. Nestes ensaios o ruído de fundo (cpm) está compreendido entre 100 e 2450 cpm. A resposta Blastogénica à Con A dá um S.I. compreendido entre 5 e 129.
A imunogenicidade das partículas preferidas da presente invenção pode igualmente ser atribuída verosimilmente à glicosilação dos péptidos resultantes de HIV na ocasião da expressão dos vectores recombinantes referidos antes.
No descrito antes, a região que contem a sequência de aminoácidos imunogénica de HIV e o seu sítio de ligação aos receptores CD4 dos linfócitos T4 provinha quase sempre de uma sequência comum pertencente a uma glicoproteína da superfície ou transmembranar de HIV. Evidentemente que cada uma destas sequências pode provir de regiões afastadas uma da outra nas proteínas naturais de HIV. Neste último caso, elas consistirão de preferência em uma sequência recombinante ou em um polipéptido recombinante resultante da expressão de duas sequências que codificam para as regiões correspondentes do genoma de HIV ou até mesmo de HIV pertencente a isolados diferentes.
No descrito antes deve igualmente notar-se que, de preferência, se recorreu a sequências resultantes de HIV melhor conservadas nos diversos isolados disponíveis de HIV. Evidentemente que se pode, contudo, recorrer às sequências menos bem conservadas de um ou outro isolado. Numa tal hipótese, a presente invenção diz igualmente respeito às composições de partículas gue correspondam à definição dada antes, contudo, estas partículas umas das outras pelo seguências de aminoácidos comuns a regiões das correspondentes a isolados diferentes.
distinguindo-se, facto de conterem glicoproteínas
A presente invenção diz finalmente respeito às seguências de aminoácidos preferidas resultantes de HIV, gue estão identificadas no guadro da presente descrição e, por consequência também às sequências de ADN que codificam para elas (como, aliás, os polipéptidos produzidos por síntese química e que apresentam propriedades imunologicas semelhantes, assim como todas as sequências de ácidos nucleicos que codificam para estes polipéptidos, quer se trate de sequências naturais quer produzidas mediante síntese nuc1eotídica ) .
Em particular, as sequências de aminoácidos anteriormente referidas podem ser utilizadas para a produção de ingredientes activos de vacinas que comportem como suporte uma bactéria E. coli e, aflorando à superfície desta bactéria, as sequências peptídicas de HIV referidas antes. Para a produção de tais vacinas pode-se recorrer à técnica descrita no pedido de patente europeia depositado em 6 de Março de 1987 e publicado com o número 0242-243.
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Claims (24)
- REIVINDICAÇÕES1.- Processo para a preparação de um vector recombinante, que compreende as seguintes etapas:- recombinação in vitro e, eventualmente, sob o controlo de um promotor reconhecido pelas polimerases de um hospedeiro celular eucariota, de uma parte de uma sequência nucleotídica exógena que codifica para uma sequência de aminoácidos imunogénica, que induz anticorpos neutralizantes face a um retrovírus da família HIV ou susceptível de ser reconhecida por tais anticorpos, e comportando um fragmento de ácido nucleico correspondente à região S e, eventualmente, a toda ou parte da região pré-S do antigénio principal da superfície do vírus da hepatite B, e permitindo, quando introduzido em um hospedeiro celular eucariota competente, e na ocasião da cultura do hospedeiro celular assim transformado, induzir a produção de partículas apresentando as características morfológicas essenciais do antigénio HBsAg e, de preferência, a excreção destas partículas no meio de cultura, e recuperação do vector recombinante formado compreendendo os elementos, tais como foram definidos antes, caracterizado pelo facto de a referida sequência nucleotídica exógena do vector recuperado codificar para uma sequência de aminoácidos imunogénica que induz anticorpos neutralizantes face a um retrovírus da família HIV ou susceptível de ser reconhecida por tais anticorpos, comportando-53pelo menos um epitopo susceptível de ser reconhecido por linfócitos B, e pelo menos um epitopo susceptível de ser reconhecido pelos linfócitos T e- de se inserir a referida sequência nucleotídica exógena quer na dita região pré-S, ou de se substituir toda ou parte da dita região pré-S.
- 2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a referida sequência nucleotídica exógena do vector recombinante recuperado codificar para uma sequência de aminoácidos ímunogénica compreendendo além disso pelo menos um sítio de ligação ao receptor CD4.
- 3. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de se colocar o fragmento de ácido nucleico do vector recombinante recuperado sob o controlo de um promotor reconhecido pelas polimerases de um hospedeiro celular eucariota.
- 4. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de o promotor contido no vector recombinante ser um promotor resultante de SV40.
- 5. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo facto de se substituir a sequência nucleotídica inserida pela totalidade da região pré-S.-546. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo facto de se inserir a sequência nucleotídica exógena do vector recuperado na parte pré-S2 da região pré-S.
- 7. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de se eliminar essencialmente a região pré-S2 de um lado e do outro da sequência inserida.
- 8.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo facto de o vector recuperado ser tal que a sequência nucleotídica exógena que ele contém compreende uma sequência que codifica para uma das sequências de aminoácidos seguintes:X! CHIRQIINTWHKVGKNVYLPPREGDLTC ΖχX2 CHIKQIINTWHKVGRNVYLPPREGELSC Z2X3 CRIKQFINMWQEVGKAMYAPPISGQIRC Z3 em que os pares Xp Zp X2, Z2 e X3, Z3 representam quer grupos COOH ou NH2 quer sequências de aminoácidos compreendendo normalmente respectivamente associadas às partes centrais correspondentes sequências indicadas anteriormente nas glicoproteínas dos retrovírus SIV, HIV-2, HIV-2 que normalmente os contêm.-559.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo facto de o vector recuperado ser tal que a sequência nucleotídica exógena que ele contém codifica para toda ou parte de uma das seguintes sequências:RGEFLYCKMNWFLNWVEDRSLTTQKPKERHKRNYVPCHIRQIINTWHKVGKNVYLPPREGDLTCNSTVTSLIANINWTDGRGEFLYCNMTWFLNWIENKTHRNYAPCHIKQIINTWHKVGRNVYLPPREGELSCNSTVTSIIANIDWQNNGGEFFYCNSTQLFNSTWFNSTWSTEGSNNTEGSDTITLPCRIKQFINMWQEVGKAMYAPPISGQIRCSSNITGLLLTRDGGNN
- 10. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de o vector ser derivado do vector pM2S .
- 11. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de o vector ser derivado do vector pSV2S.
- 12.- Processo para a produção de partículas recombinantes, caracterizado pelo facto:-56*Ύ>- de se transformar um hospedeiro celular determinado com um vector recombinante obtido por um processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 11,- de se cultivar o hospedeiro celular transformado em um meio apropriado e- de se recuperar as partículas recombinantes formadas, apresentando partículas recombinantes recuperadas as caracteristicas morfológicas essenciais das partículas HBsAg e compreendendo, aflorando à superfície destas partículas, o essencial da sequência de aminoácidos (S) correspondendo à região S e, eventualmente, a toda ou parte da sequência de aminoácidos correspondendo à região pré-S do genoma do vírus da hepatite B, a montante da referida sequência de aminoácidos (S), compreendendo ainda estas partículas uma sequência de aminoácidos imunogénica que induz anticorpos neutralizantes face a um retrovírus da família HIV ou susceptivel de ser reconhecida por tais anticorpos, comportando esta sequência pelo menos um epitopo susceptivel de ser reconhecido pelos linfócitos B, ou pelo menos um epitopo susceptivel de ser reconhecido pelos linfócitos T, sendo esta sequência imunogénica, quer inserida na sequência de aminoácidos pré-S, quer substituída em toda ou parte da proteína pré-S.
- 13.- Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto de a sequência de aminoácidos imunogénica de partículas imunogénicas recuperadas compreender-57além disso um sítio de ligação ao receptor CD4 de linfócitos T4 humanos.
- 14. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 12 ou 13, caracterizado pelo facto de a sequência de aminoácidos imunogénica das partículas recombinantes recuperadas ser quer inserida na sequência de aminoácidos codificada pela região pré-S do genoma do vírus da hepatite B, quer substituindo toda ou parte da sequência de aminoácidos pré-S2.
- 15, - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 12 ou 13, caracterizado pelo facto de, no essencial, se ter submetido a sequência de aminoácidos pré-S2
das partículas recuperadas a uma delecção. 16.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 12 a 15, caracterizado por as partículas recuperadas possuírem uma actividade imunogénica que lhes permite induzir in vivo a produção de anticorpos protectores contra um retrovírus da classe dos retrovírus HIV patogénicos para o homem. - 17,- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 12 a 16, caracterizado pelo facto de no-58essencial as partículas recuperadas terem perdido a faculdade de induzir in vivo a produção de anticorpos neutralizantes face ao vírus da hepatite B.
- 18.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 12 a 17, caracterizado pelo facto de se escolher a sequência de aminoácidos imunogénica inserida das partículas recuperadas entre as sequências indicadas a seguir:X! CHIRQIINTWHKVGKNVYLPPREGDLTC Z1X2 CHIKQIINTWHKVGRNVYLPPREGELSC Z2X3 CRIKQFINMWQEVGKAMYAPPISGQIRC Z3 em que os pares X]_, Z3, X2, Z2 e X3, Z3 representam quer grupos COOH ou NH2 quer sequências de aminoácidos compreendendo normalmente, respectivamente associadas às partes centrais correspondentes sequências indicadas antes nas glicoproteínas dos retrovírus SIV, HIV-2, HIV-1 que normalmente as contêm.
- 19.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 12 a 18, caracterizado pelo facto de se escolher a sequência de aminoácidos imunogénica das partículas recuperadas entre as sequências indicadas a seguir:-59RGEFLYCKMNWFLNWVEDRSLTTQKPKERHKRNYVPCHIRQIINTWHKVGKNVYLPPREGDLTCNSTVTSLIANINWTDGRGEFLYCNMTWFLNWIENKTHRNYAPCHIKQIINTWHKVGRNVYLPPREGELSCNSTVTSIIANIDWQNNGGEFFYCNSTQLFNSTWFNSTWSTEGSNNTEGSDTITLPCRIKQFINMWQEVGKAMYAPPISGQIRCSSNITGLLLTRDGGNN
- 20. - Processo para a obtenção de um hospedeiro celular recombinante de origem eucariota, caracterizado pelo facto de se transformar um hospedeiro celular com um vector recombinante obtido por um processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 11, sendo o hospedeiro celular transformado apto, quando em cultura, para excretar partículas obtidas por um processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 12 a 19.
- 21. - Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo facto de o hospedeiro transformado ser uma célula de mamífero.
- 22. - Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo facto de o hospedeiro transformado ser uma levedura.
- 23. - Processo para a preparação de fragmentos imunogénicos que podem estar contidos em partículas-60cj /recombinantes obtidas pelo processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo facto:- de se condensar, dois-a-dois, aminoácidos sucessivos na ordem requerida, ou de se condensar aminoacilos e fragmentos formados previamente e contendo já diversos aminoacilos na ordem apropriada, ou ainda diversos fragmentos previamente preparados deste modo, tendo todas as funções reactivas suportadas por estes aminoacilos ou fragmentos sido previamente protegidas, com excepção das funções aminas de um e carboxilos do outro, ou vice-versa, que devem normalmente intervir na formação de ligações peptidicas designadamente depois da activação da função carboxilo;- de se recuperar fragmentos imunogénicos de aminoácidos escolhidos entre os fragmentos indicados a seguir:Χχ CHIRQIINTWHKVGKNVYLPPREGDLTC Ζχ X2 CHIKQIINTWHKVGRNVYLPPREGELSC Z2 X3 CRIKQFINMWQEVGKAMYAPPISGQIRC Z3 em que os pares Χχ, Ζχ, X2, z2 e x3' z3 representam quer grupos COOH ou NH2 quer sequências de aminoácidos compreendendo normalmente, respectivamente associadas às partes centrais correspondentes, sequências indicadas antes nas glicoproteinas dos retrovirus SIV, HIV-2, HIV-1 que normalmente as contêm.
- 24,- Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo facto de os fragmentos recuperados-61compreenderem toda ou parte de um dos encadeamentos indicados a seguir:RGEFLYCKMNWFLNWVEDRSLTTQKPKERHKRNYVPCHIRQIINTWHKVGKNVYLPPREGDLTCNSTVTSLIANINWTDGRGEFLYCNMTWFLNWIENKTHRNYAPCHIKQIINTWHKVGRNVYLPPREGELSCNSTVTSIIANIDWQNN r- GGEFFYCNSTQLFNSTWFNSTWSTEGSNNTEGSDTITLPCRIKQFINMWQEVGKAMYAPPISGQIRCSSNITGLLLTRDGGNN
- 25, - Processo para a preparação de uma composição de vacina destinada à protecção contra uma infecçâo causada por um retrovirus da família HIV, caracterizado pelo facto de se associar como ingrediente activo, partículas recombinantes obtidas por um processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 12 a 19 com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
- 26. - Processo para a preparação de uma composição para o diagnóstico de uma infecçâo devida ao retrovirus HIV para a detecção da presença de anticorpos neutralizantes em um meio biológico colhido em um paciente, caracterizado pelo facto de se misturar partículas recombinantes obtidas por um processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 18 ou 19 com um fragmento imunogénico obtido por um processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 23 ou 24.-6227 .- Processo para o diagnóstico in vitro de uma infecção devida a HIV pela detecção da presença de anticorpos neutralizantes em um meio biológico colhido em um paciente, caracterizado por:- se fazer contactar, em condições apropriadas partículas recombinantes obtidas por um processo de acordo com uma das reivindicações 12 a 19 ou uma composição obtida pelo processo de acordo com a reivindicação 26 com o meio biológico testado,- se detectar a formação de um complexo antigénio-anticorpo.
- 28.- Método de doseamento in vitro da presença de anticorpos dirigidos contra um retrovírus HIV num meio biológico, em particular para o doseamento de anticorpos neutralizantes no seguimento de uma vacinação, caracterizado pelo facto:de se fazer contactar fragmentos imunogénicos de aminoácidos obtidos pelo processo de acordo com uma das reivindicaçõe 23 ou 24, marcados de maneira a permitirem o doseamento ulterior, com o meio biológico a ensaiar, em condições apropriadas para permitir a reacção,- o doseamento dos referidos fragmentos que reagiram com o meio.
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