PT95939A - Processo de producao de particulas de hiv, tornadas recombinantes e nao replicativas, e de vacinas - Google Patents

Description

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MEMÓRIft DESCRITIVA 0 presente pedido é uma continuação em parte do pedido co--pendente N2. de Série 07/439 205, pedido em 20 de Novembro de 1989, aqui incorporada na sua totalidade, apenas para referência.

1. INTRODUÇÃO 0 presente invento refere-se a partículas retrovirais tornadas recombinantes, não-infecciosas, a sistemas in vitro onde tais partículas podem ser criadas e ao seu uso como agentes anti-virais e como imunogénios para a profilaxia e terapia de retrovírus humanos como a do vírus da imunodeficiência humana (HIV). As partículas de HIV tornadas recombinantes do invento incorporam as proteínas do core e do envelope do HIV, correcta-mente processadas, e são morfológica e imunologicamente muito semelhantes ao HIV nativo. No entanto, uma vez que as partículas de HIV tornadas recombinantes do invento não contêm todos os elementos do genoma do HIV necessários para a replicação virai, elas não são infecciosas.

2. ANTECEDENTES DO INVENTO

Foram identificados dois tipos de retrovírus humanos, os vírus da leucemia e os vírus da SIDA ou relacionados com a SIDA. Os alvos principais dos retrovírus humanos são os linfócitos T e as células do sistema nervoso central. Todos os retrovírus humanos são transmitidos por contacto intimo, contaminação pelo sangue, infecçao in utero ou após nascimento pelo leite. É provável que todos os retrovírus humanos tenham a sua origem em África e que tenham encontrado a espécie humana através de infecção inter-espécies, possivelmente dos macacos verdes africanos ou de uma espécie relacionada. Os primeiros retrovírus humanos descobertos, o Vírus Linfotrópico T Humano Tipo 1 (HTLV--I) e o Vírus Linfotrópico T Humano Tipo II (HTLV-II), apresentam um tropismo preferencial para células T4 e para algumas células T8, partilham uma homologia de sequência significativa e estão associados principalmente a linfornas e leucemia de células T. 0 outro grupo de retrovírus humanos, geralmente chamado Vírus da

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Imunodeficiência Humana (HIV), é discutido abaixo em maior detalhe. Há duas diferenças principais entre os dois tipos de retrovirais humanos: (l) há uma variabilidade genómica substancial entre os vários HIV isolados, enquanto que os genomas do HTLV-I e HTLV-II são estáveis; e (2) o HIV alcançou a população humana muito mais recentemente do que o HTLV-I e HTLV-II.

2.1. 0 VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA E ft SIDA 0 virus da imunodeficiência humana (HIV) é um retrovírus citopático e é o agente causador do sindroma de imunodeficiência adquirida (SIDft). Identificaram-se até agora duas formas de HIV. 0 virus protótipo HIV-1, anteriormente designado por virus associado à linfadenopatia (LAV) e virus linfotrópico T humano Tipo III (HTLV-III), é responsável pela grande maioria dos casos de SIDft registados em todo o mundo. 0 outro retrovírus, HIV-2, foi isolado principalmente de pacientes da África Ocidental com SIDA e está relacionado patogenicamente com o HIV-1. Ao nível genético, o HIV-2 está de facto mais intimamente relacionado com o vírus da imunodeficiência dos símios (SIV), um retrovírus que infecta macacos.

Até 31 de Maio de 1989, foram registados, só nos E.U.A., mais de 97 000 casos de SIDA e metade dessas pessoas já morreram. Cerca de 3 milhões de pessoas neste pais podem ser portadores assintomáticos de HIV e capazes de transmitir o virus. Estima--se que venham a ocorrer 270 000 casos de SIDA nos Estados Unidos até 1991 (U.S. Public Health Service, 1986, Public Health Rep. 101=341). A taxa de mortalidade da SIDA é perturbadoramente elevada, excedendo os 80% dentro de três anos a partir do diagnóstico e alcançando, possivelmente, os 100% para um período maior.

Em todo o mundo, a epidemia da SIDA pode envolver cerca de 5 a 10 milhões de pessoas infectadas actualmente. São particularmente preocupantes as estatísticas do continente africano onde se crê que milhões de indivíduos estejam infectados com HIV, as mortes sejam da ordem das centenas de milhar e onde predomina a transmissão heterossexual. Até à data não há cura conhecida para r 71 852 5624-148-118 a SIDA nem uma vacina eficaz d

contra a infecção pelo HIV. 'ST^SSPS*

J 2.2. PATQQÉNESE DA INFECÇÃO POR HIV 0 HIV é um membro da família lentivírus citopático, não transformante, de retrovírus. 0 HIV provoca uma doença normalmente fatal, caracterizada por doença neurodegenerativa ou imunodeficiência grave ou ambas. A base principal da imunossu-pressão induzida pelo HIV é a deplecção do subconjunto auxiliador /indutor dos linfõcitos T que expressam a molécula de CD4 (células T4 ou CD4+), que serve de receptor da superfície celular de elevada afinidade para o vírus. Os linfõcitos T4 estão implicados directa ou indirectamente na indução de quase todas as funções imunológicas do corpo e a sua deplecção tem como resultado a susceptibilidade a uma vasta gama de infecções oportunistas e neoplasmas.

Além dos linfõcitos T4, outras células que expressam a molécula CD4 são alvo da infecção pelo HIV, especialmente os monócitos-macrõfagos e certos neurónios e células gliais do cérebro. A infecção pelo HIV também tem como resultado graves anormalidades das células B incluindo a activação policlonal, a hipergamaglobulinemia , elevados níveis de imunocomplexos circulantes e auto-anticorpos. Nos pacientes de SIDA também se observou um reduzido número de células assasinas naturais (NK), funcionais.

J A infecção de células CD4+ é iniciada pela interacção da molécula CD4 com a glicoproteina principal do envelope do HIV, gp 120, acontecimento que é seguido do internamente e des--revestimento do virião, transcrição do ARN genómico em ADN pela transcriptase inversa codificada pelo vírus e integração do ADN pró-viral, resultante,no ADN cromossomal da célula hospedeira. 0 ADN pró-viral não integrado também se acumula em grandes quantidades nas células infectadas e é, provavelmente, um factor significativo na citopaticidade do HIV (Shaw et al., 1984, Science 226=1165). Durante a replicação, os transcriptos do ARNm do ADN pró-viral integrado são traduzidos nas proteínas do HIV. Estas proteínas são, então, processadas e montadas em conjunto -5- 71 852 5624-148-118 com o ARN genómico do HIV. Os viriões maduros emergem ("bud") da superfície dos linfocitos T infectados e imergem no interior de macrófagos, incorporando os lípidos da membrana da célula hospedeira formando o envelope do virião.

Ainda que o HIV possa permanecer adormecido durante algum tempo após infecção, quando ocorre a replicação activa do vírus a célula hospedeira CD4+ é usualmente morta. 0 mecanismo preciso pelo qual o HIV exerce o seu efeito citopático é desconhecido, ainda que tenham sido propostos vários mecanismos (p.ex., a acumulação de grandes quantidades de ADN virai não integrado, nas células infectadas; o aumento da permeabilidade da membrana celular quando emergem grandes quantidades de virus a partir da superfície da célula; especulações de que o HIV possa induzir diferenciação terminal das células T4 infectadas conduzindo a um tempo de vida mais curto). Há uma crescente evidência de que tanto a molécula CD4 como o envelope do virus desempenham um papel no efeito citopático nas células infectadas pelo HIV. Uma característica proeminente na citopatologia da infecção pelo HIV ê a formação de sincicios multinucleados que parecem ser induzidos pelas proteínas do envelope, gpl20/gp41. Em contraste, os macrófagos infectados pelo HIV podem continuar a produzir HIV sem efeitos citopáticos durante longo tempo. É forte a evidência de que os monócitos e os macrófagos desempenham um papel importante na patogénese da infecção pelo HIV. Além de englobarem o virus por fagocitose alguns subconjuntos de monócitos-macrófagos expressam o antigénio de superfície CD4 e são portanto capazes de ligarem ao envelope do HIV. 0 monócito-macrófago é o tipo principal de célula infectada no cérebro e está implicado no desenvolvimento de manifestações neuropsiquiátricas da infecção pelo HIV. Além disso, observam-se habitualmente defeitos funcionais dos monócitos-macrófagos nos pacientes infectados. Estes defeitos podem contribuir para infecções oportunistas, características nos pacientes da SIDA.

De primordial importância é que o HIV pode sobreviver em estado dormente dentro do monócito-macrófago. Os monócitos -6- Γ 71 852 5624-148-118

J infectados não nostram o efeito citolitico que o HIV tem sobre as células T4, talvez devido a uma densidade mais baixa de receptores de superfície da célula CD4. Os monócitos podem portanto servir como reservatórios de HIV que podem por último transportar o vírus até ao cérebro, sistema nervoso central e a vários órgãos do corpo. É provável que o vírus atravesse a barreira sangue/cérebro dentro de monócitos onde afecta a libertação de monoquinas, enzimas e factores quimiotácticos resultando na destruição ou em danos de neurónios e da inflamação do tecido do cérebro (Ho et al-, 1987, N. Engl. J. Med. 311: 278; Fauci, 1988, Science 239: 617). Dos vários síndromas neurológicos imputáveis directamente à infecção pelo HIV, o mais predominante é a encefalite subaguda ou demência da SIDA (quase 90¾ dos pacientes de SIDA), cujas características clínicas incluem a demência, o retardamento psicomotor e alterações do comportamento.

J 2.3. MORFOLOGIA E DIVERSIDADE QENÓMICA DO HIV A estrutura fina do HIV foi determinada por técnicas analíticas imunológicas e de microscopia electrónica (Gelderblom et al., 1988, Micron and Microscopia 19: 41; Gelderblom et al., 1987, Virology 156= 171). Não se detectaram diferenças morfológicas entre as estirpes HIV-1 e HIV-2 (Gelderblom et al., 1988, Micron and Microscopia 19: 41). 0 virião do HIV é uma partícula esférica de cerca de 100 a 120 nm de largo e contém um core tubular, denso aos electrões, compreendendo a proteína gag p24, uma matriz submembrana compreendendo gag pl7 e um envelope compreendendo as proteínas de envelope, gpl20 e gp41, disseminadas na membrana lipidica de 2 camadas. 0 ARN genómico do HIV está alojado no core como parte do complexo de proteínas ribonucleares (PRN) que incorpora moléculas de transcriptase inversa (o enzima que catalisa a transcrição do ARN em ADN pró-viral) e proteínas do core. As proteínas do envelope, gpl20 e gp41, derivadas por cisão proteolítica do precursor gpl60, existem como complexos associados de modo não-covalente, embutidas na membrana. Estes complexos de proteínas do envelope são visualizados como protuberâncias nodosas com uma largura máxima de cerca de 14 nm, 5624-148-118

uma altura de 9-10 nm e parecem dispostas num padrão icosa-édrico com simetria levo T=7. As protuberâncias incluem gpl20 que se encontra frouxamente ligada à sua âncora transnembrana gp41. A gpl20 do envelope é separada espontaneamente,em alto grau, da superfície do vírus, um fenómeno que pode influenciar a patogenicidade do HIV. A maturação da partícula virai tem lugar durante e imediatamente após o processo de emersão. Depois de emergirem da superfície da célula infectada, as proteínas do core do HIV são cindidas , a partir de precursores por uma protease codificada pelo HIV, em proteínas estruturais maduras que se organizam para formar a estrutura do core. 0 genoma do HIV contém 3 genes que codificam os principais componentes estruturais do virião: env (que codifica as proteínas do envelope), gag (que codifica as proteínas do core) e pol (que codifica os enzimas transcriptase inversa, protease e endonu-clease). Estes 3 genes são ladeados por extensões de nucleótidos chamadas "repetições terminais longas" (LTR). As LTR incluem sequências que têm um papel no controlo da expressão dos genes virais. Contudo, ao contrário de outros retrovírus , o genoma do HIV inclui pelo menos seis genes adicionais, três dos quais têm funções reguladoras conhecidas. Pensa-se que a expressão destes genes reguladores tem impacto sobre a patogénese do HIV. 0 gene tat codifica uma proteína que funciona como um transactivador potente da expressão dos genes do HIV e, portanto, desempenha um papel importante na amplificação da replicação virai. 0 produto de gene rev regula a união e o transporte do ARNm do HIV. Em contraste, o gene nef pode regular no sentido da diminuição a expressão do virus. O gene vif não é absolutamente necessário à formação do virião, mas é critico na criação eficiente de viriões infecciosos e influencia a transmissão do vírus in vitro. 0 gene Vpr codifica uma proteína imunogénica de função desconhecida. Por fim, a recentemente descrita estrutura de leitura aberta Vpu codifica uma proteína implicada na regulação da maturação do vírus e no efeito citopático. Têm sido obtidos muitos isolados diferentes de HIV e determinadas as suas sequências de nucleótidos, que revelam um -8- r 71 852 5624-148-118

J grau surpreendente de diversidade genómica no gene env. As regiões de gene env, caracterizadas por uma significativa divergência, estão disseminadas com domínios conservados entre os diferentes isolados. Presumivelmente, uma destas regiões conservadas é o domínio de ligação da CD4 já que todos os isolados de HIV se ligam ãs moléculas dos receptores da superfície celular de CD4. Têm sido isoladas, a partir de pacientes individuais de SIDA no decurso de uma infecção, variantes relacionadas mas distintas de HIV-1, algumas das quais antigenicamente diversas. Os isolados podem diferir em relação ao seu tropismo para tipos específicos de células. A este respeito, certos isolados parecem replicar-se preferencialmente em células T CD4+ ou em macrófagos derivados do cérebro, o que sugere que a infecção pelo HIV provoca manifestações clinicas diferentes devidas ao mecanismo de patogenicidade selectiva.

2.4. PERSPECTIVAS DE VACINAS

J A abordagem tradicional da produção de vacinas virais envolve o uso de viriões inteiros, em formas vivas atenuadas ou em preparações inactivadas. Estas abordagens têm sido usadas com sucesso contra muitas doenças como varíola, poliomielite, sarampo, papeira, rubéola, etc.. Contudo , a utilidade potencial destas abordagens aplicadas ao desenvolvimento da vacina para o HIV tem sido questionada. Além dos riscos reais associados a inversões e activação insuficiente, esta abordagem tradicional põe ainda o risco teórico de induzir uma doença como a SIDA já que envolve a introdução do genoma retroviral inteiro em indivíduos sãos. Por consequência a maior parte dos esforços para desenvolver uma vacina contra a SIDA tem, até à data, incidido em abordagens recombinantes, na forma de subunidade ou vacinas de vectores virais. 0 estudo de antigénios tendo como alvo o HIV tem sido muito limitado às glicoproteinas do envelope e, em menor extensão, aos antigénios do core. Pouca ou nenhuma informação é conhecida acerca da imunogenicidade dos complexos de glicoproteinas do envelope (isto é, o complexo multimero gpl20-gp41, em oposição à gpl20 ou gpl60 solúveis) ou àcerca dos complexos de antigénios

71 852 5624-148-118 core-envelope, Várias linhas de evidência argumentam que pode ser importante a apresentação do complexo de glicoproteinas do envelope e dos antigénios do core, numa determinada estrutura. Em primeiro lugar, estudos sobre o antigénio superficial da hepatite B indicam que a apresentação desse antigénio como parte da estrutura de uma partícula, é mais eficaz do que o antigénio solúvel (Cabral et al., 1978, J. Gen. Virol. 38:339). Em segundo lugar, as propriedades imunogénicas de um dado epitopo, como o epítopo, neutralizador especifico de grupo, do hexão do adenoví-rus, podem ser dependentes da conformação. Em terceiro lugar, a inclusão de um antigénio do core como imunogénio pode produzir respostas imunitárias largamente reactivas para diferentes isolados de HIV-1, já que os antigénios do core do HIV estão relativamente conservados entre vários isolados. Tem portanto interesse e importância planear e avaliar vacinas que combinem as vantagens tanto da abordagem tradicional como da abordagem por recombi-nantes, isto é, vacinas tornadas recombinantes que conservem as propriedades imunogénicas dos viriões nativos ainda que sem a infecciosidade e outras desvantagens potenciais das preparações do virus inteiro.

Além do seu uso profilático, as vacinas podem também ser úteis para imunoterapia pós-exposição. Por exemplo, as vacinas correntes contra a raiva são dadas a indivíduos após exposição potencial ao vírus da raiva. Tem-se proposto que a imunoterapia pode também ter valor na prevenção do SIDA em indivíduos infectados com HIV, pois que há um grande período de latência entre a infecção e a progressão da doença (Salk, 1987, Nature 327:473-476).

3. SUMÁRIO DO INVENTO 0 presente invento refere-se a partículas retrovirais tornadas recombinantes não-replicativas, a formulações de vacinas compreendendo partículas retrovirais tornadas recombinantes não--replicativas, a processos para preparar partículas retrovirais tornadas recombinantes não-replicativas e ao uso de partículas retrovirais tornadas recombinantes não-replicativas como agentes antivirais. As partículas retrovirais tornadas recombinantes, do invento, compreendem proteínas retrovirais do core e do envelope, 71 852 5624-148-118 -10-

dispostas em estruturas com características imunológicas e morfológicas muito semelhantes ãs dos viriões de retrovírus nativos. A principal diferença estrutural entre partículas retrovirais tornadas recombinantes do invento e as partículas retrovirais nativas, é a ausência de um genoma retroviral completo nas primeiras. Sem um genoma retroviral capaz de dirigir a expressão de, inter alia, vários produtos de gene necessários para a replicação e infecciosidade retroviral, as partículas retrovirais tornadas recombinantes do invento são totalmente não infecciosas e não se podem reproduzir. Como as partículas retrovirais tornadas recombinantes são estruturalmente organizadas como as partículas retrovirais infecciosas, elas são altamente imunogénicas e capazes não somente de produzir uma resposta protectora imunitária contra o retrovírus particular em questão, mas são também eficazes no bloqueamento da infecciosidade do retrovírus. 0 processo do requerente para criar as partículas retrovirais tornadas recombinantes não-replicativas do invento envolve a co-expressão de proteínas estruturais do core e envelope do retrovírus, em células de mamífero hospedeiras capazes de dirigir a sua maturação e apoiando a sua associação em partículas emergentes, dispostas correctamente. A introdução das sequências de nucleótidos que codificam essas proteínas estruturais do core e envelope do retrovírus nas células de mamífero hospedeiras, pode ser conseguida usando diversas técnicas já estabelecidas como, p. ex., a infecção por vectores de vírus vivos e transfecção com vectores de ADN. Além disso, os requerentes crêem que deverá também ser introduzida uma sequência de nucleótidos codificando uma protease retroviral, na célula hospedeira de mamífero, a fim de assegurar o processamento adequado das proteínas retrovirais do core. liais em particular, o presente invento refere-se a partículas de HIV tornadas recombinantes não-replicativas, a vacinas contra o Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), a processos para preparar partículas de HIV tornadas recombinantes não-replicativas e ao uso de partículas de HIV tornadas recombinantes não- 71 852 5624-148-118 -11-

-replicativas para inibir a infecgão pelo HIV e para tratar indivíduos infectados com HIV. Numa concretização particular do invento, aqui descrito para exemplo, usam-se vírus vacinia recombinantes como vectores para introduzir genes gag, da protease e do envelope do Virus da Imunodeficiência Humana em células de mamíferos hospedeiras que dirigem a criação de partículas semelhantes ao HIV-1 que apresentam características imunológicas e morfológicas muito semelhantes às do HIV-1 nativo. Estas partículas de HIV-1 tornadas recombinantes são capazes de bloquear a infecciosidade do HIV vivo in vitro e são altamente imunogénicas in vivo.

4. BREVE DESCRIÇÃO DftS FIGURAS FIG. 1. Análise por radio-imunoprecipitação de proteínas de HIV-1 em células BSC-40 infectadas com vírus vacinia recombinantes. Desenvolveram-se monocamadas de células BSC-40 até à confluência em meio de Eagle Modificado com Dulbecco (DMEM) suplementado com 10¾ de soro de vitelo fetal (FCS). As células foram infectadas com v-env5 (faixas A e B), v-env5+v-gag2 (faixas C e D), v-gag2 (faixas E e F) ou com virus progenitores v-NY (faixas G e H) a uma MOI de 10 PFU/célula de cada virus. Após 12 horas de infecção, as células foram radiomarcadas durante 4 horas com [35s]-metionina e [35s]_CiSteina (100 pCi/ml). 0 meio de cultura foi recolhido e lavaram-se as células com PBS, fez-se a colheita e lisou-se em tampão RIP (1¾ NP40, 0,5¾ desoxicolato, 0,1% SDS em PBS). Os lisados de células pós-nucleares (faixas A, C, E e G) em paralelo com os meios de cultura (faixas B, D, F e H) foram avaliados quanto a proteínas de HIV-1 por RIP com soros anti-HIV-1, policlonais, humanos (Secção 6.1.2. infra), seguindo--se o fraccionamento por SDS-PAGE em matriz de acrilamida a 11,5%. As proteínas radiomarcadas foram visualizadas por auto--radiografia. As marcas de pesos moleculares indicam kilodalton (kD). FIG. 2. Compartimentação na superfície das células das proteínas de envelope do HIV sintetizadas por células BSC-40 infectadas. As células foram infectadas com v-env5 ou co--infectadas com v-env5 e v-gag2, em paralelo com vírus de origem 71 852 5624-148-118 -12-

v-NY a uma MOI de 10 PFU/células para cada vírus. Dezasseis horas após infecção, os meios de cultura foram aspirados e as células lavadas e radiomarcadas com 0,5 mCi [125jj ρΟΓ reacção catalisada por lactoperoxidase (Haffar et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1508). Os lisados de células pós-nucleases foram então avaliados por RIP e SDS-PAGE quanto a proteínas de HIV, como se descreveu na FIG. 1 e na Secção 6.1.2., infra. de FIG. 3. Isolamento de particulas/HIV recombinantes contendo proteínas gag e env de HIV-1. (1) Auto-radiograma: células BSC--40, infectadas como se descreveu na FIG. 2, foram radiomarcadas, 5 h após infecção com [35s]-metionina e [35gj_CiSteina (60 pCi/ml) durante 10 h. G meio de cultura de cada condição de infecção (14 ml) foi recolhido e clarificado de células, por centrifugação a 600 x g durante 10 min. Recolheram-se 2 ml dos sobrenadantes resultantes para avaliação do material inicial (TS). Os restantes 12 ml de cada amostra foram fraccionados num rotor SW 55Ti a 120 000 x g durante 3 h, numa pelota de partículas e um sobrenadante pós-partícuias (S). A pelota foi lavada, ressuspensa em PBS e deitada em camada sobre uma almofada de 2 ml de sacarose a 15¾. 0 material em partículas foi de novo sedimentado por ultracentrifugação num rotor SW 55Ti a 120 000 x g durante 1,5 h. A pelota de partículas resultante (P) foi ressuspensa em tampão de RIP. As fracções P (faixas B, E e H forama avaliadas quanto a proteínas HIV em paralelo com 2 ml (dos 12 ml do total) de fracções S (faixas C, F e I) e com 2 ml de material TS (faixas A, D e G), por RIP como se descreve na Secção 6.1.2. infra. (2) Gráfico: a pelota de partículas da primeira ultracentrifugação de sobrenadante de culturas de BSC-40 duplamente infectadas, foi deitada em camada sobre um gradiente (15%-60%) de densidade contínua de sacarose e sedimentada a 120 000 x g num rotor SW 55Ti durante 1,5 h. As fracções do gradiente foram recolhidas do fundo do gradiente em aliquotas de 200 ul. 0 material recolhido foi dividido ao meio e avaliou-se o seu teor em gag p24 por EIA, como se descreve na Secção 6.1.2., infra. As fracções dos picos de EIA apresentam-se como ng de p24 detectado por fracção recolhida (círculos a cheio) e podem ser c -13- 71 852 #'· 5624-148-118 correlacionadas com a concentração de sacarose (círculos a claro). As fracções que constituem o topo do gradiente (não indicadas) não continham qualquer p24, o que foi confirmado por análise de mancha Western. FIG. 4. Análise de partículas construídas de HIV-1, recombi-nantes por microscopia electrónica de secção fina e por imuno-microscopia electrónica. Células intactas BSC-40 co-infectadas com v-env5 e v-gag2 (M0I=10 PFU/célula para cada vírus), em pparalelo com a pelota de partículas sedimentada a partir de sobrenadantes de culturas (FIG. 3), foram fixadas durante 20 minutos em paraformaldeido a 4¾. As amostras foram então lavadas e bloqueadas com 0,8¾ de albumina de soro bovino, 0,1¾ de gelatina a 5¾ de soro normal de cabra, em PBS. Juntaram-se às várias amostras, como se indica, os MAb 110-4 ou 41-1 (Secção 6.1.2. infra’) como fluido ascitico (1:2000 em tampão de bloqueio). Após 3,5 h, lavaram-se as amostras com PBS, incubaram-se com IgG de cabra, anti-ratinho, conjugado com ouro e prepararam--se para análise EM seguindo os processos delineados na Secção 6.1.3., infra. FIG. 5. Teor em ácidos nucleicos de partículas HIV-1 tornadas recombinantes, determinado por ensaio de hibridação em mancha pontual ("dor blot hybridization"), como se descreve na Secção 6.2.4. infra. Painel A: sonda especifica para gag. Painel B: sonda especifica para env. As concentrações de partículas HIV-1 tornadas recombinantes e de viriões inactivados de HIV foram determinadas em equivalentes a ng de p24. (Vírus inactivado: faixa 1, 2600 ng p24; faixa 2, 260 ng p24; faixa 3, de 26 ng p24í faixa 4, 2,6 ng p24; partículas / HIV tornadas recombinantes: faixa 1, 300 ng p24). Painel C: desenho de linhas indicando as coordenadas do gene gag-pol (258-3317) e do gene env (5671-8572) usados na preparação dos vírus vacínia recombinantes v-gag2 e v-env5, respectivamente. A seta indica a posição da sequência de empacotamento de ARN (300-319) localizado a montante do gene gag-pol (Lever et al., 1989, J. Virol. 63:4085-4087). 71 852 5624-148-118

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FIG. 6. Representação esquemática da construção do plasmideo pv-G2E5 FIG. 7. Mancha Western de Células Infectadas com Vírus Vacínia Recombinante. As células BSC-40 foram infectadas a uma MOI de 5 pfu/célula e recolhidas para PAGE às 24 h após infecção. Os lisados de células infectadas foram submetidos a electroforese em gel de acrilamida a 7-15¾ e electro-transferidas para nitrocelulose. Fizeram-se reagir imuno-manchas com Soro Humano HIV + (Trimar) e depois com IgG de cabra, anti-humana, conjugada com peroxidase. As manchas foram visualizadas usando 2-cloro--naftol como substrato. As faixas de gel receberam as cargas indicadas. FIG. 8. Análise por radioimunoprecipitação de partículas de HIV-1 tornadas recombinantes, produzidas por células BSC-40 infectadas com V-G2E5. FIG. 9. Diagramas esquemáticos de construções de vectores de plasmideo descritas na Secção 8.1., infra, A: CmHIVdelXmn(1133-al) e CmHIVdelKpuAvr(Gag2TRE)(1160-al). B: CmHiGag2hre(1158-al) e CmvGag2hre(1159-al). C: CmHiEnv5(1104-bl) e CmHiTgfbEnv5(1113-al). D: BsMkTat(1103-l), BsMtRev(1102-2), CmHiRev(1132-cl) e

CmvRev(1152-al).

FIG. 10. Imunorreactividade de partículas de HIV-1 tornadas recombinantes produzidas em células CHO transfectadas. Recolheram-se partículas de HIV tornadas recombinantes de um meio de cultura de células 3010-C6, concentradas por centrifugação a alta velocidade e fraccionadas em bandas num gradiente de 15 a 60¾ de sacarose. No topo: as fracções do gradiente foram analisadas quanto ao seu teor em proteína Gag por EIA de antigénio de Gag e quanto ã sua densidade em sacarose usando um refractómetro. No fundo: alíquotas das fracções escolhidas (indicadas no painel do topo com *) foram analisadas por electroforese sobre gel de poliacrilamida com fracções escolhidas em gradiente de 7 a 15¾ e por electro-transferência para um filtro de nitrocelulose que foi sondado com soro de um paciente humano com SIDA e com Proteína A -15- 71 852 & 5624-148-118 marcada por 125j_ Também foram carregadas uma alíquota de partículas não fraccionadas e vírus HIV isolado. FIG. 11. Análise de antigénios específicos para HIV expressos em células HeLa transfectadas com vectores plasmidicos codificando os genes env, tat e rev do HIV-1. As células HeLa foram co-transfectadas com CmHiTgfbEnv5 (em cada faixa) rnais os plasmídeos tat e rev indicados acima de cada faixa ("Bs" é um plasmídeo de controlo composto do vector "Bluescribe plus" sem sequências de codificação inseridas). Juntou-se zinco ãs culturas, o que se indica por "+Zn", 24 h antes de se colherem as amostras. Os lisados celulares totais foram analisados por electroforese em gel de poliacrilamida a 10¾ e por electro-trans-ferência para um filtro de nitrocelulose que foi sondado com anticorpo monoclonal 110-4 marcado com Também foi carregada uma alíquota de células BSC-40 infectadas com v-env5 do virus vacinia. FIG. 12. Mancha Western de Células Infectadas com Vírus Vacinia Recombinante. Infectaram-se células BSC-40 a uma MOI de 10 pfu/célula e, 23 h após infecção, recolheram-se para PAGE. As células infectadas lisadas foram submetidas a electroforese em gel de acrilamida a 8,5¾ e electro-transferidas para nitrocelulose. Fizeram-se reagir as imuno-manchas com Soro Humano HIV + (Trimar) e depois com IgG, de cabra, anti-humana, conjugada com peroxidase. As manchas foram visualizadas usando 2-cloro-naftol como substrato. As faixas de gel foram carregadas como indicado. FIG. 13. Análise da infecciosidade de células linfoblas-toides T com partículas de HIV-1 tornadas recombinantes. Incubaram-se células linfoblastoides T (CEM) com partículas de HIV-1 tornadas recombinantes (correspondendo a 3 ng p24 gag) ou com virus HIV (correspondendo a 5 pg p24 gag), como se descreve na Secção 7.1., infra. Cinco dias após infecção recolheram-se amostras de células de cada alvéolo e analisaram-se quanto a antigénios de HIV intracelulares por imunofluorescência indirec-ta, como se descreve na Secção 7.1., infra. Usou-se corante azul de Evans (mancha vermelha) para facilitar a localização das -16- -16- ~zr#gm 71 852 5624-148-118 células. Painel ft: células CEM incubadas com partículas de HIV-1 tornadas recombinantes. Painel células CEM incubadas com vírus HIV, mostrando fluorescência positiva. Painel C: sincicio de células CEM incubadas com vírus HIV. FIG. 14. Títulos relativos de anticorpos em amostras de soro colhidas em coelhos brancos da Nova Zelândia imunizados com (A) partículas de HIV-1 tornadas recombinantes, e (B) com HIV-1 inactivado com psoralen, determinados por ELISA. Os detalhes do ensaio estão estabelecidos na Secção 14.1, infra. FIG. 15. Resposta imunitária humoral em animais imunizados. Os coelhos brancos da Nova Zelândia foram imunizados com partículas de HIV-1 tornadas recombinantes (R#238 e R#241) e com viriões HIV-1 inactivados (R#239 e R#243). A diferentes intervalos após as primeiras imunizações, colheram-se amostras de soro e testaram-se em relação a anticorpos específicos do HIV-1, por ELISA, em virus completos rotos (painéis A e B) ou em gpl20 purificada (painéis C e D). Os resultados apresentados (ordenadas) são os títulos, no ponto final, dos anticorpos específicos de HIV-1, calculados a 2 vezes os títulos no soro pré-imunitário. Os valores das abcissas representam o escalonamento no tempo em semanas após as primeiras imunizações, quando se colheram as amostras de soro. As setas indicam as alturas das segundas (semana 4 R#241 e 243, semana 5 R#238 e 239) e terceiras (semana 18 R#241), semana 33 R#238) imunizações. FIG. 16. Neutralização da infectividade do HIV-1 de células CEM com o soro de coelho. Testaram-se quanto à actividade de neutralização especifica do HIV-1, amostras escolhidas de soro de coelhos imunizados (painel A R#238 e R#241, painel B R#239 e R#243). 0 vírus homólogo (isolado BRU) foi pré-incubado com os soros adequados durante 45 min, a 37°C, antes da adição às células. Após 1 h, a 37°C, os virus e os soros foram retirados das células e substituídos por diluições apropriadas de soros em meio de cultura. A neutralização foi determinada medindo, com o uso de uma EIA, a redução na proteína gagp24 libertada pelas células. Os títulos de neutralização verificados (ordenadas) -17- 71 852 5624-148-118 _ **. ~·ψ< 5S» ίό" foram para 75¾ de redução nos níveis de p24 no meio de cultura. Os valores em abcissa são os descritos na descrição da FIG. 15. FIG. 17. Reactividade de anticorpos com proteínas virais individuais, determinada por análise de mancha Western. Os detalhes do processo experimental usado e a discussão dos resultados estão apresentados na Secção 14.2.4., infra. FIG. 18. Micrografias de varrimento por Laser Confocal de células HeLa transfectadas com gene CD4 incubadas com partículas de HIV-1 tornadas recombinantes e depois com anticorpos específicos de HIV. Os detalhes do processo estão estabelecidos na Secção 15.1., infra.

5. DESCRIÇÃO DETftLHflDft DO INVENTO 0 presente invento refere-se a partículas retrovirais tornadas recombinantes não replicativas que se assemelham muito a viriões de retrovirus vivos nas suas caracteristicas imunológi-cas, estruturais e morfológicas. 0 processo do invento é aplicável à construção de partículas tornadas recombinantes que se assemelham a quaisquer retrovirus humanos (p. ex., HTLV-I, HTLV-II, HIV—1, HIV-2).

Um dos aspectos particulares do invento refere-se a partículas de HIV tornadas recombinantes. As partículas de HIV tornadas recombinantes, como o HIV nativo, são compostas de proteínas do core e do envelope do HIV correctamente processadas e construídas, que retêm a imunorreactividade aos soros anti-HIV. As partículas de HIV tornadas recombinantes não contêm, contudo, genoma HIV e são portanto não replicativas. 0 processo do invento é ilustrado por exemplos em que se usa um novo sistema in vitro para criar partículas de HIV-1 tornadas recombinantes, apresentando, nas suas superfícies, complexos de proteínas gpl20/gp41 do envelope. 0 perito na arte compreenderá que o presente invento engloba numerosas concretizações e quaisquer concretizações que caiam no âmbito das reivindicações anexas, não descritas ou ilustradas especificamente aqui, estão dentro do âmbito do invento. Várias caracteristicas do presente invento distinguem-no 71 852 5624-148-118

-18-como uma nova abordagem para obtenção de uma vacina para a SIDA. Em primeiro lugar, as partículas de HIV tornadas recombinantes assemelham-se muito a viriões autênticos de HIV tanto na morfologia como nas propriedades antigénicas. Quando usado como um imunogénio, estas partículas apresentam antigénios dum modo semelhante à apresentação de antigénios durante a infecção por HIV, originando, por isso, respostas imunitárias que são altamente relevantes e potencialmente protectoras contra a infecção natural. Esta característica do invento não pode ser conseguida por nenhuma vacina de subunidade recombinante descrita até à data. Em segundo lugar, a abordagem do invento, sendo baseada em técnicas de ADN recombinante, proporciona flexibilidade para incorporar antigénios de diversos isolados de HIV-1 e HIV-2, criando portanto respostas imunitárias de reacção cruzada consideradas essenciais para uma vacina eficaz contra a SIDA. As técnicas de ADN recombinante podem, também, ser usadas para fazer a delecção ou modificar epitopos potencialmente perigosos que contribuam para qualquer aumento da infectividade ou patogenicidade do vírus. Em terceiro lugar, as partículas de HIV tornadas recombinantes aqui descritas não são infecciosas e não contêm o genoma completo do HIV. A imunização com estas partículas não introduz, portanto, o risco de infecção potencialmente associado com as vacinas de vírus inteiros inactivados ou atenuados. Estas e outras caracteristicas do presente invento serão melhor explicadas nas secções e subsecções seguintes.

As partículas de HIV tornadas recombinantes do invento podem, também, ser úteis como melhoradores imunológicos específicos para evitar a progressão da SIDA em indivíduos já infectados com HIV, por reforço da reacção imunitária contra o vírus. Esta concretização do invento visa potenciar e manter os factores imunoprotectores já induzidos no indivíduo sero-positivo. Uma abordagem semelhante está a ser trabalhada pelo Dr. Jonas Salk usando preparações de HIV morto, esgotadas em envelope.

Outros usos das partículas de HIV tornados recombinantes contemplados pelo invento incluem o seu uso como agentes anti--virais que interferem com a infecção pelo HIV, o seu uso na 71 852 5624-148-118

-19-criação de anticorpos monoclonais contra os antigénios das proteínas do core e do envelope do HIV, o seu uso no desenvolvimento de anticorpos anti-idiotípicos e o seu uso na elucidação do processo de encapsidação do HIV. As partículas de HIV-1 tornadas recombinantes do invento mostram efeito antiviral (Secções 12 e 13, infra) e produzem respostas imunitárias humoral e celular especificas do HIV tanto em coelhos como em símios do género macaca imunizados com as partículas (Secções 14 e 16, respectiva-mente).

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J 5.1. PRODUÇÃO DE PARTÍCULAS DE HIV TORNADAS RECOMBINANTES NÃO REPLICATIVAS. ÚTEIS COMO VACINAS CONTRA 0 VÍRUS DA IHUNODEFICIÊNCIA HUMANA 0 processo do requerente para preparar partículas de HIV tornadas recombinantes envolve a co-expressão das proteínas estruturais, codificadas por env e codificadas por gag do HIV, em células de mamíferos. As células hospedeiras de cultura, escolhidas, devem ser capazes de sintetizar e de processar correctamente as proteínas do HIV. A introdução dos genes env e gag em células hospedeiras pode ser conseguida usando várias técnicas estabelecidas já conhecidas na arte, incluindo a infecção por vectores de vírus vivos, como os vectores retrovirais e do vírus vacínia e a transfecção usando vectores de ADN. Após a expressão bem sucedida das proteínas do HIV em células hospedeiras, as partículas de HIV tornadas recombinantes podem ser isoladas do meio de cultura usando as técnicas padrão da arte.

Numa concretização específica, descrita adiante em maior detalhe e a título de exemplo na Secção 6, infra, as partículas de HIV tornadas recombinantes são produzidas em células renais do macaco verde africano (BSC-40) co-infactadas com dois virus vacínia recombinantes, transportando um o gene gag completo e o outro o gene env completo do HIV-1. Esta infecção dupla tem como resultado a emersão da superfície das células BSC-40 de partículas de HIV-1 construídas tornadas recombinantes. A análise bioquímica revelou que estas partículas incorporam proteínas gag e env maduras, imunorreactivas. A morfologia das partículas tornadas recombinantes, tornada visível por microscopia electró-

71 852 5624-148-118 -20 nica, é virtualmente a mesma que no HIV vivo.

Numa concretização correlacionada, mostra-se através de exemplos, um sistema alternativo para a produção das partículas retrovirais recombinantes do invento usando vectores virais, no qual se usa um só vírus vacínia recombinante, contendo ambos os genes env e gag do HIV-1, para transfectar células de mamíferos que, depois, produzem partículas de HIV-1 recombinantes (Secção 7, et seq„, infra').

Numa outra concretização, as partículas retrovirais tornadas recombinantes podem ser produzidas usando um sistema que envolve células de mamífero transfectadas com ADN que codifica as proteínas estruturais retrovirais. Como exemplo desta concretização, descrito em maior detalhe na Secção 8 et seq. infra, usam-se dois vectores plasmídicos codificando respectivamente os genes gag do HIV-1 e env do HIV-1 para transfectar células CHO que, depois, dirigem a síntese de antigénios gag e env do HIV-1 construídos em partículas HIV-1 tornadas recombinantes. Outras estratégias, ligadas a esta concretização, incluem, mas não lhes estão limitadas, a transfecção com vectores plasmídicos complexos contendo múltiplos genes de HIV, o uso de elementos intensifica-dores/promotores, constitutivos e reguláveis, para fazer a expressão dos genes do HIV, a expressão de proteínas reguladoras do HIV, em conjunção e para controlar a expressão dos genes estruturais do HIV, o uso de diferentes linhas de células e o uso de vectores plasmídicos que codificam proteínas modificadas do HIV.

Outras estratégias para a expressão das proteínas estruturais do HIV e produção de partículas de HIV tornadas recombinantes, estão descritas, p. ex., nas Secções 8.3., 9., et seq., e 10, et seq., infra.

Estão disponíveis várias opções para uso dos sistemas do presente invento, que permitem controlar a natureza das partículas resultantes. Estas opções podem ser tomadas tanto na fase da construção do vírus como na da infecção.

71 852 5624-148-118 -21-

5.1.1. PREPARAÇÃO DE VECTORES VIRAIS E DE ADN RECOMBINANTES

Os vectores de ADN recombinante e os vectores virais como os vírus vacínia podem ser construídos de acordo com os processos expostos nos pedidos de patente dos Estados Unidos, co-pendentes, N2. de série 779 909 depositado em 25 de Setembro de 1985; N2. de Série 842 984 depositado em 27 de Março de 1986 e N?. de série 905 217 depositado em 9 de Setembro de 1986, cada um deles aqui incorporado inteiramente, para referência.

Numa concretização particular do invento, são construídos e usados como vectores os virus vacínia recombinantes com as sequências env e gag de HIV. Resumidamente, os vectores plasmidi-cos contendo sequências de codificação das proteínas do core e do envelope do HIV são construídos sob o controlo de transcrição do promotor do vacínia e são usados para afectar a integração das sequências dos genes do HIV no genoma do virus vacínia por recombinação in vivo. Os virus vacínia recombinantes são identificados, purificados e avaliados quanto à sua capacidade para dirigir a síntese de proteínas do HIV em células infectadas, como se descreve nos pedidos de patente co-pendentes acima referenciados.

Numa outra concretização, constroem-se vectores plasmidicos recombinantes que codificam várias combinações de genes estruturais e/ou reguladores do HIV, que se usam para transfectar células capazes de produzirem partículas de HIV tornadas recombinantes. As construções de uma gama representativa destes vactores estão descritas na Secção 8., et seq., infra. A natureza precisa dos componentes de cada proteína das partículas tornadas recombinantes do invento pode ser modificada por técnicas de ADN recombinante, durante a construção dos vectores de ADN recombinante, dos vectores do virus vacínia recombinante, etc.. Deste modo, a existência e a composição estrutural dos epítopos retrovirais sobre as partículas, podem ser definidas. Por exemplo, epitopos variáveis de gpl20 do HIV de diferentes isolados de HIV podem ser incluídos para criar uma resposta imunitária de reacção cruzada. De modo semelhante, podem

ν.:Ί =asa> 71 852 5624-148-118 -22-ser incorporadas sequências diferentes do gene gag do HIV, em vectores recombinantes para fazer variar a imunogenicidade de partículas de HIV tornadas recombinantes. Os vectores que codificam sequências de genes de HIV com mutações, podem também ser úteis na criação de partículas de HIV tornadas recombinantes, as quais podem resultar melhoradas na sua imunogenicidade, efeito anti-viral, etc.. Os requerentes pretendem que as partículas retrovirais tornadas recombinantes e que incorporem estas proteínas modificadas do core e/ou do envelope, estejam dentro do âmbito do presente invento e das reivindicações anexas.

5.1.2. INFECÇÃO/TRANSFECÇÃQ DE CÉLULAS HOSPEDEIRAS COM VECTORES RECOMBINANTES PARft CRIAR PARTÍCULAS RETRQVIRftIS

TORNADAS RECOMBINANTES A natureza das partículas retrovirais tornadas recombinantes é controlada em grande parte não só pela composição dos vectores recombinantes usados mas também pela combinação dos vectores usados no processo de infecção ou de transfecção, sendo esta escolha a principal variável na totalidade do processo do invento. Como simples ilustração, os requerentes verificaram que infectando células hospedeiras BSC-40 com uma única estirpe de vacinia recombinante portadora do gene gag do HIV-1 (v-gag2) se obteve a formação de proteínas do core do HIV-1 dispostas em partículas. Contudo, quando estas mesmas células foram co--infectadas com v-gag2 bem como com um vacinia recombinante portador do gene env do HIV-1 (v-env5), as partículas construídas resultantes incorporavam e apresentavam nas suas superfícies proteínas do envelope do HIV-1 (Secção 6., infra). Assim, enquanto se forma uma partícula apenas composta de proteínas do core, após infecção com v-gag2, a adição de v-env5 ao sistema de infecção tem como resultado partículas de maior complexidade estutural que incorporam proteínas do envelope. Levando mais avante a referida ilustração, seria de esperar que a co-infecção de células hospedeiras com v-gag2, v-env5 e um terceiro vacinia recombinante portador do gene env do HIV-2, resultasse na formação de partículas heterólogas incorporando proteínas do core do HIV-1 bem como as proteínas do envelope tanto do HIV-1 -23- -23- c 71 852 5624-148-118 como do HIV-2. Em alternativa, podem usar-se como vectores de infecção, vírus de vacínia recombinante simples que codificam genes múltiplos de HIV. Como se mostra por meio de exemplo na

Secção 7, et seq., infra, as células hospedeiras infectadas com de um destes vectores de vírus vacínia também criam partículas/HIV-1 tornadas recombinantes, imunorreactivas.

Aplicam-se os mesmos princípios ã produção de partículas tornadas recombinantes usando outros sistemas de vectores, tais como o uso de vectores plasmídicos para transfectar células hospedeiras. Por exemplo, podem transfectar-se células hospedeiras com um único vector plasmídico que codifica env e gag do HIV, ou um vector que codifica env, gag e outros genes do HIV, etc.. As células podem, também, ser transfectadas com muitos vectores plasmídicos, codificando, cada um, um gene HIV diferente ou uma combinação de genes HIV. As linhas de células transfectadas podem, ainda, ser transfectadas com vectores construídos para adicionarem a expressão de outros genes do HIV no sistema de produção de partículas. Os vectores que codificam promotores reguláveis podem ser usados para modular a expressão de proteínas do HIV em células hospedeiras transfectadas (ver p. ex. a Secção 8.3.2., infra). Os vectores que codificam outros genes do HIV podem ser usados para afectar a sua expressão juntamente com a expressão dos genes estruturais do HIV em células transfectadas. A expressão destas proteínas reguladoras e/ou acessórias do HIV no sistema pode ser usada como meio para alterar as característi-cas das partículas e/ou os seus níveis de produção. É importante notar que as partículas não se formarão na ausência de proteínas gag, pelo que é necessária a inclusão de sequências essenciais de genes de proteínas do core do HIV no vector recombinante. Ainda que não seja necessária a protease do HIV para a construção das partículas do core, o seu papel na formação do virião infeccioso tem sido referido (Peng et al., 1989, Virology 63: 2550). Pode, por isso, ser vantajoso incluir a função protease do HIV na produção de partículas de HIV tornadas recombinantes de modo a que se assemelhem intimamente a viriões nativos. Além disto, os genes gag de HIV-1, HIV-2 ou de 71 852 5624-148-118

-24-diferentes isolados seus, podem ser usados para construir vectores recombinantes. Como é evidente para o perito na arte, a abordagem de infecção múltipla acima descrita e outras abordagens semelhantes usando outros vectores recombinantes, podem ser usadas para produzir partículas de HIV recombinantes com uma larga gama de características antigénicas da superfície e do core. É praticamente ilimitado o numero das diferentes combinações. 0 tipo de células hospedeiras escolhido também influenciará a natureza das partículas produzidas pelo processo do invento. As células deveriam ser escolhidas pela sua capacidade para expressar e processar correctamente as proteínas do HIV maduro. Uma vez que as proteínas do envelope do HIV, gpl20 e gp41, são glicosadas e derivam, por cisão proteolítica, de um precursor maior gpl60, é desejável uma célula capaz de dirigir estas modificações do processo pós-tradução. É claro que, quando se empregam vectores virais recombinantes, a célula hospedeira deve ser susceptivel à infecção com o vírus recombinante. Em concretizações preferidas do invento usam-se células hospedeiras com origem em humanos, em simios ou em roedores.

As células hospedeiras podem ser infectadas pelo virus vacínia recombinante, de acordo com as condições descritas na Secção 6., infra, ou transfectadas por vectores de plasmideo recombinantes como se descreve na Secção 8., et seq., infra. Quando se utiliza um sistema de vector vacínia recombinante, como é descrito na Secção 6., et seq.. infra, as células podem ser infectadas a uma multiplicidade de infecção (MOI) de cerca de 10 PFU por célula de cada virus vacínia recombinante. Contudo, o perito na arte compreenderá que o aumento ou redução da MOI, para um ou mais vacínia recombinantes, pode ser usado para influenciar a natureza das partículas resultantes. Isto seria um factor importante para a concepção e produção de partículas politróficas ou heterólogas. Por exemplo, pode conseguir-se uma proporção desejada entre antigénios do envelope de HIV-1 e HIV-2, sobre a superfície de uma partícula heteróloga, infectando com uma MOI proporcionalmente correspondente. 71 852 5624-148-118

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Numa concretização especifica do invento, descrita em detalhe na Secção 6., infra, usaram-se vírus vacínia recombinantes v-env5 e v-gag2 para co-infeetar células renais do macaco verde africano BSC-40. fts células BSC-40 infectadas sintetizaram as proteínas gpl20, gp41 de envelope, e o precursor gpl60 do HIV-1, bem como proteínas gag p24, pl7, pl5, p55, p45 e p39 do HIV-1. Além disso, pelo menos as p24, pl7, gpl20 e gp41 constroiem partículas que são imunorreactivas para soros anti--HIV-1 policlonais e para os anticorpos monoclonais específicos de pl7, p24, gpl20 e gp41. A análise ultra-estrutural das partículas de HIV-1 tornadas recombinantes, por microscopia electrónica de secção fina e por imunomarcação com ouro, revelou uma identidade morfológica substancial com o HIV nativo. Sob este aspecto, as partículas de HIV-1 tornadas recombinantes foram visuali2adas como objectos esféricos com um diâmetro entre 100 e 120 nrn, e continham um core interior, denso aos electrões, com o formato de bastão ou esférico, dependendo do ângulo de corte. 0 imunoensaio por enzima de captura e a análise por imunomicroscopia electrónica usando anticorpos monoclonais contra p24 e pl7, respectivamente, confirmaram a identidade de estruturas do core do HIV. A análise por imunomicroscopia electrónica usando anticorpos monoclonais específicos para a gpl20 e gp41 do HIV-1 demonstrou que o complexo gpl20/gp41 se dispõe na superfície das partículas de HIV-1 tornadas recombinantes. Foram também visualizadas várias formas de partículas imaturas, consistentes com o decurso da morfogénese do virião do HIV-1. Estas caracte-rísticas são virtualmente paralelas às observadas em análises semelhantes do virião do HIV-1 (comparem-se as micrografias electrónicas indicadas na Fie. 4 com as apresentadas por Gelderblom et al., 1988, Micron and Microscopia 19: 41, e em Gelderblom et al., 1987, J. Virol. 156: 171). Os resultados dos requerentes sugerem que a ultra-estrutura destas partículas de HIV-1 tornadas recombinantes difere da ultra-estrutura do HIV-1 vivo somente por não conter o genoma virai ou o enzima transcriptase inversa.

As partículas de HIV tornadas recombinantes do invento -26- 71 852 & 5624-148-118 podem, também, ser produzidas por células transfectadas com vectores plasrnídicos recombinantes que. codifiquem os genes gag e env do HIV e outros genes do HIV. Estão descritos na Secção 8.2., infra várias concretizações específicas deste aspecto do invento. Numa concretização particular, são transfectadas células de Ovário de Hamster Chinês (CHD) com vectores plasrnídicos que codificam os genes gag, env, tat e rev do HIV-1. Obtêm-se linhas de células CHO estáveis expresando e segregando proteínas env e gag, como partículas de HIV-1 tornadas combinantes. Podem obter-se resultados semelhantes usando células HeLa, BSC-40 e Vero, transfectadas com vários plasmídeos ou suas combinações (ver p. ex. Secções 8.3.1., 8.3.2, e 8.3.3., infra).

5.2. IDENTIFICAÇÃO E ISQLfttiENTQ DE PARTÍCULAS TORNADAS RECQMBINftNTES NÃO REPLICftTIVftS CONTENDO PROTEÍNAS IMUNORREACTIVAS DO CORE E DO ENVELOPE

As partículas tornadas recombinantes podem ser identificadas por vários meios imunoquimicos e/ou por visualização por micros-copia electrónica (EM). Podem ser usados métodos de detecção imunoquímica como a radioimunoprecipitação (RIP), imunoensaio por enzima de captura (EIA), análise de mancha Western e semelhantes. A título de exemplo na Secção 6., infra, estão descritos exemplos específicos de como é que estas técnicas podem ser usadas para identificar partículas de HIV tornadas recombinantes. Podem ser usadas várias técnicas EM para identificar e caracterizar partículas de HIV tornadas recombinantes, como a EM de secção fina e a imunomicroscopia electrónica, descritas na Secção 6.1.3., infra. Outras técnicas EM que podem ser usadas são a microscopia electrónica de varrimento (SEM), a microscopia electrónica de réplica superficial e a imunocrio-ultramicrotomia, que provaram todas ser úteis na elucidação da estrutura fina do HIV (Gelderblom et al., 1988, Micron and Microscopia 19: 41).

As partículas tornadas recombinantes podem ser isoladas do meio de cultura das células hospedeiras usando técnicas padrão já bem conhecidas na arte. É importante, contudo, usar métodos de isolamento que minimizam o grau de separação de gpl20, a fim de maximizar a imunogenicidade das partículas HIV tornadas recombi- 71 852 5624-148-118 -27- /

^ " <P nantes.

5.3. DETERMINAÇÃO DA IMUNOGENICIDADE DAS PARTÍCULAS TORNADAS RECOMBINANTES NÃO REPLICATIVAS A imunogenicidade das partículas tornadas recombinantes pode ser determinado controlando a resposta imunitária de animais de teste, após imunização. Os animais de teste podem incluir ratinhos, coelhos, chimpanzés e, eventualmente, seres humanos. Podem considerar-se várias vias de imunização incluindo a oral, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, endovenosa, subcutânea, intranasal, etc.. A resposta imunitária induzida por imunogénios de partículas de HIV tornadas recombinantes pode ser analisada por três vias*- (a) a reactividade dos soros imunitários resultantes a antigénios autênticos de HIV usando técnicas já conhecidas como o ensaio de imunossorção com enzima ligado (ELISA), imunomancha, radioimunoprecipitação, etc., (b) a capacidade dos soros imunitários neutralizarem a infectividade do HIV in vitro (Rubert-Guroff, 1985, Nature 316: 72), e (c) protecção contra a infecção por HIV e/ou atenuação dos sintomas infecciosos em animais imunizados (Francis, 1984, Lancet 2- 1276; Gujdusek, 1985, Lancet 1: 55).

Numa concretização específica, testaram-se as partículas de HIV-1 tornadas recombinantes, isoladas (Secção 6., infra) quanto à imunogenicidade em coelhos (Secção 14, et seq.. infra). Os resultados destas análises indicam que as partículas de HIV-1 tornadas recombinantes são altamente imunogénicas uma vez que as partículas originaram respostas imunitárias, humoral e celular, significativas, específicas, tanto para as proteínas estruturais do envelope como do core do HIV. Além disso, os coelhos imunizados com partículas de HIV-1 tornadas recombinantes produziram anticorpos neutralizadores do HIV-1.

Numa concretização relacionada, a imunogenicidade das partículas de HIV-1 tornadas recombinantes é avaliada em primatas não humanos (Secção 16., et seq.. infra). Mais em particular, imunizam-se símios do género macaca com partículas de HIV-1 tornadas recombinantes juntamente com outros antigénios do HIV-1. 71 852 5624-148-118

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As respostas imunitárias dos sujeitos imunizados podem ser determinadas por vários ensaios, incluindo o ELISA do vir ião inteiro, ELISA de gpl20, imunoensaio focal e ensaio da resposta linfoproliferativa. A titulo de exemplo, descrito na Secção 16., et seq., infra, quando as partículas de HIV-1 tornadas recombinantes são usadas como único imunogénioem imunizações primárias e secundárias elas originam respostas imunitárias humo-rais e celulares especificas do HIV. As partículas de HIV-1 tornadas recombinantes foram particularmente eficazes quando usadas para imunizar animais previamente sensibilizados (“primed'') com um virus vacinia recombinante que codifica antigé-nios env e gag do HIV-1.

5.4. FORMULAÇÕES DE VACINAS

Uma concretização especifica do invento é a formulação de vacinas capazes de provocarem respostas imunitárias que

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-28- contribuam para a prevenção da infecção pelo retrovirus ou para o desenvolvimento de doenças associadas ao retrovirus, como a SIDA. As formulações de vacina usam as partículas retrovirais tornadas recombinantes do invento como imunogénios que, por combinação das principais proteínas retrovirais do core e do envelope, são, por natureza, polivalentes. Em concretizações correlacionadas, as partículas retrovirais tornadas recombinantes podem ser usadas como intensificadores imunológicos específicos que podem ser usados para melhorar a progressão de doenças associadas a retrovirus em pessoas já infectadas com o retrovirus.

5.4.1. VACINAS CONTRA 0 VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA

Uma outra concretização particular do invento envolve formulações de vacinas capazes de provocarem respostas imunitárias que contribuam para a prevenção da infecção pelo HIV ou do desenvolvimento da SIDA. Estas formulações de vacinas utilizam partículas de HIV tornadas recombinantes, como imunogénios.

Tradicionalmente, as vacinas virais têm sido preparadas a partir de viriões inteiros atenuados ou inactivados. Nenhuma destas abordagens favoreceu a produção de uma vacina contra o HIV-1 principalmente devido aos perigos associados à preparação

71 852 5624 148-118 em larga escala do vírus, à activação potencialmente incompleta e à introdução do genoma do HIV em sujeitos receptores saudáveis (Minor, 1989, J. Antimicrobial Chemotherapy 23, Supp, A: 55). 0 desenvolvimento da vacina de HIV tem portanto incidido em candidatos de subunidades de vacina. Ainda que a atenção inicial se tenha dirigido para uma formulação de subunidades compreendendo a proteína gpl20 do envelope, recombinante, é agora evidente que a gpl20 e a gp41 são os antigénios alvo para o desenvolvimento de anticorpos neutralizadores (Chahn et al., 1986, EMBO J. 5: 3065; Ho et al., 1987, J. Virol. 61= 2024;

Skinner et al., 1988, J. Virol. 62: 4195), para a mediação da citotoxicidade celular dos anticorpos (Tyler et al., 1989, Fifht International Conference on AIDS, Abstract T.C.O. 33: 521), e para conferir susceptibilidade á morte do linfócito T citotóxico (Zarling et al., 1987, J. Immunol. 139: 988). Estes resultados argumentam no sentido da inclusão da gpl20 e da gp41 no planeamento de uma vacina de HIV-1. A associação da gp41 com as membranas das células, juntamente com a sua fraca interacção não covalente com a gpl20, tornam impraticável a purificação de complexos intactos, solúveis, gpl20/gp41. Ainda mais importante, os complexos gpl20/gp41 ligados a membranas, tal como outros antigénios virais presentes como componentes das estruturas da membrana, como o antigénio superficial da Hepatite B (Cabral et al., 1978, J. Gen. Virol. 38= 339) e a glicoproteina do Virus Herpes Simplex (Ho et al., 1989, J. Virol. 63: 2951), são provavelmente mais imunogénicos do que os complexos relacionados solúveis.

Tal como se viu aqui na Secção Antecedente do Invento, o desenvolvimento de uma vacina de HIV eficaz é complicado por várias características do HIV. 0 presente invento pode evitar alguns senão mesmo a maior parte dos problemas. Além de apresentar as proteínas gag e env nas suas conformações nativas, as partículas HIV tornadas recombinantes do invento podem ser concebidas de modo a que se retenham os epitopos desejáveis, enquanto que se eliminam ou modificam os epitopos indesejáveis. Além disso, o invento proporciona meios pelos quais vários 71 852 5624-148-118 -30-

epitopos diferentes das proteínas do mesmo HIV podem ser incorporados nas partículas usadas na formulação da vacina. 0 invento também proporciona um processo para criar partículas de HIV tornadas recombinantes, heterólogas, que podem ser usadas para formular uma vacina capaz de evitar tanto a infecção pelo HIV-1 como pelo HIV-2.

Um dos novos aspectos da abordagem de vacinação que utiliza o presente invento é que estes e outros epitopos podem ser incorporados numa partícula imunogénica. Além disso, estes epitopos apresentam-se ao sistema imunitário tal como se apresentam no HIV nativo, induzindo portanto respostas imunitárias que são eficazes contra a infecção pelos viriões nativos. 5.4.1.1. VACINAS DE HIV-1 A imunidade protectora contra o HIV ainda não foi completamente esclarecida, é comum acreditar-se serem necessários tanto os anticorpos neutralizadores como a imunidade mediada por células, uma vez que o HIV pode ser transmitido sob a forma isenta de células ou associada a células. Têm sido identificados, em indivíduos infectados com HIV-1, anticorpos neutralizadores que reconhecem um certo número de epitopos diferentes de HIV, incluindo os que reconhecem epitopos em regiões altamente conservadas bem como em regiões variáveis da proteína gpl20 de envelope. Analogamente foram identificados anticorpos neutralizadores dirigidos contra os epitopos de gp41 e pl7 (Papsidero et al., 1989, J. Virol. 63:267-272). Outros anticorpos detectados em indivíduos infectados com HIV incluem aqueles que são específicos para os domínios do gpl20 que se liga ao receptor da superfície da célula CD4. Ainda outros anticorpos que se ligam a uma região hipervariável da gpl20, são capazes de inibir a fusão de células infectadas pelo HIV em sincícios (Rusche et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 85: 3198). São também observadas respostas imunitárias celulares em pessoas infectadas com HIV e, especificamente, foram identificados linfócitos T citotóxicos dirigidos contra produtos de genes env, gag e pol (Walker et al., 1987, Nature 328:345; Nixon et al., 1988, Nature 336=484; Riviere et al., 1989, J. Virol. 63:2270-2277). 71 852 5624-148-118 -31-

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Outra concretização do invento é uma vacina contra o vírus HIV-1, actualmente a forma de HIV que mais prevalece, usando partículas de HIV-1 tornadas recombinantes tais como as partículas de HIV-1 tornadas recombinantes descritas na Secção 6., et seq., infra, que compreendem proteínas do core e do envelope, maduras, do vírus de tipo 1, construídas numa estrutura que imita as propriedades morfológicas e antigénicas do HIV vivo. Esta concretização engloba as formulações de vacina que usam uma variedade de partículas de HIV-1 tornadas recombinantes. Por exemplo, as partículas que simultaneamente apresentam os complexos gpl20/gp41 de dois ou mais isolados de HIV, podem ser úteis para induzir o desenvolvimento de anticorpos protectores contra um certo número de epítopos de regiões variáveis. A produção destas partículas pode ser obtida co-infectando células hospedeiras com diversos vírus vacinia recombinantes diferentes, transportando respectiva-mente os genes env dos diferentes isolados de HIV-1. Os indivíduos imunizados com estas partículas seriam capazes de respostas imunitárias contra várias estirpes diferentes de HIV-1.

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Analogamente, a construção de partículas politrópicas pode também aumentar a eficácia da formulação da vacina.· Nesta concretização, as partículas são planeadas de modo a incorporarem epítopos de estirpes de HIV-1 com diferentes tropismos. Por exemplo, partículas de HIV-1 tornadas recombinantes, mostrando determinantes exclusivos para uma estirpe de HIV-1 associada a monócitos, em combinação com determinantes comuns a estirpes do vírus associadas a células T4, podem ser produzidas por uma abordagem de infecção múltipla. Especificamente, estas partículas podem ser produzidas co-infectando células hospedeiras com três vacinia recombinantes, um deles transportando o gene gag de uma estirpe, um transportando o gene env da mesma estirpe e o outro transportando o gene env de uma estirpe tropogenicamente diferente. A vacina mais eficaz contra o HIV-1 pode envolver o uso das partículas de HIV-1 tornadas recombinantes do invento, em combinação com outros imunogénios. Neste aspecto, as partículas de HIV-1 tornadas recombinantes parecem mais eficazes para

71 852 5624-148-118 originarem respostas imunitárias humorais e celulares quando usadas como um imunogénio secundário após uma imunização inicial com gpl60 recombinante em sujeitos primatas não humanos.

5.4.1.2. VACINAS DE HIV-2 E VACINAS HETERÓLOGAS

Outras concretizações do presente invento referem-se a vacinas contra o HIV-2 bem como a vacinas heterólogas que podem incluir, por exemplo, uma vacina única para o HIV-1 e o HIV-2. As partículas tornadas recombinantes usadas nessas vacinas heterólogas podem incluir, por exemplo, as proteínas do core do HIV-1 e as proteínas do envelope do HIV-1 e HIV-2. Em alternativa, pode ser desejável formular uma vacina composta de duas ou mais partículas de HIV tornadas recombinantes, diferentes. Isto pode ser especialmente verdadeiro quando se concebe uma vacina que irá proteger contra os muitos isolados diferentes tanto do HIV-1 como do HIV-2.

As vacinas que compreendem um só tipo de partícula de HIV tornada recombinante ou dίGerentes tipos, em combinação, podem ser formuladas com um adjuvante adequado para intensificar a resposta imunológica aos seus antigénios. Adjuvantes adequados incluem, mas não lhes estão limitados, os geles minerais, as substâncias tensioactivas como a lisolecitina, polióis pluriónicos, polianiões, péptidos, emulsões oleosas e adjuvantes potencialmente úteis para o homem, como o BCG (bacilo Calmette-Guerin) e o corynebacterium parvum.

Pode ser usado um certo número de processos, já bem conhecidos na arte, para introduzir as formulações de vacina acima descritas, incluindo a escarificação intradérmica, a injecção endovenosa, a injecção subcutânea, a injecção intramuscular, a administração intranasal, a administração oral, etc..

6. EXEMPLO: PRODUÇÃO E ISOLAMENTO DE PARTÍCULAS DE HIV-1 TORNADAS RECOMBINANTES NÃO REPLICATIVAS

Encontra-se aqui descrito um sistema in vitro para preparar partículas de HIV-1 tornadas recombinantes que contêm proteínas de core e do envelope, construídas, e que apresentam, nas suas

71 852 5624-148-118 -33 superfícies, os antigénios env gpl20 e gp41. Resumidamente, as células BSC-40 são co-infectadas com virus vacínia recombinantes transportando o gene completo do envelope de HIV-1 (v-env5) ou os genes completos gag e protease (v-gag2) do HIV-1. As proteínas do HIV-1 são expressas nas células BSC-40 e construídas nas partículas de HIV-1 que emergem da membrana da célula. As partículas resultantes são não replicativas, reagem com anticor- e pos monoclonais específicos para as proteínas do envelope/do core do HIV-1 e são morfologicamente semelhantes aos viriões HIV-1.

6.1. PROCESSO GERAL

6.1.1. CÉLULAS E VÍRUS

As células renais do macaco verde africano (estirpe BSC-40, uma linha contínua de células renais do macaco verde africano derivada de células BSC-1, N2. ATCC CCL26) foram propagadas em meio de Eagle modificado com Dulbecco (DMEM, Gibco, Grand Island, NY) suplementado com 10¾ de soro de bovino fetal e 100 unidades por ml tanto de penicilina como de estreptomicina.

Os vírus vacínia recombinantes, portadores das sequências env e gag do HIV-1, foram preparados e avaliados como se descreve no pedido copendente de patente americana N°. de Série 905 217, depositado em 9 de Setembro de 1986. 0 virus vacínia v-env5 recombínante contém o gene inteiro env do HIV-1. 0 vírus vacínia v-gag2 recombínante contém os genés inteiros gag e prt do HIV-1 bem como parte do gene pol. A estirpe do virus vacínia do New York City Board of Health foi purificada a partir de uma preparação comercial de vacina da varíola (Dryvax Lot 321501G) comercializada por Wyeth Laboratories (Marietta, PA). A vacina da varíola foi diluída com PPSAM (ver abaixo) e purificada em placa, por três vezes sucessivas, sobre células BSC-40. A partir desse isolado purificado em placa preparou-se em células BSC-40 um lote (daqui em diante designado por v-NY) que foi usada para construir virus recombinantes.

6.1.2. DETECCao DE ANTIGÉNIOS DQ ENVELOPE E CORE DO HIV

Usaram-se quatro técnicas para detectar as proteínas env e gag do HIV-1: radioimunoprecipitação (RIP), imunoensaio por 71 852 5624-148-118

-34-enzima de captura (EIA), análise de mancha Western e imunomicros-copia electrónica.

As radioimunoprecipitações foram realizadas essencialmente como se descreveu em (Haffar et al., 19SS, J. Cell. Biol. 107=1677) usando soros anti-HIV-1 policlonais humanos (Trimar, Inc.). Resumidamente, infectaram-se células BSC-40 com vírus vacinia progenitor ou recombinante com uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10 PFU por célula por vírus usado. As células foram radiomarcadas durante 4 h com [3%]-metionina e [35g]--cisteina (100 wCi/ml) 12 horas após infecção. 0 meio foi, então, recolhido e as células foram lavadas com PBS, colhidas e lisadas em tampão RIP (1¾ NP40; 0,5¾ desoxicolato; 0,1¾ SDS em PBS). Fizeram-se reagir os lisados de células pós-nucleares ou os meios de cultura com anti-soros policlonais durante 30 minutos, à temperatura ambiente. Incubaram-se os complexos anticorpo-antigé-nio com Staphylococcus aureus (Staph A) fixados com glutaraldeido a 10^ durante 30 minutos à temperatura ambiente. Os complexos Staph A-anticorpo-antigénio foram sedimentados por centrifugação e lavados por duas vezes com tampão de lavagem RIP (1¾ NP-40; 0,1 SDS em PBS). As pelotas resultantes foram solubilizadas com tampão de amostra SDS-PAGE (Laemmli, 1970, Nature 227= 680), fraccionados em geles de poliacrilamida a 11,5¾ e as proteínas imunoprecipitadas foram visualizadas por auto-radiografia.

Usaram-se o imunoensaio por enzima de captura e as manchas Western para detectar especificamente a p24 do HIV-1 como se descreve em (Hu et al., 1987, Nature 328= 721) com anticorpos monoclonais contra a p24. Os anticorpos monoclonais usados para os imunoensaios por enzima de captura e para as manchas Western, foram produzidos para sequências de p24 por imunização de ratinhos com péptidos de fusão, recombinantes, que definem sequências de sobreposição na proteína p24. Os anticorpos monoclonais 25-2 e 25-3 foram preparados em Genetics Systems (Seattle, WA) e estão descritos no pedido de patente dos Estados Unidos N2. de Série 054 026 depositado em 30 de Abril de 1987, e 105 761 depositado em 7 de Outubro de 1987.

71 852 5624-148-118 -35- ft imunomicroe.copia electrõnica foi usada para detectar as proteínas gpl20 e gp41 do envelope sobre a superfície de partículas de HIV-1 tornadas recombinantes usando MAb 110-4 especifico para gpl20 (Thomas et al., 1988, AIDS Res. Hum. Retroviruses 2' 25; Linsley et al., 1988, J. Virol. 62: 3695) e MAb 41-1 específico para gp41 (Sosting et al», 1987, J. Clin. Microbiol. 25: 845) e também para elucidar a morfologia das partículas de HIV tornadas recombinantes, maduras, seguindo as técnicas de microscopia electrõnica descritas na Secção 6.1.3., infra.

6.1.3. MICROSCOPIA ELECTRÕNICA

Isolaram-se partículas de HIV-1 tornadas recombinantes e prepararam-se para visualização EM pelo modo seguinte: meios de cultura de células infectadas há 15 h, foram colhidos e misturados. Os meios foram clarificados de células contaminantes por centrifugação numa centrífuga refrigerada de bancada, a 600 x g. A fracção com partículas foi então isolada dos sobrenadantes clarificados por ultracentrifugação a 120 000 x g. 0 sobrenadante resultante foi recolhido como o material pós-partículas (S). A pelota de partículas foi ressuspensa em solução salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7,4 e re-sedimentada por ultracentrifugação a 120 000 x g através de uma camada de solução de sacarose a 15%. 0 material sedimentado por duas vezes foi referido como fracção de particulas (P). A pelota de particulas sedimentadas (P) foi lavada várias vezes cobrindo cuidadosamente a pelota com PBS e depois retirando-o por aspiração. A pelota foi, depois, fixada com paraformal-deído a 4% durante 20 min e lavada de novo com PBS. Num processo semelhante, infectaram-se pequenas monocamadas de células BSC-40 (1θ4-ΐο5 células) com os vírus recombinantes adequados. Descar-tou-se o meio de crescimento 15 h depois e as monocamadas de células foram lavadas várias vezes com PBS e depois fixadas com paraformaldeído a 4%, durante 20 min, a 22°C.

As células fixadas e as pelotas de partículas fixadas foram, depois, lavadas 5 vezes com PBS e depois bloqueadas com uma -36- -36- y* 71 852 5624-148-118 solução contendo 0,8¾ de albumina de soro bovino (BSA), 0,1¾ de gelatina e 5¾ de soro normal de cabra em PBS (tampão de bloqueamento) durante 30 minutos. Decantou-se a solução bloquea-dora e adicionaram-se anticorpos monoclonais às células como fluido ascitico (diluído a 1=2000 em tampão de bloqueamento) e deixou-se incubar durante 2 a 3 h. Lavaram-se as células em PBS e, depois, incubaram-se com anticorpo secundário de cabra, anti--ratirho, conjugado com ouro (IgG conjugado com ouro coloidal de 15 nm ; Janssen, Piscataway, NJ) a uma diluição de 1=5 por mais 2 h, lavaram-se com PBS e fixaram-se em glutaraldeído a 2¾. Incubaram-se as amostras com 1¾ de tetróxido de ósmio (OSO4) em tampão 0,1 M de cacodilato durante 30 min a 22°C. As amostras foram depois bem lavadas com PBS e desidratadas por incubações em sequência, de 3 minutos, em etanol a 35%, a 50¾ e a 75%, antes de serem marcadas com acetato de uranilo a 3% em etanol a 70% durante 30 min a 22°C. As amostras foram depois desidratadas adicionalmente por incubações em sequência, como acima se descreveu, em etanol a 80%, a 90%, a 95% e por fim a 100% (por 3 vezes) a 22°C.

As amostras foram então implantadas em resina de metacrilato (plástico) do modo seguinte: tratamento de 1 h com etanol absoluto/plástico numa proporção de 2=1 respectivamente, e tratamento durante a noite com 100% de plástico. A resina foi, então, polimerizada durante 2 dias a 60°C. 0 plástico com as amostras implantadas foi retirado mecanicamente da placa e cortaram-se secções finas (100 nm) que se receberam em grelhas revestidas com "formvar". As grelhas foram depois manchadas com acetato de uranilo saturado/citrato de chumbo (da Millonig) durante 10 min cada e lavadas muito bem. As grelhas, após secagem, foram avaliadas a uma ampliação de 100 000 x com microscópio electrónico de transmissão JE0L 100B, a 60 kV. 71 852 5624-148-118 -37-

6.2. PREPARAÇÃO DE PftRTÍCULftS DE HIV-1 TORNADAS RECOMBINANTES NÃO REPLICATIVAS CONTENDO PROTEÍNAS MADURAS GAG E ENV 6.2.1. ANALISE DAS PROTEÍNAS DE HIV-1 EXPRESSAS EM CÉLULAS BSC-40 INFECTADAS COM VÍRUS VAC1NIA RECOMBINANTE Lisados de células e meio de crescimento de células BSC-40 radiomarcadas metabolicamente, infectadas com v-env5, v-gag2, ambos os recombinantes em conjunto ou com vírus vacínia progenitor v-NY, foram analisados quanto a proteínas de HIV-1, por RIP com soros anti-HIV-1 policlonais humanos como se descreve na Secção 6.2.1. supra. Como se mostra na FIG. 1, a proteína precursora env gpl60 bem como os produtos do seu processamento proteolitico, gpl20 e gp41, foram detectados em lisados de células infectadas com v-env5 (faixa A). Além disto, foi segregada gpl20 pelas células infectadas com v-env5 (faixa B). Também o precursor gag p55 sintetizado em células infectadas com v-gag2 foi processado para dar proteínas gag maduras p24, pl7, pl5 bem como as duas espécies precursoras intermédias p45 e p39 (faixa E) (Gowda et al-, 1989, citação). É interessante notar que também se detectaram proteínas gag no sobrenadante da cultura (faixa F).

As células BSC-40 co-infectadas com v-env5 e v-gag2 produziram proteínas processadas env e gag idênticas às expressas em células infectadas individualmente (faixa C, compare-se com as faixas A e E). As proteínas maduras env e gag produzidas por estas células duplamente infectadas foram analogamente localizadas nos sobrenadantes das culturas (faixa D, compare-se com as faixas B e F) com cinética idêntica. Além disto, a iodação, catalisada pela lactoperoxidase das proteínas associadas à membrana plasmática revelou que o transporte de gpl60, gpl20 e gp41 para a superfície da célula é a mesma nas células infectadas do com v-env5/que nas células duplamente infectadas (Fig. 2, faixas A e B, respectivamente).

6.2.2. ISOLAMENTO DE PARTÍCULAS DE HIV-1 TORNADAS RECOMBINANTES NÃO REPLICATIVAS

Para determinar se a gpl20 e gp41 extracelulares, expressas 71 852 5624-148-118

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pelas células BSC-40 infectadas, eram libertadas como proteínas solúveis ou como constituintes das partículas emergentes, separaram-se os sobrenadantes das culturas em fracçõesde partículas (P) e pós-partícuias (S) (Secção 6.1.3., supra), e analisou-se por RIP o teor em proteína do HIV de cada fracção, em paralelo com o de sobrenadantes de culturas não fraccionadas (TS). Como se mostra na FIG. 3(1) (faixas A, B e C), a gpl20 extracelular derivada de células infectadas por v-env5 foi principalmente detectada na fracção S, o que sugere que a proteína não é um constituinte das partículas emergentes. Contudo, a gpl20 derivada de células, co-infectadas com v-env5 e v-gag2, foi detectada na fracção P bem como na fracção S (FIG. 3(1), faixas E e F, respectivamente), ainda que a gpl20 associada às partículas pouco tenha contribuído para o nível global de gpl20 extracelular detectável.

Em contraste com a gpl20, a gp41 foi detectada aprenas na fracção P dos sobrenadantes de células duplamente infectadas (FIG. 3(1), faixas E vs De F), indicando que a gp41 está associada apenas a partículas emergentes. Tem interesse notar que o precursor env gpl60 foi detectado na fracção P de sobrenadante de células duplamente infectadas embora a baixos níveis (FIG. 3(1), faixas E vs D e F).

As proteínas do core do HIV-1, expressas por células BSC-40 infectadas, foram analisadas de modo semelhante. Todas as proteínas detectáveis do core - p24, p55, p45, p39 e pl7 - foram observadas nas fracções P de sobrenadantes de culturas de células infectadas com v-gag2 (FIG. 3(1), comparem-se as faixas H e I) bem como nas duplamente infectadas (FIG. 3 (1), comparem-se as faixas E e F). As fracções P obtidas de células duplamente infectadas foram também sub-fraccionadas por sedimentação por um gradiente contínuo de 15¾ a 60¾ de densidade de sacarose e a presença de antigénio de p24 foi avaliada por EIA, como se descreve na Secção 6.1.2., supra. Os resultados indicados na FIG. 3(2) mostram que o p24 se separa como um só pico saliente juntamente com as fracções de sacarose de 36¾ a 40¾. Estes resultados sugerem que as proteínas gag expressas pelas células 71 852 5624-148-118 -39- BSC-40 infectadas se libertaín como constituintes com tamanho relativamente uniforme. Além disso, a presença de gpl20 e gp41 nas fracções P de células duplamente infectadas sugere que as partículas libertadas de células co-infectadas incorporam complexos gpl20/gp41. Esta conclusão é ainda apoiada pelos resultados obtidos da análise por imunomicroscopia elec-trónica (Secção 6.2.3., infra).

6.2.3. ANÁLISE ULTRA-ESTRUTURAL DE PARTÍCULAS DE HIV-1 TORNADAS RECOMBINANTES POR MICROSCOPIA ELECTRÓNICA

DE SECÇÃO FINA

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Para analisar directamente a morfologia das partículas de HIV-1 tornadas recombinantes, fizeram-se reagir fracções P isoladas de sobrenadantes de culturas de células BSC-40 co--infectadas com v-env5 e v-gag2 com anticorpos monoclonais (MAb) específicos para gpl20 (MAb 110-4) ou para gp41 (MAb 41-1). Os complexos antigénio-anticorpo primário foram feitos reagir adicionalmente com um conjugado secundário com ouro coloidal--anticorpo, implantado em plástico e foram observados por micros-copia electrónica (EM) de secção fina, como se descreve na Secção 6.1.3., supra. Estas análises revelaram partículas de cerca de 100-120 nm de diâmetro, contendo um core denso aos electrões em forma de bastão (FIG. 4, "a" e “c") ou esférico (FIG. 4, "b”),

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morfologicamente semelhante às imagens de EM de partículas isoladas do virião HIV-1 (Gelderblom et al., 1988, Micron and Microscopia 19:41; Gelderblom et al., 1987, Virology 156: 171).

Além disto, as partículas foram marcadas com os conjugados de ouro coloidal o que indica que elas apresentam nas suas superfícies, gpl20 (FIG. 4, "a” e "b") e gp41 (FIG. 4, “d").

Analisaram-se de modo semelhante, usando o MAb anti-gpl20, células intactas BSC-40 co-infectadas com os dois vírus vacínia recombinantes. Tornaram-se visíveis numerosas partículas, de 100-120 nm, positivas ao antigénio de gpl20. A maioria destas partículas associadas a células assumiram uma de duas morfologias distintas, uma caracterizada por uma forma vesicular difusa (FIG. 4, "e", seta vazia) e a outra distinguindo-se por uma região de membrana dupla espessada, localizada excentricamente (FIG. 4, *

71 852 5624-148-118 -40-"d", seta dupla). Os requerentes pensam que estas estruturas diferentes representam várias formas de partículas imaturas que podem ser paralelas às que ocorrem durante a morfogénese do vir ião HIV-1. Ocasionalmente podem ser vistas, perto da superfície da célula, partículas contendo uma estrutura de capside completamente formada, em forma de bastão, capturada como se indica na micrografia electrónica da FIG. 4, "e" (seta vazia), fts partículas de vacinia que emergem da membrana da célula não incorporaram o gpl20 (FIG. 4, "d", seta dupla).

6.2.4. TEOR EM ÁCIDOS NUCLEICOS DAS PARTÍCULAS DE HIV-1 TORNADAS RECOMBINANTES 0 teor em ácidos nucleicos das partículas de HIV-1 tornadas recombinantes foi determinado por hibridação em mancha pontual, com sondas de ARN reactivas com as sequências gag ou env. As sondas foram sintetizadas in vitro por transcrição de moldes de ADN, portadores das sequências gag ou env na presença de nucleótidos radiomarcados usando o conjunto de transcrição in vitro Promega Riboprobe, de acordo com as instruções dos fabricantes. Resumidamente, as partículas recombinantes, equivalentes a 300 ng de p24, foram solubilizadas em tampão de lise de preparação de ARN (isotiocianato de guandina 2M, citrato de sódio 125 mM, pH 7,0, 0,125¾ sarcocinato, 50¾ dimetilsulfóxido) e embebidas ("blotted") em filtros de nitrocelulose, em paralelo com várias concentrações de HIV, inactivado pela Psoralina, analogamente solubilizado (equivalente a 2600 ng, 260 ng, 26 ng e 2,6 ng de p24). Prepararam-se filtros em separado para a reacção com as sondas específicas para gag e específicas para env. Os filtros de nitrocelulose foram incubados durante 2 h a 42°C em tampão de hibridação (3x SSC, 50¾ Formamida, 5x solução de Denhardt e 150 pg de ARN não específico), antes da adição das sondas respectivas. Os filtros foram incubados com as sondas durante a noite, a 42°C, depois muito bem lavadas com solução 0,lx SSC/0,1% SDS, secos ao ar e analisados por auto-radiografia.

Na FIG. 5 mostram-se os auto-radiogramas das hibridações de mancha pontual. Apenas a sonda gag reagiu com os ácidos nucleicos na amostra de partículas recombinantes (painel A vs painel B). Em 71 852 5624-148-118 -41-contraste, ambas as sondas reagiram com os controlos de vírus inactivado pela Psoralina. Estes dados sugerem que as partículas de HIV-1 tornadas recombinantes empacotaram o ARN do gag mas não do env. Esta conclusão está de acordo com o facto de que o gene gag usado, para produzir o virus vacinia recombinante v-gag2, incluía as sequências de 5’, não traduzidas, recentemente identificadas como sinal de empacotamento do ARN virai do HIV (FIG. 5, painel C, seta).

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Estes resultados indicam que as partículas de HIV-1 tornadas recombinantes não têm capacidade de se replicarem. Esta conclusão é apoiada pelas experiências descritas na Secção 12., infra, que mostram a ausência de antigênio de HIV intracelular em células CD4+ incubadas com partículas de HIV-1 tornadas recombinantes durante extenso período.

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7. EXEMPLO: PRODUÇÃO DE PARTÍCULAS DE HIV-1 TORNADAS RECOMBINANTES N£0 REPLICATIVAS USANDO UM SÕ VECTOR DE VÍRUS VACINIA RECOMBINANTE Como alternativa ao sistema de produção de partículas de HIV-1 tornadas recombinantes usando dois vectores de vírus vacinia recombinantes como se descreveu na Secção 6., supra, pode usar-se uma abordagem por um só vector virai que envolve a construção de um virus vacinia recombinante contendo ambos os genes do HIV-1, o env e o gag. No exemplo seguinte, usa-se um virus vacinia recombinante contendo os genes env e gag do HIV-1 para infectar células BSC-40. As células infectadas expressam antigénios do envelope e do core do HIV-1 que se constroem nas células infectadas para criarem as partículas de HIV-1 recombinante. As partículas de HIV-1 recombinantes, purificadas a partir dos meios de células infectadas, são imunogénicas in vivo.

7.1. PROCESSOS GERAIS 7.2. CONSTRUÇÃO DO V-G2E5: UM VÍRUS VACINIA RECOMBINANTE. CONTENDO OS GENES ENV E GAG DO HIV-1 Excisou~se um fragmento 3,2 Kbp, que continha toda a sequência codificadora de env do HIV-1 (nucleótido N2. 5707-8608) sob controlo do promotor 7,5K do virus vacinia, a partir do / 71 852 5624-148-118

-42- plasmídeo pv-env5 (pedido copendente de patente dos Estados Unidos N2. de Série 07/593 401, depositado em 5 de Outubro de 1990) pela endonuclease de restrição EcoRI. Este fragmento foi inserido no local EcoRI no plasmídeo pv-gag2N (idêntico ao pv--gag2 descrito no pedido copendente de patente dos Estados Unidos 07/593 401, depositado em 5 de Outubro de 1990, com excepção de que se inseriu, no local Smal a jusante da sequência codificadora do gag, um ligador sintético contendo sinais de fim de tradução). 0 plasmídeo pv-gag2N contém o gene gag do HIV-1 também sob o controlo do promotor 7,5K do vírus vacínia. A construção do plasmídeo resultante, pv-G2E5, está representada esquematicamente na FIG. 6. Os genes gag e env do HIV-1 foram introduzidos no gene da timidina-quinase do vírus vacínia por recombinação in vivo como se descreve no pedido copendente de patente dos Estados Unidos N2. de Série 07/593 401, depositado em 5 de Outubro de 1990, daí se produzindo o vírus vacínia recombinante v-G2E5 contendo ambos os genes gag e env do HIV-1. 7.3. COEXPRESSÃO DOS ANTIGÉNIOS DO ENVELOPE E DO CORE D0 HIV-1 EH CÉLULAS BSC-40 INFECTADAS COM V-G2E5 Infectaram-se células renais do macaco verde africano (BSC--40) com V-G2E5 recombinante a uma multiplicidade de infecção de 5 pfu/célula. As 24 horas após infecção, lavaram-se as células e os lisados de células foram resolvidos por SDS-PAGE sobre um gel, 7-15¾. As proteínas dos lisados de células foram transferidas para filtros de nitroceiulose e fizeram-se reagir com soro humano HlV-positivo, seguido de anticorpos de imunoglobulina de cabra, anti-humana, conjugados com peroxidase de rábano silvestre. As proteínas imunorreactivas foram detectadas por reacção com substratos de peroxidase. Os resultados mostrados na FIG. 7 indicam que tanto os antigénios do envelope como os do core do HIV-1 foram expressos e processados em células infectadas com v--G2E5. 0 nível de ambos os antigénios era comparável ao obtido em células infectadas com o vírus vacínia recombinantes, sozinhos, contendo env ou contendo gag. 71 852 5624-148-118

-43-7.4. PftRTlCULftS DE HIV-1 RECOHBINANTES PRODUZIDAS EM CÉLULftS BSC-40 INFECTftDftS COM V-G2E5

Usou-se o V-62E5 recombinante para produzir partículas do tipo HIV-1 a partir de células BSC-40. Semearam-se células BSC-40 sobre pérolas de Cytodex 3 (Pharmacia LKB Biotechnology) e deixaram-se desenvolver em balões de cultura em forma de fuso ("spinner culture bottles"), de cultura em meio de Eagle modificado com Dulbecco, com 5¾ soro de vitela fetal de acordo com as recomendações do fabricante. Quando as células atingiram a confluência foram infectadas com vírus vacínia recombinante v--G2E5 a uma MOI de 5 pfu/célula. Depois de uma adsorção de 1 h, lavaram-se as células por duas vezes com meio fresco para remover qualquer excesso de inoculo. Após 24 h de incubação a 37,5°C, recolheu-se o meio de cultura e removeram-se os detritos celulares por centrifugação a baixa velocidade. 0 meio de cultura pré-clarifiçado foi, depois, centrifugado durante 3 h a 19 000 rpm num rotor tipo 19 (Sorvall). As pelotas resultantes desta centrifugação a alta velocidade foram ressuspensas em PBS, misturadas e ressedimentadas por centrifugação durante lha 32 000 rpm usando um rotor SW55TÍ (Beckman). A pelota final foi ressuspensa em PBS frio e guardada a -70,5°C até ser usada. Os teores em antigénios p24 e gpl20 das preparações de partículas foram quantificados por ensaios de captura do antigénio p24 e por imunomancha, respectivamente, essencialmente como se descreveu na Secção 6.1.2., supra. A análise por radioimunoprecipitação das partículas produzidas pelas células infectadas com V-G2E5 está representada na FIG. 8. Estes resultados demonstram a presença de ambos os antigénios gpl20 e p24 na fracção pelotizada do meio de células infectadas após centrifugação a alta velocidade, indicando a construção selectiva destas proteínas de virião maduras, na forma de partículas. A abundância relativa de p24 e gpl20 nestas partículas era semelhante à das preparações de viriões de HIV-1, sublinhando as semelhanças estruturais e bioquímicas entre os viriões tornados recombinantes e os viriões autênticos de HIV-1.

71 852 5624-148-118 -44-

8. EXEMPLO- PRODUÇÃO DE PARTÍCULAS DE HIV-1 TORNADAS RECOMBINANTES NÃO REPLICftTIVftS. POR TRANSFECÇÃO DE ftDN DE

PLftSMÍDEO PftRft CÉLULftS DE MAMÍFEROS

Além dos sistemas para produzir partículas de HIV-1 recombinantes usando vectores de vírus vacínia recombinantes, como se descreveu nas Secções 6 e 7, supra, pode usar-se um sistema que envolva células de mamíferos transfectadas com ADN que codifica os genes env e gag de HIV-1. Este sistema permite a produção de partículas de HIV-1 recombinantes numa linha de células de mamíferos, estável. A produção de partículas de HIV tornadas recombinantes usando o sistema aqui descrito pode ser conseguida usando várias estratégias incluindo, mas não lhes estando limitadas, (1) a transfecção com vectores plasmidicos complexos contendo múltiplos genes estruturais ou reguladores, do HIV, (2) a co-transfecção com vectores plasmidicos múltiplos contendo diferentes genes de HIV, (3) o uso de elementos intensificadores/promotores constitutivos e reguláveis para originar a expressão das proteínas do HIV, (4) o uso de proteínas reguladoras do HIV incluindo tat e/ou rev para controlarem indirectamente a expressão das proteínas estruturais gag e env do HIV, (5) o uso de diferentes linhas de células para expressar as proteínas do HIV e as partículas de HIV tornadas recombinantes, e (6) o uso de vectores plasmidicos que codificam proteínas modificadas do HIV. Estas variações permitem a optimização do sistema em diferentes tipos de células e a manipulação de diferentes espécies de proteínas ou de estruturas nas partículas HIV recombinantes.

8.1. CONSTRUÇÕES DE PLASM1DEQ

Muitos dos vectores plasmidicos usados neste sistema contêm um híbrido Intensificador/Promotor CMV=HIV (designado por CmHi) derivado do vector de expressão pH3MPy (Aruffo e Seed, 1987, Proc. Natl. Acad, Sei. U.S.A. 84=8573-77), que contém o intensi-ficador do gene precoce, imediato, do citomegalovirus fundido com o promotor e a região tar do HIV (nucleótidos —69 a +78). Alguns destes vectores plasmidicos contêm outros elementos intensifica-dor: promotor derivados do gene precoce imediato do citomega-

71 852 5624-148-118 lovirus (designado por CMV) ou do gene de metalotioneina-I (lit) do ratinho. Estes elementos reguladores são ligados às sequências de gene codificadoras das proteínas do HIV, às quais se segue um fragmento, de Hpal até Hhal (nucleótidos 1569 até 1680) de Adenovirus 2 contendo o local de adição poli A do gene Ela, seguido do fragmento, de BamHI até Sphl, de pBR322, clonado no plasmídeo Bluescribe plus (Stratagene). As proteínas individuais de HIV codificadas por cada um destes vectores plasmidicos, estão indicadas na Tabela I, e os diagramas esquemáticos destes plasmídeos estão na FIG. 9. TABELA I GENES DO HIV, CODIFICADOS PELOS Vector VECTORES Genes do PLASMIDICOS HIV Gag+Pro Tat Rev Env Outros CmHiEnvS (1104-(bl) + CmHiTgfbEnv5 (1113-al) + CmHiGag2Rre (1158-al) + CmVGag2Rre (1159-al) + CmHiRev (1132-cl) + CmvRev (1152-al) + CmHiTat (1132-bl) + BsMtRev (1202-2) + BsMtTAT (1203-1) + CmHIVdelXmn (1133-al) + + + Vif,Vpr, Vpu CmHIVdelKpnAvr(Gag2TRE) + + + + Vpu (1160-al) 0 plasmídeo CmHiEnvS (1104-bl) tem o fragmento, de NruI até HindIII, de pH3MPy, contendo o intensificador do gene precoce imediato do citomegalovirus e o promotor de HIV e o elemento tar, ligado aos nuçleótidos 5671-8572, Avall a Kpnl. 0 plasmídeo CmHiTgfbEnvS (1113-al) contém o fragmento 71 852 5624-148-118 -46- intensificador:promotor, de NruI até PstI, do pH3MPy ligado ao gene quimérico TGF-f3:HIV env; o gene, de simio, TGF-beta que proporciona a região 5’, não traduzida, e o péptido de sinal, está directamente fundido no local do sinal de clivagem do gene env do HIV, estendendo-se do nucleótido 5856 até ao local Kpnl do nucleótido 8572,

J

0 plasmideo CmHiGag2Re (1158-al) contém o fragmento intensi-ficador:promotor, de NruI até Xbal, de pH3MPy, ligado às sequências codificadoras de pol e gag do HIV, que se estendem do local BssHII no nucleótido 257 até ao local Asp7!8 no nucleótido 3372. Esta é a mesma região da sequência codificadora de gag contida no virus vacínia recombinante, v-gag2, e inclui toda a estrutura de leitura do gag seguida por cerca de metade da estrutura de leitura de pol. Também estão incluídas nesta região as sequências que codificam a protease de HIV e grande parte, mas não toda, a região codificadora da transcriptase inversa. Ligou-se ao local Asp718 um ligador Xbal que proporciona os codóes de fim de tradução. A este seguiu-se um fragmento do gene env do HIV, que se estende de BglII em 7178 até HindIII em 7698, contendo o elemento responsivo Rev. 0 plasmideo CmvGag2Rre (1159-al) é idêntico excepto em se ter usado o fragmento intensificador e promotor do citomagalovirus, de NruI até Xbal, derivado do vector de expressão CDM8 (Invitrogen). 0 plasmideo CmHiRev (1132-cl) contém o fragmento intensifi-cador:promotor do pH3MPy, de NruI até PstI, a montante de um gene Rev de HIV sem intrão, que se estende do local Bsu36I no nucleótido 5500 até ao local Kpnl no nucleótido 8572, com a delecção dos nucleótidos 5590-7935. 0 plasmideo Cmvrev (1152-al) é idêntico excepto em se ter usado o fragmento intensificador e promotor do citomegalovirus, de NruI até Xbal, derivado do vector de expressão CDM8 (Invitrogen). 0 plasmideo CmHiTat (1132-bl) contém o fragmento intensifi-cador:promotor do pH3MPy, de NruI até BglII, a montante de um gene tat do HIV sem intrão, que se estende do local Sall no nucleótido 5331 até ao local Kpnl no nucleótido 8572, com a

71 852 5624-148-118 -47- delecção dos nucleótidos 5590-7935 0 plasmideo BsMtRev (1202-2) contém um fragmento de 1,7 kilobase do gene da metalotioneína-I do ratinho, que se estende do local EcoRI na posição aproximada -1700 até ao local do começo da transcrição, a montante de um gene rev do HIV sem intrão, que se estende do local Bsu36I no nucleótido 5500 até ao local Kpnl no nucleótido 8572, com a delecção dos nucleótidos 5590-7935. 0 plasmideo BsMtTat (1203-1) contém um fragmento de 1,7 kilobase do gene da metalotioneína-I do ratinho, que se estende do local EcoRI na posição aproximada -1700 até ao local do começo da transcrição, a montante do gene tat de HIV sem intrão, que se estende do local Sall no nucleótido 5331 até ao local Kpnl no nucleótido 8572. 0 plasmideo CmHIVdelXmn (1133-al) contém o mesmo intensifi-cador:promotor híbrido de CMV:HIV, derivado do vector de expressão pH3MPy usado nos plasmídeos acima descritos. Este plasmideo incorpora sequências de comando de ARN, 5* do HIV até ao local Xmnl no nucleótido 384, precisamente dentro do terminal N da estrutura de leitura do gag; dentro deste segmento está o local dador de união ("splice donor site"), que está unido ("spliced") aos locais aceitadores localizados a montante de muitos genes do HIV, incluindo os que codificam as proteínas tat, rev e env. 0 local Xmnl no nucleótido 384 está ligado, através de um ligador Xbal (que contém um codão de fim de tradução TA6 que pára a tradução de um péptido de gag, N-terminal após cerca de 20 resíduos de aminoácidos), a um Xmnl no nucleótido 4034 perto do terminal C da estrutura de leitura de pol. As sequências de HIV continuam, então, até ao local Kpnl no nucleótido 8572, através da região que codifica as proteínas estruturais, reguladoras e de menor importância, do HIV, incluindo vif, vpr, tat, rev, vpu e a proteína env do HIV. Este plasmideo deverá ser capaz de codificar cada uma das proteínas de HIV acima indicadas, pela união do local doador de união 5f, localizado imediatamente antes do terminal N do gene gag, com os locais aceitadores de união ("splice acceptor sites”) localizados a montante das várias 71 852

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estruturas de leitura codificadoras das proteínas. 0 plasmideo CmHIVdelKpnAvr(Gag2TRE) (1160-al) contém a expressão motora do intensificador:promotor, híbrido, de CMV-HIV, de toda a estrutura de leitura de gag e a porção N terminal da estrutura de leitura de pol (contida no vírus vacínia recombi-nante v-gag2) ligadas directamente na porção 37 do genoma de HIV que contém as sequências codificadoras das proteínas tat, rev e env. Neste plasmideo o segmento, de NruI até EcoRI, do intensifi-cador do gene precoce, imediato, do citomegalovírus, do vector de expressão P3MPy, está ligado à sequência promotora de HIV ue começa no nucleótido -69; as sequências de ARN de controlo de HIV continuam através do gene gag e dentro do gene pol, até ao local Kpnl no nucleótido 3372, ligadas a um poli-ligador que inclui um Nhel contendo um codão de fim de tradução de TAG para a estrutura de leitura de pol. Este local Nhel está ligado a um local Avrll no nucleótido 5207 na estrutura de leitura de vpr. As sequências de HIV continuam, então, até ao local Kpnl no nucleótido 8572. Este vector contém todos os elementos da sequência que se crêem ser importantes para a síntese, união, transporte citoplásmico, tradução, processamento e função do gag, protease, proteínas tat, rev e env do HIV. Este plasmideo deverá ser capaz de codificar o gag do HIV a partir de ARNm que não sofreu união ("unspliced") e cada uma das outras proteínas do HIV acima indicadas através da união entre o local dador de união 5’, localizado imediatamente antes do terminal N do gene gag e os locais aceitadores de união localizados a montante das várias estruturas de leitura codificadoras das proteínas. Inclui também o elemento tar localizado dentro dos primeiros 60 nucleótidos do transcrito primário de ARNm do HIV, que é necessário para a transactivação de tat do promotor de HIV, e do Rre (elemento responsivo a rev), localizado entre os nucleótidos 7315 e 7559, necessário para a localização citoplásmica, catalisada por rev, dos ARNm codificadores das proteínas estruturais do HIV. Não estão contidos neste vector de plasmideo uma região central do genoma de HIV codificadora da metade da estrutura de leitura de pol, do terminal C, incluindo parte da proteína da transcriptase inversa e toda a

71 852 5624-148-118 -49-proteína de integrase, toda a estrutura de leitura de vif e o terminal N da estrutura de leitura de vpr; também está ausente deste vector a maior parte da LTR de 5’ e toda a LTR de 37 bem como a maior parte da estutura de leitura de nef. 8.2. PRODUÇÃO DE PARTÍCULAS DE HIV-1 TORNftDftS RECOMBINANTES Eh TRANSFECTANTES ESTÁVEIS DE CÉLULAS CHO Transfectaram-se células CHO dhfr- com os vectores plasmidicos CmHIVdelKpnAvr(Gag2TRE) e CmHiEnvS. Seleccionaram-se linhas de células transfectadas por co-transfecção com o plasmi-deo pSV2dhfr. Os transfectantes de CHO continham proteínas gag e env maduras, imunorreactivas, segregadas sob a forma de partículas, com propriedades de sedimentação semelhantes âs do virião HIV e às das partículas de HIV-1 tornadas recombinantes, produzidas como se descreveu na Secção 6., et seq., supra. 8.2.1. TRANSFECÇÃO E SELECÇÃO DE CÉLULAS As células CHO dhfr- foram transfectadas após crescimento em mistura de nutrientes F12 de Ham (sem hipoxantina) suplementada com 10¾ de soro bovino fetal e 150 ug/ml/prolina, em placas de cultura de tecidos, de 60 mm, até 50¾ da confluência, transferência para meio isento de soro, incubação durante 5 h com uma mistura de Lipofectin (BRL), expressão dos plasmideos de HIV CmHIVdelKpnAvr(Gag2TRE) (1160-al) e CmHiEnvS (1104-bl) e do plasmideo de selecção pSV2dhfr, remoção da mistura Lipofectin:ADN e de novo transferência para meio contendo soro. Dois ou três dias após transfecção as culturas foram transferidas para meio selectivo, DMEh mais 10¾ de FBS e prolina. Dois dias mais tarde as culturas .foram tripsinizadas e transferiram-se, para placas para cultura de tecidos de 96 alvéolos, aliquotas contendo aproximadamente 0,08¾ e 0,40¾ das células (estimadas para conterem aproximadamente 1 e 5x10^ células transfectadas, respectiva-mente). Também se transferiram aliquotas contendo 7,8¾ das células para placas para cultura de tecido de 6 alvéolos.

Após 13 dias de cultura adicional em meio selectivo um conjunto de placas de 6 alvéolos foi fixado e as células foram imunomanchadas para expressão de proteínas do HIV, por incubação

71 852 5624-148-118 -50-com soro de um paciente com SIDA (TriMar), seguido de anticorpo de cabra anti-humano, conjugado com peroxidase do rábano silvestre, e de um substrato de peroxidase (3-amino-9-etil--carbazolo). Existiam 15-20 colónias de células seleccionadas por alvéolo; cerca de 10¾ destas colónias continham proteínas do HIV o que se verificou por ensaio de imunomanchamento. Esta análise indicou que apenas cerca de 10 a 15 alvéolos por placa de 96 alvéolos, semeados com o número mais baixo de células, deveria conter uma colónia de células transfectadas e que uma fracção destas expressaria, provavelmente, as proteínas do HIV.

Os meios de cultura de tecidos de cada alveólo das placas de 96 alvéolos foram então recolhidos e ensaiadas, por um EIA de antigénio da proteína gag, quanto à proteína gag segregada (Secção 6.1.2., supra). Identificaram-se por este ensaio um certo número de alvéolos candidatos. Foram, então, escolhidos para expansão doze alvéolos potencialmente positivos, quatro alvéolos derivados de cada uma das três transfecções independentes. A inspecção visual dos alvéolos positivos, nesta altura, mostrou alguns alvéolos praticamente confluentes, outros apenas com pequenas colónias de células em crescimento e outros, aparentemente, não continham células viáveis. Expandiram-se as células das três classes de alvéolos potencialmente positivos; tripsini-zaram-se os alvéolos e transferiram-se as células para placas de 6 alvéolos, para expansão.

Além disso, semeou-se uma pequena fracção das células de cada linha de células conditada, em alvéolos em duplicado de uma placa de 24 alvéolos. Após 5 dias de crescimento, adicionaram-se a cada alvéolo células HeLa de tipo selvagem ou células HeLa T4 (transfectadas com a proteína de CD4 e expressando esta). No dia seguinte, avaliou-se por um imunoensaio focal, a expressão de gag e a função env. Resumidamente, as células foram fixadas e incubadas com um soro humano anti-HIV, seguido de um anticorpo de cabra, anti-humano, ligado a peroxidase de rábano silvestre e de um substrato de peroxidase (3-amino-9-etil-carbazolo). Por este ensaio verificou-se que quatro linhas de células, agrupáveis em duas classes, eram positivas. Duas linhas (3010-C1 e 3010-C6)

71 852 5624-148-:118 -51- tinham apenas um pequeno número de células que cora' intensamente e que formavam com grande eficiência sincícios gigantes com as células HeLa T4 mas não com células HeLa de tipo selvagem. Duas outras linhas (3010-C5 e 3010-C13) apresentavam muitas células positivas mas que coravam com menor intensidade e apenas uma fracção formava sincicios com as células HeLa T4. As células das outras linhas não coravam. A marcação, com o anticorpo, das células positivas sugere que elas sintetizam proteínas gag e a formação de sincicios com células HeLa T4 demonstra que têm, à superfície das células, proteínas funcionais de envelope gpl20 e gp41.

Após expansão adicional de cada uma das linhas escolhidas, analisaram-se os lisados de células, pelo ensaio de mancha Western, quanto à síntese de proteína de HIV. As células em placas de cultura de tecidos, de 60 mm ou de 100 mm, foram lavadas duas vezes com PBS e recolhidas directamente em 300 ul ou 750 ulde tampão de amostra de Laemmli. Após fervura, a proteína celular total da amostra foi resolvida por electroforese em gel de poliacrilamida a 10¾ ou num gel de poliacrilamida em gradiente de 8 a 16¾. Incluiram-se como controlos alíquotas de HIV, de células CEM infectadas com HIV e de células BSC-40 infectadas com vacínia recombinantes v-gagl, v -gag2 ou v-env5. 0 conteúdo do. gel foi electro-transferido para uma folha de filtro de nitroce-lulose. 0 filtro foi feito reagir com soro de paciente com SIDA ou com soro de um coelho imunizado com gpl60 derivado de células infectadas com v-env5, foi lavado muito bem, reagiu com Proteína A marcada com 125^ e ηθνο lavado muito bem. Os produtos foram então visualizados por auto-radiografia com filme de raios X.

As quatro linhas positivas identificadas no ensaio anterior, mostraram-se também positivas em relação às proteínas gag. Os lisados 3010-C1 e 3010-C6 continham várias vezes mais gag do que os lisados 3010-C5 e 3010-C13. As linhas que se tinham mostrado negativas no ensaio anterior mostraram-se também negativas em relação a gag, pelo ensaio de mancha Western. A maior parte do material imunorreactivo co-migrou com o precursor p55 e como_ uma espécie ligeiramente mais pequena que não correspondia a um 71 852 5624-148-118 /

-52- produto importante no HIV ou nas células infectadas com HIV ou com vGagl; apenas eram detectáveis nos lisados de células, quantidades muito pequenas de proteínas maduras gag p24 e pl7. Esta análise demonstrou também a presença de proteínas de envelope gpl60, gpl20 e gp41 nos lisados de células das linhas de células positivas.

8.2.2. CARACTERIZAÇÃO DE PARTÍCULAS DE HIV-1 TORNADAS

RECQMBINANTES

Para demonstrar que as proteínas gag e env, sintetizadas nestas células, estavam construídas em partículas do tipo de vírus e que eram segregadas, recolheram-se os sobrenadantes das culturas e clarificaram-se por centrifugação a baixa velocidade. Recolheu-se a fracção de partículas por centrifugação (a 32 000 rpm no rotor SW55, a 27 000 rpm no rotor SW41 ou a 19 000 rpm no rotor tipo 19). A análise de mancha Western demonstrou que este material continha ambas as proteínas gag e env. As principais proteínas gag detectadas nas partículas são as espécies p24 e pl7 maduras; também podiam ser detectadas pequenas quantidades de precursores de p55 e p40. Em contraste, as espécies precursoras representavam a maior parte do material nos lisados de células. As proteínas de envelope Gpl60, gpl20 e gp41 foram todas detectadas nas partículas. A comparação das manchas Westerm sugere que apenas uma pequena fracção das proteínas gag e env contidas nas células, é segregada sob a forma de partículas. A análise quantitativa por EIA de antigénio gag, das múltiplas preparações de partículas derivadas das células 3010-C6, sugere rendimentos da ordem dos 3 a 17 ng de gag por ml de meio de cultura. As partículas da linha de células 3010-C6 foram também analisadas por sedimentação em gradiente de sacarose (2 h a 50 000 rpm no rotor SW55, 15-60¾ de sacarose). Como se mostra na FIG. 10, tanto o EIA de antigénio gag como a avaliação por mancha Western das fracções do gradiente, mostraram que as partículas deram um pico único a cerca de 35-40¾ de sacarose. -53- 71 852 5624-148-118 8.3. ESTRATÉGIAS DE ALTERNATIVA PARft EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS ENV E GAG E PftRft PRODUÇÃO DE PftRTÍCULftS DE HIV-l TORNADAS RECOMBINANTES EM CÉLULAS DE MAMÍFEROS Nesta secção descrevem-se algumas variações que representam estratégias de alternativa para a expressão de proteínas do HIV e de partículas de HIV tornadas recombinantes em células transfec-tadas. Variações possíveis incluem, mas sem lhes estarem limitadas , (1) a transfecção com vectores plasmidicos complexos contendo genes múltiplos de HIV, estruturais e/ou reguladores, (2) a co-transfecção com vectores plasmidicos múltiplos contendo genes de HIV diferentes, (3) o uso de elementos intensificadores/promotores tanto constitutivos como reguláveis, para produzir a expressão das proteínas de HIV, (4) o uso de expressão regulada de proteínas reguladoras de HIV, incluindo tat e/ou rev, para

J controlo indirecto da expressão de proteínas estruturais gag e env do HIV e (5) a expressão de proteínas de HIV em diferentes tipos de células. Estas variações podem ser úteis na optimização de vários parâmetros do sistema e proporcionam a manipulação independente dos componentes de proteína das partículas e dos niveis de expressão nos diferentes tipos de células.

Ensaiaram-se plasmideos e combinações de plasmideos, por transfecção transiente em células HeLa (e, em alguns casos, BSC--40 e Vero) por processos padrão de transfecção com fosfato de cálcio. Os produtos foram analisados por electroforese em gel de poliacrilamida dos lisados de células totais ou das partículas de HIV tornadas recombinantes, recolhidas do meio de cultura por centrifugação a alta velocidade, electro-transferência para filtros de nitrocelulose e sondagem com anti-soros específicos. Para análise das proteínas env, o filtro foi sondado com anticorpo monoclonal 110-4 marcado com 125I (Secção 6.1.2., supra), que liga um epitopo na região V3 de gpl60 e gpl20; para análise das proteínas gag, o filtro foi sondado com soro de paciente com SIDA (TriMar) seguido de Proteína A marcada com 125-1. Os produtos foram, então, visualizados por auto-radiogra-fia com filme de raios X. 71 852 5624-148-118

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St

8.3,1. A EXPRESSÃO DE PROTEÍNftS DE HIV Eli CÉLULAS HeLa PODE SER OBTIDA A PARTIR DE MUITOS PLASMÍDEOS DIFERENTES E DE COMBINAÇÕES DE PLA5MÍDEQS A expressão de proteínas gag e env de HIV pode ser obtida por transfecção com plasmídeos complexos codificadores de muitas proteínas de HIV, incluindo as proteínas estruturais e reguladoras; em alternativa, podem ser transfectados juntos muitos plas-mideos codificadores de diferentes proteínas de HIV. A transfecção em células HeLa de plasmídeos que codifiquem individualmente a env (CmHiTgfbEnv5 ou CmHiEnvS) ou a gag (CmHiGag2Rre), em combinação com plasmídeos codificadores das proteínas tat e rev, tem como resultado a expressão das proteínas imunorreactivas do envelope de HIV, a gpl60 e a pgl20, ou a expressão de proteínas imunorreactivas relacionadas com a gag do HIV, incluindo o produto principal de tradução p55, os intermediários de processamento p47 e p39, e as proteínas gag p24 e pl7 maduras.

Em alternativa, a transfecção para células HeLa de vectores plasmídicos (CmHIVdelXmn ou CmHIVdelKpnAvr(Gag2TRE)), que contém, uma unidade de transcrição única, as sequências codificadoras funcionais, tanto para as proteínas reguladoras tat e rev como para as proteínas estruturais env ou ambas a env e gag, tem, também, como resultado a síntese de proteínas precursoras e maduras env, ou gag e env. A co-transfecção de CmHIVdelXmn com CmHiGag2Rre ou com CmVGag2Rre também resulta na síntese de ambas as proteínas gag e env. Cada um dos plasmídeos ou combinações CmHIVdelKpnAvr(Gag2TRE) (1160-al), CmHIVdelXmn (1133-al) + CmHi-Gag2Rre (1158-al), e CmHIVdelXmn (1133-al) + CmvGag2Rre (1159-al) também tem como resultado a segregação para o meio de cultura de partículas de HIV tornadas recombinantes.

Assim, a expressão de proteínas estruturais gag e env e a de produção de partículas/HIV tornadas recombinantes usando este sistema podem ser conseguidas por muitas vias. No Quadro II, abaixo, mostra-se a comparação dos níveis de expressão alcançados com diferentes combinações de plasmídeos, mostrando que dife- 5624-148-118 -55-

rentes combinações podem ser óptimas para a expressão de diferentes proteínas. Por exemplo, env parece ser mais eficientemente expressa quando co-transfectada com plasmideos que codifiquem separadamente as proteínas tat e rev. Por outro lado, a gag pode ser expressa de modo mais eficiente a partir de um plasmideo como o CmHIVdelKpnAvr(Gag2TRE) (1160-al) que contém, numa unidade de transcrição única, as sequências codificadoras funcionais para as duas proteínas reguladoras. Obtiveram-se níveis intermédios de ambas as proteínas por co-transfecção do plasmideo complexo CmHIVdelKpnAvr(Gag2TRE) (1160-al) e um plasmideo codificador de env em separado.

TABELA II

NÍVEIS RELATIVOS DE EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS ENV E GAG OBTIDAS USANDO COMBINAÇQES DIFERENTES DE PLASMIDEOS

Plasmideos env gag CmHiEnv5 + CmHiTat + CmHiRev ++++ CmHiGag2Rre + CmHiTat + CmHiRev - ++ CmvGag2 + CmvRev - + CmHIVdelXmn + - CmHiGag2Rre + CmHIVdelXmn + ++++ CmHIVdelKpnAvr(Gag2TRE) + ++++ CmHiEnvS + CmHIVdelKpnAvr(Gag2TRE) +++ +++

Os níveis relativos de expressão de gag e env, obtidos após transfecção com várias combinações de plasmideos, estão indicados em unidades arbitrárias; os níveis de expressão de gag e env foram determinados independentemente um do outro e não estão necessariamente representados pela mesma escala.

Nestes exemplos, rev é importante para a localização eficiente citoplásmica dos ARNm codificadores das proteínas estruturais de HIV e é dependente de um elemento regulador que actua de forma cis, denominado elemento responsivo a rev (Rre) localizado dentro da porção do gene env de HIV codificadora da porção terminal N da molécula gp41, que foi introduzido nos 71 852 5624-148-118 56-

plasmídeos gag como um fragmento, de BglII até HindIII, do gene do envelope, e que pode ser intrinsecamente necessário para uma expressão eficiente das proteínas gag e env do HIV. A proteína tat é importante para intensificar a transcrição iniciada a partir do promotor de HIV pela sua interacção com um elemento regulador que actua de forma cis, chamado tar, localizado entre os primeiros 75 nucleótidos dos transcritos de ARN do HIV. 0 gene tar está presente no elemento intensificador híbrido CmHi utilizado por CmHiGag2Rre, CmHiTgfbEnv5 e CmHiRev. A expressão de gag ou env pode ser tornada independente de tat por co-transfecção com plasmídeos como CmvGag2Rre e CmvRev, uma vez que estes plasmídeos não contêm a região tar. Contudo, a expressão de gag a partir da transfecção com CmvGag2Rre + CmvRev é inferior à da transfecção com CmHiGag2Rre + CmHiTat - CmHiRev. Uma vez que se sabe que o intensificador:promotor do gene precoce imediato do citomegalovírus é um elemento de transcrição muito forte, isto mostra que a combinação do elemento Intensificador: :Promotor CMV:HIV mais o gene tat do HIV pode constituir um sistema de expressão especialmente forte. Observações semelhantes foram, também, feitas no contexto da expressão da proteína env. Os híbridos entre os outros elementos intensificadores e o elemento tar/promotor de HIV podem ter outras propriedades úteis.

Estes resultados demonstram que as diferentes proteínas estruturais de HIV podem divergir nas suas necessidades de proteínas reguladoras de HIV, ou de outros factores, para obterem expressão máxima, e a relação entre proteínas gag e env pode ser controlada pela escolha de plasmídeos ou de combinações de plasmídeos adequados.

Estes resultados também indicam que os plasmídeos codificadores das diferentes proteínas de HIV podem ser introduzidos independentemente nas células como exemplo, uma linha de células produtora de particulas de HIV tornadas recombinantes pode ser transfectada adicionalmente com um plasmideo codificador de uma proteína menos importante de HIV, como vpu ou vif, para alterar os níveis de produção e/ou as propriedades das partículas de HIV tornadas recombinantes. Como outro exemplo, as linhas de 71 852 5624-148-118

-57- células transfectadas com um plasmídeo codificador das proteínas tat, rev e gag, que, portanto, produzem partículas contendo apenas proteínas gag, poderiam ser seleccionadas e depois transfectadas com diferentes plasmídeos codificadores de env, para produzir partículas contendo proteínas env a partir de diferentes estirpes ou com outras alterações estruturais. Por exemplo, por comparação da expressão de proteínas env de genes contendo a sequência natural de sinais dos genes de env do HIV (CliHIEnvS) ou contendo uma fusão entre a sequência de sinal do TGF-beta-1 de símio e o terminal N da gpl60 madura (CmHiTgfEnv5), observou-se uma expressão igualmente eficiente.

8.3.2. REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO DA PROTEÍNA env DO HIV

PELO USO DE PROMOTORES REGULÁVEIS

Numa outra concretização, células CHO dhfr- foram transfectadas com a combinação de plasmídeos CmHiTgfbEnvS + CmHiTat + + CmHiRev, em conjunto com o plasmídeo de selecção pSV2dhfr. O exame inicial das linhas de células seleccionadas nesta experiência não revelou níveis detectáveis de expressão de env de HIV. As células foram, então, seleccionadas adicionalmente por crescimento em níveis crescentes de metotrexato para amplificação do plasmídeo de selecção transfectado pSV2dhfr e co-amplificação dos plasmídeos codificadores de tat, rev e env, do HIV, na esperança de seleccionar a amplificação de níveis baixos de expressão de env do HIV. Identificou-se uma linha de células em que se estavam a sintetizar proteínas de env de HIV. Contudo, a selecção para amplificação adicional do gene dhfr e dos plasmídeos codificadores da proteína de HIV co-transfectados, por crescimento em concentrações progressivamente mais elevadas de metotrexato, não conduziu a um aumento de expressão da proteína env. Mais exactamente foi necessária uma selecção contínua para manter os níveis de expressão da proteína env, pois que os níveis de expressão da proteína do envelope baixavam nas células que cresciam sem promoção da selecção. As células que expressavam níveis mais elevados de proteínas env pareciam também crescer mais lentamente e a uma menor densidade do que as linhas de células que tinham regressado aos níveis mais baixos de expressão -58- 71 852 jTi ,,- f/ff Jy 5624-148-118 da proteína env. Estes resultados surgerem que a expressão da proteína de envelope é tóxica nestas células e pode portanto representar uma limitação aos níveis que se poderiam obter na expressão da proteína env.

Esta limitação pode ser ultrapassada pelo uso de plasrnídeos que utilizem promotores reguláveis controladores da expressão das proteínas do HIV. Estes plasrnídeos podem ser transfectados para células que inicialmente cresceriam no estado não induzido e depois seriam induzidas até altos níveis de expressão da proteína de HIV, para permitir níveis elevados, de curta duração, de produção antes de se estabelecer o efeito tóxico.

Como exemplo desta abordagem, construiram-se plasrnídeos codificando individualmente as proteínas tat e rev, sob o controlo do promotor da metalotioneína~I do ratinho, regulada por metal. Verificou-se que co-transfecções de células HeLa com as combinações de plasrnídeos Ça) CmHiTgfbEnvS + CmHiTat + CmHiRev, (b) CmHiTgfbEnv5 + BsMtTat + CmHiRev, e (c) CmHiTgfbEnvS + + CmHiTat + BsMtRev, seguidas de análise por mancha Western dos lisados celulares totais, todas elas produziram proteínas imunor-reactivas gpl60 e gpl20 do envelope de HIV (Fie. 11)- A transfecção com CmHiTgfbEnvS + CmHiTat + CmHiRev produziu o niveí mais elevado de expressão da proteína env. Mais significativamente, nas transfecções que utilizam o promotor Mt, verificou-se que os níveis de expressão foram induzidos várias vezes pela adição de zinco ao meio de cultura de tecidos, cerca de um dia antes da colheita. (Ver FIG. 11).

Estes resultados mostram que podem ser usados promotores reguláveis para modular a expressão das proteínas do HIV e que a expressão das proteínas estruturais do HIV pode ser regulada indirectamente por modulação das proteínas reguladoras tat e env do HIV. Outros exemplos desta abordagem incluem o uso de promotores reguláveis para controlar a expressão de plasrnídeos complexos codificadores de múltiplas proteínas de HIV, ou a construção de novos elementos reguladores induzíveis, por exemplo, em intensificador:promotor Mt:Hi híbrido, contendo os 71 852 5624-148-118 -59-

elementos reguladores de metal do promotor metalotioneína ligado ao promotor e à região tar do HIV.

8.3.3. EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS DE HIV EM CÉLULAS

BSC-40 E VERO

Neste exemplo várias combinações de plasmideos codificadores das proteínas tat, rev, env e gag do HIV, incluindo CmHiGag2Rre + + CmHiEnv5 + CmHiTat + CmHiRev em conjunto e CmHIVdelKpnAvr(Gag2-TRE), foram transfectadas para células HeLa, BSC-40 e Vero. 0 padrão básico de expressão de gag e env em relação aos produtos preparados e eficiência de expressão, é semelhante nas três linhas de células. Contudo, os níveis globais de expressão são mais elevados nas células HeLa, cerca de 3 vezes mais baixos nas células BSC-40, e, nas células Vero, cerca de 5 vezes mais baixos.

Estes resultados, em conjunto com os descritos acima, com células CHO, mostram que se podem usar uma variedade de linhas de células, derivadas de diferentes espécies e de órgãos diferentes, para expressar as proteínas do HIV, de forma que se podem escolher células com determinadas características pretendidas para aplicações particulares.

9. EXEMPLO: PRODUÇÃO DE PARTÍCULAS DE HIV-1 RECOMBINANTES COM CARACTERÍSTICAS ESTRUTURAIS MODIFICADAS USANDO VÍRUS VACINIA RECOMBINANTE QUE EXPRESSA FORMAS TRUNCADAS DE ANTIGÉNIOS DO ENVELOPE DO HIV-1

Descrevem-se abaixo dois virus vacínia recombinantes que dirigem a expressão de gpl60 truncada do HIV-1 em células BSC-40 infectadas. Estes vírus vacínia recombinantes podem ser usados como vectores, em conjunção com v-gag2 (Secção 6., et seq., supra1 ou com outros vectores codificadores de antigénios do core, para produzir partículas de HIV-1 recombinantes que podem ter propriedades imunogénicas e/ou anti-virais melhoradas, usando o sistema descrito na Secção 6., supra. 9.1. VÍRUS VACÍNIA RECOMBINANTE V-ED2

Construiu-se um plasmídeo recombinante que continha a sequência codificadora de env de HIV-1, do nucleótido número 5705

71 852 5624-148-118 -60-ao 8068, inserida no vector de recombinação de vacinia pGS62 (patente co-pendente dos Estados Unidos N2, série 07/593 401, depositado em 5 de Outubro de 1990), no local BamHI a jusante do promotor 7,5K. A sequência de HIV-1 foi obtida como um fragmento BamHI de 2,36 Kbp do plasmídeo pv-env5 (pedido co-pendente de patente dos Estados Unidos N2. de série 07/593 401, depositado em 5 de Outubro de 1990). 0 fragmento continha toda a sequência codificadora da gpl20 e os 241 aminoácidos do terminal N de gp41, incluindo 49 resíduos de aminoácidos da região citoplásmica de gp41 do terminal C da sequência de transmembrana proposta. 0 gene quimérico, contendo o promotor 7,5K e as sequências de env do HIV-1, foi inserido no gene da timidina-quinase do vírus vacinia de acordo com os processos descritos no pedido co-pendente de patente dos Estados Unidos NQ. de série 07/593 401, depositado em 5 de Outubro de 1990. 0 virus recombinante V-ED2 resultante dirige a expressão de uma gpl60 truncada que é clivada em gpl20 e gp41, tão eficientemente como a gpl60 de tipo selvagem (FIG. 12). As células HeLa CD4+ infectadas com v-ED2, formaram sincicios (células gigantes multinucleadas, caracteristicas de infecção pelo HIV-1) mais prontamente do que v-env5, que expressa um precursor da glicoproteína de envelope gpl60, de comprimento total. Estes resultados indicam que as glicoproteínas de envelope produzidas pelo V-ED2 podem ser funcionalmente mais activas ou apresentarem-se de modo mais eficiente do que as glicoproteínas de envelope do "tipo selvagem”.

9.2. VÍRUS VACINIA RECOMBINANTE V-ENV5DCT

Construiu-se o vírus recombinante v-env5DCT de modo a conter toda a sequência codificadora de env do HIV-lv (isolado BRU; Wain-Hobson et al., 1985, Cell 40:9317), excepto os 13 aminoàci-dos do terminal C da gp41. Introduziu-se a mutação por delecção através de um processo de mutagénese por oligonucleótidos como está descrito (Kunkel et al., 1987, Meth. In Enzymol. 154:367--382). Inseriu-se o gene quimérico contendo o promotor 7,5K e as sequências mutadas de env de HIV-1, no gene da timidina-quinase do vírus vacinia de acordo com os processos descritos no pedido 71 852 5624-148-118 -Bi

co-pendente de patente dos Estados Unidos N2. de Série 07/593 401, depositada em 5 de Outubro de 1990, 10. EXEMPLO: PRODUÇÃO DE PftRTÍCULftS DE HIV-1 RECOMBINANTES COM CARACTERISTICfiS ESTRUTURAIS MODIFICADAS USANDO VÍRUS VAC1NIA RECOMBINANTES QUE EXPRESSEM GP16Q NÃO PROCESSADA Descrevem-se aqui dois vírus vacínia recombinantes que dirigem a expressão de uma glicoproteína de envelope precursora de gpl60 com mutações no local (ou locais) de cisão proteolítica entre gpl20 e gp41. Estes vírus vaccínia recombinantes podem ser usados como vectores em conjunção com v-gag2 ou outros vectores codificadores de antigénios do core para produzirem partículas de HIV-1 recombinantes que podem ter propriedades anti-virais e/ou imunogénicas melhoradas usando o sistema descrito na Secção 6., supra.

10.1. VÍRUS VACÍNIA RECOMBINANTE V-160NC

Construiu-se um plasmideo recombinante (pv-160NC) que continha uma sequência resultante da mutação, codificadora de gpl60, do nucleótido número 5803 ao 8495, inserida a jusante do promotor 7,5K no vector de recombinação de vacínia pG62. As mutações foram introduzidas por mutagénese orientada por oligonucleótidos essencialmente como está descrito em Kunkel et al., 1987 (Meth. Enzymol. 154:367-382). As sequências resultantes da mutação estão indicadas abaixo ("f" representa o local de cisão entre gpl20 e gp41: HIV-1 BR env gpl20 f gp41

Gin Arg Glu Lys Arg f Ala tipo selvagem" ...CAG AGA GAA AAA AGA f GCA___

V-160NC ...CAG ATA GAA GAA TTC f GCA... Gin Ile Glu Glu Phe f Ala 0 gene quimérico foi inserido no genoma do vírus vacínia, no gene da timidina-quinase, por recombinação in vivo como se descreve no pedido de patente dos Estados Unidos N2. de Série 07/593 401, depositado em 5 de Outubro de 1990. 0 virus recombinante resultante dirige a expressão de uma glicoproteína de envelope precursora de gpl60 que não está clivada em gpl20 e 71 852 5624-148-118 -62-

gp41.

10.2. VÍRUS VACÍNIft RECOMBINANTE V-11K160NC

Construiu-se um virus vacínia recombinante contendo o mesmo gene env de HIV-1 resultante da mutação, sob a forma de V-160NC (Secção 10.1, supra 1 mas sob controlo do promotor de 11K do virus vacínia . Excisou-se do plasmídeo pv-160NC um fragmento BamHI de 2,26 Kbp que foi inserido num derivado do vector de recombinação vacínia pSClO (Chakrabarti et al., 1985, Mol. Cel.. Biol. 5:3403-3409), no local EcoRI a jusante do promotor 11K. Isto produziu um gene quimérico contendo o promotor 11K do vírus vacínia e toda a sequência codificadora do gpl60 de mutação. 0 gene quimérico foi inserido no genoma do virus vacínia, no gene da timidina-quinase. 0 virus recombinante resultante dirige a produção em alto nível da gpl60 mutante de HIV-1, em células infectadas. 11. EXEMPLO: VÍRUS VACÍNIA RECOMBINANTE QUE EXPRESSA 0 GENE vpu DE HIV-1 A construção e produção de partículas de HIV-1 tornadas recombinantes não exige proteínas especificas do HIV-1 além da co-expressão de antigénios do envelope e núcleo do HIV-1. Contudo, outros factores, tanto de origem virai como celular, podem participar e intensificar este processo. Um desses factores é uma proteína virai codificada por vpu. Esta proteína é um polipéptido não glicosado de 16 Kd, aparentemente associado à superfície interior da membrana citoplásmica. Ainda que a vpu não seja necessária para a formação de partículas, as mutações na vpu têm como resultado um decréscimo nos viriões libertados pelas células infectadas (Terwilliger et al, 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 86=5163-5167; Strebel et al., 1989, J. Virol. 63=3487-3791). 0 mecanismo de acção de vpu não é conhecido e o seu papel na formação de partículas num sistema recombinante, como aquele que é aqui descrito, ainda não foi definido. Prevê-se que moléculas acessórias, como a vpu, possam desempenhar um papel que facilite o processo da construção e/ou libertação de viriões. 0 exemplo seguinte descreve um sistema pelo qual se pode examinar o papel potencial dessas moléculas acessórias e a sua utilidade 71 852 5624-148-118

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na produção de partículas recombinantes demonstrada.

Construiu-se um vírus vacinia recombinante que continha toda a sequência codificadora de vpu do HIV-1. Inseriu-se um fragmento de 290 bp do ADNc do HIV-1, do nucleótido 5636 ao 5927, no vector de recombinação de vacinia pQW62, entre os locais Smal e EcoRI a jusante do promotor 7,5K. Este fragmento contém a sequência de codificação de vpu bem como as sequências não traduzidas de 7 bp de 5’ e de 37 bp de 3’. 0 gene quimérico foi, então, inserido no genoma do virus vacinia por recombinação in vivo. 0 efeito do vpu sobre a formação e libertação de partículas recombinantes pode ser demonstrado em células co-infectadas com v-vpu e v-G2E5, como se descreveu na Secção 7, et seq.. supra).

12. EXEMPLO: EFEITO ANTIVIRAL DE PARTÍCULAS HIV-1 TORNADAS RECOMBINANTES

Este exemplo demonstra a capacidade das partículas HIV-1 tornadas recombinantes, do invento, reduzirem ou anularem o poder infeccioso de linfócitos CD4+ do HIV iri vitro. Os resultados indicam que as partículas HIV-1 tornadas recombinantes inibem efectivamente a infecção do HIV-1 de modo dependente da dose.

12.1. ENSAIO DE INFECTIVIDADE

Semearam-se células linfoblastoides T (CEM) em placas de cultura, de 14 alvéolos, a 4xl04 células/alvéolo, em 0,4 ml de meio de cultura (RPMI-1640 suplementado com 10¾ de soro de vitela fetal). Alvéolos em duplicado receberam então quantidades variáveis (ver TABELA 1) de partículas de HIV-1 tornadas recombinantes em 0,4 ml de meio. As partículas adicionadas foram quantificadas pela concentração equivalente de gag p24 determinada por EIA (Secção 6.1.2., supra). Os alvéolos de controlo não receberam partículas mas corrigiu-se-lhes o volume pela adição de 0,4 ml de meio. Deixaram-se as células e partículas incubar a 37°C durante 3 h antes da adição de HIV. Um conjunto de alvéolos, em duplicado, correspondentes a cada uma das concentrações das várias partículas, recebeu (1) nenhum HIV, (2) pequena quantidade de vírus de 40 TCID5Q (50 unidades de dose infecciosa de cultura de tecidos) correspondente a 5 pg gag p24 ou (3) grande

71 852 5624-148-118 -64-quantidade de vírus de 400 TCID50, correspondente a 50 pg p24. Ao 3o dia após infecção, o meio de cultura foi retirado dos alvéolos e substituído por meio fresco contendo a concentração original adequada de partículas. Ao 5® dia e depois ao 6° dia após a infecção, recolheram-se alíquotas das células de todos os alvéolos e avaliou-se o seu poder infeccioso por determinação da expressão intracelular dos antigénios de HIV, usando um ensaio de imunofluorescência indirecta que utiliza soro anti-HIV, humano, policlonal, como anti-soro primário, seguido de uma fracção de IgG de cabra, anti-humano, conjugada até fluorescência, como soro secundário.

12.2 RESULTADOS

Os resultados da avaliação da infectividade, apresentados na TABELA 1 abaixo, indicam que as partículas de HIV-1 tornadas recombinantes podem bloquear a infectividade de células CEM pelos vir iões de HIV, num modo dependente da dose. Pode também concluiu-se que as próprias partículas recombinantes não são infecciosas e não replicam na célula, visto que não se detectou fluorescência intracelular nas células incubadas com uma elevada concentração de partículas de HIV-1 tornadas recombinantes (FIG. 13, Painel A). Além disso, enquanto que se observaram múltiplas sincicios em culturas de células que receberam quaisquer das quantidades de HIV (FIG. 13, Painel C), as partículas recombinantes não induziram qualquer formação de sincicios.

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TABELft III

INIBIÇÃO DA INFECTIVIDADE DO VÍRUS HIV PELAS PARTÍCULAS DE HIV-1 TORNADAS RECOMBINANTES

Partículas de HIV-1 tornadas recombinan Células tes (N2 de vezes em Vírus^ Fluorescência(%) CEM excesso)1 (TCID50) 52 Dia 62 Dia + 0 0 0 0 + 60 0 0 0 + 600 0 0 0 + 0 40 20 >90 + 60 40 10-20 >90 + 600 40 <1 10 4“ 0 400 90 >90 + 60 400 60-80 >90 + 600 400 30 >90 1 0 número de vezes em excesso de partículas em relação ao vírus refere-se à quantidade equivalente de proteína p24. 2 Vírus da Imunodeficiência Humana, Tipo 1 (HIV-1), estirpe LAV-1

13. EXEMPLO·· AS PARTÍCULAS DE HIV-1 TORNADAS RECOMBINANTES INIBEM A INFECCÃO PELO HIV-1 DE LINFÕCITOS DO SANGUE PERIFÉRICO CULTIVADOS ISOLADOS DE DADORES SEROPQSITIVOS AO HIV-1 0 exemplo apresentado na Secção 12., supra, demonstra que as partículas de HIV-1 tornadas recombinantes inibiram a infecção pelo HIV-1 de células linfoblastoides T (CEM) in vitro de modo dependente da dose. O exemplo seguinte confirma que as partículas de HIV-1 tornadas recombinantes têm efeito anti-viral usando um sistema de linfócitos do sangue periférico cultivados (PBL). Os PBL usados neste sistema são isolados a partir de dadores seropositivos infectados com HIV-1 e a frequência de células

71 852 5624-148-118 -66- infectadas na fracção isolada de PBL varia de 0,04¾ a 1,3¾ (Psallidopoulos, M.C. et al., 1989, J. Virol, 631=4626-4644). Durante a cultura, a infecção do virus espalha-se para células CD4+ não infectadas por transmissão por célula-livre e célula--célula. Resultados recentes de outros grupos (Daar, E.S., et al. 1990 Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 87=6574-6578) sugerem que os isolados de HIV-1, do laboratório, respondem, de modo diferente do dos isolados dos primeiros pacientes, à neutralização e aos efeitos dos agentes antivirais, p. ex., o CD4 solúvel. Portanto, o uso do sistema de linfócitos do sangue periférico cultivados para avaliar os efeitos anti-virais das partículas de HIV-1 tornadas recombinantes pode ser um sistema biologicamente mais relevante do que o sistema de células CEM descrito na Secção 12., supra.

13.1. ENSAIO DE INFECTIVIPAPE

Colheram-se linfócitos do sangue periférico (PBL) de amostras de sangue heparinizado de dadores seropositivos ao HIV--1, por fraccionamento do material de revestimento cor de couro sobre uma almofada de Hypaque ficoll. As células foram então incubadas no meio de cultura (RPMI-1640 suplementado com 10¾ de soro humano) e os linfócitos CD8+ foram esgotados por tratamento com anticorpos monoclonais específicos de CD8, CD16 e CD20, durante lha 37°C, seguindo-se a adição de complemento de coelho durante lha 4°C (Zarling, J. M. et al., 1990, Nature (London) 347= 92-95). A preparação de células resultante consistia principalmente em linfócitos CD4+, linfócitos B e macrófagos. Semearam-se as células em placas de 24 alvéolos a 1 M de células/ /alvéolo, em 0,5 ml de meio de cultura. Alvéolos em duplicado receberam várias concentrações (ver Tabelas IV e V) de partículas de HIV-1 tornadas recombinantes, ou de viriões de HIV-1 inactivados por U.V.-psoralen - Todos os alvéolos foram, depois, suplementados com 0,5 ml de meio de cultura contendo MAb G19.4 reactivo com antigénio CD3 de células T (Hoxie, J.A., et al. 1986 Science 234=1123-1127) a 1 pg/ml de concentração final, bem como "interleuken" 2 (IL-2) a uma concentração final de 5¾. Mostrou-se que a activação das células T com MAb de CD3 solúvel induzia a 71 852 5624-148-118 -67-

réplica do vírus latente HIV-1 (Zarling, J.M. et al. , 1990, Nature (London) 347: 92-95).

Quatro ou cinco dias após activação (dadores Z29, Z30 ou dadores Z31, Z39 respectivamente), retiraram-se os meios de cultura dos alvéolos, lavaram-se as células com PBS suplementado com 10¾ de soro humano e substituiu-se por meio de cultura fresco. Amostras idênticas foram deixadas incubar com o meio fresco sozinho (ver abaixo) ou foram, de novo, suplementadas com concentrações apropriadas de partículas de HIV-1 tornadas recom-binantes ou com virus HIV-1 inactivados. A certos intervalos após a segunda adição de partículas ou de virus inactivados, como se indica na TABELA IV, recolheram-se amostras dos meios de cultura dos alvéolos e analisaram-se quanto ao conteúdo de p24gag, por EIA específico (Secção 6.1.2., supra). Além disso, recolheram-se simultaneamente células que se examinaram quanto à expressão da proteína de HIV-1, por fluorescência indirecta usando uma mistura de anticorpos monoclonais que reagem com gpl20 e p24gag.

As células que tinham partículas tornadas recombinantes ou virus inactivados lavados no 4o ou 5o dia, foram passados, no 8o dia, para novos alvéolos contendo MAb anti-CD3 imobilizado, para induzir a replicação continua das células. No 112. dia, avaliaram-se amostras dos sobrenadantes das culturas quanto à produção de p24gag, por EIA (ver TABELA V). Esta parte da experiência foi planeada para determinar se a inibição de produção de virus, detectada após tratamento com as partículas de HIV-1 tornadas recombinantes, era um fenómeno reversível.

13.2. RESULTADOS

Os resultados dos ensaios de infectividade estão apresentados nas Tabelas IV e V. As partículas de HIV-1 tornadas recombinantes inibiram a propagação da infecção pelo virus, pela cultura, nas amostras de quatro pacientes diferentes seropositi-vos. Esta inibição era dependente da dose e foi detectada a 0,1 ug/ml de equivalente da proteína p24gag em amostras tratadas com partículas de HIV-1 tornadas recombinantes. Ainda que os virus inactivados por U.V.-psoralen inibissem de modo semelhante a

71 852 5624-148-118 -68-propagação da infecção do vírus nas culturas, em alguns casos (Tabela IV, dador Z29, amostras do 69. dia), foram necessários lOx mais virus inactivados quando se compara com as partículas de HIV-1 tornadas recombinantes. A inibição persistente da produção de p24gag por células que se libertaram, por lavagem, de partículas de HIV-1 tornadas recombinantes ou de vírus inactivados no dia 4 (Tabela V), sugere que a remoção das partículas não foi suficiente para inverter o fenómeno. É interessante notar que os resultados também sugerem que as partículas de HIV-1 tornadas recombinantes foram mais eficazes nesta inibição do que os viriões de HIV-1 inactivados (Tabela V, ambos os dadores).

SEGUE TABELA IV -69- $i * 71 852 5624-148-118

TABELA IV

INIBIÇSO DA INFECTIVIDADE DO VÍRUS HIV-1 POR CÉLULAS DE HIV-1 TORNADAS RECOMBINANTES

Percentagem da inibição

Dador_Tratamento_Dosef ug/ml )* 92. dia Z31 Partículas 1 86 0,1 18 0,01 0 Z39 Partículas 1 99 0,1 5 0,01 0 62. dia Z29 Partículas 10 96 1 97 0,1 73 0,01 15 HIV inactivado 10 90 1 78 0,1 0 Z30 Partículas 10 86 1 84 0,1 22 0,01 0 HIV inactivado 10 84 1 78 0,1 0 1 A concentração de partículas de HIV-1 tornadas recombinantes e de vírus inactivados está indicada em relação , à concentração de p24gag. 0 teor relativo em glicoproteína de envelope des tas preparações é 5-10¾ da de p24gag. 71 852 5624-148-118 // -70

TABELA V

A INIBIÇÃO DA INFECTIVIDADE DE HIV-1 PELAS PARTÍCULAS DE HIV-1 TORNADAS RECOMBINANTES É IRREVERSÍVEL

Percentagem da inibição

Dador_Tratamento_DoseCug/ml _da produção de p24gag2

Partículas 10 >79 1 >51 0,1 0 0,01 0 HIV inactivado 10 >44 1 0 0,1 0 Partículas 10 99 1 91 0,1 52 0,01 4 HIV inactivado 10 50 1 15 0,1 1 1 As concentraçSes do tratamento são como se descreveram na Tabela IV. 2 A inibição da produção de p24gag foi testada no 112. dia após activação. As células foram lavadas no 42. dia e deixadas recuperar na ausência de tratamento. Para assegurar o crescimento das células, as células foram cultivadas na presença de 5¾ 11-2 e expostas a MAb de CD3 imobilizado no 82. dia. 14. EXEMPLO'· IMUNOGENICIDADE DAS PARTÍCULAS DE HIV-1 TORNADAS RECOMBINANTES, IN VIVO Conduziram-se as experiências abaixo descritas para avaliar a imunogenicidade in vivo de partículas de HIV-1 tornadas recombinantes e não replicativas, usando um modelo animal 71 852 5624-148-118 -71-pequeno. Escolheram-se coelhos para estes estudos pois que relatórios anteriores indicavam a presença de anticorpos neutra-lizadores nos coelhos imunizados com várias formas de imunogénios com base no HIV.

J

A resposta imunitária humoral de cada coelho imunizado foi avaliada por ELISA e por análise de mancha Western. 0 ELISA permitiu a medição do titulo global de anticorpos específicos do HIV, enquanto que a análise de mancha Western elucidou quanto à reactividade dos anticorpos com as proteinas virais individuais. Além disso, caracterizou-se a resposta imunitária celular originada em dois dos coelhos imunizados. Os resultados destas experiências confirmaram a capacidade das partículas de HIV-1 tornadas recombinantes de provocarem respostas imunitárias específicas para o HIV, em animais imunizados.

14.1. ENSAIO DE IMUNOGENICIDADE

Imunizaram-se dois coelhos brancos da Nova Zelância , fêmea, com partículas de HIV-1 tornadas recombinantes (Secção 6., supra) ou com vírus HIV-1 inactivado pelo psoralen. As quantidades de imunogénios usadas foram normalizadas de acordo com as suas concentrações relativas de proteína p24gag, determinadas por EIA de captura (Secção 6.1.2., supra). 0 esquema de imunização está indicado na Tabela VI, abaixo.

Para a imunização primária (Io), os imunogénios foram formulados com adjuvante completo de Freund numa proporção de 1=1 e administrados por injecção intramuscular em quantidades equivalentes a 120 ug de proteína p24gag e 4-6 ug de proteína gpl20env. Cinco semanas mais tarde, os coelhos receberam imunização secundária (2o, reforço), por via subcutânea, do material formulado em adjuvante incompleto de Freund, também na proporção de 1:1. A quantidade de imunogénio usada na 2ê imunização foi equivalente a 190 ug de proteína p24 e 10-20 ug de proteína gpl20 (coelho 238 e 239), ou 100 u9 de p24 e 5 a 10 ug de proteína gpl20 (coelhos 241 e 243) (ver Tabela VI).

Os soros recolhidos dos animais, a vários intervalos de tempo, foram testados quanto à reactividade anti-HIV, por ELISA, ssscsíQBB· -72- 71 852 5624-148-118 usando o vírus imobilizado, completo, rompido ou gpl20 purificada e imobilizada, e/ou a análise de mancha Western. Foram também recolhidos soros, de cada animal, uma semana antes do começo da experiência, usados como controlos de pré-imunização. Para a análise de mancha Western, solubilizou-se o vírus LAV-1, purificado, em tampão de amostra SDS-PAGE, e fraccionou-se por electro-forese em gradiente (7%-15%) em gel de acrilamida, em lâmina. As proteínas virais fraccionadas foram transferidas para um filtro de nitrocelulose usando técnicas padrão. 0 filtro foi depois dividido em fitas idênticas e usado na análise de mancha Western. Resumidamente, após o bloqueio das fitas durante 3 h com tampão de bloqueio (3¾ de leite seco, em PBS, BLOTTO) a 22°C, cada fita foi incubada a uma diluição de 1:50, em BLOTTO a 0,2¾ NP40, de amostra de soro especifico de coelho, durante a noite, a 4°C. As fitas foram então lavadas intensamente e incubadas com 125j-- Proteína A (ICN Radiochemicals) em BLOTTO 0,2¾ NP40 durante 2 h a 22°C. As bandas das proteínas foram visualizadas por auto--radiografia. Os soros foram também testados quanto à presença de anticorpos neutralizadores que reduzem o nível de produção de p24gag, um indicador da produção e libertação de virus. A presença de anticorpos que neutralizam o isolado LAV-BRU nos soros dos coelhos imunizados, foi detectada usando uma avaliação in vitro da infectividade das células CEM. Os soros foram inactivados pelo calor e depois diluídos em série no meio de cultura (RPMI-1640 suplementado com 10¾ de soro de vitela fetal). Misturaram-se volumes iguais de soro diluído e 30 TCID50 de inoculo de vírus e incubaram-se a 37°C durante 45 min. Juntou-se a preparação de virus desafiado (0,1 ml) a 0,1 ml de culturas de células CEM (2xl04 células) em placas de microtitu-lação de 96 alvéolos e incubou-se a 37°C com mistura ocasional. Após 1 h de incubação, a mistura virus-soro foi removida dos alvéolos e substituída por meio de cultura contendo o soro original de coelho na diluição apropriada. Cinco dias depois, o progresso da infecção nas culturas foi controlado medindo os níveis de p24gag nos sobrenadantes por EIA.

71 852 5624-148-118 i?

-73-

TABELA VI

ESQUEMA DE IMUNIZAÇÃO DOS COELHOS

Coelhos 238, 239 semana 0 : 1° imunização semana 5 : 2o imunização semana 33 : 3o imunização (só o coelho 238) 241, 243 semana 0 : 1° imunização semana 4 : 2o imunização semana 18 : 3o imunização (só o coelho 241) IMUNIZAÇÃO1 IMUNOGÉNIO COELHO 1° 2o 3o Partículas de HIV -1 238 120 ug 190 ug 140 ug tornadas recombinantes 241 120 ug 100 ug 120 ug HIV-1 inactivado 239 120 pg 190 ug 243 120 ug 100 ug 1 Os imunogénios primários foram formulados < em Adjuvante Completo de Freund e administrados por via intramuscular; os imunogénios secundários e terciários foram formulados em Adjuvante Incom- pleto de Freund e administrados por via subcutânea.

14.2. RESULTADOS 14.2.1. TITULO EM ANTICORPOS DETERMINADO POR ELISA A FIG. 14 apresenta os títulos relativos em anticorpos em amostras de soro recolhidas antes da Pré-sangria, bem como 2, 5 e 7 semanas após a lã imunização, determinados por ELISA nos coelhos 238 e 239. 0 coelho 238 (FIG. 14, gráfico A) mostrou uma resposta imunitária sobreelevada a proteínas de HIV após 5 semanas que se manteve depois da 2ã imunização (ver dados da semana 7, isto é, 2 semanas após reforço). Em contraste, detectou-se reactividade apreciável com proteínas de HIV duas semanas depois da li imunização nas amostras do coelho 239 (FIG. 14, gráfico B) que diminuía às 5 semanas. Contudo, na amostra de 71 852 5624-148-118

-74-soro recolhida no coelho 239 na semana 7, observou-se um efeito elevado de reforço do título em anticorpos.

Uma explicação para a fraca resposta de reforço no coelho 238 é que a 2§ imunização foi administrada ao animal durante o pico da resposta imunitária (ver esquema de sangrias na Tabela VI). Em contraste, o título em anticorpos já estava a decair no coelho 239 (comparem-se as sangrias da semana 2 e semana 5) quando a 2§ imunização foi administrada, e assim a resposta ao reforço foi mais acentuada.

Na FIG. 15 estão apresentados os resultados dos ensaios ELISA conduzidos em todos os soros de coelho quer usando· o virus imobilizado completo, rompido (painéis 1 e 2) ou a glicoproteína de envelope gpl20 purificada imobilizada. Os dados apresentados são os títulos finais a diferentes intervalos após imunização primária. Os valores das abcissas representam as semanas após as imunizações primárias, quando se recolhiam as amostras de soro. As setas indicam os tempos das imunizações secundárias e terciárias (ver Tabela VI). Como se pode ver, ambos os coelhos imunizados com partículas de HIV-1 tornadas recombinantes (coelho 238 e 241) bem como os coelhos imunizados com viriões HIV-1 inactivados pelo psoralen/U.V. (R239 e R243) produziram um perfil de reactividade antigénica correlacionada com o esquema de reforço. 0 título em anticorpos nos vários soros de coelho reactivos ao vírus completo, rompido, foi principalmente o reflexo da reactividade com a proteína p24gag que constitui aproximadamente 90¾ do teor proteico tanto dos viriões de HIV-1 tornados recombinantes como dos viriões de HIV-1. A reactividade ao vírus completo foi aproximadamente 2 a 3 ordens de grandeza maior do que a reactividade ao gpl20, o que é uma disparidade directamente relacionada com os baixos niveis (5-10¾) de glico-proteinas do envelope na estrutura das partículas.

14.2.2. NEUTRALIZAÇÃO DA INFECTIVIDADE DO HIV-1 POR ANTI-S0R0S DE COELHO A FIG. 16 mostra que a imunização com as partículas de HIV-1 tornadas recombinantes produz títulos elevados em anticorpos

71 852 5624-148-118 -75- neutralizadores do HIV-1 homólogo (estirpe LAV-1, isolado BRU (painel A)). Tal como com a reactividade global em relação às proteínas virais, o título dos anticorpo neutralizadores está correlacionada com o esquema de reforço. Os títulos indicados estão correlacionados com 75¾ de inibição da produção de p24gag. 14.2.3. RESPOSTA IMUNITÁRIA CELULAR A resposta imunitária celular originada por imunização com as partículas tornadas recombinantes está resumida na Tabela VII abaixo. Estes resultados indicam que os linfócitos isolados a partir de coelhos imunizados proliferaram em resposta à estimulação especifica com antigénios HIV-1, o que é uma resposta indicadora de actividade de memória das células T, necessária na imunidade mediada por células. Os indícios de estímulo foram mais significativos após as imunizações terciárias em ambos os coelhos imunizados com as partículas de HIV-1 tornadas recombinantes. 0 índice de estimulação muito alto obtido para o coelho 243 estava correlacionado com a globalidade das respostas altamente imunitárias medidas (FIG. 15, painel B; FIG. 16).

SEGUE TABELA VII -76- -76- #τ./- 71 852 5624-148-118

TABELA VII

RESPOSTA DAS CÉLULAS T PROLIFERATIVAS, ESPECÍFICAS AO HIV, EM COELHOS IMUNIZADOS

ÍNDICE DE ESTIMULAÇÃO IMUNOGÉNIO ANIMAL ANTIGÉNIO DE ESTIMULAÇÃO PRIMEIRO REFORÇO SEGUNDO REFORÇO Partículas 238 Part. recomb. 3,0 15,0 recombimantes de HIV inactivado N.T. 8,4 241 Part. recomb. de HIV inactivado 2,2 N.T. 5,4 N.T. Inactivado por 239 Part. recomb. 2,6 S.R. UV/Psoralen de HIV inactivado N.T. S.R. 243 Part. recomb. de HIV inactivado 95.0 33.0 S.R. S.R. S.R.: sem reforço N.T.: não testado índice de estimulação: cpm3[H]TdR incorporado em PBL estimulado, dividido por cpm3[H]TdR incorporado em PBL estimulado

14.2.4. ANALISE DE MANCHA WESTERN DE REACTIVIDADE

DE ANTICORPOS A FIG. 17 apresenta os resultados de uma análise da reactividade de soros de coelhos imunizados em proteínas virais por mancha de Western. A resposta imunitária primária no soro, da 5§ semana, do coelho 238, era dirigida contra as proteínas gag apenas com reactividade da proteína envgp41 (FIG. 17, faixa 1). Ainda que, por ELISA, não se detectasse um efeito de reforço claro na amostra de soro da semana 7 no coelho 238, a análise de mancha Western mostra que houve uma redistribuição da resposta de 71 852 5624-148-118 -77- anticorpos entre as várias proteínas gag e a emergência de uma nova reactividade de anticorpos com as proteínas de HIV, de peso molecular mais elevado (FIG. 17, faixa 2). Em contraste, o efeito apreciável de reforço com vírus inactivado' (FIG. 17, faixa 3) foi principalmente devido à reactividade intensificada com as proteinas gag bem como com a proteína envgagl20. As faixas 5, 6 e 7 da FIG. 17 representam a reactividade de várias concentrações (1:100, 1:1000 e 1:10000, respectivamente) de soro humano misturado, de invidíduos seropositivos e servem como anticorpos de controlo. 15. EXEMPLO: PARTÍCULAS DE HIV-1 TORNADAS RECOMBINANTES LIGAM-SE E INTERNAM-SE DENTRO DE CÉLULAS CD4+

Descreve-se aqui uma experiência planeada para verificar se as partículas de HIV-1 tornadas recombinantes do invento se ligam ãs células CD4+ e entram por fusão com a membrana plásmica como o fazem os viriões HIV-1.

15.1 AVALIAÇÃO DA INTERNAÇÃO

Usaram-se neste ensaio células HeLa transfectadas com o gene codificador da molécula CD4. Estas células têm sido amplamente caracterizadas e mostrou-se que apoiam a produção de infecção pelo HIV-1. Desenvolveram-se células em monocamadas sobre uma lâmina de vidro, em meio de Eagle modificado com Dulbecco, suplementado com 10¾ de soro de vitela fetal. Lavaram-se as células com PBS/1% FCS e incubaram-se com 50 ug/ml de partículas de HIV-1 tornadas recombinantes, durante 2 h a 37°C. Lavaram-se muito bem as células e fixaram-se com solução de paraformaldeido a 3,7¾. As células fixadas foram incubadas com uma mistura, a uma diluição de 1:100, de anticorpos monoclonais que reage com as proteinas gpl20 e p24gag de HIV—1 durante 30 min a 22°C. As células foram, de novo, muito bem lavadas e incubadas com um soluto diluído a 1:50 de anticorpos de cabra, anti-ratinho, purificados por afinidade , conjugados com FITC. Após 30 min a 22°C as células foram lavadas com PUS/1% FCS e colocadas em meio de montagem para serem examinadas. As amostras foram analisadas por microscopia de varrimento de laser confocal (CLSM) para revelar coloração intracelular.

71 852 5624-148-118 -78-

15.2. RESULTftDOS

Os resultados do ensaio estão representados pelas microgra-fias CLS na FIG. 18. ft FIG. 18A mostra uma célula HeLaCD4+ exibindo fluorescência positiva após incubação com as partículas HIV-1 tornadas recombinantes. A FIG. 18B mostra a mesma célula seccionada por CLSM, partindo do topo da amostra e progredindo para a superfície da lâmina, em aumentos de 1 μ . Os painéis de micrografias mostram que a fluorescência aumenta à medida que se revela o ambiente intracelular, o que indica que as partículas de HIV-1 foram internadas após ligação. 16. EXEMPLO: IMUNQGENICIDADE DE PARTÍCULAS DE HIV-1 TORNADAS RECOMBINANTES EM PRIMATAS NÃO HUMANOS A seguir, examina-se a imunogenicidade das partículas de HIV-1 tornadas recombinantes numa espécie de primata não humano imunizado com partículas de HIV-1 tornadas recombinantes, com viribes de HIV-1 inactivados por psoralen/U.V. e com vírus vacínia recombinantes que expressem os antigénios de gag e env de HIV-1. Os resultados demonstram que as partículas de HIV-1 tornadas recombinantes originaram tanto respostas imunitárias humorais como mediadas por células, incluindo anticorpos neutra-lizadores para HIV-1.

16.1. PROTOCOLO DE IMUNIZAÇÃO

Doze símios de género Macaca (Macaca fascicularis^ foram imunizados com partículas de HIV-1 tornadas recombinantes, com viriões de HIV-1 inactivados pelo psoralen/U.V. ou com vírus vacínia recombinantes que expressem antigénios de gag e. env de HIV-1, de acordo com o seguinte esquema: / ,7” 71 852 5624-148-118 > /// fr -(/ - ✓/- , -·

"áT -79-

Grupo (n=2) Imunogénio pri-mário/adjuvante Imunogénio secun-dário/adjuvante Reforço na semana 1. v-G2E5/nenhum Particula/IFA 8 2. v-G2E5/nenhum rgpl60/IFA 8 3. Partícula/IFA Partícula/IFA 4 4. Partícula/DETOX Partícula/DETOX 4 5. HIV inactivado/IFA HIV inactivado/IFA 4 6. HIV inactivado/DETOX HIV inactivo/DETOX 4

As imunizações com virus vacinia recombinante vivo foram executadas com 1x10^ unidades formadoras de placa de V-G2E5 (Secção 7., supra) por animal inoculado por escarificação da pele. Cada dose de partículas semelhantes ao HIV tornadas recombinantes e de viriões de HIV inactivador por psoralen/U.V., continham um equivalente de 200 ug de p24, determinado pelo ensaio de captura de antigénio p24 (Genetics Systems) e aproxima-damente 6 ug de gpl20, determinados pelo ensaio de imunomancha. A gpl60 recombinante foi purificada a partir de células BSC-40 infectadas com virus vacinia recombinante expressando o mesmo antigénio, e foi usado a 6 ug por animal por imunização, o que é um nível de dose semelhante ao apresentado pelas partículas de HIV-1 tornadas recombinantes. Todos os imunogénios de partícula ou de subunidades foram formulados com o adjuvante incompleto de Freund (Difco) ou com DETOX (RIBI Imunobiochem) que continham monofosforil-lipido A destoxifiçado e esqueleto de paredes de células bacterianas. Todas as imunizações com partículas tornadas recombinantes, com viriões de HIV-1 inactivados ou com gpl60 recombinante foram executadas através de injecções intramusculares.

16.2. RESULTADOS

As respostas imunitárias ao HIV-1 produzidas por estes símios do género Macaca foram determinadas pelos seguintes ensaios: (1) anticorpos totais específicos para HIV-1, por ELISA de virião completo; (2) anticorpos específicos para o envelope

do HIV-1, por ELISA de gpl20; (3) anticorpos neutralizadores por imunoensaio focal; e (4) imunidade mediada por células, por resposta linfo-proliferativa ao estímulo por HIV-1. Os resultados estão resumidos na Tabela VIII. TABELA VIII RESPOSTAS IMUNITÁRIAS AO HIV-1 PRODUZIDAS POR SÍMIOS DO GÊNENO MACACA IMUNIZADOS Resposta ao anticorpo1 Grupo e imunização Animal HIV gpl20 Neut S.I.b 1 V-G2E5/ 89133 >25600 >1600 >400 2,1 Partícula 89149 12800 >1600 >400 115,4 2 V-G2E5/ 89147 1600 400 25 74,3 gpl60 89138 0 800 100 69,7 3 Partícula 88079 >51200 >800 25 3,9 (IFA) 89068 6400 >1600 25 50,0 4 Partícula 88116 800 1600 25 2,8 (DETOX) 89072 0 <25 0 4,6 5 HIV inactiv. 89150 12800 800 <25 4,7 (IFA) 89086 3200 <25 0 43,3 6 HIV inactiv. 89151 1600 1600 25 5,7 (DETOX) 89156 50 800 0 3,9 Macaco de Controlo 0 0 0 0,9 1 A resposta ao anticorpo foi determinada na 4ã semana após a imunização secundária, isto é, na semana 12 para os animais dos Grupos 1 e 2 e na semana 8 para os animais dos Grupos 3 a 6 b A resposta linfoproliferativa foi determinada na 4§ semana após a imunização primária. 0 índice de estimulação (S.I.) foi determinado dividindo c.p.m. ^H-timidina incorporada em células estimuladas pelo HIV-1, pelo c.p.m. incorporado em células não estimuladas.

Λ/ ¢: .íC

71 852 5624-148-118 -81-

Os resultados apresentados na Tabela VIII indicam que: (i) as partículas de HIV-1 tornadas recombinantes são imunogénicas e podem originar uma resposta imunitária específica para o HIV, particularmente quando usadas em animais previamente sensibilizados com vírus vacínia recombinante expressando ambos os antigéni-os de env e gag; (2) reforço de animais previamente sensibilizados com partículas de HIV-1 tornadas recombinantes foi mais eficaz a originar uma resposta imunitária do que o reforço com quantidades equivalentes de gpl60 solúvel, o que, muito provavelmente, se deve à apresentação efectiva de antigénios de envelope pelas partículas de HIV-1 tornadas recombinantes; e (3) quando usadas como único imunogénio nas imunizações primárias e secundárias, as partículas de HIV-1 tornadas recombinantes originam respostas imunitárias de anticorpo específico de HIV e de células T, na maioria dos simios género Macaca imunizados a níveis semelhantes aos imunizados com doses equivalentes de viriões inacti-vados de HIV-1.

17. DEPOSITO DE MICRORGANISMOS

Os seguintes vírus vacínia recombinantes foram depositados na "American Type Culture Collection", Rockville, MD, e foram--lhes atribuídos os seguintes números de acesso: Vírus recombinante NQ- de Acesso v-env5 VR 2113 v-gag2 VR 2265 V-G2E5

Os seguintes plasmídeos recombinantes foram depositados na NRRL, Peoria, Illinois e foram-lhes atribuídos os seguintes números de acesso:

Plasmídeos Hospedeiro NQ. de Acesso CMHiEnvS(1104-bl ) E. coli DH5a

CmHIVdelKpnAvr E. coli DH5a (Gag2TRE) (H60-a1 ) 0 presente invento não tem o seu âmbito limitado pelos vírus depositados uma vez que as concretizações depositadas pretendem ser apenas exemplos de um aspecto do invento e todos os que forem 71 852 5624-148-118 -82-

funcionalmente equivalentes estão dentro do âmbito do invento. De facto, para o perito na arte são evidentes várias modificações do invento, para além das aqui mostradas e descritas, a partir da descrição anterior e dos desenhos que a acompanham, Pretende-se que tais modificações caiam dentro do âmbito das reivindicações em anexo.

Entenda-se também que todos os pares de base e números de resíduos de aminoácidos e tamanhos dados para nucleótidos e péptidos são aproximados e são utilizados apenas para fins de descrição.

As posições de nucleótidos dadas para os genes de HIV-1 baseiam-se na sequência genómica do isolado LAV-BRU, N2. de acesso de Genebank K02013 (Wain-Hobson et al., 1985, Cell 40:9317).

Claims (54)

1. 71 852 5624-148-118 -83

   REIVINDICASSES 1 - Processo de produção de partículas retrovirais tornadas não replicativas, caracterizado por compreender: (a) a introdução de sequências nucleotídicas que codificam as proteínas do envelope, protease e core retroviral, numa célula de mamífero hospedeira; (b) a co-expressão das proteínas do envelope e do core retroviral maduras na célula de mamífero hospedeira; (c) a cultura da célula de mamífero hospedeira; e (d) a recuperação das partículas retrovirais tornadas recombinantes e não replicativas, do meio de cultura.
2. 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as sequências nucleotídicas que codificam as proteínas do core, da protease e do envelope retrovirais serem introduzidas na célula de mamífero por infecção com um vector virai vivo.
3. 3 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o vector virai vivo compreender um vírus vacínia recombi-nante.
4. 4 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o vector virai vivo compreender um retrovirus recombinante.
5. 5 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as sequências nucleotídicas que codificam as proteínas do core, da protease e do envelope retrovirais, serem introduzidas na célula de mamífero por transfecção com um vector de ADN.
6. 6 - Processo de produção de partículas de HIV tornadas recombinantes e não replicativas, caracterizado por compreender: (a) a co-infecção de urra célula de mamífero hospedeira com (i) pelo menos um vírus vacínia recombinante contendo um gene env de HIV e (ii) pelo menos um vírus vacínia recombinante contendo os genes gag e da protease de HIV; (b) a co-expressão dos produtos do gene, codificados por env e gag de HIV maduros na célula de mamífero hospedeira, infectada; 71 852 5624-148-118 84-

   (c) a cultura da célula de mamífero hospedeira, infectada; e (d) a recuperação das partículas de HIV tornadas recombi-nantes e não replicativas, do meio de cultura.
7. 7 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por compreender ainda a infecção da célula de mamífero hospedeira com pelo menos um vírus vacínia recombinante contendo pelo menos um gene de HIV seleccionado do grupo consistindo em tat, rev, vif, vpr e vpu.
8. 8 - Processo de acordo com as reivi ndicaçoes 6 ou 7, caracterizado por o gene env de HIV ser um gene env de HIV-1.
9. 9 - Processo de acordo com as reivindicações 6 ou 7, caracterizado por o gene env de HIV ser um gene env de HIV-2.
10. 10 - Processo de acordo com as reivi ndicaçoes 6 OU 7, caracterizado por o gene gag de HIV ser um gene gag de HIV-1.
11. 11 - Processo > de acordo com as reivi ndicaçoes 6 OU 7, caracterizado por o gene gag de HIV ser um gene gag de HIV-2.
12. 12 - Processo de acordo com as reivindicações 6 ou 7, caracterizado por o gene da protease de HIV ser um gene da protease de HIV-1.
13. 13 - Processo de acordo com as reivindicações 6 ou 7, caracterizado por o gene da protease de HIV ser um gene da protease de HIV-2.
14. 14 - Processo de produção de partículas de HIV tornadas recombinantes e não replicativas, caracterizado por compreender: (a) a infecção de uma célula de mamífero hospedeira com vírus vacínia recombinante contendo os genes env, gag e da protease de HIV; (b) a co-expressão dos produtos dos genes codificados por env e gag de HIV maduros na célula de mamífero hospedeira infectada; (c) a cultura da célula de mamífero hospedeira infectada; e 71 852 5624-148-118 -85-

    (d) a recuperação das partículas de HIV tornadas recombi-nantes e não replicativas, do meio de cultura.
15. 15 - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracteriza-do por compreender ainda a infecção da célula de mamífero hospedeira com pelo menos um vírus vacínia recombinante contendo pelo menos um gene de HIV, seleccionado do grupo consistindo em tat, rev, vif, vpr e vpu.
16. 16 - Processo de acordo com as reivindicações 14 ou 15, caracterizado por o gene env de HIV ser um gene env de HIV-1.
17. 17 - Processo de acordo com as reivindicações 14 ou 15, caracterizado por o gene env de HIV ser um gene env de HIV-2.
18. 18 - Processo de acordo com as reivindicações 14 ou 15, caracterizado por o gene gag de HIV ser um gene gag de HIV-1.
19. 19 - Processo de acordo com as reivindicações 14 ou 15, caracterizado por o gene gag de HIV ser um gene gag de HIV-2.
20. 20 - Processo de acordo com as reivindicações 14 ou 15, caracterizado por o gene da protease de HIV ser um gene da protease de HIV-1.
21. 21 - Processo de acordo com as reivindicações 14 ou 15, caracterizado por o gene da protease de HIV ser um gene da protease de HIV-2.
22. 22 - Processo de produção de partículas de HIV tornadas recombinantes e não replicativas, caracterizado por compreender: (a) a transfecção de uma célula de mamífero hospedeira com um plasmídeo recombinante contendo os genes env, gag e da protease de HIV; 0>) a co-expressão dos produtos de gene codificados por env e gag de HIV maduros, na célula de mamífero hospedeira transfec-tada; (c) a cultura da célula de mamífero hospedeira transfectada; e (d) a recuperação das partículas de HIV tornadas recombi- 71 852 5624-148-118

    -86-nantes e não replicativas, do meio de cultura.
23. 23 - Processo de acordo com a reivindicação 22, caracteriza-do por o plasmídeo recombinante também conter pelo menos um outro gene de HIV seleccionado do grupo consistindo em tat, rev, vif, vpr e vpu.
24. 24 - Processo de acordo com a reivindicação 22, caracteriza-do por compreender ainda a transfecção da célula de mamífero hospedeira com um plasmídeo recombinante contendo pelo menos um gene de HIV seleccionado do grupo consistindo em tat, rev, vif, vpr e vpu.
25. 25 - Processo de acordo com as reivindicações 22, 23 ou 24, caracterizado por o gene env de HIV ser um gene env de HIV-1.
26. 26 - Processo de acordo com as reivindicações 22, 23 ou 24, caracterizado por o gene env de HIV ser um gene env de HIV-2.
27. 27 - Processo de acordo com as reivindicações 22, 23 ou 24, caracterizado por o gene gag de HIV ser um gene gag de HIV-1.
28. 28 - Processo de acordo com as reivindicações 22, 23 ou 24, caracterizado por o gene gag de HIV ser um gene gag de HIV-2.
29. 29 - Processo de acordo com as reivindicações 22, 23 ou 24, caracterizado por o gene da protease de HIV ser um gene da protease de HIV-1.
30. 30 - Processo de acordo com as reivindicações 22, 23 ou 24, caracterizado por o gene da protease de HIV ser um gene da protease de HIV-2.
31. 31 - Processo de produção de partículas de HIV tornadas recombinantes e não replicativas, caracterizado por compreender: (a) a transfecção de uma célula de mamífero hospedeira com (i) um plasmídeo recombinante contendo pelo menos um gene env de HIV e (ii) um plasmideo recombinante contendo pelo menos os genes gag da protease de HIV; (b) a co-expressão dos produtos de gene codificados por env e gag de HIV, maduros, nas células de mamífero hospedeiras

    71 852 5624-148-118 -87-transfectadas; (c) a cultura da célula de mamífero hospedeira transfectada; e (d) a recuperação das partículas de HIV tornadas recombi-nantes e não replicativas do meio de cultura.
32. 32 - Processo de acordo com a reivindicação 31, caracteriza-do por compreender ainda a transfecção da célula de mamífero hospedeira com pelo menos um plasmídeo recombinante contendo pelo menos um gene de HIV seleccionado do grupo consistindo em tat, rev, vif, vpr e vpu.
33. 33 - Processo de acordo com as reivindicações 31 ou 32, caracterizado por o gene env de HIV ser um gene env de HIV-1.
34. 34 - Processo de acordo com as reivindicações 31 ou 32, caracterizado por o gene env de HIV ser um gene env de HIV-2.
35. 35 - Processo de acordo com as reivindicações 31 ou 32, caracterizado por o gene gag de HIV ser um gene gag de HIV-1.
36. 36 - Processo de acordo com as reivindicações 31 ou 32, caracterizado por o gene gag de HIV ser um gene gag de HIV-2.
37. 37 - Processo de acordo com as reivindicações 31 ou 32, caracterizado por o gene da protease de HIV ser um gene da protease de HIV-1.
38. 38 - Processo de acordo com as reivindicações 31 ou 32, caracterizado por o gene da protease de HIV ser um gene da protease de HIV-2.
39. 39 - Processo de acordo com as reivindicações 6, 14, 22 ou 31, caracterizado por o gene env de HIV codificar uma proteína gpl60 não clivada.
40. 40 - Processo de acordo com as reivindicações 6, 14, 22 ou 31, caracterizado por o gene env de HIV codificar uma proteína gpl60 truncada.
41. 41 - Processo de produção de partículas de HIV-1 tornadas recombinantes e não replicativas, caracterizado por compreender:

    71 852 5624-148-118 -88- (a) a co-infecção de uma célula hospedeira BSC-40 com vírus vacinia v-env5 e v-gag2, depositados no ATCC; (b) a cultura da célula BSC-40 infectada; e (c) a recuperação das partículas de HIV—1, tornadas recombi— nantes e não replicativas, do meio de cultura.
42. 42 - Processo de produção de partículas de HIV tornadas recombinante e não replicativas, caracterizado por compreender: (a) a co-expressão de proteínas estruturais codificadas em env de HIV e gag de HIV em células de mamífero; e (b) a recuperação das partículas de HIV tornadas recombi-nantes e não replicativas do meio de cultura.
43. 43 - Processo de produção de partículas de HIV-1 tornadas recombinantes e não replicativas, caracterizado por compreender: (a) a infecção de uma célula BSC-40 hospedeira com vírus vacinia recombinante V-G2E5, depositado no ATCC; (b) a cultura da célula BSC-40 infectada; e (c) a recuperação das partículas de HIV-1 tornadas recombinantes e não replicativas do meio de cultura.
44. 44 - Processo de produção de partículas de HIV-1 tornadas recombinantes e não replicativas, caracterizado por compreender: (a) a co-infecção de uma célula BSC-40 hospedeira com (i) vírus vacinia recombinante v-ED2 e (ii) vírus vacinia recombinante v-gag2; (b) a cultura da célula BSC-40 infectada; e (c) a recuperação das partículas de HIV-1 tornadas recombinantes e não replicativas do meio de cultura.
45. 45 - Processo de produção de partículas de HIV-1 tornadas recombinantes e não replicativas, caracterizado por compreender: (a) a co-infecção de uma célula BSC-40 hospedeira com (i) vírus vacinia recombinante V-ENV50CT e (ii) vírus vacinia 71 852 5624-148-118

    -89- recombinante v-gag2; (b) a cultura da célula BSC-40 infectada; e (c) a recuperação das partículas de HIV-1 tornadas recombi-nantes e não replicativas do meio de cultura.
46. 46 - Processo de produção de partículas de HIV-1 tornadas recombinantes e não replicativas, caracterizado por compreender: (a) a co-infecção de uma célula BSC-40 hospedeira com (i) vírus vacinia recornbinante V-160NC e (ii) virus vacinia recombi-nante v-gag2; (b) a cultura da célula BSC-40 infectada; e (c) a recuperação das partículas de HIV-1 tornadas recombinantes e não replicativas do meio de cultura.
47. 47 - Processo de produção de partículas de HIV-1 tornadas recombinantes e não replicativas, caracterizado por compreender: (a) a co-infecção de uma célula BSC-40 hospedeira com (i) virus vacinia recornbinante V-11K160NC e (ii) virus vacinia recom-binante v-gag2; (b) a cultura da célula BSC-40 infectada; e (c) a recuperação das partículas de HIV-1 tornadas recombinantes e não replicativas do meio de cultura.
48. 48 - Processo de produção de partículas de HIV-1 tornadas recombinantes e não replicativas, caracterizado por compreender: (a) a co-transfecção de uma célula de mamífero com os plasmídeos recombinantes CmHIVdelKpnAvr(Gag2TRE) (Il60-a1 ) e CmHiEnvS (Il04-b1), depositados no NRRL; (b) a co-expressão de produtos de gene codificados por env e gag de HIV, maduros, em células CHO transfectadas; (c) a cultura das células CHO transfectadas; e (d) a recuperação das partículas de HIV-1 tornadas recombinantes e não replicativas do meio de cultura.

    71 852 5624-148-118
49. 49 - Processo de produção de partículas de HIV-1 tornadas recombinantes e não replicativas, caracterizado por compreender: (a) a transfecção de uma célula de mamífero com os plasmíde-os recombinantes CmHIVdelKpnAvr(Gag2TRE) (Il60-a1) depositado no NRRL; (b) a co-expressão de produtos de gene codificados por env e gag de HIV, maduros, em células CHO transfectadas; (c) a cultura das células CHO transfectadas; e (d) a recuperação das partículas de HIV-1 tornadas recombinantes e não replicativas do meio de cultura.
50. 50 - Processo de produção de partículas de HIV-1 tornadas recombinantes e não replicativas, caracterizado por compreender: (a) a co-transfecção de uma célula de mamífero com os plas-mídeos recombinantes CmHiGag2Rre (1158-al) e CmHIVdelXmn (1133--al) depositados no NRRL; (b) a co-expressão de produtos de gene codificados por env e gag de HIV, maduros, em células CHO transfectadas; (c) a cultura das células CHO transfectadas; e (d) a recuperação das partículas de HIV-1 tornadas recombinantes e não replicativas do meio de cultura.
51. 51 - Processo de produção de partículas de HIV-1 tornadas recombinantes e não replicativas, caracterizado por compreender: (a) a co-transfecção de uma célula de mamífero com os plas-mideos recombinantes CmHIVdelXmn (1133-al) e CmvGag2Rre (1159--al) depositados no NRRL; (b) a co-expressão de produtos de gene codificados por env e gag de HIV, maduros, em células CHO transfectadas; (c) a cultura das células CHO transfectadas; e (d) a recuperação das partículas de HIV-1 tornadas recombinantes e não replicativas do meio de cultura. -91- 71 852 5624-148-118
52. 52 - Processo de produção de partículas de HIV-1 tornadas recombinantes e não replicativas, caracterizado por compreender: (a) a co-transfecção de uma célula de mamífero com os plas-mídeos recombinantes CmHiGag2Rre, CmHiEnv5, CmHiTat e CmHiRev depositados no NRRL; (b) a co-expressão de produtos de gene codificados por env e gag de HIV, maduros, em células CHO transfectadas; (c) a cultura das células CHO transfectadas; e (d) a recuperação das partículas de HIV—1 tornadas recombi— nantes e não replicativas do meio de cultura.
53. 53 - Processo de reduzir a infectividade de linfócitos CD4+ por Vírus da Imunodeficiência Humana, caracterizado por se tratarem, in vitro, linfócitos com partículas de HIV tornadas recombinantes e não replicativas numa quantidade eficaz para inibir a infecção por Vírus da Imunodeficiência Humana.
54. 54 - Processo de reduzir a infectividade de linfócitos CD4+ por um retrovírus humano, caracterizado por se tratarem, in vitro. linfócitos com partículas retrovirais tornadas recombinantes e não replicativas capazes de se ligarem ao receptor de CD4 da superfície celular numa quantidade eficaz para inibir a infecção pelo retrovírus humano. Lisboa, 20. a. 1>90 Por ONCOGEN LIMITED PARTNERSHIP - 0 AGENTE OFICIAL - .«a»»-