TW202206097A - 冠狀病毒抗原組成物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本揭露提供了包含含有編碼冠狀病毒抗原的序列的環狀多核糖核苷酸的組成物和方法，以及包含含有編碼冠狀病毒抗原的序列的線性多核糖核苷酸的組成物和方法。提供了與例如使用所揭露的環狀多核糖核苷酸或所揭露的線性多核糖核苷酸生成多株抗體有關的組成物和方法。

Description

冠狀病毒抗原組成物及其用途
迫切需要對冠狀病毒有活性的疫苗和治療劑。
本揭露總體上關於包含編碼冠狀病毒抗原的序列的環狀多核糖核苷酸和包含該環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物。本揭露進一步關於使用包含編碼冠狀病毒抗原的序列的該環狀多核糖核苷酸和該免疫原性組成物之方法。在一些實施方式中，本揭露之環狀多核糖核苷酸和免疫原性組成物用於生成多株抗體之方法中。所產生的多株抗體可用於受試者（例如，人類受試者）的預防方法中或治療具有冠狀病毒感染的受試者（例如，人類受試者）之方法中。所產生的多株抗體可以投與給處於暴露於冠狀病毒感染的高風險中的受試者。
本揭露還關於包含編碼選自表3的SEQ ID NO的序列的線性多核糖核苷酸和包含該線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物。本揭露進一步關於使用包含編碼冠狀病毒抗原的序列的該線性多核糖核苷酸和包含該線性多核糖核苷酸的該免疫原性組成物之方法。在一些實施方式中，本揭露之線性多核糖核苷酸和免疫原性組成物用於生成多株抗體之方法中。所產生的多株抗體可用於受試者（例如，要治療的人類受試者）的預防方法中或治療具有冠狀病毒感染的受試者（例如，要治療的人類受試者）之方法中。所產生的多株抗體可以投與給處於暴露於冠狀病毒感染的高風險中的要治療的受試者。
一方面，本發明的特徵在於一種組成物（例如免疫原性組成物），該組成物包含 (a) 環狀多核糖核苷酸，該環狀多核糖核苷酸包含編碼冠狀病毒抗原的序列，例如選自表1或表2中的SEQ ID NO.的序列，或 (b) 線性多核糖核苷酸，該線性多核糖核苷酸包含選自表3中的SEQ ID NO.的序列。
在一個實施方式中，該組成物進一步包含來自非人類動物（例如，包含人源化免疫系統的非人類動物）或人類受試者（例如，在要免疫接種的受試者進行免疫接種之後）的血漿。
在一個實施方式中，該組成物進一步包含來自非人類動物（例如，包含人源化免疫系統的非人類動物）的血漿和冠狀病毒抗原（例如，在要免疫接種的非人類動物受試者進行免疫接種之後）。在一個實施方式中，該組成物進一步包含來自人類受試者的血漿（例如，在要免疫接種的人類受試者進行免疫接種之後）和冠狀病毒抗原。
在一些實施方式中，該組成物進一步包含含有人源化免疫球蛋白基因座和人源化B細胞受體的非人B細胞，其中該人源化B細胞受體與該冠狀病毒抗原結合。在一些實施方式中，該組成物或免疫原性組成物進一步包含多個非人B細胞，其中該多個非人B細胞中的非人B細胞包含人源化免疫球蛋白基因座，其中該多個非人B細胞包含與冠狀病毒抗原的第一表位結合的第一B細胞和與冠狀病毒抗原的第二表位結合的第二B細胞。
在一些實施方式中，該冠狀病毒抗原來自β冠狀病毒或其片段，或來自沙貝科病毒（sarbecovirus）或其片段。在一些實施方式中，該冠狀病毒抗原來自嚴重急性呼吸綜合症（SARS）相關冠狀病毒或其片段。在一些實施方式中，該冠狀病毒抗原來自嚴重急性呼吸道症候群2（SARS-CoV-2）或其片段、嚴重急性呼吸道症候群1（SARS-CoV-1）或其片段、或中東呼吸症候群冠狀病毒（MERS-CoV）或其片段。
在一些實施方式中，該冠狀病毒抗原係膜蛋白或其變體或片段、病毒的包膜蛋白或其變體或片段、病毒的刺突蛋白或其變體或片段、病毒的核衣殼蛋白或其變體或其片段、病毒的輔助蛋白或其變體或片段。在一些實施方式中，該冠狀病毒抗原係刺突蛋白或其變體或片段的受體結合結構域。在一些實施方式中，該刺突蛋白缺乏裂解位點。在一些實施方式中，冠狀病毒的輔助蛋白選自由ORF3a、ORF7a、ORF7b、ORF8、ORF10或其任何變體或片段組成之群組。在一些實施方式中，該冠狀病毒抗原包含與選自表1的序列或選自表2的SEQ ID NO.的序列具有至少約80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%的序列同一性的序列。在一些實施方式中，該環狀多核糖核苷酸包含與選自表2的SEQ ID NO.的序列具有至少約80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%的序列同一性的序列。
在一些實施方式中，該多核糖核苷酸包含多個序列，每個序列均編碼抗原，並且該多個序列中的至少一個序列編碼冠狀病毒抗原。在一些實施方式中，該環狀多核糖核苷酸包含兩個或更多個ORF。在一些實施方式中，該環狀多核糖核苷酸包含至少五個序列，每個序列均編碼抗原並且該等抗原中的至少一種抗原係冠狀病毒抗原。在一些實施方式中，該環狀多核糖核苷酸包含至少兩個ORF，例如至少2、3、4或5個ORF。在一些實施方式中，該環狀多核糖核苷酸包含5至20個序列，每個序列均編碼抗原並且該等抗原中的至少一種抗原係冠狀病毒抗原。在一些實施方式中，該環狀多核糖核苷酸包含5至10個序列，每個序列均編碼抗原並且該等抗原中的至少一種抗原係冠狀病毒抗原。在一些實施方式中，該環狀多核糖核苷酸包含編碼來自至少兩種不同微生物的抗原的序列，並且至少一種微生物係冠狀病毒。在一些實施方式中，該線性多核糖核苷酸包含編碼兩種或更多種抗原的序列並且至少一種抗原係由表3中的SEQ ID NO.的序列編碼的冠狀病毒抗原。在一些實施方式中，該線性多核糖核苷酸包含編碼至少2、3、4或5種抗原的序列，並且至少一種抗原係由表3中的SEQ ID NO.的序列編碼的冠狀病毒抗原。在一些實施方式中，該冠狀病毒抗原包含表位。在一些實施方式中，該冠狀病毒抗原包含被B細胞識別的表位。在一些實施方式中，該冠狀病毒抗原包含至少兩個表位。
在一些實施方式中，包含環狀多核糖核苷酸的組成物或免疫原性組成物進一步包含含有編碼第二抗原的序列的第二環狀多核糖核苷酸。在一些實施方式中，該組成物或免疫原性組成物進一步包含含有第二ORF的第二環狀多核糖核苷酸。在一些實施方式中，該組成物或免疫原性組成物進一步包含含有編碼第三、第四或第五抗原的序列的第三、第四或第五環狀多核糖核苷酸。在一些實施方式中，該組成物或免疫原性組成物進一步包含含有編碼第二抗原的序列的第二線性多核糖核苷酸。在一些實施方式中，包含該線性多核糖核苷酸的該組成物或免疫原性組成物進一步包含含有第二ORF的第二線性多核糖核苷酸。在一些實施方式中，該組成物或免疫原性組成物進一步包含含有編碼第三、第四或第五抗原的序列的第三、第四或第五線性多核糖核苷酸。在一些實施方式中，該第一抗原、第二抗原、第三抗原、第四抗原和第五抗原係不同的抗原。
在一些實施方式中，該組成物或免疫原性組成物進一步包含藥學上可接受的載劑或賦形劑。在一些實施方式中，該多核糖核苷酸在沒有載劑的情況下投與（「裸露」）。在其他實施方式中，該多核糖核苷酸與載劑例如LNP、VLP、脂質體等一起配製。
在一些實施方式中，該組成物進一步包含佐劑。在一些實施方式中，該組成物或免疫原性組成物進一步包含稀釋劑。在一些實施方式中，該組成物或免疫原性組成物進一步包含魚精蛋白。
另一方面，本發明的特徵在於包括以下步驟之方法：(a) 向非人類動物或向人類受試者投與本文所述之組成物（例如，包含以下的組成物：(i) 環狀多核糖核苷酸，該環狀多核糖核苷酸包含編碼冠狀病毒抗原的序列，例如選自表1、2或3中的SEQ ID NO.的序列，或 (ii) 線性多核糖核苷酸，該線性多核糖核苷酸包含選自表3中的SEQ ID NO.的序列）（例如，以誘導針對該抗原的免疫反應或在要免疫接種的非人類動物或人類受試者中產生針對該抗原的多株抗體）以及 (b) 視需要，從該非人類動物或該人類受試者（例如，要免疫接種的非人類動物或人類受試者）收集針對該抗原的抗體。
在一些實施方式中，該方法進一步包括向非人類動物或向人類受試者（例如，要免疫接種的非人類動物或人類受試者）投與佐劑（例如，Addavax™ 佐劑、MF59、AS03、弗氏完全佐劑（complete Freund’s adjuvant））。該佐劑可以與該多核糖核苷酸共同配製和共同投與，或者它可以分開配製和投與。
在一些實施方式中，該方法進一步包括用藥劑（例如抗原）對非人類動物或人類受試者（例如，要免疫接種的非人類動物或人類受試者）預先投與（初免）以改善免疫原性反應。例如，該方法包括在投與包含編碼該抗原的序列的多核糖核苷酸之前（例如，1-7天，例如，1、2、3、4、5、6、7天之前）向非人類動物或人類受試者（例如，要免疫接種的非人類動物或人類受試者）投與蛋白質抗原。該蛋白質抗原可以作為蛋白質製劑投與，或在質體（pDNA）中編碼，或存在於病毒樣顆粒（VLP）中，以脂質奈米顆粒（LNP）的形式配製等。
在一些實施方式中，該方法進一步包括為受試者（例如，要免疫接種的受試者）投與或免疫接種魚精蛋白。
在一些實施方式中，該多核糖核苷酸在沒有載劑的情況下投與（「裸露」）。在其他實施方式中，該多核糖核苷酸與載劑例如LNP、VLP、脂質體等一起配製。
在一些實施方式中，該方法進一步包括為受試者（例如，要免疫接種的受試者）投與或免疫接種多核糖核苷酸（例如，環狀或線性多核糖核苷酸）至少兩次，例如2、3、4、5次。
在一些實施方式中，該方法進一步包括從受試者收集血漿（例如，在要免疫接種的受試者進行免疫接種之後）。在一些實施方式中，該方法進一步包括從受試者中純化多株抗體（例如，在要免疫接種的受試者進行免疫接種之後）。在一些實施方式中，該方法進一步包括為受試者（例如，要免疫接種的受試者）投與或免疫接種疫苗。在一些實施方式中，該疫苗係肺炎球菌多糖疫苗（例如，PCV13或PPSV23）。在一些實施方式中，該疫苗用於細菌感染。在一些實施方式中，該受試者（例如，要免疫接種的受試者）藉由注射免疫接種環狀RNA。在一些實施方式中，該受試者（例如，要免疫接種的受試者）藉由注射免疫接種線性RNA。
在實施方式中，受試者係人類受試者（例如，要免疫接種的人類受試者）。在一些實施方式中，人類受試者（例如，要免疫接種的人類受試者）係處於冠狀病毒相關疾病風險中的受試者，例如，50歲以上的人；免疫受損的人；患有諸如肥胖症、糖尿病、癌症等慢性健康病狀的人；衛生保健工作者。
在實施方式中，受試者係非人類動物（例如，要免疫接種的非人類動物）。在一些實施方式中，該非人類動物（例如，要免疫接種的非人類動物）係農業動物，例如牛、豬、綿羊、馬、山羊；寵物，例如貓或狗；或動物園動物，例如貓科動物。
在一些實施方式中，該非人類動物（例如，要免疫接種的非人類動物）係哺乳動物，例如齧齒動物（例如，兔、大鼠或小鼠），或有蹄類動物（例如，豬、牛、山羊或綿羊）。在一些實施方式中，該非人類動物（例如，要免疫接種的非人類動物）係包含人源化免疫球蛋白基因座的轉染色體非人類動物。在一些實施方式中，該非人類動物係包含人類人工染色體（HAC）載體的轉染色體牛，該載體包含人源化免疫球蛋白基因座。在一些實施方式中，該人源化免疫球蛋白基因座編碼免疫球蛋白重鏈。在一些實施方式中，該人源化免疫球蛋白重鏈包含IgG同種型重鏈。在一些實施方式中，該人源化免疫球蛋白重鏈包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同種型重鏈。
在一些實施方式中，該非人類動物（例如，要免疫接種的非人類動物）包含具有B細胞受體的B細胞，該B細胞受體與冠狀病毒抗原結合。在一些實施方式中，該非人類動物包含多個B細胞，包括與冠狀病毒抗原的第一表位結合的第一B細胞和與冠狀病毒抗原的第二表位結合的第二B細胞。
在一些實施方式中，該非人類動物（例如，要免疫接種的非人類動物）包含T細胞，其中該T細胞包含與冠狀病毒抗原結合的T細胞受體。在一些實施方式中，在活化後，該T細胞增強與該抗原結合的抗體的產生。在一些實施方式中，在活化後，該T細胞增強與該冠狀病毒抗原結合的B細胞的抗體產生。在一些實施方式中，在活化後，該T細胞增強與冠狀病毒抗原結合的B細胞的存活、增殖、漿細胞分化、體細胞超突變、免疫球蛋白類別轉換或其組合。
在一些實施方式中，該非人類動物或人類受試者（例如，要免疫接種的非人類動物或人類受試者）產生與冠狀病毒抗原特異性結合的抗體。在一些實施方式中，該抗體係人源化抗體或全人抗體。在一些實施方式中，該抗體係IgG、IgA或IgM同種型抗體。在一些實施方式中，該抗體係IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同種型抗體。在一些實施方式中，該非人類動物（例如，要免疫接種的非人類動物）包含特異性結合至少兩個由環狀多核糖核苷酸編碼的表位的多種多株抗體。在一些實施方式中，該非人類動物或人類受試者（例如，要免疫接種的非人類動物或人類受試者）包含特異性結合至少兩個由線性RNA編碼的表位的多種多株抗體。在一些實施方式中，該多種抗體包括人源化抗體。在一些實施方式中，該多種多株抗體包含全人抗體。在一些實施方式中，該多種多株抗體包括IgG抗體、IgG1抗體、IgG2抗體、IgG3抗體、IgG4抗體、IgM抗體、IgA抗體或其組合。在一些實施方式中，免疫球蛋白重鏈包括IgM或IgA同種型重鏈。在一些實施方式中，該人源化免疫球蛋白基因座編碼免疫球蛋白輕鏈。在一些實施方式中，免疫球蛋白輕鏈包括κ輕鏈或λ輕鏈。
在一些實施方式中，該方法進一步包括從非人類動物或人類受試者中收集血液（例如，在對要免疫接種的非人類動物或人類受試者進行免疫接種之後），並從血液中純化針對該抗原的抗體。
另一方面，本發明的特徵在於一種抗冠狀病毒抗體製劑（例如，多株抗體製劑），該製劑藉由以下方式產生：(a) 將包含本文所述之多核糖核苷酸的組成物投與給本文所述之非人類動物（例如，具有如本文所述之人源化免疫系統的牛）或人類受試者（例如，要免疫接種的非人類動物或人類受試者），以及 (b) 從該非人類動物或人類受試者收集針對該抗原的抗體（例如，在對要免疫接種的非人類動物或人類受試者進行免疫接種之後）。
在實施方式中，該多核糖核苷酸係 (a) 環狀多核糖核苷酸，該環狀多核糖核苷酸包含編碼冠狀病毒抗原的序列，例如選自表1、2或3中的SEQ ID NO.的序列，或 (b) 線性多核糖核苷酸，該線性多核糖核苷酸包含選自表3中的SEQ ID NO.的序列。
在實施方式中，將抗體製劑配製成藥物組成物。
另一方面，本發明的特徵在於一種將針對冠狀病毒的抗體遞送至具有冠狀病毒感染、處於暴露於冠狀病毒感染的風險中或有此需要的受試者（例如，要治療的受試者）之方法，例如，預防或治療受試者（例如，要治療的受試者）的冠狀病毒感染之方法。該方法包括向具有冠狀病毒感染、處於暴露於冠狀病毒感染的風險中或有此需要的受試者（例如，要治療的受試者）投與從具有人類或人源化免疫系統的動物（例如，哺乳動物）產生的多株抗體，該動物已經免疫接種了本文所述之多核糖核苷酸，例如 (a) 環狀多核糖核苷酸，該環狀多核糖核苷酸包含編碼冠狀病毒抗原的序列，例如選自表1、2或3中的SEQ ID NO.的序列，或 (b) 線性多核糖核苷酸，該線性多核糖核苷酸包含選自表3中的SEQ ID NO.的序列。
在某些實施方式中，該方法進一步包括以下一項或多項：為已經遺傳修飾以產生人抗體的非人類動物（例如，要免疫接種的非人類動物）免疫接種本文揭露的多核糖核苷酸，從該非人類動物中收集血液，從該非人類動物中純化抗體，配製抗體作藥物用途，並將配製的抗體投與給人類受試者（例如，要治療的人類受試者）。
在一些實施方式中，具有人類或人源化免疫系統的哺乳動物係人（例如，要免疫接種的人類受試者）。
在一些實施方式中，具有人類或人源化免疫系統的哺乳動物係已經遺傳修飾以產生人抗體的非人類動物，例如包含人源化免疫球蛋白基因座的非人類動物，例如包含含有人免疫球蛋白基因座的人類人工染色體（HAC）載體的轉染色體牛。
在實施方式中，具有冠狀病毒感染或有此需要的受試者（例如，要治療的受試者）係診斷患有冠狀病毒相關疾病，例如Covid-19、SARS、MERS的人類受試者。在一些實施方式中，處於暴露於冠狀病毒感染的風險中或有此需要的受試者（例如，要治療的受試者）係處於冠狀病毒相關疾病風險中的受試者，例如50歲以上的人；免疫受損的人；患有諸如肥胖症、糖尿病、癌症等慢性健康病狀的人；衛生保健工作者。
在一些實施方式中，投與或免疫接種係在暴露於冠狀病毒的風險之前、之後或同時進行。
在一些實施方式中，該方法進一步包括例如在投與之前和/或之後監測人類受試者（例如，要治療的受試者）是否存在針對冠狀病毒的抗體。
在下面列舉的段落中描述了本發明的示例性實施方式。
E1. 一種免疫原性組成物，該免疫原性組成物包含： a) 包含編碼冠狀病毒抗原的序列的環狀多核糖核苷酸；或 b) 包含選自SEQ ID NO: 13、15和12中的任一個的序列的線性多核糖核苷酸。
E2. 一種免疫原性組成物，包含含有編碼冠狀病毒抗原的序列的環狀多核糖核苷酸，其中該冠狀病毒抗原包含與選自SEQ ID NO: 1-10、13、15、17、19、21、23、25-30、48和49中的任一個的冠狀病毒抗原具有至少約80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%的序列同一性的序列，或該環狀多核糖核苷酸包含與選自SEQ ID NO: 12、14、16、18、20、22和24的環狀多核糖核苷酸具有至少約80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%的序列同一性的序列。
E3. 如前述實施方式中任一項所述之免疫原性組成物，該免疫原性組成物進一步包含來自非人類動物（例如，包含人源化免疫系統的非人類動物；例如，要免疫接種的非人類動物）或人類受試者（例如，要免疫接種的人類受試者）的血漿。
E4. 如前述實施方式中任一項所述之免疫原性組成物，該免疫原性組成物進一步包含該冠狀病毒抗原。
E5. 如前述實施方式中任一項所述之免疫原性組成物，其中該組成物進一步包含含有人源化免疫球蛋白基因座和人源化B細胞受體的非人B細胞，其中該人源化B細胞受體與該冠狀病毒抗原結合。
E6. 如前述實施方式中任一項所述之免疫原性組成物，其中該組成物進一步包含多個非人B細胞，其中該多個非人B細胞中的非人B細胞包含人源化免疫球蛋白基因座，其中該多個B細胞包含與該冠狀病毒抗原的第一表位結合的第一B細胞和與該冠狀病毒抗原的第二表位結合的第二B細胞。
E7. 如前述實施方式中任一項所述之免疫原性組成物，其中該冠狀病毒抗原來自β冠狀病毒或其片段，或來自沙貝科病毒或其片段。
E8. 如前述實施方式中任一項所述之免疫原性組成物，其中該冠狀病毒抗原來自嚴重急性呼吸綜合症相關冠狀病毒或其片段。
E9. 如前述實施方式中任一項所述之免疫原性組成物，其中該冠狀病毒抗原來自嚴重急性呼吸綜合症（SARS）相關冠狀病毒或其片段。
E10. 如前述實施方式中任一項所述之免疫原性組成物，其中該冠狀病毒抗原來自嚴重急性呼吸道症候群2（SARS-CoV-2）或其片段、嚴重急性呼吸道症候群1（SARS-CoV-1）或其片段、或中東呼吸症候群冠狀病毒（MERS-CoV）或其片段。
E11. 如前述實施方式中任一項所述之免疫原性組成物，其中該冠狀病毒抗原係膜蛋白或其變體或片段、病毒的包膜蛋白或其變體或片段、病毒的刺突蛋白或其變體或片段、病毒的核衣殼蛋白或其變體或其片段、病毒的輔助蛋白或其變體或片段。
E12. 如前述實施方式中任一項所述之免疫原性組成物，其中該冠狀病毒抗原係刺突蛋白或其變體或片段的受體結合結構域。
E13. 如實施方式8所述之免疫原性組成物，其中該刺突蛋白缺乏裂解位點。
E14. 如前述實施方式中任一項所述之免疫原性組成物，其中冠狀病毒的輔助蛋白選自由ORF3a、ORF7a、ORF7b、ORF8、ORF10或其任何變體或片段組成之群組。
E15. 如前述實施方式中任一項所述之免疫原性組成物，其中該環狀多核糖核苷酸包含多個序列，每個序列均編碼抗原，並且至少一個序列編碼冠狀病毒抗原。
E16. 如前述實施方式中任一項所述之免疫原性組成物，其中該環狀多核糖核苷酸包含兩個或更多個ORF。
E17. 如前述實施方式中任一項所述之免疫原性組成物，其中該環狀多核糖核苷酸包含至少五個序列，每個序列均編碼抗原，並且至少一個抗原係冠狀病毒抗原。
E18. 如前述實施方式中任一項所述之免疫原性組成物，其中該環狀多核糖核苷酸包含至少兩個ORF（例如，至少2、3、4或5個）。
E19. 如前述實施方式中任一項所述之免疫原性組成物，其中該環狀多核糖核苷酸包含編碼來自至少兩種不同微生物的抗原的序列，並且至少一種微生物係冠狀病毒。
E20. 如前述實施方式中任一項所述之免疫原性組成物，其中該線性多核糖核苷酸包含編碼兩種或更多種抗原的序列並且至少一種抗原係該冠狀病毒抗原。
E21. 如前述實施方式中任一項所述之免疫原性組成物，其中該線性多核糖核苷酸包含編碼至少2、3、4或5種抗原的序列，並且至少一種抗原係由表3中的SEQ ID NO.的序列編碼的冠狀病毒抗原。
E22. 如前述實施方式中任一項所述之免疫原性組成物，其中該冠狀病毒抗原包含表位。
E23. 如前述實施方式中任一項所述之免疫原性組成物，其中該冠狀病毒抗原包含被B細胞識別的表位。
E24. 如前述實施方式中任一項所述之免疫原性組成物，其中該冠狀病毒抗原包含至少兩個表位。
E25. 如前述實施方式中任一項所述之免疫原性組成物，該免疫原性組成物進一步包含含有編碼第二抗原的序列的第二環狀多核糖核苷酸。
E26. 如前述實施方式中任一項所述之免疫原性組成物，該免疫原性組成物進一步包含含有第二ORF的第二環狀多核糖核苷酸。
E27. 如前述實施方式中任一項所述之免疫原性組成物，該免疫原性組成物進一步包含含有編碼第三、第四或第五抗原的序列的第三、第四或第五環狀多核糖核苷酸。
E28. 如前述實施方式中任一項所述之免疫原性組成物，該免疫原性組成物進一步包含含有編碼第二抗原的序列的第二線性多核糖核苷酸。
E29. 如前述實施方式中任一項所述之免疫原性組成物，該免疫原性組成物進一步包含含有第二ORF的第二線性多核糖核苷酸。
E30. 如前述實施方式中任一項所述之免疫原性組成物，該免疫原性組成物進一步包含含有編碼第三、第四或第五抗原的序列的第三、第四或第五線性多核糖核苷酸。
E31. 如前述實施方式中任一項所述之免疫原性組成物，其中該第一抗原、第二抗原、第三抗原、第四抗原和第五抗原係不同的抗原。
E32. 如前述實施方式中任一項所述之免疫原性組成物，其中該免疫原性組成物進一步包含藥學上可接受的載劑或賦形劑。
E33. 如前述實施方式中任一項所述之免疫原性組成物，其中該免疫原性組成物進一步包含藥學上可接受的賦形劑且不含任何載劑。
E34. 如前述實施方式中任一項所述之免疫原性組成物，其中該環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸或免疫原性組成物與載劑（例如，脂質奈米顆粒、病毒樣顆粒或脂質體）一起配製。
E35. 如前述實施方式中任一項所述之免疫原性組成物，其中該免疫原性組成物進一步包含佐劑。
E36. 如實施方式35所述之免疫原性組成物，其中該佐劑係皂苷或油乳劑。
E37. 如實施方式36所述之免疫原性組成物，其中該油乳劑係角鯊烯-水乳劑（例如，Addavax™佐劑、MF59或AS03）。
E38. 如前述實施方式中任一項所述之免疫原性組成物，其中該免疫原性組成物進一步包含稀釋劑。
E39. 一種將免疫原性組成物遞送至非人類動物或人類受試者（例如，要免疫接種的非人類動物或人類受試者）之方法，該方法包括：a) 向該非人類動物或人類受試者投與如前述實施方式中任一項所述之免疫原性組成物，以及b) 視需要，從該非人類動物或人類受試者收集針對該冠狀病毒抗原的抗體。
E40. 一種在非人類動物或人類受試者（例如，要免疫接種的非人類動物或人類受試者）中誘導針對冠狀病毒抗原的免疫反應之方法，該方法包括：a) 向該非人類動物或人類受試者投與如前述實施方式中任一項所述之免疫原性組成物，以及b) 視需要，從該非人類動物或人類受試者中收集針對該冠狀病毒抗原的抗體。
E41. 如前述實施方式中任一項所述之方法，該方法進一步包括向該非人類動物或人類受試者（例如，要免疫接種的非人類動物或人類受試者）投與佐劑。
E42. 如實施方式41所述之方法，其中該佐劑與該免疫原性組成物共同配製和共同投與，或者與該免疫原性組成物分開配製和投與。
E43. 如前述實施方式中任一項所述之方法，該方法進一步包括在投與該免疫原性組成物之前用該冠狀病毒抗原對該非人類動物或人類受試者（例如，要免疫接種的非人類動物或人類受試者）投與（例如，預先投與或初免）。
E44. 如前述實施方式中任一項所述之方法，該方法進一步包括在投與該免疫原性組成物1至7天前（例如，1、2、3、4、5、6或7天前）向該非人類動物或人類受試者（例如，要免疫接種的非人類動物或人類受試者）投與該冠狀病毒抗原。
E45. 如前述實施方式中任一項所述之方法，其中該冠狀病毒抗原作為蛋白質製劑投與，在質體（pDNA）中編碼，存在於病毒樣顆粒（VLP）中，或以脂質奈米顆粒（LNP）的形式配製等。
E46. 如前述實施方式中任一項所述之方法，該方法進一步包括在沒有載劑的情況下投與該環狀多核糖核苷酸或線性多核糖核苷酸。
E47. 如前述實施方式中任一項所述之方法，該方法進一步包括用載劑（例如，脂質奈米顆粒、病毒樣顆粒或脂質體）配製該免疫原性組成物。
E48. 如前述實施方式中任一項所述之方法，該方法進一步包括向該非人類動物或人類受試者（例如，要免疫接種的非人類動物或人類受試者）投與或免疫接種該環狀多核糖核苷酸或線性多核糖核苷酸至少兩次（例如，2、3、4或5次）。
E49. 如前述實施方式中任一項所述之方法，該方法進一步包括從該非人類動物或人類受試者（例如，要免疫接種的非人類動物或人類受試者）收集血漿。
E50. 如前述實施方式中任一項所述之方法，該方法進一步包括從非人類動物或人類受試者（例如，要免疫接種的非人類動物或人類受試者）的血漿中純化多株抗體。
E51. 如前述實施方式中任一項所述之方法，該方法進一步包括為該非人類動物或人類受試者（例如，要免疫接種的非人類動物或人類受試者）投與或免疫接種疫苗。
E52. 如實施方式51所述之方法，其中該疫苗係肺炎球菌多糖疫苗（例如，PCV13或PPSV23）。
E53. 如實施方式51所述之方法，其中該疫苗用於細菌感染。
E54. 如前述實施方式中任一項所述之方法，其中該非人類動物或人類受試者（例如，要免疫接種的非人類動物或人類受試者）藉由注射免疫接種該環狀多核糖核苷酸或線性多核糖核苷酸。
E55. 如前述實施方式中任一項所述之方法，其中該人類受試者（例如，要免疫接種的人類受試者）處於患冠狀病毒相關疾病的風險中。
E56. 如前述實施方式中任一項所述之方法，其中該人類受試者（例如，要免疫接種的人類受試者）係50歲以上的人、免疫受損的人、患有慢性健康病狀（例如，肥胖症、糖尿病、癌症）的人或衛生保健工作者。
E57. 如前述實施方式中任一項所述之方法，其中該非人類動物（例如，要免疫接種的非人類動物受試者）係農業動物（例如，豬、牛、山羊、雞、綿羊）。
E58. 如前述實施方式中任一項所述之方法，其中該非人類動物（例如，要免疫接種的非人類動物受試者）係寵物（例如，狗或貓）、動物園動物（例如，貓科動物）、哺乳動物（例如有蹄類動物（例如，豬、牛、山羊、綿羊）、齧齒動物（例如兔子、大鼠、小鼠）。
E59. 如前述實施方式中任一項所述之方法，其中該非人類動物係包含人源化免疫球蛋白基因座的轉染色體非人類動物。
E60. 如實施方式59所述之方法，其中該非人類動物係包含人類人工染色體（HAC）載體的轉染色體牛，該載體包含人源化免疫球蛋白基因座。
E61. 如實施方式59或60中任一項所述之方法，其中該人源化免疫球蛋白基因座編碼免疫球蛋白重鏈。
E62. 如實施方式61所述之方法，其中該人源化免疫球蛋白重鏈包含IgG同種型重鏈。
E63. 如實施方式61或62中任一項所述之方法，其中該人源化免疫球蛋白重鏈包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同種型重鏈。
E64. 如實施方式59-63中任一項所述之方法，其中該人源化免疫球蛋白基因座編碼免疫球蛋白輕鏈。
E65. 如實施方式64所述之方法，其中該免疫球蛋白輕鏈包含κ輕鏈或λ輕鏈。
E66. 如前述實施方式中任一項所述之方法，其中該非人類動物包含具有B細胞受體的B細胞，並且其中該B細胞受體與該抗原結合。
E67. 如前述實施方式中任一項所述之方法，其中該非人類動物包含多個B細胞，包括與冠狀病毒抗原的第一表位結合的第一B細胞和與冠狀病毒抗原的第二表位結合的第二B細胞。
E68. 如前述實施方式中任一項所述之方法，其中該非人類動物包含T細胞，並且其中該T細胞包含與該冠狀病毒抗原結合的T細胞受體。
E69. 如前述實施方式中任一項所述之方法，其中在活化後，該T細胞增強與該冠狀病毒抗原結合的抗體的產生。
E70. 如前述實施方式中任一項所述之方法，其中在活化後，該T細胞增強與該冠狀病毒抗原結合的B細胞的抗體產生。
E71. 如前述實施方式中任一項所述之方法，其中在活化後，該T細胞增強與冠狀病毒抗原結合的B細胞的存活、增殖、漿細胞分化、體細胞超突變、免疫球蛋白類別轉換或其組合。
E72. 如前述實施方式中任一項所述之方法，該方法進一步包括從該非人類動物或人類受試者（例如，要免疫接種的非人類動物或人類受試者）的血漿中純化針對該冠狀病毒抗原的多株抗體。
E73. 如前述實施方式中任一項所述之方法，其中該等多株抗體中的一種抗體與該冠狀病毒抗原特異性結合。
E74. 如前述實施方式中任一項所述之方法，其中該等多株抗體中的一種抗體係人源化抗體或全人抗體。
E75. 如前述實施方式中任一項所述之方法，其中該等多株抗體中的一種抗體係IgG、IgG、IgA或IgM同種型抗體。
E76. 如前述實施方式中任一項所述之方法，其中該等多株抗體中的一種抗體係IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同種型抗體。
E77. 如前述實施方式中任一項所述之方法，其中該非人類動物包含特異性結合至少兩個由該環狀多核糖核苷酸編碼的表位的多種多株抗體。
E78. 如前述實施方式中任一項所述之方法，其中該非人類動物包含特異性結合至少兩個由該線性多核糖核苷酸編碼的表位的多種多株抗體。
E79. 如實施方式75或76中任一項所述之方法，其中該多種多株抗體包括人源化抗體。
E80. 如實施方式77或78中任一項所述之方法，其中該多種多株抗體包括全人抗體。
E81. 如實施方式77-80中任一項所述之方法，其中該多種多株抗體包括IgG抗體、IgG1抗體、IgG2抗體、IgG3抗體、IgG4抗體、IgM抗體、IgA抗體或其組合。
E82. 如實施方式77-80中任一項所述之方法，其中該多種多株抗體包含含有IgM或IgA同種型重鏈的人源化免疫球蛋白基因座。
E83. 如實施方式77-82中任一項所述之方法，其中該多種多株抗體包含編碼免疫球蛋白輕鏈的人源化免疫球蛋白基因座。
E84. 如實施方式83所述之方法，其中該等免疫球蛋白輕鏈包含κ輕鏈或λ輕鏈。
E85. 如前述實施方式中任一項所述之方法，該方法進一步包括從該非人類動物或人類受試者（例如，要免疫接種的非人類動物或人類受試者）收集血液並且從該血液中純化針對該冠狀病毒抗原的抗體。
E86. 一種產生針對冠狀病毒抗原的多株抗體製劑（例如，抗冠狀病毒抗體製劑）之方法，該方法包括： a) 向非人類動物或人類受試者（例如，要免疫接種的非人類動物或人類受試者）投與如前述實施方式中任一項所述之免疫原性組成物；以及 b) 從該非人類動物或人類受試者中收集血液或血漿。
E87. 如實施方式86所述之方法，其中將該多株抗體製劑配製成藥物組成物或獸用組成物。
E88. 一種將針對冠狀病毒的多株抗體製劑遞送至具有冠狀病毒感染的受試者（例如，要治療的受試者）之方法，該方法包括向具有冠狀病毒感染的受試者投與如前述實施方式中任一項所述之多株抗體製劑。
E89. 一種將多株抗體製劑遞送至處於暴露於冠狀病毒感染的風險中的受試者（例如，要治療的受試者）之方法，該方法包括向處於暴露於冠狀病毒感染的風險中的受試者投與如前述實施方式中任一項所述之多株抗體製劑。
E90. 一種預防或治療有需要的受試者（例如，要治療的受試者）的冠狀病毒感染之方法，該方法包括向有此需要的受試者投與如前述實施方式中任一項所述之多株抗體製劑。
E91. 如前述實施方式中任一項所述之方法，該方法進一步包括: a) 為已經遺傳修飾以產生人抗體的非人類動物免疫接種前述實施方式中任一項所述之環狀多核糖核苷酸或前述實施方式中任一項所述之線性多核糖核苷酸； b) 從該非人類動物中收集血液； c) 從該非人類動物中純化抗體； d) 配製該等抗體作藥物用途；以及 e) 向人類受試者投與所配製的抗體。
E92. 如實施方式91所述之方法，其中該非人類動物具有人源化免疫系統。
E93. 如實施方式91所述之方法，其中該非人類動物具有人源化免疫球蛋白基因座。
E94. 如實施方式91所述之方法，其中該非人類動物係包含人類人工染色體（HAC）載體的轉染色體牛，該載體包含人免疫球蛋白基因座
E95. 如前述實施方式中任一項所述之方法，其中該投與或免疫係在有此需要的受試者處於暴露於冠狀病毒的風險之前、之後或同時進行。
E96. 如前述實施方式中任一項所述之方法，其中具有冠狀病毒感染的受試者（例如，要治療的受試者）、處於暴露於冠狀病毒感染的風險中的受試者或有此需要的受試者係人類受試者。
E97. 如實施方式96所述之方法，其中該人類受試者（例如，要治療的人類受試者）係50歲以上的人、免疫受損的人、患有慢性健康病狀（例如，肥胖症、糖尿病或癌症）的人或衛生保健工作者。
E98. 如前述實施方式中任一項所述之方法，其中處於暴露於冠狀病毒感染的風險中的受試者（例如，要治療的受試者）或有此需要的受試者係處於冠狀病毒相關疾病的風險中的人類受試者。
E99. 如前述實施方式中任一項所述之方法，其中具有冠狀病毒感染的受試者（例如，要治療的受試者）、處於暴露於冠狀病毒感染的風險中的受試者或有此需要的受試者係被診斷患有冠狀病毒相關疾病（例如，Covid-19、SARS、MERS）的人類受試者。
E100. 如前述實施方式中任一項所述之方法，其中具有冠狀病毒感染的受試者（例如，要治療的受試者）、處於暴露於冠狀病毒感染的風險中的受試者（例如，要治療的受試者）或有此需要的受試者（例如，要治療的受試者）係非人類動物受試者。
E101. 如前述實施方式中任一項所述之方法，其中具有冠狀病毒感染的受試者（例如，要治療的受試者）、處於暴露於冠狀病毒感染的風險中的受試者（例如，要治療的受試者）或有此需要的受試者（例如，要治療的受試者）係農業動物（例如，牛、豬、綿羊、馬、山羊）、寵物（例如，貓或狗）或動物園動物（例如，貓科動物）。
E102. 如前述實施方式中任一項所述之方法，該方法進一步包括監測具有冠狀病毒感染的受試者（例如，要治療的受試者）、處於暴露於冠狀病毒感染的風險中的受試者（例如，要治療的受試者）或有此需要的受試者是否存在該等多株抗體。
E103. 如前述實施方式中任一項所述之方法，其中該監測係在投與該等多株抗體之前和/或投與該等多株抗體之後。
定義
本發明將針對特定實施方式並參考某些附圖進行描述，但是本發明不限於此，而是僅由申請專利範圍來限定。除非另有說明，否則下文陳述的術語通常應以其共識來理解。
如本文所用，術語「circRNA」、「環狀多核糖核苷酸」和「環狀RNA」可互換使用，並且意指具有無游離末端的結構（即，沒有游離3'末端和/或5'末端）的多核糖核苷酸分子，例如藉由共價鍵或非共價鍵形成環狀或無末端結構的多核糖核苷酸。
如本文所用，術語「circRNA製劑」、「環狀多核糖核苷酸製劑」和「環狀RNA製劑」可互換使用，並且意指包含circRNA分子和稀釋劑、載劑、第一佐劑或其組合的組成物。「免疫原性」circRNA製劑係當引入動物體內時使動物的免疫系統變得對circRNA表現的抗原有反應性的製劑。
如本文所用，術語「線性RNA」、「線性多核糖核苷酸」和「線性多核糖核苷酸分子」可互換使用並且意指具有5'末端和3’末端的單核糖核苷酸分子或多核糖核苷酸分子。5'末端和3’末端中的一個或兩個可以是游離末端或者可以與另一部分連接。在一些實施方式中，線性RNA具有經修飾或受保護免於降解（例如，藉由5'末端保護劑或3'末端保護劑保護）的5'末端或3'末端。在一些實施方式中，線性RNA具有非共價連接的5'或3'末端。線性RNA可以用作起始材料藉由例如夾板連接或化學、酶促、核酶或剪接催化的環化方法進行環化。
如本文所用，術語「線性RNA製劑」和「線性多核糖核苷酸製劑」可互換使用，並且意指包含線性RNA分子和稀釋劑、載劑、第一佐劑或其組合的組成物。「免疫原性」線性RNA製劑係當引入動物體內時使動物的免疫系統變得對circRNA表現的抗原有反應性的製劑。
如本文所用，術語「總核糖核苷酸分子」意指藉由核糖核苷酸分子的總品質所測量的任何核糖核苷酸分子的總量，包括線性多核糖核苷酸分子、環狀多核糖核苷酸分子、單體核糖核苷酸、其他多核糖核苷酸分子、其片段及其經修飾的變體。
如本文所用，術語「片段」意指比核苷酸分子短至少一個核苷酸的核苷酸分子的任何部分。例如，核苷酸分子可以是線性多核糖核苷酸分子並且其片段可以是單核糖核苷酸或作為線性多核糖核苷酸分子的一部分的任意數量的連續多核糖核苷酸。再如，核苷酸分子可以是環狀多核糖核苷酸分子並且其片段可以是多核糖核苷酸或作為環狀多核糖核苷酸分子的一部分的任意數量的連續多核糖核苷酸。核苷酸分子的片段包括至少10個核酸殘基，例如至少20個核酸殘基、至少50個核酸殘基和至少100個核酸殘基。片段還意指比多肽分子短至少一個肽的多肽分子的任何部分。例如，多肽的片段可以是多肽或作為全長多肽分子的一部分的任意數量的連續胺基酸。多肽的片段包括至少5個胺基酸殘基，例如至少10個胺基酸殘基、至少20個胺基酸殘基、至少50個胺基酸殘基、至少100個胺基酸殘基。
如本文所用，術語「表現序列」係編碼產物，例如肽或多肽或調控核酸的核酸序列。編碼肽或多肽的示例性表現序列可以包含多個核苷酸三聯體，其中每一個都可以編碼胺基酸，並被稱為「密碼子」。
如本文所用，術語「經修飾的核糖核苷酸」係具有至少一個針對糖、核鹼基或核苷間鍵的修飾的核苷酸。
如本文所用，短語「凖螺旋結構」係環狀多核糖核苷酸的高階結構，其中環狀多核糖核苷酸的至少一部分折疊成螺旋結構。
如本文所用，短語「准雙鏈二級結構」係環狀多核糖核苷酸的高階結構，其中環狀多核糖核苷酸的至少一部分產生內部雙鏈。
如本文所用，術語「調控元件」係修飾環狀多核糖核苷酸內表現序列的表現的部分，諸如核酸序列。
如本文所用，術語「重複核苷酸序列」係一段DNA或RNA內或整個基因組內的重複核酸序列。在一些實施方式中，重複核苷酸序列包括聚CA序列或聚TG（UG）序列。在一些實施方式中，重複核苷酸序列包括內含子Alu家族中的重複序列。
如本文所用，術語「複製元件」係可用於複製或起始環狀多核糖核苷酸轉錄的序列和/或模體。
如本文所用，術語「交錯元件」係在翻譯期間誘導核糖體暫停的部分，諸如核苷酸序列。在一些實施方式中，交錯元件係具有強α-螺旋傾向的胺基酸的非保守序列，然後是共有序列-D(V/I)ExNPG P，其中x = 任何胺基酸。在一些實施方式中，交錯元件可以包括化學部分，諸如丙三醇、非核酸連接部分、化學修飾、經修飾的核酸或其任何組合。
如本文所用，術語「基本上對……有抗性」可以指相較於參考物對效應物具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%抗性的物質。
如本文所用，術語「化學計量翻譯」係由環狀多核糖核苷酸翻譯獲得的表現產物的基本上相等的產生。例如，對於具有兩個表現序列的環狀多核糖核苷酸，環狀多核糖核苷酸的化學計量翻譯意指兩個表現序列的表現產物可具有基本相等的量，例如兩個表現序列之間的量差（例如莫耳差）可以為約0，或小於1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%或20%或之間的任何百分比。
如本文所用，術語「翻譯起始序列」係在環狀多核糖核苷酸中起始表現序列的翻譯的核酸序列。
如本文所用，術語「終止元件」係終止環狀多核糖核苷酸中表現序列的翻譯的部分，諸如核酸序列。
如本文所用，術語「翻譯效率」係從核糖核苷酸轉錄物產生蛋白質或肽的速率或量。在一些實施方式中，翻譯效率可以表示為給定量的編碼蛋白質或肽的轉錄物產生的蛋白質或肽的量，例如在給定的時間段內，例如在給定的翻譯系統中，例如體外翻譯系統（像兔網狀紅血球裂解物）或體內翻譯系統（像真核細胞或原核細胞）。
如本文所用，術語「環化效率」係所得環狀多核糖核苷酸相對於其非環狀起始材料的測量。
如本文所用，術語「適應性免疫反應」係指體液或細胞介導的免疫反應。體液免疫反應（也稱為抗體免疫反應）由B淋巴細胞介導，B淋巴細胞會釋放與抗原特異性結合的抗體。細胞介導的免疫反應（也稱為細胞免疫反應）關於細胞毒性T淋巴細胞（CTL）與外來或受感染的細胞的結合，然後裂解該等細胞。
如本文所用，術語「佐劑」係指當與環狀RNA分子組合使用時，增大或以其他方式改變或修改所產生的免疫反應的化合物。免疫反應的修改包括強化或擴大抗體和細胞免疫反應中的任一者或兩者的特異性。免疫反應的修改還可以意指降低或阻遏某些抗原特異性免疫反應。
如本文所用，術語「人抗體」、「人免疫球蛋白」和「人多株抗體」可互換使用並且意指在非人類動物中產生的一種或多種抗體，在其他方面與接種了相同環狀RNA製劑的人中產生的抗體無法區分。這與「人源化抗體」形成對比，「人源化抗體」經修飾為具有人類特徵（諸如藉由生成嵌合體），但保持產生它們的宿主動物的屬性。因為根據本文揭露之方法製備的人抗體由全人的IgG組成，不需要酶處理來消除與異源物種IgG相關的過敏反應和血清病的風險。
如本文所用，術語「線性對應物」係具有與環狀多核糖核苷酸相同或相似的核苷酸序列（例如，100%、95%、90%、85%、80%、75%或之間的任何百分比的序列相似性）並且具有兩個游離末端（即，環狀多核糖核苷酸的未環化形式（及其片段））的多核糖核苷酸分子（及其片段）。在一些實施方式中，線性對應物（例如，環化前形式）係具有與環狀多核糖核苷酸相同或相似的核苷酸序列（例如，100%、95%、90%、85%、80%、75%或之間的任何百分比的序列相似性）和相同或相似的核酸修飾並且具有兩個游離末端（即，環狀多核糖核苷酸的未環化形式（及其片段））的多核糖核苷酸分子（及其片段）。在一些實施方式中，線性對應物係具有與環狀多核糖核苷酸相同或相似的核苷酸序列（例如，100%、95%、90%、85%、80%、75%或之間的任何百分比的序列相似性）和不同的核酸修飾或沒有核酸修飾並且具有兩個游離末端（即，環狀多核糖核苷酸的未環化形式（及其片段））的多核糖核苷酸分子（及其片段）。在一些實施方式中，作為線性對應物的多核糖核苷酸分子的片段係線性對應物多核糖核苷酸分子的比該線性對應物多核糖核苷酸分子短的任何部分。在一些實施方式中，線性對應物進一步包含5'帽。在一些實施方式中，線性對應物進一步包含聚腺苷尾。在一些實施方式中，線性對應物進一步包含3’ UTR。在一些實施方式中，線性對應物進一步包含5’ UTR。
如本文所用，術語「載劑」意指藉由經由部分或完全包封劑或其組合對環狀多核糖核苷酸的共價修飾而利於將組成物（例如，環狀多核糖核苷酸）運輸或遞送到細胞中的化合物、組成物、試劑或分子。載劑的非限制性實例包括碳水化合物載劑（例如，酸酐改性的植物糖原或糖原型材料）、奈米顆粒（例如，包封或共價連接結合至環狀多核糖核苷酸的奈米顆粒，諸如脂質奈米顆粒或LNP）、脂質體、融合體（fusosome）、離體分化的網狀紅血球、外泌體、蛋白質載劑（例如，與環狀多核糖核苷酸共價連接的蛋白質）或陽離子載劑（例如，陽離子脂聚合物或轉染試劑）。
如本文所用，術語「裸」、「裸遞送」及其同源詞意指無需借助於載劑而遞送至細胞且沒有對有助於遞送至細胞的部分進行共價修飾的配製物。裸遞送配製物不含任何轉染試劑、陽離子載劑、碳水化合物載劑、奈米顆粒載劑或蛋白質載劑。例如，環狀多核糖核苷酸的裸遞送配製物係包含沒有共價修飾的環狀多核糖核苷酸且不含載劑的配製物。裸遞送配製物可以包含非載劑藥物賦形劑或稀釋劑。
術語「稀釋劑」意指包含非活性溶劑的媒介物（vehicle），本文所述之組成物（例如，包含環狀多核糖核苷酸的組成物）可以稀釋或溶解在其中。稀釋劑可以是RNA增溶劑、緩衝劑、等滲劑或其混合物。稀釋劑可以是液體稀釋劑或固體稀釋劑。液體稀釋劑的非限制性實例包括水或其他溶劑、增溶劑和乳化劑（諸如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲醯胺、油類（尤其是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油）、丙三醇、四氫糠醇、聚乙二醇和脫水山梨糖醇的脂肪酸酯以及1,3-丁二醇。固體稀釋劑的非限制性實例包括碳酸鈣、碳酸鈉、磷酸鈣、磷酸二鈣、硫酸鈣、磷酸氫鈣、磷酸鈉乳糖、蔗糖、纖維素、微晶纖維素、高嶺土、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、氯化鈉、乾澱粉、玉米澱粉或糖粉。
如本文所用，「要免疫接種的受試者」係投與免疫原性組成物（例如，包含含有編碼冠狀病毒抗原的序列的環狀多核糖核苷酸的組成物，或包含含有選自表3中的SEQ ID NO.的序列的線性多核糖核苷酸的組成物）的受試者。要免疫接種的受試者係非人類動物（「要免疫接種的非人類動物受試者」）（例如，農業動物、寵物、動物園動物等）或人類受試者（「要免疫接種的人類受試者」）。
如本文所用，「要治療的受試者」係投與針對冠狀病毒的多株抗體（例如，針對冠狀病毒的多株抗體製劑）作為預防性治療或治療冠狀病毒感染的受試者。預防性治療包括將針對冠狀病毒的多株抗體投與給處於暴露於冠狀病毒的風險中的受試者（例如，衛生保健工作者）或處於患冠狀病毒相關疾病的風險中的受試者（例如，超過50歲的人；免疫受損的人；患有慢性健康病狀諸如肥胖症、糖尿病、癌症等慢性健康病狀的人）。要治療的受試者係非人類動物（「要治療的非人類動物受試者」）（例如，農業動物、寵物、動物園動物等）或人類受試者（「要治療的人類受試者」）。
如本文所用，「變體」係指與親本或野生型多肽相比在一個或多個殘基位置包括至少一個改變，例如取代、插入、缺失和/或融合的多肽。變體可以包括1至10個、10至20個、20至50個、50至100個或更多個改變。
藉由引用併入
本說明書中提到的所有公開、專利和專利申請藉由引用併入本文，其程度如同明確地和單獨地指明將各篇公開、專利或者專利申請藉由引用併入本文。
本揭露總體上關於包含編碼來自冠狀病毒的抗原和/或表位的序列的環狀多核糖核苷酸、包含編碼冠狀病毒抗原和/或表位的環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物、以及用於產生編碼冠狀病毒抗原和/或表位的環狀多核糖核苷酸之方法和包含編碼冠狀病毒抗原和/或表位的環狀多核糖核苷酸的組成物。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸和/或免疫原性組成物用於藉由向受試者投與環狀多核糖核苷酸和/或免疫原性組成物或為受試者免疫接種包含編碼冠狀病毒抗原和/或表位的序列的環狀多核糖核苷酸和/或包含該環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物而生成針對來自冠狀病毒的抗原和/或表位的免疫反應之方法中。受試者（例如，要免疫接種的受試者）可以是哺乳動物，諸如有蹄類動物。要免疫接種的受試者可以是人。在一些實施方式中，要免疫接種的受試者係具有人源化免疫系統的非人類動物。
本揭露總體上還關於包含編碼來自冠狀病毒的抗原和/或表位的序列的線性多核糖核苷酸、包含編碼冠狀病毒抗原和/或表位的線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物、以及用於產生編碼冠狀病毒抗原和/或表位的線性多核糖核苷酸之方法和包含編碼冠狀病毒抗原和/或表位的線性多核糖核苷酸的組成物。在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸和/或免疫原性組成物用於藉由向受試者投與線性多核糖核苷酸和/或免疫原性組成物或為受試者免疫接種包含編碼冠狀病毒抗原和/或表位的序列的線性多核糖核苷酸和/或包含該線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物而生成針對來自冠狀病毒的抗原和/或表位的免疫反應之方法中。受試者（例如，要免疫接種的受試者）可以是哺乳動物，諸如有蹄類動物。要免疫接種的受試者可以是人。在一些實施方式中，要免疫接種的受試者係具有人源化免疫系統的非人類動物。
本揭露總體上還關於使用本文所述之環狀多核糖核苷酸或免疫原性組成物生成或產生與來自受試者中冠狀病毒的抗原和/或表位結合的多株抗體之方法。在一些實施方式中，要免疫接種的受試者係人。在一些實施方式中，要免疫接種的受試者係非人類動物（例如，有蹄類動物）。在一些實施方式中，非人類動物具有人源化免疫系統。在一個特定實施方式中，將編碼來自冠狀病毒的抗原和/或表位的環狀多核糖核苷酸和/或包含編碼冠狀病毒抗原和/或表位的環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物投與給具有人源化免疫系統的非人類動物，從而刺激與來自冠狀病毒的抗原和/或表位結合的人多株抗體的產生。
本揭露總體上還關於使用本文所述之線性多核糖核苷酸或免疫原性組成物生成或產生與來自受試者中冠狀病毒的抗原和/或表位結合的多株抗體之方法。在一些實施方式中，要免疫接種的受試者係人。在一些實施方式中，要免疫接種的受試者係非人類動物（例如，有蹄類動物）。在一個實施方式中，將編碼來自冠狀病毒的抗原和/或表位的線性多核糖核苷酸和/或包含編碼冠狀病毒抗原和/或表位的線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物投與給具有人源化免疫系統的非人類動物，從而刺激與來自冠狀病毒的抗原和/或表位結合的人多株抗體的產生。
在進一步的實施方式中，純化所產生的多株抗體。純化的多株抗體適合用作針對冠狀病毒的預防劑或冠狀病毒感染的治療。純化的多株抗體可以投與給要治療的受試者。圖2中提供了本文所述之方法的示意性實例。
環狀多核糖核苷酸
如本文所揭露的環狀多核糖核苷酸包含編碼來自冠狀病毒的抗原和/或表位的序列。這種環狀多核糖核苷酸在受試者（例如，要免疫接種的受試者）中表現編碼來自冠狀病毒的抗原和/或表位的序列。在一些實施方式中，包含冠狀病毒抗原和/或表位的環狀多核糖核苷酸用於在受試者（例如，要免疫接種的受試者）中產生免疫反應。在一些實施方式中，包含冠狀病毒抗原和/或表位的環狀多核糖核苷酸用於產生如本文所述之多株抗體。
A. 冠狀病毒抗原和表位
環狀多核糖核苷酸包含編碼冠狀病毒抗原或表位的序列。本文揭露的抗原和/或表位與冠狀病毒相關。在一些實施方式中，該等抗原和/或表位係由冠狀病毒表現的，或源自冠狀病毒所表現的抗原和/或表位。
抗原係含有一個或多個表位（線性表位、構象表位或兩者）的分子，將會在受試者（例如，要免疫接種的受試者）中引發適應性免疫反應。表位可以是被給定抗體或T細胞受體識別、靶向或結合的抗原的一部分。表位可以是線性表位，例如胺基酸的連續序列。表位可以是構象表位，例如，含有在蛋白質的折疊構象中形成表位的胺基酸的表位。構象表位可以含有來自一級胺基酸序列的非連續胺基酸。通常，表位將包括約3-15個，通常約5-15個胺基酸。B細胞表位通常為約5個胺基酸，但也可以小至3-4個胺基酸。T細胞表位（諸如CTL表位）將包括至少約7-9個胺基酸，而輔助T細胞表位包括至少約12-20個胺基酸。通常，表位將包括約7至15個胺基酸，諸如9、10、12或15個胺基酸。
冠狀病毒抗原或表位可以是或可以包含蛋白質、肽、糖蛋白、脂蛋白、磷蛋白、核糖核蛋白、碳水化合物（例如，多糖）、脂質（例如，磷脂或三酸甘油酯）或核酸（例如，DNA、RNA）的全部或一部分。
冠狀病毒抗原或表位可以包含蛋白質抗原或表位（例如，來自蛋白質、糖蛋白、脂蛋白、磷蛋白或核糖核蛋白的肽抗原或肽表位）。抗原或表位可以包括胺基酸、糖、脂質、磷醯基或磺醯基或其組合。
冠狀病毒蛋白抗原或表位可以包含翻譯後修飾，例如糖基化、泛素化、磷酸化、亞硝基化、甲基化、乙醯化、醯胺化、羥基化、硫酸化或脂化。
在一些實施方式中，冠狀病毒係病原性冠狀病毒。在一些實施方式中，冠狀病毒係呼吸道病原體。在一些實施方式中，冠狀病毒係血源性病原體。在一些實施方式中，冠狀病毒係腸道病原體。
本揭露之冠狀病毒的非限制性實例包括嚴重急性呼吸綜合症相關冠狀病毒（SARS-CoV，例如SARS-CoV-1、SARS-CoV-2）、中東呼吸症候群冠狀病毒（MERS-CoV）、蝙蝠冠狀病毒、可感染人類或其他動物的人畜共患冠狀病毒、新出現或新發現的冠狀病毒以及其他冠狀病毒。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包含嚴重急性呼吸綜合症相關冠狀病毒（SARS-CoV）抗原和/或表位。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包含SARS-CoV-1抗原和/或表位。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包含SARS-CoV-2抗原和/或表位。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包含中東呼吸症候群冠狀病毒（MERS-CoV）抗原和/或表位。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包含可感染人類或其他動物的人畜共患冠狀病毒抗原和/或表位。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包含來自新出現的冠狀病毒的抗原和/或表位。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包含冠狀病毒科（Coronaviridae）抗原和/或表位。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包含來自α冠狀病毒（Alphacoronavirus）、β冠狀病毒（Betacoronavirus）、γ冠狀病毒（Gammacoronavirus）、δ冠狀病毒（Deltacoronavirus）、美貝科病毒（Mebecovirus）或沙貝科病毒（Sarbecovirus）的屬或亞屬的抗原和/或表位。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包含β冠狀病毒抗原和/或表位。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包含沙貝科病毒抗原和/或表位。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包含美貝科病毒抗原和/或表位。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包含來自係生物安全2級（BSL-2）病原體的冠狀病毒的抗原的序列。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包含來自係生物安全3級（BSL-3）病原體的冠狀病毒的序列。在一些實施方式中，冠狀病毒係生物安全4級（BSL-4）病原體。在一些實施方式中，沒有批准的藥物（例如，抗病毒或抗生素藥物）可用於治療冠狀病毒感染，環狀多核糖核苷酸所表現的抗原就源自該冠狀病毒。在一些實施方式中，沒有批准的疫苗可用於預防或降低冠狀病毒感染的風險，環狀多核糖核苷酸所表現的抗原就源自該冠狀病毒。
抗原和/或表位可以來自冠狀病毒表面蛋白、冠狀病毒膜蛋白、冠狀病毒包膜蛋白、冠狀病毒衣殼蛋白、冠狀病毒核衣殼蛋白、冠狀病毒刺突蛋白、刺突的冠狀病毒受體結合結構域（RBD）蛋白、冠狀病毒進入蛋白、冠狀病毒膜融合蛋白、冠狀病毒結構蛋白、冠狀病毒非結構蛋白、冠狀病毒調節蛋白、冠狀病毒輔助蛋白、分泌型冠狀病毒蛋白、冠狀病毒聚合酶蛋白、冠狀病毒RNA聚合酶、冠狀病毒蛋白酶、冠狀病毒糖蛋白、冠狀病毒融合原、冠狀病毒螺旋衣殼蛋白、冠狀病毒二十面體衣殼蛋白、冠狀病毒基質蛋白、冠狀病毒複製酶、冠狀病毒轉錄因子或冠狀病毒酶。
來自許多冠狀病毒的抗原和/或表位係由該環狀多核糖核苷酸表現的。在一些情況下，抗原和/或表位與本文揭露的一種冠狀病毒相關或由其表現。在一些實施方式中，抗原和/或表位與本文揭露的兩種或更多種冠狀病毒相關或由其表現。
在一些情況下，兩種或更多種冠狀病毒在表型上有關。例如，本揭露之組成物和方法可以利用來自以下冠狀病毒的抗原和/或表位：作為呼吸道病原體的兩種或更多種冠狀病毒、與嚴重疾病相關的兩種或更多種冠狀病毒、與免疫受損受試者（例如，要免疫接種的受試者）中的不良結果相關的兩種或更多種冠狀病毒的、與急性呼吸窘迫症候群（ARDS）相關的兩種或更多種冠狀病毒、與嚴重急性呼吸綜合症（SARS）相關的兩種或更多種冠狀病毒、與中東呼吸綜合症（MERS）相關的兩種或更多種冠狀病毒或該等的組合。
環狀多核糖核苷酸可以包含或編碼例如來自至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少15種、至少20種、至少25種、至少30種、至少40種、至少50種、至少60種、至少70種、至少80種、至少90種、至少100種或更多種冠狀病毒的抗原和/或表位。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包含或編碼來自至多2種、至多3種、至多4種、至多5種、至多6種、至多7種、至多8種、至多9種、至多10種、至多15種、至多20種、至多25種、至多30種、至多40種、至多50種、至多60種、至多70種、至多80種、至多90種、至多100種或更少的冠狀病毒的抗原和/或表位。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包含或編碼來自約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100種冠狀病毒的抗原和/或表位。
在一些實施方式中，抗原和/或表位來自冠狀病毒，例如嚴重急性呼吸綜合症相關冠狀病毒（SARS-CoV，例如SARS-CoV-1、SARS-CoV-2）、中東呼吸症候群冠狀病毒（MERS-CoV）或另一種冠狀病毒。在一些實施方式中，本揭露之抗原和/或表位來自冠狀病毒基因組的預測開放閱讀框。
可以藉由新病毒特定基因組區域的多核苷酸序列與已知SARS病毒特定基因組區域的多核苷酸序列的99%、98%、97%、95%、92%、90%、85%或80%同源性的同源性百分比來鑒定新的SARS分離株。另外，可以藉由新SARS病毒的特定基因組區域的多核苷酸所編碼的多肽序列與已知SARS病毒特定區域的多核苷酸所編碼的多肽序列的99%、98%、97%、95%、92%、90%、85%或80%同源性的同源性百分比來鑒定新的SARS分離株。該等基因組區域可以包括在眾多冠狀病毒中通常共有的區域（例如，基因產物或ORF），以及組特異性區域（例如，抗原組），例如本領域熟練的病毒學家可以容易地鑒定的以下基因組區域中的任何一個：5'非翻譯區（UTR）、前導序列、ORF1a、ORF1b、非結構蛋白2（NS2）、血凝素酯酶糖蛋白（HE）（也稱為E3）、刺突糖蛋白（S）（也稱為E2）、ORF3a、ORF3b、非結構蛋白4（NS4）、包膜（小膜）蛋白（E）（也稱為sM）、膜糖蛋白（M）（也稱為E1）、ORF5a、ORF5b、核衣殼磷蛋白（N）、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8、ORF8a、ORF8b、ORF9a、ORF9b、ORF10、基因間序列、刺突蛋白的受體結合結構域（RBD）、3'UTR或RNA依賴性RNA聚合酶（pol）。SARS病毒可具有可鑒定的基因組區域和一個或多個以上鑒定的基因組區域。SARS病毒抗原包括由該等基因組區域中的任何一個編碼的蛋白質。SARS病毒抗原可以是與冠狀病毒高度保守的蛋白質或其片段。SARS病毒抗原可以是對SARS病毒具有特異性（與已知冠狀病毒相比）的蛋白質或其片段。
在一些實施方式中，本揭露之抗原和/或表位來自SARS-CoV基因組的預測轉錄物。在一些實施方式中，本揭露之抗原和/或表位來自由來自SARS-CoV基因組的開放閱讀框編碼的蛋白質。SARS-CoV基因組中開放閱讀框的非限制性實例可以包括ORF1a、ORF1b、刺突（S）、ORF3a、ORF3b、包膜（E）、膜（M）、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8、ORF8a、ORF8b、ORF9a、ORF9b、核衣殼（N）和ORF10。
ORF1a和ORF1b編碼16種非結構蛋白（nsp），例如nsp1、nsp2、nsp3、nsp4、nsp5、nsp6、nsp7、nsp8、nsp9、nsp10、nsp11、nsp12、nsp13、nsp14、nsp15和nsp16。例如，非結構蛋白有助於病毒複製、病毒組裝、免疫反應調節或其組合。在一些實施方式中，抗原係非結構蛋白或者係編碼非結構蛋白的抗原序列。在一些實施方式中，表位來自冠狀病毒非結構蛋白。
刺突（S）編碼刺突蛋白，在一些實施方式中刺突蛋白有助於與宿主細胞受體的結合、病毒與宿主細胞膜的融合、病毒進入宿主細胞或其組合。刺突蛋白可以是抗原。在一些實施方式中，本揭露之表位來自刺突蛋白。在一些實施方式中，本揭露之表位包含刺突蛋白的受體結合結構域。在一些實施方式中，本揭露之表位包含刺突蛋白的ACE2結合結構域。
包膜（E）編碼包膜蛋白，在一些實施方式中包膜蛋白有助於病毒組裝和形態發生。包膜蛋白可以是抗原。在一些實施方式中，本揭露之表位來自冠狀病毒包膜蛋白。
膜（M）編碼膜蛋白，在一些實施方式中膜蛋白有助於病毒組裝。膜蛋白可以是抗原。在一些實施方式中，本揭露之表位來自冠狀病毒膜蛋白。
核衣殼（N）編碼核衣殼蛋白，在一些實施方式中核衣殼蛋白可與基因組RNA形成複合物並有助於病毒組裝，和/或與M蛋白相互作用。核衣殼蛋白可以是抗原。在一些實施方式中，本揭露之表位來自冠狀病毒核衣殼蛋白。
ORF3a、ORF3b、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8、ORF8a、ORF8b、ORF9a、ORF9b和ORF10編碼輔助蛋白。在一些實施方式中，輔助蛋白可以調節宿主細胞傳訊，調節宿主細胞免疫反應，作為次要結構蛋白併入成熟病毒粒子中，或該等的組合。輔助蛋白可以是抗原。在一些實施方式中，本揭露之表位來自冠狀病毒輔助蛋白。
本揭露之組成物和方法可以利用由SARS-CoV基因組的一個或多個開放閱讀框編碼或源自該一個或多個開放閱讀框的抗原和/或表位。例如，抗原和/或表位可由ORF1a、ORF1b、刺突（S）、ORF3a、ORF3b、包膜（E）、膜（M）、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8、ORF8a、ORF8b、ORF9a、ORF9b、核衣殼（N）、ORF10或其任何組合編碼或源自該等或其任何組合。
在一些實施方式中，本揭露之表位來自刺突蛋白。在一些實施方式中，本揭露之表位包含刺突蛋白的受體結合結構域（RBD）。在一些實施方式中，本揭露之表位包含刺突蛋白的ACE2結合結構域。在一些實施方式中，本揭露之表位包含刺突蛋白的S1亞基、刺突蛋白的S2亞基或其組合。在一些實施方式中，本揭露之表位包含刺突蛋白的胞外域。在一些實施方式中，本揭露之表位包含來自冠狀病毒刺突蛋白的Gln498、Thr500、Asn501或其組合。在一些實施方式中，本揭露之表位包含來自冠狀病毒刺突蛋白的Lys417、Tyr453或其組合。在一些實施方式中，本揭露之表位包含來自冠狀病毒刺突蛋白的Gln474、Phe486或其組合。在一些實施方式中，本揭露之表位包含來自冠狀病毒刺突蛋白的刺突蛋白變體或衍生物或其組合的Gln498、Thr500、Asn501、Lys417、Tyr453、Gln474、Phe486、一個或多個等效胺基酸。在一些實施方式中，本揭露之刺突蛋白包含D614G突變，即在614位置具有胺基酸甘胺酸（G）而不是天冬胺酸（D）。在一些實施方式中，本揭露之表位包含來自冠狀病毒刺突蛋白的刺突蛋白變體或衍生物或其組合的Gly614。在一些情況下，D614G突變可導致S1脫落減少和冠狀病毒傳染性增加。
在一些實施方式中，抗原和/或表位由ORF1a編碼或源自ORF1a。在一些實施方式中，抗原和/或表位由SARS-CoV ORF1b編碼或源自SARS-CoV ORF1b。在一些實施方式中，抗原和/或表位由SARS-CoV刺突編碼或源自SARS-CoV刺突。在一些實施方式中，抗原和/或表位由SARS-CoV ORF3a編碼或源自SARS-CoV ORF3a。在一些實施方式中，抗原和/或表位由SARS-CoV ORF3b編碼或源自SARS-CoV ORF3b。在一些實施方式中，抗原和/或表位由SARS-CoV包膜（E）編碼或源自SARS-CoV包膜（E）。在一些實施方式中，抗原和/或表位由SARS-CoV膜（M）編碼或源自SARS-CoV膜（M）。在一些實施方式中，抗原和/或表位由SARS-CoV ORF6編碼或源自SARS-CoV ORF6。在一些實施方式中，抗原和/或表位由SARS-CoV ORF7a編碼或源自SARS-CoV ORF7a。在一些實施方式中，抗原和/或表位由SARS-CoV ORF7b編碼或源自SARS-CoV ORF7b。在一些實施方式中，抗原和/或表位由SARS-CoV ORF8編碼或源自SARS-CoV ORF8。在一些實施方式中，抗原和/或表位由SARS-CoV ORF8a編碼或源自SARS-CoV ORF8a。在一些實施方式中，抗原和/或表位由SARS-CoV ORF9a編碼或源自SARS-CoV ORF9a。在一些實施方式中，抗原和/或表位由SARS-CoV ORF9b編碼或源自SARS-CoV ORF9b。在一些實施方式中，抗原和/或表位由SARS-CoV核衣殼（N）編碼或源自SARS-CoV核衣殼（N）。在一些實施方式中，抗原和/或表位由SARS-CoV ORF10編碼或源自SARS-CoV ORF10。在一些實施方式中，抗原和/或表位由SARS-CoV刺突（S）、包膜（E）、膜（M）和核衣殼（N）編碼或源自SARS-CoV刺突（S）、包膜（E）、膜（M）和核衣殼（N）。
在一些實施方式中，抗原和/或表位不是由SARS-CoV ORF1a編碼或不是源自SARS-CoV ORF1a。在一些實施方式中，抗原和/或表位不是由SARS-CoV ORF1b編碼或不是源自SARS-CoV ORF1b。在一些實施方式中，抗原和/或表位不是由SARS-CoV刺突編碼或不是源自SARS-CoV刺突。在一些實施方式中，抗原和/或表位不是由SARS-CoV ORF3a編碼或不是源自SARS-CoV ORF3a。在一些實施方式中，抗原和/或表位不是由SARS-CoV ORF3b編碼或不是源自SARS-CoV ORF3b。在一些實施方式中，抗原和/或表位不是由SARS-CoV包膜（E）編碼或不是源自SARS-CoV包膜（E）。在一些實施方式中，抗原和/或表位不是由SARS-CoV膜（M）編碼或不是源自SARS-CoV膜（M）。在一些實施方式中，抗原和/或表位不是由SARS-CoV ORF6編碼或不是源自SARS-CoV ORF6。在一些實施方式中，抗原和/或表位不是由SARS-CoV ORF7a編碼或不是源自SARS-CoV ORF7a。在一些實施方式中，抗原和/或表位不是由SARS-CoV ORF7b編碼或不是源自SARS-CoV ORF7b。在一些實施方式中，抗原和/或表位不是由SARS-CoV ORF8編碼或不是源自SARS-CoV ORF8。在一些實施方式中，抗原和/或表位不是由SARS-CoV ORF8a編碼或不是源自SARS-CoV ORF8a。在一些實施方式中，抗原和/或表位不是由SARS-CoV ORF9a編碼或不是源自SARS-CoV ORF9a。在一些實施方式中，抗原和/或表位不是由SARS-CoV ORF9b編碼或不是源自SARS-CoV ORF9b。在一些實施方式中，抗原和/或表位不是由SARS-CoV核衣殼（N）編碼或不是源自SARS-CoV核衣殼（N）。在一些實施方式中，抗原和/或表位不是由SARS-CoV ORF10編碼或不是源自SARS-CoV ORF10。在一些實施方式中，抗原和/或表位不是由SARS-CoV刺突（S）、包膜（E）、膜（M）和核衣殼（N）編碼或不是源自SARS-CoV刺突（S）、包膜（E）、膜（M）和核衣殼（N）。
抗原和/或表位可由SARS-CoV2編碼或源自SARS-CoV2。
SARS-CoV-2基因組的非限制性實例在DB來源登錄號MN908947.3中提供，這係嚴重急性呼吸道症候群2分離株的完整基因組序列，其內容藉由援引以其全文併入本文。DB來源登錄號MN908947.3: 21563-25384對應於S蛋白，其內容藉由援引以其全文併入本文。GenBank序列中提供了SARS-CoV-2刺突蛋白的非限制性實例：QHD43416.1，這係嚴重急性呼吸道症候群2分離株的刺突蛋白的序列，其內容藉由援引以其全文併入本文。
SARS-CoV-2基因組的非限制性實例在序列NCBI參考序列登錄號NC_045512，版本NC_045512.2中提供，這係嚴重急性呼吸道症候群2分離株Wuhan-Hu-1的完整基因組序列，其內容藉由援引以其全文併入本文。
在一些實施方式中，SAR-CoV-2基因組在www.gisaid.org.的GISAID數據庫中提供。在一些實施方式中，SARS-CoV-2基因組在www.insdc.org/的國際核苷酸序列數據庫協作（INSDC）中提供。
在一些實施方式中，本揭露之抗原和/或表位來自SARS-CoV-2基因組的預測轉錄物。在一些實施方式中，本揭露之抗原和/或表位來自由來自SARS-CoV-2基因組的開放閱讀框編碼的蛋白質，或其衍生物。SARS-CoV-2基因組中開放閱讀框的非限制性實例包括ORF1a、ORF1b、刺突（S）、ORF3a、包膜（E）、膜（M）、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8、核衣殼（N）和ORF10。在一些實施方式中，SARS-CoV-2基因組編碼ORF3b、ORF9a、ORF9b或其組合。在一些實施方式中，SARS-CoV-2基因組不編碼ORF3b、ORF9a、ORF9b或其任何組合。
表1中提供了胺基酸序列的非限制性實例。在一些實施方式中，抗原包含與來自表1的序列具有至少約80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%的序列同一性的序列。
[ 表 1] ： 由SARS-CoV-2基因組編碼的蛋白質的胺基酸序列的實例。
SEQ ID NO: 描述 序列
1 刺突（S）蛋白 MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT
2 包膜（E）蛋白 MYSFVSEETGTLIVNSVLLFLAFVVFLLVTLAILTALRLCAYCCNIVNVSLVKPSFYVYSRVKNLNSSRVPDLLV   
3 膜（M）蛋白 MADSNGTITVEELKKLLEQWNLVIGFLFLTWICLLQFAYANRNRFLYIIKLIFLWLLWPVTLACFVLAAVYRINWITGGIAIAMACLVGLMWLSYFIASFRLFARTRSMWSFNPETNILLNVPLHGTILTRPLLESELVIGAVILRGHLRIAGHHLGRCDIKDLPKEITVATSRTLSYYKLGASQRVAGDSGFAAYSRYRIGNYKLNTDHSSSSDNIALLVQ   
4 核衣殼（N）蛋白 MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA
5 ORF3a輔助蛋白 MDLFMRIFTIGTVTLKQGEIKDATPSDFVRATATIPIQASLPFGWLIVGVALLAVFQSASKIITLKKRWQLALSKGVHFVCNLLLLFVTVYSHLLLVAAGLEAPFLYLYALVYFLQSINFVRIIMRLWLCWKCRSKNPLLYDANYFLCWHTNCYDYCIPYNSVTSSIVITSGDGTTSPISEHDYQIGGYTEKWESGVKDCVVLHSYFTSDYYQLYSTQLSTDTGVEHVTFFIYNKIVDEPEEHVQIHTIDGSSGVVNPVMEPIYDEPTTTTSVPL   
6 ORF6輔助蛋白 MFHLVDFQVTIAEILLIIMRTFKVSIWNLDYIINLIIKNLSKSLTENKYSQLDEEQPMEID   
7 ORF7a輔助蛋白 MKIILFLALITLATCELYHYQECVRGTTVLLKEPCSSGTYEGNSPFHPLADNKFALTCFSTQFAFACPDGVKHVYQLRARSVSPKLFIRQEEVQELYSPIFLIVAAIVFITLCFTLKRKTE   
8 ORF7b輔助蛋白 MIELSLIDFYLCFLAFLLFLVLIMLIIFWFSLELQDHNETCHA   
9 ORF8輔助蛋白 MKFLVFLGIITTVAAFHQECSLQSCTQHQPYVVDDPCPIHFYSKWYIRVGARKSAPLIELCVDEAGSKSPIQYIDIGNYTVSCLPFTINCQEPKLGSLVVRCSFYEDFLEYHDVRVVLDFI   
10 ORF10輔助蛋白 MGYINVFAFPFTIYSLLLCRMNSRNYIAQVDVVNFNLT   
由SARS-CoV-2基因組編碼的蛋白質的其他非限制性實例包括具有以下NCBI登錄號的內容的那些：MT334522、MT334523、MT334524、MT334525、MT334526、MT334527、MT334528、MT334529、MT334530、MT334531、MT334532、MT334533、MT334534、MT334535、MT334536、MT334537、MT334538、MT334539、MT334540、MT334541、MT334542、MT334543、MT334544、MT334545、MT334546、MT334555、MT334547、MT334548、MT334549、MT334550、MT334551、MT334552、MT334553、MT334554、MT334556、MT334557、MT334558、MT334559、MT334560、MT334561、MT334562、MT334563、MT334564、MT334565、MT334566、MT334567、MT334568、MT334569、MT334570、MT334571、MT334572、MT334573、MT326097、MT326106、MT326107、MT326116、MT326117、MT326124、MT326125、MT326126、MT326127、MT326134、MT326135、MT326136、MT326137、MT326138、MT326139、MT326140、MT326141、MT326142、MT326143、MT326144、MT326145、MT326146、MT326148、MT326149、MT326150、MT326151、MT326152、MT326158、MT326159、MT326160、MT326161、MT326162、MT326168、MT326169、MT326170、MT326171、MT326172、MT326178、MT326179、MT326180、MT326181、MT326182、MT326183、MT326188、MT326189、MT326190、MT326191、MT326129、MT326121、MT326120、MT326119、MT326118、MT326111、MT326023、MT326025、MT326033、MT326035、MT326036、MT326040、MT326043、MT326045、MT326053、MT326055、MT326056、MT326063、MT326066、MT326070、MT326071、MT326072、MT326075、MT326076、MT326078、MT326079、MT326089、MT325563、MT325565、MT325566、MT326155、MT326163、MT326177、MT326130、MT326128、MT326110、MT326109、MT326108、MT326101、MT326100、MT326099、MT326098、MT326094、MT326093、MT326092、MT325568、MT325569、MT325590、MT325640、MT325606、MT325607、MT325608、MT325609、MT325610、MT325611、MT325616、MT325618、MT325619、MT325620、MT325622、MT325623、MT325624、MT325599、MT325600、MT325601、MT325602、MT325612、MT325613、MT325615、MT325617、MT325625、MT324062、MT324684、MT325573、MT325574、MT325577、MT325579、MT325586、MT325592、MT325593、MT325594、MT325598、MT325605、MT325626、MT325627、MT325633、MT325634、MT326028、MT326031、MT326091、MT326090、MT326085、MT326084、MT326083、MT326082、MT326081、MT326080、MT326077、MT326067、MT326057、MT326024、MT326026、MT326027、MT326032、MT326034、MT326037、MT326039、MT326041、MT326042、MT326044、MT326046、MT326047、MT326049、MT326050、MT326051、MT326052、MT326054、MT326059、MT326060、MT326061、MT326062、MT326064、MT326065、MT326068、MT326069、MT326073、MT326074、MT326088、MT327745、MT324679、MT325561、MT325571、MT325572、MT325575、MT325583、MT325587、MT325588、MT325589、MT325596、MT325597、MT325603、MT325604、MT325614、MT325621、MT325629、MT325630、MT325631、MT325632、MT325635、MT325636、MT325637、MT325638、MT325639、MT326086、MT326096、MT326102、MT326104、MT326105、MT326112、MT326113、MT326114、MT326115、MT326122、MT328034、MT325564、MT325567、MT326164、MT326165、MT326173、MT326174、MT326184、MT326185、MT326186、MT326187、MT325584、MT325585、MT326087、MT326095、MT326103、MT326123、MT326131、MT326132、MT326133、MT328033、MT325562、MT326147、MT326153、MT326154、MT326156、MT326157、MT326166、MT326167、MT326175、MT326176、MT324680、MT325570、MT325576、MT325578、MT325580、MT325581、MT325582、MT325591、MT325595、MT325628、MT326029、MT326030、MT326038、MT326048、MT326058、MT324681、MT324682、MT324683、MT328032、MT328035、MT322404、MT039874、MT322398、MT322409、MT322421、MT322423、MT322408、MT322413、MT322417、MT322394、MT322407、MT322418、MT322424、MT322411、MT077125、MT322395、MT322396、MT322397、MT322399、MT322400、MT322401、MT322402、MT322403、MT322405、MT322406、MT322414、MT322416、MT322419、MT322420、MT322410、MT322412、MT322415、MT322422、MT320538、MT320891、MT308692、MT308693、MT308695、MT308696、MT308698、MT308699、MT308701、MT308703、MT308704、MT308694、MT308697、MT308700、MT308702、MT293547、MT304476、MT304474、MT304475、MT304477、MT304478、MT304479、MT304481、MT304482、MT304484、MT304485、MT304486、MT304487、MT304488、MT304491、MT304480、MT304483、MT304489、MT304490、MT300186、MT292571、MT292576、MT292578、MT293186、MT292570、MT292573、MT293173、MT292575、MT293179、MT293180、MT293184、MT293189、MT293192、MT293193、MT293194、MT293201、MT293202、MT292572、MT292577、MT293185、MT293187、MT293188、MT291826、MT291832、MT291833、MT291835、MT291836、MT291831、MT293170、MT292574、MT293178、MT293181、MT293183、MT293195、MT293196、MT293197、MT293203、MT293204、MT293223、MT293212、MT293214、MT293215、MT293216、MT293219、MT293224、MT293225、MT293206、MT293208、MT293209、MT293221、MT295464、MT293160、MT293166、MT293171、MT293190、MT293161、MT293167、MT293168、MT293174、MT293175、MT293182、MT293191、MT293158、MT293162、MT293163、MT293164、MT293156、MT293157、MT293159、MT291834、MT291829、MT291827、MT291830、MT291828、MT293169、MT293200、MT293210、MT293211、MT293217、MT293218、MT295465、MT293198、MT293205、MT293207、MT293213、MT293220、MT293222、MT292581、MT292569、MT293172、MT293177、MT293176、MT293199、MT292580、MT292582、MT293165、MT292579、MT273658、MT281577、MT281530、MT276597、MT276598、MT276323、MT276328、MT276331、MT276329、MT276330、MT276324、MT276325、MT276327、MT276326、MT263388、MT263392、MT262900、MT262902、MT262906、MT262908、MT262912、MT262913、MT262914、MT262993、MT263074、MT263381、MT263391、MT262901、MT262903、MT262907、MT262909、MT262911、MT262899、MT262904、MT262915、MT262916、MT262897、MT262898、MT262905、MT262910、MT263400、MT263382、MT263383、MT263384、MT263385、MT262896、MT263407、MT263415、MT263406、MT263408、MT263422、MT263469、MT263439、MT263457、MT263459、MT263432、MT263450、MT263458、MT263467、MT263401、MT263411、MT263413、MT263426、MT263421、MT263443、MT263412、MT263416、MT263417、MT263423、MT263431、MT263461、MT263410、MT263424、MT263425、MT263427、MT263442、MT263402、MT263405、MT263409、MT263418、MT263419、MT263398、MT263399、MT263403、MT263404、MT263414、MT263430、MT263390、MT263434、MT263436、MT263446、MT263448、MT263452、MT263453、MT263456、MT263462、MT263463、MT263386、MT263387、MT263389、MT263428、MT263429、MT263433、MT263435、MT263437、MT263438、MT263440、MT263447、MT263449、MT263455、MT263444、MT263445、MT263451、MT263466、MT263420、MT263441、MT263454、MT263464、MT263465、MT263468、MT263460、MT263393、MT263394、MT263395、MT263396、MT263397、MT259226、MT259275、MT259276、MT259279、MT259247、MT258377、MT258378、MT258379、MT259231、MT259228、MT259238、MT259248、MT256917、MT259227、MT259236、MT256918、MT258380、MT259235、MT259237、MT259239、MT259281、MT259282、MT259283、MT259240、MT259243、MT259249、MT259250、MT259251、MT259256、MT259258、MT259266、MT259267、MT259274、MT259286、MT259287、MT259241、MT259242、MT258381、MT259257、MT259261、MT259262、MT259263、MT259264、MT259268、MT259269、MT259270、MT259271、MT259272、MT259273、MT259277、MT259278、MT259280、MT258383、MT258382、MT259246、MT256924、MT259244、MT259245、MT259252、MT259253、MT259254、MT259255、MT259259、MT259284、MT259229、MT259230、MT259265、MT259260、MT259285、LC534419、LC534418、MT253710、MT253709、MT253705、MT253708、MT253701、MT253702、MT253703、MT253704、MT253706、MT253707、MT251972、MT251974、MT251975、MT251973、MT251976、MT251979、MT253697、MT253699、MT253696、MT253698、MT253700、MT251977、MT251978、MT251980、MT246451、MT246461、MT246471、MT246472、MT246474、MT246483、MT246450、MT246453、MT246454、MT246462、MT246463、MT246464、MT246470、MT246473、MT246480、MT246484、MT246449、MT246455、MT246456、MT246478、MT246485、MT246488、MT246452、MT246460、MT246465、MT246481、MT246482、MT246490、MT246459、MT246468、MT246475、MT246477、MT246479、MT246457、MT246458、MT246466、MT246467、MT246469、MT246476、MT246486、MT246487、MT246489、MT233526、MT246667、MT240479、MT232870、MT232871、MT233523、MT232869、MT232872、MT233519、MT233521、MT233522、MT233520、MT226610、MT198653、MT198651、MT198652、MT192773、MT192758、MT192772、MT192765、MT192759、MT188341、MT188340、MT188339、MT186676、MT186681、MT186677、MT186678、MT187977、MT186680、MT186682、MT186679、MT184909、MT184911、MT184912、MT184913、MT184910、MT184907、MT184908、CADDYA000000000、MT163718、MT163719、MT163720、MT163714、MT163715、MT163721、MT163717、MT163737、MT163738、MT163712、MT163716、MT159706、MT159716、MT159719、MT159707、MT159717、MT159709、MT159715、MT159718、MT159722、MT159708、MT161607、MT159705、MT159710、MT159711、MT159712、MT159713、MT159714、MT159720、MT159721、MT121215、MT159778、MT066156、LC529905、MT050493、MT012098、MT152900、MT152824、MT135044、MT135042、MT135041、MT135043、MT126808、MT127113、MT127114、MT127116、MT127115、LC528232、LC528233、MT123293、MT123291、MT123290、MT123292、MT118835、MT111896、MT111895、MT106052、MT106053、MT106054、MT093571、MT093631、MT081061、MT081063、MT081066、MT081062、MT081064、MT081065、MT081067、MT081059、MT081060、MT081068、MT072667、MT072668、MT072688、MT066157、MT066176、MT066159、MT066175、MT066158、LC523809、LC523807、LC523808、MT044258、MT044257、MT050416、MT050417、MT042773、MT042774、MT042775、MT042776、MT049951、MT050414、MT050415、MT042777、MT042778、MT039887、MT039888、MT039890、MT039873、LC522350、MT027062、MT027063、MT027064、MT020881、MT019530、MT019531、MT019533、MT020880、MT019532、MT019529、MT020781、LR757995、LR757998、LR757996、LR757997、MT007544、MT008022、MT008023、MN996531、MN996530、MN996527、MN996528、MN996529、MN997409、MN988668、MN988669、MN994467、MN994468、MN988713、MN938384、MN975262、MN985325、MN938386、MN938388、MN938385、MN938387、MN938390、MN938389、MN975263、MN975267、MN975268、MN975265、MN975264、MN975266、MN970004、MN970003、MN908947，其內容藉由援引以其全文併入。
在特定實施方式中，環狀多核糖核苷酸包含表 2 中描述的SARS-CoV-2抗原。在一些實施方式中，抗原包含與來自表 2 的序列具有至少約80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%的序列同一性的序列。
[ 表 2]. 構建體和SARS-CoV-2 ORF的描述
構建體 ORF （ SEQ ID NO. ） ORF 的描述 脯胺酸取代 選殖優化 環化優化 IRES
p1 SEQ ID NO. 12 1（13） S蛋白跨膜（TM）結構域完全去除，並添加了三聚化結構域 是 是 否 CVB3
p3 SEQ ID NO.14 3（15） S蛋白跨膜（TM）結構域完全完好 是 是 否 CVB3
p5 SEQ ID NO.16 5（17） S蛋白跨膜（TM）結構域部分去除（去除了195個核苷酸中的111個）（去除了核苷酸3709-3819） 是 是 否 CVB3
p7 SEQ ID NO.18 7（19） S蛋白跨膜（TM）結構域完全去除，並添加了三聚化結構域 是 是 是 CVB3
p9 SEQ ID NO.20 9（21） S蛋白跨膜（TM）結構域完全完好 是 是 是 CVB3
p11 SEQ ID NO.22 11（23） S蛋白跨膜（TM）結構域部分去除（去除了195個核苷酸中的111個）（去除了核苷酸3709-3819） 是 是 是 CVB3
p13 SEQ ID NO.24 13（25） S蛋白受體結合結構域（RBD）僅有分泌信號與5'末端翻譯融合 不適用 不適用 不適用 CVB3
p15 3（15） S蛋白跨膜（TM）結構域完全去除，並添加了三聚化結構域 是 是 不適用 EMCV
p17 5（17） S蛋白跨膜（TM）結構域完全完好 是 是 不適用 EMCV
p19 1（13） S蛋白跨膜（TM）結構域部分去除（去除了195個核苷酸中的111個）（去除了核苷酸3709-3819） 是 是 不適用 EMCV
p21 7（19） S蛋白跨膜（TM）結構域完全去除，並添加了三聚化結構域 是 是 是 EMCV
p23 9（21） S蛋白跨膜（TM）結構域完全完好 是 是 是 EMCV
p25 11（23） S蛋白跨膜（TM）結構域部分去除（去除了195個核苷酸中的111個）（去除了核苷酸3709-3819） 是 是 是 EMCV
p27 13（25） S蛋白受體結合結構域（RBD）僅有分泌信號與5'末端翻譯融合 不適用 不適用 不適用 EMCV
p33 33（26） S蛋白受體結合結構域（RBD）僅有分泌信號與5'末端翻譯融合並且去除了RBD II型終止子 不適用 不適用 不適用 EMCV
p35 35（27） S蛋白跨膜（TM）結構域完全完好且去除了RBD II型終止子 是 是 否 EMCV
p36 36（28） S蛋白跨膜（TM）結構域完全完好且去除了RBD II型終止子 是 是 是 EMCV
p39 39（29） S蛋白跨膜（TM）結構域完全完好。GC優化 不適用 不適用 不適用 EMCV
p41 41（30） S蛋白受體結合結構域（RBD）僅有分泌信號與5'末端翻譯融合並且去除了RBD II型終止子。GC優化 不適用 不適用 不適用 EMCV
p44 44（48） S蛋白受體結合結構域（RBD）僅有IL-2分泌信號與5'末端翻譯融合並且去除了RBD II型終止子 不適用 不適用 不適用 EMCV
p45 45（49） S蛋白受體結合結構域（RBD）僅有Gluc分泌信號與5'末端翻譯融合並且去除了RBD II型終止子 不適用 不適用 不適用 EMCV
在表 2 中，「脯胺酸取代」表示殘基986和987處的脯胺酸取代，以及弗林蛋白酶裂解位點（殘基682-685）處的「GSAS」取代。對於「選殖優化」，在座標2541處進行單鹼基取代以破壞BsaI位點，以協助質體DNA模板的金門選殖構建（Golden Gate Cloning construction）。對於「環化優化」：四個單核苷酸-在位置2307、2790、159和315處-被取代以破壞可潛在結合夾板核酸序列環化元件的位點，從而潛在地抑制有效連接。對於去除了II型終止子的構建體（例如，p33、p35、p36、p39、p41、p44和p45）：兩個單核苷酸-在位置1047、1049處，被取代以破壞II型終止子位點。對於具有GC優化的構建體（例如，p39和p41），進行GC優化以使GC含量為大約50%。所有單鹼基對取代都被設計為翻譯緘默。此外，在表 2 中，IRES係EMCV（SEQ ID NO: 31）或CVB3（SEQ ID NO: 45）。
在一些實施方式中，抗原或表位來自宿主受試者（例如，要免疫接種的受試者）細胞。例如，可以藉由使用來自於病毒用作進入因子的宿主細胞組分的抗原或表位來產生阻斷冠狀病毒進入的抗體。
在一些實施方式中，冠狀病毒表位包含或含有至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少24個、至少25個、至少26個、至少27個、至少28個、至少29個或至少30個胺基酸，或更多個胺基酸。在一些實施方式中，冠狀病毒表位包含或含有至多4個、至多5個、至多6個、至多7個、至多8個、至多9個、至多10個、至多11個、至多12個、至多13個、至多14個、至多15個、至多16個、至多17個、至多18個、至多19個、至多20個、至多21個、至多22個、至多23個、至多24個、至多25個、至多26個、至多27個、至多28個、至多29個或至多30個胺基酸，或更少的胺基酸。在一些實施方式中，冠狀病毒表位包含或含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個胺基酸。在一些實施方式中，冠狀病毒表位含有5個胺基酸。在一些實施方式中，冠狀病毒表位含有6個胺基酸。在一些實施方式中，表位含有7個胺基酸。在一些實施方式中，冠狀病毒表位含有8個胺基酸。在一些實施方式中，表位可以是約8至約11個胺基酸。在一些實施方式中，表位可以是約9至約22個胺基酸。
冠狀病毒抗原可以包括被B細胞識別的抗原、被T細胞識別的抗原或其組合。在一些實施方式中，抗原包括被B細胞識別的抗原。在一些實施方式中，冠狀病毒抗原係被B細胞識別的抗原。在一些實施方式中，冠狀病毒抗原包括被T細胞識別的抗原。在一些實施方式中，抗原係被T細胞識別的抗原。
冠狀病毒表位包括被B細胞識別的抗原、被T細胞識別的抗原或其組合。在一些實施方式中，冠狀病毒表位包括被B細胞識別的表位。在一些實施方式中，表位係被B細胞識別的表位。在一些實施方式中，冠狀病毒表位包括被T細胞識別的表位。在一些實施方式中，冠狀病毒表位係被T細胞識別的表位。
例如，用於經由電腦模擬鑒定抗原和表位的技術例如在Sanchez-Trincado等人(2017)，Fundamentals and methods for T-and B-cell epitope prediction. [T細胞和B細胞表位預測的基本原理和方法], Journal of immunology research [免疫學研究雜誌]；Grifoni, Alba等人，A Sequence Homology and Bioinformatic Approach Can Predict Candidate Targets for Immune Responses to SARS-CoV-2 [序列同源性和生物資訊學方法可以預測SARS-CoV-2免疫反應的候選靶標], Cell host & microbe [細胞宿主與微生物] (2020)；Russi等人，In silico prediction of T-and B-cell epitopes in PmpD: First step towards to the design of a Chlamydia trachomatis vaccine [PmpD中T細胞和B細胞表位的電腦模擬預測：設計沙眼衣原體疫苗的第一步], biomedical journal [生物醫學雜誌] 41.2 (2018): 109-117；Baruah等人，Immunoinformatics‐aided identification of T cell and B cell epitopes in the surface glycoprotein of 2019‐nCoV [免疫資訊學輔助鑒定2019‐nCoV表面糖蛋白中的T細胞和B細胞表位], Journal of Medical Virology [醫學病毒學雜誌] (2020)中已經揭露；其每一者均藉由援引以其全文併入本文。
本揭露之環狀多核糖核苷酸可以包含許多冠狀病毒抗原和/或表位的序列。環狀多核糖核苷酸包含例如至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少15種、至少20種、至少25種、至少30種、至少40種、至少50種、至少60種、至少70種、至少80種、至少90種、至少100種、至少120種、至少140種、至少160種、至少180種、至少200種、至少250種、至少300種、至少350種、至少400種、至少450種、至少500種或更多種冠狀病毒抗原或表位的序列。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包含例如至多1種、至多2種、至多3種、至多4種、至多5種、至多6種、至多7種、至多8種、至多9種、至多10種、至多15種、至多20種、至多25種、至多30種、至多40種、至多50種、至多60種、至多70種、至多80種、至多90種、至多100種、至多120種、至多140種、至多160種、至多180種、至多200種、至多250種、至多300種、至多350種、至多400種、至多450種、至多500種或更少的冠狀病毒抗原或表位的序列。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包含例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450或500種冠狀病毒抗原或表位的序列。
環狀多核糖核苷酸可以包含來自冠狀病毒抗原的一個或多個冠狀病毒表位的序列。例如，冠狀病毒抗原可以包含胺基酸序列，其中可以含有多個冠狀病毒表位（例如，被B細胞和/或T細胞識別的表位），並且環狀多核糖核苷酸可以包含或編碼那些冠狀病毒表位中的一個或多個表位。
環狀多核糖核苷酸包含來自一種冠狀病毒抗原的例如至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個、至少100個、至少120個、至少140個、至少160個、至少180個、至少200個、至少250個、至少300個、至少350個、至少400個、至少450個、至少500個或更多個表位的序列。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包含來自一種冠狀病毒抗原的例如至多2個、至多3個、至多4個、至多5個、至多6個、至多7個、至多8個、至多9個、至多10個、至多15個、至多20個、至多25個、至多30個、至多40個、至多50個、至多60個、至多70個、至多80個、至多90個、至多100個、至多120個、至多140個、至多160個、至多180個、至多200個、至多250個、至多300個、至多350個、至多400個、至多450個、或至多500個或更少的冠狀病毒表位的序列。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包含來自一種冠狀病毒抗原的例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450或500個冠狀病毒表位的序列。
環狀多核糖核苷酸可以編碼冠狀病毒抗原或表位的變體。變體可以是天然存在的變體（例如，在來自不同的冠狀病毒屬、種、分離株或凖種的序列數據中鑒定的變體），或者可以是如本文所揭露的已經經由電腦模擬生成的衍生序列（例如，與野生型抗原或表位相比具有一個或多個胺基酸插入、缺失、取代或其組合的抗原或表位）。
環狀多核糖核苷酸包含例如冠狀病毒抗原或表位的至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少15種、至少20種、至少25種、至少30種、至少40種、至少50種、至少60種、至少70種、至少80種、至少90種、至少100種、至少120種、至少140種、至少160種、至少180種、至少200種、至少250種、至少300種、至少350種、至少400種、至少450種、至少500種或更多種變體的序列。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包含例如冠狀病毒抗原或表位的至多2種、至多3種、至多4種、至多5種、至多6種、至多7種、至多8種、至多9種、至多10種、至多15種、至多20種、至多25種、至多30種、至多40種、至多50種、至多60種、至多70種、至多80種、至多90種、至多100種、至多120種、至多140種、至多160種、至多180種、至多200種、至多250種、至多300種、至多350種、至多400種、至多450種、至多500種、或更少的變體的序列。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包含例如冠狀病毒抗原或表位的約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450或500種變體的序列。
環狀多核糖核苷酸的冠狀病毒抗原和/或表位序列也可稱為冠狀病毒表現序列。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包含一個或多個冠狀病毒表現序列，其中每一個都可以可編碼冠狀病毒多肽。冠狀病毒多肽可以大量產生。冠狀病毒多肽可以是從細胞分泌的或定位於細胞的細胞質、細胞核或膜隔室的冠狀病毒多肽。一些冠狀病毒多肽包括但不限於如本文所揭露的抗原、如本文所揭露的表位、冠狀病毒蛋白的至少一部分（例如，病毒包膜蛋白、病毒基質蛋白、病毒刺突蛋白、病毒刺突蛋白的病毒受體結合結構域（RBD）、病毒膜蛋白、病毒核衣殼蛋白、病毒輔助蛋白、其片段或其組合）。在一些實施方式中，由本揭露之環狀多核糖核苷酸編碼的冠狀病毒多肽包含本文揭露的冠狀病毒抗原的片段。在一些實施方式中，由本揭露之環狀多核糖核苷酸編碼的冠狀病毒多肽包含融合蛋白，該融合蛋白包含兩種或更多種本文揭露的冠狀病毒抗原或其片段。在一些實施方式中，由本揭露之環狀多核糖核苷酸編碼的冠狀病毒多肽包含冠狀病毒表位。在一些實施方式中，由本揭露之環狀多核糖核苷酸編碼的多肽包含融合蛋白，該融合蛋白包含兩個或更多個本文揭露的冠狀病毒表位，例如包含來自本揭露之一種或多種冠狀病毒的多個預測表位的人工肽序列。
在一些實施方式中，從本文揭露的環狀多核糖核苷酸表現的示例性冠狀病毒蛋白包括分泌蛋白，例如天然包括訊息肽的蛋白（例如抗原和/或表位），或通常不編碼訊息肽，但是經修飾含有訊息肽的蛋白。
在一些情況下，環狀多核糖核苷酸表現如下的分泌性冠狀病毒蛋白，該分泌性冠狀病毒蛋白在血液中具有較短半衰期，或者可以是具有亞細胞定位信號的蛋白，或者係具有分泌訊息肽的蛋白。在一些情況下，環狀多核糖核苷酸表現如下的跨膜結構域，該跨膜結構域在血液中具有較短半衰期，或者可以是具有亞細胞定位信號的蛋白，或者係具有分泌肽的蛋白。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包含一個或多個冠狀病毒表現序列，並被配置用於在受試者（例如，要免疫接種的受試者）體內的細胞中持續表現。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸被配置為使得該一個或多個冠狀病毒表現序列在細胞中在較晚的時間點的表現等於或高於較早的時間點的表現。在此類實施方式中，該一個或多個冠狀病毒表現序列的表現可以維持在相對穩定的水平或可以隨時間增加。在一些實施方式中，冠狀病毒表現序列的表現長期相對穩定。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸在受試者（例如，要免疫接種的受試者）中，例如瞬時或長期表現一種或多種冠狀病毒抗原和/或表位。在某些實施方式中，冠狀病毒表現序列的表現持續至少約1小時至約30天，或至少約2小時、6小時、12小時、18小時、24小時、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天或更長時間或介於之間的任何時間。在某些實施方式中，冠狀病毒抗原和/或表位的表現持續不超過約30分鐘至約7天、或不超過約1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、13小時、14小時、15小時、16小時、17小時、18小時、19小時、20小時、21小時、22小時、24小時、36小時、48小時、60小時、72小時、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、45天、60天、75天、90天或介於之間的任何時間。
在一些實施方式中，冠狀病毒表現序列的長度小於5000 bp（例如，小於約5000 bp、4000 bp、3000 bp、2000 bp、1000 bp、900 bp、800 bp、700 bp、600 bp、500 bp、400 bp、300 bp、200 bp、100 bp、50 bp、40 bp、30 bp、20 bp、10 bp或更小）。在一些實施方式中，冠狀病毒表現序列獨立地或額外地具有大於10 bp的長度（例如，至少約10 bp、20 bp、30 bp、40 bp、50 bp、60 bp、70 bp、80 bp、90 bp、100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600 bp、700 bp、800 bp、900 bp、1000 kb、1.1 kb、1.2 kb、1.3 kb、1.4 kb、1.5 kb、1.6 kb、1.7 kb、1.8 kb、1.9 kb、2 kb、2.1 kb、2.2 kb、2.3 kb、2.4 kb、2.5 kb、2.6 kb、2.7 kb、2.8 kb、2.9 kb、3 kb、3.1 kb、3.2 kb、3.3 kb、3.4 kb、3.5 kb、3.6 kb、3.7 kb、3.8 kb、3.9 kb、4 kb、4.1 kb、4.2 kb、4.3 kb、4.4 kb、4.5 kb、4.6 kb、4.7 kb、4.8 kb、4.9 kb、5 kb或更大）。
1. 衍生物和片段
本揭露之抗原或表位可以包含野生型序列。當描述抗原或表位時，術語「野生型」係指天然存在的且由基因組（例如，冠狀病毒基因組）編碼的序列（例如，胺基酸序列）。冠狀病毒可以具有一個野生型序列或者具有兩個或更多個野生型序列（例如，在參考冠狀病毒基因組中存在一個規範的野生型序列，並且存在由突變產生的其他變體的野生型序列）。
當描述抗原或表位時，術語「衍生物」和「源自」係指與野生型序列的不同之處在於一個或多個胺基酸，例如相對於野生型序列含有一個或多個胺基酸插入、缺失和/或取代的序列（例如，胺基酸序列）。
抗原或表位衍生物序列係與野生型序列（例如，野生型蛋白質、抗原或表位序列）具有至少60%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性的序列。
「序列同一性」和「序列相似性」係藉由使用全域或局部比對演算法對兩個肽或兩個核苷酸序列進行比對來確定的。當序列（例如，藉由程式GAP或BESTFIT使用預設參數進行最佳比對時）至少具有某個最小百分比的序列同一性時，則可以將它們稱為「基本上相同」或「基本相似」。GAP使用Needleman和Wunsch全域比對演算法在兩個序列的整個長度上對其進行比對，從而最大程度地增加了匹配數目並最大程度地減少了空位數目。通常，使用GAP預設參數，空位產生罰分=50（核苷酸）/8（蛋白質），空位延伸罰分=3（核苷酸）/2（蛋白質）。對於核苷酸，使用的預設評分矩陣係nwsgapdna而對於蛋白質，使用的預設評分矩陣係Blosum62（Henikoff和Henikoff, 1992, PNAS [美國國家科學院院刊] 89, 915-919）。序列比對和百分比序列同一性的評分可以使用電腦程式來確定，諸如可從美國92121-3752加州聖地牙哥斯克蘭頓路9685號的阿賽樂德公司（Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA）獲得的GCG Wisconsin套裝軟體10.3版或EmbossWin 2.10.0版（使用程式「needle」）確定。替代性地或另外，藉由使用諸如FASTA、BLAST等的演算法對數據庫進行搜索來確定相似性或同一性百分比。序列同一性係指在序列的整個長度上的序列同一性。
在一些實施方式中，抗原或表位含有影響所編碼的蛋白質的結構的一個或多個胺基酸插入、缺失、取代或其組合。在一些實施方式中，抗原或表位含有影響所編碼的蛋白質的功能的一個或多個胺基酸插入、缺失、取代或其組合。在一些實施方式中，抗原或表位含有影響細胞對所編碼的蛋白質的表現或加工的一個或多個胺基酸插入、缺失、取代或其組合。
胺基酸的插入、缺失、取代或其組合可以引入翻譯後修飾的位點（例如，引入糖基化、泛素化、磷酸化、亞硝基化、甲基化、乙醯化、醯胺化、羥基化、硫酸化或脂質化位點，或靶向進行裂解的序列）。在一些實施方式中，胺基酸的插入、缺失、取代或其組合去除翻譯後修飾的位點（例如，去除糖基化、泛素化、磷酸化、亞硝基化、甲基化、乙醯化、醯胺化、羥基化、硫酸化或脂質化位點，或靶向進行裂解的序列）。在一些實施方式中，胺基酸的插入、缺失、取代或其組合修飾翻譯後修飾的位點（例如，修飾位點以改變糖基化、泛素化、磷酸化、亞硝基化、甲基化、乙醯化、醯胺化、羥基化、硫酸化或脂質化位點，或裂解的效率或特徵）。
胺基酸取代可以是保守性或非保守性取代。保守性胺基酸取代可以是一個胺基酸被具有類似生物化學性質（例如，電荷、大小和/或疏水性）的另一胺基酸取代。非保守性胺基酸取代可以是一個胺基酸被具有不同生物化學性質（例如，電荷、大小和/或疏水性）的另一胺基酸取代。保守性胺基酸變化可以是例如對多肽的二級或三級結構影響最小的取代。保守性胺基酸變化可以是從一種親水性胺基酸到另一種親水性胺基酸的胺基酸變化。親水性胺基酸可以包括Thr（T）、Ser（S）、His（H）、Glu（E）、Asn（N）、Gln（Q）、Asp（D）、Lys（K）和Arg（R）。保守性胺基酸變化可以是從一種疏水性胺基酸到另一種親水性胺基酸的胺基酸變化。疏水性胺基酸可以包括Ile（I）、Phe（F）、Val（V）、Leu（L）、Trp（W）、Met（M）、Ala（A）、Gly（G）、Tyr（Y）和Pro（P）。保守性胺基酸變化可以是從一種酸性胺基酸到另一種酸性胺基酸的胺基酸變化。酸性胺基酸可以包括Glu（E）和Asp（D）。保守性胺基酸變化可以是從一種鹼性胺基酸到另一種鹼性胺基酸的胺基酸變化。鹼性胺基酸可以包括His（H）、Arg（R）和Lys（K）。保守性胺基酸變化可以是從一種極性胺基酸到另一種極性胺基酸的胺基酸變化。極性胺基酸可以包括Asn（N）、Gln（Q）、Ser（S）和Thr（T）。保守性胺基酸變化可以是從一種非極性胺基酸到另一種非極性胺基酸的胺基酸變化。非極性胺基酸可以包括Leu（L）、Val（V）、Ile（I）、Met（M）、Gly（G）和Ala（A）。保守性胺基酸變化可以是從一種芳族胺基酸到另一種芳族胺基酸的胺基酸變化。芳族胺基酸可以包括Phe（F）、Tyr（Y）和Trp（W）。保守性胺基酸變化可以是從一種脂族胺基酸到另一種脂族胺基酸的胺基酸變化。脂族胺基酸可以包括Ala（A）、Val（V）、Leu（L）和Ile（I）。在一些實施方式中，保守性胺基酸取代係以下各類之一的一個胺基酸到另一胺基酸的胺基酸變化：I類：ala、pro、gly、gln、asn、ser、thr；II類：cys、ser、tyr、thr；III類：val、ile、leu、met、ala、phe；IV類：lys、arg、his；V類：phe、tyr、trp、his；和VI類：asp、glu。
在一些實施方式中，本揭露之抗原衍生物或表位衍生物相對於本文揭露的序列（例如，野生型序列）包括至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個或至少100個胺基酸缺失。
在一些實施方式中，本揭露之抗原衍生物或表位衍生物相對於本文揭露的序列（例如，野生型序列）包括至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個或至少50個胺基酸取代。
在一些實施方式中，本揭露之抗原衍生物或表位衍生物相對於本文揭露的序列（例如，野生型序列）包括至多1個、至多2個、至多3個、至多4個、至多5個、至多6個、至多7個、至多8個、至多9個、至多10個、至多11個、至多12個、至多13個、至多14個、至多15個、至多16個、至多17個、至多18個、至多19個、至多20個、至多25個、至多30個、至多35個、至多40個、至多45個或至多50個胺基酸取代。
在一些實施方式中，本揭露之抗原衍生物或表位衍生物相對於本文揭露的序列（例如，野生型序列）包括1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-15、1-20、1-30、1-40、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、2-15、2-20、2-30、2-40、3-3、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、3-15、3-20、3-30、3-40、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、5-15、5-20、5-30、5-40、10-15、15-20或20-25個胺基酸取代。
在一些實施方式中，本揭露之抗原衍生物或表位衍生物相對於本文揭露的序列（例如，野生型序列）包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸取代。
這一個或多個胺基酸取代可以處於N端、C端、胺基酸序列內，或為其組合。該等胺基酸取代可以是連續的、非連續的或其組合。
在一些實施方式中，本揭露之抗原衍生物或表位衍生物相對於本文揭露的序列（例如，野生型序列）包括至多1個、至多2個、至多3個、至多4個、至多5個、至多6個、至多7個、至多8個、至多9個、至多10個、至多11個、至多12個、至多13個、至多14個、至多15個、至多16個、至多17個、至多18個、至多19個、至多20個、至多25個、至多30個、至多35個、至多40個、至多45個、至多50個、至多60個、至多70個、至多80個、至多90個、至多100個、至多120個、至多140個、至多160個、至多180個或至多200個胺基酸缺失。
在一些實施方式中，本揭露之抗原衍生物或表位衍生物相對於本文揭露的序列（例如，野生型序列）包括1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-15、1-20、1-30、1-40、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、2-15、2-20、2-30、2-40、3-3、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、3-15、3-20、3-30、3-40、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、5-15、5-20、5-30、5-40、10-15、15-20、20-25、20-30、30-50、50-100或100-200個胺基酸缺失。
在一些實施方式中，本揭露之抗原衍生物或表位衍生物相對於本文揭露的序列（例如，野生型序列）包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸缺失。
這一個或多個胺基酸缺失可以處於N端、C端、胺基酸序列內，或為其組合。該等胺基酸缺失可以是連續的、非連續的或其組合。
在一些實施方式中，本揭露之抗原衍生物或表位衍生物相對於本文揭露的序列（例如，野生型序列）包括至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個或至少50個胺基酸插入。
在一些實施方式中，本揭露之免疫原衍生物或表位衍生物相對於本文揭露的序列（例如，野生型序列）包括至多1個、至多2個、至多3個、至多4個、至多5個、至多6個、至多7個、至多8個、至多9個、至多10個、至多11個、至多12個、至多13個、至多14個、至多15個、至多16個、至多17個、至多18個、至多19個、至多20個、至多25個、至多30個、至多35個、至多40個、至多45個或至多50個胺基酸插入。
在一些實施方式中，本揭露之抗原衍生物或表位衍生物相對於本文揭露的序列（例如，野生型序列）包括1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-15、1-20、1-30、1-40、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、2-15、2-20、2-30、2-40、3-3、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、3-15、3-20、3-30、3-40、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、5-15、5-20、5-30、5-40、10-15、15-20或20-25個胺基酸插入。
在一些實施方式中，本揭露之免疫原衍生物或表位衍生物相對於本文揭露的序列（例如，野生型序列）包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸插入。
這一個或多個胺基酸插入可以處於N端、C端、胺基酸序列內，或為其組合。該等胺基酸插入可以是連續的、非連續的或其組合。
B. 環狀多核糖核苷酸
環狀多核糖核苷酸包含如下所述之元件以及本文所述之冠狀病毒抗原或表位。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸為至少約20個核苷酸、至少約30個核苷酸、至少約40個核苷酸、至少約50個核苷酸、至少約75個核苷酸、至少約100個核苷酸、至少約200個核苷酸、至少約300個核苷酸、至少約400個核苷酸、至少約500個核苷酸、至少約1,000個核苷酸、至少約2,000個核苷酸、至少約5,000個核苷酸、至少約6,000個核苷酸、至少約7,000個核苷酸、至少約8,000個核苷酸、至少約9,000個核苷酸、至少約10,000個核苷酸、至少約12,000個核苷酸、至少約14,000個核苷酸、至少約15,000個核苷酸、至少約16,000個核苷酸、至少約17,000個核苷酸、至少約18,000個核苷酸、至少約19,000個核苷酸或至少約20,000個核苷酸。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸可以具有足夠的大小以容納核糖體的結合位點。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸的最大大小可以與產生環狀多核糖核苷酸和/或使用環狀多核糖核苷酸的技術限制內的一樣大。不受任何特定理論的束縛，有可能RNA的多個區段可以從DNA產生並且其5'游離末端和3'游離末端退火以產生一「串」RNA，當只留有一個5'游離末端和一個3'游離末端時，該「串」RNA最終可能會被環化。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸的最大尺寸可能受包裝RNA並將其遞送至靶標的能力所限制。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸的大小係足以編碼有用的多肽（諸如本揭露之抗原和/或表位）的長度，並且因此至少20,000個核苷酸、至少15,000個核苷酸、至少10,000個核苷酸、至少7,500個核苷酸或至少5,000個核苷酸、至少4,000個核苷酸、至少3,000個核苷酸、至少2,000個核苷酸、至少1,000個核苷酸、至少500個核苷酸、至少400個核苷酸、至少300個核苷酸、至少200個核苷酸、至少100個核苷酸、或至少70個核苷酸的長度可能是有用的。
1. 環狀多核糖核苷酸元件
在一些實施方式中，除了包含編碼冠狀病毒抗原和/或表位的序列之外，環狀多核糖核苷酸還包含如本文所述之元件中的一種或多種。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺乏聚A序列，缺乏游離的3'末端，缺乏RNA聚合酶識別模體，或它們的任何組合。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括如特此藉由援引以其全文併入本文的WO 2019/118919中揭露的任何特徵或特徵的任何組合。例如，環狀多核糖核苷酸包含調控元件，例如修飾環狀多核糖核苷酸內表現序列的表現的序列。調控元件可以包括位置與編碼表現產物的表現序列相鄰的序列。調控元件可以可操作地連接至相鄰序列。與不存在調控元件時表現的產物的量相比，調控元件可以增加表現的產物的量。另外，一個調控元件可以增加串聯連接的多個表現序列表現的產物的量。因此，一種調控元件可以增強一個或多個表現序列的表現。也可以使用多種調控元件，例如，差異性地調控不同表現序列的表現。在一些實施方式中，本文提供的調控元件可以包括選擇性翻譯序列。如本文所用，術語「選擇性翻譯序列」係指選擇性地起始或激活環狀多核糖核苷酸中的表現序列的翻譯的核酸序列，例如某些核糖開關適體酶。調控元件還可以包括選擇性降解序列。如本文所用，術語「選擇性降解序列」係指起始環狀多核糖核苷酸或環狀多核糖核苷酸的表現產物的降解的核酸序列。在一些實施方式中，調控元件係翻譯調節子。翻譯調節子可以調節環狀多核糖核苷酸中表現序列的翻譯。翻譯調節子可以是翻譯增強子或翻譯抑制子。在一些實施方式中，翻譯起始序列可以充當調控元件。在WO 2019/118919的段落[0154]-[0161]中描述了調控元件的其他實例，該專利特此藉由援引以其全文併入。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸編碼產生目標人多株抗體的抗原並包含翻譯起始序列，例如起始密碼子。在一些實施方式中，翻譯起始序列包括科紮克或夏因-達爾加諾（Shine-Dalgarno）序列。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括與表現序列相鄰的翻譯起始序列，例如科紮克序列。在一些實施方式中，翻譯起始序列係非編碼起始密碼子。在一些實施方式中，翻譯起始序列（例如科紮克序列）存在於每個表現序列的一側或兩側，導致表現產物的隔開。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括與表現序列相鄰的至少一個翻譯起始序列。在一些實施方式中，翻譯起始序列為環狀多核糖核苷酸提供構象柔性。在一些實施方式中，翻譯起始序列基本上在環狀多核糖核苷酸的單鏈區域內。在WO 2019/118919的段落[0163]-[0165]中描述了翻譯起始序列的其他實例，該專利特此藉由援引以其全文併入。
在一些實施方式中，本文所述之環狀多核糖核苷酸包含內部核糖體進入位點（IRES）元件。包括在環狀多核糖核苷酸中的合適的IRES元件可以是能夠接合真核核糖體的RNA序列。在WO 2019/118919的段落[0166]-[0168]中描述了IRES的其他實例，該專利特此藉由援引以其全文併入。
環狀多核糖核苷酸可以包括一個或多個表現序列（例如，編碼抗原），並且每個表現序列可以具有或可以不具有終止元件。在WO 2019/118919的段落[0169]-[0170]中描述了終止元件的其他實例，該專利特此藉由援引以其全文併入。
本揭露之環狀多核糖核苷酸可以包含交錯元件。術語「交錯元件」係指在翻譯期間誘導核糖體暫停的部分，諸如核苷酸序列。在一些實施方式中，交錯元件係具有強α-螺旋傾向的胺基酸的非保守序列，然後是共有序列-D(V/I)ExNPGP，其中x=任何胺基酸（SEQ ID NO: 52）。在一些實施方式中，交錯元件可以包括化學部分，諸如丙三醇、非核酸連接部分、化學修飾、經修飾的核酸或其任何組合。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括與表現序列相鄰的至少一個交錯元件。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括與每個表現序列相鄰的交錯元件。在一些實施方式中，交錯元件存在於每個表現序列的一側或兩側，導致例如一種或多種肽和/或一種或多種多肽的表現產物的隔開。在一些實施方式中，交錯元件係一個或多個表現序列的一部分。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包含一個或多個表現序列，並且該一個或多個表現序列中的每一個藉由環狀多核糖核苷酸上的交錯元件與後繼的表現序列隔開。在一些實施方式中，交錯元件阻止 (a) 單個表現序列的兩輪翻譯或 (b) 兩個或更多個表現序列的一輪或多輪翻譯生成單個多肽。在一些實施方式中，交錯元件係與該一個或多個表現序列隔開的序列。在一些實施方式中，交錯元件包括一個或多個表現序列中的表現序列的一部分。
在WO 2019/118919的段落[0172]-[0175]中描述了交錯元件的實例，該專利特此藉由援引以其全文併入。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括一個或多個調控核酸序列或包括一個或多個編碼調控核酸（例如，修飾內源基因和/或外源基因的表現的核酸）的表現序列。在一些實施方式中，本文提供的環狀多核糖核苷酸的表現序列可以包含與調控核酸像非編碼RNA諸如但不限於tRNA、lncRNA、miRNA、rRNA、snRNA、microRNA、siRNA、piRNA、snoRNA、snRNA、exRNA、scaRNA、Y RNA和hnRNA反義的序列。
在WO 2019/118919的段落[0177]-[0194]中描述了示例性的調控核酸，該專利特此藉由援引以其全文併入。
在一些實施方式中，本文提供的環狀多核糖核苷酸的翻譯效率大於參考物，例如線性對應物、線性表現序列或線性環狀多核糖核苷酸。在一些實施方式中，本文提供的環狀多核糖核苷酸具有的翻譯效率高於參考物的翻譯效率至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、600%、70%、800%、900%、1000%、2000%、5000%、10000%、100000%或更高。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸的翻譯效率高於線性對應物的翻譯效率10%。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸的翻譯效率高於線性對應物的翻譯效率300%。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸產生化學計量比的表現產物。滾環翻譯連續地以基本上相等的比率產生表現產物。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸具有化學計量的翻譯效率，使得表現產物以基本上相等的比率產生。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸具有多種表現產物（例如來自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多個表現序列的產物）的化學計量翻譯效率。
在一些實施方式中，一旦起始環狀多核糖核苷酸的翻譯，在完成環狀多核糖核苷酸的至少一輪翻譯之前，結合至環狀多核糖核苷酸的核糖體不會與環狀多核糖核苷酸脫離。在一些實施方式中，如本文所述之環狀多核糖核苷酸能夠滾環翻譯。在一些實施方式中，在滾環翻譯期間，一旦起始環狀多核糖核苷酸的翻譯，在完成環狀多核糖核苷酸的至少2輪、至少3輪、至少4輪、至少5輪、至少6輪、至少7輪、至少8輪、至少9輪、至少10輪、至少11輪、至少12輪、至少13輪、至少14輪、至少15輪、至少20輪、至少30輪、至少40輪、至少50輪、至少60輪、至少70輪、至少80輪、至少90輪、至少100輪、至少150輪、至少200輪、至少250輪、至少500輪、至少1000輪、至少1500輪、至少2000輪、至少5000輪、至少10000輪、至少105輪或至少106輪翻譯之前，結合至環狀多核糖核苷酸的核糖體不會與環狀多核糖核苷酸脫離。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸的滾環翻譯導致生成多肽產物，該多肽產物由環狀多核糖核苷酸的多於一輪翻譯得出（「連續」表現產物）。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包含交錯元件，並且環狀多核糖核苷酸的滾環翻譯導致生成多肽產物，該多肽產物由環狀多核糖核苷酸的單輪翻譯或少於單輪翻譯生成（「離散」表現產物）。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸被配置為使得環狀多核糖核苷酸的滾環翻譯期間生成的總多肽（莫耳/莫耳）中的至少10%、20%、30%、40%、50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%係離散多肽。在一些實施方式中，在體外翻譯系統中測試離散產物相對於總多肽的量比。在一些實施方式中，用於測試量比的體外翻譯系統包含兔網狀紅血球裂解物。在一些實施方式中，在體內翻譯系統如真核細胞或原核細胞、培養細胞或生物體中的細胞中測試量比。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包含非翻譯區（UTR）。包含基因的基因組區域的UTR可以轉錄但不翻譯。在一些實施方式中，UTR可以被包括在本文所述之表現序列的翻譯起始序列的上游。在一些實施方式中，UTR可以被包括在本文所述之表現序列的下游。在一些情況下，第一表現序列的一個UTR與第二表現序列的另一個UTR相同或連續或重疊。在一些實施方式中，內含子係人內含子。在一些實施方式中，內含子係全長人內含子，例如ZKSCAN1。
在WO 2019/118919的段落[0197]-[201]中描述了示例性的非翻譯區，該專利特此藉由援引以其全文併入。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括聚A序列。在WO 2019/118919的段落[0202]-[0205]中描述了示例性的聚A序列，該專利特此藉由援引以其全文併入。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少聚A序列。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包含一種或多種核糖開關。在WO 2019/118919的段落[0232]-[0252]中描述了示例性的核糖開關，該專利特此藉由援引以其全文併入。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包含適體酶。在WO 2019/118919的段落[0253]-[0259]中描述了示例性適體酶，該專利特此藉由援引以其全文併入。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包含一個或多個RNA結合位點。微小RNA（或miRNA）抗原係短非編碼RNA，可與核酸分子的3'UTR結合並藉由降低核酸分子的穩定性或藉由抑制翻譯來下調基因表現。環狀多核糖核苷酸可以包含一種或多種微小RNA靶標序列、微小RNA序列或微小RNA種子。此類序列可以對應於任何已知的微小RNA，如在美國公開US2005/0261218和美國公開US2005/0059005中傳授的那些，其內容藉由援引以其全文併入本文。在WO 2019/118919的段落[0206]-[0215]中描述了RNA結合位點的其他實例，該專利特此藉由援引以其全文併入。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括一個或多個蛋白質結合位點，使得蛋白質例如核糖體能夠結合至RNA序列中的內部位點。在WO 2019/118919的段落[0218]-[0221]中描述了蛋白質結合位點的其他實例，該專利特此藉由援引以其全文併入。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包含間隔序列。在一些實施方式中，多核糖核苷酸的元件可以藉由間隔區序列或連接子（linker）彼此隔開。在WO 2019/118919的段落[0293]-[0302]中描述了示例性的間隔區序列，該專利特此藉由援引以其全文併入。
本文所述之環狀多核糖核苷酸還可以包含非核酸連接子。在WO 2019/118919的段落[0303]-[0307]中描述了示例性的非核酸連接子，該專利特此藉由援引以其全文併入。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸還包括另一種核酸序列。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸可以包含其他序列，其包括DNA、RNA或人工核酸。其他序列可以包括但不限於基因組DNA，cDNA或編碼tRNA、mRNA、rRNA、miRNA、gRNA、siRNA或其他RNAi分子的序列。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括siRNA，以靶向與環狀多核糖核苷酸相同的基因表現產物的不同基因座。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括siRNA，以靶向與環狀多核糖核苷酸中存在的基因表現產物不同的基因表現產物。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少5'-UTR。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少3'-UTR。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少聚A序列。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少終止元件。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少內部核糖體進入位點。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少核酸外切酶的降解易感性。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少降解易感性的事實可能意味著環狀多核糖核苷酸不被核酸外切酶降解，或在僅存在核酸外切酶時被降解的有限程度例如與不存在核酸外切酶時相當或相似。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸不被核酸外切酶降解。在一些實施方式中，當暴露於核酸外切酶時，環狀多核糖核苷酸降解減少。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少與帽結合蛋白的結合。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少5'帽。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少5'-UTR，並且能夠從其一個或多個表現序列表現蛋白。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少3'-UTR，並且能夠從其一個或多個表現序列表現蛋白。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少聚A序列，並且能夠從其一個或多個表現序列表現蛋白。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少終止元件，並且能夠從其一個或多個表現序列表現蛋白。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少內部核糖體進入位點，並且能夠從其一個或多個表現序列表現蛋白。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少帽，並且能夠從其一個或多個表現序列表現蛋白。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少5'-UTR、3'-UTR和IRES，並且能夠從其一個或多個表現序列表現蛋白。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸進一步包含以下序列中的一個或多個：編碼一個或多個miRNA的序列、編碼一個或多個複製蛋白的序列、編碼外源基因的序列、編碼治療劑的序列、調控元件（例如翻譯調節子，例如翻譯增強子或抑制子）、翻譯起始序列、靶向內源基因（例如，siRNA、lncRNA、shRNA）的一種或多種調控核酸和編碼治療性mRNA或蛋白質的序列。
作為其環化的結果，環狀多核糖核苷酸可能包含某些使其區別於線性RNA的特徵。例如，與線性RNA相比，環狀多核糖核苷酸不易被核酸外切酶降解。這樣，環狀多核糖核苷酸可以比線性RNA更穩定，尤其是在核酸外切酶存在下孵育時。與線性RNA相比，環狀多核糖核苷酸的穩定性提高，可使環狀多核糖核苷酸作為產生多肽（例如，引發抗體反應的抗原和/或表位）的細胞轉化試劑更加有用。與線性RNA相比，環狀多核糖核苷酸的穩定性提高，可使環狀多核糖核苷酸與線性RNA相比，更易儲存更長時間。可以使用本領域標準之方法測試用核酸外切酶處理的環狀多核糖核苷酸的穩定性，該方法確定是否已經發生RNA降解（例如，藉由凝膠電泳）。
此外，與線性RNA不同，當環狀多核糖核苷酸與磷酸酶諸如小牛腸磷酸酶一起孵育時，環狀多核糖核苷酸可能不太容易去磷酸化。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包含特定的序列特徵。例如，環狀多核糖核苷酸可以包含特定的核苷酸組成。在一些此類實施方式中，環狀多核糖核苷酸可以包括一個或多個嘌呤（腺嘌呤或鳥嘌呤）富集區。在一些此類實施方式中，環狀多核糖核苷酸可以包括一個或多個嘌呤富集區。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸可以包括一個或多個AU富集區或元件（ARE）。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸可以包括一個或多個腺嘌呤富集區。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸可以包括本文其他處所述之一個或多個重複元件。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包含一個或多個本文其他處所述之修飾。
環狀多核糖核苷酸相對於參考序列可以包括一個或多個取代、插入和/或添加、缺失和共價修飾。例如，相對於親本多核糖核苷酸具有一個或多個插入、添加、缺失和/或共價修飾的環狀多核糖核苷酸包括在本揭露之範圍內。在WO 2019/118919的段落[0310]-[0325]中描述了示例性的修飾，該專利特此藉由援引以其全文併入。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包含高階結構，例如二級或三級結構。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸的互補區段將其自身折疊成雙鏈區段，與氫鍵結合配對（例如，A-U和C-G）。在一些實施方式中，螺旋，也稱為莖，在分子內形成，具有連接至端環的雙鏈區段。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸具有至少一個具有准雙鏈二級結構的區段。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸的一個或多個序列包括基本上單鏈的與雙鏈的區域。在一些實施方式中，單鏈與雙鏈的比率可以影響環狀多核糖核苷酸的功能。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸的一個或多個序列基本上係單鏈的。在一些實施方式中，基本上單鏈的環狀多核糖核苷酸的一個或多個序列可以包括蛋白質或RNA結合位點。在一些實施方式中，基本上單鏈的環狀多核糖核苷酸序列可以是構象柔性的以允許增加相互作用。在一些實施方式中，有目的地將環狀多核糖核苷酸的序列工程化以包括此類二級結構，從而結合或增加蛋白質或核酸結合。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸序列基本上係雙鏈的。在一些實施方式中，基本上雙鏈的環狀多核糖核苷酸的一個或多個序列可以包括構象識別位點，例如核糖開關或適體酶。在一些實施方式中，基本上雙鏈的環狀多核糖核苷酸序列可以是構象剛性的。在一些此類實例中，構象剛性序列可能在空間上阻礙環狀多核糖核苷酸結合蛋白質或核酸。在一些實施方式中，有目的地將環狀多核糖核苷酸的序列工程化以包括此類二級結構，從而避免或減少蛋白質或核酸結合。
有16種可能的鹼基對，但是其中的六種（AU、GU、GC、UA、UG、CG）可能形成實際的鹼基對。其餘的稱為不匹配，以極低的頻率出現在螺旋中。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸的結構不容易被破壞，不影響其功能且無致命後果，這提供了保持二級結構的選擇。在一些實施方式中，莖的一級結構（即其核苷酸序列）仍可變化，同時仍保持螺旋區。鹼基的性質係高階結構的第二位，且只要它們保留二級結構，就可以進行取代。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸具有凖螺旋結構。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸具有至少一個具有凖螺旋結構的區段。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括富U或富A序列或其組合中的至少一個。在一些實施方式中，富U和/或富A序列以將產生三聯凖螺旋結構的方式排列。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸具有雙凖螺旋結構。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸具有一個或多個具有雙凖螺旋結構的區段（例如2、3、4、5、6或更多個）。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括富C和/或富G的序列中的至少一個。在一些實施方式中，富C和/或富G序列以將產生三聯凖螺旋結構的方式排列。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸具有有助於穩定的分子內三聯凖螺旋結構。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸具有兩個凖螺旋結構（例如，藉由磷酸二酯鍵隔開），使得它們末端的鹼基對堆疊，並且凖螺旋結構變為共線性，導致「同軸堆疊」的子結構。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包含具有一個或多個模體的三級結構，例如假結、g-四鏈體、螺旋和同軸堆疊。
在WO 2019/118919的段落[0326]-[0333]中描述了如本文所揭露的環狀多核糖核苷酸的結構的其他實例，該專利特此藉由援引以其全文併入。
2. 穩定性和半衰期
在一些實施方式中，本文提供的環狀多核糖核苷酸具有比參考物，例如具有相同核苷酸序列，未被環化的線性多核糖核苷酸（線性對應物）增加的半衰期。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸基本上對降解（例如核酸外切酶的降解）有抗性。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸抗自降解。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少酶促裂解位點，例如dicer裂解位點。在WO 2019/118919的段落[0308]-[0309]中描述了如本文所揭露的環狀多核糖核苷酸的穩定性和半衰期的其他實例，該專利特此藉由援引以其全文併入。
3. 生產方法
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括非天然存在的去氧核糖核酸序列，並且可以使用重組技術（例如，使用DNA質體體外衍生）或化學合成或其組合產生。
在本揭露之範圍內，用於產生RNA環的DNA分子可以包括天然存在的原始核酸序列的DNA序列、其修飾形式或編碼通常未在自然界中發現的合成多肽的DNA序列（例如，嵌合分子或融合蛋白，諸如包括多種免疫原的融合蛋白）。DNA和RNA分子可以使用多種技術修飾，包括但不限於經典誘變技術和重組技術，如定點誘變、化學處理核酸分子以誘導突變、限制性酶裂解核酸片段、連接核酸片段、聚合酶鏈式反應（PCR）擴增和/或誘變核酸序列的選定區域、合成寡核苷酸混合物以及連接混合物基團以「建造」核酸分子混合物、及其組合。
環狀多核糖核苷酸可以根據任何可用的技術製備，包括但不限於化學合成和酶促合成。在一些實施方式中，線性初級構建體或線性mRNA可被環化或連環化以產生本文所述之環狀多核糖核苷酸。環化或連環化的機制可以藉由諸如但不限於化學、酶促、夾板連接或核酶催化之方法來發生。新形成的5'-/3'-鍵可以是分子內鍵或分子間鍵。
製備本文所述之環狀多核糖核苷酸之方法描述於以下中，例如，Khudyakov & Fields, Artificial DNA: Methods and Applications [人工DNA：方法與應用], CRC出版社（2002）；Zhao, Synthetic Biology: Tools and Applications [合成生物學：工具和應用],（第一版）, 學術出版社（Academic Press）（2013）；和Egli & Herdewijn, Chemistry and Biology of Artificial Nucleic Acids [人工核酸的化學與生物學],（第一版）, Wiley-VCH（2012）。
多種合成環狀多核糖核苷酸之方法也在本領域中進行了描述（參見例如，美國專利號US6210931、美國專利號US5773244、美國專利號US5766903、美國專利號US5712128、美國專利號US5426180、美國公開號US20100137407、國際公開號WO 1992001813和國際公開號WO 2010084371；其各自的內容藉由引用以其全文併入本文）。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸係純化的，例如，去除了游離核糖核酸、線性或帶切口的RNA、DNA、蛋白質等。在一些實施方式中，可以藉由本領域通常使用的任何已知方法純化環狀多核糖核苷酸。純化方法的非限制性實例包括柱層析法、凝膠切除、尺寸排阻等。
4. 環化
在一些實施方式中，線性環狀多核糖核苷酸可以被環化或連環化。在一些實施方式中，線性環狀多核糖核苷酸可以在配製和/或遞送之前被體外環化。在一些實施方式中，線性環狀多核糖核苷酸可以在細胞內環化。
a. 細胞外環化
在一些實施方式中，使用化學方法環化或連環化線性環狀多核糖核苷酸以形成環狀多核糖核苷酸。在一些化學方法中，核酸的5'-端和3'-端（例如，線性環狀多核糖核苷酸）包括化學反應性基團，當基團彼此靠近時，可在分子的3'-端和5'-端之間形成新的共價鍵。5'-端可以含有NHS酯反應性基團，且3'-端可以含有3'-胺基末端的核苷酸，使得在有機溶劑中，線性RNA分子3'-端上的3'-胺基末端的核苷酸將在5'-NHS-酯部分上經歷親核攻擊，形成新的5'-/3'-醯胺鍵。
在一些實施方式中，使用DNA或RNA連接酶將5'-磷酸化的核酸分子（例如，線性環狀多核糖核苷酸）酶促連接至核酸（例如，線性核酸）的3'-羥基，形成新的磷酸二酯鍵。在示例性反應中，根據製造商的方案，將線性環狀多核糖核苷酸與1-10單位的T4 RNA連接酶（麻塞諸塞州伊普斯威奇新英格蘭生物學實驗室公司（New England Biolabs, Ipswich, MA））在37°C下孵育1小時。連接反應可以在存在線性核酸時發生，該線性核酸能夠與並列的5'-和3'-區域鹼基配對，以輔助酶促連接反應。在一些實施方式中，連接係夾板連接。例如，夾板連接酶，如SplintR®連接酶，可用於夾板連接。對於夾板連接，單鏈多核苷酸（夾板），如單鏈RNA，可以被設計成與線性多核糖核苷酸的兩個末端雜交，使得在與單鏈夾板雜交時可以將兩個末端並列。因此，夾板連接酶可以催化線性多核糖核苷酸並列的兩個末端的連接，生成環狀多核糖核苷酸。
在一些實施方式中，DNA或RNA連接酶用於環狀多核苷酸的合成。作為一個非限制性實例，連接酶可以是circ連接酶或環狀連接酶。
在一些實施方式中，線性環狀多核糖核苷酸的5'-或3'-末端可編碼連接酶核酶序列，使得在體外轉錄期間，所得線性環狀多核糖核苷酸包括活性核酶序列，該活性核酶序列能夠將線性環狀多核糖核苷酸的5'-末端連接至線性環狀多核糖核苷酸的3'-末端。連接酶核酶可以衍生自第I組內含子、D型肝炎病毒、髮夾核酶，或者可以藉由SELEX（藉由指數富集進行的配位基系統進化）進行選擇。核酶連接酶反應在0°C與37°C之間的溫度下可能需要1小時至24小時。
在一些實施方式中，可藉由使用至少一個非核酸部分將線性環狀多核糖核苷酸環化或連環化。在一方面，至少一個非核酸部分可與線性環狀多核糖核苷酸的5'末端附近和/或3'末端附近的區域或特徵反應，以環化或連環化線性環狀多核糖核苷酸。在另一方面，至少一個非核酸部分可以位於或連接至或鄰近線性環狀多核糖核苷酸的5'末端和/或3'末端。設想的非核酸部分可以是同源或異源的。作為一個非限制性實例，非核酸部分可以是鍵，如疏水鍵、離子鍵、可生物降解的鍵和/或可裂解的鍵。作為另一個非限制性實例，非核酸部分係連接部分。作為又另一個非限制性實例，非核酸部分可以是寡核苷酸或肽部分，如本文所述之適體或非核酸連接子。
在一些實施方式中，線性環狀多核糖核苷酸由於非核酸部分而被環化或連環化，造成位於、鄰近或連接至環狀多核糖核苷酸的5'和3'端的原子、分子表面之間的吸引。作為一個非限制性實例，可藉由分子間作用力或分子內作用力將一個或多個線性環狀多核糖核苷酸環化或連環化。分子間作用力的非限制性實例包括偶極-偶極力、偶極誘導偶極力、誘導偶極誘導偶極力、凡得瓦力和色散力。分子內作用力的非限制性實例包括共價鍵、金屬鍵、離子鍵、共振鍵、抓氫鍵（agnostic bond）、偶極鍵、軛合、超軛合和反向鍵。
在一些實施方式中，線性環狀多核糖核苷酸可在5'末端附近和3'末端附近包含核酶RNA序列。當序列暴露於核酶的其餘部分時，核酶RNA序列可以共價地連接至肽。在一方面，肽共價地連接至5'末端和3'末端附近的核酶RNA序列可以彼此聯繫，引起線性環狀多核糖核苷酸環化或連環化。在另一方面，肽共價地連接至核酶RNA序列5'末端和3'末端附近可以引起線性初級構建體或線性mRNA在使用本領域已知之方法（諸如但不限於蛋白連接）進行連接後環化或連環化。用於本發明的線性初級構建體或線性RNA中的核酶的非限制性實例，或摻入和/或共價地連接肽之方法的非窮舉列表在美國專利申請號US20030082768中描述，該專利內容藉由引用以其全文併入本文。
在一些實施方式中，線性環狀多核糖核苷酸可以包括被轉化為5'單磷酸的核酸的5'三磷酸，例如藉由使5'三磷酸與RNA 5'焦磷酸水解酶（RppH）或ATP二磷酸水解酶（脫磷酸酶）接觸。替代性地，將線性環狀多核糖核苷酸的5'三磷酸轉化為5'單磷酸可藉由兩步反應完成，該兩步反應包括：(a) 使線性環狀多核糖核苷酸的5'核苷酸與磷酸酶（例如，熱敏磷酸酶、蝦鹼性磷酸酶或小牛腸磷酸酶）接觸以除去所有三個磷酸；以及 (b) 在步驟 (a) 之後，使5'核苷酸與添加單個磷酸酯的激酶（例如，多核苷酸激酶）接觸。
在一些實施方式中，本文提供的環化方法的環化效率為至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%或100%。在一些實施方式中，本文提供的環化方法的環化效率為至少約40%。在一些實施方式中，所提供的環化方法的環化效率介於約10%至約100%之間；例如，環化效率可為約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%和約99%。在一些實施方式中，環化效率介於約20%至約80%之間。在一些實施方式中，環化效率介於約30%至約60%之間。在一些實施方式中，環化效率為約40%。
b. 剪接元件
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括至少一個剪接元件。在WO 2019/118919的段落[0270]-[0275]中描述了示例性的剪接元件，該專利特此藉由援引以其全文併入。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括至少一個剪接元件。在本文提供的環狀多核糖核苷酸中，剪接元件可以是可以介導環狀多核糖核苷酸的剪接的完整剪接元件。替代性地，剪接元件也可以是來自完成的剪接事件的剩餘剪接元件。例如，在一些情況下，線性多核糖核苷酸的剪接元件可介導導致線性多核糖核苷酸環化的剪接事件，從而所得的環狀多核糖核苷酸包含來自此類剪接介導的環化事件的剩餘剪接元件。在一些情況下，剩餘剪接元件無法介導任何剪接。在其他情況下，剩餘剪接元件在某些情況下仍可以介導剪接。在一些實施方式中，剪接元件與至少一個表現序列相鄰。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括與每個表現序列相鄰的剪接元件。在一些實施方式中，剪接元件在每個表現序列的一側或兩側，導致例如一種或多種肽和/或一種或多種多肽的表現產物的隔開。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括內部剪接元件，該剪接元件在被複製時，剪接端部被連接在一起。一些實例可以包括具有剪接位點序列和短反向重複序列（30-40 nt）的微型內含子（＜100 nt），如AluSq2、AluJr和AluSz、側接內含子中的反向序列、側接內含子中的Alu元件以及在接近反向剪接事件的（suptable4富集模體）順式序列元件中發現的模體，如帶有側接外顯子的反向剪接位點（backsplice site）之前（上游）或之後（下游）200 bp中的序列。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括至少一個本文其他處所述之重複核苷酸序列作為內部剪接元件。在此類實施方式中，重複核苷酸序列可以包括來自Alu家族內含子的重複序列。在一些實施方式中，剪接相關的核糖體結合蛋白可以調控環狀多核糖核苷酸的生物發生（例如，盲肌蛋白和震動蛋白（QKI）剪接因子）。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸可以包括側接環狀多核糖核苷酸的頭尾接合點處的典範剪接位點。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸可以包括隆起-螺旋-隆起模體，包含兩個3-核苷酸隆起側接的4-鹼基對莖。裂解發生在隆起區域的一個位點處，生成末端為5'-羥基和2',3'-環狀磷酸酯的特徵片段。藉由將5'-OH基團親核攻擊到形成3',5'-磷酸二酯橋的同一分子的2',3'-環狀磷酸酯上來進行環化。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸可以包括具有HPR元件的多聚重複RNA序列。HPR包含2',3'-環狀磷酸酯和5'-OH端。HPR元件自加工用於環化的線性多核糖核苷酸的5'-末端和3'-末端，從而將該等末端連接在一起。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸可以包括自剪接元件。例如，環狀多核糖核苷酸可以包括來自藍細菌魚腥藻（Anabaena）的內含子。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸可以包括介導自連接的序列。在一個實施方式中，環狀多核糖核苷酸可以包括HDV序列（例如，HDV複製結構域保守序列，GGCUCAUCUCGACAAGAGGCGGCAGUCCUCAGUACUCUUACUCUUUUCUGUAAAGAGGAGACUGCUGGACUCGCCGCCCAAGUUCGAGCAUGAGCC或GGCUAGAGGCGGCAGUCCUCAGUACUCUUACUCUUUUCUGUAAAGAGGAGACUGCUGGACUCGCCGCCCGAGCC）以進行自連接。在一個實施方式中，環狀多核糖核苷酸可以包括環E序列（例如在PSTVd中）以進行自連接。在另一個實施方式中，環狀多核糖核苷酸可以包括自環化內含子，例如5'和3'剪接接合，或自環化催化內含子，如I型、II型或III型內含子。I型內含子自剪接序列的非限制性實例可以包括源自T4噬菌體基因td的自剪接置換內含子-外顯子序列和四膜蟲的插入序列（IVS）rRNA。
c.      其他環化方法
在一些實施方式中，線性環狀多核糖核苷酸可以包括互補序列，包括個體內含子內或側接內含子內的重複或非重複核酸序列。重複核酸序列係在環狀多核糖核苷酸的區段內出現的序列。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括重複核酸序列。在一些實施方式中，重複核苷酸序列包括聚CA序列或聚UG序列。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括與環狀多核糖核苷酸的另一區段中的互補重複核酸序列雜交的至少一個重複核酸序列，其雜交的區段形成內部雙鏈。在一些實施方式中，兩個單獨的環狀多核糖核苷酸的重複核酸序列和互補重複核酸序列雜交以生成單個環化多核糖核苷酸，雜交的區段形成內部雙鏈。在一些實施方式中，互補序列位於線性環狀多核糖核苷酸的5'端和3'端。在一些實施方式中，互補序列包括約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多個配對的核苷酸。
在一些實施方式中，環化化學方法可用於生成環狀多核糖核苷酸。此類方法可以包括但不限於點擊化學（例如，基於炔烴和疊氮化物之方法，或可點擊的鹼基）、烯烴複分解、胺基磷酸酯連接、半亞胺-亞胺交聯、鹼基修飾及其任何組合。
在一些實施方式中，環化酶促方法可用於生成環狀多核糖核苷酸。在一些實施方式中，連接酶，例如DNA或RNA連接酶，可用於生成環狀多核糖核苷酸或互補物的模板、環狀多核糖核苷酸的互補鏈或環狀多核糖核苷酸。
環狀多核糖核苷酸的環化可以藉由本領域已知之方法完成，例如，Petkovic和Muller, "RNA circularization strategies in vivo and in vitro [體內外核糖核酸環化策略]" Nucleic Acids Res [核酸研究], 2015, 43(4): 2454-2465，和Muller和Appel, "In vitro circularization of RNA [核糖核酸的體外環化]" RNA Biol [RNA生物學], 2017, 14(8):1018-1027中描述的那些方法。
環狀多核糖核苷酸可編碼可用於複製的序列和/或模體。在WO 2019/118919的段落[0280]-[0286]中描述了示例性的複製元件，該專利特此藉由援引以其全文併入。
線性多核糖核苷酸
如本文所揭露的線性多核糖核苷酸包含編碼來自冠狀病毒的抗原和/或表位的序列。這種線性多核糖核苷酸在受試者（例如，要免疫接種的受試者）中表現編碼來自冠狀病毒的抗原和/或表位的序列。在一些實施方式中，包含冠狀病毒抗原和/或表位的線性多核糖核苷酸用於在受試者（例如，要免疫接種的受試者）中產生免疫反應。在一些實施方式中，係mRNA並且包含冠狀病毒抗原和/或表位的線性多核糖核苷酸用於在受試者（例如，要免疫接種的受試者）中產生免疫反應。在一些實施方式中，包含冠狀病毒抗原和/或表位的線性多核糖核苷酸用於產生如本文所述之多株抗體。
A. 冠狀病毒抗原和表位
線性多核糖核苷酸包含編碼冠狀病毒抗原或表位的序列。本文揭露的抗原和/或表位與冠狀病毒相關。在一些實施方式中，該等抗原和/或表位係由冠狀病毒表現的，或源自冠狀病毒所表現的抗原和/或表位。
抗原係含有一個或多個表位（線性表位、構象表位或兩者）的分子，在受試者（例如，要免疫接種的受試者）中引發適應性免疫反應。表位可以是被給定抗體或T細胞受體識別、靶向或結合的抗原的一部分。表位可以是線性表位，例如胺基酸的連續序列。表位可以是構象表位，例如，含有在蛋白質的折疊構象中形成表位的胺基酸的表位。構象表位可以含有來自一級胺基酸序列的非連續胺基酸。通常，表位將包括約3-15個，通常約5-15個胺基酸。B細胞表位通常為約5個胺基酸，但也可以小至3-4個胺基酸。T細胞表位（諸如CTL表位）將包括至少約7-9個胺基酸，而輔助T細胞表位包括至少約12-20個胺基酸。通常，表位將包括約7至15個胺基酸，諸如9、10、12或15個胺基酸。
冠狀病毒抗原或表位可以是或可以包含蛋白質、肽、糖蛋白、脂蛋白、磷蛋白、核糖核蛋白、碳水化合物（例如，多糖）、脂質（例如，磷脂或三酸甘油酯）或核酸（例如，DNA、RNA）的全部或一部分。
冠狀病毒抗原或表位可以包含蛋白質抗原或表位（例如，來自蛋白質、糖蛋白、脂蛋白、磷蛋白或核糖核蛋白的肽抗原或肽表位）。抗原或表位可以包括胺基酸、糖、脂質、磷醯基或磺醯基或其組合。
冠狀病毒蛋白抗原或表位可以包含翻譯後修飾，例如糖基化、泛素化、磷酸化、亞硝基化、甲基化、乙醯化、醯胺化、羥基化、硫酸化或脂化。
抗原和/或表位可以來自冠狀病毒表面蛋白、冠狀病毒膜蛋白、冠狀病毒包膜蛋白、冠狀病毒衣殼蛋白、冠狀病毒核衣殼蛋白、冠狀病毒刺突蛋白、刺突的冠狀病毒受體結合結構域蛋白、冠狀病毒進入蛋白、冠狀病毒膜融合蛋白、冠狀病毒結構蛋白、冠狀病毒非結構蛋白、冠狀病毒調節蛋白、冠狀病毒輔助蛋白、分泌型冠狀病毒蛋白、冠狀病毒聚合酶蛋白、冠狀病毒RNA聚合酶、冠狀病毒蛋白酶、冠狀病毒糖蛋白、冠狀病毒融合原、冠狀病毒螺旋衣殼蛋白、冠狀病毒二十面體衣殼蛋白、冠狀病毒基質蛋白、冠狀病毒複製酶、冠狀病毒轉錄因子或冠狀病毒酶。
在一些實施方式中，本揭露之抗原和/或表位來自SARS-CoV基因組的預測轉錄物。在一些實施方式中，本揭露之抗原和/或表位來自由來自SARS-CoV基因組的開放閱讀框編碼的蛋白質。SARS-CoV基因組中開放閱讀框的非限制性實例可以包括ORF1a、ORF1b、刺突（S）、ORF3a、ORF3b、包膜（E）、膜（M）、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8、ORF8a、ORF8b、ORF9a、ORF9b、核衣殼（N）和ORF10。在一些實施方式中，來自SARS-CoV基因組的開放閱讀框包括SEQ ID NO: 11。
在特定實施方式中，線性多核糖核苷酸包含表 3 中描述的SARS-CoV-2抗原。
[ 表 3] ： 設計的線性構建體的描述。
構建體 ORF （ SEQ ID NO. ） ORF 的描述 脯胺酸取代 選殖優化 環化優化 5’ 元件 3’ 元件
p29 1（13） S蛋白跨膜（TM）結構域完全去除，並添加了三聚化結構域 是 是 否 珠蛋白 珠蛋白
p30 3（15） S蛋白跨膜（TM）結構域完全完好 是 是 否 珠蛋白 珠蛋白
p31 13（12） S蛋白受體結合結構域（RBD）僅有分泌信號與5'末端翻譯融合 不適用 不適用 不適用 珠蛋白 珠蛋白
p32 1（13） S蛋白跨膜（TM）結構域完全去除，並添加了三聚化結構域 是 是 是 珠蛋白 珠蛋白
在表 3 中，「脯胺酸取代」表示處於殘基986和987處的脯胺酸取代，以及弗林蛋白酶裂解位點（殘基682-685）處的「GSAS」取代。對於選殖優化，在座標2541處進行單鹼基取代以破壞BsaI位點，以協助質體DNA模板的金門選殖構建。對於環化優化，四個單核苷酸-在位置2307、2709、159和315處-被取代以破壞可潛在結合夾板核酸序列環化元件的位點，從而潛在地抑制有效連接。所有單鹼基對取代都被設計為翻譯緘默。此外，在表 3 中，5’元件係珠蛋白（SEQ ID NO: 32）；並且3’元件係：珠蛋白（SEQ ID NO: 33）。
在一些實施方式中，冠狀病毒表位包含或含有至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少24個、至少25個、至少26個、至少27個、至少28個、至少29個或至少30個胺基酸，或更多個胺基酸。在一些實施方式中，冠狀病毒表位包含或含有至多4個、至多5個、至多6個、至多7個、至多8個、至多9個、至多10個、至多11個、至多12個、至多13個、至多14個、至多15個、至多16個、至多17個、至多18個、至多19個、至多20個、至多21個、至多22個、至多23個、至多24個、至多25個、至多26個、至多27個、至多28個、至多29個或至多30個胺基酸，或更少的胺基酸。在一些實施方式中，冠狀病毒表位包含或含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個胺基酸。在一些實施方式中，冠狀病毒表位含有5個胺基酸。在一些實施方式中，冠狀病毒表位含有6個胺基酸。在一些實施方式中，表位含有7個胺基酸。在一些實施方式中，冠狀病毒表位含有8個胺基酸。在一些實施方式中，表位可以是約8至約11個胺基酸。在一些實施方式中，表位可以是約9至約22個胺基酸。
冠狀病毒抗原可以包括被B細胞識別的抗原、被T細胞識別的抗原或其組合。在一些實施方式中，抗原包括被B細胞識別的抗原。在一些實施方式中，冠狀病毒抗原係被B細胞識別的抗原。在一些實施方式中，冠狀病毒抗原包括被T細胞識別的抗原。在一些實施方式中，抗原係被T細胞識別的抗原。
冠狀病毒表位包括被B細胞識別的表位、被T細胞識別的表位或其組合。在一些實施方式中，冠狀病毒表位包括被B細胞識別的表位。在一些實施方式中，表位係被B細胞識別的表位。在一些實施方式中，冠狀病毒表位包括被T細胞識別的表位。在一些實施方式中，冠狀病毒表位係被T細胞識別的表位。
例如，用於經由電腦模擬鑒定抗原和表位的技術例如在Sanchez-Trincado等人(2017)，Fundamentals and methods for T-and B-cell epitope prediction [T細胞和B細胞表位預測的基本原理和方法], Journal of immunology research [免疫學研究雜誌]；Grifoni, Alba等人，A Sequence Homology and Bioinformatic Approach Can Predict Candidate Targets for Immune Responses to SARS-CoV-2 [序列同源性和生物資訊學方法可以預測SARS-CoV-2免疫反應的候選靶標], Cell host & microbe [細胞宿主與微生物] (2020)；Russi等人，In silico prediction of T-and B-cell epitopes in PmpD: First step towards to the design of a Chlamydia trachomatis vaccine [PmpD中T細胞和B細胞表位的電腦模擬預測：設計沙眼衣原體疫苗的第一步], biomedical journal [生物醫學雜誌] 41.2 (2018): 109-117；Baruah等人，Immunoinformatics‐aided identification of T cell and B cell epitopes in the surface glycoprotein of 2019‐nCoV [免疫資訊學輔助鑒定2019‐nCoV表面糖蛋白中的T細胞和B細胞表位], Journal of Medical Virology [醫學病毒學雜誌] (2020)中已經揭露；其每一者均藉由援引以其全文併入本文。
本揭露之線性多核糖核苷酸可以包含許多冠狀病毒抗原和/或表位的序列。線性多核糖核苷酸包含例如至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少15種、至少20種、至少25種、至少30種、至少40種、至少50種、至少60種、至少70種、至少80種、至少90種、至少100種、至少120種、至少140種、至少160種、至少180種、至少200種、至少250種、至少300種、至少350種、至少400種、至少450種、至少500種或更多種冠狀病毒抗原或表位的序列。
在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸包含例如至多1種、至多2種、至多3種、至多4種、至多5種、至多6種、至多7種、至多8種、至多9種、至多10種、至多15種、至多20種、至多25種、至多30種、至多40種、至多50種、至多60種、至多70種、至多80種、至多90種、至多100種、至多120種、至多140種、至多160種、至多180種、至多200種、至多250種、至多300種、至多350種、至多400種、至多450種、至多500種或更少的冠狀病毒抗原或表位的序列。
在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸包含例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450或500種冠狀病毒抗原或表位的序列。
線性多核糖核苷酸可以包含來自冠狀病毒抗原的一個或多個冠狀病毒表位的序列。例如，冠狀病毒抗原可以包含胺基酸序列，其中可以含有多個冠狀病毒表位（例如，被B細胞和/或T細胞識別的表位），並且線性多核糖核苷酸可以包含或編碼那些冠狀病毒表位中的一個或多個表位。
線性多核糖核苷酸包含例如來自一種冠狀病毒抗原的至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個、至少100個、至少120個、至少140個、至少160個、至少180個、至少200個、至少250個、至少300個、至少350個、至少400個、至少450個、至少500個或更多個表位的序列。
在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸包含例如來自一種冠狀病毒抗原的至多2個、至多3個、至多4個、至多5個、至多6個、至多7個、至多8個、至多9個、至多10個、至多15個、至多20個、至多25個、至多30個、至多40個、至多50個、至多60個、至多70個、至多80個、至多90個、至多100個、至多120個、至多140個、至多160個、至多180個、至多200個、至多250個、至多300個、至多350個、至多400個、至多450個、至多500個或更少的冠狀病毒表位的序列。
在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸包含例如來自一種冠狀病毒抗原的約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450或500個冠狀病毒表位的序列。
線性多核糖核苷酸可以編碼冠狀病毒抗原或表位的變體。變體可以是天然存在的變體（例如，在來自不同的冠狀病毒屬、種、分離株或凖種的序列數據中鑒定的變體），或者可以是如本文所揭露的已經經由電腦模擬生成的衍生序列（例如，與野生型抗原或表位相比具有一個或多個胺基酸插入、缺失、取代或其組合的抗原或表位）。
線性多核糖核苷酸包含例如冠狀病毒抗原或表位的至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少15種、至少20種、至少25種、至少30種、至少40種、至少50種、至少60種、至少70種、至少80種、至少90種、至少100種、至少120種、至少140種、至少160種、至少180種、至少200種、至少250種、至少300種、至少350種、至少400種、至少450種、至少500種或更多種變體的序列。
在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸包含例如冠狀病毒抗原或表位的至多2種、至多3種、至多4種、至多5種、至多6種、至多7種、至多8種、至多9種、至多10種、至多15種、至多20種、至多25種、至多30種、至多40種、至多50種、至多60種、至多70種、至多80種、至多90種、至多100種、至多120種、至多140種、至多160種、至多180種、至多200種、至多250種、至多300種、至多350種、至多400種、至多450種、至多500種、或更少的變體的序列。
在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸包含例如冠狀病毒抗原或表位的約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450或500種變體的序列。
線性多核糖核苷酸的冠狀病毒抗原和/或表位序列也可稱為冠狀病毒表現序列。在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸包含一個或多個冠狀病毒表現序列，其中每一個都可以可編碼冠狀病毒多肽。冠狀病毒多肽可以大量產生。冠狀病毒多肽可以是從細胞分泌的或定位於細胞的細胞質、細胞核或膜隔室的冠狀病毒多肽。一些冠狀病毒多肽包括但不限於如本文所揭露的抗原、如本文所揭露的表位、冠狀病毒蛋白的至少一部分（例如，病毒包膜蛋白、病毒基質蛋白、病毒刺突蛋白、病毒膜蛋白、病毒核衣殼蛋白、病毒輔助蛋白、其片段或其組合）。在一些實施方式中，由本揭露之線性多核糖核苷酸編碼的冠狀病毒多肽包含本文揭露的冠狀病毒抗原的片段。在一些實施方式中，由本揭露之線性多核糖核苷酸編碼的冠狀病毒多肽包含融合蛋白，該融合蛋白包含兩種或更多種本文揭露的冠狀病毒抗原或其片段。在一些實施方式中，由本揭露之線性多核糖核苷酸編碼的冠狀病毒多肽包含冠狀病毒表位。在一些實施方式中，由本揭露之線性多核糖核苷酸編碼的多肽包含融合蛋白，該融合蛋白包含兩個或更多個本文揭露的冠狀病毒表位，例如包含來自本揭露之一種或多種冠狀病毒的多個預測表位的人工肽序列。
在一些實施方式中，從本文揭露的線性多核糖核苷酸表現的示例性冠狀病毒蛋白包括分泌蛋白，例如天然包括訊息肽的蛋白（例如抗原和/或表位），或通常不編碼訊息肽，但是經修飾含有訊息肽的蛋白。
B. 線性多核糖核苷酸
線性多核糖核苷酸包含如下所述之元件以及本文所述之冠狀病毒抗原或表位。
本文所述之線性多核糖核苷酸係具有5'末端和3'末端的多核糖核苷酸分子。在一些實施方式中，線性RNA具有游離的5'末端或3'末端。在一些實施方式中，線性RNA具有經修飾或受保護免於降解的5'末端或3'末端。在一些實施方式中，線性RNA具有非共價連接的5'或3'末端。在一些實施方式中，線性RNA係mRNA。
線性RNA可以在其末端進行修飾以提高穩定性和/或減少降解。例如，5'游離末端和/或3'游離末端包括帽、聚A尾、G-四鏈體、假結、穩定的末端莖環、富含U的表現、核保留元件（ENE）或結合部分。例如，5'游離末端和/或3'游離末端包括末端保護劑，諸如帽、聚A尾、g-四鏈體、假結、穩定的末端莖環、富含U的表現、核保留元件（ENE）或結合部分。
在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸為至少約20個核苷酸、至少約30個核苷酸、至少約40個核苷酸、至少約50個核苷酸、至少約75個核苷酸、至少約100個核苷酸、至少約200個核苷酸、至少約300個核苷酸、至少約400個核苷酸、至少約500個核苷酸、至少約1,000個核苷酸、至少約2,000個核苷酸、至少約5,000個核苷酸、至少約6,000個核苷酸、至少約7,000個核苷酸、至少約8,000個核苷酸、至少約9,000個核苷酸、至少約10,000個核苷酸、至少約12,000個核苷酸、至少約14,000個核苷酸、至少約15,000個核苷酸、至少約16,000個核苷酸、至少約17,000個核苷酸、至少約18,000個核苷酸、至少約19,000個核苷酸或至少約20,000個核苷酸。
在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸可以具有足夠的大小以容納核糖體的結合位點。在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸的最大尺寸可以與產生線性多核糖核苷酸和/或使用線性多核糖核苷酸的技術限制內的一樣大。不受任何特定理論的束縛，有可能RNA的多個區段可以從DNA產生並且其5'游離末端和3'游離末端退火以產生一「串」RNA。在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸的最大尺寸可能受包裝RNA並將其遞送至靶標的能力所限制。在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸的大小係足以編碼有用的多肽（諸如本揭露之免疫原或其表位）的長度，並且因此至少20,000個核苷酸、至少15,000個核苷酸、至少10,000個核苷酸、至少7,500個核苷酸或至少5,000個核苷酸、至少4,000個核苷酸、至少3,000個核苷酸、至少2,000個核苷酸、至少1,000個核苷酸、至少500個核苷酸、至少400個核苷酸、至少300個核苷酸、至少200個核苷酸、至少100個核苷酸、或至少70個核苷酸的長度可能是有用的。
1. 線性多核糖核苷酸元件
在一些實施方式中，除了包含編碼冠狀病毒抗原和/或表位的序列之外，線性多核糖核苷酸還包含如本文所述之元件中的一種或多種。例如，線性多核糖核苷酸包含調控元件，例如修飾線性多核糖核苷酸內表現序列的表現的序列。調控元件可以包括位置與編碼表現產物的表現序列相鄰的序列。調控元件可以可操作地連接至相鄰序列。與不存在調控元件時表現的產物的量相比，調控元件可以增加表現的產物的量。另外，一個調控元件可以增加串聯連接的多個表現序列表現的產物的量。因此，一種調控元件可以增強一個或多個表現序列的表現。也可以使用多種調控元件，例如，差異性地調控不同表現序列的表現。在一些實施方式中，本文提供的調控元件可以包括選擇性翻譯序列。如本文所用，術語「選擇性翻譯序列」係指選擇性地起始或激活線性多核糖核苷酸中的表現序列的翻譯的核酸序列，例如某些核糖開關適體酶。調控元件還可以包括選擇性降解序列。如本文所用，術語「選擇性降解序列」係指起始線性多核糖核苷酸或線性多核糖核苷酸的表現產物的降解的核酸序列。在一些實施方式中，調控元件係翻譯調節子。翻譯調節子可以調節線性多核糖核苷酸中表現序列的翻譯。翻譯調節子可以是翻譯增強子或翻譯抑制子。在一些實施方式中，翻譯起始序列可以充當調控元件。
在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸編碼產生目標多株抗體的抗原並包含翻譯起始序列，例如起始密碼子。在一些實施方式中，翻譯起始序列包括科紮克或夏因-達爾加諾（Shine-Dalgarno）序列。在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸包括與表現序列相鄰的翻譯起始序列，例如科紮克序列。在一些實施方式中，翻譯起始序列係非編碼起始密碼子。在一些實施方式中，翻譯起始序列（例如科紮克序列）存在於每個表現序列的一側或兩側，導致表現產物的隔開。在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸包括與表現序列相鄰的至少一個翻譯起始序列。在一些實施方式中，翻譯起始序列為線性多核糖核苷酸提供構象柔性。在一些實施方式中，翻譯起始序列基本上在線性多核糖核苷酸的單鏈區域內。
在一些實施方式中，本文所述之線性多核糖核苷酸包含內部核糖體進入位點（IRES）元件。包括在線性多核糖核苷酸中的合適的IRES元件可以是能夠接合真核核糖體的RNA序列。
線性多核糖核苷酸可以包括一個或多個表現序列（例如，編碼抗原），並且每個表現序列可以具有或可以不具有終止元件。
在一些實施方式中，線性多核苷酸包含5’帽，其中mRNA的5’帽結構增加mRNA穩定性。5'帽與mRNA帽結合蛋白（MBP）結合，藉由CBP與聚A結合蛋白締合形成成熟的RNA種類，有助於細胞中的mRNA穩定性和翻譯能力。
在一些實施方式中，線性多核苷酸係5'末端加帽的並且在線性多核苷酸的末端鳥苷帽殘基與5'末端轉錄的有義核苷酸之間包含5'-ppp-5'三磷酸鍵。這種5'鳥苷帽，也稱為5'鳥苷酸化帽，可以被甲基化以生成N7-甲基鳥苷酸帽。
在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸包含非翻譯區（UTR）。包含基因的基因組區域的UTR可以轉錄但不翻譯。在一些實施方式中，UTR可以被包括在本文所述之表現序列的翻譯起始序列的上游。在一些實施方式中，UTR可以被包括在本文所述之表現序列的下游。在一些情況下，第一表現序列的一個UTR與第二表現序列的另一個UTR相同或連續或重疊。在一些實施方式中，內含子係人內含子。在一些實施方式中，內含子係全長人內含子，例如ZKSCAN1。
在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸包括聚A序列。在一些實施方式中，聚A序列的長度大於10個核苷酸。在一些實施方式中，聚A序列的長度大於15個核苷酸（例如，至少或大於約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500和3,000個核苷酸）。在一些實施方式中，聚A序列係約10個至約3,000個核苷酸（例如，30至50、30至100、30至250、30至500、30至750、30至1,000、30至1,500、30至2,000、30至2,500、50至100、50至250、50至500、50至750、50至1,000、50至1,500、50至2,000、50至2,500、50至3,000、100至500、100至750、100至1,000、100至1,500、100至2,000、100至2,500、100至3,000、500至750、500至1,000、500至1,500、500至2,000、500至2,500、500至3,000、1,000至1,500、1,000至2,000、1,000至2,500、1,000至3,000、1,500至2,000、1,500至2,500、1,500至3,000、2,000至3,000、2,000至2,500和2,500至3,000）。
在一些實施方式中，相對於整個線性多核糖核苷酸的長度設計聚A序列。該設計可以基於編碼區的長度、特定特徵或區域（如第一或側翼區）的長度，或者基於線性多核糖核苷酸表現的最終產物的長度。在本文中，聚A序列的長度可以比線性多核糖核苷酸或其特徵長10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。還可將聚A序列設計為線性多核糖核苷酸的一部分。在本文中，聚A序列可以是構建體的總長度的或構建體總長度減去聚A序列後的10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。進一步，工程化的結合位點和線性多核糖核苷酸與聚A結合蛋白的軛合可以增強表現。
在一些實施方式中，將線性多核糖核苷酸設計為包括聚A-G四分體（quartet）。G-四分體係四個鳥嘌呤核苷酸的環狀氫鍵陣列，可以由DNA和RNA中的富含G的序列形成。在一些實施方式中，G-四分體可被摻入聚A序列的端部。可以測定所得的線性多核糖核苷酸構建體的穩定性、蛋白產量和/或其他參數，包括在不同時間點的半衰期。在一些實施方式中，聚A-G四分體產生的蛋白產量可以等於單獨使用120個核苷酸的聚A序列所得的蛋白產量的至少75%。
在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸包含內嵌有一段或多段的腺苷和尿苷的UTR。AU富集簽名可增加表現產物的轉化率。
UTR AU富集元件（ARE）的引入、去除或修飾可用於調節線性多核糖核苷酸的穩定性或免疫原性。工程化特定的線性多核糖核苷酸時，可以將ARE的一個或多個拷貝引入以使線性多核糖核苷酸不穩定，並且ARE的該等拷貝可以減少翻譯和/或減少表現產物的產量。同樣，可以鑒定和去除ARE或對其進行突變以增加細胞內穩定性，從而增加翻譯和所得蛋白的產量。
可以將來自任何基因的UTR併入線性多核糖核苷酸的相應側翼區域（例如，在5'末端或3'末端）。此外，可以利用任何已知基因的多個野生型UTR。在一些實施方式中，可以使用不是野生型基因的變體的人工UTR。該等UTR或其部分可以放置在與選擇它們的轉錄物中相同的方向，或者可以改變方向或位置。因此，可以將5'-或3'-UTR反向、縮短、加長、或與一個或多個其他5'-UTR或3'-UTR製成嵌合體。如本文使用的，與UTR序列有關時，術語「改變的」係指UTR已經相對於參考序列以某種方式改變。例如，3'-或5'-UTR可以藉由如上所傳授的方向或位置的更改相對於野生型或天然UTR改變，或者可以藉由額外核苷酸的納入、核苷酸的缺失、核苷酸的交換或轉座來改變。該等產生「改變的」UTR的任何更改（無論是3'還是5'）都包含變體UTR。
在一些實施方式中，可以使用雙UTR、三UTR或四UTR，如5'-或3'-UTR。如本文所用，「雙」UTR係其中相同UTR的兩個拷貝被串聯或基本上串聯地編碼的一種情況。例如，在本發明的一些實施方式中可以使用雙β-珠蛋白3'-UTR。
在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸包括一個或多個調控核酸序列或包括一個或多個編碼調控核酸（例如，修飾內源基因和/或外源基因的表現的核酸）的表現序列。在一些實施方式中，本文提供的線性多核糖核苷酸的表現序列可以包含與調控核酸像非編碼RNA諸如但不限於tRNA、lncRNA、miRNA、rRNA、snRNA、microRNA、siRNA、piRNA、snoRNA、snRNA、exRNA、scaRNA、Y RNA和hnRNA反義的序列。
在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸產生化學計量比的表現產物。在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸具有化學計量的翻譯效率，使得表現產物以基本上相等的比率產生。在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸具有多種表現產物（例如來自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多個表現序列的產物）的化學計量翻譯效率。
在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸包含一種或多種核糖開關。
在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸包含適體酶。
在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸缺少5'-UTR。在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸缺少3'-UTR。在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸缺少聚A序列。在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸缺少終止元件。在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸缺少內部核糖體進入位點。在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸缺少與帽結合蛋白的結合。在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸缺少5’帽。
2. 生產方法
在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸包括非天然存在的去氧核糖核酸序列，並且可以使用重組技術（例如，使用DNA質體體外衍生）或化學合成或其組合產生。
在本揭露之範圍內，用於產生RNA的DNA分子可以包括天然存在的原始核酸序列的DNA序列、其修飾形式或編碼通常未在自然界中發現的合成多肽的DNA序列（例如，嵌合分子或融合蛋白，諸如包括多種免疫原的融合蛋白）。DNA和RNA分子可以使用多種技術修飾，包括但不限於經典誘變技術和重組技術，如定點誘變、化學處理核酸分子以誘導突變、限制性酶裂解核酸片段、連接核酸片段、聚合酶鏈式反應（PCR）擴增和/或誘變核酸序列的選定區域、合成寡核苷酸混合物以及連接混合物基團以「建造」核酸分子混合物、及其組合。
線性多核糖核苷酸可以根據任何可用的技術製備，包括但不限於化學合成和酶促合成。在一些實施方式中，線性初級構建體或線性mRNA可以連環化以產生本文所述之線性多核糖核苷酸。連環化的機制可以藉由諸如但不限於化學、酶促、夾板連接或核酶催化之方法來發生。新形成的5'-/3'-鍵可以是分子內鍵或分子間鍵。
製備本文所述之線性多核糖核苷酸之方法描述於以下中，例如，Khudyakov & Fields, Artificial DNA: Methods and Applications [人工DNA：方法與應用], CRC出版社（2002）；Zhao, Synthetic Biology: Tools and Applications [合成生物學：工具和應用],（第一版）, 學術出版社（Academic Press）（2013）；和Egli & Herdewijn, Chemistry and Biology of Artificial Nucleic Acids [人工核酸的化學與生物學],（第一版）, Wiley-VCH（2012）。
多種合成線性多核糖核苷酸之方法也在本領域中進行了描述（參見例如，美國專利號US6210931、美國專利號US5773244、美國專利號US5766903、美國專利號US5712128、美國專利號US5426180、美國公開號US20100137407、國際公開號WO 1992001813和國際公開號WO 2010084371；其各自的內容藉由引用以其全文併入本文）。
產生免疫反應之方法
本揭露提供了包含上述環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物。本揭露提供了包含上述線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物。本發明的免疫原性組成物可以包含稀釋劑或載劑、佐劑或其任何組合。本發明的免疫原性組成物還可以包含一種或多種免疫調節劑，例如一種或多種佐劑。佐劑可以包括下面進一步討論的TH1佐劑和/或TH2佐劑。在一些實施方式中，免疫原性組成物包含不含任何載劑的稀釋劑，並且用於將環狀多核糖核苷酸裸遞送至受試者（例如，要免疫接種的受試者）。在一些實施方式中，免疫原性組成物包含不含任何載劑的稀釋劑，並且用於將線性多核糖核苷酸裸遞送至受試者。
本發明的免疫原性組成物用於在受試者（例如，要免疫接種的受試者）中產生免疫反應。免疫反應可以包括抗體反應（通常包括IgG）和/或細胞介導的免疫反應。在一些實施方式中，免疫原性組成物用於產生如本文所述之多株抗體。例如，為受試者免疫接種包含含有冠狀病毒抗原和/或表位的環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物，以刺激與冠狀病毒抗原和/或表位結合的多株抗體的產生。在另一個實例中，為受試者免疫接種包含含有冠狀病毒抗原和/或表位的線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物，以刺激與冠狀病毒抗原和/或表位結合的多株抗體的產生。在一些實施方式中，受試者係人。在一些實施方式中，受試者係非人類動物。在一些實施方式中，非人類動物具有人源化免疫系統。在一些實施方式中，受試者進一步用佐劑免疫接種。在一些實施方式中，受試者進一步用疫苗免疫接種。視需要，在用包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物免疫接種後，從受試者收集並純化所產生的多株抗體。視需要，在用包含線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物免疫接種後，從受試者收集並純化所產生的多株抗體。在一些實施方式中，組成物包含在投與本文所述之免疫原性組成物後收集的血漿。
A. 免疫接種
在一些實施方式中，本揭露之方法包括為受試者（例如，要免疫接種的受試者）免疫接種包含如本文所揭露的環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物。在一些實施方式中，冠狀病毒抗原和/或表位由環狀多核糖核苷酸表現。在一些實施方式中，免疫接種在受試者中誘導針對由環狀多核糖核苷酸表現的冠狀病毒抗原和/或表位的免疫反應。在一些實施方式中，免疫接種誘導與環狀多核糖核苷酸表現的冠狀病毒抗原和/或表位結合的多株抗體的產生。在一些實施方式中，免疫原性組成物在單一組成物中包含環狀多核糖核苷酸和稀釋劑、載劑、第一佐劑或其組合。在一些實施方式中，受試者進一步用第二佐劑免疫接種。在一些實施方式中，受試者進一步用疫苗免疫接種。
在一些實施方式中，本揭露之方法包括為受試者（例如，要免疫接種的受試者）免疫接種包含如本文所揭露的線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物。在一些實施方式中，冠狀病毒抗原和/或表位由線性多核糖核苷酸表現。在一些實施方式中，免疫接種在受試者中誘導針對由線性多核糖核苷酸表現的冠狀病毒抗原和/或表位的免疫反應。在一些實施方式中，免疫接種誘導與線性多核糖核苷酸表現的冠狀病毒抗原和/或表位結合的多株抗體的產生。在一些實施方式中，免疫原性組成物在單一組成物中包含線性多核糖核苷酸和稀釋劑、載劑、第一佐劑或其組合。在一些實施方式中，受試者進一步用第二佐劑免疫接種。在一些實施方式中，受試者進一步用疫苗免疫接種。
如本文所揭露的環狀多核糖核苷酸藉由在受試者（例如，要免疫接種的受試者）免疫接種後刺激適應性免疫反應來刺激人多株抗體的產生。在一些實施方式中，受試者的適應性免疫反應包括刺激B淋巴細胞釋放與環狀多核糖核苷酸表現的冠狀病毒抗原特異性結合的多株抗體。如本文所揭露的線性多核糖核苷酸藉由在受試者免疫接種後刺激適應性免疫反應來刺激人多株抗體的產生。在一些實施方式中，受試者的適應性免疫反應包括刺激B淋巴細胞釋放與線性多核糖核苷酸表現的冠狀病毒抗原特異性結合的多株抗體。在一些實施方式中，受試者的適應性免疫反應包括刺激細胞介導的免疫反應。
受試者（例如，要免疫接種的受試者）免疫接種一種或多種包含任意數量的環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物。受試者用例如包含至少1種環狀多核糖核苷酸的一種或多種免疫原性組成物免疫接種。具有非人源化免疫系統的非人動物用例如包含至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少11種、至少12種、至少13種、至少14種、至少15種、至少20種不同的環狀多聚核糖核苷酸或更多種不同的環狀多聚核糖核苷酸的一種或多種免疫原性組成物免疫接種。在一些實施方式中，受試者用包含至多1種環狀多核糖核苷酸的一種或多種免疫原性組成物免疫接種。在一些實施方式中，具有人源化免疫系統的非人類動物用包含至多2種、至多3種、至多4種、至多5種、至多6種、至多7種、至多8種、至多9種、至多10種、至多11種、至多12種、至多13種、至多14種、至多15種、至多20種不同的環狀多聚核糖核苷酸或少於21種不同的環狀多聚核糖核苷酸的一種或多種免疫原性組成物免疫接種。在一些實施方式中，受試者用包含約1種環狀多核糖核苷酸的一種或多種免疫原性組成物免疫接種。在一些實施方式中，具有人源化免疫系統的非人動物用包含約2種、約3種、約4種、約5種、約6種、約7種、約8種、約9種、約10種、約11種、約12種、約13種、約14種、約15種或約20種不同的環狀多聚核糖核苷酸的一種或多種免疫原性組成物免疫接種。在一些實施方式中，受試者用包含約1-20、1-15、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-20、2-15、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-20、3-15、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-20、4-15、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、4-4、4-3、5-20、5-15、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、5-10、10-15或15-20種不同的環狀多聚核糖核苷酸的一種或多種免疫原性組成物免疫接種。不同的環狀多核糖核苷酸具有彼此不同的序列。例如，它們可以包括或編碼不同的抗原和/或表位、重疊的抗原和/或表位、相似的抗原和/或表位或相同的抗原和/或表位（例如，具有相同或不同的調控元件、起始序列、啟動子、終止元件或本揭露之其他元件）。在受試者用包含兩種或更多種不同的環狀多聚核糖核苷酸的一種或多種免疫原性組成物免疫接種的情況下，這兩種或更多種不同的環狀多聚核糖核苷酸可以處於相同或不同的免疫原性組成物中並且同時或在不同時間免疫接種。可以將包含兩種或更多種不同的環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物投與給相同的解剖位置或不同的解剖位置。
這兩種或更多種不同的環化多核糖核苷酸可以包括或編碼來自相同冠狀病毒、不同冠狀病毒或本文揭露的冠狀病毒的不同組合的抗原和/或表位。這兩種或更多種不同的環狀多核糖核苷酸可以包括或編碼來自相同冠狀病毒或來自不同冠狀病毒（例如，不同分離株）的抗原和/或表位。
受試者（例如，要免疫接種的受試者）免疫接種一種或多種包含任意數量的線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物。受試者用例如包含至少1種線性多核糖核苷酸的一種或多種免疫原性組成物免疫接種。具有非人源化免疫系統的非人動物用例如包含至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少11種、至少12種、至少13種、至少14種、至少15種、至少20種不同的線性多聚核糖核苷酸或更多種不同的線性多聚核糖核苷酸的一種或多種免疫原性組成物免疫接種。在一些實施方式中，受試者用包含至多1種線性多核糖核苷酸的一種或多種免疫原性組成物免疫接種。在一些實施方式中，具有人源化免疫系統的非人類動物用包含至多2種、至多3種、至多4種、至多5種、至多6種、至多7種、至多8種、至多9種、至多10種、至多11種、至多12種、至多13種、至多14種、至多15種、至多20種不同的線性多聚核糖核苷酸或少於21種不同的線性多聚核糖核苷酸的一種或多種免疫原性組成物免疫接種。在一些實施方式中，受試者用包含約1種線性多核糖核苷酸的一種或多種免疫原性組成物免疫接種。在一些實施方式中，具有人源化免疫系統的非人動物用包含約2種、約3種、約4種、約5種、約6種、約7種、約8種、約9種、約10種、約11種、約12種、約13種、約14種、約15種或約20種不同的線性多聚核糖核苷酸的一種或多種免疫原性組成物免疫接種。在一些實施方式中，受試者用包含約1-20、1-15、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-20、2-15、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-20、3-15、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-20、4-15、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、4-4、4-3、5-20、5-15、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、5-10、10-15或15-20種不同的線性多聚核糖核苷酸的一種或多種免疫原性組成物免疫接種。不同的線性多核糖核苷酸具有彼此不同的序列。例如，它們可以包括或編碼不同的抗原和/或表位、重疊的抗原和/或表位、相似的抗原和/或表位或相同的抗原和/或表位（例如，具有相同或不同的調控元件、起始序列、啟動子、終止元件或本揭露之其他元件）。在受試者用包含兩種或更多種不同的線性多聚核糖核苷酸的一種或多種免疫原性組成物免疫接種的情況下，這兩種或更多種不同的線性多聚核糖核苷酸可以處於相同或不同的免疫原性組成物中並且同時或在不同時間免疫接種。可以將包含兩種或更多種不同的線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物投與給相同的解剖位置或不同的解剖位置。
這兩種或更多種不同的線性多核糖核苷酸可以包括或編碼來自相同冠狀病毒、不同冠狀病毒或本文揭露的冠狀病毒的不同組合的抗原和/或表位。這兩種或更多種不同的線性多核糖核苷酸可以包括或編碼來自相同冠狀病毒或來自不同冠狀病毒（例如，不同分離株）的抗原和/或表位。
在一些實施方式中，受試者（例如，要免疫接種的受試者）用如本文所揭露的包含任何數量的環狀多核糖核苷酸的一種或多種免疫原性組成物和包含任何數量的線性多核糖核苷酸的一種或多種免疫原性組成物免疫接種。在一些實施方式中，本文揭露的免疫原性組成物包含如本文所揭露的一種或多種環狀多核糖核苷酸和一種或多種線性多核糖核苷酸。
在一些實施方式中，免疫原性組成物包含環狀多核糖核苷酸和稀釋劑、載劑、第一佐劑或其組合。在一個特定實施方式中，免疫原性組成物包含本文所述之環狀多核糖核苷酸和載劑或不含任何載劑的稀釋劑。在一些實施方式中，包含環狀多核糖核苷酸與不含任何載劑的稀釋劑的免疫原性組成物用於將環狀多核糖核苷酸裸遞送至受試者。在另一個特定實施方式中，免疫原性組成物包含本文所述之環狀多核糖核苷酸和第一佐劑。
在某些實施方式中，進一步向受試者（例如，要免疫接種的受試者）投與第二佐劑。佐劑增強先天免疫反應，繼而增強受試者中的適應性免疫反應以產生多株抗體。佐劑可以是如下所討論的任何佐劑。在某些實施方式中，佐劑作為免疫原性組成物的一部分與環狀多核糖核苷酸一起配製。在某些實施方式中，佐劑不是包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物的一部分。在某些實施方式中，佐劑與包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物分開投與。在這方面，佐劑與包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物共同投與（例如同時投與）或在不同的時間投與給受試者。例如，在包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物之後1分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、90分鐘、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、12小時、14小時、16小時、18小時、20小時、22小時或24小時，或介於之間的任何分鐘數或小時數，投與佐劑。在一些實施方式中，在包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物之前1分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、90分鐘、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、12小時、14小時、16小時、18小時、20小時、22小時或24小時，或介於之間的任何分鐘數或小時數，投與佐劑。例如，在包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物之後1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77或84天，或介於之間的任何天數，投與佐劑。在一些實施方式中，在包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物之前1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77或84天，或介於之間的任何天數，投與佐劑。將佐劑投與到與包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物相同的解剖位置或不同的解剖位置。
在一些實施方式中，免疫原性組成物包含線性多核糖核苷酸和稀釋劑、載劑、第一佐劑或其組合。在一個特定實施方式中，免疫原性組成物包含本文所述之線性多核糖核苷酸和載劑或不含任何載劑的稀釋劑。在一些實施方式中，包含線性多核糖核苷酸與不含任何載劑的稀釋劑的免疫原性組成物用於將線性多核糖核苷酸裸遞送至受試者（例如，要免疫接種的受試者）。在另一個特定實施方式中，免疫原性組成物包含本文所述之線性多核糖核苷酸和第一佐劑。
在某些實施方式中，進一步向受試者（例如，要免疫接種的受試者）投與第二佐劑。佐劑增強先天免疫反應，繼而增強受試者中的適應性免疫反應以產生多株抗體。佐劑可以是如下所討論的任何佐劑。在某些實施方式中，佐劑作為免疫原性組成物的一部分與線性多核糖核苷酸一起配製。在某些實施方式中，佐劑不是包含線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物的一部分。在某些實施方式中，佐劑與包含線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物分開投與。在這方面，佐劑與包含線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物共同投與（例如同時投與）或在不同的時間投與給受試者。例如，在包含線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物之後1分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、90分鐘、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、12小時、14小時、16小時、18小時、20小時、22小時或24小時，或介於之間的任何分鐘數或小時數，投與佐劑。在一些實施方式中，在包含線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物之前1分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、90分鐘、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、12小時、14小時、16小時、18小時、20小時、22小時或24小時，或介於之間的任何分鐘數或小時數，投與佐劑。例如，在包含線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物之後1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77或84天，或介於之間的任何天數，投與佐劑。在一些實施方式中，在包含線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物之前1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77或84天，或介於之間的任何天數，投與佐劑。將佐劑投與到與包含線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物相同的解剖位置或不同的解剖位置。
在一些實施方式中，受試者（例如，要免疫接種的受試者）用第二藥劑，例如不是環狀多核糖核苷酸的疫苗（如下所述）進一步免疫接種。該疫苗與包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物共同投與（例如同時投與）或在不同的時間投與給受試者。例如，在包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物之後1分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、90分鐘、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、12小時、14小時、16小時、18小時、20小時、22小時或24小時，或介於之間的任何分鐘數或小時數，投與疫苗。在一些實施方式中，在包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物之前1分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、90分鐘、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、12小時、14小時、16小時、18小時、20小時、22小時或24小時，或介於之間的任何分鐘數或小時數，投與疫苗。例如，在包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物之後1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77或84天，或介於之間的任何天數，投與疫苗。在一些實施方式中，在包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物之前1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77或84天，或介於之間的任何天數，投與疫苗。
在一些實施方式中，受試者（例如，要免疫接種的受試者）用第二藥劑，例如不是線性多核糖核苷酸的疫苗（如下所述）進一步免疫接種。該疫苗與包含線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物共同投與（例如同時投與）或在不同的時間投與給受試者。例如，在包含線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物之後1分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、90分鐘、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、12小時、14小時、16小時、18小時、20小時、22小時或24小時，或介於之間的任何分鐘數或小時數，投與疫苗。在一些實施方式中，在包含線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物之前1分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、90分鐘、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、12小時、14小時、16小時、18小時、20小時、22小時或24小時，或介於之間的任何分鐘數或小時數，投與該疫苗。例如，在包含線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物之後1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77或84天，或介於之間的任何天數，投與疫苗。在一些實施方式中，在包含線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物之前1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77或84天，或介於之間的任何天數，投與該疫苗。
受試者（例如，要免疫接種的受試者）可以用免疫原性組成物、佐劑、疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合免疫接種任何合適的次數，以實現所需的反應。例如，可利用初免-加強免疫接種策略來生成含有高濃度的與本揭露之抗原和/或表位結合的抗體的超免疫血漿。受試者可以用本揭露之免疫原性組成物、佐劑、疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合免疫接種，例如至少1次、至少2次、至少3次、至少4次、至少5次、至少6次、至少7次、至少8次、至少9次、至少10次或至少15次或更多次。
在一些實施方式中，受試者（例如，要免疫接種的受試者）可以用本揭露之免疫原性組成物、佐劑、疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合免疫接種，至多2次、至多3次、至多4次、至多5次、至多6次、至多7次、至多8次、至多9次、至多10次、至多15次或至多20次或更少次。
在一些實施方式中，受試者（例如，要免疫接種的受試者）可以用本揭露之免疫原性組成物、佐劑、疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合免疫接種約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20次。
在一些實施方式中，受試者（例如，要免疫接種的受試者）可以用本揭露之免疫原性組成物、佐劑、疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合免疫接種一次。在一些實施方式中，受試者可以用本揭露之免疫原性組成物、佐劑、疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合免疫接種兩次。在一些實施方式中，受試者可以用本揭露之免疫原性組成物、佐劑、疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合免疫接種三次。在一些實施方式中，受試者可以用本揭露之免疫原性組成物、佐劑、疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合免疫接種四次。在一些實施方式中，受試者可以用本揭露之免疫原性組成物、佐劑、疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合免疫接種五次。在一些實施方式中，受試者可以用本揭露之免疫原性組成物、佐劑、疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合免疫接種七次。
可以選擇合適的時間間隔以間隔兩次或更多次免疫接種。該時間間隔可以適用於用相同免疫原性組成物、佐劑或疫苗（例如蛋白質亞基疫苗）或其組合進行多次免疫接種，例如，相同免疫原性組成物、佐劑或疫苗（例如蛋白質亞基疫苗）或其組合可以經由相同的免疫接種途徑或不同的免疫接種途徑以相同的量或不同的量投與。該時間間隔可適用於用不同藥劑，例如，包含第一環狀多核糖核苷酸的第一免疫原性組成物和包含第二環狀多核糖核苷酸的第二免疫原性組成物進行免疫接種。該時間間隔可以適用於包含第一線性多核糖核苷酸的第一免疫原性組成物和包含第二線性多核糖核苷酸的第二免疫原性組成物。對於包括三次或更多次免疫接種的方案，免疫接種的時間間隔可以相同或不同。在一些實例中，兩次免疫接種之間經過約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、16、17、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、40、48或72小時。在一些實施方式中，兩次免疫接種之間經過約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、16、17、18、20、21、24、28或30天。在一些實施方式中，兩次免疫接種之間經過約1、2、3、4、5、6、7或8週。在一些實施方式中，兩次免疫接種之間經過約1、2、3、4、5、6、7或8個月。
在一些實施方式中，兩次免疫接種之間經過至少1小時、至少2小時、至少3小時、至少4小時、至少5小時、至少6小時、至少7小時、至少8小時、至少9小時、至少10小時、至少15小時、至少20小時、至少24小時、至少36小時或至少72小時或更長時間。在一些實施方式中，兩次免疫接種之間經過至多1小時、至多2小時、至多3小時、至多4小時、至多5小時、至多6小時、至多7小時、至多8小時、至多9小時、至多10小時、至多15小時、至多20小時、至多24小時、至多36小時或至多72小時或更少時間。
在一些實施方式中，兩次免疫接種之間經過至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少15天、至少20天、至少21天、至少22天、至少23天、至少24天、至少25天、至少26天、至少27天、至少28天、至少29天或至少30天或更長時間。在一些實施方式中，兩次免疫接種之間經過至多2天、至多3天、至多4天、至多5天、至多6天、至多7天、至多8天、至多9天、至多10天、至多15天、至多20天、至多21天、至多22天、至多23天、至多24天、至多25天、至多26天、至多27天、至多28天、至多29天、至多30天、至多32天、至多34天或至多36天或更少時間。
在一些實施方式中，兩次免疫接種之間經過至少1週、至少2週、至少3週、至少4週、至少5週、至少6週、至少7週或至少8週或更長時間。在一些實施方式中，兩次免疫接種之間經過至多2週、至多3週、至多4週、至多5週、至多6週、至多7週、至多8週或更少時間。
在一些實施方式中，兩次免疫接種之間經過至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月或至少8個月或更長時間。在一些實施方式中，兩次免疫接種之間經過至多2個月、至多3個月、至多4個月、至多5個月、至多6個月、至多7個月、至多8個月或更少時間。
在一些實施方式中，具有人源化免疫系統的非人類動物以3-4週的間隔免疫接種3次。
在一些實施方式中，該方法進一步包括向非人類動物（例如，具有人源化免疫系統的非人類動物）或人類受試者（例如，要免疫接種的非人類動物或人類受試者）預先投與藥劑以提高免疫反應。在一些實施方式中，該藥劑係如本文所揭露的抗原（例如，蛋白質抗原）。例如，該方法包括在投與包含編碼蛋白質抗原的序列的環狀多核糖核苷酸前1至7天投與蛋白質抗原。在一些實施方式中，在投與包含編碼蛋白質抗原的序列的環狀多核糖核苷酸前1、2、3、4、5、6或7天投與蛋白質抗原。例如，該方法包括在投與包含編碼蛋白質抗原的序列的線性多核糖核苷酸前1至7天投與蛋白質抗原。在一些實施方式中，在投與包含編碼蛋白質抗原的序列的線性多核糖核苷酸前1、2、3、4、5、6或7天投與蛋白質抗原。蛋白質抗原可以作為蛋白質製劑投與，在質體（pDNA）中編碼，存在於病毒樣顆粒（VLP）中，以脂質奈米顆粒的形式配製等。
受試者（例如，要免疫接種的受試者）可以在任何合適數目的解剖部位用免疫原性組成物、佐劑或疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合免疫接種。可以將相同的免疫原性組成物、佐劑、疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合投與給多個解剖部位，可以將包含相同或不同的環狀多核糖核苷酸的不同免疫原性組成物、佐劑、疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合投與給不同的解剖部位，可以將包含相同或不同的環狀多核糖核苷酸的不同免疫原性組成物、佐劑、疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合投與給相同的解剖部位，或其任何組合。例如，可以將包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物投與給兩個不同的解剖部位，和/或可以將包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物投與給一個解剖部位，並且可以將佐劑投與給不同的解剖部位。可以將相同的免疫原性組成物、佐劑、疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合投與給多個解剖部位，可以將包括相同或不同的線性多核糖核苷酸的不同免疫原性組成物、佐劑、疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合投與給不同的解剖部位，可以將包括相同或不同的線性多核糖核苷酸的不同免疫原性組成物、佐劑、疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合投與給相同的解剖部位，或其任何組合。例如，可以將包含線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物投與給兩個不同的解剖部位，和/或可以將包含線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物投與給一個解剖部位，並且可以將佐劑投與給不同的解剖部位。
任何兩個或更多個解剖途徑的免疫接種可以經由相同的免疫接種途徑（例如，肌內）或藉由兩個或更多個免疫接種途徑來進行。在一些實施方式中，將本揭露之包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物、佐劑或疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合向受試者的至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或至少6個解剖部位免疫接種。在一些實施方式中，將本揭露之包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物、佐劑或疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合向受試者的至多2個、至多3個、至多4個、至多5個、至多6個、至多7個、至多8個、至多9個或至多10個解剖部位或更少解剖部位免疫接種。在一些實施方式中，將本揭露之包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物或佐劑向受試者的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個解剖部位免疫接種。在一些實施方式中，將本揭露之包含線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物、佐劑或疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合向受試者的至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或至少6個解剖部位免疫接種。在一些實施方式中，將本揭露之包含線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物、佐劑或疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合向受試者的至多2個、至多3個、至多4個、至多5個、至多6個、至多7個、至多8個、至多9個或至多10個解剖部位或更少解剖部位免疫接種。在一些實施方式中，將本揭露之包含線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物或佐劑向受試者的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個解剖部位免疫接種。
免疫接種可以經由任何合適的途徑。免疫接種途徑的非限制性實例包括靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、真皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊柱內、硬膜外、胸骨內、腦內、眼內、病灶內、腦室內、腦池內或實質內，例如注射和輸注。在一些情況下，免疫接種可以經由吸入進行。可以藉由相同或不同的途徑進行兩次或更多次免疫接種。
可以向本揭露之受試者（例如，要免疫接種的受試者）投與任何適量的環狀多核糖核苷酸。例如，受試者可以用至少約1 ng、至少約10 ng、至少約100 ng、至少約1 μg、至少約10 μg、至少約100 μg、至少約1 mg、至少約10 mg、至少約100 mg或至少約1 g的環狀多核糖核苷酸免疫接種。在一些實施方式中，受試者可以用至多約1 ng、至多約10 ng、至多約100 ng、至多約1 μg、至多約10 μg、至多約100 μg、至多約1 mg、至多約10 mg、至多約100 mg或至多約1 g的環狀多核糖核苷酸免疫接種。在一些實施方式中，受試者可以用約1 ng、約10 ng、約100 ng、約1 μg、約10 μg、約100 μg、約1 mg、約10 mg、約100 mg或約1 g的環狀多核糖核苷酸免疫接種。
可以向本揭露之受試者（例如，要免疫接種的受試者）投與任何適量的線性多核糖核苷酸。例如，受試者可以用至少約1 ng、至少約10 ng、至少約100 ng、至少約1 μg、至少約10 μg、至少約100 μg、至少約1 mg、至少約10 mg、至少約100 mg或至少約1 g的線性多核糖核苷酸免疫接種。在一些實施方式中，受試者可以用至多約1 ng、至多約10 ng、至多約100 ng、至多約1 μg、至多約10 μg、至多約100 μg、至多約1 mg、至多約10 mg、至多約100 mg或至多約1 g的線性多核糖核苷酸免疫接種。在一些實施方式中，受試者可以用約1 ng、約10 ng、約100 ng、約1 μg、約10 μg、約100 μg、約1 mg、約10 mg、約100 mg或約1 g的線性多核糖核苷酸免疫接種。
在一些實施方式中，該方法進一步包括評價非人類動物或人類受試者（例如，要免疫接種的受試者）對抗原的抗體反應。在一些實施方式中，評價係在投與包含編碼冠狀病毒抗原的序列的環狀多核糖核苷酸之前和/或之後。在一些實施方式中，評價係在投與包含編碼冠狀病毒抗原的序列的線性多核糖核苷酸之前和/或之後。
1. 稀釋劑
在一些實施方式中，本發明的免疫原性組成物包含環狀多核糖核苷酸和稀釋劑。在一些實施方式中，本發明的免疫原性組成物包含線性多核糖核苷酸和稀釋劑。
稀釋劑可以是非載劑賦形劑。非載劑賦形劑用作組成物（諸如，如本文所述之環狀多核糖核苷酸）的媒介物或介質。非載劑賦形劑用作組成物（諸如，如本文所述之線性多核糖核苷酸）的媒介物或介質。非載劑賦形劑的非限制性實例包括溶劑、水性溶劑、非水溶劑、分散介質、稀釋劑、分散劑、助懸劑、表面活性劑、等滲劑、增稠劑、乳化劑、防腐劑、聚合物、肽、蛋白質、細胞、透明質酸酶、分散劑、製粒劑、崩散劑、黏合劑、緩衝劑（例如，磷酸鹽緩衝鹽水（PBS））、潤滑劑、油及其混合物。非載劑賦形劑可以是經美國食品和藥物管理局（FDA）批准並列在非活性成分數據庫中的不表現出細胞穿透作用的任一種非活性成分。非載劑賦形劑可以是適於投與給非人類動物（例如，適合獸醫用途）的任何非活性成分。為了使組成物適於向各種動物投與，對適於向人投與的組成物的修飾得到很好的理解，並且普通技術的獸醫藥理師可以僅藉由普通的實驗（如果有）來設計和/或進行此類修飾。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸可以以裸遞送配製物的形式遞送，諸如包含稀釋劑。裸遞送配製物將環狀多核糖核苷酸遞送至細胞，無需借助於載劑並且無需對環狀多核糖核苷酸、加帽的多核糖核苷酸或其複合物進行修飾或部分或完全包封。
裸遞送配製物係不含載劑的配製物並且其中環狀多核糖核苷酸沒有結合有助於遞送至細胞的部分的共價修飾，或者沒有對環狀多核糖核苷酸的部分或完全包封。在一些實施方式中，沒有結合有助於遞送至細胞的部分的共價修飾的環狀多核糖核苷酸係未與蛋白質、小分子、顆粒、聚合物或生物聚合物共價結合的多核糖核苷酸。沒有結合有助於遞送至細胞的部分的共價修飾的環狀多核糖核苷酸不含經修飾的磷酸基團。例如，沒有結合有助於遞送至細胞的部分的共價修飾的環狀多核糖核苷酸不含硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼代磷酸鹽、硼代磷酸酯、磷酸氫鹽、胺基磷酸酯、二胺基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯或磷酸三酯。
在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸可以以裸遞送配製物的形式遞送，諸如包含稀釋劑。裸遞送配製物將線性多核糖核苷酸遞送至細胞，無需借助於載劑並且無需對線性多核糖核苷酸、加帽的多核糖核苷酸或其複合物進行修飾或部分或完全包封。
裸遞送配製物係不含載劑的配製物並且其中線性多核糖核苷酸沒有結合有助於遞送至細胞的部分的共價修飾，或者沒有對線性多核糖核苷酸的部分或完全包封。在一些實施方式中，沒有結合有助於遞送至細胞的部分的共價修飾的線性多核糖核苷酸係未與蛋白質、小分子、顆粒、聚合物或生物聚合物共價結合的多核糖核苷酸。沒有結合有助於遞送至細胞的部分的共價修飾的線性多核糖核苷酸不含經修飾的磷酸基團。例如，沒有結合有助於遞送至細胞的部分的共價修飾的線性多核糖核苷酸不含硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼代磷酸鹽、硼代磷酸酯、磷酸氫鹽、胺基磷酸酯、二胺基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯或磷酸三酯。
在一些實施方式中，裸遞送配製物不含以下任何或全部：轉染試劑、陽離子載劑、碳水化合物載劑、奈米顆粒載劑或蛋白質載劑。在一些實施方式中，裸遞送配製物不含植物糖原辛烯基琥珀酸酯、植物糖原β-糊精、酸酐改性的植物糖原β-糊精、脂轉染胺（lipofectamine）、聚乙烯亞胺、聚(三甲基亞胺)、聚(四甲基亞胺)、聚丙烯亞胺、胺基糖苷-聚胺、雙去氧-二胺基-b-環糊精、精胺、亞精胺、聚甲基丙烯酸(2-二甲基胺基)乙酯、聚(離胺酸)、聚(組胺酸)、聚(精胺酸)、陽離子明膠、樹狀聚合物、殼聚糖、1,2-二油醯基-3-三甲基銨-丙烷（DOTAP）、N-[1-(2,3-二油醯氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨（DOTMA）、1-[2-(油醯氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羥乙基)咪唑鎓氯化物（DOTIM）、2,3-二油醯氧基-N-[2(精胺甲醯胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-三氟乙酸丙銨（DOSPA）、3B-[N-(N,N'-二甲胺基乙烷)-胺基甲醯基]膽固醇鹽酸鹽（DC-膽固醇鹽酸鹽）、二-十七烷基胺基甘胺醯基亞精胺（DOGS）、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化銨（DDAB）、N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羥乙基溴化銨（DMRIE）、N,N-二油基-N,N-二甲基氯化銨（DODAC）、人血清白蛋白（HSA）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）或球蛋白。
在某些實施方式中，裸遞送配製物包含非載劑賦形劑。在一些實施方式中，非載劑賦形劑包含不表現出細胞穿透作用的非活性成分。在一些實施方式中，非載劑賦形劑包含緩衝劑，例如PBS。在一些實施方式中，非載劑賦形劑係溶劑、非水溶劑、稀釋劑、助懸劑、表面活性劑、等滲劑、增稠劑、乳化劑、防腐劑、聚合物、肽、蛋白質、細胞、透明質酸酶、分散劑、成粒劑、崩散劑、黏合劑、緩衝劑、潤滑劑或油。
在一些實施方式中，裸遞送配製物包含稀釋劑。稀釋劑可以是液體稀釋劑或固體稀釋劑。在一些實施方式中，稀釋劑係RNA增溶劑、緩衝劑或等滲劑。RNA增溶劑的實例包括水、乙醇、甲醇、丙酮、甲醯胺和2-丙醇。緩衝劑的實例包括2-(N-𠰌啉代)乙磺酸（MES）、Bis-Tris、2-[(2-胺基-2-側氧基乙基)-(羧甲基)胺基]乙酸（ADA）、N-(2-乙醯胺基)-2-胺基乙烷磺酸（ACES）、哌𠯤-N,N′-雙(2-乙磺酸)（PIPES）、2-[[1,3-二羥基-2-(羥甲基)丙-2-基]胺基]乙磺酸（TES）、3-(N-𠰌啉代)丙烷磺酸（MOPS）、4-(2-羥乙基)-1-哌𠯤乙磺酸（HEPES）、Tris、Tricine、Gly-Gly、Bicine或磷酸鹽。等滲劑的實例包括甘油、甘露醇、聚乙二醇、丙二醇、海藻糖或蔗糖。
2. 載劑
在一些實施方式中，本發明的免疫原性組成物包含環狀多核糖核苷酸和載劑。在一些實施方式中，本發明的免疫原性組成物包含線性多核糖核苷酸和載劑。
在某些實施方式中，免疫原性組成物包含在囊泡或其他基於膜的載劑中的如本文所述之環狀多核糖核苷酸。在某些實施方式中，免疫原性組成物包含在囊泡或其他基於膜的載劑中的如本文所述之線性多核糖核苷酸。
在其他實施方式中，免疫原性組成物包含在或經由細胞、囊泡或其他基於膜的載劑中的環狀多核糖核苷酸。在其他實施方式中，免疫原性組成物包含在或經由細胞、囊泡或其他基於膜的載劑中的線性多核糖核苷酸。在一個實施方式中，免疫原性組成物包含在脂質體或其他類似囊泡中的環狀多核糖核苷酸。在一個實施方式中，免疫原性組成物包含在脂質體或其他類似囊泡中的線性多核糖核苷酸。脂質體係球形囊泡結構，該等球形囊泡結構由圍繞內部水性隔室的單層或多層的脂質雙層和相對不可滲透的外部親脂性磷脂雙層構成。脂質體可以是陰離子的、中性的或陽離子的。脂質體具有生物相容性，無毒，可以遞送親水性和親脂性藥物分子，避免其貨物被血漿酶降解，並將其負載運輸穿過生物膜和血腦屏障（BBB）（有關綜述，參見，例如，Spuch和Navarro, Journal of Drug Delivery [藥物遞送雜誌], 第2011卷, 文章ID 469679, 第12頁, 2011. doi:10.1155/2011/469679）。
囊泡可由幾種不同類型的脂質製成；然而，最常使用磷脂生成作為藥物載劑的脂質體。製備多層囊泡脂質之方法係本領域已知的（參見例如美國專利號6,693,086，其關於多層囊泡脂質製備的教導藉由援引併入文中）。儘管當脂質膜與水溶液混合時，囊泡的形成係自發的，但也可以藉由使用均質器、超音波儀或擠壓裝置以振盪的形式施加力來加快囊泡的形成（有關綜述，參見，例如，Spuch和Navarro, Journal of Drug Delivery [藥物遞送雜誌], 第2011卷, 文章ID 469679, 第12頁, 2011. doi:10.1155/2011/469679）。可藉由擠出通過具有減小尺寸的過濾器來製備擠出的脂質，如Templeton等人, Nature Biotech [自然生物技術], 15:647-652, 1997中所述，其關於擠出脂質製備的教導藉由援引併入文中。
在某些實施方式中，本發明的免疫原性組成物包含環狀多核糖核苷酸和脂質奈米顆粒。在某些實施方式中，本發明的免疫原性組成物包含線性多核糖核苷酸和脂質奈米顆粒。脂質奈米顆粒係為如本文所述之環狀多核糖核苷酸分子提供生物相容性和可生物降解的遞送系統的載劑的另一個實例。脂質奈米顆粒係為如本文所述之線性多核糖核苷酸分子提供生物相容性和可生物降解的遞送系統的載劑的另一個實例。奈米結構化的脂質載劑（NLC）係經修飾的固體脂質奈米顆粒（SLN），其保留了SLN的特性，提高了藥物的穩定性和載藥量，並防止了藥物洩漏。聚合物奈米顆粒（PNP）係藥物遞送的重要組成部分。該等奈米顆粒可以有效地將藥物遞送引導至特定靶標並改善藥物穩定性和受控的藥物釋放。也可以使用脂質聚合物奈米顆粒（PLN），其係一種組合了脂質體和聚合物的新型載劑。該等奈米顆粒具有PNP和脂質體的互補優勢。PLN由核-殼結構構成；聚合物核提供了穩定的結構，磷脂殼提供了良好的生物相容性。這樣，這兩種組分提高了藥物包封有效率，促進了表面修飾，並防止了水溶性藥物的洩漏。有關綜述，參見例如Li等人2017, Nanomaterials [奈米材料] 7, 122; doi:10.3390/nano7060122。
載劑的其他非限制性實例包括碳水化合物載劑（例如，酸酐改性的植物糖原或糖原型材料）、蛋白質載劑（例如，與環狀多核糖核苷酸共價連接的蛋白質或與線性多核糖核苷酸共價連接的蛋白質）或陽離子載劑（例如，陽離子脂聚合物或轉染試劑）。碳水化合物載劑的非限制性實例包括植物糖原辛烯基琥珀酸酯、植物糖原β-糊精和酸酐改性的植物糖原β-糊精。陽離子載劑的非限制性實例包括脂轉染胺（lipofectamine）、聚乙烯亞胺、聚(三甲基亞胺)、聚(四甲基亞胺)、聚丙烯亞胺、胺基糖苷-聚胺、雙去氧-二胺基-b-環糊精、精胺、亞精胺、聚甲基丙烯酸(2-二甲基胺基)乙酯、聚(離胺酸)、聚(組胺酸)、聚(精胺酸)、陽離子明膠、樹狀聚合物、殼聚糖、1,2-二油醯基-3-三甲基銨-丙烷（DOTAP）、N-[1-(2,3-二油醯氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨（DOTMA）、1-[2-(油醯氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羥乙基)咪唑鎓氯化物（DOTIM）、2,3-二油醯氧基-N-[2(精胺甲醯胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-三氟乙酸丙銨（DOSPA）、3B-[N-(N,N'-二甲胺基乙烷)-胺基甲醯基]膽固醇鹽酸鹽（DC-膽固醇鹽酸鹽）、二-十七烷基胺基甘胺醯基亞精胺（DOGS）、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化銨（DDAB）、N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羥乙基溴化銨（DMRIE）和N,N-二油基-N,N-二甲基氯化銨（DODAC）。蛋白質載劑的非限制性實例包括人血清白蛋白（HSA）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）或球蛋白。
外來體也可用作本文所述之環狀多核糖核苷酸分子的載劑或藥物遞送媒介物。外來體也可用作本文所述之線性多核糖核苷酸分子的載劑或藥物遞送媒介物。有關綜述，參見Ha等人2016年7月. Acta Pharmaceutica Sinica B. [藥學學報]第6卷, 第4期, 第287-296頁；https://doi.org/10.1016/j.apsb.2016.02.001。
離體分化的紅血球也可以用作本文所述之環狀多核糖核苷酸分子的載劑。離體分化的紅血球也可以用作本文所述之線性多核糖核苷酸分子的載劑。參見，例如，WO 2015073587；WO 2017123646；WO 2017123644；WO 2018102740；WO 2016183482；WO 2015153102；WO 2018151829；WO 2018009838；Shi等人2014. Proc Natl Acad Sci USA.[美國國家科學院院刊]111（28）: 10131-10136；美國專利9,644,180；Huang等人2017.Nature Communications [自然通訊] 8: 423；Shi等人2014. Proc Natl Acad Sci USA. [美國國家科學院院刊] 111(28): 10131-10136。
例如WO 2018208728中所述之融合體組成物也可以用作載劑遞送本文所述之環狀多核糖核苷酸分子。例如WO 2018208728中所述之融合體組成物也可以用作載劑遞送本文所述之線性多核糖核苷酸分子。
病毒體和病毒樣顆粒（VLP）也可用作載劑將本文所述之環狀多核糖核苷酸分子遞送至靶向的細胞。病毒體和病毒樣顆粒（VLP）也可用作載劑將本文所述之線性多核糖核苷酸分子遞送至靶向的細胞。
例如國際專利公開號WO 2011097480、WO 2013070324、WO 2017004526或WO 2020041784中所述之植物奈米囊泡和植物信使包（PMP）也可用作載劑遞送本文所述之環狀多核糖核苷酸。植物奈米囊泡和植物信使包（PMP）也可用作載劑遞送本文所述之線性多核糖核苷酸分子
微泡也可以用作載劑遞送本文所述之環狀多核糖核苷酸分子。微泡也可以用作載劑遞送本文所述之線性多核糖核苷酸。參見，例如，US7115583；Beeri, R.等人，Circulation. [循環]2002年10月1日；106(14):1756-1759；Bez, M.等人，Nat Protoc. [自然實驗手冊]2019年4月；14（4）: 1015-1026；Hernot, S.等人，Adv Drug Deliv Rev. [高級藥物遞送綜述] 2008年6月30日; 60（10）: 1153-1166；Rychak, J.J.等人，Adv Drug Deliv Rev. [高級藥物遞送綜述] 2014年6月; 72: 82-93。在一些實施方式中，微泡係白蛋白包被的全氟化碳微泡。
3. 佐劑
佐劑會增強在接受佐劑和/或包含該佐劑的免疫原性組成物的受試者（例如，要免疫接種的受試者）中引發的免疫反應（體液和/或細胞免疫反應）。在一些實施方式中，向受試者（例如，要免疫接種的受試者）投與佐劑以從如本文所揭露的環狀多核糖核苷酸產生多株抗體。在一些實施方式中，向受試者投與佐劑以從如本文所揭露的線性多核糖核苷酸產生多株抗體。在一些實施方式中，佐劑用於本文所述之方法中以產生如本文所述之多株抗體。在一個特定實施方式中，佐劑用於促進受試者中針對由環狀多核糖核苷酸表現的冠狀病毒抗原和/或表位的多株抗體的產生。在一些實施方式中，佐劑和環狀多核糖核苷酸在分開的組成物中共同投與。在一些實施方式中，將佐劑與環狀多核糖核苷酸混合或配製為單一組成物以獲得免疫原性組成物，將該免疫原性組成物投與給受試者。在一個特定實施方式中，佐劑用於促進受試者中針對由線性多核糖核苷酸表現的冠狀病毒抗原和/或表位的多株抗體的產生。在一些實施方式中，佐劑和線性多核糖核苷酸在分開的組成物中共同投與。在一些實施方式中，將佐劑與線性多核糖核苷酸混合或配製為單一組成物以獲得免疫原性組成物，將該免疫原性組成物投與給受試者。
佐劑可以是TH1佐劑和/或TH2佐劑。較佳的佐劑包括但不限於以下的一種或多種： 含礦物質的組成物。適於在本發明中用作佐劑的含礦物質的組成物包括礦物鹽，諸如鋁鹽和鈣鹽。本發明包括礦物鹽，諸如氫氧化物（例如羥基氧化物）、磷酸鹽（例如羥基磷酸鹽、正磷酸鹽）、硫酸鹽等，或不同礦物化合物的混合物，其中化合物呈任何合適的形式（例如凝膠、結晶、無定形形式等）。鈣鹽包括磷酸鈣（例如，「CAP」）。鋁鹽包括氫氧化物、磷酸鹽、硫酸鹽等。
油乳劑組成物。適於在本發明中用作佐劑的油乳劑組成物包括角鯊烯-水乳劑，諸如MF59（5%角鯊烯、0.5%吐溫80和0.5% Span，使用微流化器配製為亞微米顆粒）、AS03（水包油乳劑中的α-生育酚、角鯊烯和聚山梨醇酯80）、Montanide配製物（例如Montanide ISA 51、Montanide ISA 720）、不完全弗氏佐劑（IFA）、完全弗氏佐劑（CFA）和不完全弗氏佐劑（IFA）。
小分子。適於在本發明中用作佐劑的小分子包括咪喹莫特或847、瑞喹莫德或R848、或嘎德莫特。
聚合物奈米顆粒。適於在本發明中用作佐劑的聚合物奈米顆粒包括聚(a-羥基酸)、聚羥基丁酸、聚內酯（包括聚己內酯）、聚對二氧環己酮、聚戊內酯、聚原酸酯、聚酸酐、聚氰基丙烯酸酯、酪胺酸衍生的聚碳酸酯、聚乙烯基吡咯啶酮或聚酯-醯胺及其組合。
皂苷（即，糖苷，附接至一條或多條糖側鏈的多環苷元）。適於在本發明中用作佐劑的皂苷配製物包括純化配製物，諸如QS21，以及脂質配製物，諸如ISCOM和ISCOM基質。QS21作為STIMULON（TM）在市場上銷售。皂苷配製物也可以包含固醇，諸如膽固醇。皂苷和膽固醇的組合可用於形成稱為免疫刺激複合物（ISCOM）的獨特顆粒。ISCOM通常還包含磷脂，諸如磷脂醯乙醇胺或磷脂醯膽鹼。任何已知的皂苷都可用於ISCOM中。較佳的是，ISCOM包含QuilA、QHA和QHC中的一種或多種。視需要，ISCOM可以不含另外的洗滌劑。
脂多糖。適於在本發明中使用的佐劑包括腸細菌脂多糖（LPS）的無毒衍生物。此類衍生物包括單磷醯基脂質A（MPLA）、哌喃葡萄糖基脂質A（GLA）和3-O-去醯化MPL（3dMPL）。3dMPL係3去氧-醯化單磷醯基脂質A與4、5或6條醯化鏈的混合物。其他無毒LPS衍生物包括單磷醯基脂質A模擬物，諸如胺基烷基胺基葡萄糖胺磷酸鹽衍生物，例如RC-529。
脂質體。適於在本發明中用作佐劑的脂質體包括病毒體和CAF01。
脂質奈米顆粒。適於在本發明中使用的佐劑包括脂質奈米顆粒（LNP）及其組分。
脂肽（即，包含一個或多個脂肪酸殘基和兩個或更多個胺基酸殘基的化合物）。適於在本發明中用作佐劑的脂肽包括Pam2（Pam2CSK4）和Pam3（Pam3CSK4）。
糖脂。適於在本發明中用作佐劑的糖脂包括索狀因子（海藻糖二黴菌酸酯）。
從革蘭氏陰性細菌或革蘭氏陽性細菌衍生（合成或純化）的肽和肽聚糖，諸如MDP（N-乙醯-胞壁醯-L-丙胺醯-D-異麩醯胺酸）適於在本發明中用作佐劑。
適於用作佐劑的碳水化合物（含碳水化合物）或多糖包括右旋糖酐（例如，支鏈微生物多糖）、硫酸右旋糖酐、香菇多糖、酵母聚糖、β-葡聚糖、deltin、甘露聚糖和幾丁質。
基於RNA的佐劑。適於在發明中使用的基於RNA的佐劑係聚IC、聚IC:LC、帶有或不帶5'三磷酸的髮夾RNA、病毒序列、含聚U的序列、dsRNA天然或合成RNA序列及核酸類似物（例如，環狀GMP-AMP或其他環狀二核苷酸（例如環狀二-GMP）、免疫刺激性鹼基類似物（例如C8-取代的和N7,C8-二取代的鳥嘌呤核糖核苷酸））。
基於DNA的佐劑。適於在本發明中使用的基於DNA的佐劑包括CpG、dsDNA和天然或合成的免疫刺激DNA序列。
蛋白質或肽。適於在本發明中用作佐劑的蛋白質和肽包括鞭毛蛋白融合蛋白、MBL（甘露糖結合凝集素）、細胞介素和趨化因子。
病毒顆粒。適於用作佐劑的病毒顆粒包括病毒體（磷脂細胞膜雙層）。
在本發明中使用的佐劑可以是細菌來源的，諸如鞭毛蛋白、LPS或細菌毒素（例如腸毒素（蛋白質），例如熱不穩定毒素或霍亂毒素）。在本發明中使用的佐劑可以是雜交分子，諸如軛合至咪喹莫特的CpG。在本發明中使用的佐劑可以是真菌或卵菌MAMP，諸如幾丁質或β-葡聚糖。在一些實施方式中，佐劑係無機奈米顆粒，諸如金奈米棒或基於二氧化矽的奈米顆粒（例如介孔二氧化矽奈米顆粒（MSN））。在一些實施方式中，佐劑係用糖脂免疫調節劑（海藻糖6,6-二山崳酸酯（TDB），這可以是位於分枝桿菌細胞壁上的索狀因子的合成變體）穩定的多組分佐劑或佐劑系統，諸如AS01、AS03、AS04（MLP5+明礬）、CFA（完全弗氏佐劑：IFA+肽聚糖或海藻糖二黴菌酸酯）、CAF01（陽離子脂質體媒介物的兩組分系統（二甲基雙十八烷基銨（DDA））。
細胞介素。佐劑可以是編碼細胞介素的部分或全長DNA，該細胞介素諸如促炎細胞介素（例如，GM-CSF、IL-1α、IL-1β、TGF-β、TNF-α、TNF-β）、Th-1誘導細胞介素（例如，IFN-γ、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18）或Th-2誘導細胞介素（例如，IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13）。
趨化因子。佐劑可以是編碼趨化因子的部分或全長DNA，趨化因子諸如MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、Rantes或TCA-3。
佐劑可以是編碼共刺激分子的部分或全長DNA，共刺激分子諸如CD80、CD86、CD40-L、CD70或CD27。
佐劑可以是編碼先天免疫前哨（部分、全長或突變）或組成型活性（ca）先天免疫前哨的部分或全長DNA，該等前哨諸如caTLR4、casting、caTLR3、caTLR3、caTLR9、caTLR7、caTLR8、caTLR7、caRIG-I/DDX58或caMDA-5/IFIH1。
佐劑可以是編碼適體或傳訊分子的部分或全長DNA，該適體或傳訊分子諸如STING、TRIF、TRAM、MyD88、IPS1、ASC、MAVS、MAPK、IKK-α、IKK複合物、TBK1、β-連環蛋白和半胱天冬酶1。
佐劑可以是編碼轉錄活化因子的部分或全長DNA，該轉錄活化因子諸如可以上調免疫反應的轉錄活化因子（例如，AP1、NF-κB、IRF3、IRF7、IRF1或IRF5）。佐劑可以是編碼細胞介素受體諸如IL-2β、IFN-γ或IL-6的部分或全長DNA。
佐劑可以是編碼細菌組分諸如鞭毛蛋白或MBL的部分或全長DNA。
佐劑可以是編碼先天免疫系統的任何組分的部分或全長DNA。
在一個特定實施方式中，本發明中使用的佐劑係SAB的專有佐劑配製物，SAB-adj-1或SAB-adj-2。
4. 疫苗
在本文所述之方法的一些實施方式中，還向受試者（例如，要免疫接種的受試者）投與第二藥劑，例如，還向受試者（例如，要免疫接種的受試者）投與第二疫苗。在一些實施方式中，投與給受試者的組成物包含本文所述之環狀多核糖核苷酸和第二疫苗。在一些實施方式中，疫苗和環狀多核糖核苷酸在分開的組成物中共同投與。該疫苗與環狀多核糖核苷酸免疫接種同時投與，在環狀多核糖核苷酸免疫接種之前或在環狀多核糖核苷酸免疫接種之後投與。
例如，在一些實施方式中，受試者（例如，要免疫接種的受試者）用非環狀多核糖核苷酸冠狀病毒疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）和包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物免疫接種。在一些實施方式中，受試者用第一微生物（例如，肺炎球菌）的非多核糖核苷酸疫苗和包含如本文所揭露的環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物免疫接種。疫苗可以是任何細菌感染疫苗或病毒感染疫苗。在一個特定實施方式中，疫苗係肺炎球菌多糖疫苗，諸如PCV13或PPSV23。在一些實施方式中，疫苗係流感疫苗。在一些實施方式中，疫苗係RSV疫苗（例如，帕利珠單抗）。
在一些實施方式中，投與給受試者的組成物包含本文所述之線性多核糖核苷酸和疫苗。在一些實施方式中，疫苗和線性多核糖核苷酸在分開的組成物中共同投與。該疫苗與線性多核糖核苷酸免疫接種同時投與，在線性多核糖核苷酸免疫接種之前或在線性多核糖核苷酸免疫接種之後投與。
例如，在一些實施方式中，受試者（例如，要免疫接種的受試者）用多核糖核苷酸（例如，非線性多核糖核苷酸）冠狀病毒疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）和包含如本文所揭露的包含編碼冠狀病毒抗原的序列的線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物免疫接種。在一些實施方式中，受試者用第一微生物（例如，肺炎球菌）的非多核糖核苷酸疫苗和包含如本文所揭露的包含編碼冠狀病毒抗原的序列的線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物免疫接種。疫苗可以是任何細菌感染疫苗或病毒感染疫苗。在一個特定實施方式中，疫苗係肺炎球菌多糖疫苗，諸如PCV13或PPSV23。在一些實施方式中，疫苗係流感疫苗。在一些實施方式中，疫苗係RSV疫苗（例如，帕利珠單抗）。
5. 要免疫接種的受試者
本揭露提供為受試者（例如，要免疫接種的受試者）投與或免疫接種包含含有編碼冠狀病毒抗原和/或表位的序列的環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物。本揭露提供為受試者（例如，要免疫接種的受試者）投與或免疫接種包含含有編碼冠狀病毒抗原和/或表位的序列的線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物。在一些實施方式中，受試者（例如，要免疫接種的受試者）係動物。在一個特定實施方式中，受試者（例如，要免疫接種的受試者）係哺乳動物。在某些實施方式中，受試者（例如，要免疫接種的受試者）係人。在一些實施方式中，受試者（例如，要免疫接種的受試者）係非人類動物。在一些實施方式中，非人類動物具有人源化免疫系統。受試者的血漿或血液用於生成超免疫血漿，例如具有高濃度的與目標冠狀病毒抗原和/或表位結合的抗體的血漿。
要免疫接種的非人類動物
本揭露提供為非人類動物（例如，要免疫接種的非人類動物）投與或免疫接種包含含有編碼冠狀病毒抗原和/或表位的序列的環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物。本揭露提供為非人類動物（例如，要免疫接種的非人類動物）投與或免疫接種包含含有編碼冠狀病毒抗原和/或表位的序列的線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物。
在一些實施方式中，非人類動物（例如，要免疫接種的非人類動物）係寵物。在一些實施方式中，非人類動物（例如，要免疫接種的非人類動物）係家畜動物。在一些實施方式中，非人類動物（例如，要免疫接種的非人類動物）係農場動物。在一些實施方式中，非人類動物（例如，要免疫接種的非人類動物）係動物園動物（例如，老虎、獅子、狼等）。
在一些實施方式中，非人類動物（例如，要免疫接種的非人類動物）係哺乳動物。非人類動物（例如，要免疫接種的非人類動物）包括有蹄類動物，例如驢、山羊、馬、牛或豬。非人類動物（例如，要免疫接種的非人類動物）還包括兔、大鼠或小鼠。在一些實施方式中，非人類動物（例如，要免疫接種的非人類動物）係牛（牛科）。在其他實施方式中，非人類動物係山羊。
在一些實施方式中，非人類動物（例如，要免疫接種的非人類動物）係雞。
在一些實施方式中，非人類動物（例如，要免疫接種的非人類動物）具有人源化免疫系統並用於產生人多株抗體。
人源化免疫系統
具有人源化免疫系統的非人類動物（例如，具有人源化免疫系統的要免疫接種的非人類動物）包括有蹄類動物，例如驢、山羊、馬、牛或豬。具有人源化免疫系統的非人類動物還包括兔、大鼠或小鼠。在一些實施方式中，具有人源化免疫系統的非人類動物係牛（牛科）。在一些實施方式中，具有人源化免疫系統的非人類動物係山羊。在一些實施方式中，具有人源化免疫系統的非人類動物係雞。
具有人源化免疫系統的非人類動物（例如，具有人源化免疫系統的要免疫接種的非人類動物）係產生人抗體或其抗體變體、片段和衍生物的動物。人源化免疫系統包含一個人源化免疫球蛋白基因座，或多個人源化免疫球蛋白基因座。
在一些實施方式中，人源化免疫球蛋白基因座包含人免疫球蛋白的種系序列，從而允許非人類動物產生人源化抗體（例如，全人抗體）。
在一些實施方式中，本揭露之具有人源化免疫系統的非人類動物包含具有人源化免疫球蛋白基因座的非人B細胞。人源化免疫球蛋白基因座在B細胞發育過程中經歷VDJ重組，從而允許生成具有多種抗原結合特異性的B細胞。
抗體的結合特異性藉由VDJ重組過程生成。編碼抗原結合部分（可變區）的外顯子藉由發育中的B細胞中的染色體斷裂和重新連接進行組裝。編碼抗原結合結構域的外顯子由所謂的V（可變）、D（多樣性）和J（連接）基因區段藉由「切割和黏貼」DNA重排組裝而成。稱為V(D)J重組的這一過程選擇一對區段，在每個區段附近引入雙鏈斷裂，刪除（或在選定的情況下，倒置）插入的DNA，並將該等區段連接在一起。重排可以有序的方式發生，進行D與J連接之後將V區段連接到重排的DJ區段。這種組合組裝過程—從幾種（有時係多種）可能性中選擇每種類型的一個區段係在哺乳動物中驅動抗原受體多樣性的基本引擎。不同區段之間連接處的特徵變異性（少量核苷酸的丟失或增加）極大地擴大了多樣性。該過程利用對生殖系編碼能力的相對較小的投資，將其轉化為幾乎無限的潛在抗原結合特異性。
在一些實施方式中，具有人源化免疫系統的非人類動物包含藉由例如人源化免疫球蛋白基因座的VDJ重組生成的具有不同特異性的多個B細胞。編碼與本揭露之抗原和/或表位特異性結合的B細胞受體（和抗體）的B細胞在遇到同源抗原時被激活，例如，在遇到從本揭露之環狀多核糖核苷酸表現的抗原和/或表位之後被激活。編碼與本揭露之抗原和/或表位特異性結合的B細胞受體（和抗體）的B細胞在遇到同源抗原時被激活，例如，在遇到從本揭露之線性多核糖核苷酸表現的抗原和/或表位之後被激活。活化的B細胞產生特異性結合本揭露之抗原和/或表位的抗體。活化的B細胞發生增殖。在一些實施方式中，活化的非人B細胞分化成記憶B細胞和/或漿細胞。在一些實施方式中，活化的非人B細胞經歷類別轉換以生成如本文所揭露的不同同種型的抗體。在一些實施方式中，非人B細胞經歷體細胞超突變以生成以更高親和力與抗原和/或表位結合的抗體。
在用包含表現多種抗原和/或表位的本揭露之一種或多種環狀多核糖核苷酸的一種或多種免疫原性組成物免疫接種後，多種B細胞殖株對其各自的同源抗原反應，導致生成具有多種結合特異性的多株抗體。在一些實施方式中，用包含本揭露之一種或多種環狀多核糖核苷酸的一種或多種免疫原性組成物為本揭露之非人類動物免疫接種激活至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少11種、至少12種、至少13種、至少14種、至少15種、至少20種、至少25種、至少30種、至少35種、至少40種、至少50種、至少60種、至少70種、至少80種、至少90種或至少100種非人B細胞殖株。在一些實施方式中，用包含本揭露之一種或多種環狀多核糖核苷酸的一種或多種免疫原性組成物為本揭露之非人類動物免疫接種導致多株抗血清的產生，該多株抗血清包含特異性結合至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少11種、至少12種、至少13種、至少14種、至少15種、至少20種、至少25種、至少30種、至少35種、至少40種、至少50種、至少60種、至少70種、至少80種、至少90種或至少100種本揭露之抗原和/或表位的抗體。
在用包含表現多種抗原和/或表位的本揭露之一種或多種線性多核糖核苷酸的一種或多種免疫原性組成物免疫接種後，多種B細胞殖株對其各自的同源抗原反應，導致生成具有多種結合特異性的多株抗體。在一些實施方式中，用包含本揭露之一種或多種線性多核糖核苷酸的一種或多種免疫原性組成物為本揭露之非人類動物免疫接種激活至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少11種、至少12種、至少13種、至少14種、至少15種、至少20種、至少25種、至少30種、至少35種、至少40種、至少50種、至少60種、至少70種、至少80種、至少90種或至少100種非人B細胞殖株。在一些實施方式中，用包含本揭露之一種或多種線性多核糖核苷酸的一種或多種免疫原性組成物為本揭露之非人類動物免疫接種導致多株抗血清的產生，該多株抗血清包含特異性結合至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少11種、至少12種、至少13種、至少14種、至少15種、至少20種、至少25種、至少30種、至少35種、至少40種、至少50種、至少60種、至少70種、至少80種、至少90種或至少100種本揭露之抗原和/或表位的抗體。
可以採用各種用於修飾非人類動物（例如，要免疫接種的非人類動物）的基因組的技術來開發能夠產生人源化抗體的動物。非人類動物可以是轉基因動物，例如，包含一個或多個人源化免疫球蛋白基因座的全部或大部分的轉基因動物。非人類動物可以是轉染色體動物，例如包含人類人工染色體或酵母人工染色體的非人類動物。
人源化免疫球蛋白基因座可以存在於載體上，例如人類人工染色體或酵母人工染色體（YAC）。可以將包含人源化免疫球蛋白基因座的人類人工染色體（HAC）引入動物中。載體（例如，HAC）可以含有人抗體重鏈基因（來自人14號染色體）和人抗體輕鏈基因（例如κ輕鏈基因（來自人2號染色體）和λ輕鏈基因（來自人22號染色體）中的一者或兩者）的種系庫。HAC可以轉移到非人類動物物種的細胞中，並且可以藉由體細胞核轉移產生轉基因動物。還可以培育轉基因動物以產生包含人源化免疫球蛋白基因座的非人類動物。
在一些實施方式中，將人源化免疫球蛋白基因座整合到非人類動物的基因組中。例如，可以採用包括同源重組或同源定向修復的技術來修飾動物基因組以引入人類核苷酸序列。可以使用諸如CRISPR/Cas、TALEN和鋅指核酸酶等工具以靶向整合。
已經揭露了生成具有人源化免疫系統的非人類動物（例如，具有人源化免疫系統的要免疫接種的非人類動物）之方法。例如，可以生成人類人工染色體並將其轉移到包含其他目標基因組修飾（例如，內源性非人類免疫系統基因的缺失）的細胞中，並且該細胞可以用作核供體以生成轉基因非人類動物。
在一些實施方式中，人源化免疫系統包含一條或多條人抗體重鏈，其中編碼抗體重鏈的每個基因均與類別轉換調控元件可操作地連接。可操作地連接可以意指第一DNA分子（例如，重鏈基因）與第二DNA分子（例如，類別轉換調控元件）連接，其中第一和第二DNA分子排列成使得第一DNA分子影響第二DNA分子的功能。這兩種DNA分子可能是或者可能不是單個連續DNA分子的一部分，並且可能相鄰或者可能不相鄰。例如，如果啟動子能夠影響可轉錄DNA分子的轉錄或翻譯，則啟動子與可轉錄DNA分子可操作地連接。
在一些實施方式中，人源化免疫系統包含一條或多條人抗體輕鏈。在一些實施方式中，人源化免疫系統包含一條或多條人抗體替代輕鏈。
在一些實施方式中，人源化免疫系統包含源自非人類動物的胺基酸序列，例如恒定區，諸如重鏈恒定區或其一部分。在一些實施方式中，人源化免疫系統包含來自非人類動物的IgM重鏈恒定區（例如，有蹄類動物來源的IgM重鏈恒定區）。在一些實施方式中，將編碼該一條或多條人抗體重鏈的基因的至少一種類別轉換調控元件置換為非人（例如，有蹄類動物來源的）類別轉換調控元件，例如，以在非人類動物體內產生針對本揭露之抗原和/或表位的抗體時允許抗體類別轉換。
人源化免疫球蛋白基因座可以包含為了與非人類動物相容而併入的非人類元件。在一些實施方式中，非人類元件可以存在於人源化免疫球蛋白基因座中以減少被非人類動物免疫系統的任何其餘元件的識別。在一些實施方式中，免疫球蛋白基因（例如，IgM）可以部分置換為來自非人類動物的胺基酸序列。在一些實施方式中，非人調控元件存在於人源化免疫球蛋白基因座中以利於該基因座在非人類動物體內的表現和調節。
人源化免疫球蛋白基因座可以包含人DNA序列。可以對人源化免疫球蛋白基因座進行密碼子優化以利於所包含的基因（例如，抗體基因）在非人類動物中的表現。
具有人源化免疫系統的非人類動物（例如，具有人源化免疫系統的要免疫接種的非人類動物）可以包含或可缺少內源性非人免疫系統組分。在一些實施方式中，具有人源化免疫系統的非人類動物可缺少非人抗體（例如，缺少產生非人抗體的能力）。具有人源化免疫系統的非人類動物可缺少例如一種或多種非人免疫球蛋白重鏈基因、一種或多種非人免疫球蛋白輕鏈基因或其組合。
具有人源化免疫系統的非人類動物（例如，具有人源化免疫系統的要免疫接種的非人類動物）可以保留例如非人免疫細胞。具有人源化免疫系統的非人類動物可以保留非人類先天免疫系統組分（例如，細胞、補體、抗菌肽等）。在一些實施方式中，具有人源化免疫系統的非人類動物可以留保非人T細胞。在一些實施方式中，具有人源化免疫系統的非人類動物可以保留非人B細胞。在一些實施方式中，具有人源化免疫系統的非人類動物可以保留非人抗原呈遞細胞。在一些實施方式中，具有人源化免疫系統的非人類動物可以保留非人抗體。
在一些實施方式中，人源化免疫系統包含人先天免疫蛋白，例如補體蛋白。
在一些實施方式中，人源化免疫系統包含人源化T細胞和/或抗原呈遞細胞。
在一些實施方式中，本揭露之組成物和方法包含T細胞。例如，本揭露之環狀多核糖核苷酸可以包含被B細胞和T細胞識別的抗原，並且在非人類動物用人源化免疫系統免疫接種後，T細胞可以提供T細胞幫助，從而增加非人類動物體內抗體的產生。在另一個實例中，本揭露之線性多核糖核苷酸可以包含被B細胞和T細胞識別的抗原，並且在非人類動物用人源化免疫系統免疫接種後，T細胞可以提供T細胞幫助，從而增加非人類動物體內抗體的產生。
在一些實施方式中，具有人源化免疫系統的非人類動物（例如，具有人源化免疫系統的要免疫接種的非人類動物）包含如US20170233459中揭露的任何特徵或特徵的任何組合或任何製備方法，該專利特此藉由援引以其全文併入。在一些實施方式中，具有人源化免疫系統的非人類動物（例如，具有人源化免疫系統的要免疫接種的非人類動物）包含如以下揭露的任何特徵或特徵的任何組合或任何製備方法：Kuroiwa, Y等人，Nat Biotechnol [自然生物技術], 2009年2月; 27(2):173-81；Matsushita, H.等人PLos ONE [公共科學圖書館：綜合], 2014年3月6日; 9(3): e90383; Hooper, J.W.等人Sci Transl Med [科學轉化醫學], 2014年11月26日; 6(264): 264ra162; Matsushit, H.等人, PLoS ONE [公共科學圖書館：綜合] 2015年6月24日; 10(6): e0130699; Luke, T.等人Sci Transl Med [科學轉化醫學], 2016年2月17日; 8(326): 326ra21; Dye, J.等人, Sci Rep. [科學報告] 2016年4月25日;6:24897; Gardner, C.等人J Virol. [病毒學雜誌]2017年6月26日；91(14); Stein, D.等人, Antiviral Res [抗病毒研究] 2017年10月; 146:164-173；Silver, J.N., Clin Infect Dis. [臨床傳染病]2018年3月19日；66(7):1116-1119；Beigel, J.H.等人, Lancet Infect Dis [柳葉刀傳染病], 2018年4月; 18；(4):410-418；Luke, T.等人, J Inf Dis. [傳染病雜誌]2018年11月33日；218(增刊_5): S636-S648，其各自特此藉由援引以其全文併入。
B. 血漿收集
可以從用環狀多核糖核苷酸免疫接種的受試者（例如，在要免疫接種的受試者免疫接種後）收集包含由免疫原性組成物產生的多株抗體的血漿，該免疫原性組成物包含編碼冠狀病毒抗原和/或表位的環狀多核糖核苷酸，冠狀病毒抗原和/或表位由如本文所揭露的環狀多核糖核苷酸表現。該等多株抗體可用於預防或治療與由環狀多核糖核苷酸表現的抗原和/或表位相關的冠狀病毒。可以從用線性多核糖核苷酸免疫接種的受試者（例如，在要免疫接種的受試者免疫接種後）收集包含由免疫原性組成物產生的多株抗體的血漿，該免疫原性組成物包含編碼冠狀病毒抗原和/或表位的線性多核糖核苷酸，冠狀病毒抗原和/或表位從如本文所揭露的線性多核糖核苷酸表現。該等多株抗體可用於預防或治療與由線性多核糖核苷酸表現的抗原和/或表位相關的冠狀病毒。血漿可以經由血漿去除術收集。可以從同一受試者（例如，在要免疫接種的受試者免疫接種後）收集血漿一次或多次，例如，在免疫接種後的給定時間段內各自多次、免疫接種後多次、免疫接種之間多次，或其任何組合。
可以在免疫接種（例如第一次免疫接種、最近一次免疫接種或中間免疫接種）後任何適當的時間，從受試者（例如，在要免疫接種的受試者免疫接種後）收集血漿。可以在免疫接種後至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少15天、至少20天、至少21天、至少22天、至少23天、至少24天、至少25天、至少26天、至少27天、至少28天、至少29天或至少30天或更多天從受試者收集血漿。在一些實施方式中，在免疫接種後至多2天、至多3天、至多4天、至多5天、至多6天、至多7天、至多8天、至多9天、至多10天、至多15天、至多20天、至多21天、至多22天、至多23天、至多24天、至多25天、至多26天、至多27天、至多28天、至多29天、至多30天、至多35天、至多42天、至多49天或至多56從受試者收集血漿。在一些實施方式中，在免疫接種後約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、16、17、18、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41或42天或更長時間從受試者收集血漿。在一些實施方式中，組成物包含在投與本文所述之免疫原性組成物後收集的血漿。
血漿可以冷凍（例如，冷凍儲存或運輸）。在一些實施方式中，將血漿保持新鮮，或從新鮮血漿中純化抗體。
在一些實施方式中，組成物包含收集的血漿。例如，組成物包含來自受試者的血漿和含有編碼抗原的序列的環狀多核糖核苷酸。在一些實施方式中，組成物包含來自受試者的血漿和含有編碼抗原的序列的環狀多核糖核苷酸，以及抗原。在一個實例中，組成物包含來自受試者的血漿和含有編碼抗原的序列的線性多核糖核苷酸。在一些實施方式中，組成物包含來自受試者的血漿和含有編碼抗原的序列的線性多核糖核苷酸，以及抗原。
C. 多株抗體純化
本揭露提供了對本發明的冠狀病毒抗原和/或表位具有特異性的多株抗體，以及藉由向受試者投與有效量的多株抗體（例如，受試者治療）來治療或預防冠狀病毒相關疾病或感染之方法。多株抗體如本文所揭露的那樣產生並在從用包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物免疫接種的受試者（例如，要免疫接種的受試者）收集血漿後純化。多株抗體如本文所揭露的那樣產生並在從用包含線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物免疫接種的受試者（例如，要免疫接種的受試者）收集血漿後純化。
使用熟悉該項技術者熟知的技術從血漿中純化多株抗體。例如，將血漿pH調節至4.8（例如，滴加20%乙酸），以1.0的辛酸/總蛋白比率用辛酸進行分級分離，然後離心澄清（例如，在室溫下10,000g離心20 min）。將含有多株抗體（例如，IgG多株抗體）的上清液用1 M tris中和至pH 7.5，0.22 μm過濾，並用抗人免疫球蛋白特異性柱（例如，抗人IgG輕鏈特異性柱）進行親和力純化。多株抗體藉由特異性結合雜質（例如來自非人類動物的非人抗體）的親和柱進一步純化。將多株抗體儲存在合適的緩衝液，例如由10 mM麩胺酸單鈉鹽、262 mM D-山梨糖醇和吐溫（Tween）（0.05 mg/ml）（pH 5.5）組成的無菌過濾緩衝液中。測定純化的多株抗體的量和濃度。進行HPLC尺寸排阻層析法以確定是否存在聚集物或多聚體。
在一些實施方式中，人多株抗體從具有人源化免疫系統的非人類動物根據Beigel, JH等人（Lancet Infect. Dis. [柳葉刀傳染病], 18:410-418 (2018)，包括補充附錄）而純化，該文獻藉由援引以其全文併入本文。簡言之，使用層析法純化來自具有人源化免疫系統的非人類動物的人源化IgG多株抗體。作為捕獲步驟使用人IgGκ鏈特異性親和柱（例如，來自通用電氣醫療集團（GE Healthcare）的KappaSelect），將全人IgG與非人類動物IgG分開。人IgGκ鏈特異性親和柱特異性結合全人IgG，對非人類動物IgG Fc和IgG的交叉反應最小。使用與非人類動物IgG特異性結合的IgG Fc特異性親和柱（例如，對於牛科而言，係來自通用電氣醫療集團的Capto HC15）去除另外的非人類動物IgG，其用作負親和步驟以特異性清除非人類動物IgG。也可以使用陰離子交換層析步驟進一步減少污染物，諸如宿主DNA、內毒素、IgG聚集物和浸出的親和配位基。
1. 多株抗體
如所揭露那樣產生的多株抗體與冠狀病毒抗原和/或表位（例如，SARS-CoV-2抗原和/或表位）結合。該等多株抗體用於治療或預防冠狀病毒相關疾病或感染（例如，COVID-19或SARS-CoV-2感染）之方法中，例如，該等抗體可以提供針對表現該等抗原和/或表位或類似抗原和/或表位的冠狀病毒的保護。
本揭露之多株抗體與例如至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少15種、至少20種、至少25種、至少30種、至少40種、至少50種、至少60種、至少70種、至少80種、至少90種、至少100種、至少120種、至少140種、至少160種、至少180種、至少200種、至少250種、至少300種、至少350種、至少400種、至少450種、至少500種或更多種冠狀病毒抗原或表位結合。
在一些實施方式中，本揭露之多株抗體與例如至多5種、至多6種、至多7種、至多8種、至多9種、至多10種、至多15種、至多20種、至多25種、至多30種、至多40種、至多50種、至多60種、至多70種、至多80種、至多90種、至多100種、至多120種、至多140種、至多160種、至多180種、至多200種、至多250種、至多300種、至多350種、至多400種、至多450種、至多500種或更少的冠狀病毒抗原或表位結合。
在一些實施方式中，本揭露之多株抗體與例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450或500種冠狀病毒抗原或表位結合。
本揭露之多株抗體與來自冠狀病毒抗原的一個或多個表位結合。例如，冠狀病毒抗原包含胺基酸序列，其中含有多個表位（例如，被B細胞和/或T細胞識別的表位），並且抗體殖株與那些表位中的一個或多個結合。
在一些實施方式中，本揭露之多株抗體與來自一種冠狀病毒抗原的例如至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個、至少100個、至少120個、至少140個、至少160個、至少180個、至少200個、至少250個、至少300個、至少350個、至少400個、至少450個、至少500個或更多個表位結合。
在一些實施方式中，本揭露之多株抗體與來自一種冠狀病毒抗原的例如至多2個、至多3個、至多4個、至多5個、至多6個、至多7個、至多8個、至多9個、至多10個、至多15個、至多20個、至多25個、至多30個、至多40個、至多50個、至多60個、至多70個、至多80個、至多90個、至多100個、至多120個、至多140個、至多160個、至多180個、至多200個、至多250個、至多300個、至多350個、至多400個、至多450個、或至多500個或更少的表位結合。
在一些實施方式中，本揭露之多株抗體與來自一種冠狀病毒抗原的例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450或500個表位結合。
本揭露之多株抗體與冠狀病毒抗原或表位的變體結合。變體可以是天然存在的變體（例如，在來自不同的冠狀病毒種、分離株或凖種的序列數據中鑒定的變體），或者可以是如本文所揭露的已經經由電腦模擬生成的衍生序列（例如，與野生型抗原或表位相比具有一個或多個胺基酸插入、缺失、取代或其組合的抗原或表位）。
在一些實施方式中，本揭露之多株抗體與一種冠狀病毒抗原或表位的例如至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少15種、至少20種、至少25種、至少30種、至少40種、至少50種、至少60種、至少70種、至少80種、至少90種、至少100種、至少120種、至少140種、至少160種、至少180種、至少200種、至少250種、至少300種、至少350種、至少400種、至少450種、至少500種或更多種變體結合。
在一些實施方式中，本揭露之多株抗體與一種冠狀病毒抗原或表位的例如至多2種、至多3種、至多4種、至多5種、至多6種、至多7種、至多8種、至多9種、至多10種、至多15種、至多20種、至多25種、至多30種、至多40種、至多50種、至多60種、至多70種、至多80種、至多90種、至多100種、至多120種、至多140種、至多160種、至多180種、至多200種、至多250種、至多300種、至多350種、至多400種、至多450種、至多500種、或更少的變體結合。
在一些實施方式中，本揭露之多株抗體與一種冠狀病毒抗原或表位的例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450或500種變體結合。
在一個特定實施方式中，本揭露之抗體係中和抗體、非中和抗體或其組合。
人源化抗體或其變體、片段和衍生物可以是可以配製用於投與給人的抗體。人源化抗體可以是嵌合人源化抗體或全人抗體。
人源化抗體可以是嵌合人源化抗體，例如，包含來自人抗體胺基酸序列或與人抗體胺基酸序列具有相似性的胺基酸序列和非人胺基酸序列。例如，嵌合人源化抗體的重鏈和/或輕鏈的一部分可以與人抗體中的相應序列相同或相似，而該一條或多條鏈的其餘部分可以是非人的，例如與源自另一物種或屬於另一抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或相似。可以將非人序列人源化以降低免疫原性的可能性，同時保留靶標特異性，例如，藉由將人DNA併入在非人類動物中產生抗體的基因的基因序列中。
人源化抗體可以是全人抗體，例如，含有作為人抗體胺基酸序列的胺基酸序列。
在一些實施方式中，具有人源化免疫系統的非人類動物僅產生全人抗體。
本揭露之抗體可以是包含基本四鏈抗體單元的抗體。基本四鏈抗體單元可以包含兩個重鏈（H）多肽序列和兩個輕鏈（L）多肽序列。每條重鏈可以包含一個N端可變（VH ）區和三個或四個C端恒定區（CH 1、CH 2、CH 3和CH 4）區。每條輕鏈可以包含一個N端可變（VL ）區和一個C端恒定（CL ）區。輕鏈可變區與重鏈可變區對齊，且輕鏈恒定區與第一重鏈恒定區CH1 對齊。重鏈可變區和輕鏈可變區配對一起形成單個抗原結合位點。每條輕鏈藉由一個共價二硫鍵與重鏈連接。根據重鏈同種型，兩條重鏈藉由一個或多個二硫鍵相互連接。每條重鏈和輕鏈還可以包含規律間隔的鏈內二硫橋。重鏈的C端恒定區包含抗體的Fc區，它可以例如藉由與Fc受體或補體蛋白的相互作用介導效應子功能。
基於恒定區的胺基酸序列，輕鏈可以命名為κ或λ。基於恒定區的胺基酸序列，重鏈可以命名為α、δ、ε、γ或μ。抗體基於重鏈分為五種免疫球蛋白類別或同種型。IgA包含α重鏈，IgD包含δ重鏈，IgE包含ε重鏈，IgG包含γ重鏈，並且IgM包含μ重鏈。IgG、IgD和IgE類的抗體包含上述四鏈單元的單體（兩條重鏈和兩條輕鏈），而IgM和IgA類可以包含四鏈單元的多聚體。基於重鏈恒定區序列和功能的差異，α和γ類進一步分為亞類。人類表現的IgA和IgG亞類包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
表 4 中提供了人恒定結構域序列的說明性胺基酸序列。在一些實施方式中，本揭露之抗體、非人類動物或非人B細胞包含人IgG1恒定結構域序列，例如，包含SEQ ID NO: 34 或其變體、衍生物或片段。在一些實施方式中，本揭露之抗體、非人類動物或非人B細胞包含人IgG2恒定結構域序列，例如，包含SEQ ID NO: 35 或其變體、衍生物或片段。在一些實施方式中，本揭露之抗體、非人類動物或非人B細胞包含人IgG3恒定結構域序列，例如，包含SEQ ID NO: 36 或其變體、衍生物或片段。在一些實施方式中，本揭露之抗體、非人類動物或非人B細胞包含人IgG4恒定結構域序列，例如，包含SEQ ID NO: 37 或其變體、衍生物或片段。在一些實施方式中，本揭露之抗體、非人類動物或非人B細胞包含人IgE恒定結構域序列，例如，包含SEQ ID NO: 38 或其變體、衍生物或片段。在一些實施方式中，本揭露之抗體、非人類動物或非人B細胞包含人IgA1恒定結構域序列，例如，包含SEQ ID NO: 39 或其變體、衍生物或片段。在一些實施方式中，本揭露之抗體、非人類動物或非人B細胞包含人IgA2恒定結構域序列，例如，包含SEQ ID NO: 40 或其變體、衍生物或片段。在一些實施方式中，本揭露之抗體、非人類動物或非人B細胞包含人IgM恒定結構域序列，例如，包含SEQ ID NO: 41 或其變體、衍生物或片段。在一些實施方式中，本揭露之抗體、非人類動物或非人B細胞包含人IgD恒定結構域序列，例如，包含SEQ ID NO: 42 或其變體、衍生物或片段。
[ 表 4]: 人恒定結構域序列的說明性胺基酸序列。
表 4
SEQ ID NO: 名稱 胺基酸序列
34 IgG1恒定結構域 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
35 IgG2恒定結構域 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
36 IgG3恒定結構域 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK
37 IgG4恒定結構域 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
38 IgE恒定結構域 ASTQSPSVFPLTRCCKNIPSNATSVTLGCLATGYFPEPVMVTWDTGSLNGTTMTLPATTLTLSGHYATISLLTVSGAWAKQMFTCRVAHTPSSTDWVDNKTFSVCSRDFTPPTVKILQSSCDGGGHFPPTIQLLCLVSGYTPGTINITWLEDGQVMDVDLSTASTTQEGELASTQSELTLSQKHWLSDRTYTCQVTYQGHTFEDSTKKCADSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTSGPRAAPEVYAFATPEWPGSRDKRTLACLIQNFMPEDISVQWLHNEVQLPDARHSTTQPRKTKGSGFFVFSRLEVTRAEWEQKDEFICRAVHEAASPSQTVQRAVSVNPGK
39 IgA1恒定結構域 ASPTSPKVFPLSLCSTQPDGNVVIACLVQGFFPQEPLSVTWSESGQGVTARNFPPSQDASGDLYTTSSQLTLPATQCLAGKSVTCHVKHYTNPSQDVTVPCPVPSTPPTPSPSTPPTPSPSCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGVTFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAAYPESKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY
40 IgGA2恒定結構域 ASPTSPKVFPLSLDSTPQDGNVVVACLVQGFFPQEPLSVTWSESGQNVTARNFPPSQDASGDLYTTSSQLTLPATQCPDGKSVTCHVKHYTNSSQDVTVPCRVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTANITKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTYAVTSILRVAAEDWKKGETFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRMAGKPTHINVSVVMAEADGTCY
41 IgM恒定結構域 GSASAPTLFPLVSCENSPSDTSSVAVGCLAQDFLPDSITFSWKYKNNSDISSTRGFPSVLRGGKYAATSQVLLPSKDVMQGTDEHVVCKVQHPNGNKEKNVPLPVIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY
42 IgD恒定結構域 APTKAPDVFPIISGCRHPKDNSPVVLACLITGYHPTSVTVTWYMGTQSQPQRTFPEIQRRDSYYMTSSQLSTPLQQWRQGEYKCVVQHTASKSKKEIFRWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPRSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDHGPMK
本揭露之抗體可以包含人輕鏈恒定結構域序列，例如κ（IgK）或λ（IgL）鏈。在一些實施方式中，本揭露之抗體、非人類動物或非人B細胞包含人IgK恒定結構域序列，例如，包含SEQ ID NO: 43 或其變體、衍生物或片段。在一些實施方式中，本揭露之抗體、非人類動物或非人B細胞包含人IgL恒定結構域序列，例如，包含SEQ ID NO: 44 或其變體、衍生物或片段。
[ 表 5] 提供了示例輕鏈恒定結構域序列。
表 5
SEQ ID NO: 名稱 胺基酸序列
43 IgK恒定結構域 TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
44 IgL恒定結構域 GQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
訊息肽可導致細胞更高的蛋白質表現和/或分泌。在一些實施方式中，本揭露之抗體包含訊息肽。訊息肽酶可以從蛋白質上裂解訊息肽，例如，在分泌過程中，生成不包含訊息肽序列的成熟蛋白質。在一些實施方式中，訊息肽從本揭露之化合物或抗體上裂解下來。在一些實施方式中，本揭露之成熟化合物或抗體不包含訊息肽。
恒定區可以介導各種效應子功能，並且可以最低限度地參與抗原結合。不同的IgG同種型或亞類可以與不同的效應子功能或治療特徵相關，例如，這係因為與不同的Fc受體和/或補體蛋白的相互作用。包含接合活化Fc受體的Fc區的抗體可參與抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）、抗體依賴性細胞吞噬作用（ADCP）、補體依賴性細胞毒性（CDC）、藉由基於免疫受體酪胺酸的活化模體（ITAM）進行的傳訊的誘導和細胞介素分泌的誘導。例如，包含接合抑制性Fc受體的Fc區的抗體可以藉由基於免疫受體酪胺酸的抑制模體（ITIM）誘導傳訊。
不同的抗體亞類包含不同的引發免疫效應子功能的能力。例如，IgG1和IgG3可以有效地募集補體以激活CDC，IgG2引發最小的ADCC。IgG4具有較低的觸發免疫效應子功能的能力。對恒定區的修飾也可以影響抗體特徵，例如，Fc受體連接的增強或減少、ADCC的增強或減少、ADCP的增強或減少、CDC的增強或減少、藉由ITAM進行的傳訊的增強或減少、細胞介素誘導的增強或減少、藉由ITIM進行的傳訊的增強或減少、半衰期的增強或減少、或抗原與Fc受體的共同接合的增強或減少。修飾可以包括例如胺基酸突變、改變翻譯後修飾（例如糖基化）、組合來自不同同種型或亞類的結構域、或其組合。
本揭露之抗體可以包含經選擇或修飾以提供合適的抗體特徵，例如用於治療如本文所揭露的疾病或病狀的合適特徵的恒定區或Fc區。在一些實施方式中，IgG1可用於例如促進炎症、免疫活化和免疫效應子功能以治療感染。在一些實施方式中，例如，在需要具有降低的免疫效應子功能的抗體的拮抗特性（例如，為了中和冠狀病毒抗原並抑制病毒進入細胞而不促進炎症和免疫激活）的情況下，可以使用IgG4。
[ 表 6] 中提供了抗體修飾及其作用的非限制性實例。
表 6
效果 同種型 突變 / 修飾
增強的ADCC IgG1 F243L / R292P / Y300L / V305I / P396L
增強的ADCC IgG1 S239D / I332E
增強的ADCC IgG1 S239D / I332E / A330L
增強的ADCC IgG1 S298A / E333A / K334A
增強的ADCC IgG1 在一條重鏈中： L234Y / L235Q / G236W / S239M / H268D / D270E / S298A 在相反的重鏈中： D270E / K326D / A330M / K334E
增強的ADCP IgG1 G236A / S239D / I332E
增強的CDC IgG1 K326W / E333S
增強的CDC IgG1 S267E / H268F / S324T
增強的CDC IgG1、IgG3 來自IgG1/IgG3的結構域的組合
增強的CDC IgG1 E345R / E430G / S440Y
缺少糖基化、效應子功能降低 IgG1 N297A或N297Q或N297G
效應子功能降低 IgG1、IgG4 L235E
效應子功能降低 IgG1 L234A / L235A
效應子功能降低 IgG4 F234A / L235A
效應子功能降低 IgG4 F234A / L235A / G237A / P238S
效應子功能降低 IgG4 F234A / L235A / ΔG236 / G237A / P238S
效應子功能降低 IgG2、IgG4 來自IgG2/IgG4的結構域的組合
效應子功能降低 IgG2 H268Q / V309L / A330S / P331S
效應子功能降低 IgG2 V234A / G237A / P238S / H268A / V309L / A330S / P331S
效應子功能降低 IgG1 L234A / L235A / G237A / P238S / H268A / A330S / P331S
半衰期增加 IgG1 M252Y / S254T / T256E
半衰期增加 IgG1 M428L / N434S
抗原/Fc受體共同接合增加 IgG1 S267E / L328F
抗原/Fc受體共同接合改變 IgG1 N325S / L328F
Fab臂交換減少 IgG4 S228P
可變（V）區可以介導抗原結合並限定特定抗體對抗原的特異性。可變區包括稱為框架區的相對不變的序列和高變區，高變區在不同結合特異性的抗體之間在序列上差異很大。每條抗體重鏈或輕鏈的可變區包含由三個高變區隔開的四個框架區。重鏈和輕鏈的可變區以使高變區緊密靠近在一起的方式折疊以產生抗原結合位點。四個框架區主要呈f3-折疊構型，而三個高變區形成環，該等環連接f3-折疊結構，而在一些情況下形成f3-折疊結構的一部分。
在高變區內的是主要決定抗體結合特異性的胺基酸殘基。包含該等殘基的序列稱為互補決定區（CDR）。抗體的一個抗原結合位點可以包含六個CDR，三個位於輕鏈的高變區，三個位於重鏈的高變區。輕鏈中的CDR可以稱為LCDR1、LCDR2、LCDR3，而重鏈中的CDR可以稱為HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在一些實施方式中，本揭露之抗體包括其變體、衍生物和抗原結合片段。例如，可以對非人類動物進行遺傳修飾以產生抗體變體、衍生物及其抗原結合片段。在一些實施方式中，抗體可以是單結構域抗體（sdAb），例如，僅重鏈的抗體（HCAb）VHH，或奈米抗體。抗原結合片段的非限制性實例包括Fab、Fab'、F(ab')2 、Fab軛合物的二聚體和三聚體、Fv、scFv、微型抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體和四鏈抗體，以及線性抗體。Fab和Fab’係可以包含經由二硫鍵連接到輕鏈VL 和CL 結構域的重鏈VH 和CH 1結構域的抗原結合片段。F(ab’)2 可以包含兩個藉由二硫鍵連接的Fab或Fab’。Fv可以包含藉由非共價相互作用保持在一起的VH 和VL 結構域。scFv（單鏈可變片段）係可以包含藉由肽連接子連接的VH 和VL 結構域的融合蛋白。對VH 和VL 結構域的方向以及連接子長度的操縱可用於產生不同形式的分子，該等分子可以是單體、二聚體（雙鏈抗體）、三聚體（三鏈抗體）或四聚體（四鏈抗體）。微型抗體係組裝成二價二聚體的scFv-CH 3融合蛋白。
在一些實施方式中，本揭露之抗體係藉由將如本文所揭露的免疫原性組成物投與給非人類動物或人類受試者（例如，要免疫接種的非人類動物或人類受試者）產生的抗冠狀病毒抗體。在一些實施方式中，本揭露之多種抗體係藉由用如本文所揭露的免疫原性組成物為非人類動物或人受試者（例如，要免疫接種的非人類動物或人受試者）免疫接種而產生的多種抗冠狀病毒多株抗體。在一些實施方式中，該抗冠狀病毒抗體或該多種抗冠狀病毒多株抗體進一步包含藥學上可接受的載劑或賦形劑。在一些實施方式中，非人類動物（例如，要免疫接種的非人類動物受試者）係具有人源化免疫系統的非人類動物。
藥物組成物
在一些實施方式中，投與給受試者（例如，要免疫接種的受試者）的免疫原性組成物係藥物組成物。本發明所考慮的藥物組成物還可以包括藥學上可接受的賦形劑。
本揭露還提供了藥物組成物，該等藥物組成物包含本文揭露的多種針對冠狀病毒的多株抗體或多株抗體製劑以及藥學上可接受的賦形劑。
藥學上可接受的賦形劑可以是非載劑賦形劑。非載劑賦形劑用作組成物（諸如，如本文所述之環狀多核糖核苷酸）的媒介物或介質。非載劑賦形劑用作組成物（諸如，如本文所述之線性多核糖核苷酸）的媒介物或介質。非載劑賦形劑的非限制性實例包括溶劑、水性溶劑、非水溶劑、分散介質、稀釋劑、分散劑、助懸劑、表面活性劑、等滲劑、增稠劑、乳化劑、防腐劑、聚合物、肽、蛋白質、細胞、透明質酸酶、分散劑、製粒劑、崩散劑、黏合劑、緩衝劑（例如，磷酸鹽緩衝鹽水（PBS））、潤滑劑、油及其混合物。非載劑賦形劑可以是經美國食品和藥物管理局（FDA）批准並列在非活性成分數據庫中的不表現出細胞穿透作用的任一種非活性成分。藥物組成物可視需要包含一種或多種另外的活性物質，例如治療和/或預防活性物質。本發明的藥物組成物可以是無菌的和/或無熱原的。可以在以下中找到藥學製劑的配製和/或生產中的一般考慮：例如，Remington: The Science and Practice of Pharmacy [雷明頓：藥學科學與實踐]第21版, Lippincott Williams & Wilkins, 2005（藉由引用併入本文）。
本揭露之藥物組成物可以包含本揭露之多株抗體、本揭露之環狀多核糖核苷酸或其組合。本揭露之藥物組成物可以包含本揭露之多株抗體、本揭露之線性多核糖核苷酸或其組合。本揭露之藥物組成物可以包含本揭露之多株抗體、本揭露之環狀多核糖核苷酸、本揭露之線性多核糖核苷酸或其組合。
在一些實施方式中，本文提供的藥物組成物適合投與給人類。在一些實施方式中，本文提供的藥物組成物（例如，包含環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸，或如本文所述之免疫原性組成物）適合投與給受試者（例如，要免疫接種的受試者），其中該受試者係人。在一些實施方式中，本文提供的藥物組成物（例如，包含多種多株抗體或如本文所述之多株抗體製劑）適合投與給受試者（例如，要免疫接種的受試者），其中該受試者係人。
在一些實施方式中，本文提供的藥物組成物（例如，包含環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸，或如本文所述之免疫原性組成物）適合投與給受試者（例如，要免疫接種的受試者），其中該受試者係非人類動物，例如適合獸用。為了使組成物適合於投與給各種動物而對適合於投與給人類的藥物組成物的修飾係眾所周知的，並且普通獸醫藥理師可以僅藉由普通的實驗（如果有的話）來設計和/或進行這種修飾。預期投與藥物組成物的受試者包括但不限於任何動物，諸如人和/或其他靈長類；哺乳動物，包括與商業有關的哺乳動物，例如寵物和牲畜動物，諸如牛、豬、馬、綿羊、貓、狗、小鼠和/或大鼠；和/或鳥類，包括與商業有關的鳥類，諸如鸚鵡、家禽、雞、鴨、鵝、母雞或公雞和/或火雞；動物園動物，例如貓科動物；非哺乳類動物，例如爬行動物、魚類、兩棲動物等。
在一些實施方式中，本文提供的藥物組成物（例如，包含多種多株抗體或如本文所述之多株抗體製劑）適合投與給受試者（例如，要免疫接種的受試者），其中該受試者係非人類動物，例如，適合於獸用。為了使組成物適合於投與給各種動物而對適合於投與給人類的藥物組成物的修飾係眾所周知的，並且普通獸醫藥理師可以僅藉由普通的實驗（如果有的話）來設計和/或進行這種修飾。預期投與藥物組成物的受試者包括但不限於任何動物，諸如人和/或其他靈長類；哺乳動物，包括與商業有關的哺乳動物，例如寵物和牲畜動物，諸如牛、豬、馬、綿羊、貓、狗、小鼠和/或大鼠；和/或鳥類，包括與商業有關的鳥類，諸如鸚鵡、家禽、雞、鴨、鵝、母雞或公雞和/或火雞；動物園動物，例如貓科動物；非哺乳類動物，例如爬行動物、魚類、兩棲動物等。
考慮投與藥物組成物的受試者（例如，要免疫接種的受試者或要治療的受試者）包括任何有蹄類動物。
本文描述的藥物組成物的製劑可以藉由藥理學領域中已知的或以後開發的任何方法來製備。通常，這樣的製備方法包括以下步驟：使活性成分與賦形劑和/或一種或多種其他輔助成分結合，然後，如果必要和/或期望的話，將產品分開、成形和/或包裝。
藥物組成物在製造和儲存條件下可以是無菌和穩定的。該組成物可以配製成溶液、微乳液、脂質體或其他適合高藥物濃度的有序結構。可以用於本發明的藥物組成物中的合適的水性和非水性組成物的實例包括水、乙醇、多元醇（諸如丙三醇、丙二醇、聚乙二醇等），及其合適的混合物、植物油（諸如橄欖油）以及可注射有機酯，諸如油酸乙酯。可以例如藉由使用諸如卵磷脂的包衣材料、在分散液的情況下藉由維持所要求的粒度、以及藉由使用表面活性劑來維持適當流動性。
無菌注射溶液可藉由將所需量的活性化合物（例如，藥劑，諸如環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸或抗體）摻入例如以上枚舉的成分中的一種或組合（根據需要）的適當溶劑中，接著進行滅菌微過濾來製備。通常，藉由將活性化合物摻入無菌媒介物中來製備分散體，該無菌媒介物含有基礎分散介質以及來自以上枚舉的那些的所需其他成分。在用於製備無菌注射液的無菌粉末的情況下，較佳的製備方法係真空乾燥和冷凍乾燥（凍乾）產生活性成分加上來自於先前無菌過濾溶液中的任何其他所需成分的粉末。
本揭露之藥劑（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸或抗體）可以製備成將會避免它們快速釋放的組成物，諸如控釋平日食品，包括植入物、透皮貼劑和微囊化遞送系統。可以使用生物可降解、生物相容的聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。用於製備此類配製物之方法通常為熟悉該項技術者已知。參見，例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems [緩釋和控釋藥物遞送系統], J.R. Robinson編輯, 紐約馬塞爾·德克公司（Marcel Dekker, Inc., New York）, 1978。本揭露之組成物可以是例如立即釋放形式或控釋配製物。可以配製立即釋放配製物以允許化合物（例如，藥劑，諸如環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸或抗體）迅速起作用。立即釋放配製物的非限制性實例包括易溶解的配製物。控釋配製物可以是下述藥物配製物，其經過調整使得活性劑的釋放速率和釋放曲線可以與生理和時間治療要求相匹配，或者，已經配製為以程式化速率實現活性劑的釋放。控釋配製物的非限制性實例包括顆粒劑、延遲釋放顆粒劑、水凝膠（例如，合成或天然來源的）、其他膠凝劑（例如，形成凝膠的膳食纖維）、基於基質的配製物（例如，包含有至少一種活性成分分散於其中的聚合物材料的配製物）、基質內的顆粒劑、聚合物混合物和顆粒團。
用於投與的藥物配製物可以包括水溶性形式的活性化合物（例如，藥劑，諸如環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸或抗體）的水溶液。活性化合物的懸浮液可以製備成油性注射懸浮液。合適的親脂性溶劑或媒介物包括脂肪油（諸如芝麻油）或合成脂肪酸酯（諸如油酸乙酯或三酸甘油酯）或脂質體。水性注射懸浮液可含有增加懸浮液黏度的物質，諸如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或葡聚糖。懸浮液也可含有合適的穩定劑或增加藥劑溶解度以允許製備高濃縮的溶液的試劑。活性成分可以呈粉末形式，用於在使用前用合適的媒介物（例如滅菌無熱原水）復原。
製備包含本文所述藥劑的組成物之方法包括將藥劑與一種或多種惰性的、藥學上可接受的賦形劑或載劑配製以形成固體、半固體或液體組成物。固體組成物包括例如粉末、可分散顆粒劑和扁囊劑。液體組成物包括例如藥劑溶解在其中的溶液、包含藥劑的乳液、或含有包含如本文所揭露的藥劑的脂質體、膠束或奈米顆粒的溶液。半固體組成物包括例如凝膠、懸浮液和乳膏。組成物可以是液體溶液或懸浮液、適合在使用前溶解或懸浮在液體中的固體形式，或作為乳液形式。該等組成物還可以含有少量無毒的輔助物質，諸如潤濕劑或乳化劑、pH緩衝劑和其他藥學上可接受的添加劑。
適合用於本揭露之劑型的非限制性實例包括液體、粉末、凝膠、奈米混懸劑、奈米顆粒、微凝膠、水性或油性混懸劑、乳液及其任何組合。
在一些實施方式中，本揭露之配製物含有熱穩定劑，諸如糖或糖醇，例如蔗糖、山梨糖醇、丙三醇、海藻糖或甘露糖醇，或其任何組合。在一些實施方式中，穩定劑係糖。在一些實施方式中，糖係蔗糖、甘露醇或海藻糖。
如本文所述之藥物組成物可配製為例如包括藥物賦形劑或載劑。藥物載劑可以是膜、脂質雙層和/或聚合物載劑，例如脂質體或顆粒（諸如奈米顆粒，例如脂質奈米顆粒），並藉由已知方法，諸如經由部分或完全包封環狀多核糖核苷酸，遞送至有此需要的受試者（例如，要免疫接種的受試者或要治療的受試者）（例如人或非人農業動物或家畜，例如牛、狗、貓、馬、家禽）。
A. 遞送方法
如本文所述之環狀多核糖核苷酸或如本文所述之其藥物組成物可以在如本文所述之囊泡或其他基於膜的載劑中投與給細胞。如本文所述之線性多核糖核苷酸或如本文所述之其藥物組成物可以在如本文所述之囊泡或其他基於膜的載劑中投與給細胞。
在一些實施方式中，細胞係真核細胞。在一些實施方式中，細胞係哺乳動物細胞。在一些實施方式中，細胞係有蹄動物細胞。在一些實施方式中，細胞係動物細胞。在一些實施方式中，細胞係免疫細胞。在一些實施方式中，組織係結締組織、肌肉組織、神經組織或上皮組織。在一些實施方式中，組織係器官（例如，肝、肺、脾、腎等）。在一些實施方式中，受試者（例如，要免疫接種的受試者）係哺乳動物。在一些實施方式中，受試者（例如，要免疫接種的受試者）係有蹄類動物。
在一些實施方式中，本文揭露的藥物配製物可以包含：(i) 本文揭露的化合物（例如，環狀多核糖核苷酸或抗體）；(ii) 緩衝劑；(iii) 非離子型洗滌劑；(iv) 張度劑；和 (v) 穩定劑。在一些實施方式中，本文揭露的藥物配製物可以包含：(i) 本文揭露的化合物（例如，線性多核糖核苷酸或抗體）；(ii) 緩衝劑；(iii) 非離子型洗滌劑；(iv) 張度劑；和 (v) 穩定劑。在一些實施方式中，本文揭露的藥物配製物係穩定的液體藥物配製物。
治療方法
本揭露提供可用作治療或預防劑的組成物和方法，例如包含可用於避免受試者（例如，要免疫接種的受試者或要治療的受試者）受冠狀病毒感染影響的抗體的組成物和方法。例如，可以將本揭露之環狀多核糖核苷酸投與給受試者（例如，要免疫接種的受試者）以刺激與預期冠狀病毒抗原/和或表位結合的抗體（例如，人多株抗體）的產生。可以將本揭露之線性多核糖核苷酸投與給受試者（例如，要免疫接種的受試者）以刺激與預期冠狀病毒抗原/和或表位結合的抗體（例如，人多株抗體）的產生。可以從受試者獲得抗體（例如，在要免疫接種的受試者免疫接種之後）並配製用於投與給受試者（例如，要治療的受試者，例如要治療的人類受試者），例如作為治療或預防劑。抗體可以提供針對例如表現抗原和/或表位的冠狀病毒的保護。在另一個實例中，可以將環狀多核糖核苷酸投與給人類受試者（例如，要免疫接種的受試者）以刺激人類受試者中與預期抗原/和或表位結合的抗體的產生。在另一個實例中，可以將線性多核糖核苷酸投與給人類受試者（例如，要免疫接種的受試者）以刺激人類受試者中與預期抗原/和或表位結合的抗體的產生。在一些實施方式中，本揭露提供了用於治療或預防冠狀病毒感染的組成物。
可以藉由本揭露之組成物和方法治療的病狀和疾病的非限制性實例包括由本文揭露的冠狀病毒引起的或與之相關的那些，例如冠狀病毒感染。在一些實施方式中，病狀由SARS-CoV引起或與之相關。在一些實施方式中，病狀由SARS-CoV-2引起或與之相關。在一些實施方式中，病狀係2019冠狀病毒疾病（COVID-19）。在一些實施方式中，病狀由MERS-CoV引起或與之相關。
在一些實施方式中，藉由用本揭露之環狀多核糖核苷酸為非人類動物或人類受試者（例如，要免疫接種的非人類動物或人類受試者）免疫接種產生多株抗體，從非人類動物或人類受試者（例如，在要免疫接種的非人類動物或人類受試者免疫接種後）收集血漿，並且從血漿中純化出多株抗體。在一些實施方式中，藉由用本揭露之線性多核糖核苷酸為非人類動物或人類受試者（例如，要免疫接種的非人類動物或人類受試者）免疫接種產生多株抗體，從非人類動物或人類受試者（例如，在要免疫接種的非人類動物或人類受試者免疫接種後）收集血漿，並且從血漿中純化出多株抗體。視需要，從一種以上的非人類動物或人類受試者純化的多株抗體（例如，在要免疫接種的一種以上非人類動物或人類受試者免疫接種後）、從同一非人類動物或人類受試者純化的多份多株抗體樣本（例如，在要免疫接種的非人類動物或人類受試者免疫接種後）或其組合，合併在一起並投與給有此需要的受試者（例如，要治療的受試者），例如有此需要的人類受試者（例如，要治療的人類受試者）。在一些實施方式中，將多株抗體配製成多株抗體製劑，例如針對冠狀病毒的多株抗體製劑。一種產生針對冠狀病毒的人多株抗體製劑之方法，該方法包括 (a) 向能夠產生抗體的動物（例如，要免疫接種的動物）投與包含含有編碼冠狀病毒抗原的序列的多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸或線性多核糖核苷酸）的免疫原性組成物，(b) 從哺乳動物中收集血液或血漿，(c) 從血液或血漿中純化針對冠狀病毒的多株抗體，並且 (d) 將多株抗體配製為供人類使用（例如，投與給要治療的人類受試者）的治療或藥物製劑或供非人類動物使用（例如，投與給要治療的非人類動物受試者）的獸醫製劑。
在一些實施方式中，該方法進一步包括監測具有冠狀病毒感染的受試者（例如，要治療的受試者）、處於暴露於冠狀病毒感染的風險中的受試者（例如，要治療的受試者）或有此需要的受試者例如，要治療的受試者）是否存在冠狀病毒抗原的多株抗體。在一些實施方式中，該監測係在投與該等多株抗體之前和/或投與該等多株抗體之後。
在實踐本文提供的治療或使用方法時，將治療有效量的本文所述之化合物（例如藥劑，諸如環狀多核糖核苷酸或抗體）以藥物組成物的形式投與給患有有待治療的疾病或病狀或需要預防的受試者（例如，要免疫接種的受試者或要治療的受試者）。在實踐本文提供的治療或使用方法時，將治療有效量的本文所述之化合物（例如藥劑，諸如線性多核糖核苷酸或抗體）以藥物組成物的形式投與給患有有待治療的疾病或病狀或需要預防的受試者（例如，要免疫接種的受試者或要治療的受試者）。在一些實施方式中，受試者（例如，要免疫接種的受試者或要治療的受試者）係哺乳動物，諸如人。治療有效量可根據疾病的嚴重程度、受試者（例如，要免疫接種的受試者或要治療的受試者）的年齡和相對健康狀況、所用化合物的效力、給定冠狀病毒的特徵以及其他因素而廣泛變化。
A. 投與方法和途徑
本文揭露的組成物（例如，藥物組成物）可以藉由各種形式和途徑（包括例如口服或局部投與）以治療有效量投與。在一些實施方式中，組成物可以藉由以下方式投與：腸胃外、靜脈內、皮下、肌肉內、皮內、腹膜內、腦內、蛛網膜下、眼內、胸骨內、眼、內皮、局部、鼻內、肺內、直腸、動脈內、鞘內、吸入、病灶內、皮內、硬膜外、囊內、囊下、心內、經氣管、皮下、蛛網膜下或椎管內投與（例如注射或輸注）。在一些實施方式中，組成物可以通過上皮或皮膚黏膜襯裡吸收來投與（例如，口腔黏膜、直腸和腸黏膜投與）。在一些實施方式中，組成物經由多種投與途徑遞送。
在一些實施方式中，組成物藉由靜脈輸注投與。在一些實施方式中，組成物藉由長時間（諸如超過24小時）緩慢連續輸注來投與。在一些實施方式中，組成物作為靜脈注射或短時間輸注投與。
藥物組成物可以以局部方式投與，例如，經由將藥劑直接注射到器官中，視需要以貯庫或持續釋放配製物或植入物的形式投與。藥物組成物可以以快速釋放配製物的形式，以緩釋配製物的形式或以中間釋放配製物的形式提供。快速釋放形式可以提供立即釋放。緩釋配製物可以提供控釋或延遲緩釋。在一些實施方式中，泵可用於遞送藥物組成物。在一些實施方式中，筆式遞送裝置可用於例如皮下遞送本揭露之組成物。
本文提供的藥物組成物可以與其他療法聯合投與，例如抗病毒療法、抗生素、細胞療法、細胞介素療法或抗炎劑。在一些實施方式中，本文所述之環狀多核糖核苷酸或抗體可單獨使用或與一種或多種治療劑組合作為混合物的組分使用。在一些實施方式中，本文所述之線性多核糖核苷酸或抗體可單獨使用或與一種或多種治療劑組合作為混合物的組分使用。
B. 劑量和頻率
可以在疾病或病狀發生之前、期間或之後投與本文所述之治療劑，並且投與含有治療劑的組成物的時間可以變化。在一些情況下，組成物可用作預防劑並且可連續投與給具有冠狀病毒易感性或對冠狀病毒相關的病狀或疾病有傾向的受試者（例如，要免疫接種的受試者或要治療的受試者）。預防性投與可減小感染、疾病或病狀發生的可能性，或者可降低感染、疾病或病狀的嚴重程度。
組成物可以在症狀發作之後（例如，之後儘快）投與給受試者（例如，要免疫接種的受試者或要治療的受試者）。可以在測試結果之後（例如，之後儘快）將組成物投與給受試者（例如，要免疫接種的受試者或要治療的受試者），該測試結果例如提供診斷的測試結果，顯示受試者（例如，要免疫接種的受試者或要治療的受試者）中存在冠狀病毒的測試，或顯示病狀進展（例如血氧水平降低）的測試。可以在檢測或懷疑的疾病或病狀的發作之後（例如，之後切實可行地儘快）投與治療劑。治療劑可以在潛在暴露於冠狀病毒之後（例如，之後切實可行地儘快）投與，例如在受試者（例如，要免疫接種的受試者或要治療的受試者）與受感染的受試者接觸之後，或得知他們接觸過可能具有傳染性的受感染的受試者之後。
本文所述之環狀多核糖核苷酸、抗體或治療劑以任何期望的間隔投與。本文所述之線性多核糖核苷酸、抗體或治療劑以任何期望的間隔投與。
本揭露之藥劑（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸、抗體或治療劑）的實際劑量水平可以變化以便獲得一定量的藥劑以對特定受試者、組成物和投與模式實現期望的治療反應，而對受試者（例如，要免疫接種的受試者或要治療的受試者）沒有毒性。選擇的劑量水平可取決於多種藥物動力學因素，包括所採用的本發明的特定組成物的活性，投與途徑，投與時間，排泄速率，治療持續時間，其他藥物，與所採用的特定組成物組合使用的化合物和/或材料，受治療的患者的年齡、性別、體重、病狀、總體健康狀況和既往病史，以及醫學領域眾所周知的類似因素。
可以調整劑量方案以提供最佳的期望反應（例如，治療和/或預防反應）。例如，如治療情境的緊急情況所示，可以投與單次推注，可以隨時間推移投與幾個分劑量或按比例減少或增加劑量。尤其有利的是以劑量單位形式配製腸胃外組成物以易於投與和實現劑量均一性。如本文所用的劑量單位形式係指適合作為受試者（例如，要免疫接種的受試者或要治療的受試者）的單位劑量的物理離散單位；每個單位含有經計算會產生所需治療作用的預定量的活性劑以及所需的藥物載劑。本揭露之劑量單位形式的規格可由以下方面決定並且直接依賴於以下方面：(a) 活性劑的獨特特徵和待實現的特定療效，以及 (b) 本領域中配製此類活性劑用於治療個體敏感性的固有局限性。劑量可以藉由參考環狀多核糖核苷酸或抗體的血漿濃度或局部濃度來確定。劑量可以藉由輔助線性多核糖核苷酸或抗體的血漿濃度或局部濃度來確定。
本文所述之藥物組成物可以是適合單次投與精確劑量的單位劑型。在單位劑型中，配製物可以分成含有適量的一種或多種環狀多核糖核苷酸、抗體和/或治療劑的單位劑量。在單位劑型中，配製物可以分成含有適量的一種或多種線性多核糖核苷酸、抗體和/或治療劑的單位劑量。單位劑量可以是包含離散量的配製物的包裝形式。非限制性實例係包裝的注射劑、小瓶和安瓿。本文揭露的水性懸浮液組成物可以包裝在單劑量的不可重新封閉的容器中。可以將多劑量的可重新封閉的容器例如與防腐劑一起使用或不與防腐劑一起使用。本文揭露的注射用配製物能以單位劑型存在，例如在安瓿中或在具有防腐劑的多劑量容器中。
劑量可以基於每千克受試者（例如，要免疫接種的受試者或要治療的受試者）體重對應的藥劑的量。藥劑（例如，抗體）的劑量在10-3000 mg/kg，例如100-2000 mg/kg，例如300-500 mg/kg/天的範圍內，持續1-10天或1-5天；例如，400 mg/kg/天，持續3-6天；例如，1 g/kg/天，持續2-3天。
C. 受試者
提供了一種組成物，用於治療或預防本文揭露的病狀，諸如冠狀病毒感染。該組成物可以投與給具有冠狀病毒感染或相關疾病或病狀的受試者（例如，要免疫接種的受試者或要治療的受試者）。該組成物可以作為預防劑投與給具有冠狀病毒感染傾向或相關病裝或疾病易感性的受試者（例如，要免疫接種的受試者或要治療的受試者）以便減小感染、疾病或病狀的可能性，或降低感染、疾病或病狀的嚴重程度。
受試者（例如，要免疫接種的受試者或要治療的受試者）可以是感染了冠狀病毒的受試者。受試者（例如，要免疫接種的受試者或要治療的受試者）可以是冠狀病毒測試呈陽性的受試者。受試者（例如，要免疫接種的受試者或要治療的受試者）可以是已經暴露於冠狀病毒的受試者。受試者（例如，要免疫接種的受試者或要治療的受試者）可以是可能已經暴露於冠狀病毒的受試者。受試者（例如，要免疫接種的受試者或要治療的受試者）可以是表現出與冠狀病毒感染一致的一種或多種體征和/或症狀的受試者。
在一些實施方式中，受試者（例如，要免疫接種的受試者或要治療的受試者）係處於與本揭露之冠狀病毒接觸的高風險中的受試者。例如，受試者（例如，要免疫接種的受試者或要治療的受試者）可能是衛生保健工作者、實驗室工作人員或更可能接觸本揭露之冠狀病毒（例如，SARS-CoV2）的現場急救員。受試者（例如，要免疫接種的受試者或要治療的受試者）可以在醫療保健機構工作，例如，醫院、診療室、住院機構、門診機構、緊急護理機構、養老院、老年護理機構或療養院。
在一些實施方式中，受試者（例如，要免疫接種的受試者或要治療的受試者）係如果感染了本揭露之冠狀病毒則處於併發症的高風險中的受試者。例如，受試者（例如，要免疫接種的受試者或要治療的受試者）可患有共病，年齡超過50歲，患有1型糖尿病、2型糖尿病、胰島素抵抗，或其組合。在一些實施方式中，受試者係免疫受損的受試者。在一些實施方式中，受試者（例如，要免疫接種的受試者或要治療的受試者）正在服用免疫抑制藥物。在一些實施方式中，受試者（例如，要免疫接種的受試者或要治療的受試者）係正在服用免疫抑制藥物的移植受者。在一些實施方式中，受試者（例如，要免疫接種的受試者或要治療的受試者）正在接受可能降低免疫系統功能的癌症療法，例如化學療法。
受試者（例如，要免疫接種的受試者或要治療的受試者）可以是哺乳動物。受試者（例如，要免疫接種的受試者或要治療的受試者）可以是人。受試者（例如，要免疫接種的受試者或要治療的受試者）可以是非人類動物。非人類動物可以是農業動物，例如牛、豬、綿羊、馬或山羊；寵物，例如貓或狗；或動物園動物，例如貓科動物。
實例
將以下實施方式包括在內僅僅是為了說明的目的，並非旨限制本發明的範圍。
實例 1 ：環狀 RNA 構建體
該實例描述了新型SARS-CoV-2開放閱讀框（ORF）和circRNA構建體的設計。
在該實例中，SARS-CoV-2 ORF和編碼SARS-CoV-2 ORF的環狀RNA構建體的設計如表2所述。
實例 2 ：編碼 SARS-CoV-2 抗原的環狀 RNA 的體外產生
該實例展示了環狀RNA的體外產生。
將環狀RNA設計成包括一個IRES、一個編碼經修飾的SARS-CoV-2刺突抗原或RBD抗原的ORF（如實例 1 中所述）和兩個位於IRES-ORF側翼的間隔區元件。環化能夠實現滾環翻譯，具有交替交錯元件以用於離散的ORF表現和受控的蛋白質化學計量的多個ORF，以及靶向RNA以用於核糖體進入的IRES。圖1中示出了包含編碼冠狀病毒抗原的序列的環狀多核糖核苷酸的示例圖。
在該實例中，環狀RNA如下生成。使用T7 RNA聚合酶藉由體外轉錄從DNA區段合成未修飾的線性RNA。轉錄的RNA用RNA純化系統（新英格蘭生物學實驗室公司）純化，按照製造商的說明用RNA 5'磷酸水解酶（RppH）（新英格蘭生物學實驗室公司，M0356）處理，並再次用RNA純化系統純化。使用夾板DNA將RppH處理的線性RNA環化。替代性地或除了用5'RppH處理之外，使RNA在GMP超過GTP的條件下轉錄。
夾板連接如下進行：藉由使用T4 DNA連接酶1（新英格蘭生物學實驗室公司，M0437M）處理轉錄的線性RNA和DNA夾板（5’-GTTTTTCGGCTATTCCCAATAGCCGTTTTG-3’）（SEQ ID NO: 47）來生成環狀RNA。為了純化環狀RNA，在4%變性PAGE上解析連接混合物，並切除對應於環狀RNA中的每一個的RNA。碾碎切除的RNA凝膠片段，並用凝膠洗脫緩衝劑（0.5 M乙酸鈉、0.1% SDS、1 mM EDTA）在37°C下洗脫RNA一小時。收穫洗脫的緩衝劑，並藉由向碾碎的凝膠中添加凝膠洗脫緩衝劑再次洗脫RNA，並孵育一小時。藉由離心過濾器去除凝膠碎片並用乙醇沈澱RNA。使用瓊脂糖凝膠電泳作為驗證純度和環化的品質控制測量。
實例 3 ： mRNA 構建體
該實例描述了編碼SARS-CoV-2 ORF的新型mRNA構建體的設計。
在本實例中，如表3所述設計編碼SARS-CoV-2 ORF的線性RNA構建體。
實例 4 ：編碼 SARS-CoV-2 抗原的 mRNA 的體外產生
該實例展示了mRNA的體外產生。
在該實例中，如實例 3 所述，設計的mRNA具有編碼經修飾的SARS-CoV-2刺突抗原或RBD的ORF。
在該實例中，經修飾的mRNA係藉由體外轉錄製備的。將RNA用偽尿苷和5-甲基-C完全取代，用CleanCap™ AG加帽，包括5'和3'人α-珠蛋白UTR，並且聚腺苷酸化。mRNA經尿素-PAGE純化，在緩衝液（0.5 M醋酸鈉、0.1% SDS、1 mM EDTA）中洗脫，乙醇沈澱並重懸於RNA儲存溶液（賽默飛世爾科技（ThermoFisher Scientific），目錄號AM7000）中。使用瓊脂糖凝膠電泳作為驗證純度和環化的品質控制測量。
實例 5 ：哺乳動物細胞中來自環狀 RNA 的分泌型 SARS-CoV-2 抗原的表現
該實例證明了在哺乳動物細胞中從環狀RNA表現病毒抗原的能力。
在該實例中，如實例 1 中所述設計編碼SARS-CoV-2 RBD抗原的環狀RNA並且如實例 2 中所述產生和純化。
藉由免疫沈澱聯合蛋白質印跡法（IP-Western）測試編碼RBD的環狀RNA的表現。簡言之，使用Lipofectamine MessengerMax（賽默飛世爾公司，LMRNA015），將編碼RBD的環狀RNA（0.1皮莫耳）轉染到BJ成纖維細胞和HeLa細胞（96孔板中每孔10,000個細胞）中。使用單獨的MessengerMax作為對照。在24小時時收集上清液，並使用對與蛋白G-戴諾磁珠（Protein G-Dynabeads）（英傑公司，10003D）偶聯的SARS-CoV-2 RBD-刺突糖蛋白（義翹神州生物技術有限公司，目錄號：40592-T62）具有特異性的兔抗體進行免疫沈澱並使用相同抗體檢測藉由PAGE解析的免疫沈澱產物。使用重組RBD（42ng）免疫沈澱作為對照並定量細胞蛋白的表現。使用Image Studio™ Lite蛋白質印跡定量軟體（Li-COR生物科學公司）對膜化學發光進行定量。
在BJ成纖維細胞和HeLa細胞上清液中檢測到由環狀RNA編碼的RBD抗原，而在對照中則未檢測到（圖 3 ）。
該實例表明，SAR-CoV-2 RBD抗原（係分泌型蛋白）在哺乳動物細胞中由環狀RNA表現。
實例 6 ： 哺乳動物細胞中來自 RNA 的非分泌型 SARS-CoV-2 抗原的表現
在該實例中，如實例 1 和實例 3 中所述設計編碼SARS-CoV-2刺突抗原的環狀RNA或mRNA並且如實例 2 和實例 4 中所述產生和純化。將環狀RNA和mRNA配製在MessengerMax中，並根據製造商的說明將0.1皮莫耳的環狀RNA轉染到HEK293細胞（每孔10 000個細胞）中。
在24、48和72小時使用SARS-CoV-2刺突抗原特異性ELISA測量刺突抗原表現。為了測量表現，在適當的時間點在每個孔中使用裂解緩衝液和蛋白酶抑制劑裂解細胞。回收細胞裂解液，並以12,000 rpm離心10分鐘。收集上清液。在該實例中，根據製造商的說明使用SARS-CoV-2 2019刺突抗原檢測夾心ELISA套組（kit）（SARS-CoV-2（2019-nCoV）刺突檢測ELISA套組，義翹神州生物技術有限公司（Sino Biological），KIT40591）。
實例 7 ：用於向非人類動物投與的 RNA 的配製
在該實例中，如實例 1 和實例 3 中所述設計編碼SARS-CoV-2 RBD抗原的環狀RNA或mRNA並且如實例 2 和實例 4 中所述產生和純化。
純化後，如下配製環狀RNA或mRNA： A. 將環狀RNA或mRNA在PBS中稀釋到50 μL中為2.5皮莫耳或25皮莫耳的最終濃度，以獲得環狀RNA製劑或線性RNA製劑（未配製）。
B. 根據製造商的說明（15% TransIT、5% Boost），用脂質載劑（例如TransIT（米盧斯生物公司（Mirus Bio）））和mRNA加強試劑（米盧斯生物公司）配製環狀RNA或mRNA，以獲得50 μL中2.5皮莫耳或25皮莫耳的最終RNA濃度，以獲得環狀RNA製劑或線性RNA製劑。
C. 將環狀RNA或mRNA用陽離子聚合物（例如，魚精蛋白）配製。簡言之，將環狀RNA或mRNA在純淨水中稀釋。將硫酸魚精蛋白溶解在林格氏乳酸溶液（4000 ng/μL）中。在攪拌的同時，將魚精蛋白-林格乳酸溶液添加到一半環狀RNA或mRNA溶液中，直到RNA:魚精蛋白的重量比為2:1。將該溶液再攪拌10分鐘以確保形成穩定的複合物。然後添加剩餘的環狀RNA或mRNA（即，將剩餘的環狀RNA添加到環狀RNA溶液中，將剩餘的mRNA添加到mRNA溶液中），並短暫攪拌該溶液。使用林格氏乳酸溶液調節混合物（即，環狀RNA混合物或mRNA混合物）的最終濃度，以獲得最終RNA濃度為每50 μL中2.5皮莫耳或25皮莫耳的環狀RNA製劑或線性RNA製劑。
D. 用脂質奈米顆粒配製環狀RNA或mRNA。簡言之，將環狀RNA或mRNA在pH=4的25 mM乙酸鹽緩衝液中稀釋（通過0.2 μm過濾器過濾）到0.2 μg/μL的濃度。首先藉由將可電離的脂質（例如ALC0315）、膽固醇、DSPC和DMG-PEG2000以50/38.5/10/1.5 mol%的莫耳比溶解在乙醇中（通過0.2 μm無菌過濾器過濾）來配製脂質奈米顆粒（LNP）。最終可電離的脂質/RNA重量比為8/1 w/w。使用微流體系統將脂質和RNA溶液在微混合器晶片中混合，流量比為3/1緩衝液/乙醇且總流量為1 ml/min。然後將LNP在pH=7.4的PBS中透析3小時以去除乙醇。使用Ribogreen測定法測量LNP內部的RNA濃度和包封效率。如有必要，可使用截止值為100 kDa的Amicon離心過濾器將LNP濃縮至所需的RNA濃度。使用Zetasizer Ultra（瑪律文帕納科（Malvern Pananaytical））測量顆粒的大小、濃度和電荷。用PBS將RNA濃度調節至0.1或0.2 μg/μl的最終濃度。對於含有兩種RNA序列的配製物，在LNP中配製之前或在單獨配製每種RNA之後將RNA混合。對於體內實驗，通過無菌的0.2 μm再生纖維素過濾器過濾LNP中配製的最終RNA。
實例 8 ：將 RNA 投與給非人類動物
在該實例中，小鼠經由後腿單次肌肉注射或背部單次皮內注射接受各50 μL環狀RNA製劑或線性RNA製劑的注射。
實例 9 ：檢測血液中的分泌型抗原
藉由顴骨下抽吸從每隻小鼠收集血樣（~25 μL）進行分析。在環狀RNA給藥後0小時、6小時、24小時、48小時和7天，將血液收集到EDTA試管中。藉由在4°C下以1300 g離心30分鐘來分離血漿。使用ELISA或蛋白質印跡評估分泌型抗原的表現，例如對於RBD抗原而言，使用如實例 5 中所述之方法。
實例 10 ：對針對抗原的抗體的檢測
該實例描述了如何確定針對抗原的抗體的存在。
如Chen X等人所述使用ELISA（medRxiv , doi: doi.org/10.1101/2020.04.06.20055475 (2020)）。簡言之，將每孔100 μL PBS中的SARS-CoV-2蛋白於4°C包被在ELISA板上過夜。然後用封閉緩衝液（5% FBS加上0.05%吐溫20）將ELISA板封閉1小時。然後在1小時內將10倍稀釋的血漿添加到每個孔的100 μL封閉緩衝液中。用含Tween® 洗滌劑的1X磷酸鹽緩衝液（PBST）洗滌後，將結合的抗體與抗小鼠IgG HRP檢測抗體（英傑公司）一起孵育30分鐘，接著用PBST洗滌，然後用PBS洗滌，並添加四甲基苯。使ELISA板反應5分鐘，然後使用1 M HCl終止緩衝液淬滅。在450 nm下測定光密度（OD）值。
A. 對於針對 SARS-CoV-2 RBD 抗原的抗體 ，所用的SARS-CoV-2蛋白質係SARS-CoV-2 RBD（義翹神州生物技術有限公司，40592-V08B）。
B. 對於針對 SARS-CoV-2 刺突抗原的抗體 ，所用的SARS-CoV-2蛋白質係SARS-CoV-2刺突蛋白（義翹神州生物技術有限公司，40591-V08H）。
實例 11 ： SARS-CoV-2 的中和抗體的評價
使用SARS-CoV-2病毒中和測定法測試針對SARS-CoV-2感染的抗體的中和能力。Okba NMA等人描述了此類測定法的實例（Emerg Infect Dis. [新發傳染病], doi: 10.3201/eid2607.200841 (2020)）。該測定法檢測功能性抑制病毒感染的抗體的產生，這藉由病毒斑塊數目的減少得以證明。在Gauger PC和Vincent AL（在Animal Influenza Virus: Methods and Protocols [動物流感病毒：方法和方案], 第3版，E. Spackman編輯，第311-320頁(2014)）和Wilson HL等人（J. Clin. Microbiol. [臨床微生物學雜誌], 55(10):3104-3112 (2017)）中描述了這種測定法的輕微變型。簡言之，SARS-CoV-2病毒中和測定法確定小鼠響應於用編碼SARS-CoV-2抗原的環狀RNA進行免疫接種而產生含有抗SARS-CoV-2抗體的血漿的中和能力。來自僅注射媒介物（無環狀RNA）的原初小鼠的血漿用作對照。
實例 12 ： SARS-CoV-2 RBD 抗原在小鼠模型中的免疫原性
在小鼠模型中評價了用陽離子聚合物（例如，魚精蛋白）配製的編碼SARS-CoV-2 RBD抗原的環狀RNA的免疫原性。在小鼠模型中還評價了用陽離子聚合物配製的針對SARS-CoV-2 RBD抗原的抗體的產生。
在該實例中，將環狀RNA設計成具有IRES和如實例 2 所述之編碼SARS-CoV-2 RBD抗原的ORF。以過量的5’單磷酸鳥苷，使用T7 RNA聚合酶藉由體外轉錄從DNA區段合成未修飾的線性RNA。按照製造商的說明，用RNA純化系統（新英格蘭生物學實驗室公司）純化轉錄的RNA。使用夾板DNA將純化的線性RNA環化。
藉由分裂連接生成環狀RNA，如下：將轉錄的線性RNA和DNA夾板（5’-GTTTTTCGGCTATTCCCAATAGCCGTTTTG-3’）混合並退火，並用RNA連接酶處理。為了純化環狀RNA，藉由反相層析法解析連接混合物。藉由增加流動相的有機物含量，從線性RNA中選擇性洗脫環狀RNA。分級收集洗脫的RNA，並測定其環狀RNA的純度。合併選擇的級分並交換緩衝液以去除流動相鹽和溶劑。使用丙烯醯胺凝膠電泳作為驗證純度和環化的品質控制測量。
將純化的環狀RNA在純淨水中稀釋至1100 ng/μL的濃度。將硫酸魚精蛋白溶解在林格氏乳酸溶液（4000 ng/μL）中。在攪拌的同時，將魚精蛋白-林格乳酸溶液添加到一半環狀RNA溶液中，直到RNA:魚精蛋白的重量比為2:1。將該溶液再攪拌10分鐘以確保形成穩定的複合物。然後添加剩餘的環狀RNA（即，將剩餘的環狀RNA添加到環狀RNA:魚精蛋白溶液中），並短暫攪拌該溶液。使用林格氏乳酸溶液調節混合物（即，環狀RNA混合物）的最終濃度，以獲得環狀RNA製劑，其最終RNA濃度為50 μL中2 μg或10 μg RNA。
每組三隻小鼠在第0天和第21天經肌內或皮內接種2 μg或10 μg劑量的環狀RNA製劑或魚精蛋白媒介物對照。在第0天和第21天投與環狀RNA製劑後24小時，經肌內或皮內向每隻小鼠投與Addavax™佐劑（英傑公司）一次。按照製造商的說明，Addavax™佐劑按1X PBS中50%的濃度以50 μL給藥。
藉由顴骨下抽吸從每隻小鼠收集血液。在環狀RNA給藥後第7、14、21、23、28、35、41、49、56、63、69、77、84、108和115天，將血液收集到乾燥的無抗凝劑的試管中。藉由在4°C下以1200 g離心30分鐘從全血中分離血清。藉由56°C加熱1小時使血清熱滅活。藉由酶聯免疫吸附測定（ELISA），測定各個熱滅活的血清樣本中是否存在RBD特異性IgG。將ELISA板（MaxiSorp 442404 96孔，能肯公司（Nunc））在4°C下用在100 μL PBS中的SARS-CoV-2 RBD（義翹神州生物技術有限公司，40592-V08B；100 ng）包被過夜。然後用封閉緩衝液（含2% FBS和0.05%吐溫20的TBS）將板封閉1小時。然後將血清稀釋液添加到每個孔的100 μL封閉緩衝液中，並在室溫下孵育1小時。用含Tween®洗滌劑的1X Tris緩衝液（TBS-T）洗滌三次後，將板與抗小鼠IgG HRP檢測抗體（Jackson 115-035-071）孵育1小時，接著用TBS-T洗滌三次，然後添加四甲基苯（Pierce 34021）。使ELISA板反應5分鐘，然後使用2 N硫酸淬滅。在450 nm下測定光密度（OD）值。
將每個血清樣本的光密度除以背景（包被有RBD，僅與二抗孵育的板）的光密度。繪製每個樣本相對於背景的倍數。
結果顯示，在注射環狀RNA製劑後第14、21、23、28、35、41、49、56、63、69、77、84、108和115天獲得抗RBD抗體（圖 4 ）。注射魚精蛋白媒介物後未獲得抗RBD抗體。該等結果還顯示，編碼RBD抗原的環狀RNA在小鼠中誘導抗原特異性免疫反應。
使用類似的ELISA測定血清樣本中是否存在刺突特異性IgG。將ELISA板（MaxiSorp 442404 96孔，能肯公司）在4°C下用在100 μL PBS中的SARS-CoV-2刺突（義翹神州生物技術有限公司，40589-V08B1；100 ng）包被過夜。然後用封閉緩衝液（含2% FBS和0.05%吐溫20的TBS）將板封閉1小時。然後將血清稀釋液添加到每個孔的100 μL封閉緩衝液中，並在室溫下孵育1小時。用含Tween®洗滌劑的1X Tris緩衝液（TBS-T）洗滌三次後，將板與抗小鼠IgG HRP檢測抗體（Jackson 115-035-071）孵育1小時，接著用TBS-T洗滌三次，然後添加四甲基苯（Pierce 34021）。使ELISA板反應5分鐘，然後使用2 N硫酸淬滅。在450 nm下測定光密度（OD）值。
結果顯示，在注射環狀RNA製劑後35天獲得抗刺突抗體（圖 5 ）。注射媒介物後未獲得抗刺突抗體。
在給藥後第14天，使用測量相對IgG1與IgG2a同種型的測定法來表徵血清抗體（圖 6 ），並且使用PRNT中和測定法來表徵血清抗體中和病毒的能力。結果顯示，隨佐劑一起肌內給藥2 μg RBD eRNA具有中和能力。
實例 13 ：使用定時佐劑遞送調節小鼠體內由環狀 RNA 產生高斯螢光素酶
該實例證實在遞送佐劑以刺激免疫反應的同時，體內由環狀RNA表現蛋白質。
在該實例中，將環狀RNA設計成具有IRES和編碼高斯螢光素酶（GLuc）的ORF。在該實例中，如實例 2 中所述產生和純化環狀RNA。如實例 7 中所述配製環狀RNA，以獲得環狀RNA製劑（例如，TransIT配製的，魚精蛋白配製的，PBS/未配製的）。如實例 8 中所述，經肌內向小鼠投與每種環狀RNA製劑。
為了刺激免疫反應，在0小時或24小時將Addavax™佐劑（英傑公司）（一種基於角鯊烯的水包油奈米乳劑，其配方類似於MF59®佐劑）注射至小鼠後腿（與環狀RNA製劑同時遞送）。根據製造商的說明，Addavax™佐劑以50 μL給藥。
藉由顴骨下抽吸從每隻小鼠收集血樣（~25 μL）。在環狀RNA給藥後0、6、24和48小時，將血液收集到EDTA試管中。藉由在4°C下以1300 g離心30分鐘分離血漿，並使用高斯螢光素酶活性測定法（賽默科技皮爾斯公司（Thermo Scientific Pierce））測試了高斯螢光素酶（一種分泌酶）的活性。將50 μL 1x GLuc底物添加到5 μL血漿中，以進行GLuc螢光素酶活性測定。在發光檢測儀（普洛麥格公司）中混合後立即讀取平板。
該實例證明使用以下方法可在長時間內在體內從環狀RNA成功表現蛋白質：(a) 肌內注射TransIT配製的、魚精蛋白配製的和未配製的環狀RNA製劑，不遞送佐劑（圖 7 ）和在0和24小時遞送佐劑（圖 8 ）；以及 (b) 皮內注射魚精蛋白配製的環狀RNA製劑，不遞送佐劑和在24小時遞送佐劑（圖 9 ）。
實例 14 ：將編碼 SARS-CoV-2 抗原的 RNA 投與給轉染色體（ Tc ）牛
本實例描述了在具有人源化免疫系統的非人類哺乳動物中從編碼冠狀病毒抗原的環狀RNA產生冠狀病毒抗原的全人中和多株抗體。
在該實例中，如實例 1 和實例 3 中所述設計編碼SARS-CoV-2抗原的環狀RNA或mRNA並且如實例 2 和實例 4 中所述產生和純化。
在該實例中，在一種方法中，如實例 7 中所述配製RNA（例如，用脂質載劑（例如，TransIT）配製，用陽離子聚合物（例如，魚精蛋白）配製或未配製），以獲得第一組環狀RNA製劑或第一組線性RNA製劑。在第二種方法中，將Addavax™佐劑（英維公司（Invivogen））、MF59® 佐劑、完全弗氏佐劑、AS03或SAB專有佐劑配製物（SAB-adj-1）與RNA-脂質載劑混合物或未配製的RNA製劑（例如，環狀RNA製劑或線性RNA製劑）一起配製，如Beigel JH等人所述（Lancet Infect. Dis. [柳葉刀傳染病], 18: 410-418 (2018)），以獲得第二組環狀RNA製劑或第二組線性RNA製劑，其最終RNA濃度為100 μL中有25皮莫耳。對於每種方法，生成的總體積為8 mL，對應於2納莫耳的環狀RNA或線性RNA。在注射到動物體內前不久配製環狀RNA或線性RNA以獲得環狀RNA製劑或線性RNA製劑。
在該實例中，Tc牛用環狀RNA製劑（即，第一環狀RNA製劑或第二環狀RNA製劑）、線性RNA製劑（即，第一環狀RNA製劑或第二環狀RNA製劑）或僅媒介物的對照（即無RNA的對照）經由肌內或皮內注射進行免疫接種。
A. 肌內注射：在每個時間點在以下部位總共進行4次注射：每隻耳後注射一次2 mL（各自）；並在頸部兩側注射一次2 mL（各自）。
B. 皮內注射：在每個時間點在以下部位總共進行4次注射：向頸肩邊界的各個部位注射四次2 mL。
總共使用以下8個時間點：0、3、6、9、12、15、18和21週。
在投與第一組RNA製劑（例如，環狀RNA製劑或線性RNA製劑）時，將Addavax™佐劑（英維公司）、MF59® 佐劑、完全弗氏佐劑、AS03或SAB的SAB-adj-1分別鄰近（1-2 cm）前3個時間點的每個注射部位（總共2 mL）投與。在第一次注射（V1）之前，從每頭研究Tc牛收集一定體積的注射前血漿，用作陰性對照。在注射後第8、9、10、11、12和14天的每個時間點和最終注射後60天的其他時間點，經由頸靜脈穿刺收集高達牛體重2.1%的血樣。使用自動血漿置換系統（百特保健公司（Baxter Healthcare），Autopheresis C型號200）收集血漿。然後使用基於抗原的ELISA檢驗血漿中的抗原特異性抗體。如下面實例 21 )中所述，對於抗原特異性多株抗體，使用Cohn-Oncley純化和辛酸鹽分級分離法從血漿中純化人多株抗體。
實例 15 ：從投與給 Tc 牛的環狀 RNA 表現的分泌型抗原的檢測
為了檢測SARS-CoV-2 RBD抗原的表現，在注射後第1、3、5、7、14和21天經由頸靜脈穿刺從高達牛體重2.1%的血樣中收集來自環狀RNA的分泌型蛋白。使用自動血漿置換系統（百特保健公司，Autopheresis C型號200）收集血漿。然後檢驗血漿中SARS-CoV-2 RBD抗原的表現。如實例 5 中所述評估RBD抗原的表現。對於該等測定，使用抗人IgG HRP檢測抗體（英傑公司）。
實例 16 ：從投與給 Tc 牛的環狀 RNA 表現的非分泌型抗原的檢測
為了檢測SARS-CoV-2刺突抗原（一種來自環狀RNA的非分泌型蛋白）的表現，收穫組織用於分析蛋白質表現。在給藥後0、2、5、7和21天，將Tc牛處死並收穫肝臟、脾臟和肌肉（來自注射部位）。如實例 6 中所述對從每個組織中提取的蛋白質評估刺突抗原的表現。在該等ELISA中，使用抗人IgG HRP檢測抗體（英傑公司）代替抗小鼠IgG HRP檢測抗體。
實例 17 ：從投與給 Tc 牛的環狀 RNA 產生對 SARS-CoV-2 抗原具有特異性的人多株抗體
為了確定針對SARS-CoV-2抗原的抗體的存在，在注射後第8、9、10、11、12、14、20、40和60天經由頸靜脈穿刺收集高達牛科受試者體重2.1%的血樣。使用自動血漿置換系統（百特保健公司，Autopheresis C型號200）收集血漿。然後檢驗血漿中的抗原特異性抗體。如實例 10 中所述確定針對SARS-CoV-2抗原的抗體的存在。在該等測定中，使用抗人IgG HRP檢測抗體（英傑公司）。
實例 18 ：從投與給 Tc 牛的環狀 RNA 產生針對 SARS-CoV-2 的人中和多株抗體
在注射後第8、9、10、11、12和14天的每個時間點和最終注射後60天的其他時間點，經由頸靜脈穿刺收集高達牛科受試者體重2.1%的血樣。使用自動血漿置換系統（百特保健公司，Autopheresis C型號200）收集血漿。然後檢驗血漿中的抗原特異性抗體。如實例 11 中所述，進行SARS-CoV-2病毒中和測定以確定血漿中抗體的中和能力。
實例 19 ：隨著佐劑投與將編碼 SARS-CoV-2 抗原的 RNA 投與給轉染色體（ Tc ）牛
在該實例中，如實例 1 和實例 3 中所述設計編碼SARS-CoV-2抗原的環狀RNA或mRNA並且如實例 2 和實例 4 中所述產生和純化。
環狀RNA和mRNA在有或沒有佐劑的情況下配製，如下：
A. RNA （例如，環狀 RNA 或 mRNA ）和佐劑獨立投與。 如實例 7 中所述配製RNA（例如，用脂質載劑（例如，TransIT）配製，用陽離子聚合物（例如，魚精蛋白）配製或未配製），以獲得環狀RNA製劑或線性RNA製劑。最終RNA濃度為100 μL中有25皮莫耳。生成的總體積為8 mL，對應於2納莫耳的環狀RNA或mRNA。環狀RNA或mRNA在注射到動物體內前不久配製。對於總共8次注射，配製總共64 mL的環狀RNA或mRNA。在該實例中，Tc牛用環狀RNA製劑、線性RNA製劑或僅媒介物的對照（即無RNA的對照）經由肌內注射或皮內注射進行免疫接種。
(i) 肌內注射：在每個時間點在以下部位總共進行4次注射：每隻耳後注射一次2 mL（各自）；並向每條後腿注射一次2 mL（各自）。
(ii) 皮內注射：在每個時間點在以下部位總共進行4次注射：向頸肩邊界的各個部位注射4次2 mL。
總共使用以下8個時間點：0、3、6、9、12、15、18和21週。Addavax™佐劑（英維公司）、MF59® 佐劑、完全弗氏佐劑、AS03或SAB的專有佐劑配製物（SAB-adj-1）鄰近（1-2 cm）前3個時間點的每個疫苗接種部位投與（共2 mL）。
B. RNA （例如，環狀 RNA 或 mRNA ）和佐劑共同投與。 如實例 7 中所述配製RNA（例如，用脂質載劑（例如，TransIT）配製，用陽離子聚合物（例如，魚精蛋白）配製或未配製）。然後將Addavax™佐劑（英維公司）、MF59® 佐劑、完全弗氏佐劑、AS03或SAB的專有佐劑配製物（SAB-adj-1）與RNA載劑配製物、RNA-聚合物配製物或未配製的RNA一起配製，如Beigel JH等人所述（Lancet Infect. Dis. [柳葉刀傳染病], 18: 410-418 (2018)），以獲得環狀製劑線性RNA製劑，其最終RNA濃度為100 μL中有25皮莫耳。生成的總體積為8 mL，對應於2納莫耳的RNA。環狀RNA和mRNA在注射到動物體內前不久配製。對於總共8次注射，配製總共64 mL的環狀RNA和總共64 mL的mRNA。
在該實例中，Tc牛用環狀RNA製劑、線性RNA製劑或僅媒介物的對照（即無RNA的對照）經由肌內注射或皮內注射進行免疫接種。
A. 肌內注射。在每個時間點在以下部位總共進行4次注射：每隻耳後注射一次2 mL（各自）；並向每條後腿注射一次2 mL（各自）。
B. 皮內注射。在每個時間點在以下部位總共進行4次注射：向頸肩邊界的各個部位注射4次2 mL。
實例 20 ：在 Tc 山羊中從環狀 RNA 產生對 SARS-CoV-2 具有特異性的中和多株抗體
在該實例中，如實例 1 和實例 3 中所述設計編碼SARS-CoV-2抗原的環狀RNA或mRNA並且如實例 2 和實例 4 中所述產生和純化。
如實例 7 中所述配製環狀RNA和mRNA（例如，用脂質載劑（例如，TransIT）配製，用陽離子聚合物（例如，魚精蛋白）配製或未配製），以獲得環狀RNA製劑或線性RNA製劑。最終RNA濃度為100 μL中有25皮莫耳。生成的總體積為1 mL，對應於0.25納莫耳的環狀RNA或0.25納莫耳的mRNA。在注射到動物體內前不久配製環狀RNA和mRNA以獲得環狀RNA製劑或線性RNA製劑。對於總共4次注射，配製總共4 mL的環狀RNA和總共4 mL的線性RNA。
在該實例中，使用轉染色體山羊（Tc山羊），其中將包含生殖系構型的整個人免疫球蛋白（Ig）基因庫的人類人工染色體（HAC）引入家養山羊的基因組成中。Tc山羊在其血清中產生人多株抗體（參見Wu H等人(Sci Rep [科學報告], 9(1): 366, doi: doi.org/10.1038/s41598-018-36961-5 (2019)）。
在該實例中，Tc山羊用環狀RNA製劑、線性RNA製劑或僅媒介物的對照（即無RNA的對照）經由肌內或皮內注射進行免疫接種。
A. 肌內注射。在每個時間點在以下部位總共進行2次注射：向頸部兩側注射一次0.5 mL（各自）。
B. 皮內注射。在每個時間點在以下部位總共進行2次注射：向下頸肩部相對側注射一次0.5 mL（各自）。
總共使用以下4個時間點：0、3、6和9週。
Addavax™佐劑（英維公司）、MF59® 佐劑、完全弗氏佐劑、AS03或SAB的專有佐劑配製物（SAB-adj-1）鄰近（1-2 cm）前3個時間點的每個注射部位投與（共0.5 mL）。
在注射後第8和14的每個時間點和最終注射後60天的其他時間點，經由頸靜脈穿刺收集血樣（40 mL）。使用自動血漿置換系統（百特保健公司，Autopheresis C型號200）收集血漿。然後檢驗血漿中的抗原特異性抗體。
實例 21 ：多株抗體分級分離純化
該實例描述了從具有人源化免疫系統的非人哺乳動物血漿中純化人多株抗體。
為了從收集的血漿中純化人抗SARS-CoV-2多株抗體並隨後在人類受試者中使用，需要對蛋白質抗原進行滅活和去除。在該實例中，使用Cohn-Oncley方法從血漿中純化人多株抗SARS-CoV-2抗體，如（Ofosu等人FA (Thromb. Haemost. [血栓形成與止血], 99(5):851-862 (2008)）；Buchacher A和Iberer G（Biotechnol. J. [生物技術雜誌], 1(2): 148-163 (2006)）；Buchacher A和Curling JM（Biopharm. Process. [生物製藥製程], 第42章, 第857-876頁, doi: https://doi.org/10.1016/B978-0-08-100623-8.00043-8 (2018)）中所述。收集藉由Cohn-Oncley方法獲得的級分(I+) II+III，並使用Lebing等人（Vox Sanguinis [血液之聲], 84(3):193-201 (2003)）描述之方法從該級分中純化人多株抗SARS-CoV-2抗體。簡言之，將級分II+III懸浮在12體積的pH 4.2的注射用水（WFI）中。添加辛酸鈉（20 mM），並用氫氧化鈉將pH調節至pH 5.1。在該步驟中，脂蛋白、白蛋白和部分辛酸鹽沈澱。在助濾劑的存在下藉由布過濾去除沈澱物。過濾後，將辛酸鹽濃度重新調整至20 mM，並將溶液在pH 5.1和25°C下孵育1小時，以滅活包膜病毒。藉由用助濾劑進行深度過濾，使溶液澄清。然後使濾液在pH 5.2下藉由兩個連續的陰離子交換層析柱（Q Sepharose FF，然後是ANX Sepharose FF）。藉由超濾（BioMax 50KDa盒，密理博公司（Millipore））濃縮洗脫液，並使用相同的系統用WFI進行滲濾。將純化的IgG溶液調節至pH 4.25、0.2 M甘胺酸和100 mg/mL蛋白質。將散裝IVIG無菌過濾並用於填裝10、50、100或200 mL的小瓶。將最終產品在23-27°C下孵育21天以滅活病毒，然後在2-8°C下儲存。
為了檢驗IVIG的富集，使用醋酸纖維素電泳。對於臨床使用，95%的純度係典型的並且預計係這種純化程序的結果。
實例 22 ：用於治療人類受試者的全人多株抗體的配製
在該實例中，將純化的抗體配製為中性pH（pH 7.2），並稀釋於含有氯化鈉的離子溶液中。使用美國藥典（USP）級輸注溶液即0.9%的氯化鈉。臨床配製可以基於一些溶液組成物，該等組成物包含：
1.海藻糖、檸檬酸鈉、檸檬酸、聚山梨醇酯80。
2.琥珀酸鈉、蔗糖、聚山梨醇酯20。
3.氯化鈉、胺丁三醇、聚山梨醇酯80。
4.蔗糖、氯化鈉、磷酸鈉、葡聚糖40。
實例 23 ：感染了 SARS-CoV-2 的人類受試者的治療
該實例描述了向患有SARS-CoV-2的人類受試者投與全人抗SARS-CoV-2多株抗體。
在該實例中，患有COVID-19的成年人類受試者藉由輸注靜脈投與單劑量（400 mg/kg）的配製的多株抗體。以1.0 mg/kg/min的速率開始輸注，20分鐘後增加到1.5-2.5 mg/kg/min。也可以使用本領域已知的其他合適的輸注速率。
藉由評價COVID-19的標誌物來評估多株抗體對COVID-19的影響，例如在人類受試者輸注前和輸注後的病毒載量、血清抗體滴定度、體溫變化、序貫器官衰竭評估（SOFA）評分（範圍0-24，分數越高表明疾病越嚴重）、Pao2/Fio2、血常規生化指標、ARDS以及通氣和體外膜肺氧合（ECMO）支持。
實例 24 ：健康人類受試者針對 SARS-CoV-2 感染的被動免疫
該實例描述了用在具有人源化免疫系統的非人類哺乳動物中產生的針對SARS-CoV-2的全人多株抗體對人類受試者進行被動免疫而免受SARS-CoV-2感染。
在該實例中，健康人類受試者藉由輸注靜脈投與單劑量（400 mg/kg）的配製的多株抗體或安慰劑（生理鹽水對照）。以1.0 mg/kg/min的速率開始輸注，20分鐘後增加到1.5-2.5 mg/kg/min。可以使用本領域已知的其他合適的輸注速率。3天後，從治療的受試者中抽取血液並如實例 11 中所述使用蝕斑減少中和測定法測試血漿中抗體的中和能力。
在該實例中，在投與配製的多株抗體後14天對人類受試者進行血清學測試。SARS-CoV-2的血清學測試係本領域已知的，包括例如Gonzalez JM等人medRxiv ，（doi: doi.org/10.1101/2020.04.10.20061150 (2020)）。
實例 25 ：健康人類受試者的預防性治療
該實例描述了用在具有人源化免疫系統的非人類哺乳動物中產生的針對SARS-CoV-2的全人多株抗體對人類受試者進行針對SARS-CoV-2感染的預防性治療。
對於該實例，如實例 21 中所述獲得針對SARS-CoV-2的純化人多株抗體。如實例 22 中所述配製純化的多株抗體，隨後如實例 24 中所述將其投與給健康人類受試者。
3天後，從投與了配製的多株抗體或安慰劑（生理鹽水對照）的健康人類受試者中抽取血液，並如實例 11 中所述使用蝕斑減少中和測定法測試血漿中抗體的中和能力。
實例 26 ：非人靈長類動物的預防性治療
該實例描述了用在具有人源化免疫系統的非人類哺乳動物中產生的針對SARS-CoV-2的全人多株抗體對非人靈長類動物進行針對SARS-CoV-2感染的預防性治療。
在該實例中，如實例 21 中所述獲得針對SARS-CoV-2的純化人多株抗體。如實例 22 中所述配製純化的多株抗體，隨後將其投與給成年恒河猴。簡言之，將多株抗體配製物以10 mg/kg的劑量靜脈內投與給恒河猴。作為對照，使用來自僅注射了媒介物（無環狀RNA）的轉染色體牛的多株抗體。
然後以1×106 50%組織培養感染劑量（TCID50 ）用SARS-CoV-2對恒河猴進行氣管內攻擊，並且如Bao L等人（bioRxiv , doi: doi.org/10.1101/2020.03.13.990226 (2020)）所述，按時進行體重、體溫、X射線、血清採樣、鼻/喉拭子和所有初生組織測試。攻擊後至多30天取樣並評估病毒載量。
實例 27 ：將編碼 SARS-CoV-2 抗原的 RNA 投與給人類受試者
該實例描述了向人類受試者投與編碼SARS-CoV-2抗原的環狀RNA。
在該實例中，如實例 1 和實例 3 中所述設計編碼SARS-CoV-2抗原的環狀RNA或mRNA並且如實例 2 和實例 4 中所述產生和純化。
在該實例中，在一種方法中，如實例 7 中所述配製RNA（例如，用脂質載劑（例如，TransIT）配製，用陽離子聚合物（例如，魚精蛋白）配製，用脂質奈米顆粒配製或未配製），以獲得第一組環狀RNA製劑或第一組線性RNA製劑。在第二種方法中，Addavax™佐劑（英維公司）、MF59® 佐劑或完全弗氏佐劑與RNA-脂質載體混合物或未配製的RNA製劑（例如，環狀RNA製劑或線性RNA製劑）一起配製，如Beigel JH等人所述（Lancet Infect. Dis. [柳葉刀傳染病], 18: 410-418 (2018)），以獲得第二組環狀RNA製劑或第二組線性RNA製劑。在注射到人類受試者體內前不久配製環狀RNA或線性RNA以獲得環狀RNA製劑或線性RNA製劑。
在該實例中，人類受試者用環狀RNA製劑（即，第一環狀RNA製劑或第二環狀RNA製劑）、線性RNA製劑（即，第一環狀RNA製劑或第二環狀RNA製劑）經由肌內或皮內注射進行免疫接種。向人類受試者投與環狀RNA製劑或線性RNA製劑至少一次、至少兩次、至少3次或更多次以在人類受試者中引發免疫原性反應。
實例 28 ：在哺乳動物細胞中由環狀 RNA 表現多種抗原
該實例證明在哺乳動物細胞中由環狀RNA表現多種抗原。圖 12 中示出了該等構建體的示例性示意圖。
實驗 1
如實例 1 中所述設計編碼SARS-CoV-2 RBD抗原的第一環狀RNA（核酸SEQ ID NO: 56；胺基酸SEQ ID NO: 55），並如實例 2 中所述產生和純化。如實例 1 中所述設計編碼SARS-CoV-2刺突抗原的第二環狀RNA（核酸SEQ ID NO: 54；胺基酸SEQ ID NO: 53），並如實例 2 中所述產生和純化。將第一環狀RNA和第二環狀RNA混合在一起以獲得混合物。使用Lipofectamine MessengerMax（賽默飛世爾公司，LMRNA015）將混合物（各1皮莫耳的環狀RNA）轉染到HeLa細胞（24孔板中每孔100,000個細胞）中。作為對照，使用MessengerMax也將第一環狀RNA和第二環狀RNA單獨轉染到HeLa細胞中。
在24小時時使用SARS-CoV-2 RBD抗原特異性ELISA測量RBD抗原的表現。在24小時時藉由流動式細胞測量術測量刺突抗原表現。
藉由用該混合物轉染，在HeLa細胞上清液中檢測到SARS-Co-V-2 RBD抗原，並且在HeLa細胞的細胞表面檢測到SARS-CoV-2刺突抗原。藉由用第一環狀RNA轉染，檢測到SARS-CoV-2 RBD抗原，但未檢測到SARS-CoV-2刺突抗原。藉由用第二環狀RNA轉染，檢測到SARS-CoV-2刺突抗原，但未檢測到SARS-CoV-2 RBD抗原。這證明在哺乳動物細胞中由環狀RNA的組合混合物表現SAR-CoV-2 RBD和SARS-CoV-2刺突抗原兩者。
實驗 2
如實例 1 中所述設計編碼SARS-CoV-2 RBD抗原的第一環狀RNA（核酸SEQ ID NO: 56；胺基酸SEQ ID NO. 55），並如實例 2 中所述產生和純化。設計具有IRES和編碼高斯螢光素酶（GLuc）的ORF的第二環狀RNA（核酸SEQ ID NO: 58；胺基酸SEQ ID NO. 57），並如實例 2 中所述產生和純化。將第一環狀RNA和第二環狀RNA單獨與Lipofectamine MessengerMax（賽默飛世爾公司，LMRNA015）複合，然後混合在一起以獲得混合物。將混合物（各0.1皮莫耳的環狀RNA）轉染到HeLa細胞（96孔板中每孔20,000個細胞）中。作為對照，使用MessengerMax也將第一環狀RNA和第二環狀RNA單獨轉染到HeLa細胞中。
在24小時時使用SARS-CoV-2 RBD抗原特異性ELISA測量RBD抗原的表現。在24小時時使用高斯螢光素酶活性測定法（賽默科技皮爾斯公司）測量GLuc活性。
藉由用該混合物轉染，在24小時時在HeLa細胞上清液中檢測到SARS-CoV-2 RBD抗原和GLuc活性。藉由用第一環狀RNA轉染，檢測到SARS-CoV-2 RBD抗原，但未檢測到GLuc活性。藉由用第二環狀RNA轉染，檢測到GLuc活性，但未檢測到SARS-CoV-2 RBD抗原。這證明在哺乳動物細胞中由環狀RNA的組合混合物表現SAR-CoV-2 RBD和GLuc抗原兩者。
實驗 3
如實例 1 中所述設計編碼SARS-CoV-2 RBD抗原的第一環狀RNA（核酸SEQ ID NO: 56；胺基酸SEQ ID NO. 55），並如實例 2 中所述產生和純化。將第二環狀RNA設計為包括IRES，接著係編碼來自流感A H1N1，A/加利福尼亞/07/2009的血凝素（HA）的ORF（核酸SEQ ID NO: 60；胺基酸SEQ ID NO: 59），並如實例 2 中所述產生和純化。將第一環狀RNA和第二環狀RNA混合在一起以獲得混合物。使用Lipofectamine MessengerMax（賽默飛世爾公司，LMRNA015）將混合物（各1皮莫耳的環狀RNA）轉染到HeLa細胞（24孔板中每孔100,000個細胞）中。作為對照，使用MessengerMax也將第一環狀RNA和第二環狀RNA單獨轉染到HeLa細胞中。
在24小時時使用SARS-CoV-2 RBD抗原特異性ELISA測量RBD抗原的表現。在24小時時使用免疫印跡法測量HA抗原表現。簡言之，對於免疫印跡法，在轉染後24小時，裂解細胞並使用甲型流感H1N1 HA（A/加利福利亞/07/2009）單株抗體（MA5-29920（賽默飛世爾公司））作為一抗並使用山羊抗小鼠IgG H＆L（HRP）作為二抗（艾博抗公司（Abcam），ab 97023）進行蛋白質印跡法以檢測HA抗原。為了負載對照，將α微管蛋白與作為一抗的α微管蛋白（DM1A）小鼠抗體（細胞傳訊技術公司（Cell Signaling Technology），CST＃3873）和作為二抗的山羊抗小鼠IgG H＆L（HRP）（艾博抗公司，ab 97023）一起使用。
藉由用混合物轉染，檢測到SARS-CoV-2 RBD和流感HA抗原兩者。藉由用第一環狀RNA轉染，檢測到SARS-CoV-2 RBD，但未檢測到流感HA抗原。藉由用第二環狀RNA轉染，檢測到流感HA抗原，但未檢測到SARS-CoV-2 RBD抗原。這證明在哺乳動物細胞中由環狀RNA的組合混合物表現SAR-CoV-2 RBD和流感HA抗原兩者。
實驗 4
如實例 1 中所述設計編碼SARS-CoV-2刺突抗原的第一環狀RNA（核酸SEQ ID NO: 45；胺基酸SEQ ID NO: 53），並如實例 2 中所述產生和純化。將第二環狀RNA設計為包括IRES，接著係編碼來自流感A H1N1，A/加利福利亞/07/2009的HA的ORF（核酸SEQ ID NO: 60；胺基酸SEQ ID NO: 59），並如實例 2 中所述產生和純化。將第一環狀RNA和第二環狀RNA混合在一起以獲得混合物。使用Lipofectamine MessengerMax（賽默飛世爾公司，LMRNA015）將混合物（各1皮莫耳的環狀RNA）轉染到HeLa細胞（24孔板中每孔100,000個細胞）中。作為對照，使用MessengerMax也將第一環狀RNA和第二環狀RNA單獨轉染到HeLa細胞中。
在24小時時藉由流動式細胞測量術測量刺突抗原表現。如上文實驗3中所述，在24小時時藉由免疫印跡法測量HA抗原表現。
藉由用混合物轉染，檢測到SARS-CoV-2刺突抗原和流感HA抗原兩者。藉由用第一環狀RNA轉染，檢測到SARS-CoV-2刺突抗原，但未檢測到流感HA抗原。藉由用第二環狀RNA轉染，檢測到流感HA抗原，但未檢測到SARS-CoV-2刺突抗原。這證明在哺乳動物細胞中由環狀RNA的組合混合物表現SAR-CoV-2刺突抗原和流感HA抗原兩者。
該實例顯示，在哺乳動物細胞中從包含環狀RNA的不同組合的環狀RNA製劑表現了多種抗原。
實例 29 ：從環狀 RNA 表現多種抗原
該實例證明在哺乳動物細胞中由環狀RNA表現多種抗原。圖 10 和圖 11 中示出了該等構建體的示例性示意圖。
實驗 1
在該實例中，將環狀RNA設計成包括IRES，其後是編碼GLuc抗原的ORF、終止密碼子、間隔區、IRES、編碼SARS-CoV-2 RBD抗原的ORF和終止密碼子。如實例2中所述產生和純化環狀RNA。作為對照，如上所述產生以下環狀RNA：(i) 具有IRES和編碼SARS-CoV-2 RBD抗原的ORF的環狀RNA；(ii) 具有IRES和編碼GLuc的ORF的環狀RNA。
使用Lipofectamine MessengerMax（賽默飛世爾公司，LMRNA015）將環狀RNA（0.1皮莫耳）轉染到HeLa細胞（96孔板中每孔10,000個細胞）中。
在24小時時使用SARS-CoV-2 RBD抗原特異性ELISA測量RBD抗原的表現。在24小時時使用高斯螢光素酶活性測定法（賽默科技皮爾斯公司）測量GLuc活性。
從編碼SARSs-CoV-2 RBD抗原的環狀RNA中檢測到RBD抗原的表現（圖13A）。從編碼GLuc的環狀RNA中檢測到GLuc活性（圖13B）。這證明哺乳動物細胞中從編碼SARS-CoV-2 RBD和GLuc抗原的環狀RNA表現SAR-CoV-2 RBD和GLuc抗原。
實驗 2
在該實例中，將環狀RNA設計為包括IRES，其後是編碼SARS-CoV-2 RBD抗原的ORF、終止密碼子、間隔區、編碼中東呼吸綜合症（MERS）RBD抗原的ORF和終止密碼子。如實例 2 中所述產生和純化環狀RNA。
使用Lipofectamine MessengerMax（賽默飛世爾公司，LMRNA015）以各種濃度將環狀RNA轉染到HeLa細胞（96孔板中每孔10,000個細胞）中。
在24小時時使用SARS-CoV-2 RBD抗原特異性ELISA測量SARS-CoV-2 RBD抗原的表現。在24小時時使用能夠檢測的MERS RBD抗原特異性抗體測量MERS RBD抗原表現。
實例 30 ：小鼠模型中來自環狀 RNA 的多種抗原的免疫原性
該實例描述了藉由投與多個環狀RNA分子在受試者中表現多種抗原。
實驗 1
在小鼠模型中評價配製於脂質奈米顆粒中的環狀RNA製劑的免疫原性，該環狀RNA製劑包含 (a) 編碼SARS-CoV-2 RBD抗原的環狀RNA以及 (b) 編碼作為模型抗原的GLuc的環狀RNA。還在小鼠模型中評價了針對SARS-CoV-2 RBD抗原的抗體的產生和GLuc活性。
如實例 1 中所述設計編碼SARS-CoV-2 RBD抗原的第一環狀RNA（核酸SEQ ID NO: 56；胺基酸SEQ ID NO: 55），並如實例 2 中所述產生和純化。設計具有IRES和編碼GLuc的ORF的第二環狀RNA（核酸SEQ ID NO: 58；胺基酸SEQ ID NO. 57），並如實例 2 中所述產生和純化。將第一環狀RNA和第二環狀RNA混合在一起以獲得混合物。然後如實例 7 中所述用脂質奈米顆粒配製該混合物，以獲得第一環狀RNA製劑。還如實例 7 中所述用脂質奈米顆粒單獨配製第一環狀RNA和第二環狀RNA，然後混合在一起以獲得第二環狀RNA製劑。
三隻小鼠在第0天肌內接種第一環狀RNA製劑（總劑量為10 μg RBD + 10 μg GLuc）並且在第12天接種第二環狀RNA製劑（總劑量為10 μg RBD + 10 μg GLuc）。另外的小鼠（每組3隻或4隻）也在第0天和第12天肌內接種：(i) 10 μg劑量的用脂質奈米顆粒配製的第一環狀RNA；(ii) 10 μg劑量的用脂質奈米顆粒配製的第二環狀RNA；或 (iii) PBS。
藉由下頜下抽吸從每隻小鼠收集血液。用第一環狀RNA製劑初免後2天和17天將血液收集到乾燥的無抗凝劑的試管中。藉由在4°C下以1200 g離心30分鐘從全血中分離血清。藉由酶聯免疫吸附測定（ELISA），測定各血清樣本中是否存在RBD特異性IgG。將ELISA板（MaxiSorp 442404 96孔，能肯公司）在4°C下用在100 µL的1X包被緩衝液（百進生技公司（Biolegend），421701）中的SARS-CoV-2 RBD（義翹神州生物技術有限公司，40592-V08B；100 ng）包被過夜。然後用封閉緩衝液（含2% BSA和0.05%吐溫20的TBS）將板封閉1小時。然後將血清稀釋液（1:500、1:1500、1:4500和1:13,500）添加到每個孔的100 µL封閉緩衝液中，並在室溫下孵育1小時。用含Tween®洗滌劑的1X Tris緩衝液（TBS-T）洗滌三次後，將板與抗小鼠IgG HRP檢測抗體（艾博抗公司，ab97023）孵育1小時，接著用TBS-T洗滌三次，然後添加四甲基苯（百進生技公司，421101）。使ELISA板反應10-20分鐘，然後使用0.2 N硫酸淬滅。在450 nm下測定光密度（O.D.）值。
將每個血清樣本的光密度除以背景（包被有RBD，僅與二抗孵育的板）的光密度。繪製每個樣本相對於背景的倍數。
使用高斯螢光素酶活性測定法（賽默科技皮爾斯公司）測試GLuc的活性。將50 μL 1x GLuc底物添加到10 μL血清中，以進行GLuc螢光素酶活性測定。在發光檢測儀（普洛麥格公司）中混合後立即讀取平板。
結果顯示在初免後17天（即，注射第一環狀RNA製劑後17天）獲得抗RBD抗體（圖 14A ），並且在初免後2天（即，注射第一環狀RNA製劑後2天）檢測到GLuc活性（圖 14B ）。
該等結果顯示，包含兩種編碼不同抗原的環狀RNA的環狀RNA製劑在小鼠中誘導抗原特異性反應。
實驗 2
在小鼠模型中評價配製於脂質奈米顆粒中的環狀RNA製劑的免疫原性，該環狀RNA製劑包含 (a) 編碼SARS-CoV-2 RBD抗原的環狀RNA以及 (b) 編碼流感血凝素（HA）抗原的環狀RNA。還在小鼠模型中評價了針對SARS-CoV-2 RBD和流感HA抗原的抗體的產生。
如實例 1 中所述設計編碼SARS-CoV-2 RBD抗原的第一環狀RNA（核酸SEQ ID NO: 56；胺基酸SEQ ID NO: 55），並如實例 2 中所述產生和純化。將第二環狀RNA設計為包括IRES，接著係編碼來自流感A H1N1，A/加利福尼亞/07/2009的血凝素（HA）的ORF（核酸SEQ ID NO: 60；胺基酸SEQ ID NO: 59），並如實例 2 中所述產生和純化。將第一環狀RNA和第二環狀RNA混合在一起以獲得混合物。然後如實例 7 中所述用脂質奈米顆粒配製該混合物，以獲得第一環狀RNA製劑。還如實例 7 中所述用脂質奈米顆粒單獨配製第一環狀RNA和第二環狀RNA，然後混合在一起以獲得第二環狀RNA製劑。
三隻小鼠在第0天肌內接種第一環狀RNA製劑（總劑量為10 μg RBD + 10 μg HA）並且在第12天接種第二環狀RNA製劑（總劑量為10 μg RBD + 10 μg HA）。另外的小鼠（每組3隻或4隻）也在第0天和第12天肌內接種：(i) 10 μg劑量的用脂質奈米顆粒配製的第一環狀RNA；(ii) 10 μg劑量的用脂質奈米顆粒配製的第二環狀RNA；或 (iii) PBS。
如實驗1中所述採集血液。如實驗1中所述，藉由ELISA確定RBD特異性IgG的存在。
藉由ELISA測定各血清樣本中是否存在HA特異性IgG。將ELISA板在4°C下用HA重組蛋白（義翹神州生物技術有限公司，11085-V08B；100 ng）包被過夜，並將板如實驗1中所述進行處理。將每個血清樣本的光密度除以背景（包被有HA，僅與二抗孵育的板）的光密度。繪製每個樣本相對於背景的倍數。
結果顯示，在初免後17天（即，注射第一環狀RNA製劑後17天）獲得抗RBD和抗HA抗體（圖 16A 和圖 16B ）。
結果還顯示，包含兩種編碼不同抗原的環狀RNA的環狀RNA製劑在小鼠中誘導抗原特異性免疫反應。
實驗 3
在小鼠模型中評價配製於脂質奈米顆粒中的環狀RNA製劑的免疫原性，該環狀RNA製劑包含 (a) 編碼SARS-CoV-2刺突抗原的環狀RNA以及 (b) 編碼流感血凝素（HA）抗原的環狀RNA。還在小鼠模型中評價了針對SARS-CoV-2刺突和流感HA抗原的抗體的產生。
如實例1中所述設計編碼SARS-CoV-2刺突抗原的第一環狀RNA（核酸SEQ ID NO: 54；胺基酸SEQ ID NO: 53），並如實例 2 中所述產生和純化。將第二環狀RNA設計為包括IRES，接著係編碼來自流感A H1N1，A/加利福尼亞/07/2009的血凝素（HA）的ORF（核酸SEQ ID NO: 60；胺基酸SEQ ID NO: 59），並如實例 2 中所述產生和純化。將第一環狀RNA和第二環狀RNA混合在一起以獲得混合物。然後如實例 7 中所述用脂質奈米顆粒配製該混合物，以獲得第一環狀RNA製劑。還如實例 7 中所述用脂質奈米顆粒單獨配製第一環狀RNA和第二環狀RNA，然後混合在一起以獲得第二環狀RNA製劑。
三隻小鼠在第0天肌內接種第一環狀RNA製劑（總劑量為10 μg刺突+ 10 μg HA）並且在第12天接種第二環狀RNA製劑（總劑量為10 μg刺突+ 10 μg HA）。另外的小鼠（每組3隻或4隻）也在第0天和第12天肌內接種：(i) 10 μg劑量的用脂質奈米顆粒配製的第一環狀RNA；(ii) 10 μg劑量的用脂質奈米顆粒配製的第二環狀RNA；或 (iii) PBS。
如實驗1中所述採集血液，藉由在4°C下以1200 g離心30分鐘從全血中分離血清。如實驗1中所述，藉由ELISA測定各血清樣本中是否存在RBD（即刺突的RBD）特異性IgG。
藉由ELISA測定各血清樣本中是否存在HA特異性IgG。將ELISA板在4°C下用HA重組蛋白（義翹神州生物技術有限公司，11085-V08B；100 ng）包被過夜，並將板如實驗1中所述進行處理。將每個血清樣本的光密度除以背景（包被有HA，僅與二抗孵育的板）的光密度。繪製每個樣本相對於背景的倍數。
結果顯示，在初免後17天（即，注射第一環狀RNA製劑後17天）獲得抗RBD抗體和抗HA抗體（圖 15A 和圖 15B ）。
結果還顯示，包含兩種編碼不同抗原的環狀RNA的環狀RNA製劑在小鼠中誘導抗原特異性免疫反應。
實驗 4
在小鼠模型中評價包含配製在脂質奈米顆粒中的環狀RNA的環狀RNA製劑的免疫原性，該環狀RNA設計為包括IRES，其後是編碼SARS-CoV-2 RBD抗原的ORF、終止密碼子、間隔區、IRES、編碼MERS RBD抗原的ORF和終止密碼子。還在小鼠模型中評價了針對SARS-CoV-2 RBD和MERS RBD抗原的抗體的產生。
然後如實例 7 中所述用脂質奈米顆粒配製該環狀RNA，以獲得環狀RNA製劑。
在第0天和初始投與後至少一天，以5 µg、10 µg、20 µg或50 µg的量用環狀RNA製劑對小鼠進行肌內或皮內接種。
如實驗1中所述採集血液。如實驗1中所述，藉由ELISA確定SARS-CoV-2 RBD特異性IgG的存在。還藉由ELISA確定MERS RBD特異性IgG的存在。
測定各血清樣本中是否存在抗SARS-CoV-2 RBD結合抗體、抗MERS RBD結合抗體、針對SARS-CoV-2 RBD抗原的中和抗體、針對MERS RBD抗原的中和抗體、對SARS-CoV-2抗原的細胞反應以及對MERS RBD抗原的細胞反應。
實例 31 ：包含多種抗原的環狀 RNA 在小鼠模型中的免疫原性
該實例描述了包含多種抗原的環狀RNA的免疫原性。該實例還描述了在小鼠模型中針對由單個環狀RNA編碼的多種抗原的抗體的產生。
在該實例中，將環狀RNA設計成包括IRES，其後是編碼GLuc的ORF、終止密碼子、間隔區、IRES、編碼SARS-CoV-2 RBD抗原的ORF和終止密碼子，如實例 29 中所述產生和純化。作為對照，如上所述產生以下環狀RNA：(i) 具有IRES和編碼SARS-CoV-2 RBD抗原的ORF的環狀RNA；(ii) 具有IRES和編碼GLuc的ORF的環狀RNA。
如實例 7 中所述用脂質奈米顆粒配製環狀RNA，以獲得環狀RNA製劑。
每組三隻小鼠在第0天和第12天肌內接種10 μg或20 μg總劑量的環狀RNA製劑。
如實例 30 中所述採集血液。如實例 30 中所述，藉由ELISA確定RBD特異性IgG的存在。如實例 30 中所述測量GLuc活性。
實例 32 ：對 T 細胞反應的評價
使用ELISpot測定法檢測SARS-CoV-2刺突或RBD特異性T細胞或流感HA特異性T細胞的存在。對來自實例 30 的以下幾組小鼠進行該項測定： 1.  RBD 2.  GLuc 3.  HA 4.  刺突 5.  RBD+HA 6.  刺突+HA 7.  PBS
在加強後第30天（即，注射第一環狀RNA製劑後30天）收穫小鼠脾臟，並將其加工成單細胞懸液。將脾細胞以每孔0.5 M細胞接種在IFN-g或IL-4 ELISpot板（ImmunoSpot）上。脾細胞不受刺激或用SARS CoV-2和HA肽庫（JPT、PM-WCPV-SRB和PM-IFNA_HACal）刺激。將ELISPOT板根據製造商的方案進行處理。
雖然本文已經顯示和描述了本發明的較佳的實施方式，但是對於熟悉該項技術者顯而易見的是，此類實施方式僅以舉例的方式提供。在不脫離本發明的情況下，現在熟悉該項技術者將想到許多改變、變化和取代。應該理解的是，本文所述之本發明的實施方式的各種替代方案可用於實踐本發明。其意圖係以下請求項限定本發明的範圍，並且由此覆蓋該等請求項及其等同項範圍內之方法和結構。 序列表
SEQ ID NO: 注解 序列
11 QHD42416.1 atgtttgtttttcttgttttattgccactagtctctagtcagtgtgttaatcttacaaccagaactcaattaccccctgcatacactaattctttcacacgtggtgtttattaccctgacaaagttttcagatcctcagttttacattcaactcaggacttgttcttacctttcttttccaatgttacttggttccatgctatacatgtctctgggaccaatggtactaagaggtttgataaccctgtcctaccatttaatgatggtgtttattttgcttccactgagaagtctaacataataagaggctggatttttggtactactttagattcgaagacccagtccctacttattgttaataacgctactaatgttgttattaaagtctgtgaatttcaattttgtaatgatccatttttgggtgtttattaccacaaaaacaacaaaagttggatggaaagtgagttcagagtttattctagtgcgaataattgcacttttgaatatgtctctcagccttttcttatggaccttgaaggaaaacagggtaatttcaaaaatcttagggaatttgtgtttaagaatattgatggttattttaaaatatattctaagcacacgcctattaatttagtgcgtgatctccctcagggtttttcggctttagaaccattggtagatttgccaataggtattaacatcactaggtttcaaactttacttgctttacatagaagttatttgactcctggtgattcttcttcaggttggacagctggtgctgcagcttattatgtgggttatcttcaacctaggacttttctattaaaatataatgaaaatggaaccattacagatgctgtagactgtgcacttgaccctctctcagaaacaaagtgtacgttgaaatccttcactgtagaaaaaggaatctatcaaacttctaactttagagtccaaccaacagaatctattgttagatttcctaatattacaaacttgtgcccttttggtgaagtttttaacgccaccagatttgcatctgtttatgcttggaacaggaagagaatcagcaactgtgttgctgattattctgtcctatataattccgcatcattttccacttttaagtgttatggagtgtctcctactaaattaaatgatctctgctttactaatgtctatgcagattcatttgtaattagaggtgatgaagtcagacaaatcgctccagggcaaactggaaagattgctgattataattataaattaccagatgattttacaggctgcgttatagcttggaattctaacaatcttgattctaaggttggtggtaattataattacctgtatagattgtttaggaagtctaatctcaaaccttttgagagagatatttcaactgaaatctatcaggccggtagcacaccttgtaatggtgttgaaggttttaattgttactttcctttacaatcatatggtttccaacccactaatggtgttggttaccaaccatacagagtagtagtactttcttttgaacttctacatgcaccagcaactgtttgtggacctaaaaagtctactaatttggttaaaaacaaatgtgtcaatttcaacttcaatggtttaacaggcacaggtgttcttactgagtctaacaaaaagtttctgcctttccaacaatttggcagagacattgctgacactactgatgctgtccgtgatccacagacacttgagattcttgacattacaccatgttcttttggtggtgtcagtgttataacaccaggaacaaatacttctaaccaggttgctgttctttatcaggatgttaactgcacagaagtccctgttgctattcatgcagatcaacttactcctacttggcgtgtttattctacaggttctaatgtttttcaaacacgtgcaggctgtttaataggggctgaacatgtcaacaactcatatgagtgtgacatacccattggtgcaggtatatgcgctagttatcagactcagactaattctcctcggcgggcacgtagtgtagctagtcaatccatcattgcctacactatgtcacttggtgcagaaaattcagttgcttactctaataactctattgccatacccacaaattttactattagtgttaccacagaaattctaccagtgtctatgaccaagacatcagtagattgtacaatgtacatttgtggtgattcaactgaatgcagcaatcttttgttgcaatatggcagtttttgtacacaattaaaccgtgctttaactggaatagctgttgaacaagacaaaaacacccaagaagtttttgcacaagtcaaacaaatttacaaaacaccaccaattaaagattttggtggttttaatttttcacaaatattaccagatccatcaaaaccaagcaagaggtcatttattgaagatctacttttcaacaaagtgacacttgcagatgctggcttcatcaaacaatatggtgattgccttggtgatattgctgctagagacctcatttgtgcacaaaagtttaacggccttactgttttgccacctttgctcacagatgaaatgattgctcaatacacttctgcactgttagcgggtacaatcacttctggttggacctttggtgcaggtgctgcattacaaataccatttgctatgcaaatggcttataggtttaatggtattggagttacacagaatgttctctatgagaaccaaaaattgattgccaaccaatttaatagtgctattggcaaaattcaagactcactttcttccacagcaagtgcacttggaaaacttcaagatgtggtcaaccaaaatgcacaagctttaaacacgcttgttaaacaacttagctccaattttggtgcaatttcaagtgttttaaatgatatcctttcacgtcttgacaaagttgaggctgaagtgcaaattgataggttgatcacaggcagacttcaaagtttgcagacatatgtgactcaacaattaattagagctgcagaaatcagagcttctgctaatcttgctgctactaaaatgtcagagtgtgtacttggacaatcaaaaagagttgatttttgtggaaagggctatcatcttatgtccttccctcagtcagcacctcatggtgtagtcttcttgcatgtgacttatgtccctgcacaagaaaagaacttcacaactgctcctgccatttgtcatgatggaaaagcacactttcctcgtgaaggtgtctttgtttcaaatggcacacactggtttgtaacacaaaggaatttttatgaaccacaaatcattactacagacaacacatttgtgtctggtaactgtgatgttgtaataggaattgtcaacaacacagtttatgatcctttgcaacctgaattagactcattcaaggaggagttagataaatattttaagaatcatacatcaccagatgttgatttaggtgacatctctggcattaatgcttcagttgtaaacattcaaaaagaaattgaccgcctcaatgaggttgccaagaatttaaatgaatctctcatcgatctccaagaacttggaaagtatgagcagtatataaaatggccatggtacatttggctaggttttatagctggcttgattgccatagtaatggtgacaattatgctttgctgtatgaccagttgctgtagttgtctcaagggctgttgttcttgtggatcctgctgcaaatttgatgaagacgactctgagccagtgctcaaaggagtcaaattacattacacataa
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13 ORF1 atgtttgtttttcttgttttattgccactagtctctagtcagtgtgttaatcttacaaccagaactcaattaccccctgcatacactaattctttcacacgtggtgtttattaccctgacaaagttttcagatcctcagttttacattcaactcaggacttgttcttacctttcttttccaatgttacttggttccatgctatacatgtctctgggaccaatggtactaagaggtttgataaccctgtcctaccatttaatgatggtgtttattttgcttccactgagaagtctaacataataagaggctggatttttggtactactttagattcgaagacccagtccctacttattgttaataacgctactaatgttgttattaaagtctgtgaatttcaattttgtaatgatccatttttgggtgtttattaccacaaaaacaacaaaagttggatggaaagtgagttcagagtttattctagtgcgaataattgcacttttgaatatgtctctcagccttttcttatggaccttgaaggaaaacagggtaatttcaaaaatcttagggaatttgtgtttaagaatattgatggttattttaaaatatattctaagcacacgcctattaatttagtgcgtgatctccctcagggtttttcggctttagaaccattggtagatttgccaataggtattaacatcactaggtttcaaactttacttgctttacatagaagttatttgactcctggtgattcttcttcaggttggacagctggtgctgcagcttattatgtgggttatcttcaacctaggacttttctattaaaatataatgaaaatggaaccattacagatgctgtagactgtgcacttgaccctctctcagaaacaaagtgtacgttgaaatccttcactgtagaaaaaggaatctatcaaacttctaactttagagtccaaccaacagaatctattgttagatttcctaatattacaaacttgtgcccttttggtgaagtttttaacgccaccagatttgcatctgtttatgcttggaacaggaagagaatcagcaactgtgttgctgattattctgtcctatataattccgcatcattttccacttttaagtgttatggagtgtctcctactaaattaaatgatctctgctttactaatgtctatgcagattcatttgtaattagaggtgatgaagtcagacaaatcgctccagggcaaactggaaagattgctgattataattataaattaccagatgattttacaggctgcgttatagcttggaattctaacaatcttgattctaaggttggtggtaattataattacctgtatagattgtttaggaagtctaatctcaaaccttttgagagagatatttcaactgaaatctatcaggccggtagcacaccttgtaatggtgttgaaggttttaattgttactttcctttacaatcatatggtttccaacccactaatggtgttggttaccaaccatacagagtagtagtactttcttttgaacttctacatgcaccagcaactgtttgtggacctaaaaagtctactaatttggttaaaaacaaatgtgtcaatttcaacttcaatggtttaacaggcacaggtgttcttactgagtctaacaaaaagtttctgcctttccaacaatttggcagagacattgctgacactactgatgctgtccgtgatccacagacacttgagattcttgacattacaccatgttcttttggtggtgtcagtgttataacaccaggaacaaatacttctaaccaggttgctgttctttatcaggatgttaactgcacagaagtccctgttgctattcatgcagatcaacttactcctacttggcgtgtttattctacaggttctaatgtttttcaaacacgtgcaggctgtttaataggggctgaacatgtcaacaactcatatgagtgtgacatacccattggtgcaggtatatgcgctagttatcagactcagactaattctcctggcagcgccagcagtgtagctagtcaatccatcattgcctacactatgtcacttggtgcagaaaattcagttgcttactctaataactctattgccatacccacaaattttactattagtgttaccacagaaattctaccagtgtctatgaccaagacatcagtagattgtacaatgtacatttgtggtgattcaactgaatgcagcaatcttttgttgcaatatggcagtttttgtacacaattaaaccgtgctttaactggaatagctgttgaacaagacaaaaacacccaagaagtttttgcacaagtcaaacaaatttacaaaacaccaccaattaaagattttggtggttttaatttttcacaaatattaccagatccatcaaaaccaagcaagaggtcatttattgaagatctacttttcaacaaagtgacacttgcagatgctggcttcatcaaacaatatggtgattgccttggtgatattgctgctagggacctcatttgtgcacaaaagtttaacggccttactgttttgccacctttgctcacagatgaaatgattgctcaatacacttctgcactgttagcgggtacaatcacttctggttggacctttggtgcaggtgctgcattacaaataccatttgctatgcaaatggcttataggtttaatggtattggagttacacagaatgttctctatgagaaccaaaaattgattgccaaccaatttaatagtgctattggcaaaattcaagactcactttcttccacagcaagtgcacttggaaaacttcaagatgtggtcaaccaaaatgcacaagctttaaacacgcttgttaaacaacttagctccaattttggtgcaatttcaagtgttttaaatgatatcctttcacgtcttgaccctcccgaggctgaagtgcaaattgataggttgatcacaggcagacttcaaagtttgcagacatatgtgactcaacaattaattagagctgcagaaatcagagcttctgctaatcttgctgctactaaaatgtcagagtgtgtacttggacaatcaaaaagagttgatttttgtggaaagggctatcatcttatgtccttccctcagtcagcacctcatggtgtagtcttcttgcatgtgacttatgtccctgcacaagaaaagaacttcacaactgctcctgccatttgtcatgatggaaaagcacactttcctcgtgaaggtgtctttgtttcaaatggcacacactggtttgtaacacaaaggaatttttatgaaccacaaatcattactacagacaacacatttgtgtctggtaactgtgatgttgtaataggaattgtcaacaacacagtttatgatcctttgcaacctgaattagactcattcaaggaggagttagataaatattttaagaatcatacatcaccagatgttgatttaggtgacatctctggcattaatgcttcagttgtaaacattcaaaaagaaattgaccgcctcaatgaggttgccaagaatttaaatgaatctctcatcgatctccaagaacttggaaagtatgagcagGGGTATATCCCTGAAGCCCCCAGGGACGGCCAGGCTTACGTCAGAAAGGATGGAGAGTGGGTGCTCTTGAGCACCTTCCTGTAA
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16 p5 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17 ORF5 atgtttgtttttcttgttttattgccactagtctctagtcagtgtgttaatcttacaaccagaactcaattaccccctgcatacactaattctttcacacgtggtgtttattaccctgacaaagttttcagatcctcagttttacattcaactcaggacttgttcttacctttcttttccaatgttacttggttccatgctatacatgtctctgggaccaatggtactaagaggtttgataaccctgtcctaccatttaatgatggtgtttattttgcttccactgagaagtctaacataataagaggctggatttttggtactactttagattcgaagacccagtccctacttattgttaataacgctactaatgttgttattaaagtctgtgaatttcaattttgtaatgatccatttttgggtgtttattaccacaaaaacaacaaaagttggatggaaagtgagttcagagtttattctagtgcgaataattgcacttttgaatatgtctctcagccttttcttatggaccttgaaggaaaacagggtaatttcaaaaatcttagggaatttgtgtttaagaatattgatggttattttaaaatatattctaagcacacgcctattaatttagtgcgtgatctccctcagggtttttcggctttagaaccattggtagatttgccaataggtattaacatcactaggtttcaaactttacttgctttacatagaagttatttgactcctggtgattcttcttcaggttggacagctggtgctgcagcttattatgtgggttatcttcaacctaggacttttctattaaaatataatgaaaatggaaccattacagatgctgtagactgtgcacttgaccctctctcagaaacaaagtgtacgttgaaatccttcactgtagaaaaaggaatctatcaaacttctaactttagagtccaaccaacagaatctattgttagatttcctaatattacaaacttgtgcccttttggtgaagtttttaacgccaccagatttgcatctgtttatgcttggaacaggaagagaatcagcaactgtgttgctgattattctgtcctatataattccgcatcattttccacttttaagtgttatggagtgtctcctactaaattaaatgatctctgctttactaatgtctatgcagattcatttgtaattagaggtgatgaagtcagacaaatcgctccagggcaaactggaaagattgctgattataattataaattaccagatgattttacaggctgcgttatagcttggaattctaacaatcttgattctaaggttggtggtaattataattacctgtatagattgtttaggaagtctaatctcaaaccttttgagagagatatttcaactgaaatctatcaggccggtagcacaccttgtaatggtgttgaaggttttaattgttactttcctttacaatcatatggtttccaacccactaatggtgttggttaccaaccatacagagtagtagtactttcttttgaacttctacatgcaccagcaactgtttgtggacctaaaaagtctactaatttggttaaaaacaaatgtgtcaatttcaacttcaatggtttaacaggcacaggtgttcttactgagtctaacaaaaagtttctgcctttccaacaatttggcagagacattgctgacactactgatgctgtccgtgatccacagacacttgagattcttgacattacaccatgttcttttggtggtgtcagtgttataacaccaggaacaaatacttctaaccaggttgctgttctttatcaggatgttaactgcacagaagtccctgttgctattcatgcagatcaacttactcctacttggcgtgtttattctacaggttctaatgtttttcaaacacgtgcaggctgtttaataggggctgaacatgtcaacaactcatatgagtgtgacatacccattggtgcaggtatatgcgctagttatcagactcagactaattctcctggcagcgccagcagtgtagctagtcaatccatcattgcctacactatgtcacttggtgcagaaaattcagttgcttactctaataactctattgccatacccacaaattttactattagtgttaccacagaaattctaccagtgtctatgaccaagacatcagtagattgtacaatgtacatttgtggtgattcaactgaatgcagcaatcttttgttgcaatatggcagtttttgtacacaattaaaccgtgctttaactggaatagctgttgaacaagacaaaaacacccaagaagtttttgcacaagtcaaacaaatttacaaaacaccaccaattaaagattttggtggttttaatttttcacaaatattaccagatccatcaaaaccaagcaagaggtcatttattgaagatctacttttcaacaaagtgacacttgcagatgctggcttcatcaaacaatatggtgattgccttggtgatattgctgctagggacctcatttgtgcacaaaagtttaacggccttactgttttgccacctttgctcacagatgaaatgattgctcaatacacttctgcactgttagcgggtacaatcacttctggttggacctttggtgcaggtgctgcattacaaataccatttgctatgcaaatggcttataggtttaatggtattggagttacacagaatgttctctatgagaaccaaaaattgattgccaaccaatttaatagtgctattggcaaaattcaagactcactttcttccacagcaagtgcacttggaaaacttcaagatgtggtcaaccaaaatgcacaagctttaaacacgcttgttaaacaacttagctccaattttggtgcaatttcaagtgttttaaatgatatcctttcacgtcttgaccctcccgaggctgaagtgcaaattgataggttgatcacaggcagacttcaaagtttgcagacatatgtgactcaacaattaattagagctgcagaaatcagagcttctgctaatcttgctgctactaaaatgtcagagtgtgtacttggacaatcaaaaagagttgatttttgtggaaagggctatcatcttatgtccttccctcagtcagcacctcatggtgtagtcttcttgcatgtgacttatgtccctgcacaagaaaagaacttcacaactgctcctgccatttgtcatgatggaaaagcacactttcctcgtgaaggtgtctttgtttcaaatggcacacactggtttgtaacacaaaggaatttttatgaaccacaaatcattactacagacaacacatttgtgtctggtaactgtgatgttgtaataggaattgtcaacaacacagtttatgatcctttgcaacctgaattagactcattcaaggaggagttagataaatattttaagaatcatacatcaccagatgttgatttaggtgacatctctggcattaatgcttcagttgtaaacattcaaaaagaaattgaccgcctcaatgaggttgccaagaatttaaatgaatctctcatcgatctccaagaacttggaaagtatgagcagtatataaaatggccatggtacatttggctaggttttatagctggcttgattgccatagtaatggtgacaattatgctttgctgtTAA
18 P7 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19 ORF7 atgtttgtttttcttgttttattgccactagtctctagtcagtgtgttaatcttacaaccagaactcaattaccccctgcatacactaattctttcacacgtggtgtttattaccctgacaaagttttcagatcctcagttttacattcaactcaggatttgttcttacctttcttttccaatgttacttggttccatgctatacatgtctctgggaccaatggtactaagaggtttgataaccctgtcctaccatttaatgatggtgtttattttgcttccactgagaagtctaacataataagaggctggatctttggtactactttagattcgaagacccagtccctacttattgttaataacgctactaatgttgttattaaagtctgtgaatttcaattttgtaatgatccatttttgggtgtttattaccacaaaaacaacaaaagttggatggaaagtgagttcagagtttattctagtgcgaataattgcacttttgaatatgtctctcagccttttcttatggaccttgaaggaaaacagggtaatttcaaaaatcttagggaatttgtgtttaagaatattgatggttattttaaaatatattctaagcacacgcctattaatttagtgcgtgatctccctcagggtttttcggctttagaaccattggtagatttgccaataggtattaacatcactaggtttcaaactttacttgctttacatagaagttatttgactcctggtgattcttcttcaggttggacagctggtgctgcagcttattatgtgggttatcttcaacctaggacttttctattaaaatataatgaaaatggaaccattacagatgctgtagactgtgcacttgaccctctctcagaaacaaagtgtacgttgaaatccttcactgtagaaaaaggaatctatcaaacttctaactttagagtccaaccaacagaatctattgttagatttcctaatattacaaacttgtgcccttttggtgaagtttttaacgccaccagatttgcatctgtttatgcttggaacaggaagagaatcagcaactgtgttgctgattattctgtcctatataattccgcatcattttccacttttaagtgttatggagtgtctcctactaaattaaatgatctctgctttactaatgtctatgcagattcatttgtaattagaggtgatgaagtcagacaaatcgctccagggcaaactggaaagattgctgattataattataaattaccagatgattttacaggctgcgttatagcttggaattctaacaatcttgattctaaggttggtggtaattataattacctgtatagattgtttaggaagtctaatctcaaaccttttgagagagatatttcaactgaaatctatcaggccggtagcacaccttgtaatggtgttgaaggttttaattgttactttcctttacaatcatatggtttccaacccactaatggtgttggttaccaaccatacagagtagtagtactttcttttgaacttctacatgcaccagcaactgtttgtggacctaaaaagtctactaatttggttaaaaacaaatgtgtcaatttcaacttcaatggtttaacaggcacaggtgttcttactgagtctaacaaaaagtttctgcctttccaacaatttggcagagacattgctgacactactgatgctgtccgtgatccacagacacttgagattcttgacattacaccatgttcttttggtggtgtcagtgttataacaccaggaacaaatacttctaaccaggttgctgttctttatcaggatgttaactgcacagaagtccctgttgctattcatgcagatcaacttactcctacttggcgtgtttattctacaggttctaatgtttttcaaacacgtgcaggctgtttaataggggctgaacatgtcaacaactcatatgagtgtgacatacccattggtgcaggtatatgcgctagttatcagactcagactaattctcctggcagcgccagcagtgtagctagtcaatccatcattgcctacactatgtcacttggtgcagaaaattcagttgcttactctaataactctattgccatacccacaaattttactattagtgttaccacagaaattctaccagtgtctatgaccaagacatcagtagattgtacaatgtacatttgtggtgattcaactgaatgcagcaatcttttgttgcaatatggcagtttttgtacacaattaaaccgtgctttaactgggatagctgttgaacaagacaaaaacacccaagaagtttttgcacaagtcaaacaaatttacaaaacaccaccaattaaagattttggtggttttaatttttcacaaatattaccagatccatcaaaaccaagcaagaggtcatttattgaagatctacttttcaacaaagtgacacttgcagatgctggcttcatcaaacaatatggtgattgccttggtgatattgctgctagggacctcatttgtgcacaaaagtttaacggccttactgttttgccacctttgctcacagatgaaatgattgctcaatacacttctgcactgttagcgggtacaatcacttctggttggacctttggtgcaggtgctgcattacaaataccatttgctatgcaaatggcttataggtttaatggtattggagttacacagaatgttctctatgagaaccaaaaattgattgccaaccaatttaatagtgccattggcaaaattcaagactcactttcttccacagcaagtgcacttggaaaacttcaagatgtggtcaaccaaaatgcacaagctttaaacacgcttgttaaacaacttagctccaattttggtgcaatttcaagtgttttaaatgatatcctttcacgtcttgaccctcccgaggctgaagtgcaaattgataggttgatcacaggcagacttcaaagtttgcagacatatgtgactcaacaattaattagagctgcagaaatcagagcttctgctaatcttgctgctactaaaatgtcagagtgtgtacttggacaatcaaaaagagttgatttttgtggaaagggctatcatcttatgtccttccctcagtcagcacctcatggtgtagtcttcttgcatgtgacttatgtccctgcacaagaaaagaacttcacaactgctcctgccatttgtcatgatggaaaagcacactttcctcgtgaaggtgtctttgtttcaaatggcacacactggtttgtaacacaaaggaatttttatgaaccacaaatcattactacagacaacacatttgtgtctggtaactgtgatgttgtaataggaattgtcaacaacacagtttatgatcctttgcaacctgaattagactcattcaaggaggagttagataaatattttaagaatcatacatcaccagatgttgatttaggtgacatctctggcattaatgcttcagttgtaaacattcaaaaagaaattgaccgcctcaatgaggttgccaagaatttaaatgaatctctcatcgatctccaagaacttggaaagtatgagcagGGGTATATCCCTGAAGCCCCCAGGGACGGCCAGGCTTACGTCAGAAAGGATGGAGAGTGGGTGCTCTTGAGCACCTTCCTGTAA
20 P9 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21 ORF9 atgtttgtttttcttgttttattgccactagtctctagtcagtgtgttaatcttacaaccagaactcaattaccccctgcatacactaattctttcacacgtggtgtttattaccctgacaaagttttcagatcctcagttttacattcaactcaggatttgttcttacctttcttttccaatgttacttggttccatgctatacatgtctctgggaccaatggtactaagaggtttgataaccctgtcctaccatttaatgatggtgtttattttgcttccactgagaagtctaacataataagaggctggatctttggtactactttagattcgaagacccagtccctacttattgttaataacgctactaatgttgttattaaagtctgtgaatttcaattttgtaatgatccatttttgggtgtttattaccacaaaaacaacaaaagttggatggaaagtgagttcagagtttattctagtgcgaataattgcacttttgaatatgtctctcagccttttcttatggaccttgaaggaaaacagggtaatttcaaaaatcttagggaatttgtgtttaagaatattgatggttattttaaaatatattctaagcacacgcctattaatttagtgcgtgatctccctcagggtttttcggctttagaaccattggtagatttgccaataggtattaacatcactaggtttcaaactttacttgctttacatagaagttatttgactcctggtgattcttcttcaggttggacagctggtgctgcagcttattatgtgggttatcttcaacctaggacttttctattaaaatataatgaaaatggaaccattacagatgctgtagactgtgcacttgaccctctctcagaaacaaagtgtacgttgaaatccttcactgtagaaaaaggaatctatcaaacttctaactttagagtccaaccaacagaatctattgttagatttcctaatattacaaacttgtgcccttttggtgaagtttttaacgccaccagatttgcatctgtttatgcttggaacaggaagagaatcagcaactgtgttgctgattattctgtcctatataattccgcatcattttccacttttaagtgttatggagtgtctcctactaaattaaatgatctctgctttactaatgtctatgcagattcatttgtaattagaggtgatgaagtcagacaaatcgctccagggcaaactggaaagattgctgattataattataaattaccagatgattttacaggctgcgttatagcttggaattctaacaatcttgattctaaggttggtggtaattataattacctgtatagattgtttaggaagtctaatctcaaaccttttgagagagatatttcaactgaaatctatcaggccggtagcacaccttgtaatggtgttgaaggttttaattgttactttcctttacaatcatatggtttccaacccactaatggtgttggttaccaaccatacagagtagtagtactttcttttgaacttctacatgcaccagcaactgtttgtggacctaaaaagtctactaatttggttaaaaacaaatgtgtcaatttcaacttcaatggtttaacaggcacaggtgttcttactgagtctaacaaaaagtttctgcctttccaacaatttggcagagacattgctgacactactgatgctgtccgtgatccacagacacttgagattcttgacattacaccatgttcttttggtggtgtcagtgttataacaccaggaacaaatacttctaaccaggttgctgttctttatcaggatgttaactgcacagaagtccctgttgctattcatgcagatcaacttactcctacttggcgtgtttattctacaggttctaatgtttttcaaacacgtgcaggctgtttaataggggctgaacatgtcaacaactcatatgagtgtgacatacccattggtgcaggtatatgcgctagttatcagactcagactaattctcctggcagcgccagcagtgtagctagtcaatccatcattgcctacactatgtcacttggtgcagaaaattcagttgcttactctaataactctattgccatacccacaaattttactattagtgttaccacagaaattctaccagtgtctatgaccaagacatcagtagattgtacaatgtacatttgtggtgattcaactgaatgcagcaatcttttgttgcaatatggcagtttttgtacacaattaaaccgtgctttaactgggatagctgttgaacaagacaaaaacacccaagaagtttttgcacaagtcaaacaaatttacaaaacaccaccaattaaagattttggtggttttaatttttcacaaatattaccagatccatcaaaaccaagcaagaggtcatttattgaagatctacttttcaacaaagtgacacttgcagatgctggcttcatcaaacaatatggtgattgccttggtgatattgctgctagggacctcatttgtgcacaaaagtttaacggccttactgttttgccacctttgctcacagatgaaatgattgctcaatacacttctgcactgttagcgggtacaatcacttctggttggacctttggtgcaggtgctgcattacaaataccatttgctatgcaaatggcttataggtttaatggtattggagttacacagaatgttctctatgagaaccaaaaattgattgccaaccaatttaatagtgccattggcaaaattcaagactcactttcttccacagcaagtgcacttggaaaacttcaagatgtggtcaaccaaaatgcacaagctttaaacacgcttgttaaacaacttagctccaattttggtgcaatttcaagtgttttaaatgatatcctttcacgtcttgaccctcccgaggctgaagtgcaaattgataggttgatcacaggcagacttcaaagtttgcagacatatgtgactcaacaattaattagagctgcagaaatcagagcttctgctaatcttgctgctactaaaatgtcagagtgtgtacttggacaatcaaaaagagttgatttttgtggaaagggctatcatcttatgtccttccctcagtcagcacctcatggtgtagtcttcttgcatgtgacttatgtccctgcacaagaaaagaacttcacaactgctcctgccatttgtcatgatggaaaagcacactttcctcgtgaaggtgtctttgtttcaaatggcacacactggtttgtaacacaaaggaatttttatgaaccacaaatcattactacagacaacacatttgtgtctggtaactgtgatgttgtaataggaattgtcaacaacacagtttatgatcctttgcaacctgaattagactcattcaaggaggagttagataaatattttaagaatcatacatcaccagatgttgatttaggtgacatctctggcattaatgcttcagttgtaaacattcaaaaagaaattgaccgcctcaatgaggttgccaagaatttaaatgaatctctcatcgatctccaagaacttggaaagtatgagcagtatataaaatggccatggtacatttggctaggttttatagctggcttgattgccatagtaatggtgacaattatgctttgctgtatgaccagttgctgtagttgtctcaagggctgttgttcttgtggatcctgctgcaaatttgatgaagacgactctgagccagtgctcaaaggagtcaaattacattacacaTAA
22 P11 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23 ORF11 atgtttgtttttcttgttttattgccactagtctctagtcagtgtgttaatcttacaaccagaactcaattaccccctgcatacactaattctttcacacgtggtgtttattaccctgacaaagttttcagatcctcagttttacattcaactcaggatttgttcttacctttcttttccaatgttacttggttccatgctatacatgtctctgggaccaatggtactaagaggtttgataaccctgtcctaccatttaatgatggtgtttattttgcttccactgagaagtctaacataataagaggctggatctttggtactactttagattcgaagacccagtccctacttattgttaataacgctactaatgttgttattaaagtctgtgaatttcaattttgtaatgatccatttttgggtgtttattaccacaaaaacaacaaaagttggatggaaagtgagttcagagtttattctagtgcgaataattgcacttttgaatatgtctctcagccttttcttatggaccttgaaggaaaacagggtaatttcaaaaatcttagggaatttgtgtttaagaatattgatggttattttaaaatatattctaagcacacgcctattaatttagtgcgtgatctccctcagggtttttcggctttagaaccattggtagatttgccaataggtattaacatcactaggtttcaaactttacttgctttacatagaagttatttgactcctggtgattcttcttcaggttggacagctggtgctgcagcttattatgtgggttatcttcaacctaggacttttctattaaaatataatgaaaatggaaccattacagatgctgtagactgtgcacttgaccctctctcagaaacaaagtgtacgttgaaatccttcactgtagaaaaaggaatctatcaaacttctaactttagagtccaaccaacagaatctattgttagatttcctaatattacaaacttgtgcccttttggtgaagtttttaacgccaccagatttgcatctgtttatgcttggaacaggaagagaatcagcaactgtgttgctgattattctgtcctatataattccgcatcattttccacttttaagtgttatggagtgtctcctactaaattaaatgatctctgctttactaatgtctatgcagattcatttgtaattagaggtgatgaagtcagacaaatcgctccagggcaaactggaaagattgctgattataattataaattaccagatgattttacaggctgcgttatagcttggaattctaacaatcttgattctaaggttggtggtaattataattacctgtatagattgtttaggaagtctaatctcaaaccttttgagagagatatttcaactgaaatctatcaggccggtagcacaccttgtaatggtgttgaaggttttaattgttactttcctttacaatcatatggtttccaacccactaatggtgttggttaccaaccatacagagtagtagtactttcttttgaacttctacatgcaccagcaactgtttgtggacctaaaaagtctactaatttggttaaaaacaaatgtgtcaatttcaacttcaatggtttaacaggcacaggtgttcttactgagtctaacaaaaagtttctgcctttccaacaatttggcagagacattgctgacactactgatgctgtccgtgatccacagacacttgagattcttgacattacaccatgttcttttggtggtgtcagtgttataacaccaggaacaaatacttctaaccaggttgctgttctttatcaggatgttaactgcacagaagtccctgttgctattcatgcagatcaacttactcctacttggcgtgtttattctacaggttctaatgtttttcaaacacgtgcaggctgtttaataggggctgaacatgtcaacaactcatatgagtgtgacatacccattggtgcaggtatatgcgctagttatcagactcagactaattctcctggcagcgccagcagtgtagctagtcaatccatcattgcctacactatgtcacttggtgcagaaaattcagttgcttactctaataactctattgccatacccacaaattttactattagtgttaccacagaaattctaccagtgtctatgaccaagacatcagtagattgtacaatgtacatttgtggtgattcaactgaatgcagcaatcttttgttgcaatatggcagtttttgtacacaattaaaccgtgctttaactgggatagctgttgaacaagacaaaaacacccaagaagtttttgcacaagtcaaacaaatttacaaaacaccaccaattaaagattttggtggttttaatttttcacaaatattaccagatccatcaaaaccaagcaagaggtcatttattgaagatctacttttcaacaaagtgacacttgcagatgctggcttcatcaaacaatatggtgattgccttggtgatattgctgctagggacctcatttgtgcacaaaagtttaacggccttactgttttgccacctttgctcacagatgaaatgattgctcaatacacttctgcactgttagcgggtacaatcacttctggttggacctttggtgcaggtgctgcattacaaataccatttgctatgcaaatggcttataggtttaatggtattggagttacacagaatgttctctatgagaaccaaaaattgattgccaaccaatttaatagtgccattggcaaaattcaagactcactttcttccacagcaagtgcacttggaaaacttcaagatgtggtcaaccaaaatgcacaagctttaaacacgcttgttaaacaacttagctccaattttggtgcaatttcaagtgttttaaatgatatcctttcacgtcttgaccctcccgaggctgaagtgcaaattgataggttgatcacaggcagacttcaaagtttgcagacatatgtgactcaacaattaattagagctgcagaaatcagagcttctgctaatcttgctgctactaaaatgtcagagtgtgtacttggacaatcaaaaagagttgatttttgtggaaagggctatcatcttatgtccttccctcagtcagcacctcatggtgtagtcttcttgcatgtgacttatgtccctgcacaagaaaagaacttcacaactgctcctgccatttgtcatgatggaaaagcacactttcctcgtgaaggtgtctttgtttcaaatggcacacactggtttgtaacacaaaggaatttttatgaaccacaaatcattactacagacaacacatttgtgtctggtaactgtgatgttgtaataggaattgtcaacaacacagtttatgatcctttgcaacctgaattagactcattcaaggaggagttagataaatattttaagaatcatacatcaccagatgttgatttaggtgacatctctggcattaatgcttcagttgtaaacattcaaaaagaaattgaccgcctcaatgaggttgccaagaatttaaatgaatctctcatcgatctccaagaacttggaaagtatgagcagtatataaaatggccatggtacatttggctaggttttatagctggcttgattgccatagtaatggtgacaattatgctttgctgtTAA
24 P13 AGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTATTAGAAAAATTCATCCAGCAGACGATAAAACGCAATACGCTGGCTATCCGGTGCCGCAATGCCATACAGCACCAGAAAACGATCCGCCCATTCGCCGCCCAGTTCTTCCGCAATATCACGGGTGGCCAGCGCAATATCCTGATAACGATCCGCCACGCCCAGACGGCCGCAATCAATAAAGCCGCTAAAACGGCCATTTTCCACCATAATGTTCGGCAGGCACGCATCACCATGGGTCACCACCAGATCTTCGCCATCCGGCATGCTCGCTTTCAGACGCGCAAACAGCTCTGCCGGTGCCAGGCCCTGATGTTCTTCATCCAGATCATCCTGATCCACCAGGCCCGCTTCCATACGGGTACGCGCACGTTCAATACGATGTTTCGCCTGATGATCAAACGGACAGGTCGCCGGGTCCAGGGTATGCAGACGACGCATGGCATCCGCCATAATGCTCACTTTTTCTGCCGGCGCCAGATGGCTAGACAGCAGATCCTGACCCGGCACTTCGCCCAGCAGCAGCCAATCACGGCCCGCTTCGGTCACCACATCCAGCACCGCCGCACACGGAACACCGGTGGTGGCCAGCCAGCTCAGACGCGCCGCTTCATCCTGCAGCTCGTTCAGCGCACCGCTCAGATCGGTTTTCACAAACAGCACCGGACGACCCTGCGCGCTCAGACGAAACACCGCCGCATCAGAGCAGCCAATGGTCTGCTGCGCCCAATCATAGCCAAACAGACGTTCCACCCACGCTGCCGGGCTACCCGCATGCAGGCCATCCTGTTCAATCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGGCCGCTACAGGGCGCTCCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGTTTCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAGCGCGACGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGAAGGAAGGCCGTCAAGGCCGCATGGGAAGCCCTCGACCGTCGATTGTCCACTGGTCAACAATAGATGACTTACAACTAATCGGAAGGTGCAGAGACTCGACGGGAGCTACCCTAACGTCAAGACGAGGGTAAAGAGAGAGTCCAATTCTCAAAGCCAATAGGCAGTAGCGAAAGCTGCAAGAGAATGAAAATCCGTTGACCTTAAACGGTCGTGTGGGTTCAAGTCCCTCCACCCCCACGCCGGAAACGCAATAGCCGAAAAACAAAAAACAAAAAAAACAAAAAAAAAACCAAAAAAACAAAACACAacgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataataGCCACCatgtttgtttttcttgttttattgccactagtctctagtcagtgtagagtccaaccaacagaatctattgttagatttcctaatattacaaacttgtgcccttttggtgaagtttttaacgccaccagatttgcatctgtttatgcttggaacaggaagagaatcagcaactgtgttgctgattattctgtcctatataattccgcatcattttccacttttaagtgttatggagtgtctcctactaaattaaatgatctctgctttactaatgtctatgcagattcatttgtaattagaggtgatgaagtcagacaaatcgctccagggcaaactggaaagattgctgattataattataaattaccagatgattttacaggctgcgttatagcttggaattctaacaatcttgattctaaggttggtggtaattataattacctgtatagattgtttaggaagtctaatctcaaaccttttgagagagatatttcaactgaaatctatcaggccggtagcacaccttgtaatggtgttgaaggttttaattgttactttcctttacaatcatatggtttccaacccactaatggtgttggttaccaaccatacagagtagtagtactttcttttgaacttctacatgcaccagcaactgtttgtggacctaaaaagtctactaatttggttaaaaacaaatgtgtcaatttcTAAAAAAAACAAAAAACAAAACGGCTATTATGCGTTACCGGCGAGACGCTACGGACTTAAATAATTGAGCCTTAAAGAAGAAATTCTTTAAGTGGATGCTCTCAAACTCAGGGAAACCTAAATCTAGTTATAGACAAGGCAATCCTGAGCCAAGCCGAAGTAGTAATTAGTAAGACCAGTGGACAATCGACGGATAACAGCATATCTAGCTGGGCCTCATGGGCCTTCCTTTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAACATGGTCATAGCTGTTTCCTTGCGTATTGGGCGCTCTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATG
25 ORF13 atgtttgtttttcttgttttattgccactagtctctagtcagtgtagagtccaaccaacagaatctattgttagatttcctaatattacaaacttgtgcccttttggtgaagtttttaacgccaccagatttgcatctgtttatgcttggaacaggaagagaatcagcaactgtgttgctgattattctgtcctatataattccgcatcattttccacttttaagtgttatggagtgtctcctactaaattaaatgatctctgctttactaatgtctatgcagattcatttgtaattagaggtgatgaagtcagacaaatcgctccagggcaaactggaaagattgctgattataattataaattaccagatgattttacaggctgcgttatagcttggaattctaacaatcttgattctaaggttggtggtaattataattacctgtatagattgtttaggaagtctaatctcaaaccttttgagagagatatttcaactgaaatctatcaggccggtagcacaccttgtaatggtgttgaaggttttaattgttactttcctttacaatcatatggtttccaacccactaatggtgttggttaccaaccatacagagtagtagtactttcttttgaacttctacatgcaccagcaactgtttgtggacctaaaaagtctactaatttggttaaaaacaaatgtgtcaatttcTAA
26 ORF33 atgtttgtttttcttgttttattgccactagtctctagtcagtgtagagtccaaccaacagaatctattgttagatttcctaatattacaaacttgtgcccttttggtgaagtttttaacgccaccagatttgcatccgtgtatgcttggaacaggaagagaatcagcaactgtgttgctgattattctgtcctatataattccgcatcattttccacttttaagtgttatggagtgtctcctactaaattaaatgatctctgctttactaatgtctatgcagattcatttgtaattagaggtgatgaagtcagacaaatcgctccagggcaaactggaaagattgctgattataattataaattaccagatgattttacaggctgcgttatagcttggaattctaacaatcttgattctaaggttggtggtaattataattacctgtatagattgtttaggaagtctaatctcaaaccttttgagagagatatttcaactgaaatctatcaggccggtagcacaccttgtaatggtgttgaaggttttaattgttactttcctttacaatcatatggtttccaacccactaatggtgttggttaccaaccatacagagtagtagtactttcttttgaacttctacatgcaccagcaactgtttgtggacctaaaaagtctactaatttggttaaaaacaaatgtgtcaatttcTAA
27 ORF35 atgtttgtttttcttgttttattgccactagtctctagtcagtgtgttaatcttacaaccagaactcaattaccccctgcatacactaattctttcacacgtggtgtttattaccctgacaaagttttcagatcctcagttttacattcaactcaggacttgttcttacctttcttttccaatgttacttggttccatgctatacatgtctctgggaccaatggtactaagaggtttgataaccctgtcctaccatttaatgatggtgtttattttgcttccactgagaagtctaacataataagaggctggatttttggtactactttagattcgaagacccagtccctacttattgttaataacgctactaatgttgttattaaagtctgtgaatttcaattttgtaatgatccatttttgggtgtttattaccacaaaaacaacaaaagttggatggaaagtgagttcagagtttattctagtgcgaataattgcacttttgaatatgtctctcagccttttcttatggaccttgaaggaaaacagggtaatttcaaaaatcttagggaatttgtgtttaagaatattgatggttattttaaaatatattctaagcacacgcctattaatttagtgcgtgatctccctcagggtttttcggctttagaaccattggtagatttgccaataggtattaacatcactaggtttcaaactttacttgctttacatagaagttatttgactcctggtgattcttcttcaggttggacagctggtgctgcagcttattatgtgggttatcttcaacctaggacttttctattaaaatataatgaaaatggaaccattacagatgctgtagactgtgcacttgaccctctctcagaaacaaagtgtacgttgaaatccttcactgtagaaaaaggaatctatcaaacttctaactttagagtccaaccaacagaatctattgttagatttcctaatattacaaacttgtgcccttttggtgaagtttttaacgccaccagatttgcatccgtgtatgcttggaacaggaagagaatcagcaactgtgttgctgattattctgtcctatataattccgcatcattttccacttttaagtgttatggagtgtctcctactaaattaaatgatctctgctttactaatgtctatgcagattcatttgtaattagaggtgatgaagtcagacaaatcgctccagggcaaactggaaagattgctgattataattataaattaccagatgattttacaggctgcgttatagcttggaattctaacaatcttgattctaaggttggtggtaattataattacctgtatagattgtttaggaagtctaatctcaaaccttttgagagagatatttcaactgaaatctatcaggccggtagcacaccttgtaatggtgttgaaggttttaattgttactttcctttacaatcatatggtttccaacccactaatggtgttggttaccaaccatacagagtagtagtactttcttttgaacttctacatgcaccagcaactgtttgtggacctaaaaagtctactaatttggttaaaaacaaatgtgtcaatttcaacttcaatggtttaacaggcacaggtgttcttactgagtctaacaaaaagtttctgcctttccaacaatttggcagagacattgctgacactactgatgctgtccgtgatccacagacacttgagattcttgacattacaccatgttcttttggtggtgtcagtgttataacaccaggaacaaatacttctaaccaggttgctgttctttatcaggatgttaactgcacagaagtccctgttgctattcatgcagatcaacttactcctacttggcgtgtttattctacaggttctaatgtttttcaaacacgtgcaggctgtttaataggggctgaacatgtcaacaactcatatgagtgtgacatacccattggtgcaggtatatgcgctagttatcagactcagactaattctcctggcagcgccagcagtgtagctagtcaatccatcattgcctacactatgtcacttggtgcagaaaattcagttgcttactctaataactctattgccatacccacaaattttactattagtgttaccacagaaattctaccagtgtctatgaccaagacatcagtagattgtacaatgtacatttgtggtgattcaactgaatgcagcaatcttttgttgcaatatggcagtttttgtacacaattaaaccgtgctttaactggaatagctgttgaacaagacaaaaacacccaagaagtttttgcacaagtcaaacaaatttacaaaacaccaccaattaaagattttggtggttttaatttttcacaaatattaccagatccatcaaaaccaagcaagaggtcatttattgaagatctacttttcaacaaagtgacacttgcagatgctggcttcatcaaacaatatggtgattgccttggtgatattgctgctagggacctcatttgtgcacaaaagtttaacggccttactgttttgccacctttgctcacagatgaaatgattgctcaatacacttctgcactgttagcgggtacaatcacttctggttggacctttggtgcaggtgctgcattacaaataccatttgctatgcaaatggcttataggtttaatggtattggagttacacagaatgttctctatgagaaccaaaaattgattgccaaccaatttaatagtgctattggcaaaattcaagactcactttcttccacagcaagtgcacttggaaaacttcaagatgtggtcaaccaaaatgcacaagctttaaacacgcttgttaaacaacttagctccaattttggtgcaatttcaagtgttttaaatgatatcctttcacgtcttgaccctcccgaggctgaagtgcaaattgataggttgatcacaggcagacttcaaagtttgcagacatatgtgactcaacaattaattagagctgcagaaatcagagcttctgctaatcttgctgctactaaaatgtcagagtgtgtacttggacaatcaaaaagagttgatttttgtggaaagggctatcatcttatgtccttccctcagtcagcacctcatggtgtagtcttcttgcatgtgacttatgtccctgcacaagaaaagaacttcacaactgctcctgccatttgtcatgatggaaaagcacactttcctcgtgaaggtgtctttgtttcaaatggcacacactggtttgtaacacaaaggaatttttatgaaccacaaatcattactacagacaacacatttgtgtctggtaactgtgatgttgtaataggaattgtcaacaacacagtttatgatcctttgcaacctgaattagactcattcaaggaggagttagataaatattttaagaatcatacatcaccagatgttgatttaggtgacatctctggcattaatgcttcagttgtaaacattcaaaaagaaattgaccgcctcaatgaggttgccaagaatttaaatgaatctctcatcgatctccaagaacttggaaagtatgagcagtatataaaatggccatggtacatttggctaggttttatagctggcttgattgccatagtaatggtgacaattatgctttgctgtatgaccagttgctgtagttgtctcaagggctgttgttcttgtggatcctgctgcaaatttgatgaagacgactctgagccagtgctcaaaggagtcaaattacattacacaTAA
28 ORF36 atgtttgtttttcttgttttattgccactagtctctagtcagtgtgttaatcttacaaccagaactcaattaccccctgcatacactaattctttcacacgtggtgtttattaccctgacaaagttttcagatcctcagttttacattcaactcaggatttgttcttacctttcttttccaatgttacttggttccatgctatacatgtctctgggaccaatggtactaagaggtttgataaccctgtcctaccatttaatgatggtgtttattttgcttccactgagaagtctaacataataagaggctggatctttggtactactttagattcgaagacccagtccctacttattgttaataacgctactaatgttgttattaaagtctgtgaatttcaattttgtaatgatccatttttgggtgtttattaccacaaaaacaacaaaagttggatggaaagtgagttcagagtttattctagtgcgaataattgcacttttgaatatgtctctcagccttttcttatggaccttgaaggaaaacagggtaatttcaaaaatcttagggaatttgtgtttaagaatattgatggttattttaaaatatattctaagcacacgcctattaatttagtgcgtgatctccctcagggtttttcggctttagaaccattggtagatttgccaataggtattaacatcactaggtttcaaactttacttgctttacatagaagttatttgactcctggtgattcttcttcaggttggacagctggtgctgcagcttattatgtgggttatcttcaacctaggacttttctattaaaatataatgaaaatggaaccattacagatgctgtagactgtgcacttgaccctctctcagaaacaaagtgtacgttgaaatccttcactgtagaaaaaggaatctatcaaacttctaactttagagtccaaccaacagaatctattgttagatttcctaatattacaaacttgtgcccttttggtgaagtttttaacgccaccagatttgcatccgtgtatgcttggaacaggaagagaatcagcaactgtgttgctgattattctgtcctatataattccgcatcattttccacttttaagtgttatggagtgtctcctactaaattaaatgatctctgctttactaatgtctatgcagattcatttgtaattagaggtgatgaagtcagacaaatcgctccagggcaaactggaaagattgctgattataattataaattaccagatgattttacaggctgcgttatagcttggaattctaacaatcttgattctaaggttggtggtaattataattacctgtatagattgtttaggaagtctaatctcaaaccttttgagagagatatttcaactgaaatctatcaggccggtagcacaccttgtaatggtgttgaaggttttaattgttactttcctttacaatcatatggtttccaacccactaatggtgttggttaccaaccatacagagtagtagtactttcttttgaacttctacatgcaccagcaactgtttgtggacctaaaaagtctactaatttggttaaaaacaaatgtgtcaatttcaacttcaatggtttaacaggcacaggtgttcttactgagtctaacaaaaagtttctgcctttccaacaatttggcagagacattgctgacactactgatgctgtccgtgatccacagacacttgagattcttgacattacaccatgttcttttggtggtgtcagtgttataacaccaggaacaaatacttctaaccaggttgctgttctttatcaggatgttaactgcacagaagtccctgttgctattcatgcagatcaacttactcctacttggcgtgtttattctacaggttctaatgtttttcaaacacgtgcaggctgtttaataggggctgaacatgtcaacaactcatatgagtgtgacatacccattggtgcaggtatatgcgctagttatcagactcagactaattctcctggcagcgccagcagtgtagctagtcaatccatcattgcctacactatgtcacttggtgcagaaaattcagttgcttactctaataactctattgccatacccacaaattttactattagtgttaccacagaaattctaccagtgtctatgaccaagacatcagtagattgtacaatgtacatttgtggtgattcaactgaatgcagcaatcttttgttgcaatatggcagtttttgtacacaattaaaccgtgctttaactgggatagctgttgaacaagacaaaaacacccaagaagtttttgcacaagtcaaacaaatttacaaaacaccaccaattaaagattttggtggttttaatttttcacaaatattaccagatccatcaaaaccaagcaagaggtcatttattgaagatctacttttcaacaaagtgacacttgcagatgctggcttcatcaaacaatatggtgattgccttggtgatattgctgctagggacctcatttgtgcacaaaagtttaacggccttactgttttgccacctttgctcacagatgaaatgattgctcaatacacttctgcactgttagcgggtacaatcacttctggttggacctttggtgcaggtgctgcattacaaataccatttgctatgcaaatggcttataggtttaatggtattggagttacacagaatgttctctatgagaaccaaaaattgattgccaaccaatttaatagtgccattggcaaaattcaagactcactttcttccacagcaagtgcacttggaaaacttcaagatgtggtcaaccaaaatgcacaagctttaaacacgcttgttaaacaacttagctccaattttggtgcaatttcaagtgttttaaatgatatcctttcacgtcttgaccctcccgaggctgaagtgcaaattgataggttgatcacaggcagacttcaaagtttgcagacatatgtgactcaacaattaattagagctgcagaaatcagagcttctgctaatcttgctgctactaaaatgtcagagtgtgtacttggacaatcaaaaagagttgatttttgtggaaagggctatcatcttatgtccttccctcagtcagcacctcatggtgtagtcttcttgcatgtgacttatgtccctgcacaagaaaagaacttcacaactgctcctgccatttgtcatgatggaaaagcacactttcctcgtgaaggtgtctttgtttcaaatggcacacactggtttgtaacacaaaggaatttttatgaaccacaaatcattactacagacaacacatttgtgtctggtaactgtgatgttgtaataggaattgtcaacaacacagtttatgatcctttgcaacctgaattagactcattcaaggaggagttagataaatattttaagaatcatacatcaccagatgttgatttaggtgacatctctggcattaatgcttcagttgtaaacattcaaaaagaaattgaccgcctcaatgaggttgccaagaatttaaatgaatctctcatcgatctccaagaacttggaaagtatgagcagtatataaaatggccatggtacatttggctaggttttatagctggcttgattgccatagtaatggtgacaattatgctttgctgtatgaccagttgctgtagttgtctcaagggctgttgttcttgtggatcctgctgcaaatttgatgaagacgactctgagccagtgctcaaaggagtcaaattacattacacaTAA
29 ORF39 ATGTTCGTTTTCCTTGTTTTACTGCCCCTCGTGTCTTCACAGTGTGTGAACCTCACCACTCGCACACAGCTACCTCCCGCGTACACTAATTCATTTACCAGGGGCGTCTATTATCCTGATAAGGTGTTCCGGAGTTCAGTGTTGCATAGCACTCAAGACCTGTTCCTGCCCTTCTTCTCCAATGTCACTTGGTTTCATGCGATACATGTGTCTGGTACCAACGGAACGAAGAGATTTGATAACCCCGTACTGCCATTCAATGATGGCGTATACTTTGCTTCGACTGAAAAATCCAACATCATCAGGGGCTGGATTTTTGGTACAACGCTTGATTCCAAGACCCAGTCCCTCCTTATTGTGAACAATGCGACCAACGTCGTGATAAAGGTCTGTGAGTTTCAGTTCTGCAATGACCCATTCCTTGGAGTGTATTATCACAAGAACAACAAATCGTGGATGGAGTCAGAGTTTAGGGTGTACAGCAGCGCTAACAACTGTACATTTGAGTATGTGAGTCAGCCGTTTCTGATGGATCTTGAGGGCAAACAGGGCAATTTTAAGAATCTCAGAGAATTTGTGTTCAAGAACATTGATGGTTACTTTAAGATCTATAGCAAACATACGCCAATCAACTTGGTTCGTGATCTGCCACAGGGATTTAGCGCACTGGAACCTCTCGTTGACTTGCCCATAGGTATTAACATCACCAGGTTCCAGACGCTCTTGGCATTACACCGTAGTTATCTGACCCCCGGGGACTCCAGTTCCGGATGGACTGCAGGAGCCGCTGCCTACTATGTGGGTTACCTCCAGCCCAGGACCTTTCTTTTGAAATATAACGAGAACGGCACAATCACTGATGCTGTGGACTGCGCATTGGATCCTTTGTCAGAGACTAAGTGCACTCTGAAGTCATTCACAGTCGAGAAAGGCATTTACCAGACGTCTAACTTCAGGGTTCAGCCTACTGAGTCCATCGTGAGATTCCCAAACATCACAAATCTTTGTCCCTTCGGTGAGGTATTCAATGCGACACGATTTGCCTCAGTGTACGCGTGGAATCGGAAGAGGATCTCCAATTGCGTGGCCGACTACTCCGTCTTATACAACTCAGCTAGCTTTTCAACATTCAAGTGCTATGGCGTGAGCCCTACCAAGCTCAATGACCTGTGCTTCACTAATGTGTATGCCGACTCTTTTGTCATTCGCGGCGACGAGGTCCGACAAATCGCACCGGGCCAAACCGGTAAAATTGCCGACTACAACTACAAGCTGCCTGACGACTTCACCGGCTGCGTAATCGCCTGGAACAGCAATAACCTGGATAGCAAAGTGGGCGGAAACTACAACTACCTGTACCGGCTCTTTAGAAAGTCCAACCTGAAACCATTCGAGCGCGATATCTCGACCGAAATCTACCAGGCGGGCAGCACCCCCTGTAATGGTGTAGAAGGGTTCAATTGTTACTTTCCACTCCAGAGTTATGGGTTCCAGCCGACCAATGGCGTCGGTTATCAACCATATCGCGTTGTGGTGTTGTCCTTTGAGCTGCTACACGCCCCAGCTACAGTGTGCGGGCCAAAGAAAAGCACAAATCTTGTCAAGAACAAATGCGTTAACTTTAATTTTAATGGACTCACAGGTACAGGAGTCCTGACCGAATCTAATAAGAAGTTCCTGCCCTTTCAACAGTTCGGACGAGACATTGCCGACACCACCGATGCCGTTCGGGACCCACAGACCTTAGAAATTCTGGATATTACTCCATGTAGTTTTGGGGGAGTGTCTGTCATCACCCCTGGCACTAATACATCTAACCAGGTTGCAGTCCTCTACCAGGATGTGAACTGTACCGAAGTGCCGGTCGCTATTCACGCAGACCAGCTCACTCCTACCTGGCGGGTGTACTCCACAGGCTCTAACGTGTTTCAGACACGTGCAGGGTGCCTAATCGGCGCAGAGCATGTAAATAACTCCTATGAGTGTGATATCCCCATCGGAGCCGGGATCTGCGCTTCCTACCAGACACAAACGAATAGTCCCGGATCTGCCTCAAGCGTGGCATCTCAATCCATTATAGCATATACGATGTCCCTTGGAGCTGAAAACAGCGTTGCGTATTCAAACAATAGTATCGCTATTCCAACCAATTTTACAATTAGCGTGACCACAGAAATACTCCCTGTGAGCATGACCAAGACCAGTGTAGACTGTACTATGTACATCTGCGGCGACAGTACTGAGTGTAGCAATCTGCTGCTACAGTATGGGTCCTTCTGTACTCAGCTTAATCGGGCTCTCACCGGAATCGCTGTAGAGCAAGATAAAAACACACAAGAAGTGTTTGCTCAAGTGAAGCAGATCTATAAGACACCTCCCATCAAGGATTTCGGTGGGTTCAACTTTAGCCAGATTCTGCCCGATCCGTCTAAACCGTCCAAGCGAAGTTTCATCGAAGACCTGCTTTTCAATAAGGTCACGCTGGCAGATGCTGGATTTATCAAACAGTACGGCGACTGTCTGGGCGATATCGCCGCAAGAGACTTGATATGCGCCCAAAAGTTTAATGGGTTAACCGTCCTTCCACCGCTCCTGACAGACGAGATGATCGCCCAGTATACAAGTGCCTTATTAGCTGGGACCATTACTAGTGGATGGACATTTGGCGCCGGGGCTGCTCTACAGATACCCTTCGCCATGCAGATGGCTTACCGCTTCAACGGAATCGGAGTTACCCAGAACGTACTGTACGAAAATCAGAAACTCATAGCTAATCAATTTAACTCTGCCATCGGGAAGATTCAGGATTCCCTGTCGTCTACAGCGTCCGCCTTGGGGAAACTGCAAGATGTAGTGAACCAGAACGCCCAGGCCTTAAATACTCTGGTCAAGCAGTTATCTTCAAATTTCGGAGCAATTAGCTCTGTGTTGAACGATATTCTTTCCAGGCTGGACCCTCCAGAAGCCGAAGTGCAAATAGACCGGCTCATCACGGGGCGCTTGCAAAGCCTGCAAACCTATGTCACCCAGCAACTGATTCGAGCAGCCGAGATCCGGGCCAGTGCTAATCTGGCCGCCACAAAAATGAGCGAGTGCGTCCTCGGGCAGAGCAAACGCGTAGACTTCTGCGGTAAAGGCTATCACCTGATGAGCTTCCCTCAGAGCGCACCCCACGGGGTGGTCTTCCTCCACGTTACCTACGTCCCTGCGCAGGAGAAGAACTTCACTACGGCCCCTGCAATTTGCCACGATGGCAAGGCCCACTTTCCCAGGGAGGGGGTCTTCGTTTCCAACGGGACTCATTGGTTCGTGACTCAGAGAAATTTTTATGAACCTCAGATCATTACCACTGATAATACATTCGTGTCTGGCAACTGTGATGTGGTTATTGGGATAGTTAATAATACGGTATACGACCCACTCCAGCCCGAGCTGGACTCCTTCAAAGAGGAGCTGGACAAGTACTTTAAAAATCACACCTCACCTGATGTGGACCTAGGTGACATATCTGGCATAAATGCTAGCGTGGTTAACATTCAGAAGGAAATCGACAGACTCAACGAGGTGGCCAAAAATCTGAACGAGAGTCTGATCGACCTGCAGGAGTTGGGAAAATATGAACAGTACATCAAATGGCCATGGTACATCTGGCTGGGCTTCATAGCAGGCCTGATCGCCATCGTCATGGTGACTATTATGCTGTGCTGCATGACATCCTGTTGTAGCTGTTTGAAGGGGTGTTGCTCCTGCGGCTCATGCTGCAAATTCGACGAGGACGATTCAGAACCTGTGCTGAAGGGAGTGAAGCTGCATTACACATAA
30 ORF41 ATGTTCGTTTTCCTTGTTTTACTGCCCCTCGTGTCTTCACAGTGTAGGGTTCAGCCTACTGAGTCCATCGTGAGATTCCCAAACATCACAAATCTTTGTCCCTTCGGTGAGGTATTCAATGCGACACGATTTGCCTCAGTGTACGCGTGGAATCGGAAGAGGATCTCCAATTGCGTGGCCGACTACTCCGTCTTATACAACTCAGCTAGCTTTTCAACATTCAAGTGCTATGGCGTGAGCCCTACCAAGCTCAATGACCTGTGCTTCACTAATGTGTATGCCGACTCTTTTGTCATTCGCGGCGACGAGGTCCGACAAATCGCACCGGGCCAAACCGGTAAAATTGCCGACTACAACTACAAGCTGCCTGACGACTTCACCGGCTGCGTAATCGCCTGGAACAGCAATAACCTGGATAGCAAAGTGGGCGGAAACTACAACTACCTGTACCGGCTCTTTAGAAAGTCCAACCTGAAACCATTCGAGCGCGATATCTCGACCGAAATCTACCAGGCGGGCAGCACCCCCTGTAATGGTGTAGAAGGGTTCAATTGTTACTTTCCACTCCAGAGTTATGGGTTCCAGCCGACCAATGGCGTCGGTTATCAACCATATCGCGTTGTGGTGTTGTCCTTTGAGCTGCTACACGCCCCAGCTACAGTGTGCGGGCCAAAGAAAAGCACAAATCTTGTCAAGAACAAATGCGTTAACTTTTAA
31 EMCV IRES ACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATA
32 5’ UTR珠蛋白 ACTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCACC
33 3’ UTR珠蛋白 GCTGGAGCCTCGGTAGCCGTTCCTCCTGCCCGCTGGGCCTCCCAACGGGCCCTCCTCCCCTCCTTGCACCGGCCCTTCCTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCAGCA
45 CVB3 TTAAAACAGCCTGTGGGTTGATCCCACCCACAGGCCCATTGGGCGCTAGCACTCTGGTATCACGGTACCTTTGTGCGCCTGTTTTATACCCCCTCCCCCAACTGTAACTTAGAAGTAACACACACCGATCAACAGTCAGCGTGGCACACCAGCCACGTTTTGATCAAGCACTTCTGTTACCCCGGACTGAGTATCAATAGACTGCTCACGCGGTTGAAGGAGAAAGCGTTCGTTATCCGGCCAACTACTTCGAAAAACCTAGTAACACCGTGGAAGTTGCAGAGTGTTTCGCTCAGCACTACCCCAGTGTAGATCAGGTCGATGAGTCACCGCATTCCCCACGGGCGACCGTGGCGGTGGCTGCGTTGGCGGCCTGCCCATGGGGAAACCCATGGGACGCTCTAATACAGACATGGTGCGAAGAGTCTATTGAGCTAGTTGGTAGTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCCTAACTGCGGAGCACACACCCTCAAGCCAGAGGGCAGTGTGTCGTAACGGGCAACTCTGCAGCGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCATTTTATTCCTATACTGGCTGCTTATGGTGACAATTGAGAGATCGTTACCATATAGCTATTGGATTGGCCATCCGGTGACTAATAGAGCTATTATATATCCCTTTGTTGGGTTTATACCACTTAGCTTGAAAGAGGTTAAAACATTACAATTCATTGTTAAGTTGAATACAGCAAA
46 WT EMCV GLuc IS CGCGGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAATAGCCGAAAAACAAAAAACAAAAAAAACAAAAAAAAAACCAAAAAAACAAAACACAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATAGCCACCATGGGAGTCAAAGTTCTGTTTGCCCTGATCTGCATCGCTGTGGCCGAGGCCAAGCCCACCGAGAACAACGAAGACTTCAACATCGTGGCCGTGGCCAGCAACTTCGCGACCACGGATCTCGATGCTGACCGCGGGAAGTTGCCCGGCAAGAAGCTGCCGCTGGAGGTGCTCAAAGAGATGGAAGCCAATGCCCGGAAAGCTGGCTGCACCAGGGGCTGTCTGATCTGCCTGTCCCACATCAAGTGCACGCCCAAGATGAAGAAGTTCATCCCAGGACGCTGCCACACCTACGAAGGCGACAAAGAGTCCGCACAGGGCGGCATAGGCGAGGCGATCGTCGACATTCCTGAGATTCCTGGGTTCAAGGACTTGGAGCCCATGGAGCAGTTCATCGCACAGGTCGATCTGTGTGTGGACTGCACAACTGGCTGCCTCAAAGGGCTTGCCAACGTGCAGTGTTCTGACCTGCTCAAGAAGTGGCTGCCGCAACGCTGTGCGACCTTTGCCAGCAAGATCCAGGGCCAGGTGGACAAGATCAAGGGGGCCGGTGGTGACTAAAAAAAACAAAAAACAAAACGGCTATT
47 夾板 GTTTTTCGGCTATTCCCAATAGCCGTTTTG
48 ORF44 ATGTACCGGATGCAGTTGTTGTCCTGTATAGCTCTTTCCCTTGCATTGGTCACTAATTCTagagtccaaccaacagaatctattgttagatttcctaatattacaaacttgtgcccttttggtgaagtttttaacgccaccagatttgcatccgtgtatgcttggaacaggaagagaatcagcaactgtgttgctgattattctgtcctatataattccgcatcattttccacttttaagtgttatggagtgtctcctactaaattaaatgatctctgctttactaatgtctatgcagattcatttgtaattagaggtgatgaagtcagacaaatcgctccagggcaaactggaaagattgctgattataattataaattaccagatgattttacaggctgcgttatagcttggaattctaacaatcttgattctaaggttggtggtaattataattacctgtatagattgtttaggaagtctaatctcaaaccttttgagagagatatttcaactgaaatctatcaggccggtagcacaccttgtaatggtgttgaaggttttaattgttactttcctttacaatcatatggtttccaacccactaatggtgttggttaccaaccatacagagtagtagtactttcttttgaacttctacatgcaccagcaactgtttgtggacctaaaaagtctactaatttggttaaaaacaaatgtgtcaatttcTAA
49 ORF45 ATGGGAGTCAAAGTTCTGTTTGCCCTGATCTGCATCGCTGTGGCCGAGGCCAAGagagtccaaccaacagaatctattgttagatttcctaatattacaaacttgtgcccttttggtgaagtttttaacgccaccagatttgcatccgtgtatgcttggaacaggaagagaatcagcaactgtgttgctgattattctgtcctatataattccgcatcattttccacttttaagtgttatggagtgtctcctactaaattaaatgatctctgctttactaatgtctatgcagattcatttgtaattagaggtgatgaagtcagacaaatcgctccagggcaaactggaaagattgctgattataattataaattaccagatgattttacaggctgcgttatagcttggaattctaacaatcttgattctaaggttggtggtaattataattacctgtatagattgtttaggaagtctaatctcaaaccttttgagagagatatttcaactgaaatctatcaggccggtagcacaccttgtaatggtgttgaaggttttaattgttactttcctttacaatcatatggtttccaacccactaatggtgttggttaccaaccatacagagtagtagtactttcttttgaacttctacatgcaccagcaactgtttgtggacctaaaaagtctactaatttggttaaaaacaaatgtgtcaatttcTAA
50 IL2分泌信號序列 ATGTACCGGATGCAGTTGTTGTCCTGTATAGCTCTTTCCCTTGCATTGGTCACTAATTCT
51 Gluc分泌信號序列 ATGGGAGTCAAAGTTCTGTTTGCCCTGATCTGCATCGCTGTGGCCGAGGCCAAG
無
本發明的新穎特徵在所附申請專利範圍中詳細闡述。藉由參考下面的詳細描述和附圖，將獲得對本發明特徵和優點的更好理解，下面的詳細描述闡述了說明性實施方式，其中利用了本揭露之原理，並且附圖中：
[ 圖 1] 示出了包含編碼冠狀病毒抗原（例如，刺突蛋白、刺突蛋白的受體結合結構域（RBD）蛋白）的序列之示例性環狀多核糖核苷酸。
[ 圖 2] 示出了生成與冠狀病毒抗原結合的人多株抗體以投與給人類受試者之示意圖。
[ 圖 3] 顯示由環狀RNA編碼的RBD抗原在BJ成纖維細胞和HeLa細胞中檢測到，而在用媒介物對照的BJ成纖維細胞和HeLa細胞未檢測到。
[ 圖 4] 顯示在小鼠模型中，投與經陽離子聚合物（例如，魚精蛋白）配製的編碼SARS-CoV-2 RBD抗原的環狀RNA後，獲得可持續的抗RBD抗體反應。
[ 圖 5] 顯示在小鼠模型中，投與經陽離子聚合物（例如，魚精蛋白）配製的編碼SARS-CoV-2 RBD抗原的環狀RNA後，獲得抗刺突反應。
[ 圖 6] 示出了在小鼠模型中，投與經陽離子聚合物（例如，魚精蛋白）配製的編碼SARS-CoV-2 RBD抗原的環狀RNA後獲得的抗-RBD IgG2a和IgG1同種型水平。
[ 圖 7] 顯示在肌內注射環狀RNA製劑（Trans-IT配製的、魚精蛋白配製的、未配製的）、僅魚精蛋白媒介物後和在未注射的對照小鼠中，長期從體內環狀RNA表現蛋白質。
[ 圖 8] 顯示在同時肌內遞送Addavax™佐劑與 (i) 未配製的環狀RNA製劑（左圖），(ii) 經TransIT配製的環狀RNA（中間圖），和 (iii) 經魚精蛋白配製的環狀RNA（右圖）後，長期從體內環狀RNA表現蛋白質。在每種情況下，Addavax™佐劑均在0和24小時以單獨注射的形式遞送。
[ 圖 9] 顯示在 (i) 經魚精蛋白配製的環狀RNA、(ii) 經魚精蛋白配製的環狀RNA（在24小時注射Addavax™佐劑）、(iii) 僅魚精蛋白媒介物的皮內遞送後，和 (iv) 未注射的對照小鼠，長期從體內環狀RNA表現蛋白質。
[ 圖 10] 係包括兩個表現序列的示例性環狀RNA之示意圖，其中每個表現序列編碼一種抗原並且其中一個或兩個表現序列編碼冠狀病毒抗原。環狀RNA包含兩個開放閱讀框（ORF），每個ORF均編碼表現序列，其中每個ORF與IRES可操作地連接。
[ 圖 11] 係包括兩個表現序列的示例性環狀RNA之示意圖，其中每個表現序列係一種抗原，並且其中一個或兩個表現序列編碼冠狀病毒抗原。環狀RNA包含兩個被2A序列隔開的表現序列，所有表現序列均與IRES可操作地連接。
[ 圖 12] 示出了多個多核糖核苷酸之示意圖，其中每個多核苷酸均包括編碼抗原的ORF，並且其中一個或兩個ORF編碼冠狀病毒抗原。
[ 圖 13A] 示出了環狀多核糖核苷酸之多抗原表現。從編碼SARSs-CoV-2 RBD抗原和GLuc的環狀RNA中檢測到RBD抗原的表現。
[ 圖 13B] 示出了環狀多核糖核苷酸之多抗原表現。從編碼SARSs-CoV-2 RBD抗原和GLuc的環狀RNA中檢測到GLuc活性。
[ 圖 14A] 證明了小鼠模型中來自環狀RNA的多種抗原之免疫原性。用編碼SARS-CoV-2 RBD抗原的第一環狀RNA和編碼GLuc的第二環狀RNA為小鼠接種。注射後17天獲得抗RBD抗體。
[ 圖 14B] 證明了小鼠模型中來自環狀RNA的多種抗原的免疫原性。用編碼SARS-CoV-2 RBD抗原的第一環狀RNA和編碼GLuc的第二環狀RNA為小鼠接種。注射後2天檢測到GLuc活性。
[ 圖 15A] 證明了小鼠模型中來自環狀RNA的多種抗原之免疫原性。用編碼SARS-CoV-2 RBD抗原的第一環狀RNA和編碼流感病毒血凝素（HA）抗原的第二環狀RNA為小鼠接種。注射後17天獲得抗RBD抗體。
[ 圖 15B] 證明了小鼠模型中來自環狀RNA的多種抗原之免疫原性。用編碼SARS-CoV-2 RBD抗原的第一環狀RNA和編碼流感病毒血凝素（HA）抗原的第二環狀RNA為小鼠接種。注射後17天獲得抗HA抗體。
[ 圖 16A] 證明了小鼠模型中來自環狀RNA的多種抗原之免疫原性。用編碼SARS-CoV-2刺突抗原的第一環狀RNA和編碼流感病毒血凝素（HA）抗原的第二環狀RNA為小鼠接種。注射後17天獲得抗RBD（刺突結構域）抗體。
[ 圖 16B] 證明了小鼠模型中來自環狀RNA的多種抗原之免疫原性。用編碼SARS-CoV-2刺突抗原的第一環狀RNA和編碼流感病毒血凝素（HA）抗原的第二環狀RNA為小鼠接種。注射後17天獲得抗HA抗體。序列表 本申請包含序列表，該序列表已經以ASCII格式以電子方式提交，並且特此藉由援引以其全文併入。創建於2021年5月18日的所述ASCII副本名稱為51509-20TW6_Sequence_Listing_05.18.21_ST25並且大小係206,923位元組。
無
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Claims (37)

  1. 一種免疫原性組成物，包含含有編碼冠狀病毒抗原的序列的環狀多核糖核苷酸。
  2. 一種免疫原性組成物，包含含有編碼冠狀病毒抗原的序列的環狀多核糖核苷酸，其中該冠狀病毒抗原包含與選自SEQ ID NO: 1-10、13、15、17、19、21、23、25-30、48和49中的任一個的冠狀病毒抗原具有至少約80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%的序列同一性的序列，或該環狀多核糖核苷酸包含與選自SEQ ID NO: 12、14、16、18、20、22和24的環狀多核糖核苷酸具有至少約80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%的序列同一性的序列。
  3. 如前述請求項中任一項所述之免疫原性組成物，該免疫原性組成物進一步包含該冠狀病毒抗原。
  4. 如前述請求項中任一項所述之免疫原性組成物，其中該冠狀病毒抗原來自β冠狀病毒或其片段，或來自沙貝科病毒或其片段。
  5. 如前述請求項中任一項所述之免疫原性組成物，其中該冠狀病毒抗原來自嚴重急性呼吸道症候群2（SARS-CoV-2）或其片段、嚴重急性呼吸道症候群1（SARS-CoV-1）或其片段、或中東呼吸症候群冠狀病毒（MERS-CoV）或其片段。
  6. 如前述請求項中任一項所述之免疫原性組成物，其中該冠狀病毒抗原係膜蛋白或其變體或片段、病毒的包膜蛋白或其變體或片段、病毒的刺突蛋白或其變體或片段、病毒的核衣殼蛋白或其變體或其片段、病毒的輔助蛋白或其變體或片段。
  7. 如前述請求項中任一項所述之免疫原性組成物，其中該冠狀病毒抗原係刺突蛋白或其變體或片段的受體結合結構域。
  8. 如請求項7所述之免疫原性組成物，其中該刺突蛋白缺乏裂解位點。
  9. 如前述請求項中任一項所述之免疫原性組成物，其中冠狀病毒的輔助蛋白選自由ORF3a、ORF7a、ORF7b、ORF8、ORF10或其任何變體或片段組成之群組。
  10. 如前述請求項中任一項所述之免疫原性組成物，其中該環狀多核糖核苷酸包含多個序列，每個序列均編碼抗原，並且至少一個序列編碼冠狀病毒抗原。
  11. 如前述請求項中任一項所述之免疫原性組成物，其中該環狀多核糖核苷酸包含兩個或更多個ORF。
  12. 如前述請求項中任一項所述之免疫原性組成物，其中該環狀多核糖核苷酸包含編碼來自至少兩種不同微生物的抗原的序列，並且至少一種微生物係冠狀病毒。
  13. 如前述請求項中任一項所述之免疫原性組成物，其中該冠狀病毒抗原包含表位。
  14. 如前述請求項中任一項所述之免疫原性組成物，其中該冠狀病毒抗原包含被B細胞識別的表位。
  15. 如前述請求項中任一項所述之免疫原性組成物，該免疫原性組成物進一步包含含有編碼第二抗原的序列的第二環狀多核糖核苷酸。
  16. 如前述請求項中任一項所述之免疫原性組成物，該免疫原性組成物進一步包含含有第二ORF的第二環狀多核糖核苷酸。
  17. 如前述請求項中任一項所述之免疫原性組成物，該免疫原性組成物進一步包含含有編碼第三、第四或第五抗原的序列的第三、第四或第五環狀多核糖核苷酸。
  18. 如前述請求項中任一項所述之免疫原性組成物，其中該第一抗原、第二抗原、第三抗原、第四抗原和第五抗原係不同的抗原。
  19. 如前述請求項中任一項所述之免疫原性組成物，其中該免疫原性組成物進一步包含藥學上可接受的載劑或賦形劑。
  20. 如前述請求項中任一項所述之免疫原性組成物，其中該免疫原性組成物進一步包含藥學上可接受的賦形劑且不含任何載劑。
  21. 一種包含線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物，該線性多核糖核苷酸包含選自SEQ ID NO: 13、15和12中的任一個的序列。
  22. 如請求項21所述之免疫原性組成物，其中該線性多核糖核苷酸包含編碼兩種或更多種抗原的序列，並且至少一種抗原係該冠狀病毒抗原。
  23. 如請求項21或請求項22所述之免疫原性組成物，其中該線性多核糖核苷酸包含編碼至少2、3、4或5種抗原的序列，並且至少一種抗原係由SEQ ID NO：13、15和12的序列編碼的冠狀病毒抗原。
  24. 一種向人類受試者遞送免疫原性組成物之方法，該方包括：a) 向該人類受試者投與如前述請求項中任一項所述之免疫原性組成物。
  25. 一種在非人類動物或人類受試者中誘導針對冠狀病毒抗原的免疫反應之方法，該方法包括：a) 向該非人類動物或人類受試者投與如前述請求項中任一項所述之免疫原性組成物。
  26. 一種向人類受試者遞送免疫原性組成物之方法，該方包括：a) 向該人類受試者投與如前述請求項中任一項所述之免疫原性組成物以及b) 從該非人類動物或人類受試者中收集針對該冠狀病毒抗原的抗體。
  27. 一種在非人類動物或人類受試者中誘導針對冠狀病毒抗原的免疫反應之方法，該方法包括：a) 向該非人類動物或人類受試者投與如前述請求項中任一項所述之免疫原性組成物，以及b) 從該非人類動物或人類受試者中收集針對該冠狀病毒抗原的抗體。
  28. 如前述請求項中任一項所述之方法，該方法進一步包括向該非人類動物或人類受試者投與佐劑。
  29. 如請求項28所述之方法，其中該佐劑與該免疫原性組成物共同配製和共同投與，或者與該免疫原性組成物分開配製和投與。
  30. 如前述請求項中任一項所述之方法，該方法進一步包括用載劑配製該免疫原性組成物。
  31. 如前述請求項中任一項所述之方法，該方法進一步包括向該非人類動物或人類受試者投與或免疫接種該環狀多核糖核苷酸至少兩次。
  32. 如前述請求項中任一項所述之方法，該方法進一步包括向該非人類動物或人類受試者投與或免疫接種疫苗。
  33. 如請求項32所述之方法，其中該疫苗係肺炎球菌多糖疫苗。
  34. 如請求項32所述之方法，其中該疫苗用於細菌感染。
  35. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該非人類動物或人類受試者藉由注射免疫接種該環狀多核糖核苷酸。
  36. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該等多株抗體中的一種抗體與該冠狀病毒抗原特異性結合。
  37. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該等多株抗體中的一種抗體係人源化抗體或全人抗體。
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