KR20220005039A - 이온화 가능한 아민 지질 및 지질 나노입자 - Google Patents

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스테판 에스. 스컬리
데릭 라프라카
레이첼 펠리
루비나 자레 파르마
미카 매테니
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인텔리아 테라퓨틱스, 인크.
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Abstract

본 개시내용은 생물학적 활성제의 전달, 예를 들어, 조작된 세포를 제조하기 위해 생물학적 활성제를 세포에 전달하는 것에 유용한 이온화 가능한 아민 지질 및 이의 염(예를 들어, 이의 약제학적으로 허용 가능한 염)을 제공한다. 본 명세서에 개시된 이온화 가능한 아민 지질은 지질 나노입자-기반 조성물의 제형에서 이온화 가능한 지질로서 유용하다.

Description

이온화 가능한 아민 지질 및 지질 나노입자
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 4월 25일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/838,551호, 및 2019년 5월 6일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/843,854호에 대한 우선권의 유익을 주장하며, 이들 각각의 전문은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
이온화 가능한 아민-함유 지질과 함께 제형화된 지질 나노입자는 생물학적 활성제, 특히 폴리뉴클레오타이드, 예컨대, RNA, mRNA 및 가이드 RNA의 세포 내로의 전달을 위한 화물(cargo) 비히클로서 작용할 수 있다. 이온화 가능한 지질을 함유하는 LNP 조성물은 세포막을 가로지르는 올리고뉴클레오타이드 제제의 전달을 용이하게 할 수 있으며, 유전자 편집을 위한 성분 및 조성물을 생세포에 도입하는 데 사용될 수 있다. 세포에 전달하는 것이 특히 어려운 생물학적 활성제는 단백질, 핵산-기반 약물 및 이들의 유도체, 특히 상대적으로 큰 올리고뉴클레오타이드, 예컨대, mRNA를 포함하는 약물을 포함한다. 유망한 유전자 편집 기술을 세포 내로 전달하기 위한, 예컨대, CRISPR/Cas9 시스템 성분을 전달하기 위한 조성물에 특히 관심이 있다(예를 들어, 뉴클레아제를 암호화하는 mRNA 및 관련된 가이드 RNA(gRNA)).
CRISPR/Cas의 단백질 및 핵산 성분을 세포, 예컨대, 환자의 세포에 전달하기 위한 조성물이 필요하다. 특히, CRISPR 단백질 성분을 암호화하는 mRNA를 전달하기 위한 조성물, 및 CRISPR gRNA를 전달하기 위한 조성물에 특히 관심이 있다. RNA 성분을 안정화시키고 전달할 수 있는 시험관내 및 생체내 전달을 위한 유용한 특성을 갖는 조성물에 특히 관심이 있다.
본 개시내용은 지질 나노입자(lipid nanoparticle: LNP) 조성물의 제형화에 유용한 아민-함유 지질을 제공한다. 이러한 LNP 조성물은 핵산 화물, 예컨대, CRISPR/Cas 유전자 편집 성분을 세포에 전달하는 데 유리한 특성을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 지질은 하기 화학식 II의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 염이다:
Figure pct00001
,
식 중,
X1은 O, NR1 또는 직접 결합이며,
X2는 C2-5 알킬렌이고,
X3은 C(=O) 또는 직접 결합이며,
R1은 H 또는 Me이고,
R3은 C1-3 알킬이며,
R2는 C1-3 알킬이거나, 또는
R2는 이들이 부착된 질소 원자 및 X2의 1 내지 3개의 탄소 원자와 함께 4-, 5- 또는 6-원 고리를 형성하거나, 또는
X1은 NR1이고, R1 및 R2는 이들이 부착된 질소 원자와 함께 5- 또는 6-원 고리를 형성하거나, 또는
R2는 R3 및 이들이 부착된 질소 원자와 함께 5-, 6- 또는 7-원 고리를 형성하고,
Y1은 C2-12 알킬렌이며,
Y2는 (배향 중 하나에서)
Figure pct00002
, (배향 중 하나에서)
Figure pct00003
, 및 (배향 중 하나에서)
Figure pct00004
로부터 선택되고,
n은 0 내지 3이며,
R4는 C1-15 알킬이고,
Z1은 C1-6 알킬렌 또는 직접 결합이며,
Z2는 (배향 중 하나에서)
Figure pct00005
이거나 또는 존재하지 않고, 단, Z1이 직접 결합이라면, Z2는 존재하지 않으며;
R5는 C5-9 알킬 또는 C6-10 알콕시이고,
R6은 C5-9 알킬 또는 C6-10 알콕시이며,
W는 메틸렌 또는 직접 결합이고, 그리고
R7은 H 또는 Me이고,
단, R3 및 R2가 C2 알킬이고, X1이 O이며, X2는 선형 C3 알킬렌이고, X3은 C(=O)이며, Y1은 선형 C6 알킬렌이고, (Y2 )n-R4는
Figure pct00006
이며, R4는 선형 C5 알킬이고, Z1은 C2 알킬렌이며, Z2는 존재하지 않고, W는 메틸렌이고, R7이 H라면, R5 및 R6은 C8 알콕시가 아니다.
특정 실시형태에서, 지질은 하기 화학식 (I)의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 염이다:
Figure pct00007
X1은 O, NR1 또는 직접 결합이며,
X2는 C2-5 알킬렌이고,
X3은 C(=O) 또는 직접 결합이며,
R1은 H 또는 Me이고,
R3은 C1-3 알킬이며,
R2는 C1-3 알킬이거나, 또는
R2는 이들이 부착된 질소 원자 및 X2의 1 내지 3개의 탄소 원자와 함께 4-, 5- 또는 6-원 고리를 형성하거나, 또는
X1은 NR1이고, R1 및 R2는 이들이 부착된 질소 원자와 함께 5- 또는 6-원 고리를 형성하거나, 또는
R2는 R3 및 이들이 부착된 질소 원자와 함께 5-, 6- 또는 7-원 고리를 형성하고,
Y1은 C2-12 알킬렌이며,
Y2는 (배향 중 하나에서)
Figure pct00008
및 (배향 중 하나에서)
Figure pct00009
로부터 선택되고,
R4는 C3-15 알킬이며,
Z1은 C1-6 알킬렌 또는 직접 결합이며,
Z2는 (배향 중 하나에서)
Figure pct00010
또는 존재하지 않고, 단, Z1이 직접 결합이라면, Z2는 존재하지 않고;
R5는 C5-9 알킬 또는 C6-10 알콕시이고,
R6은 C5-9 알킬 또는 C6-10 알콕시이며,
W는 메틸렌 또는 직접 결합이고, 그리고
R7은 H 또는 Me이며,
단, R3 및 R2가 C2 알킬이고, X1이 O이며, X2는 선형 C3 알킬렌이고, X3은 C(=O)이며, Y1은 선형 C6 알킬렌이고, Y2는
Figure pct00011
이며, R4는 선형 C4 알킬이고, Z1은 C2 알킬렌이며, Z2는 존재하지 않고, W는 메틸렌이고, R7이 H라면, R5 및 R6은 C8 알콕시가 아니다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 임의의 화합물에 관한 것이되, 화합물의 양성자화된 형태의 pKa는 약 5.1 내지 약 9.0, 예를 들어, 약 5.7 내지 약 7.6, 또는 약 6 내지 약 7.5이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 임의의 화합물 및 지질 성분을 포함하는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 화합물 및 지질 성분, 예를 들어, 아민 지질, 바람직하게는 화학식 (I) 또는 화학식 (II)의 화합물의 약 50%(예를 들어, 지질 성분의 약 50%)를 포함하는, 조성물에 관한 것이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 임의의 조성물에 관한 것이되, 조성물은 LNP 조성물이다. 예를 들어, 본 발명은 본 명세서에 기재된 임의의 화합물 및 지질 성분을 포함하는 LNP 조성물에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 임의의 LNP 조성물에 관한 것이되, 지질 성분은 헬퍼 지질 및 PEG 지질을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 임의의 LNP 조성물에 관한 것이되, 지질 성분은 헬퍼 지질, PEG 지질 및 중성 지질을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 동결보호제를 더 포함하는, 본 명세서에 기재된 임의의 LNP 조성물에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 완충제를 더 포함하는, 본 명세서에 기재된 임의의 LNP 조성물에 관한 것이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 핵산 성분을 더 포함하는, 본 명세서에 기재된 임의의 LNP 조성물에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 RNA 또는 DNA 성분을 더 포함하는, 본 명세서에 기재된 임의의 LNP 조성물에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 임의의 LNP 조성물에 관한 것이되, LNP 조성물은 N/P 비가 약 3 내지 10이고, 예를 들어, N/P 비는 약 6±1이거나, 또는 N/P 비는 약 6±0.5이다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 임의의 LNP 조성물에 관한 것이되, LNP 조성물은 N/P 비가 약 6이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 임의의 LNP 조성물에 관한 것이되, RNA 성분은 mRNA를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 임의의 LNP 조성물에 관한 것이되, RNA 성분은 RNA-가이드된 DNA-결합제, 예를 들어, Cas 뉴클레아제 mRNA, 예컨대, 클래스 2 Cas 뉴클레아제 mRNA, 또는 Cas9 뉴클레아제 mRNA를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 임의의 LNP 조성물에 관한 것이되, mRNA는 변형된 mRNA이다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 임의의 LNP 조성물에 관한 것이되, RNA 성분은 gRNA 핵산을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 임의의 LNP 조성물에 관한 것이되, gRNA 핵산은 gRNA이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 LNP 조성물에 관한 것이되, RNA 성분은 클래스 2 Cas 뉴클레아제 mRNA 및 gRNA를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 임의의 LNP 조성물에 관한 것이되, gRNA 핵산은 이중-가이드 RNA(dgRNA)이거나, 이를 암호화한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 임의의 LNP 조성물에 관한 것이되, gRNA 핵산은 단일-가이드 RNA(sgRNA)이거나, 이를 암호화한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 임의의 LNP 조성물에 관한 것이되, gRNA는 변형된 gRNA이다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 임의의 LNP 조성물에 관한 것이되, 변형된 gRNA는 5' 말단에서 처음 5개의 뉴클레오타이드 중 하나 이상에서 변형을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 임의의 LNP 조성물에 관한 것이되, 변형된 gRNA는 3' 말단에서 마지막 5개의 뉴클레오타이드 중 하나 이상에서 변형을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 임의의 LNP 조성물에 관한 것이되, 적어도 하나의 주형 핵산을 더 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 세포를 LNP와 접촉시키는 단계를 포함하는, 유전자 편집 방법에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 DNA를 절단시키는 단계를 포함하는, 본 명세서에 기재된 유전자 편집의 임의의 방법에 관한 것이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은, 세포를 LNP 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, DNA를 절단하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 DNA를 절단하는 임의의 방법에 관한 것이되, 절단하는 단계는 단일 가닥 DNA 틈을 도입하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 DNA를 절단하는 임의의 방법에 관한 것이되, 절단하는 단계는 이중 가닥 DNA 파손을 도입하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 DNA를 절단하는 임의의 방법에 관한 것이되, LNP 조성물은 클래스 2 Cas mRNA 및 gRNA 핵산을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 적어도 하나의 주형 핵산을 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함하는, 본 명세서에 기재된 DNA를 절단하는 임의의 방법에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포를 주형 핵산을 포함하는 LNP 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 본 명세서에 기재된 DNA를 절단하는 임의의 방법에 관한 것이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 유전자 편집의 임의의 방법에 관한 것이되, 상기 방법은 LNP 조성물을 동물, 예를 들어, 인간에 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 유전자 편집의 임의의 방법에 관한 것이되, 상기 방법은 LNP 조성물을 세포, 예컨대, 진핵 세포를 투여하는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 유전자 편집의 임의의 방법에 관한 것이되, 상기 방법은 mRNA, gRNA, gRNA 핵산 및 주형 핵산 중 하나 이상을 포함하는 제1 LNP 조성물 및 제2 LNP 조성물로 제형화된 mRNA를 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 유전자 편집의 임의의 방법에 관한 것이되, 제1 LNP 조성물과 제2 LNP 조성물은 동시에 투여된다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 유전자 편집의 임의의 방법에 관한 것이되, 제1 LNP 조성물 및 제2 LNP 조성물은 순차적으로 투여된다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 유전자 편집의 임의의 방법에 관한 것이되, 상기 방법은 단일 LNP 조성물로 제형화된 mRNA 및 gRNA 핵산을 투여하는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 유전자 편집의 임의의 방법에 관한 것이되, 유전자 편집은 유전자 넉아웃(gene knockout)을 초래한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 유전자 편집의 임의의 방법에 관한 것이되, 유전자 편집은 유전자 교정(gene correction)을 초래한다.
도 1a는 화합물 1, 화합물 29, 화합물 31 또는 화합물 32를 포함하는 LNP를 이용하는 전달 후에 마우스 간 세포에서의 TTR의 편집 백분율을 나타내는 그래프를 도시한 도면. 용량 반응 데이터를 또한 나타낸다. 실시예 122 참조.
도 1b는 화합물 1, 화합물 40, 화합물 53 또는 화합물 54를 포함하는 LNP를 이용하는 전달 후에 마우스 간 세포에서의 TTR의 편집 백분율을 나타내는 그래프를 도시한 도면. 용량 반응 데이터를 또한 나타낸다. 실시예 122 참조.
도 1c는 화합물 1 또는 화합물 59를 포함하는 LNP를 이용하는 전달 후에 마우스 간 세포에서의 B2M 및 TTR의 편집 백분율을 나타내는 그래프를 도시한 도면. 용량 반응 데이터를 또한 나타낸다. 실시예 122 참조.
도 1d는 화합물 1, 화합물 24, 화합물 59, 화합물 61 또는 화합물 94를 포함하는 LNP를 이용하는 전달 후에 마우스 간 세포에서의 TTR의 편집 백분율을 나타내는 그래프를 도시한 도면. 용량 반응 데이터를 또한 나타낸다. 실시예 122 참조.
도 2는 화합물 1, 화합물 100, 화합물 101, 화합물 102 또는 화합물 103을 포함하는 LNP를 이용하는 전달 후에 마우스 간 세포에서의 TTR의 편집 백분율을 나타내는 그래프를 도시한 도면. 실시예 123 참조.
도 3은 화합물 1, 화합물 114, 화합물 115 또는 화합물 116을 포함하는 LNP를 이용하는 전달 후에 마우스 간 세포에서의 TTR의 편집 백분율을 나타내는 그래프를 도시한 도면. 실시예 123 참조.
도 4는 화합물 1, 화합물 12, 화합물 59 또는 화합물 94를 포함하는 LNP를 이용하는 전달 후에 랫트 간 세포에서의 TTR의 편집 백분율을 나타내는 그래프를 도시한 도면. 용량 반응 데이터를 나타낸다. 실시예 125 참조.
본 개시내용은 핵산, 예컨대, CRISPR/Cas 성분 RNA("화물")를 포함하는 생물학적 활성제를 세포에 전달하는 데 유용한 지질, 특히 이온화 가능한 지질, 및 이러한 조성물을 제조하고 이용하는 방법을 제공한다. 지질 및 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은, 선택적으로 LNP 조성물을 비롯하여, 지질을 포함하는 조성물로서 제공된다. 특정 실시형태에서, LNP 조성물은 생물학적 활성제, 예를 들어, RNA 성분, 및 본 명세서에 규정된 바와 같은 화학식 (II) 또는 화학식 (I)의 화합물을 포함하는 지질 성분을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, RNA 성분은 RNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 지질은 생물학적 활성제, 예를 들어, mRNA를 세포, 예컨대, 간 세포에 전달하는 데 사용된다. 특정 실시형태에서, RNA 성분은 클래스 2 Cas 뉴클레아제를 암호화하는 gRNA 및 선택적으로 mRNA를 포함한다. 유전자 편집 방법 및 이들 조성물을 이용하여 조작된 세포를 제조하는 방법이 또한 제공된다.
지질 나노입자 조성물
본 명세서에 생물학적 활성제, 예컨대, CRISPR/Cas 화물을 포함하는 핵산, 예를 들어, mRNA 및 gRNA를 전달하기 위한 다양한 LNP 조성물이 개시된다. 이러한 LNP 조성물은 중성 지질, PEG 지질, 및 헬퍼 지질과 함께 "이온화 가능한 아민 지질"을 포함한다. "지질 나노입자" 또는 "LNP"는 의미를 제한하지 않고, 분자간 힘에 의해 서로 물리적으로 관련된 복수의(즉, 하나 초과의) LNP 성분을 포함하는 입자를 지칭한다.
지질
본 개시내용은 LNP 조성물에서 사용될 수 있는 지질을 제공한다. 일부 실시형태에서, 지질은 하기 화학식 II의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 염이다:
Figure pct00012
식 중,
X1은 O, NR1 또는 직접 결합이며,
X2는 C2-5 알킬렌이고,
X3은 C(=O) 또는 직접 결합이며,
R1은 H 또는 Me이고,
R3은 C1-3 알킬이며,
R2는 C1-3 알킬이거나, 또는
R2는 이들이 부착된 질소 원자 및 X2의 1 내지 3개의 탄소 원자와 함께 4-, 5- 또는 6-원 고리를 형성하거나, 또는
X1은 NR1이고, R1 및 R2는 이들이 부착된 질소 원자와 함께 5- 또는 6-원 고리를 형성하거나, 또는
R2는 R3 및 이들이 부착된 질소 원자와 함께 5-, 6- 또는 7-원 고리를 형성하고,
Y1은 C2-12 알킬렌이며,
Y2는 (배향 중 하나에서)
Figure pct00013
, (배향 중 하나에서)
Figure pct00014
, 및 (배향 중 하나에서)
Figure pct00015
로부터 선택되고,
n은 0 내지 3이며,
R4는 C1-15 알킬이고,
Z1은 C1-6 알킬렌 또는 직접 결합이며,
Z2는 (배향 중 하나에서)
Figure pct00016
또는 존재하지 않고, 단, Z1이 직접 결합이라면, Z2는 존재하지 않으며;
R5는 C5-9 알킬 또는 C6-10 알콕시이고,
R6은 C5-9 알킬 또는 C6-10 알콕시이며,
W는 메틸렌 또는 직접 결합이고, 그리고
R7은 H 또는 Me이며,
단, R3 및 R2가 C2 알킬이고, X1이 O이며, X2는 선형 C3 알킬렌이고, X3은 C(=O)이며, Y1은 선형 C6 알킬렌이고, (Y2)n-R4는
Figure pct00017
이며, R4는 선형 C5 알킬이고, Z1은 C2 알킬렌이며, Z2는 존재하지 않고, W는 메틸렌이고, R7이 H라면, R5 및 R6은 C8 알콕시가 아니다.
일부 실시형태에서, n은 1 내지 3이고, 예를 들어, n은 1이다. 특정 실시형태에서, n은 2이다. 일부 실시형태에서, n은 3이다.
특정 실시형태에서, 지질은 하기 화학식 (I)의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 염이다:
Figure pct00018
X1은 O, NR1 또는 직접 결합이며,
X2는 C2-5 알킬렌이고,
X3은 C(=O) 또는 직접 결합이며,
R1은 H 또는 Me이고,
R3은 C1-3 알킬이며,
R2는 C1-3 알킬이거나, 또는
R2는 이들이 부착된 질소 원자 및 X2의 1 내지 3개의 탄소 원자와 함께 4-, 5- 또는 6-원 고리를 형성하거나, 또는
X1은 NR1이고, R1 및 R2는 이들이 부착된 질소 원자와 함께 5- 또는 6-원 고리를 형성하거나, 또는
R2는 R3 및 이들이 부착된 질소 원자와 함께 5-, 6- 또는 7-원 고리를 형성하고,
Y1은 C2-12 알킬렌이며,
Y2는 (배향 중 하나에서)
Figure pct00019
및 (배향 중 하나에서)
Figure pct00020
로부터 선택되고,
R4는 C3-15 알킬이며,
Z1은 C1-6 알킬렌 또는 직접 결합이며,
Z2는 (배향 중 하나에서)
Figure pct00021
이거나 또는 존재하지 않고, 단, Z1이 직접 결합이라면, Z2는 존재하지 않고;
R5는 C5-9 알킬 또는 C6-10 알콕시이고,
R6은 C5-9 알킬 또는 C6-10 알콕시이며,
W는 메틸렌 또는 직접 결합이고, 그리고
R7은 H 또는 Me이며,
단, R3 및 R2가 C2 알킬이고, X1이 O이며, X2는 선형 C3 알킬렌이고, X3은 C(=O)이며, Y1은 선형 C6 알킬렌이고, Y2는
Figure pct00022
이며, R4는 선형 C4 알킬이고, Z1은 C2 알킬렌이며, Z2는 존재하지 않고, W는 메틸렌이고, R7이 H라면, R5 및 R6은 C8 알콕시가 아니다(예를 들어, 화합물은 화합물 1이 아님).
바람직하게는, 화합물은 화학식 (I)의 구조식을 갖는 화합물이며, 단, R3 및 R2가 C2 알킬이고, X1이 O이며, X2는 선형 C3 알킬렌이고, X3은 C(=O)이며, Y1은 선형 C6 알킬렌이고, Y2는
Figure pct00023
이며, R4는 선형 C4 알킬이고, Z1은 C2 알킬렌이며, Z2는 존재하지 않고, W는 메틸렌이고, R7이 H라면, R5 및 R6은 C6-10 알콕시가 아니다.
일부 실시형태에서, 화합물은 하기 화학식　(Ia)의 화합물이다:
Figure pct00024
.
일부 실시형태에서,
Figure pct00025
는
Figure pct00026
로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, X2는 선형 C2 알킬렌, 또는 선형 C3 알킬렌, 또는 선형 C4 알킬렌이다.
다음 실시형태에서, R3은 C1 알킬 또는 C2 알킬이다.
특정 실시형태에서, R2는 C1 알킬 또는 C2 알킬이다. 일부 다른 실시형태에서, R2는 질소 원자 및 X2의 1 내지 2개의 탄소 원자와 함께 5-원 고리를 형성한다. 대안적으로, R2는 질소 원자 및 X2의 1 내지 3개의 탄소 원자와 함께 6-원 고리를 형성할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, R2 및 R3은 질소 원자와 함께 5-원 고리를 형성한다. 특정 실시형태에서, X1은 NH 또는 직접 결합이다.
일부 실시형태에서, Y1은 선형 C3-10 알킬렌, 예컨대, 선형 C4-8 알킬렌, 예를 들어, 선형 C5-7 알킬렌이다.
특정 실시형태에서, R4는 선형 C4-14 알킬, 바람직하게는 선형 C6-12 알킬이다.
일부 실시형태에서, Z1은 선형 C2-4 알킬렌이다.
특정 실시형태에서, R5 및 R6은 각각 독립적으로 선형 C5-9 알킬, 예컨대, 선형 C6-8 알킬이다.
일부 실시형태에서, R5 및 R6은 각각 독립적으로 선형 C7-9 알콕시이다.
특정 실시형태에서, R5와 R6은 동일하다. 대안적으로, R5와 R6은 상이하다.
일부 실시형태에서, Y2는
Figure pct00027
이다. 다음 실시형태에서, Y2는
Figure pct00028
이다. 일부 실시형태에서, Y1은 선형 C7 알킬렌이고, Y2는
Figure pct00029
이며, n은 1이고, R4는 선형 C10 알킬이다.
특정 실시형태에서 Z2는
Figure pct00030
이다.
일부 실시형태에서, Z1, Z2 및 R5는 에스터 및 아세탈의 탄소 및 산소 원자를 포함하는, 6 내지 18개 원자의 선형쇄를 형성하도록 선택된다.
일부 실시형태에서, Y1, Y2 및 R4는 에스터의 탄소 및 산소 원자를 포함하는, 14 내지 24개 원자의 선형쇄를 형성하도록 선택된다.
화학식 (II)의 대표적인 화합물은 하기 화합물 또는 이들 염, 예컨대, 이들 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
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Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같이 제형화된 지질 조성물의 화학식 (II) 또는 화학식 (I)의 화합물의 적어도 75%는 투여 후 8, 10, 12, 24 또는 48시간, 또는 3, 4, 5, 6, 7 또는 10일 이내에 대상체의 혈장으로부터 클리어런스된다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 화학식 (II) 또는 (I)의 화합물을 포함하는 지질 조성물의 적어도 50%는 투여 후 8, 10, 12, 24 또는 48시간, 또는 3, 4, 5, 6, 7 또는 10일 이내에 대상체의 혈장으로부터 클리어런스되며, 예를 들어, 혈장 중의 지질(예를 들어, 화학식 (II) 또는 (I)의 화합물), RNA(예를 들어, mRNA), 또는 다른 성분을 측정함으로써, 결정될 수 있다. 특정 실시형태에서, 지질 조성물의 유리 지질, RNA, 또는 핵산 성분에 대한 지질-캡슐화가 측정된다.
지질 클리어런스는 문헌에 기재된 바와 같이 측정될 수 있다. 문헌[Maier, M.A., et al. Biodegradable Lipids Enabling Rapidly Eliminated Lipid Nanoparticles for Systemic Delivery of RNAi Therapeutics. Mol. Ther. 2013, 21(8), 1570-78 ("Maier")] 참조. 예를 들어, Maier에서, 루시퍼라제-표적화 siRNA를 함유하는 LNP-siRNA 시스템은 옆 꼬리 정맥을 통해 정맥내 볼루스 주사에 의해 0.3㎎/㎏으로 6 내지 8주령 수컷 C57Bl/6 마우스에게 투여되었다. 혈액, 간 및 비장 샘플은 투약 후 0.083, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 96 및 168시간에 수집되었다. 마우스는 조직 수집 전에 식염수로 관류되었고, 혈액 샘플은 혈장을 얻도록 가공되었다. 모든 샘플이 가공되고, LC-MS에 의해 분석된다. 추가로, Maier는 LNP-siRNA 조성물의 투여 후 독성을 평가하기 위한 절차를 기재한다. 예를 들어, 루시퍼라제-표적화 siRNA는 수컷 스프래그-돌리 랫트에 대해 5㎖/㎏의 용량 용적으로 단일 정맥내 볼루스 주사를 통해 0, 1, 3, 5 및 10㎎/㎏(5마리 동물/그룹)으로 투여되었다. 24시간 후에, 의식이 있는 동물의 경정맥으로부터 약 1㎖의 혈액이 얻어졌고, 혈청이 단리되었다. 투약 후 72시간에, 부검을 위해 모든 동물이 안락사되었다. 임상 징후, 체중, 혈청 화학, 기관 중량 및 조직병리학의 평가가 수행되었다. Maier는 siRNA-LNP 조성물을 평가하는 방법을 기재하지만, 이들 방법은 본 개시내용의 지질 조성물, 예컨대, LNP 조성물의 클리어런스, 약물동태학 및 독성을 평가하는 데 적용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 화학식 (II) 또는 (I)의 화합물을 이용하는 지질 조성물은 대안의 이온화 가능한 아민 지질에 비해 증가된 클리어런스율을 나타낸다. 일부 이러한 실시형태에서, 클리어런스율은 지질 클리어런스율, 예를 들어, 화학식 (II) 또는 (I)의 화합물이 혈액, 혈청 또는 혈장으로부터 클리어런스된 비율이다. 일부 실시형태에서, 클리어런스율은 화물(예를 들어, 생물학적 활성제) 클리어런스율, 예를 들어, 화물 성분이 혈액, 혈청 또는 혈장으로부터 클리어런스되는 비율이다. 일부 실시형태에서, 클리어런스율은 RNA 클리어런스율, 예를 들어, mRNA 또는 gRNA가 혈액, 혈청 또는 혈장으로부터 클리어런스된 비율이다. 일부 실시형태에서, 클리어런스율은 LNP가 혈액, 혈청 또는 혈장으로부터 클리어런스된 비율이다. 일부 실시형태에서, 클리어런스율은 LNP가 간 조직 또는 비장 조직과 같은 조직으로부터 클리어런스된 비율이다. 바람직하게는, 고비율의 클리어런스는 순환 및/또는 조직에서 상당한 유해 효과 및/또는 감소된 LNP 축적 없이 안전성 프로파일을 초래할 수 있다.
본 개시내용의 화학식 (II) 또는 (I)의 화합물은 이들이 있는 매질의 pH에 따라 염을 형성할 수 있다. 예를 들어, 약간 산성인 매질에서, 화학식 (II) 또는 (I)의 화합물은 양성자화될 수 있고, 따라서 양전하를 보유할 수 있다. 정반대로, 약간 염기성인 매질, 예를 들어, pH가 대략 7.35인 혈액에서, 화학식 (II) 또는 (I)의 화합물은 양성자화되지 않을 수 있고, 따라서 전하를 보유하지 않을 수도 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 화학식 (II) 또는 (I)의 화합물은 적어도 약 9의 pH에서 대부분 양성자화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 화학식 (II) 또는 (I)의 화합물은 적어도 약 10의 pH에서 대부분 양성자화될 수 있다.
화학식 (II) 또는 (I)의 화합물이 대부분 양성자화되는 pH는 이의 고유 pKa와 관련된다. 바람직한 실시형태에서, 본 개시내용의 화학식 (II) 또는 (I)의 화합물의 염은 pKa가 약 5.1 내지 약 8.0, 훨씬 더 바람직하게는 약 5.5 내지 약 7.6의 범위이다. 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 화학식 (II) 또는 (I)의 화합물의 염은 pKa가 약 5.7 내지 약 7.6, 예를 들어, 약 6 내지 약 7.5의 범위이다. 대안적으로, 본 개시내용의 화학식 (II) 또는 (I)의 화합물의 염은 pKa가 약 6 내지 약 8의 범위이다. 약 5.5 내지 약 7.0 범위의 pKa를 갖는 특정 지질에 의해 제형화된 LNP가 생체내, 예를 들어, 간에 대한 화물의 전달에 효과적이라는 것이 발견되었기 때문에, 화학식 (II) 또는 (I)의 화합물의 염의 pKa는 LNP 제형화에 있어서 중요한 고려사항일 수 있다. 추가로, pKa가 약 5.3 내지 약 6.4 범위인 특정 지질에 의해 제형화된 LNP는 생체내, 예를 들어, 종양에 대한 전달에 효과적이라는 것이 발견되었다. 예를 들어, WO 2014/136086 참조.
추가적인 지질
본 개시내용의 지질 조성물에서 사용하기에 적합한 "중성 지질"은, 예를 들어, 다양한 중성, 비하전 또는 양쪽성 지질을 포함한다. 본 개시내용에서 사용하기에 적합한 중성 인지질의 예는, 다이팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 다이스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 포스포콜린(DOPC), 다이미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 포스파티딜콜린(PLPC), 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DAPC), 포스파티딜에탄올아민(PE), 난황 포스파티딜콜린(EPC), 다이라우릴로일포스파티딜콜린(DLPC), 다이미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 1-미리스토일-2-팔미토일 포스파티딜콜린(MPPC), 1-팔미토일-2-미리스토일 포스파티딜콜린(PMPC), 1-팔미토일-2-스테아로일 포스파티딜콜린(PSPC), 1,2-다이아라키도일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DBPC), 1-스테아로일-2-팔미토일 포스파티딜콜린(SPPC), 1,2-다이에이코세노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DEPC), 팔미토일올레오일 포스파티딜콜린(POPC), 라이소포스파티딜 콜린, 다이올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE), 다이리놀레오일포스파티딜콜린 다이스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE), 다이미리스토일 포스파티딜에탄올아민(DMPE), 다이팔미토일 포스파티딜에탄올아민(DPPE), 팔미토일올레오일 포스파티딜에탄올아민(POPE), 라이소포스파티딜에탄올아민 및 이들의 조합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 중성 인지질은 다이스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) 및 다이미리스토일 포스파티딜 에탄올아민(DMPE), 바람직하게는 다이스테아로일포스파티딜콜린(DSPC)으로부터 선택될 수 있다.
"헬퍼 지질"은 스테로이드, 스테롤 및 알킬 레조르시놀을 포함한다. 본 개시내용에서 사용하기에 적합한 헬퍼 지질은 콜레스테롤, 5-헵타데실레조르시놀 및 콜레스테롤 헤미석시네이트를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤 또는 이의 유도체, 예컨대, 콜레스테롤 헤미석시네이트일 수 있다.
PEG 지질은 나노입자가 생체내에(예를 들어, 혈액에) 존재할 수 있는 시간의 길이에 영향을 미칠 수 있다. PEG 지질은, 예를 들어, 입자 응집을 감소시키고, 입자 크기를 제어함으로써, 제형화 공정을 도울 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 PEG 지질은 LNP의 약물동태학 특성을 조절할 수 있다. 전형적으로, PEG 지질은 지질 모이어티 및 PEG에 기반한 중합체 모이어티(때때로 폴리(에틸렌 옥사이드)로서 지칭됨)(PEG 모이어티)를 포함한다. 본 개시내용의 화학식 (II) 또는 (I)의 화합물을 갖는 지질 조성물에서 사용하기에 적합한 PEG 지질 및 이러한 지질의 생화학에 관한 정보는 문헌[Romberg et al., Pharmaceutical Research 25(1), 2008, pp. 55-71 및 Hoekstra et al., Biochimica et Biophysica Acta 1660 (2004) 41-52]에서 찾을 수 있다. 추가적인 적합한 PEG 지질은, 예를 들어, WO 2015/095340(31 페이지, 14째줄 내지 37 페이지, 6째줄), WO 2006/007712, 및 WO 2011/076807 ("스텔스 지질(stealth lipid)")에 개시되어 있다.
일부 실시형태에서, 지질 모이어티는 독립적으로 약 C4 내지 약 C40 포화 또는 불포화 탄소 원자를 포함하는 알킬쇄 길이를 갖는 다이알킬글리세롤 또는 다이알킬글리카마이드기를 포함하는 것을 포함하는, 다이아실글리세롤 또는 다이아실글리카마이드로부터 유래될 수 있되, 쇄는 하나 이상의 작용기, 예를 들어, 아마이드 또는 에스터를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 알킬쇄 길이는 약 C10 내지 C20을 포함한다. 다이알킬글리세롤 또는 다이알킬글리카마이드기는 하나 이상의 치환된 알킬기를 추가로 포함할 수 있다. 쇄 길이는 대칭 또는 비대칭일 수 있다.
달리 표시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "PEG"는 임의의 폴리에틸렌 글리콜 또는 다른 폴리알킬렌 에터 중합체, 예컨대, 에틸렌 글리콜 또는 에틸렌 옥사이드의 선택적으로 치환된 선형 또는 분지된 중합체를 의미한다. 특정 실시형태에서, PEG 모이어티는 비치환된다. 대안적으로, PEG 모이어티는, 예를 들어, 하나 이상의 알킬, 알콕시, 아실, 하이드록시 또는 아릴기에 의해 치환될 수 있다. 예를 들어, PEG 모이어티는 PEG 공중합체, 예컨대, PEG-폴리우레탄 또는 PEG-폴리프로필렌(예를 들어, 문헌[J. Milton Harris, Poly(ethylene glycol) chemistry: biotechnical and biomedical applications (1992)] 참조)을 포함할 수 있고; 대안적으로, PEG 모이어티는 PEG 동종중합체일 수 있다. 특정 실시형태에서, PEG 모이어티는 분자량이 약 130 내지 약 50,000, 예컨대, 약 150 내지 약 30,000, 또는 심지어 약 150 내지 약 20,000이다. 유사하게, PEG 모이어티는 분자량이 약 150 내지 약 15,000, 약 150 내지 약 10,000, 약 150 내지 약 6,000, 또는 심지어 약 150 내지 약 5,000일 수 있다. 특정 바람직한 실시형태에서, PEG 모이어티는 분자량이 약 150 내지 약 4,000, 약 150 내지 약 3,000, 약 300 내지 약 3,000, 약 1,000 내지 약 3,000, 또는 약 1,500 내지 약 2,500이다.
특정 바람직한 실시형태에서, PEG 모이어티는 "PEG 2000"로도 지칭되는 "PEG-2K"이며, 평균 분자량이 약 2,000 달톤이다. PEG-2K는 본 명세서에서 다음의 화학식 (II)로 표시되되, n은 45이고, 이는 수 평균 중합도가 약 45개의 서브유닛
Figure pct00052
를 포함한다는 것을 의미한다. 그러나, 당업계에 공지된 다른 PEG 실시형태가 사용될 수 있으며, 예를 들어, 수 평균 중합도가 약 23개의 서브유닛(n=23), 및/또는 68개의 서브유닛(n=68)을 포함하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, n은 약 30 내지 약 60의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, n은 약 35 내지 약 55의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, n은 약 40 내지 약 50의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, n은 약 42 내지 약 48의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, n은 45일 수 있다. 일부 실시형태에서, R은 H, 치환된 알킬, 및 비치환된 알킬로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, R은 비치환된 알킬, 예컨대, 메틸일 수 있다.
본 명세서에 기재된 임의의 실시형태에서, PEG 지질은 PEG-다이라우로일글리세롤, PEG-다이미리스토일글리세롤(PEG-DMG)(일본 도쿄에 소재한 NOF로부터의 카탈로그 번호 GM-020), PEG-다이팔미토일글리세롤, PEG-다이스테아로일글리세롤(PEG-DSPE)(카탈로그 번호 DSPE-020CN, NOF, 일본 도쿄에 소재), PEG-다이라우릴글리카마이드, PEG-다이미리스틸글리카마이드, PEG-다이팔미토일글리카마이드, 및 PEG-다이스테아로일글리카마이드, PEG-콜레스테롤(1-[8'-(콜레스트-5-엔-3[베타]-옥시)카복스아미도-3',6'-다이옥사옥탄일]카바모일-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜), PEG-DMB(3,4-다이테트라데크옥실벤질-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜)에터), 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](PEG2k-DMG), 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](PEG2k-DSPE)(미국 앨라배마주 앨러배스터에 소재한 Avanti Polar Lipids로부터의 카탈로그 번호 880120C), 1,2-다이스테아로일-sn-글리세롤, 메톡시폴리에틸렌 글리콜(PEG2k-DSG; GS-020, NOF 일본 도쿄에 소재), 폴리(에틸렌 글리콜)-2000-다이메타크릴레이트(PEG2k-DMA), 및 1,2-다이스테아릴옥시프로필-3-아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](PEG2k-DSA)로부터 선택될 수 있다. 소정의 이러한 실시형태에서, PEG 지질은 PEG2k-DMG일 수 있다. 일부 실시형태에서, PEG 지질은 PEG2k-DSG일 수 있다. 다른 실시형태에서, PEG 지질은 PEG2k-DSPE일 수 있다. 일부 실시형태에서, PEG 지질은 PEG2k-DMA일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, PEG 지질은 PEG2k-C-DMA일 수 있다. 특정 실시형태에서, PEG 지질은 WO2016/010840(단락 [00240] 내지 [00244])에 개시되어 있는 화합물 S027일 수 있다. 일부 실시형태에서, PEG 지질은 PEG2k-DSA일 수 있다. 다른 실시형태에서, PEG 지질은 PEG2k-C11일 수 있다. 일부 실시형태에서, PEG 지질은 PEG2k-C14일 수 있다. 일부 실시형태에서, PEG 지질은 PEG2k-C16일 수 있다. 일부 실시형태에서, PEG 지질은 PEG2k-C18일 수 있다.
본 발명의 지질 조성물에서 사용하기에 적합한 양이온성 지질은 N,N-다이올레일-N,N-다이메틸암모늄 클로라이드(DODAC),N,N-다이스테아릴-N,N-다이메틸암모늄 브로마이드(DDAB), N-(1-(2,3-다이올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드(DOTAP), 1,2-다이올레오일-3-다이메틸암모늄-프로판(DODAP), N-(1-(2,3-다이올레일옥시)프로필)-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), 1,2-다이올레오일카바밀-3-다이메틸암모늄-프로판(DOCDAP), 1,2-다이리네오일-3-다이메틸암모늄-프로판(DLINDAP), 다이라우릴(C12:0) 트라이메틸 암모늄 프로판(DLTAP), 다이옥타데실아미도글리실 스퍼민(DOGS), DC-Choi, 다이올레오일옥시-N-[2-(스퍼민카복스아미도)에틸]-N,N-다이메틸-1-프로판아미늄트라이플루오로아세테이트(DOSPA), 1,2-다이미리스틸옥시프로필-3-다이메틸-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DMRIE), 3-다이메틸아미노-2-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시부탄-4-옥시)-1-(시스,시스-9,12-옥타데카다이엔옥시)프로판(CLinDMA), N,N-다이메틸-2,3-다이올레일옥시)프로필아민(DODMA), 2-[5'-(콜레스트-5-엔-3[베타]-옥시)-3'-옥사펜톡시)-3-다이메틸-1-(시스,시스-9',1-2'-옥타데카다이엔옥시)프로판(CpLinDMA), N,N-다이메틸-3,4-다이올레일옥시벤질아민(DMOBA) 및 1,2-N,N'-다이올레일카바밀-3-다이메틸아미노프로판(DOcarbDAP)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, 양이온성 지질은 DOTAP 또는 DLTAP이다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 음이온성 지질은 포스파티딜글리세롤, 카디오리핀, 다이아실포스파티딜세린, 다이아실포스파티드산, N-도데칸오일 포스파티딜 에탄올아민, N-석신일 포스파티딜에탄올아민, N-글루타릴 포스파티딜에탄올아민 콜레스테롤 헤미석시네이트(CHEMS), 및 라이실포스파티딜글리세롤을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
지질 조성물
본 발명은 화학식 (II) 또는 (I) 중 적어도 하나의 화합물 또는 이들의 염(예를 들어, 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염) 및 적어도 하나의 다른 지질 성분을 포함하는 지질 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 또한 선택적으로 하나 이상의 다른 지질 성분과 조합하여 생물학적 활성제를 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 지질 조성물은 지질 성분 및 생물학적 활성제를 포함하는 수성 성분을 포함한다.
일 실시형태에서, 지질 조성물은 화학식 (II) 또는 (I)의 화합물, 또는 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염, 및 적어도 1종의 다른 지질 성분을 포함한다. 다른 실시형태에서, 지질 조성물은 선택적으로 하나 이상의 다른 지질 성분과 조합하여 생물학적 활성제를 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, 지질 조성물은 리포좀 형태이다. 다른 실시형태에서, 지질 조성물은 지질 나노입자(LNP)의 형태이다. 다른 실시형태에서, 지질 조성물은 간에 전달하기에 적합하다.
일 실시형태에서, 지질 조성물은 화학식 (II) 또는 (I)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 및 다른 지질 성분을 포함한다. 이러한 다른 지질 성분은 중성 지질, 헬퍼 지질, PEG 지질, 양이온성 지질 및 음이온성 지질을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 지질 조성물은 화학식 (II) 또는 (I)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 및 중성 지질, 예를 들어 DSPC를 선택적으로 1종 이상의 추가적인 지질 성분과 함께 포함한다. 다른 실시형태에서, 지질 조성물은 화학식 (II) 또는 (I)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 및 헬퍼 지질, 예를 들어, 콜레스테롤을 선택적으로 1종 이상의 추가적인 지질 성분과 함께 포함한다. 다른 실시형태에서, 지질 조성물은 화학식 (II) 또는 (I)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 및 PEG 지질을 선택적으로 1종 이상의 추가적인 지질 성분과 함께 포함한다. 다른 실시형태에서, 지질 조성물은 화학식 (II) 또는 (I)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 및 양이온성 지질을 선택적으로 1종 이상의 추가적인 지질 성분과 함께 포함한다. 다른 실시형태에서, 지질 조성물은 화학식 (II) 또는 (I)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 및 음이온성 지질을 선택적으로 1종 이상의 추가적인 지질 성분과 함께 포함한다. 하위 실시형태에서, 지질 조성물은 화학식 (II) 또는 (I)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 헬퍼 지질 및 PEG 지질을 선택적으로 중성 지질과 함께 포함한다. 추가 하위 실시형태에서, 지질 조성물은 화학식 (II) 또는 (I)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 헬퍼 지질, PEG 지질 및 중성 지질을 포함한다.
화학식 (II) 또는 (I)의 지질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 또는 이의 지질 조성물을 함유하는 조성물은 다양한 분자를 세포에 전달하는 데 유용한 마이크로입자, 나노입자 및 형질감염제를 포함하는 전달제를 형성하는 입자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 다양한 형태일 수 있다. 특정 조성물은 생물학적 활성제를 형질감염시키거나 전달하는 데 효과적이다. 바람직한 생물학적 활성제는 RNA 및 DNA이다. 추가 실시형태에서, 생물학적 활성제는 mRNA, gRNA 및 DNA로부터 선택된다. gRNA는 dgRNA 또는 sgRNA일 수 있다. 특정 실시형태에서, 화물은 RNA-가이드된 DNA-결합제를 암호화하는 mRNA(예를 들어, Cas 뉴클레아제, 클래스 2 Cas 뉴클레아제, 또는 Cas9), gRNA 또는 gRNA를 암호화하는 핵산, 또는 mRNA와 gRNA의 조합물을 포함한다.
상기 지질 조성물에 사용하기 위한 화학식 (II) 또는 (I)의 예시적인 화합물은 실시예 2 내지 99, 100 내지 103 및 113 내지 118에 제공된다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 2이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 3이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 4이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 5이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 6이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 7이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 8이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 9이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 10이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 11이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 12이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 13이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 14이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 15이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 16이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 17이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 18이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 19이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 20이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 21이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 22이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 23이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 24이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 25이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 26이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 27이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 28이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 29이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 30이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 31이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 32이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 33이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 34이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 35이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 36이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 37이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 38이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 39이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 40이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 41이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 42이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 43이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 44이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 45이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 46이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 47이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 48이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 49이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 50이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 51이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 52이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 53이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 54이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 55이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 56이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 57이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 58이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 59이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 60이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 61이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 62이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 63이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 64이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 65이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 66이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 67이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 68이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 69이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 70이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 71이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 72이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 73이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 74이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 75이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 76이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 77이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 78이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 79이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 80이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 81이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 82이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 83이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 84이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 85이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 86이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 87이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 88이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 89이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 90이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 91이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 92이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 93이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 94이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 95이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 96이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 97이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 98이다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 99이다. 특정 실시형태에서, 화합물은 화합물 100이다. 특정 실시형태에서, 화합물은 화합물 101이다. 특정 실시형태에서, 화합물은 화합물 102이다. 특정 실시형태에서, 화합물은 화합물 103이다. 특정 실시형태에서, 화합물은 화합물 113이다. 특정 실시형태에서, 화합물은 화합물 114이다. 특정 실시형태에서, 화합물은 화합물 115이다. 특정 실시형태에서, 화합물은 화합물 116이다. 특정 실시형태에서, 화합물은 화합물 117이다. 특정 실시형태에서, 화합물은 화합물 118이다.
LNP 조성물
지질 조성물은 LNP 조성물로서 제공될 수 있다. 지질 나노입자는, 예를 들어, 마이크로스피어(일부 실시형태에서 실질적으로 구체이고, 더 구체적인 실시형태에서, 예를 들어, RNA 분자의 상당 부분을 포함하는 수성 코어를 포함할 수 있는 단층 및 다층 소수포, 예를 들어, "리포좀"-층상 지질 이중층을 포함), 에멀션에서 분산된 상, 마이셀 또는 현탁액에서 내부 상일 수 있다.
LNP는 크기가 약 1 내지 약 1,000㎚, 약 10 내지 약 500㎚, 약 20 내지 약 500㎚, 하위 실시형태에서 약 50 내지 약 400㎚, 하위 실시형태에서, 약 50 내지 약 300㎚, 하위 실시형태에서 약 50 내지 약 200㎚, 및 하위 실시형태에서 약 50 내지 약 150㎚, 및 다른 하위 실시형태에서 약 60 내지 약 120㎚이다. 바람직하게는, LNP는 크기가 약 60㎚ 내지 약 100㎚이다. 완전히 형성된 LNP의 평균 크기(직경)는 Malvern Zetasizer 또는 Wyatt NanoStar 상에서 동적광산란에 의해 측정될 수 있다. LNP 샘플은 계수율이 대략 200 내지 400 kcp가 되도록 인산염 완충 식염수(PBS)에서 희석된다. 데이터는 강도 측정의 가중치 부여된 평균으로서 제시된다.
본 개시내용의 실시형태는 조성물 중의 성분 지질의 각 몰비에 따라 기재된 지질 조성물을 제공한다. 모든 ㏖% 수는 지질 조성물 또는 더 구체적으로는 LNP 조성물의 지질 성분 분율로서 제공된다. 특정 실시형태에서, 화학식 (II) 또는 (I)의 화합물의 ㏖%는 약 30㏖% 내지 약 70㏖%일 수 있다. 특정 실시형태에서, 화학식 (II) 또는 (I)의 화합물의 ㏖%는 적어도 30㏖%, 적어도 40㏖%, 적어도 50㏖%, 또는 적어도 60㏖%일 수 있다.
특정 실시형태에서, 중성 지질의 ㏖%는 약 0㏖% 내지 약 30㏖%일 수 있다. 특정 실시형태에서, 중성 지질의 ㏖%는 약 0㏖% 내지 약 20㏖%일 수 있다. 특정 실시형태에서, 중성 지질의 ㏖%는 약 10㏖%일 수 있다. 특정 실시형태에서, 중성 지질의 ㏖%는 약 9㏖%일 수 있다.
특정 실시형태에서, 헬퍼 지질의 ㏖%는 약 0㏖% 내지 약 80㏖%일 수 있다. 특정 실시형태에서, 헬퍼 지질의 ㏖%는 약 20㏖% 내지 약 60㏖%일 수 있다. 특정 실시형태에서, 헬퍼 지질의 ㏖%는 약 30㏖% 내지 약 50㏖%일 수 있다. 특정 실시형태에서, 헬퍼 지질의 ㏖%는 30㏖% 내지 약 40㏖% 또는 약 35% ㏖% 내지 약 45㏖%일 수 있다. 특정 실시형태에서, 헬퍼 지질의 ㏖%는 지질 성분이 100㏖%가 되도록 화학식 (II) 또는 (I)의 화합물, 중성 지질, 및/또는 PEG 지질 농도에 기반하여 조절된다.
특정 실시형태에서, PEG 지질의 ㏖%는 약 1㏖% 내지 약 10㏖%일 수 있다. 특정 실시형태에서, PEG 지질의 ㏖%는 약 1㏖% 내지 약 4㏖%일 수 있다. 특정 실시형태에서, PEG 지질의 ㏖%는 약 1㏖% 내지 약 2㏖%일 수 있다. 특정 실시형태에서, PEG 지질의 ㏖%는 약 1.5㏖%일 수 있다.
다양한 실시형태에서, LNP 조성물은 화학식 (II) 또는 (I)의 화합물 또는 이의 염(예컨대, 이의 약제학적으로 허용 가능한 염(예를 들어, 본 명세서에 개시된 바와 같음)), 중성 지질(예를 들어, DSPC), 헬퍼 지질(예를 들어, 콜레스테롤), 및 PEG 지질(예를 들어, PEG2k-DMG)을 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물은 화학식 (II) 또는 (I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염(예를 들어, 본 명세서에 개시된 바와 같음), DSPC, 콜레스테롤, 및 PEG 지질을 포함한다. 일부 이러한 실시형태에서, LNP 조성물은 DMG를 포함하는 PEG 지질, 예컨대, PEG2k-DMG를 포함한다. 특정 바람직한 실시형태에서, LNP 조성물은 화학식 (II) 또는 (I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 콜레스테롤, DSPC, 및 PEG2k-DMG를 포함한다.
특정 실시형태에서, 지질 조성물, 예컨대, LNP 조성물은 지질 성분 및 핵산 성분, 예를 들어, RNA 성분을 포함하고, 화학식 (II) 또는 (I)의 화합물 대 핵산의 몰비가 측정될 수 있다. 본 개시내용의 실시형태는 또한 화학식 (II) 또는 (I)의 화합물의 약제학적으로 허용 가능한 염의 양으로 하전된 아민기(N)와 캡슐화될 핵산의 음으로 하전된 인산염기(P) 사이에 정해진 몰비를 갖는 지질 조성물을 제공한다. 이는 식 N/P로 수학적으로 나타낸다. 일부 실시형태에서, 지질 조성물, 예컨대, LNP 조성물은 화학식 (II) 또는 (I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 지질 성분; 및 핵산 성분을 포함할 수 있되, N/P 비는 약 3 내지 10이다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물은 화학식 (II) 또는 (I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 지질 성분; 및 RNA 성분을 포함할 수 있되, N/P 비는 약 3 내지 10이다. 예를 들어, N/P 비는 약 4 내지 7일 수 있다. 대안적으로, N/P 비는 약 6, 예를 들어, 6±1, 또는 6±0.5일 수 있다.
일부 실시형태에서, 수성 성분은 생물학적 활성제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 수성 성분은 폴리펩타이드를 선택적으로 핵산과 조합하여 포함한다. 일부 실시형태에서, 수성 성분은 핵산, 예컨대, RNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 수성 성분은 핵산 성분이다. 일부 실시형태에서, 핵산 성분은 DNA를 포함하고, 이는 DNA 성분으로 불릴 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산 성분은 RNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 수성 성분, 예컨대, RNA 성분은 mRNA, 예컨대, RNA-가이드된 DNA-결합제를 암호화하는 mRNA를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 Cas 뉴클레아제이다. 특정 실시형태에서, 수성 성분은 Cas9를 암호화하는 mRNA를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 수성 성분은 gRNA를 포함할 수 있다. RNA-가이드된 DNA-결합제를 암호화하는 mRNA를 포함하는 일부 조성물에서, 조성물은 gRNA 핵산, 예컨대, gRNA를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 수성 성분은 RNA-가이드된 DNA-결합제 및 gRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 수성 성분은 Cas 뉴클레아제 mRNA 및 gRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 수성 성분은 클래스 2 Cas 뉴클레아제 mRNA 및 gRNA를 포함한다.
특정 실시형태에서, 지질 조성물, 예컨대, LNP 조성물은 Cas 뉴클레아제, 예컨대, 클래스 2 Cas 뉴클레아제를 암호화하는 mRNA, 화학식 (II) 또는 (I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 헬퍼 지질, 선택적으로 중성 지질, 및 PEG 지질을 포함할 수 있다. Cas 뉴클레아제, 예컨대, 클래스 2 Cas 뉴클레아제를 암호화하는 mRNA를 포함하는 특정 조성물에서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤이다. Cas 뉴클레아제, 예컨대, 클래스 2 Cas 뉴클레아제를 암호화하는 mRNA를 포함하는 다른 조성물에서, 중성 지질은 DSPC이다. Cas 뉴클레아제, 예컨대, 클래스 2 Cas 뉴클레아제, 예를 들어, Cas9를 암호화하는 mRNA를 포함하는 추가적인 실시형태에서, PEG 지질은 PEG2k-DMG이다. Cas 뉴클레아제, 예컨대, 클래스 2 Cas 뉴클레아제를 암호화하는 mRNA, 및 화학식 (II) 또는 (I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 특정 조성물에서. 특정 조성물에서, 조성물은 gRNA, 예컨대, dgRNA 또는 sgRNA를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 지질 조성물, 예컨대, LNP 조성물은 gRNA를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 조성물은 화학식 (II) 또는 (I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, gRNA, 헬퍼 지질, 선택적으로 중성 지질, 및 PEG 지질을 포함할 수 있다. gRNA를 포함하는 특정 LNP 조성물에서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤이다. gRNA를 포함하는 일부 조성물에서, 중성 지질은 DSPC이다. gRNA를 포함하는 추가적인 실시형태에서, PEG 지질은 PEG2k-DMG이다. 특정 조성물에서, gRNA는 dgRNA 및 sgRNA로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 지질 조성물, 예컨대, LNP 조성물은 수성 성분에 sgRNA일 수 있는 RNA-가이드된 DNA-결합제를 암호화하는 mRNA 및 gRNA 및 지질 성분에 화학식 (II) 또는 (I)의 화합물을 포함한다. 예를 들어, LNP 조성물은 화학식 (II) 또는 (I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, Cas 뉴클레아제를 암호화하는 mRNA, gRNA, 헬퍼 지질, 중성 지질 및 PEG 지질을 포함할 수 있다. Cas 뉴클레아제를 암호화하는 mRNA 및 gRNA를 포함하는 특정 조성물에서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤이다. Cas 뉴클레아제를 암호화하는 mRNA 및 gRNA를 포함하는 일부 조성물에서, 중성 지질은 DSPC이다. Cas 뉴클레아제를 암호화하는 mRNA 및 gRNA를 포함하는 추가적인 실시형태에서, PEG 지질은 PEG2k-DMG이다.
특정 실시형태에서, 지질 조성물, 예컨대, LNP 조성물은 RNA-가이드된 DNA-결합제, 예컨대, 클래스 2 Cas mRNA 및 적어도 하나의 gRNA를 포함한다. 특정 실시형태에서, LNP 조성물은 약 1:1 또는 약 1:2의 gRNA 대 RNA-가이드된 DNA-결합제 mRNA, 예컨대, 클래스 2 Cas 뉴클레아제 mRNA의 비를 포함한다. 일부 실시형태에서, 비는 약 25:1 내지 약 1:25, 약 10:1 내지 약 1:10, 약 8:1 내지 약 1:8, 약 4:1 내지 약 1:4, 또는 약 2:1 내지 약 1:2이다.
본 명세서에 개시된 지질 조성물, 예컨대, LNP 조성물은 주형 핵산, 예를 들어, DNA 주형을 포함할 수 있다. 주형 핵산은 LNP 조성물을 비롯하여, 화학식 (II) 또는 (I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 지질 조성물과 함께 또는 별개로 전달될 수 있다. 일부 실시형태에서, 주형 핵산은 목적하는 수선 메커니즘에 따라서 단일- 또는 이중-가닥일 수 있다. 주형은 표적 DNA에 대해, 예를 들어, 표적 DNA 서열 내에서 그리고 또는 표적 DNA에 인접한 서열에 대해 상동성 영역을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, LNP는 수성 RNA 용액을 유기 용매-기반 지질 용액과 혼합함으로써 형성된다. 적합한 용액 또는 용매는 물, PBS, 트리스(Tris) 완충제, NaCl, 시트르산염 완충제, 아세테이트 완충제, 에탄올, 클로로폼, 다이에틸에터, 사이클로헥산, 테트라하이드로퓨란, 메탄올, 아이소프로판올을 포함하거나 함유할 수 있다. 예를 들어, 유기 용매는 100% 에탄올일 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 완충제가, 예를 들어, LNP의 생체내 투여를 위해, 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 완충제는 pH 6.5 이상에서 LNP를 포함하는 조성물의 pH를 유지하는 데 사용된다. 특정 실시형태에서, 완충제는 pH 7.0 이상에서 LNP를 포함하는 조성물의 pH를 유지하는 데 사용된다. 특정 실시형태에서, 조성물은 pH가 약 7.2 내지 약 7.7의 범위이다. 추가적인 실시형태에서, 조성물은 pH가 약 7.3 내지 약 7.7의 범위이거나 약 7.4 내지 약 7.6의 범위이다. 추가 실시형태에서, 조성물은 pH가 약 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6 또는 7.7이다. 조성물의 pH는 마이크로 pH 프로브로 측정될 수 있다. 특정 실시형태에서, 동결보호제는 조성물에 포함된다. 동결보호제의 비제한적 예는 수크로스, 트레할로스, 글리세롤, DMSO 및 에틸렌 글리콜을 포함한다. 예시적인 조성물은 최대 10% 동결보호제, 예를 들어, 수크로스를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 조성물은 트리스 식염수 수크로스(TSS)를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, LNP 조성물은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10%의 동결보호제를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, LNP 조성물은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10%의 수크로스를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물은 완충제를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 완충제는 인산염 완충제(PBS), 트리스 완충제, 시트르산염 완충제, 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 특정 예시적 실시형태에서, 완충제는 NaCl을 포함한다. 특정 실시형태에서, 완충제는 NaCl을 결여한다. NaCl의 예시적인 양은 약 20mM 내지 약 45mM의 범위일 수 있다. NaCl의 예시적인 양은 약 40mM 내지 약 50mM의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, NaCl의 양은 약 45mM이다. 일부 실시형태에서, 완충제는 트리스 완충제이다. 트리스의 예시적인 양은 약 20mM 내지 약 60mM의 범위일 수 있다. 트리스의 예시적인 양은 약 40mM 내지 약 60mM의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, 트리스의 양은 약 50mM이다. 일부 실시형태에서, 완충제는 NaCl 및 트리스를 포함한다. LNP 조성물의 특정 예시적 실시형태는 트리스 완충제 중에 5% 수크로스 및 45mM NaCl을 함유한다. 다른 예시적인 실시형태에서, 조성물은 pH 7.5에서 약 5% w/v의 양으로 수크로스, 약 45mM NaCl, 및 약 50mM 트리스를 함유한다. 전체 조성물의 삼투압몰농도가 유지되도록 염, 완충제 및 동결보호제 양은 달라질 수 있다. 예를 들어, 최종 삼투압몰농도는 450mOsm/ℓ 미만에서 유지될 수 있다. 추가 실시형태에서, 삼투압몰농도는 350 내지 250mOsm/ℓ이다. 특정 실시형태는 최종 삼투압몰농도가 300+/-20mOsm/ℓ 또는 310 +/- 40mOsm/ℓ이다.
일부 실시형태에서, 유기 용매 중의 수성 RNA 용액 및 지질 용액의 미세유체 혼합, T-혼합 또는 교차-혼합이 사용된다. 특정 양상에서, 유속, 접합 크기, 접합 기하학, 접합 형상, 관 직경, 용액 및/또는 RNA 및 지질 농도는 변할 수 있다. LNP 또는 LNP 조성물은, 예를 들어, 투석, 원심분리 필터, 접선 유동 여과 또는 크로마토그래피를 통해 농축 또는 정제될 수 있다. LNP는, 예를 들어, 현탁액, 에멀션 또는 동결건조 분말로서 저장될 수 있다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물은 2 내지 8℃에서 저장되고, 특정 양상에서, LNP 조성물은 실온에서 저장된다. 추가적인 실시형태에서, LNP 조성물은, 예를 들어 -20℃ 또는 -80℃에서 냉동 저장된다. 다른 실시형태에서, LNP 조성물은 약 0℃ 내지 약 -80℃ 범위의 온도에서 저장된다. 냉동된 LNP 조성물은 사용 전에, 예를 들어, 얼음 상에서, 실온에서 또는 25℃에서 해동될 수 있다.
LNP는, 예를 들어, 마이크로스피어(일부 실시형태에서 실질적으로 구체이고, 더 구체적인 실시형태에서, 예를 들어, RNA 분자의 상당 부분을 포함하는 수성 코어를 포함할 수 있는 단층 및 다층 소수포, 예를 들어, "리포좀"-층상 지질 이중층을 포함), 에멀션에서 분산된 상, 마이셀 또는 현탁액에서 내부 상일 수 있다.
바람직한 지질 조성물, 예컨대, LNP 조성물은, 이들이 치료적으로 유효한 용량으로 생체내에서 세포독성 수준을 축적하지 않는다는 점에서 생분해성이다. 일부 실시형태에서, 조성물은 치료적 용량 수준에서 실질적인 유해 효과를 야기하는 선천성 면역 반응을 야기하지 않는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조성물은 치료적 용량 수준에서 독성을 야기하지 않는다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 LNP는 다분산도(polydispersity index: PDI)가 약 0.005 내지 약 0.75의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, LNP는 PDI가 약 0.01 내지 약 0.5 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, LNP는 PDI가 약 0 내지 약 0.4 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, LNP는 PDI가 약 0 내지 약 0.35 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, LNP는 PDI가 약 0 내지 약 0.35 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, LNP PDI는 약 0 내지 약 0.3의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, LNP는 PDI가 약 0 내지 약 0.25 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, LNP PDI는 약 0 내지 약 0.2의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, LNP는 PDI가 약 0.08, 0.1, 0.15, 0.2 또는 0.4 미만일 수 있다.
본 명세서에 개시된 LNP는 크기(예를 들어, Z-평균 직경)가 약 1 내지 약 250㎚이다. 일부 실시형태에서, LNP는 크기가 약 10 내지 약 200㎚이다. 추가 실시형태에서, LNP는 크기가 약 20 내지 약 150㎚이다. 일부 실시형태에서, LNP는 크기가 약 50 내지 약 150㎚이다. 일부 실시형태에서, LNP는 크기가 약 50 내지 약 100㎚이다. 일부 실시형태에서, LNP는 크기가 약 50 내지 약 120㎚이다. 일부 실시형태에서, LNP는 크기가 약 60 내지 약 100㎚이다. 일부 실시형태에서, LNP는 크기가 약 75 내지 약 150㎚이다. 일부 실시형태에서, LNP는 크기가 약 75 내지 약 120㎚이다. 일부 실시형태에서, LNP는 크기가 약 75 내지 약 100㎚이다. 달리 표시되지 않는 한, 본 명세서에 언급된 모든 크기는 Malvern Zetasizer 또는 Wyatt NanoStar 상의 동적광산란에 의해 측정될 때, 완전히 형성된 나노입자의 평균 크기(직경)이다. 나노입자 샘플은 계수율이 대략 200 내지 400kcp가 되도록 인산염 완충 식염수(PBS)에서 희석된다. 데이터는 강도 측정의 가중치 부여된 평균으로서 제시된다(Z-평균 직경).
일부 실시형태에서, LNP는 약 50% 내지 약 100% 범위의 평균 캡슐화 효율로 형성된다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 50% 내지 약 95% 범위의 평균 캡슐화 효율로 형성된다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 70% 내지 약 90% 범위의 평균 캡슐화 효율로 형성된다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 90% 내지 약 100% 범위의 평균 캡슐화 효율로 형성된다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 75% 내지 약 95% 범위의 평균 캡슐화 효율로 형성된다.
화물
LNP 조성물을 통해 전달된 화물은 생물학적 활성제일 수 있다. 특정 실시형태에서, 화물은 1종 이상의 생물학적 활성제, 예컨대, mRNA, gRNA, 발현 벡터, 주형 핵산, RNA-가이드된 DNA-결합제, 항체(예를 들어, 단클론성, 키메라, 인간화, 나노바디 및 이들의 단편 등), 콜레스테롤, 호르몬, 펩타이드, 단백질, 화학치료제 및 다른 유형의 항신생물제, 저분자량 약물, 비타민, 보조인자, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 효소적 핵산, 안티센스 핵산, 삼중가닥 형성 올리고뉴클레오타이드, 안티센스 DNA 또는 RNA 조성물, 키메라 DNA:RNA 조성물, 알로자임, 앱타머, 리보자임, 유인물(decoy) 및 이들의 유도체, 플라스미드 및 다른 유형의 벡터, 및 작은 핵산 분자, RNAi 제제, 짧은 간섭 핵산(siNA), 짧은 간섭 RNA(siRNA), 이중-가닥 RNA(dsRNA), 마이크로-RNA (miRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 및 "자기-복제 RNA"(레플리카제 효소 활성을 암호화하고 이것 자신의 복제 또는 생체내 증폭을 지시할 수 있음) 분자, 펩타이드 핵산(PNA), 잠금 핵산 리보뉴클레오타이드(LNA), 몰폴리노 뉴클레오타이드, 트레오스 핵산(TNA), 글리콜 핵산(GNA), sisiRNA(작은 내부적으로 세그먼트화된 간섭 RNA), 및 iRNA(비대칭 간섭 RNA)이거나 이들을 포함한다. 생물학적 활성제의 상기 열거는 단지 예시적이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 이러한 화합물은 정제되거나 부분적으로 정제될 수 있고, 천연 유래 또는 합성일 수 있고, 화학적으로 변형될 수 있다.
LNP 조성물을 통해 전달된 화물은 RNA, 예컨대, 관심 대상의 단백질을 암호화하는 mRNA 분자일 수 있다. 예를 들어, 단백질, 예컨대, 녹색 형광 단백질(GFP), RNA-가이드된 DNA-결합제, 또는 Cas 뉴클레아제를 발현시키기 위한 mRNA가 포함된다. 클래스 2 Cas 뉴클레아제, 예컨대, Cas9 또는 Cpf1 단백질의 세포에서 발현을 가능하게 하는 Cas 뉴클레아제 mRNA, 예를 들어, 클래스 2 Cas 뉴클레아제 mRNA를 포함하는 LNP 조성물이 제공된다. 추가로, 화물은 gRNA를 암호화하는 하나 이상의 gRNA 또는 핵산을 함유할 수 있다. 주형 핵산은, 예를 들어, 수선 또는 재조합을 위해, 또한 조성물에 포함될 수 있거나 또는 주형 핵산은 본 명세서에 기재된 방법에 사용될 수 있다. 하위 실시형태에서, 화물은 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) Cas9, 선택적으로 및 스트렙토코커스 피오게네스 gRNA를 암호화하는 mRNA를 포함한다. 추가 하위 실시형태에서, 화물은 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis) Cas9, 선택적으로 및 Nme(네이세리아 메닌기티디스) gRNA를 암호화하는 mRNA를 포함한다.
"mRNA"는 폴리뉴클레오타이드를 지칭하고, 폴리펩타이드로 번역될 수 있는(즉, 리보솜 및 아미노-아실화된 tRNA에 의한 번역을 위한 기질로서 작용할 수 있는) 오픈 리딩 프레임을 포함한다. mRNA는 리보스 잔기 또는 이의 유사체, 예를 들어, 2'-메톡시 리보스 잔기를 포함하는 인산염-당 골격을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, mRNA 인산염-당 골격의 당은 리보스 잔기, 2'-메톡시 리보스 잔기, 또는 이들의 조합물로 본질적으로 이루어진다. 일반적으로, mRNA는 상당량의 티미딘 잔기(예를 들어, 0개의 잔기 또는 30, 20, 10, 5, 4, 3 또는 2개 미만의 티미딘 잔기; 또는 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.2%, 또는 0.1% 미만의 티미딘 함량)를 함유하지 않는다. mRNA는 이의 유리딘 위치의 일부 또는 모두에서 변형된 유리딘을 포함할 수 있다.
CRISPR/Cas 화물
특정 실시형태에서, 개시된 조성물은 RNA-가이드된 DNA-결합제, 예컨대, Cas 뉴클레아제를 암호화하는 mRNA를 포함한다. 특정 실시형태에서, 개시된 조성물은 클래스 2 Cas 뉴클레아제, 예컨대, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 암호화하는 mRNA를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, "RNA-가이드된 DNA-결합제"는 RNA 및 DNA-결합 활성을 갖는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 복합체, 또는 이러한 복합체의 DNA-결합 서브유닛을 의미하되, DNA-결합 활성은 서열-특이적이고, RNA의 서열에 의존한다. 예시적인 RNA-가이드된 DNA-결합제는 Cas 절단효소/틈내기효소 및 이들의 비활성화된 형태("dCas DNA-결합제")를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 "Cas 뉴클레아제"는 Cas 절단효소, Cas 틈내기효소, 및 dCas DNA-결합제를 포함한다. Cas 절단효소/틈내기효소 및 dCas DNA-결합제는 III형 CRISPR 시스템의 Csm 또는 Cmr 복합체, 이의 Cas10, Csm1 또는 Cmr2 서브유닛, I형 CRISPR 시스템 캐스케이드 복합체, 이의 Cas3 서브유닛 및 클래스 2 Cas 뉴클레아제를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, "클래스 2 Cas 뉴클레아제"는 RNA-가이드된 DNA-결합 활성을 갖는 단일쇄 폴리펩타이드이다. 클래스 2 Cas 뉴클레아제는 클래스 2 Cas 절단효소/틈내기효소(예를 들어, H840A, D10A 또는 N863A 변이체)(이는 RNA-가이드된 DNA 절단효소 또는 틈내기효소 활성을 추가로 가짐), 및 클래스 2 dCas DNA-결합제를 포함하며, 이때 절단효소/틈내기효소 활성은 비활성화된다. 클래스 2 Cas 뉴클레아제는, 예를 들어, Cas9, Cpf1, C2c1, C2c2, C2c3, HF Cas9(예를 들어, N497A, R661A, Q695A, Q926A 변이체), HypaCas9(예를 들어, N692A, M694A, Q695A, H698A 변이체), eSPCas9(1.0)(예를 들어, K810A, K1003A, R1060A 변이체), 및 eSPCas9(1.1)(예를 들어, K848A, K1003A, R1060A 변이체) 단백질 및 이의 변형을 포함한다. Cpf1 단백질, 문헌[Zetsche et al., Cell, 163: 1-13 (2015)]은 Cas9에 상동성이며, RuvC-유사 뉴클레아제 도메인을 포함한다. Zetsche의 Cpf1 서열은 이들 전체가 참조에 의해 포함된다. 예를 들어, 문헌[Zetsche, 표 2 및 표 4] 참조. 예를 들어, 문헌[Makarova et al., Nat Rev Microbiol, 13(11): 722-36 (2015); Shmakov et al., Molecular Cell, 60:385-397 (2015)] 참조.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, "리보핵산단백질"(RNP) 또는 "RNP 복합체"는 gRNA와 RNA-가이드된 DNA-결합제, 예컨대, Cas 뉴클레아제, 예를 들어, Cas 절단효소, Cas 틈내기효소, 또는 dCas DNA-결합제(예를 들어, Cas9)를 함께 지칭한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 RNA-가이드된 DNA-결합제, 예컨대, Cas9를 표적 서열로 가이드하며, gRNA는 표적 서열에 결합하는 제제와 혼성화하고; 제제가 절단효소 또는 틈내기효소인 경우에, 결합 다음에 절단 또는 틈내기가 이어질 수 있다.
본 개시내용의 일부 실시형태에서, LNP 조성물에 대한 화물은 뉴클레아제(예를 들어, Cas 뉴클레아제, 예컨대, Cas9)일 수 있는 RNA-가이드된 DNA-결합제를 표적 DNA로 보내는 가이드 서열을 포함하는 적어도 하나의 gRNA를 포함한다. gRNA는 Cas 뉴클레아제 또는 클래스 2 Cas 뉴클레아제를 표적 핵산 분자 상의 표적 서열로 가이드할 수 있다. 일부 실시형태에서, gRNA는 클래스 2 Cas 뉴클레아제와 결합하고, 이에 의한 절단의 특이성을 제공한다. 일부 실시형태에서, gRNA 및 Cas 뉴클레아제는 리보핵산단백질(RNP), 예를 들어, CRISPR/Cas 복합체, 예컨대, CRISPR/Cas9 복합체를 형성할 수 있다. 일부 실시형태에서, CRISPR/Cas 복합체는 II형 CRISPR/Cas9 복합체일 수 있다. 일부 실시형태에서, CRISPR/Cas 복합체는 V형 CRISPR/Cas 복합체, 예컨대, Cpf1/gRNA 복합체일 수 있다. Cas 뉴클레아제 및 동족 gRNA는 짝지어질 수 있다. 각각의 클래스 2 Cas 뉴클레아제와 짝지어지는 gRNA 스캐폴드 구조는 구체적 CRISPR/Cas 시스템에 따라 다르다.
"가이드 RNA", "gRNA" 및 단순히 "가이드"는 RNA-가이드된 DNA-결합제에 대한 동족 가이드 핵산을 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호 호환적으로 사용된다. 가이드 RNA는 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형된 RNA를 포함할 수 있다. gRNA는 crRNA(CRISPR RNA로도 알려짐), 또는 crRNA와 trRNA의 조합물(tracrRNA로도 알려짐) 중 하나일 수 있다. crRNA 및 trRNA는 단일 RNA 분자(단일 가이드 RNA, sgRNA)로서 또는 2개의 별개의 RNA 분자(이중 가이드 RNA, dgRNA)에 회합될 수 있다. "가이드 RNA" 또는 "gRNA"는 각각의 유형을 지칭한다. trRNA는 천연-유래 서열, 또는 천연-유래 서열에 비해 변형 또는 변화를 갖는 trRNA 서열일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "가이드 서열"은 표적 서열에 상보성이며, RNA-가이드된 DNA-결합제에 의한 결합 또는 변형(예를 들어, 절단)을 위해 gRNA를 표적 서열로 보내는 작용을 하는, gRNA 내의 서열을 지칭한다. "가이드 서열"은 또한 "표적화 서열" 또는 "스페이서 서열"로서 지칭될 수 있다. 가이드 서열은, 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스(즉, Spy Cas9) 및 관련된 Cas9 상동체/오솔로그의 경우에, 길이가 20개의 염기쌍일 수 있다. 보다 짧거나 보다 긴 서열, 예를 들어, 15-, 16-, 17-, 18-, 19-, 21-, 22-, 23-, 24- 또는 25-뉴클레오타이드 길이가 또한 가이드로서 사용된다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은, 예를 들어, 유전자 내 또는 염색체 상에 있고, 가이드 서열에 상보성이다. 일부 실시형태에서, 가이드 서열과 이의 대응하는 표적 서열 간의 상보성 또는 동일성 정도는 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%일 수 있다. 일부 실시형태에서, 가이드 서열 및 표적 영역은 적어도 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 인접한 뉴클레오타이드의 영역에 걸쳐 100% 상보성 또는 동일할 수 있다. 다른 실시형태에서, 가이드 서열 및 표적 영역은 적어도 하나의 미스매치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 가이드 서열 및 표적 서열은 1, 2, 3 또는 4개의 미스매치를 포함할 수 있고, 여기서 표적 서열의 총 길이는 적어도 17, 18, 19, 20개 이상의 염기쌍이다. 일부 실시형태에서, 가이드 서열 및 표적 영역은 1 내지 4개의 미스매치를 포함할 수 있고, 여기서 가이드 서열은 적어도 17, 18, 19, 20개 이상의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 가이드 서열 및 표적 영역은 1, 2, 3 또는 4개의 미스매치를 포함할 수 있고, 여기서 가이드 서열은 20개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
RNA-가이드된 DNA-결합 단백질, 예컨대, Cas 단백질에 대한 표적 서열은, Cas 단백질에 대한 핵산 기질이 이중 가닥 핵산이기 때문에 게놈 DNA의 양성 가닥과 음성 가닥(즉, 주어진 서열 및 서열의 역 보체)을 둘 다 포함한다. 따라서, 가이드 서열이 "표적 서열에 대해 상보성"인 것으로 언급되는 경우에, 가이드 서열은 gRNA가 표적 서열의 역 보체에 결합하도록 지시할 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 가이드 서열이 표적 서열의 역 보체에 결합하는 경우, 가이드 서열은 가이드 서열에서 T를 U로 치환한 것을 제외하고, 표적 서열(예를 들어, PAM을 포함하지 않는 표적 서열)의 특정 뉴클레오타이드와 동일하다.
표적화 서열의 길이는 사용한 CRISPR/Cas 시스템 및 성분에 따를 수 있다. 예를 들어, 상이한 박테리아 종으로부터의 상이한 클래스 2 Cas 뉴클레아제는 다양한 최적의 표적화 서열 길이를 가진다. 따라서, 표적화 서열은 길이 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 50개 초과의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적화 서열 길이는 천연-유래 CRISPR/Cas 시스템의 가이드 서열보다 더 길거나 더 짧은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오타이드이다. 특정 실시형태에서, Cas 뉴클레아제 및 gRNA 스캐폴드는 동일한 CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래될 것이다. 일부 실시형태에서, 표적화 서열은 18 내지 24개의 뉴클레오타이드를 포함하거나, 이들로 이루어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적화 서열은 19 내지 21개의 뉴클레오타이드를 포함하거나, 이들로 이루어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적화 서열은 20개의 뉴클레오타이드를 포함하거나, 이들로 이루어질 수 있다.
일부 실시형태에서, sgRNA는 Cas9 단백질에 의해 RNA-가이드된 DNA 절단을 매개할 수 있는 "Cas9 sgRNA"이다. 일부 실시형태에서, sgRNA는 Cpf1 단백질에 의해 RNA-가이드된 DNA 절단을 매개할 수 있는 "Cpf1 sgRNA"이다. 특정 실시형태에서, gRNA는 Cas9 단백질과 활성 복합체를 형성하고 RNA-가이드된 DNA 절단을 매개하는 데 충분한 crRNA 및 tracr RNA를 포함한다. 특정 실시형태에서, gRNA는 Cpf1 단백질과 활성 복합체를 형성하고 RNA-가이드된 DNA 절단을 매개하는 데 충분한 crRNA를 포함한다. 문헌[Zetsche 2015] 참조.
본 발명의 특정 실시형태는 또한 본 명세서에 기재된 gRNA를 암호화하는 핵산, 예를 들어, 발현 카세트를 제공한다. "가이드 RNA 핵산"은 gRNA(예를 들어, sgRNA 또는 dgRNA), 및 하나 이상의 gRNA를 암호화하는 핵산인 gRNA 발현 카세트를 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다.
변형된 RNA
특정 실시형태에서, 지질 조성물, 예컨대, LNP 조성물은 변형된 RNA를 포함하는, 변형된 핵산을 포함한다.
변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드는 RNA, 예를 들어, gRNA 또는 mRNA에 존재할 수 있다. 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 포함하는 gRNA 또는 mRNA는, 예를 들어, 표준 A, G, C 및 U 잔기 대신에 또는 이에 추가로 사용되는 하나 이상의 비천연 및/또는 천연 유래 성분 또는 입체배치의 존재를 설명하기 위해 "변형된" RNA로 불린다. 일부 실시형태에서, 변형된 RNA는 본 명세서에서 "변형된"으로 불리는 비표준 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 이용하여 합성된다.
변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 (i) 포스포다이에스터 골격 결합에서 비-연결 인산염 산소 중 하나 또는 둘 다의 그리고/또는 연결하는 인산염 산소 중 하나 이상의 변경, 예를 들어, 대체(예시적인 골격 변형); (ii) 리보스 당의 구성요소의, 예를 들어, 리보스 당 상의 2' 하이드록실의 변경, 예를 들어, 대체(예시적인 당 변형); (iii) 인산염 모이어티의 "데포스포(dephospho)" 링커로의 대규모 대체(예시적인 골격 변형); (iv) 비표준 핵염기에 의하는 것을 포함하는 천연 유래 핵염기의 변형 또는 대체(예시적인 염기 변형); (v) 리보스-인산염 골격의 대체 또는 변형(예시적인 골격 변형); (vi) 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단 또는 5' 말단의 변형, 예를 들어, 모이어티, 캡 또는 링커의 말단 인산염기 또는 접합의 제거, 변형 또는 대체(이러한 3' 또는 5' 캡 변형은 당 및/또는 골격 변형을 포함할 수 있음); 및 (vii) 당의 변형 또는 대체(예시적인 당 변형) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 특정 실시형태는 mRNA, gRNA, 또는 핵산에 대한 5' 말단 변형을 포함한다. 특정 실시형태는 mRNA, gRNA, 또는 핵산에 대한 변형을 포함한다. 특정 실시형태는 mRNA, gRNA, 또는 핵산에 대한 3' 말단 변형을 포함한다. 변형된 RNA는 5' 말단 및 3' 말단 변형을 포함할 수 있다. 변형된 RNA는 비-말단 위치에 하나 이상의 변형된 잔기를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, gRNA는 적어도 하나의 변형된 잔기를 포함한다. 특정 실시형태에서, mRNA는 적어도 하나의 변형된 잔기를 포함한다.
비변형 핵산은, 예를 들어, 세포내 뉴클레아제 또는 혈청에서 발견된 것에 의해 분해되기 쉬울 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제는 핵산 포스포다이에스터 결합을 가수분해할 수 있다. 따라서, 일 양상에서, 본 명세서에 기재된 RNA(예를 들어, mRNA, gRNA)는, 예를 들어, 세포내 또는 혈청 기반 뉴클레아제쪽으로 안정성을 도입하기 위해 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 RNA 분자는 생체내와 생체외 둘 다에서 세포 집단 내로 도입될 때 감소된 선천성 면역 반응을 나타낼 수 있다. 용어 "선천성 면역 반응"은 사이토카인 발현 및 방출, 특히 인터페론 및 세포사의 유도를 수반하는 단일 가닥 핵산을 포함하는 외인성 핵산에 대한 세포 반응을 포함한다.
따라서, 일부 실시형태에서, RNA 또는 핵산은, 예를 들어, 생체내 뉴클레아제 분해에 대해 개선된 내성을 포함하는, 핵산에 대해 증가 또는 향상된 안정성을 부여하는 적어도 하나의 변형을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "변형" 및 "변형된"과 같은 용어는 바람직하게는 안정성을 향상시키고 RNA 또는 핵산의 야생형 또는 천연 유래 형태보다 더 안정한(예를 들어, 뉴클레아제 분해에 저항성인) RNA 또는 핵산을 제공하는 적어도 하나의 변경을 포함하는 본 명세서에 제공된 핵산에 관한 것이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "안정한" 및 "안정성"과 같은 용어는 본 발명의 핵산에 관한 것이며, 특히 RNA와 관련하여, 예를 들어 정상적으로 이러한 RNA를 분해할 수 있는 뉴클레아제(즉, 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제)에 의한 분해에 대해 증가된 또는 향상된 내성을 지칭한다. 증가된 안정성은 내인성 효소(예를 들어, 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제) 또는 표적 세포 또는 조직 내의 조건에 의한 가수분해 또는 다른 파괴에 대해 더 적은 민감성을 포함함으로써, 표적 세포, 조직, 대상체 및/또는 세포질에서 이러한 RNA 또는 핵산의 저항성을 증가시키거나 향상시킬 수 있다. 본 명세서에 제공된 안정화된 RNA 또는 핵산 분자는 이들의 천연 유래, 비변형 상대(예를 들어, 분자의 야생형 형태)에 대해 더 긴 반감기를 입증한다. 또한 본 명세서에 개시된 LNP 조성물의 mRNA와 관련된 "변형" 및 "변형된"과 같은 용어에 의해, 예를 들어, 단백질 번역의 개시에서 작용하는 서열(예를 들어, Kozak 공통 서열)을 포함하는, mRNA 핵산의 번역을 개선하거나 향상시키는 변경이 상정된다. (Kozak, M., Nucleic Acids Res 15 (20): 8125-48 (1987)).
일부 실시형태에서, RNA 또는 핵산은 이를 더 안정하게 만들도록 화학적 또는 생물학적으로 변형되었다. RNA 또는 핵산에 대한 예시적인 변형은 염기의 고갈(예를 들어, 결실에 의해 또는 하나의 뉴클레오타이드의 다른 뉴클레오타이드로의 치환에 의해) 또는 염기의 변형, 예를 들어, 염기의 화학적 변형을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 어구 "화학적 변형"은 천연 유래 RNA 또는 핵산, 예를 들어, 공유 변형, 예컨대, 변형된 뉴클레오타이드(예를 들어, 뉴클레오타이드 유사체, 또는 이러한 RNA 또는 핵산 분자에서 자연적으로 발생되지 않는 현수기의 포함)에서 보이는 것과 다른 화학을 도입하는 변형을 포함한다.
골격 변형의 일부 실시형태에서, 변형된 잔기의 인산염 기는 산소 상이한 치환체로 하나 이상의 산소를 상이한 치환체로 대체함으로써 변형될 수 있다. 추가로, 변형된 잔기, 예를 들어, 변형된 핵산에 존재하는 변형된 잔기는 비변형 인산염 모이어티를 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형된 인산염 기로 대대적으로 대체하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 인산염 골격의 골격 변형은 비대칭 전하 분포를 갖는 비하전 링커 또는 하전 링커를 초래하는 변경을 포함할 수 있다.
변형된 인산염기의 예는 포스포로티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노인산염, 보라노 인산염 에스터, 인산수소, 포스포로아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트 및 포스포트라이에스터를 포함한다. 비변형 인산염기에서 인 원자는 아키랄(achiral)이다. 그러나, 비-브리지 산소 중 하나를 상기 원자 중 하나 또는 원자의 기로 대체하는 것은 인 원자 키랄을 제공할 수 있다. 입체발생 인 원자는 "R" 입체배치(본 명세서에서 Rp) 또는 "S" 입체배치(본 명세서에서 Sp) 중 하나를 가질 수 있다. 골격은 또한 브리징 산소(즉, 인산염을 뉴클레오사이드에 연결하는 산소)를 질소(브리지된 포스포로아미데이트), 황(브리지된 포스포로티오에이트) 및 탄소(브리지된 메틸렌포스포네이트)로 대체함으로써 변형될 수 있다. 대체는 연결하는 산소 또는 연결하는 산소 둘 다에서 생길 수 있다. 인산염기는 특정 골격 변형에서 비-인 함유 커넥터에 의해 대체될 수 있다. 일부 실시형태에서, 하전된 인산염기는 중성 모이어티로 대체될 수 있다. 인산염기를 대체할 수 있는 모이어티의 예는, 예를 들어, 메틸 포스포네이트, 하이드록실아미노, 실록산, 탄산염, 카복시메틸, 카밤산염, 아마이드, 티오에터, 에틸렌 옥사이드 링커, 설폰산염, 설폰아마이드, 티오폼아세탈, 폼아세탈, 옥심, 메틸렌이미노, 메틸렌메틸이미노, 메틸렌하이드라조, 메틸렌다이메틸하이드라조 및 메틸렌옥시메틸이미노를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
mRNA
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 조성물 또는 제형은 RNA-가이드된 DNA-결합제, 예컨대, 본 명세서에 기재된 바와 같은 Cas 뉴클레아제, 또는 클래스 2 Cas 뉴클레아제를 암호화하는 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 mRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA-결합제, 예컨대, Cas 뉴클레아제 또는 클래스 2 Cas 뉴클레아제를 암호화하는 ORF를 포함하는 mRNA가 제공되거나, 사용되거나, 투여된다. mRNA는 5' 캡, 5' 비번역 영역(UTR), 3' UTR 및 폴리아데닌 꼬리 중 하나 이상을 포함할 수 있다. mRNA는, 예를 들어, 핵 국소화 서열을 암호화하기 위해 또는 단백질을 암호화하는 교번의 코돈을 사용하기 위해 변형된 오픈 리딩 프레임을 포함할 수 있다.
개시된 LNP 조성물에서 mRNA는, 예를 들어, 분비된 호르몬, 효소, 수용체, 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 정상적으로 분비되는 관심 대상의 다른 단백질을 암호화할 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, mRNA는 선택적으로, 예를 들어, 이러한 mRNA의 안정성 및/또는 반감기를 개선시키거나 단백질 생성을 개선시키거나 또는 달리 용이하게 하는 화학적 또는 생물학적 변형을 가질 수 있다.
추가로, 적합한 변형은 코돈이 동일한 아미노산을 암호화하지만, mRNA의 야생형 형태에서 발견되는 코돈보다 더 안정하도록, 코돈의 하나 이상의 뉴클레오타이드에서 변경을 포함한다. 예를 들어, RNA의 안정성과 더 높은 수의 사이티딘(C) 및/또는 유리딘(U) 잔기 사이의 반비례 관계는 입증되었고, C 및 U 잔기가 없는 RNA는 대부분의 RNase에 대해 안정한 것으로 발견되었다(Heidenreich, et al. J Biol Chem 269, 2131-8 (1994)). 일부 실시형태에서, mRNA 서열에서 C 및/또는 U 잔기의 수는 감소된다. 다른 실시형태에서, C 및/또는 U 잔기의 수는 특정 아미노산을 암호화하는 하나의 코돈의 동일 또는 관련된 아미노산을 암호화하는 다른 코돈에 대한 치환에 의해 대체된다. 본 발명의 mRNA 핵산에 대해 상정된 변형은 또한 슈도유리딘(pseudouridine)의 혼입을 포함한다. 슈도유리딘의 본 발명의 mRNA 핵산 내로의 혼입은 안정성 및 번역 능력을 향상시킬 뿐만 아니라 생체내 면역원성을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 문헌[
Figure pct00053
, K., et al., Molecular Therapy 16 (11): 1833-1840 (2008)] 참조. 본 발명의 mRNA에 대한 치환 및 변형은 당업자에게 용이하게 공지되어 있는 방법에 의해 수행될 수 있다.
서열 내 C 및 U 잔기 수를 감소시키는 데 있어서 제약은 비번역 영역에 비해 mRNA의 암호화 영역 내에서 더 클 가능성이 있을 것이다(즉, 메세지에 존재하는 C 및 U 잔기 모두를 제거할 가능성은 없지만, 메세지가 목적하는 아미노산 서열을 암호화하는 능력을 보유함). 그러나 유전자 암호의 축퇴(degeneracy)는 C 및/또는 U 잔기 수가 감소될 서열에 존재하는 것을 가능하게 하는 기회를 제공하는 한편, 동일한 암호화 능력을 유지한다(즉, 아미노산이 코돈에 의해 암호화되는 것에 따라, RNA 서열의 변형에 대한 몇몇 상이한 가능성이 가능할 수 있다.
용어 변형은 또한, 예를 들어, 비-뉴클레오타이드 결합 또는 변형된 뉴클레오타이드의 본 발명의 mRNA 서열 내로의 혼입(예를 들어, 기능적 분비 단백질 또는 효소를 암호화하는 mRNA 분자의 3' 및 5' 말단 중 하나 또는 둘 다에 대한 변형)을 포함한다. 이러한 변형은 mRNA 서열에 대한 염기의 첨가(예를 들어, 폴리 A 꼬리 또는 더 긴 폴리 A 꼬리의 포함), 3' UTR 또는 5' UTR의 변경, mRNA와 제제(예를 들어, 단백질 또는 상보성 핵산 분자)의 복합체화, 및 mRNA 분자 구조를 변화시키는(예를 들어, 2차 구조를 형성하는) 요소의 포함을 포함한다.
폴리 A 꼬리는 천연 메신저를 안정화시키는 것으로 생각된다. 따라서, 일 실시형태에서, 긴 폴리 A 꼬리가 mRNA 분자에 첨가되고, 그에 따라 mRNA를 더 안정하게 제공할 수 있다. 다양한 당업계에 인식된 기법을 이용하여 폴리 A 꼬리가 첨가될 수 있다. 예를 들어, 긴 폴리 A 꼬리는 폴리 A 중합효소를 이용하여 합성 또는 시험관내 전사된 mRNA에 첨가될 수 있다(Yokoe, et al. Nature Biotechnology. 1996; 14: 1252-1256). 전사 벡터는 또한 긴 폴리 A 꼬리를 암호화할 수 있다. 추가로, 폴리 A 꼬리는 PCR 산물로부터 직접 전사에 의해 첨가될 수 있다. 일 실시형태에서, 폴리 A 꼬리의 길이는 적어도 약 90, 200, 300, 400 적어도 500개의 뉴클레오타이드이다. 일 실시형태에서, 폴리 A 꼬리의 길이는 본 발명의 변형된 mRNA 분자의 안정성, 및 그에 따른 단백질 전사를 제어하도록 조절된다. 예를 들어, 폴리 A 꼬리 길이는 mRNA 분자의 반감기에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 폴리 A 꼬리 길이는 뉴클레아제에 대한 mRNA의 저항성 수준을 변형시키도록 조절될 수 있고, 이에 의해 세포 내 단백질 발현의 시간 과정을 제어할 수 있다. 일 실시형태에서, 안정화된 mRNA 분자는 이들이 전달 비히클 없이 표적 세포에 전달될 수 있도록 (예를 들어, 뉴클레아제에 의한) 생체내 분해에 대해 충분히 저항성이다.
일 실시형태에서, mRNA는 야생형 mRNA에서 자연적으로 발견되지 않는 3' 및/또는 5' 비번역(UTR) 서열의 혼입에 의해 변형될 수 있다. 일 실시형태에서, mRNA에 자연적으로 측접하고 제2, 비번역 단백질을 암호화하는 3' 및/또는 5' 측접 서열은 이를 변형시키기 위해 치료적 또는 기능적 단백질을 암호화하는 mRNA 분자의 뉴클레오타이드 서열에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 안정한 mRNA 분자(예를 들어, 글로빈, 액틴, GAPDH, 튜불린, 히스톤, 또는 시트르산 주기 효소)로부터의 3' 또는 5' 서열은 센스 mRNA 분자의 안정성을 증가시키기 위해 센스 mRNA 핵산 분자의 3' 및/또는 5' 영역 내로 혼입될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제2003/0083272호 참조.
mRNA 변형의 더 상세한 설명은 미국 특허 제2017/0210698A1호, 페이지 57 내지 68에서 찾을 수 있으며, 이의 내용은 본 명세서에 원용된다.
주형 핵산
본 명세서에 개시된 조성물 및 방법은 주형 핵산을 포함할 수 있다. 주형은 RNA-가이드된 DNA-결합 단백질, 예컨대, Cas 뉴클레아제, 예를 들어, 클래스 2 Cas 뉴클레아제에 대한 표적 부위에서 또는 근처에서 핵산 서열을 변경시키거나 삽입하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 세포에 주형을 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 주형이 제공될 수 있다. 다른 실시형태에서, 둘 이상의 표적 부위에서 편집이 일어날 수 있도록 둘 이상의 주형이 제공될 수 있다. 예를 들어, 세포 내 단일 유전자, 또는 세포 내 두 상이한 유전자를 편집하기 위해 상이한 주형이 제공될 수 있다.
일부 실시형태에서, 주형은 상동성 재조합에서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상동성 재조합은 주형 서열 또는 주형 서열 일부의 표적 핵산 분자 내로의 통합을 초래할 수 있다. 다른 실시형태에서, 주형은 핵산 내 절단 부위에서의 DNA 가닥 침해를 수반하는 상동 직접 수선(homology-directed repair)에서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상동 직접 수선은 편집된 표적 핵산 분자에서 주형 서열을 포함하는 것을 초래할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 주형은 비상동성 말단 접합에 의해 매개되는 유전자 편집에서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 주형 서열은 절단 부위 근처의 핵산 서열에 대해 유사성을 갖지 않는다. 일부 실시형태에서, 주형 서열의 주형 또는 일부가 혼입된다. 일부 실시형태에서, 주형은 측접하는 역위 말단 반복부(inverted terminal repeat: ITR) 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 주형 서열은 표적 세포의 내인성 서열에 대응하거나, 이를 포함하거나, 이들로 이루어질 수 있다. 또한 또는 대안적으로 표적 세포의 내인성 서열에 대응하거나, 이를 포함하거나, 이루어질 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "내인성 서열"은 세포에 대해 천연인 서열을 지칭한다. 용어 "외인성 서열"은 세포에 대해 천연이 아닌 서열, 또는 세포의 게놈 내 천연 위치가 상이한 위치에 있는 서열을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 내인성 서열은 세포의 게놈 서열일 수 있다. 일부 실시형태에서, 내인성 서열은 염색체 또는 염색체외 서열일 수 있다. 일부 실시형태에서, 내인성 서열은 세포의 플라스미드 서열일 수 있다.
일부 실시형태에서, 주형은 측접하는 역위-말단 반복부(ITR) 서열을 포함하는 ssDNA 또는 dsDNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 주형은 벡터, 플라스미드, 미니서클, 나노입자 또는 PCR 산물로서 제공된다.
일부 실시형태에서, 핵산은 정제된다. 일부 실시형태에서, 핵산은 침전 방법(예를 들어, LiCl 침전, 알코올 침전, 또는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 동등한 방법)을 이용하여 정제된다. 일부 실시형태에서, 핵산은 크로마토그래피-기반 방법, 예컨대, HPLC-기반 방법 또는 동등한 방법(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)을 이용하여 정제된다. 일부 실시형태에서, 핵산은 침전 방법(예를 들어, LiCl 침전) 및 HPLC-기반 방법을 둘 다 이용하여 정제된다. 일부 실시형태에서, 핵산은 접선 유동 여과(TFF)에 의해 정제된다.
화합물 또는 조성물은 반드시는 아니지만, 일반적으로 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함할 것이다. 용어 "부형제"는 본 개시내용의 화합물(들) 이외의 임의의 성분, 기타 지질 성분(들) 및 생물학적 활성제를 포함한다. 부형제는 조성물에 대해 기능적(예를 들어, 약물 방출 속도 제어) 및/또는 비기능적(예를 들어, 가공 보조 또는 희석제) 특징을 부여할 수 있다. 부형제의 선택은 특정 투여 방식, 용해성 및 안정성에 대한 부형제의 효과, 및 투약 형태의 특성과 같은 요인에 크게 의존할 것이다.
비경구 제형은 전형적으로 수성 또는 유성 용액 또는 현탁액이다. 제형이 수성, 부형제, 예컨대, 당(글루코스, 만니톨, 솔비톨 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않음) 염, 탄수화물 및 완충제(바람직하게는 pH 3 내지 9)인 경우, 그러나 일부 적용에 대해, 이들은 멸균 비수성 용액으로 또는 건조 형태로 더 적합하게 제형화되어 적합한 비히클, 예컨대, 멸균, 무발열원수(WFI)와 함께 사용될 수 있다.
본 발명은 예시된 실시형태와 함께 기재하지만, 본 발명을 해당 실시형태로 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것이 이해된다. 대조적으로, 본 발명은 첨부하는 청구범위에 의해 규정되는 바와 같은 본 발명 내에 포함될 수 있는 구체적 특징의 등가물을 비롯한 모든 대안, 변형 및 등가물을 아우르는 것으로 의도된다.
앞서 언급한 일반적 설명과 상세한 설명뿐만 아니라 다음의 실시예는 단지 예시적이며, 교시를 제한하지 않는다. 본 명세서에서 사용되는 표제 부문은 단지 조직화 목적을 위한 것이며, 목적하는 대상을 임의의 방법으로 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 참조에 의해 원용되는 임의의 문헌이 본 명세서에 규정된 임의의 용어와 모순되는 경우에, 본 명세서로 조절한다. 본 출원에 주어진 모든 범위는 달리 언급되지 않는 한 종점을 포함한다.
정의
본 출원에서 사용되는 바와 같은 단수 형태는 문맥에 달리 명확하게 표시되지 않는 한 복수의 대상을 포함한다는 것을 주목하여야 한다. 따라서, 예를 들어, "조성물"에 대한 언급은 복수의 조성물을 포함하고, "세포"에 대한 언급은 복수의 세포 등을 포함한다. "또는"의 사용은 포괄적이며, 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다.
상기 명세서에 구체적으로 언급되지 않는 한, "포함하는" 다양한 성분을 열거하는 본 명세서의 실시형태는 또한 열거된 성분으로 "이루어진" 또는 "본질적으로 이루어진"으로서 상정되고; "이루어진" 다양한 성분을 열거하는 본 명세서의 실시형태는 또한 열거된 성분을 "포함하는" 또는 "본질적으로 이루어진"으로서 상정되며; "약" 다양한 성분을 열거하는 본 명세서의 실시형태는 또한 열거된 성분"에서" 상정되며; "본질적으로 이루어진" 다양한 성분을 열거하는 본 명세서의 실시형태는 또한 열거된 성분으로 "이루어진" 또는 "포함하는"으로서 상정된다(이런 상호 호환성은 청구범위에서의 이들 용어의 사용에 적용하지 않는다).
수치적 범위는 범위를 획정하는 숫자를 포함한다. 측정되고 측정 가능한 값은 유의한 숫자 및 측정과 연관된 오차를 고려한 근삿값인 것으로 이해된다. 본 출원에서 사용된 바와 같은 용어 "약" 및 "대략"은 이들의 당업계에서 이해되는 의미를 가지며; 다른 것에 대한 하나의 사용은 반드시 상이한 범주를 암시하지는 않는다. 달리 표시되지 않는 한, 본 출원에서 사용되는 수치는, "약" 또는 "대략"과 같은 변형 용어와 함께 또는 이들 없이, 적절한 분야에서 당업자에 의해 인식될 바와 같은 정상 분기 및/또는 변동을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 특정 실시형태에서, 용어 "대략" 또는 "약"은 달리 언급되거나 또는 문맥으로부터 달리 분명하지 않다면 언급된 기준 값의 방향 중 하나에서 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하 (초과 또는 미만) 이내에 속하는 값의 범위를 지칭한다(이러한 수가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우를 제외함).
본 명세서에서 사용되는 용어 "접촉시키는"은 둘 이상의 독립체 간의 물리적 결합을 확립하는 것을 의미한다. 예를 들어, 포유류 세포를 나노입자 조성물과 접촉시키는 것은 포유류 세포 및 나노입자가 물리적 연결을 공유하게 한다는 것을 의미한다. 생체내 및 생체외 둘 다에서 세포를 외부 독립체와 접촉시키는 방법은 생물학 기술에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 나노입자 조성물과 포유류 내에 배치된 포유류 세포를 접촉시키는 것은 다양한 투여 경로(예를 들어, 정맥내, 근육내, 진피내 및 피하)에 의해 수행될 수 있고, 다양한 양의 나노입자 조성물을 수반할 수 있다. 게다가, 하나 초과의 포유류 세포가 나노입자 조성물에 의해 접촉될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "전달하는"은 독립체를 목적지에 제공하는 것을 의미한다. 예를 들어, 대상체에게 치료제 및/또는 예방제를 전달하는 것은 (예를 들어, 정맥내, 근육내, 진피내 또는 피하 경로에 의해) 대상체에게 치료제 및/또는 예방제를 포함하는 나노입자 조성물을 투여하는 것을 수반할 수 있다. 포유류 또는 포유류 세포에 대한 나노입자 조성물의 투여는 하나 이상의 세포를 나노입자 조성물과 접촉시키는 것을 수반할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, "캡슐화 효율"은 나노입자 조성물의 제조에서 사용되는 치료제 및/또는 예방제의 초기 총량에 비한 나노입자 조성물의 부분이 되는 치료제 및/또는 예방제의 양을 지칭한다. 예를 들어, 97㎎의 치료제 및/또는 예방제가 조성물에 처음에 제공된 총 100㎎의 치료제 및/또는 예방제 중의 나노입자 조성물로 캡슐화된다면, 캡슐화 효율은 97%로서 주어질 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은, "캡슐화"는 완전한, 실질적인 또는 부분적 밀폐, 가둠, 둘러쌈 또는 케이스에 넣기를 지칭할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "생분해성"은 세포에 도입될 때, 세포 상에서 유의한 독성 효과(들) 없이 세포를 재사용 또는 배치할 수 있는 성분으로 세포 기작(예를 들어 효소적 분해)에 의해 또는 가수분해에 의해 분해되는 물질을 지칭하는 데 사용된다. 특정 실시형태에서, 생분해성 물질의 분해에 의해 생성된 성분은 염증 및/또는 생체내 다른 유해 효과를 유도하지 않는다. 일부 실시형태에서, 생분해성 물질은 효소적으로 분해된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 실시형태에서, 생분해성 물질은 가수분해에 의해 분해된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "N/P 비"는 이온화 가능한 질소 원자-함유 지질(예를 들어, 화학식 I의 화합물) 대 RNA의, 예를 들어, 지질 성분 및 RNA를 포함하는 나노입자 조성물 중의 인산염 기의 몰비이다.
조성물은 또한 하나 이상의 화합물의 염을 포함할 수 있다. 염은 약제학적으로 허용 가능한 염일 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은, "약제학적으로 허용 가능한 염"은 개시된 화합물의 유도체를 지칭하되, 모 화합물은 존재하는 산 또는 염기 모이어티를 이의 염 형태로 전환시킴으로써(예를 들어, 유리 염기기를 적합한 유기산과 반응시킴으로써) 변경된다. 약제학적으로 허용 가능한 염의 예는 염기성 잔기, 예컨대, 아민의 무기 또는 유기산염; 산성 잔기, 예컨대, 카복실산의 알칼리 또는 유기 염 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 대표적인 산 부가염은 아세트산염, 아디프산염, 알긴산염, 아스코브산염, 아스파트산염, 벤젠설폰산염, 벤조산염, 중황산염, 붕산염, 뷰티르산염, 캄포산염, 캄포설폰산염, 시트르산염, 사이클로펜탄프로피온산염, 다이글루콘산염, 도데실황산염, 에탄설폰산염, 퓨마르산염, 글루코헵톤산염, 글리세로인산염, 헤미황산염, 헵톤산염, 헥산산, 브로민화수소산염, 염산염, 아이오딘화수소산, 2-하이드록시-에탄설포네이트, 락토바이오네이트, 락테이트, 라우레이트, 라우릴 설페이트, 말산염, 말레산염, 말론산염, 메탄설폰산염, 2-나프탈렌설포네이트, 니코틴산염, 질산염, 올레산염, 옥살산염, 팔미트산염, 파모산염, 펙틴산염, 과황산염, 3-페닐프로피온산염, 인산염, 피크르산염, 피발산염, 프로피온산염, 스테아르산염, 석신산염, 황산염, 타르타르산염, 티오시안산염, 톨루엔설폰산염, 운데칸산염, 발레르산염 등을 포함한다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리토금속염은 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등뿐만 아니라 비독성 암모늄, 4차 암모늄, 및 암모늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸아민, 다이메틸아민, 트라이메틸아민, 트라이에틸아민, 에틸아민 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 아민 양이온을 포함한다. 본 개시내용의 약제학적으로 허용 가능한 염은, 예를 들어, 비독성 무기 또는 유기산으로부터 형성된 모 화합물의 통상적인 비독성염을 포함한다. 본 개시내용의 약제학적으로 허용 가능한 염은 통상적인 화학적 방법에 의해 염기성 또는 산성 모이어티를 포함하는 모 화합물로부터 합성될 수 있다. 일반적으로, 이러한 염은 물에서 또는 유기 용매에서, 또는 둘의 혼합물에서 이들 화합물의 유리산 또는 염기 형태를 화학량론적 양의 적절한 염기 또는 산과 반응시킴으로써 제조될 수 있고; 일반적으로, 에터, 에틸 아세테이트, 에탄올, 아이소프로판올 또는 아세토나이트릴과 같은 비수성 매질이 바람직하다. 적합한 염의 목록은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, p. 1418, Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P. H. Stahl and C. G. Wermuth (eds.), Wiley-VCH, 2008, 및 Berge et al., Journal of Pharmaceutical Science, 66, 1-19 (1977)]에서 찾을 수 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 이들 전문이 참조에 의해 원용된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "다분산도"는 시스템의 입자 크기 분포의 균질성을 기재하는 비이다. 작은 값, 예를 들어, 0.3 미만은 좁은 입자 크기 분포를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 다분산도는 0.1 미만일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "형질감염"은 종(예를 들어, RNA)의 세포 내로의 도입을 지칭한다. 형질감염은, 예를 들어, 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 일어날 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "알킬"은 1 내지 24개의 탄소 원자, 예컨대, 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소프로필, n-뷰틸, 아이소뷰틸, s-뷰틸, t-뷰틸, n-펜틸, 아이소펜틸, s-펜틸, 네오펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 도데실, 테트라데실, 헥사데실, 에이코실, 테트라코실 등의 분지 또는 비분자 포화 탄화수소기이다. 알킬기는 환식 또는 비환식일 수 있다. 알킬기는 분지 또는 비분지(즉, 선형)일 수 있다. 알킬기는 또한 치환 또는 비치환일 수 있다. 예를 들어, 알킬기는 본 명세서에 기재된 바와 같은 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬, 알콕시, 아미노, 에터, 할로겐화물, 하이드록시, 나이트로, 실릴, 설폭소, 설폰산염, 카복실레이트 또는 티올을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 하나 이상의 기로 치환될 수 있다. "저급 알킬"기는 1 내지 6개(예를 들어, 1 내지 4개)의 탄소 원자를 포함하는 알킬기이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "알켄일"은 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 지방족기를 지칭하며, "비치환 알켄일"과 "치환된 알켄일"을 둘 다 포함하는 것으로 의도되며, 이 중 후자는 알켄일기의 하나 이상의 탄소 상의 수소를 대체하는 치환체를 갖는 알켄일 모이어티를 지칭한다.　이러한 치환체는 하나 이상의 이중 결합에 포함되거나 포함되지 않는 하나 이상의 탄소 상에서 생길 수 있다.　게다가, 이러한 치환체는 안정성이 금지된 경우를 제외하고, 이하에 논의하는 바와 같이 알길기에 대해 상정된 것 모두를 포함한다.　 예를 들어, 알켄일기는 하나 이상의 알킬, 카보사이클릴, 아릴, 헤테로사이클릴 또는 헤테로아릴기로 치환될 수 있다.　 예시적인 알켄일기는 비닐 (-CH=CH2), 알릴(-CH2CH=CH2), 사이클로펜텐일(-C5H7) 및 5-헥센일(-CH2CH2CH2CH2CH=CH2)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
"알킬렌" 기는 분지 또는 비분지(즉, 선형)일 수 있는 2가 알킬 라디칼을 지칭한다. 임의의 상기 언급한 1가 알킬기는 알킬로부터의 두 번째 수소 원자의 제거에 의해 알킬렌으로 전환될 수 있다. 대표적인 알킬렌은 C2-4 알킬렌 및 C2-3 알킬렌을 포함한다. 전형적인 알킬렌기는 -CH(CH3)-, -C(CH3)2-, -CH2CH2-, -CH2CH(CH3)-, -CH2C(CH3)2-, -CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2- 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 알킬렌기는 또한 치환 또는 비치환될 수 있다. 예를 들어, 알킬렌기는 본 명세서에 기재된 바와 같은 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬, 알콕시, 아미노, 에터, 할로겐화물, 하이드록시, 나이트로, 실릴, 설폭소, 설폰산염, 카복실레이트 또는 티올을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 하나 이상의 기로 치환될 수 있다.
용어 "알켄일렌"은 적어도 하나의 탄소-탄소 이중결합을 갖는 2가, 직쇄 또는 분지쇄, 분포화, 비환식 탄화수소기를 포함하고, 일 실시형태에서 탄소-탄소 삼중 결합을 포함하지 않는다. 임의의 상기 언급한 1가 알켄일기는 알켄일로부터의 두 번째 수소 원자의 제거에 의해 알켄일렌으로 전환될 수 있다. 대표적인 알켄일렌은 C2-6알켄일렌을 포함한다.
화학적 모이어티, 예컨대, 알킬 또는 알킬렌과 함께 사용될 때 용어 "Cx-y"는 쇄에 x 내지 y개의 탄소를 포함하는 기를 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 용어 "Cx-y 알킬"는 쇄에 x 내지 y개의 탄소를 포함하는 직쇄 및 분지쇄 알킬 및 알킬렌기를 포함하는, 치환 또는 비치환된 포화 탄화수소기를 지칭한다.
참조에 의한 원용
본 명세서에 언급되거나 인용된 논문, 특허 및 특허 출원, 및 모든 기타 문헌 및 전자적으로 이용 가능한 정보의 내용은 각각의 개개 간행물이 참조에 의해 원용되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시되는 것과 동일한 정도로 이들의 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 출원인은 임의의 이러한 논문, 특허, 특허 출원 또는 기타 물리적 및 전자적 문헌으로부터의 임의의 및 모든 물질 및 정보를 자연 법칙에 따라 본 출원에 원용할 권리를 보유한다.
실시예
일반적 정보
모든 시약 및 용매를 구입하였고, 상업적 공급업자로부터 받은 대로 사용하거나 인용된 절차에 따라 합성하였다. 모든 중간체 및 최종 화합물은 실리카겔 상의 플래시 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. Bruker 또는 Varian 400㎒ 분광기 상에서 NMR 스펙트럼을 기록하였고, 주위 온도에서 CDCl3 중의 NMR 데이터를 수집하였다. 화학적 이동을 CDCl3(7.26)에 대한 백만분율(ppm)로 기록한다. 1H NMR에 대한 데이터를 다음과 같이 보고한다: 화학적 이동, 다중도(br = 브로드, s = 단일선, d = 이중선, t = 삼중선, q = 사중선, dd = 이중선의 이중선, dt = 삼중선의 이중선, m = 다중선, ddd = 이중선의 이중선의 이중선, td = 이중선의 삼중선, tt = 삼중선의 삼중선, tdd = 이중선의 이중선의 삼중선, dddd = 이중선의 이중선의 이중선의 이중선 등), 결합 상수 및 통합. MS 데이터를 전기분무 이온화(ESI) 공급원을 이용하는 Waters SQD2 질량 분광기 상에서 기록하였다. 광 다이오드 어레이(PDA) 및 증기 광산란(ELS) 검출기와 함께 SQD2 질량 분석계를 구비한 Waters Acquity H-클래스 액체 크로마토그래피 기기를 이용하여 UPLC-MS-ELS에 의해 최종 화합물의 순도를 결정하였다.
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실시예의 합성
실시예 1의 합성
중간체 1a: 3-하이드록시-2-(하이드록시메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00076
DCM(100㎖) 중 리놀렌산(13.2g, 47.1m㏖), DMAP(1.15g, 9.42m㏖), DIPEA(12.3㎖, 70.6m㏖) 및 2-(하이드록시메틸)프로판-1,3-다이올(5g, 47.1m㏖)의 용액에 rt에서 EDC·HCl(13.5g, 70.6m㏖)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 rt에서 24시간 동안 교반하고, 진공 하에 농축시키고, 실리카겔 크로마토그래피(120 g HC Si, 헥산 중 0 내지 50% EtOAc)를 이용하여 직접 정제하여, 6.7g(18.1m㏖, 39% 수율)의 목적하는 생성물을 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.44 - 5.25 (m, 4H), 4.25 (d, J = 6.3 Hz, 2H), 3.76 (m, 4H), 2.77 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.43 - 2.27 (m, 4H), 2.11 - 1.96 (m, 5H), 1.62 (m, 2H), 1.43 - 1.22 (m, 14H), 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 3H) ppm.
중간체 1b: 4,4-비스(옥틸옥시)부탄나이트릴
Figure pct00077
4,4-다이에톡시부탄나이트릴(9.4g, 60m㏖, 1 당량) 및 옥탄-1-올(3 당량)의 혼합물에 rt에서 피리디늄 p-톨루엔설포네이트(0.05 당량)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 105℃까지 가온시키고, 반응 용기를 공기에 개방하고 환류 컨덴서가 장착되지 않은 채로 적어도 18시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 rt까지 냉각시키고, 실리카겔 크로마토그래피(헥산 중 EtOAc의 구배)를 이용하여 직접 정제하여, 10.1g(31.0m㏖, 52% 수율)의 목적하는 생성물을 맑은 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 4.55 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 3.60 (dt, J = 9.2, 6.6 Hz, 2H), 3.43 (dt, J = 9.2, 6.6 Hz, 2H), 2.42 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.94 (td, J = 7.4, 5.3 Hz, 2H), 1.63 - 1.50 (m, 4H), 1.38 - 1.19 (m, 20H), 0.93 - 0.82 (m, 6H) ppm; MS: 348 m/z [M+Na].
중간체 1c: 4,4-비스(옥틸옥시)부탄산
Figure pct00078
에탄올(1M) 중 중간체 1b(8.42g, 31m㏖, 1 당량)의 용액에 rt에서 수성 수산화칼륨(2.5 M, 2.5 당량)을 첨가하였다. 반응 용기에 환류 컨덴서를 장착 시, 반응 혼합물을 110℃까지 가온시키고, 20 내지 24시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 수성 1N HCl을 이용하여 pH 5까지 산성화시키고, 헥산에 추출하였다. 합한 유기 추출물을 물 및 염산으로 세척하고, 무수 황산나트륨 또는 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과 후, 진공 하에 농축시켜, 8.15g(23.6m㏖, 76% 수율)의 목적하는 생성물을 맑은 오일로서 얻었고, 이를 추가 정제 없이 조질로 사용하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 4.50 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 3.57 (dt, J = 9.4, 6.7 Hz, 2H), 3.41 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.40 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.92 (td, J = 7.4, 5.3 Hz, 2H), 1.56 (m, 4H), 1.37 - 1.21 (m, 20H), 0.92 - 0.83 (m, 6H) ppm; MS: 343 m/z [M-H].
중간체 1d: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-(하이드록시메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00079
DCM(0.08 내지 0.4M) 중 중간체 1a(0.8-1.2 당량) 및 중간체 1c(1.1g, 3.2m㏖, 1　당량)의 용액에 rt에서 DMAP(0.1 내지 0.2 당량), DIPEA(1.4-3 당량) 및 EDC·HCl(1.4 내지 1.6 당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 rt에서 적어도 5시간 동안 교반하고, 진공 하에 농축시키고, 실리카겔 크로마토그래피(헥산 중 EtOAc의 구배)를 이용하여 직접 정제하여, 1.08g(1.55m㏖, 48% 수율)의 목적하는 생성물을 맑은 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.36 (m, 4H), 4.49 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 4.17 (m, 4H), 3.66 - 3.53 (m, 4H), 3.40 (m, 2H), 2.77 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.41 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.32 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.19 (m, 2H), 2.05 (m, 4H), 1.93 (m, 2H), 1.58 (m, 7H), 1.31 (m, 32H), 0.88 (m, 9H) ppm.
실시예 1: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카본일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00080
아세토나이트릴(0.04 내지 0.1M) 중 중간체 1d(1.08g, 1.55m㏖, 1 당량)의 용액에 rt에서 피리딘(2 당량), DMAP(0.2 당량) 및 4-나이트로페닐 클로로포메이트(1.5당량)를 순차적으로 첨가하였다. 적어도 2시간 동안 교반 시, 3-(다이에틸아미노)프로판-1-올(3 당량)을 첨가하고, 얻어진 반응 혼합물을 rt에서 추가적인 2 내지 24시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 헥산(20㎖)에 추출하고, 물로 추출하였다. 얻어진 수층을 헥산으로 재추출하였다. 합한 헥산층을 무수 MgSO4 또는 Na2SO4로 건조시키고, 여과 후, 진공 하에 농축시켰다. 조질의 잔사를 실리카겔 크로마토그래피(헥산 중 EtOAc 또는 DCM 중 메탄올의 구배)를 이용하여 정제하여, 711㎎(0.834m㏖, 54% 수율)의 목적하는 생성물을 맑은 오일로서 제공하였다. 1H NMR (CDCl3, 400 ㎒) δ 5.35 (m, 4H), 4.48 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.17 (m, 8H), 3.56 (m, 2H), 3.40 (m, 2H), 2.77 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.55 (q, J = 7.2 Hz, 6H), 2.40 (m, 3H), 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 4H), 1.92 (m, 2H), 1.84 (m, 2H), 1.57 (m, 6H), 1.30 (m, 34H), 1.03 (t, J = 7.2 Hz, 6H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 853 m/z [M+H].
실시예 2 내지 24의 합성
실시예 1에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 1d 및 아미노 알코올 또는 다이아민 시약으로부터 다음의 실시예를 합성하였다.
실시예 2: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((3-(다이메틸아미노)프로폭시)카본일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00081
42% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.44 - 5.27 (m, 4H), 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.23 - 4.08 (m, 8H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.47 - 2.34 (m, 5H), 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.24 (s, 6H), 2.05 (q, J = 6.9 Hz, 4H), 1.97 - 1.79 (m, 4H), 1.58 (m, 6H), 1.41 - 1.24 (m, 34H), 0.88 (m, 9H) ppm. MS: 825 m/z [M+H].
실시예 3: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((3-(피롤리딘-1-일)프로폭시)카본일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00082
38% 수율; 1H NMR (400 ㎒, , CDCl3) δ 5.44 - 5.27 (m, 4H), 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.24 - 4.08 (m, 8H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.56 (m, 6H), 2.47 - 2.35 (m, 3H), 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 4H), 1.97 - 1.85 (m, 4H), 1.86 - 1.73 (m, 4H), 1.58 (m, 6H), 1.41 - 1.24 (m, 34H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 851 m/z [M+H].
실시예 4: 13-(((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)메틸)-2,5-다이메틸-10-옥소-9,11-다이옥사-2,5-다이아자테트라데칸-14-일(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00083
25% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.44 - 5.27 (m, 4H), 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.22 - 4.11 (m, 8H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.58 - 2.38 (m, 9H), 2.33-2.28 (m, 8H), 2.25 (s, 3H), 2.05 (q, J = 6.8　Hz, 4H), 1.97 - 1.79 (m, 4H), 1.58 (m, 6H), 1.41 - 1.23 (m, 34H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 882 m/z [M+H].
실시예 5: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-(((((1-에틸피페리딘-3-일)메톡시)카본일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00084
19% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.44 - 5.27 (m, 4H), 4.48 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.13 - 3.95 (m, 8H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.96 (m, 2H), 2.77 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.54 - 2.35 (m, 5H), 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.05 (q, J = 6.9 Hz, 5H), 2.02 - 1.54 (m, 15H), 1.42 - 1.24 (m, 31H), 1.16 - 1.00 (m, 5H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 865 m/z [M+H].
실시예 6: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((3-(다이메틸아미노)프로필)카바모일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00085
50% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.70 (br m, 1H), 5.44 - 5.27 (m, 4H), 4.48 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.13 (br m, 6H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.26 (q, J = 6.2 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.55 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.40 (m, 7H), 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.21-2.02 (m, 11H), 1.92 (m, 2H), 1.77 (m, 2H), 1.57 (m, 4H), 1.42 - 1.25 (m, 31H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 824 m/z [M+H].
실시예 7: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로필)카바모일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00086
37% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 6.14 (s, 1H), 5.44 - 5.28 (m, 4H), 4.48 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.18 - 4.06 (m, 6H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7　Hz, 2H), 3.27 (q, J = 5.8 Hz, 2H), 2.74 (m, 7H), 2.39 (m, 3H), 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.13 - 2.00 (m, 4H), 1.92 (td, J = 7.6, 5.5 Hz, 2H), 1.78 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 1.57 (m, 6H), 1.40 - 1.22 (m, 35H), 1.14 (t, J = 7.2 Hz, 6H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 852 m/z [M+H].
실시예 8: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((3-(피롤리딘-1-일)프로필)카바모일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00087
44% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.87 (br m, 1H), 5.43 - 5.27 (m, 4H), 4.48 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.11 (m, 6H), 3.56 (dt, J = 9.2, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.29 (q, J = 6.1 Hz, 2H), 2.95 - 2.68 (m, 8H), 2.44 - 2.26 (m, 5H), 2.05 (m, 4H), 1.98 - 1.81 (m, 8H), 1.58 (m, 7H), 1.41 - 1.18 (m, 33H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 850 m/z [M+H].
실시예 9: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((2-(다이에틸아미노)에톡시)카본일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00088
84% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.44 - 5.27 (m, 4H), 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.28 - 4.06 (m, 8H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.79 - 2.60 (m, 8H), 2.46 - 2.35 (m, 3H), 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 4H), 1.92 (td, J = 7.6, 5.4 Hz, 2H), 1.58 (m, 9H), 1.42 - 1.17 (m, 31H), 1.05 (br m, 6H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 839 m/z [M+H].
실시예 10: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((2-(피롤리딘-1-일)에톡시)카본일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00089
74% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.44 - 5.27 (m, 4H), 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.27 (t, J = 5.9 Hz, 2H), 4.23 - 4.08 (m, 6H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.77 (m, 4H), 2.59 (br s, 4H), 2.47 - 2.35 (m, 3H), 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 4H), 1.92 (td, J = 7.6, 5.4 Hz, 2H), 1.86 - 1.74 (br m, 4H), 1.58 (m, 7H), 1.41 - 1.16 (m, 33H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 837 m/z [M+H].
실시예 11: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((4-(다이에틸아미노)뷰톡시)카본일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00090
74% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.44 - 5.27 (m, 4H), 4.48 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.22 - 4.08 (m, 8H), 3.56 (dt, J = 9.2, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.65 - 2.35 (m, 8H), 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 4H), 1.92 (td, J = 7.6, 5.4 Hz, 2H), 1.74 - 1.52 (m, 12H), 1.42 - 1.18 (m, 33H), 1.03 (t, J = 7.2 Hz, 6H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 867 m/z [M+H].
실시예 12: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((2-(다이에틸아미노)에틸)카바모일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00091
72% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.43 - 5.27 (m, 4H), 4.48 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.12 (m, 6H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.25 (br m, 2H), 2.77 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.57 (s, 5H), 2.44 - 2.26 (m, 5H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 4H), 1.92 (td, J = 7.6, 5.5 Hz, 2H), 1.58 (m, 9H), 1.41 - 1.18 (m, 32H), 1.05 (br m, 6H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 838 m/z [M+H].
실시예 13: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((4-(피롤리딘-1-일)뷰톡시)카본일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00092
58% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.44 - 5.27 (m, 4H), 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.22 - 4.11 (m, 8H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.60 - 2.38 (m, 8H), 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 4H), 1.92 (td, J = 7.6, 5.4 Hz, 2H), 1.86 - 1.77 (br m, 4H), 1.77 - 1.52 (m, 13H), 1.41 - 1.24 (m, 32H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 865 m/z [M+H].
실시예 14: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-(((((1-메틸피롤리딘-2-일)메톡시)카본일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00093
60% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.44 - 5.27 (m, 4H), 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.21 - 4.05 (m, 8H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.11 (br m, 1H), 2.77 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.50 - 2.35 (m, 6H), 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 3H), 2.07-1.52 (m, 19H), 1.30 (m, 32H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 837 m/z [M+H].
실시예 15: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((3-(다이프로필아미노)프로폭시)카본일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00094
79% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.44 - 5.27 (m, 4H), 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.23 - 4.07 (m, 8H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.55 - 2.28 (m, 11H), 2.10 - 2.00 (m, 4H), 1.92 (td, J = 7.6, 5.4 Hz, 2H), 1.81 (br m, 2H), 1.62 - 1.24 (m, 44H), 0.88 (m, 15H) ppm; MS: 881 m/z [M+H].
실시예 16: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((2-페닐-3-(피롤리딘-1-일)프로폭시)카본일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00095
58% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 7.36 - 7.17 (m, 5H), 5.44 - 5.27 (m, 4H), 4.53 - 4.43 (m, 2H), 4.33 (dd, J = 10.7, 7.6 Hz, 1H), 4.11 (m, 6H), 3.55 (dt, J = 9.3, 6.7　Hz, 2H), 3.39 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.24 (br m, 1H), 2.92 (br m, 1H), 2.77 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.61 - 2.33 (m, 7H), 2.28 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.05 (q, J = 6.9 Hz, 4H), 1.91 (td, J = 7.6, 5.4 Hz, 2H), 1.74 (br m, 4H), 1.66 - 1.51 (m, 8H), 1.41 - 1.24 (m, 33H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 927 m/z [M+H].
실시예 17: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-(((((1-에틸피페리딘-4-일)옥시)카본일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00096
40% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.43 - 5.28 (m, 4H), 4.66 (br s, 1H), 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.22 - 4.11 (m, 6H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7　Hz, 2H), 2.77 (m, 4H), 2.50 - 2.24 (m, 8H), 2.05 (m, 6H), 1.92 (td, J = 7.6, 5.4 Hz, 2H), 1.87 - 1.74 (m, 2H), 1.58 (m, 10H), 1.41 - 1.24 (m, 31H), 1.11 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 851m/z[M+H].
실시예 18: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((2-(다이메틸아미노)에톡시)카본일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00097
52% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.44 - 5.27 (m, 4H), 4.48 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.29 - 4.18 (m, 4H), 4.18 - 4.08 (m, 4H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.64 (br t, J = 5.8 Hz, 2H), 2.40 (m, 3H), 2.31 (m, 7H), 2.04 (dd, J = 8.8, 5.0 Hz, 4H), 1.92 (td, J = 7.6, 5.4 Hz, 2H), 1.56 (m, 10H), 1.30 (m, 31H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 811 m/z [M+H].
실시예 19: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-(((((1-(다이메틸아미노)프로판-2-일)옥시)카본일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00098
63% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.44 - 5.26 (m, 4H), 4.88 (m, 1H), 4.48 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.16 (m, 7H), 3.56 (dt, J = 9.2, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.57 (dd, J = 13.0, 7.7 Hz, 1H), 2.49 - 2.35 (m, 3H), 2.29 (m, 8H), 2.09 - 1.99 (m, 4H), 1.92 (td, J = 7.6, 5.5 Hz, 2H), 1.69-1.53 (m, 10H), 1.30 (m, 33H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 825 m/z [M+H].
실시예 20: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((3-(에틸(메틸)아미노)프로폭시)카본일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00099
30% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.44 - 5.27 (m, 4H), 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.24 - 4.09 (m, 8H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.57 - 2.38 (m, 6H), 2.32 - 2.20 (m, 5H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 4H), 1.95 - 1.82 (m, 4H), 1.58 (m, 7H), 1.42 - 1.25 (m, 34H), 1.09 (br m, 3H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 839 m/z [M+H].
실시예 21: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((3-(다이아이소프로필아미노)프로폭시)카본일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00100
31% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.44 - 5.27 (m, 4H), 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.22 - 4.08 (m, 8H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.98 (m, J = 6.7 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.50 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 2.47 - 2.35 (m, 3H), 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 4H), 1.92 (td, J = 7.6, 5.4 Hz, 2H), 1.74 (m, 2H), 1.63 - 1.51 (m, 10H), 1.42 - 1.24 (m, 36H), 0.98 (d, J = 6.6 Hz, 9H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 881 m/z [M+H].
실시예 22: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((3-(다이메틸아미노)뷰톡시)카본일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00101
35% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.44 - 5.27 (m, 4H), 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.29 - 4.21 (m, 1H), 4.27 - 4.10 (m, 8H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.4 Hz, 3H), 2.46 - 2.35 (m, 3H), 2.29 (m, 7H), 2.05 (q, J = 6.8　Hz, 4H), 1.92 (td, J = 7.6, 5.4 Hz, 3H), 1.60 (m, 8H), 1.42 - 1.25 (m, 33H), 1.02 (br s, 3H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 839 m/z [M+H].
실시예 23: 3-(((3-(아제판-1-일)프로폭시)카본일)옥시)-2-(((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00102
59% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.35 (m, 4H), 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.24 - 4.09 (m, 8H), 3.56 (dt, J = 9.4, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.5　Hz, 2H), 2.64 (br m, 6H), 2.47 - 2.35 (m, 3H), 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.04 (dd, J = 7.9, 5.9 Hz, 4H), 1.95 - 1.81 (m, 4H), 1.70 - 1.52 (m, 14H), 1.41 - 1.23 (m, 34H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 879 m/z [M+H].
실시예 24: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((2-(1-메틸피롤리딘-2-일)에톡시)카본일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00103
56% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.35 (m, 4H), 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.29 - 4.07 (m, 8H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.13 (br s, 1H), 2.77 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.45 - 1.50 (m, 28H) 1.29 (m, 34H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 851 m/z [M+H].
실시예 25의 합성
실시예 25: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((2-(1-메틸피롤리딘-2-일)에톡시)카본일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00104
DCM(0.10 내지 0.15M) 중 중간체 1d(300㎎, 0.43m㏖, 1 당량), 5-(다이메틸아미노)펜탄산(1 내지 3 당량), DIPEA(1.4-3 당량) 및 DMAP(0.1 내지 0.2당량)의 용액에 rt에서 EDC·HCl(1.4 내지 1.5 당량)을 첨가하였다. 적어도 2시간 동안 rt에서 교반 시, 반응 혼합물을 물로 희석시키고, 유기층을 분리시키고 나서, 진공 하에 농축시켰다. 조질의 잔사를 실리카겔 크로마토그래피(헥산 중 EtOAc 또는 DCM 중 MeOH의 구배)를 이용하여 정제하여, 159㎎(0.19m㏖, 44% 수율)의 목적하는 생성물을 제공하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.35 (m, 4H), 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.12 (m, 6H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.70 (br m, 2H), 2.56 (br s, 6H), 2.39 (m, 5H), 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.04 (m, 4H), 1.92 (td, J = 7.6, 5.4 Hz, 2H), 1.81 - 1.52 (m, 10H), 1.41 - 1.24 (m, 34H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 823.42 m/z [M+H].
실시예 26 내지 32의 합성
실시예 25에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 1d 및 카복실산 시약으로부터 다음의 실시예를 합성하였다.
실시예 26: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-(((4-(다이메틸아미노)부탄오일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00105
39% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.44 - 5.27 (m, 4H), 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.13 (m, J = 6.0, 2.2 Hz, 6H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.44 - 2.28 (m, 9H), 2.21 (s, 6H), 2.10 - 2.00 (m, 4H), 1.92 (td, J = 7.6, 5.5 Hz, 2H), 1.78 (m, J = 7.4 Hz, 2H), 1.58 (m, 6H), 1.42 - 1.22 (m, 34H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 809.47 m/z [M+H].
실시예 27: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-(((3-(다이에틸아미노)프로판오일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00106
78% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.44 - 5.27 (m, 4H), 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.13 (m, 6H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.77 (m, 4H), 2.56 - 2.34 (m, 9H), 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.10 - 2.00 (m, 4H), 1.92 (td, J = 7.6, 5.5　Hz, 2H), 1.58 (m, 6H), 1.42 - 1.22 (m, 34H), 1.01 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 823.42 m/z [M+H].
실시예 28: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-(((5-(다이에틸아미노)펜탄오일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00107
77% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.43 - 5.28 (m, 4H), 4.48 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.13 (m, 6H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.7　Hz, 2H), 2.50 (q, J = 7.2 Hz, 4H), 2.45 - 2.27 (m, 9H), 2.04 (dd, J = 7.8, 6.2 Hz, 4H), 1.92 (td, J = 7.6, 5.5 Hz, 2H), 1.64 - 1.44 (m, 11H), 1.31 (m, 33H), 1.01 (t, J = 7.1　Hz, 6H), 0.88 (m, 9H) ppm. MS: 851.86 m/z [M+H].
실시예 29: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-(((4-(다이에틸아미노)부탄오일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00108
53% 수율; 1H NMR (500 ㎒, CDCl3) δ 5.43 - 5.28 (m, 4H), 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.13 (m, 6H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.7　Hz, 2H), 2.50 (m, 5H), 2.45 - 2.29 (m, 10H), 2.05 (q, J = 6.9 Hz, 4H), 1.92 (td, J = 7.6, 5.5 Hz, 2H), 1.75 (m, 2H), 1.66 - 1.52 (m, 7H), 1.40 - 1.23 (m, 30H), 1.00 (m, 6H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 837.01 m/z [M+H].
실시예 30: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔오일)옥시)메틸)프로필 1,3-다이메틸피롤리딘-3-카복실레이트
Figure pct00109
45% 수율; 1H NMR (500 ㎒, CDCl3) δ 5.43 - 5.28 (m, 4H), 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H) 4.18 - 4.11 (m, 6H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.93 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 2.77 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.64 - 2.52 (m, 2H), 2.47 - 2.27 (m, 11H), 2.05 (q, J = 7.0 Hz, 4H), 1.92 (td, J = 7.6, 5.5 Hz, 2H), 1.71 - 1.52 (m, 9H), 1.40 - 1.24 (m, 34H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 821.30 m/z [M+H].
실시예 31: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔오일)옥시)메틸)프로필 1-메틸피페리딘-4-카복실레이트
Figure pct00110
87% 수율; 1H NMR (500 ㎒, CDCl3) δ 5.43 - 5.28 (m, 4H), 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.16 - 4.09 (m, 6H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.78 (m, 4H), 2.43 - 2.34 (m, 3H), 2.34 - 2.22 (m, 6H), 2.05 (q, J = 6.9 Hz, 4H), 2.00 - 1.87 (m, 6H), 1.76 (m, 2H), 1.65 - 1.52 (m, 7H), 1.42 - 1.19 (m, 33H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 821.80 m/z [M+H].
실시예 32: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔오일)옥시)메틸)프로필 1,4-다이메틸피페리딘-4-카복실레이트
Figure pct00111
39% 수율; 1H NMR (500 ㎒, CDCl3) δ 5.43 - 5.28 (m, 4H), 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.17 - 4.09 (m, 6H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.58 (m, 2H), 2.41 (m, 3H), 2.31 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.24 (s, 3H), 2.15 - 2.01 (m, 8H), 1.92 (td, J = 7.6, 5.3 Hz, 2H), 1.63 - 1.48 (m, 9H), 1.42 - 1.24 (m, 33H), 1.19 (s, 3H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 835.79 m/z [M+H].
실시예 33 내지 36의 합성
실시예 1에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 1d 및 아미노 알코올 또는 다이아민 시약으로부터 다음의 실시예를 합성하였다.
실시예 33: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((2-(다이에틸아미노)에틸)(메틸)카바모일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00112
62% 수율; 1H NMR (500 ㎒, CDCl3) δ 5.43 - 5.28 (m, 4H), 4.48 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.13 (m, 6H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.30 (m, 2H), 2.94 (s, 1.5H), 2.91 (s, 1.5H), 2.77 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.54 (m, 6H), 2.39 (m, 3H), 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.04 (m, 4H), 1.92 (td, J = 7.6, 5.5 Hz, 2H), 1.64 - 1.54 (m, 7H), 1.39 - 1.22 (m, 33H), 1.01 (m, 6H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 852.80 m/z [M+H].
실시예 34: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((2-(다이메틸아미노)에틸)카바모일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00113
44% 수율; 1H NMR (500 ㎒, CDCl3) δ 5.43 - 5.28 (m, 4H), 5.20 (br t, J = 5.1 Hz, 1H), 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.13 (m, 6H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7　Hz, 2H), 3.24 (m, 2H), 2.77 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.43 - 2.34 (m, 5H), 2.30 (t, J = 7.6　Hz, 2H), 2.22 (s, 6H), 2.05 (q, J = 6.9 Hz, 5H), 1.92 (td, J = 7.6, 5.4 Hz, 2H), 1.63 - 1.52 (m, 7H), 1.40 - 1.24 (m, 32H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 810.73 m/z [M+H].
실시예 35: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((2-(에틸(메틸)아미노)에틸)카바모일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00114
53% 수율; 1H NMR (500 ㎒, CDCl3) δ 5.43 - 5.28 (m, 4H), 5.20 (t, J = 5.1 Hz, 1H), 4.48 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.12 (m, 6H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7　Hz, 2H), 3.24 (m, 2H), 2.77 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.48 - 2.33 (m, 7H), 2.30 (t, J = 7.6　Hz, 2H), 2.20 (s, 3H), 2.05 (q, J = 6.9 Hz, 4H), 1.92 (td, J = 7.7, 5.5 Hz, 2H), 1.62 - 1.52 (m, 7H), 1.35 - 1.23 (m, 33H), 1.04 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 824.77 m/z [M+H].
실시예 36: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((1-에틸피페리딘-3-일)카바모일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00115
46% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.43 - 5.27 (m, 4H), 5.20 (br s, 1H), 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.12 (m, 6H), 3.78 (br s, 1H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.50 - 2.19 (m, 8H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 4H), 1.92 (td, J = 7.6, 5.5 Hz, 2H), 1.73 - 1.52 (m, 14H), 1.41 - 1.23 (m, 33H), 1.04 (t, J = 7.2　Hz, 3H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 850.48 m/z [M+H].
실시예 37의 합성
실시예 37: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((1-에틸피페리딘-4-일)카바모일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00116
아세토나이트릴(6㎖) 중 중간체 1d(400㎎, 0.57m㏖)의 용액에 피리딘(93㎕, 1.15m㏖), DMAP(14㎎, 0.08m㏖) 및 4-나이트로페닐 클로로포메이트(173㎎, 0.86m㏖)을 rt에서 순차적으로 첨가하였다. 2시간 동안 교반 시, 1-에틸피페리딘-4-아민 다이하이드로클로라이드(344㎎, 1.72m㏖) 및 DIPEA(800㎕, 4.60m㏖)를 첨가하고, 얻어진 반응 혼합물을 추가 4시간 동안 rt에서 교반하였다. 반응 혼합물을 헥산에 추출하고, 물로 추출하였다. 필요하다면, 얻어진 수층을 헥산으로 재추출하였다. 합한 헥산층을 무수 MgSO4로 건조시키고, 여과 후, 진공 하에 농축시켰다. 조질의 잔사를 실리카겔 크로마토그래피(헥산 중 EtOAc 또는 DCM 중 메탄올의 구배)를 이용하여 정제하여, 157㎎(0.18m㏖, 32% 수율)의 목적하는 생성물을 맑은 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.43 - 5.27 (m, 4H), 4.59 (br d, J = 8.1 Hz, 1H), 4.48 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.12 (m, 6H), 3.59 - 3.49 (m, 3H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.85 (br d, J = 11.1 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.45 - 2.35 (m, 5H), 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.05 (q, J = 7.2 Hz, 6H), 1.99 - 1.87 (m, 4H), 1.65 - 1.21 (m, 43H), 1.07 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 850.34 m/z [M+H].
실시예 38 내지 49의 합성
실시예 1에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 1d 및 다이아민 시약으로부터 다음의 실시예를 합성하였다.
실시예 38: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-(((((1-에틸피페리딘-2-일)메틸)카바모일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00117
30% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.41 - 5.27 (m, 4H), 5.14 (br s, 1H), 4.48 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.16 - 4.09 (m, 6H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.45 - 3.23 (m, 4H), 2.89 (m, 1H), 2.77 (m, 3H), 2.49 - 2.26 (m, 7H), 2.19 (m, 1H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 4H), 1.92 (td, J = 7.5, 5.5 Hz, 2H), 1.73 - 1.25 (m, 46H), 1.02 (t, J = 7.0 Hz, 3H), 0.93 - 0.84 (m, 9H) ppm; MS: 864.39 m/z [M+H].
실시예 39: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-(((((1-메틸피롤리딘-2-일)메틸)카바모일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00118
18% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.43 - 5.27 (m, 4H), 5.13 (s, 1H), 4.48 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.13 (m, 6H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (m, 3H), 3.20 - 2.98 (m, 2H), 2.77 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.41 - 2.17 (m, 10H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 4H), 1.98 - 1.78 (m, 3H), 1.72 - 1.52 (m, 11H), 1.41 - 1.24 (m, 32H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 836.27 m/z [M+H].
실시예 40: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-(((((1-에틸피롤리딘-2-일)메틸)카바모일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00119
13% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.42 - 5.27 (m, 4H), 5.15 (br d, J = 7.7 Hz, 1H), 4.48 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.13 (m, 6H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.43 - 3.31 (m, 3H), 3.19 - 3.05 (m, 2H), 2.78 (m, 3H), 2.50 (br m, 1H), 2.39 (m, 3H), 2.30 (t, J = 7.6　Hz, 2H), 2.26 - 2.08 (m, 2H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 4H), 1.97 - 1.79 (m, 3H), 1.76 - 1.51 (m, 11H), 1.40 - 1.22 (m, 32H), 1.09 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 850.20 m/z [M+H].
실시예 41: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((1-에틸피롤리딘-3-일)카바모일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00120
34% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.44 - 5.27 (m, 4H), 5.01 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 4.48 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.20 - 4.02 (m, 7H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.86 - 2.73 (m, 3H), 2.62 - 2.19 (m, 11H), 2.05 (q, J = 6.9 Hz, 4H), 1.92 (td, J = 7.6, 5.5 Hz, 2H), 1.66 - 1.51 (m, 9H), 1.44 - 1.21 (m, 32H), 1.10 (t, J = 7.2　Hz, 3H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 836.33 m/z [M+H].
실시예 42: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((1-메틸피페리딘-3-일)카바모일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00121
57% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.43 - 5.27 (m, 4H), 5.18 (br m, 1H), 4.48 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.13 (m, 6H), 3.78 (br m, 1H), 3.56 (dt, J = 9.2, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.2, 6.7 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.47 - 2.13 (m, 11H), 2.05 (q, J = 6.9 Hz, 4H), 1.92 (td, J = 7.6, 5.5 Hz, 3H), 1.71 - 1.52 (m, 11H), 1.41 - 1.24 (m, 33H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 836.51 m/z [M+H].
실시예 43: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-(((((1-메틸피롤리딘-3-일)메틸)카바모일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00122
30% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.44 - 5.30 (m, 4H), 5.19 (t, J = 5.1 Hz, 1H), 4.51 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.18 - 4.11 (m, 6H), 3.58 (dt, J = 9.2, 6.7 Hz, 2H), 3.42 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.19 (t, J = 5.9 Hz, 2H), 2.84 - 2.79 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.64 (m, 1H), 2.56 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 2.44 - 2.31 (m, 11H), 2.10 - 1.92 (m, 7H), 1.71 - 1.46 (m, 9H), 1.44 - 1.19 (m, 33H), 0.91 (m, 9H) ppm; MS: 836.31 m/z [M+H].
실시예 44: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((1-(다이에틸아미노)프로판-2-일)카바모일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00123
78% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.42 - 5.27 (m, 4H), 5.07 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 4.48 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.12 (m, 6H), 3.67 - 3.51 (m, 3H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.61 - 2.26 (m, 10H), 2.04 (dd, J = 7.8, 5.9 Hz, 4H), 1.92 (td, J = 7.6, 5.5 Hz, 2H), 1.68 - 1.50 (m, 7H), 1.41 - 1.24 (m, 34H), 1.17 (d, J = 6.4 Hz, 3H), 0.99 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 852.59 m/z [M+H].
실시예 45: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((1-(다이메틸아미노)프로판-2-일)카바모일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00124
68% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.42 - 5.27 (m, 4H), 5.02 (br m, 1H), 4.48 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.18 - 4.07 (m, 6H), 3.66 (m, 1H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.42 - 2.27 (m, 6H), 2.22 (s, 6H), 2.14 (dd, J = 12.4, 5.5 Hz, 1H), 2.05 (q, J = 6.9 Hz, 4H), 1.92 (td, J = 7.6, 5.5 Hz, 2H), 1.65 - 1.50 (m, 8H), 1.41 - 1.25 (m, 32H), 1.18 (d, J = 6.4 Hz, 3H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 824.28 m/z [M+H].
실시예 46: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((3-(4-하이드록시피페리딘-1-일)프로필)카바모일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00125
26% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 6.72 (br s, 1H), 5.42 - 5.27 (m, 4H), 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.23 - 4.05 (m, 6H), 3.62 (br s, 1H) 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.27 (q, J = 5.7 Hz, 2H), 2.83 (d, J = 11.2 Hz, 2H), 2.77 (m, 2H), 2.49 - 2.26 (m, 7H), 2.09 - 2.02 (m, 6H), 1.93 (m, 4H), 1.68 - 1.52 (m, 11H), 1.41 - 1.24 (m, 34H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 880.46 m/z [M+H].
실시예 47: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔오일)옥시)메틸)프로필 4-메틸피페라진-1-카복실레이트
Figure pct00126
61% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.42 - 5.27 (m, 4H), 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.18 - 4.09 (m, 6H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.47 (br s, 4H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7　Hz, 2H), 2.81 - 2.73 (m, 2H), 2.45 - 2.26 (m, 11H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 4H), 1.92 (td, J = 7.6, 5.5 Hz, 2H), 1.65 - 1.49 (m, 7H), 1.41 - 1.21 (m, 34H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 822.25 m/z [M+H].
실시예 48: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔오일)옥시)메틸)프로필 4-에틸피페라진-1-카복실레이트
Figure pct00127
66% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.44 - 5.27 (m, 4H), 4.48 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.19 - 4.09 (m, 6H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.48 (br s, 4H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7　Hz, 2H), 2.81 - 2.73 (m, 2H), 2.47 - 2.35 (m, 8H), 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.05 (q, J = 6.9 Hz, 4H), 1.92 (td, J = 7.6, 5.5 Hz, 2H), 1.65 - 1.52 (m, 7H), 1.41 - 1.24 (m, 34H), 1.09 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 836.30 m/z [M+H].
실시예 49: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((2-(4-하이드록시피페리딘-1-일)에틸)카바모일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00128
58% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.43 - 5.27 (m, 3H), 5.18 (s, 1H), 4.48 (t, 1H), 4.17 - 4.09 (m, 6H), 3.76 - 3.65 (m, 1H), 3.56 (d, 2H), 3.40 (dt, 2H), 3.30 - 3.21 (m, 2H), 2.81 - 2.66 (m, 4H), 2.53 - 2.34 (m, 6H), 2.30 (t, 2H), 2.21 - 2.10 (m, 2H), 2.05 (q, 4H), 1.97 - 1.85 (m, 5H), 1.67 - 1.51 (m, 10H), 1.40 - 1.25 (m, 35H), 0.94 - 0.84 (m, 9H); MS: 866.41m/z[M+H].
실시예 50의 합성
실시예 50: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-(((((1-에틸아제티딘-3-일)메톡시)카본일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00129
아세토나이트릴(6㎖) 중 중간체 1d(300㎎, 0.43m㏖)의 용액에 피리딘(69㎕, 86m㏖), DMAP(11㎎, 0.086m㏖) 및 4-나이트로페닐 클로로포메이트(134㎎, 0.65m㏖)를 rt에서 순차적으로 첨가하였다. 2시간 동안 교반 시, (1-에틸아제티딘-3-일)메탄올 하이드로클로라이드(194㎎, 1.29m㏖) 및 Et3N(359㎕, 2.58m㏖)을 첨가하고, 얻어진 반응 혼합물을 추가 4시간 동안 rt에서 교반하였다. 반응 혼합물을 헥산에 추출하고, 물로 추출하였다. 필요하다면, 얻어진 수층을 헥산으로 재추출하였다. 합한 헥산층을 무수 MgSO4로 건조시키고, 여과 후, 진공 하에 농축시켰다. 조질의 잔사를 실리카겔 크로마토그래피(헥산 중 EtOAc의 구배)를 이용하여 정제하여, 181㎎(0.22m㏖, 50% 수율)의 목적하는 생성물을 맑은 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.35 (m, 4H), 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.27 - 4.14 (m, 8H), 3.66 - 3.36 (m, 4H), 2.94 (br s, 1H), 2.78 (m, 3H), 2.42 (m, 5H), 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.05 (q, J = 7.0 Hz, 4H), 1.92 (m, 2H), 1.62 - 1.52 (m, 8H), 1.31 (m, 35H), 0.95 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.89 (m, 9H) ppm; MS: 837.30 m/z [M+H].
실시예 51 내지 53의 합성
실시예 1에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 1d 및 아미노 알코올 시약으로부터 다음의 실시예를 합성하였다.
실시예 51: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-(((((1-에틸피롤리딘-3-일)메톡시)카본일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00130
57% 수율; 1H NMR (500 ㎒, CDCl3) δ 5.42 - 5.29 (m, 4H), 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.22 - 4.09 (m, 8H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.6 Hz, 2H), 2.96 - 2.49 (m, 7H), 2.45 - 2.36 (m, 4H), 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.20 - 2.29 (m, 5H), 1.91 (td, J = 7.6, 5.3 Hz, 2H), 1.75 - 1.52 (m, 8H), 1.40 - 1.16 (m, 37H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 851.48 m/z [M+H].
실시예 52: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-(((((1-에틸-3-메틸피페리딘-3-일)메톡시)카본일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00131
66% 수율; 1H NMR (500 ㎒, CDCl3) 5.43 - 5.28 (m, 4H), 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.22 - 4.12 (m, 8H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.46 - 2.37 (m, 3H), 2.31 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.21 (br s, 6H), 2.05 (q, J = 7.0 Hz, 4H), 1.92 (td, J = 7.5, 5.4 Hz, 2H), 1.57 (m, 10H), 1.45 - 1.17 (m, 40H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 865.58 m/z [M+H].
실시예 53: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-(((((1-메틸피페리딘-3-일)메톡시)카본일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00132
42% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.45 - 5.24 (m, 4H), 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.24 - 3.93 (m, 8H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.2, 6.7 Hz, 2H), 3.09 (br m, 2H), 2.77 (t, J = 6.5 Hz, 1H), 2.70 - 2.16 (m, 7H), 2.05 (q, J = 6.9 Hz, 4H), 1.92 (td, J = 7.6, 5.5 Hz, 2H), 1.87 - 1.71 (m, 3H), 1.57 (m, 10H), 1.42 - 1.00 (m, 36H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 850.77 m/z [M+H].
실시예 54의 합성
중간체 54a: (Z)-9-(논-2-엔-1-일옥시)-9-옥소노난산
Figure pct00133
THF(0.4 내지 0.5M) 중 노난다이온(25g, 132m㏖, 1 당량)의 용액에 15 내지 25℃에서 염화옥살릴(1.1 내지 1.5 당량)을 첨가하였다. 적어도 10분 동안 교반 시, DMF(0.01 내지 0.1 당량)를 첨가한 후에, 적어도 10분 동안 추가로 교반하였다. 이어서, (Z)-논-2-엔-1-올(24.3g, 171m㏖, 1.3 당량)을 적가하였고, 얻어진 혼합물을 적어도 30분 동안 15 내지 25℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 실리카겔 크로마토그래피를 이용하여 직접 정제하여, 17.3g(55.4m㏖, 42% 수율)의 목적하는 생성물을 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ　5.65 (m, 1H), 5.53 (m, 1H), 4.62 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 2.33 (m, 4H), 2.10 (m, 2H), 1.63 (m, 4H), 1.28 (m, 14H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H) ppm; MS: 335.27 m/z [M+Na].
중간체 54b: 3-하이드록시-2-(하이드록시메틸)프로필 4,4-비스(옥틸옥시)부타노에이트
Figure pct00134
DCM(231㎖) 중 중간체 1c(16.0g, 46.4m㏖), DMAP(1.1g, 9.28m㏖), DIPEA (24.1㎖, 139m㏖) 및 2-(하이드록시메틸)프로판-1,3-다이올(6.39g, 60.3m㏖)의 용액에 rt에서 EDC·HCl(10.6g, 55.6m㏖)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 rt에서 18시간 동안 교반하고, 물로 희석시키고, 유기층을 진공 하에 농축시켰다. 조질의 잔사를 실리카겔 크로마토그래피(헥산 중 0 내지 100% EtOAc)를 이용하여 정제하여 6.7g(15.4m㏖, 33% 수율)의 목적하는 생성물을 제공하였다. 1H NMR (400　㎒, CDCl3) δ 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.24 (d, J = 6.3 Hz, 2H), 3.75 (m, 4H), 3.55 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.39 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.54 (br s, 2H), 2.41 (t, J = 7.5　Hz, 2H), 2.02 (m, 1H), 1.93 (td, J = 7.5, 5.4 Hz, 2H), 1.59 - 1.48 (m, 4H), 1.37 - 1.20 (m, 20H), 0.87 (t, J = 7.0 Hz, 6H) ppm.
중간체 54c: (Z)-1-(3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-(하이드록시메틸)프로필) 9-(논-2-엔-1-일) 노난다이오에이트
Figure pct00135
DCM(0.2M) 중 중간체 54a(1 내지 1.2 당량), DMAP(0.15 당량), DIPEA(1.6 내지 3.0　당량) 및 중간체 54b(900㎎, 2.08m㏖, 1 당량)의 용액에 rt에서 EDCI·HCl(1.6 당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 rt에서 적어도 2시간 동안 교반하고, 진공 하에 농축시키고, 실리카겔 크로마토그래피(헥산 중 EtOAc의 구배)를 이용하여 직접 정제하여, 503㎎(0.69m㏖, 33% 수율)의 목적하는 생성물을 맑은 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.64 (m, 1H), 5.51 (m, 1H), 4.61 (d, J = 6.7　Hz, 2H), 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.17 (m, 4H), 3.65 - 3.51 (m, 4H), 3.39 (dt, J = 9.4, 6.7 Hz, 2H), 2.40 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.29 (m, 5H), 2.19 (m, 1H), 2.09 (q, J = 7.2　Hz, 2H), 1.93 (td, J = 7.5, 5.4 Hz, 2H), 1.67 - 1.50 (m, 8H), 1.40 - 1.19 (m, 32H), 0.87 (t, J = 6.7 Hz, 9H) ppm; MS: 749.69 m/z [M+Na].
실시예 54: (Z)-1-(3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카본일)옥시)메틸)프로필) 9-(논-2-엔-1-일) 노난다이오에이트
Figure pct00136
실시예 54를 실시예 1에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 54c 및 3-(다이에틸아미노)프로판-1-올로부터 48% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400　㎒, CDCl3) δ 5.68 - 5.58 (m, 1H), 5.55 - 5.46 (m, 1H), 4.61 (dd, J = 6.8, 1.2 Hz, 2H), 4.47 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.21 - 4.06 (m, 8H), 3.55 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.39 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.50 (m, 6H), 2.45 - 2.35 (m, 3H), 2.29 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.09 (m, 2H), 1.91 (m, 2H), 1.80 (m, 2H), 1.67 - 1.49 (m, 8H), 1.40 - 1.21 (m, 34H), 1.00 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.87 (m, 9H) ppm; MS: 885.65 m/z [M+H].
실시예 55의 합성
중간체 55a: (Z)-7-(논-2-엔-1-일옥시)-7-옥소헵탄산
Figure pct00137
중간체 54a를 중간체 54a에 대해 사용한 방법을 이용하여 헵탄다이온 및 (Z)-논-2-엔-1-올로부터 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.58 (m, 1H), 5.44 (m, 1H), 4.55 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 2.26 (m, 4H), 2.03 (m, 2H), 1.59 (m, 4H), 1.30 (m, 10H), 0.81 (t, J = 6.8 Hz, 3H) ppm.
중간체 55b: (Z)-1-(3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-(하이드록시메틸)프로필) 7-(논-2-엔-1-일) 헵탄다이오에이트
Figure pct00138
중간체 55b를 중간체 54c에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 55a 및 중간체 54b로부터 30% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ　5.64 (m, 1H), 5.51 (m, 1H), 4.62 (dd, J = 6.8, 1.2 Hz, 2H), 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.22 - 4.07 (m, 4H), 3.67 - 3.51 (m, 4H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.41 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.32 (td, J = 7.5, 5.9 Hz, 4H), 2.19 (m, 1H), 2.09 (m, 2H), 1.93 (td, J = 7.5, 5.4　Hz, 2H), 1.68 - 1.50 (m, 8H), 1.39 - 1.23 (m, 30H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 721.67 m/z [M+Na].
실시예 55: (Z)-1-(3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카본일)옥시)메틸)프로필) 7-(논-2-엔-1-일) 헵탄다이오에이트
Figure pct00139
실시예 55를 실시예 1에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 55b 및 3-(다이에틸아미노)프로판-1-올로부터 46% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400　㎒, CDCl3) δ 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.69 - 5.59 (m, 1H), 5.55 - 5.47 (m, 1H), 4.62 (dd, J = 6.9, 1.3 Hz, 2H), 4.48 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.20 (m, 4H), 4.13 (m, 4H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.94 - 2.57 (br m, 6H), 2.47 - 2.36 (m, 3H), 2.31 (td, J = 7.5, 2.0 Hz, 4H), 2.19 - 1.89 (m, 6H) 1.70 - 1.49 (m, 9H), 1.41 -1.08 (m, 35H), 0.88 (m, 9H); MS: 857.57 m/z [M+H].
실시예 56의 합성
중간체 56a: (Z)-5-(논-2-엔-1-일옥시)-5-옥소펜탄산
Figure pct00140
중간체 56a를 중간체 54a에 대해 사용한 방법을 이용하여 펜탄다이온 및 (Z)-논-2-엔-1-올로부터 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.66 (m, 1H), 5.52 (m, 1H), 4.64 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 2.43 (m, 4H), 2.15 (m, 2H), 1.97 (m, 2H), 1.28 (m, 8H), 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 3H) ppm.
중간체 56b: (Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-(하이드록시메틸)프로필 논-2-엔-1-일 글루타레이트
Figure pct00141
중간체 56b를 중간체 54c에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 56a 및 중간체 54b로부터 32% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ　5.65 (m, 1H), 5.51 (m, 1H), 4.63 (dd, J = 6.9, 1.3 Hz, 2H), 4.49 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.18 (m, 4H), 3.64 (m, 2H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.40 (m, 6H), 2.19 (m, 1H), 2.20 (m, 2H), 1.94 (m, 4H), 1.56 (m, 4H), 1.39 - 1.19 (m, 28H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 693.64[M+Na].
실시예 56: (Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카본일)옥시)메틸)프로필 논-2-엔-1-일 글루타레이트
Figure pct00142
실시예 56을 실시예 1에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 56b 및 3-(다이에틸아미노)프로판-1-올로부터 66% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400　㎒, CDCl3) δ 5.74 - 5.58 (m, 1H), 5.58 - 5.45 (m, 1H), 4.63 (dd, J = 6.8, 1.3 Hz, 2H), 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.25 - 4.17 (m, 4H), 4.14 (dd, J = 6.2, 3.1 Hz, 4H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.71 (br m, 6H), 2.48 - 2.35 (m, 7H), 2.09 (qd, J = 7.3, 1.5 Hz, 3H), 2.04 - 1.87 (m, 5H), 1.66 - 1.52 (m, 5H), 1.42 - 1.30 (m, 30H), 1.15 (br m, 3H), 0.88 (m, 9H); MS: 829.67 m/z [M+H].
실시예 57의 합성
중간체 57a: 9-(헥실옥시)-9-옥소노난산
Figure pct00143
중간체 57a를 중간체 54a에 대해 사용한 방법을 이용하여 노난다이온산 및 헥산-1-올로부터 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 4.05 (t, J = 6.8　Hz, 2H), 2.36 - 2.26 (m, 4H), 1.60 (m, 6H), 1.32 (m, 12H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H) ppm.
중간체 57b: 1-(3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-(하이드록시메틸)프로필) 9-헥실 노난다이오에이트
Figure pct00144
중간체 57b를 중간체 54c에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 57a 및 중간체 54b로부터 30% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ　4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.21 - 4.12 (m, 4H), 4.04 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.61 (t, J = 5.9　Hz, 2H), 3.55 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.39 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.40 (t, J = 7.5　Hz, 2H), 2.29 (m, 5H), 2.19 (m, 1H), 1.92 (td, J = 7.5, 5.4 Hz, 2H), 1.66 - 1.49 (m, 9H), 1.38 - 1.24 (m, 32H), 0.87 (m, 9H) ppm; MS: 709.64 m/z [M+Na].
실시예 57: 1-(3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카본일)옥시)메틸)프로필) 9-헥실 노난다이오에이트
Figure pct00145
실시예 57를 실시예 1에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 57b 및 3-(다이에틸아미노)프로판-1-올로부터 65% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400　㎒, CDCl3) δ 4.47 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.23 - 4.08 (m, 8H), 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.55 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.39 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.50 (m, 6H), 2.40 (m, 3H), 2.29 (td, J = 7.5, 5.9 Hz, 4H), 1.91 (m, 2H), 1.80 (m, 2H), 1.66 - 1.49 (m, 10H), 1.39 - 1.21 (m, 32H), 1.00 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 845.63 m/z [M+H].
실시예 58의 합성
중간체 58a: 9-(옥틸옥시)-9-옥소노난산
Figure pct00146
중간체 58a를 중간체 54a에 대해 사용한 방법을 이용하여 노난다이온산 및 옥탄-1-올로부터 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, MeOD) δ 4.05 (t, J = 6.6　Hz, 2H), 2.28 (m, 4H), 1.61 (m, 6H), 1.32 (m, 16H), 0.90 (t, J = 6.6 Hz, 3H) ppm.
중간체 58b: 1-(3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-(하이드록시메틸)프로필) 9-옥틸 노난다이오에이트
Figure pct00147
중간체 58b를 중간체 54c에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 58a 및 중간체 54b로부터 26% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ　4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.22 - 4.13 (m, 4H), 4.05 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.62 (t, J = 5.9　Hz, 2H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.39 (dt, J = 9.4, 6.7 Hz, 2H), 2.40 (t, J = 7.5　Hz, 2H), 2.34 - 2.24 (m, 5H), 2.19 (m, 1H), 1.93 (td, J = 7.5, 5.4 Hz, 2H), 1.66 - 1.49 (m, 10H), 1.39 - 1.19 (m, 36H), 0.87 (m, 9H) ppm.
실시예 58: 1-(3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카본일)옥시)메틸)프로필) 9-옥틸 노난다이오에이트
Figure pct00148
실시예 58을 실시예 1에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 58b 및 3-(다이에틸아미노)프로판-1-올로부터 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 4.47 (t, J = 5.5　Hz, 1H), 4.22 - 4.08 (m, 8H), 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.55 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.39 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.50 (m, 6H), 2.40 (m, 3H), 2.29 (td, J = 7.6, 6.2 Hz, 4H), 1.91 (td, J = 7.6, 5.5 Hz, 2H), 1.80 (m, 2H), 1.66 - 1.51 (m, 10H), 1.38 - 1.21 (m, 36H), 1.00 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 873.67 m/z [M+H].
실시예 59의 합성
중간체 59a: 9-(데실옥시)-9-옥소노난산
Figure pct00149
중간체 59a를 중간체 54a에 대해 사용한 방법을 이용하여 노난다이온산 및 데칸-1-올로부터 39% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, MeOD) δ 4.08 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.31 (m, 4H), 1.63 (m, 6H), 1.33 (m, 20H), 0.92 (t, J = 6.8 Hz, 3H) ppm.
중간체 59b: 1-(3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-(하이드록시메틸)프로필) 9-데실 노난다이오에이트
Figure pct00150
중간체 59b를 중간체 54c에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 59a 및 중간체 54b로부터 43% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.22 - 4.12 (m, 4H), 4.04 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.61 (t, J = 5.9　Hz, 2H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.39 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.40 (t, J = 7.5　Hz, 2H), 2.34 - 2.24 (m, 5H), 2.19 (m, 1H), 1.93 (td, J = 7.5, 5.4 Hz, 2H), 1.66 - 1.50 (m, 10H), 1.37 - 1.21 (m, 40H), 0.87 (m, 9H) ppm; MS: 765.68 m/z [M+Na].
실시예 59: 1-(3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카본일)옥시)메틸)프로필) 9-데실 노난다이오에이트
Figure pct00151
실시예 59를 실시예 1에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 59b 및 3-(다이에틸아미노)프로판-1-올로부터 65% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400　㎒, CDCl3) δ 4.47 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.21 - 4.09 (m, 8H), 4.04 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.55 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.39 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.50 (m, 6H), 2.39 (m, 3H), 2.28 (m, 4H), 1.91 (td, J = 7.6, 5.5 Hz, 2H), 1.80 (m, 2H), 1.66 - 1.49 (m, 10H), 1.37 - 1.21 (m, 40H), 1.00 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 901.76 m/z [M+H].
실시예 60의 합성
중간체 60a: 12-옥소-12-(펜틸옥시)도데칸산
Figure pct00152
중간체 60a를 중간체 54a에 대해 사용한 방법을 이용하여 도데칸다이온산 및 펜탄-1-올로부터 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 4.07 (t, J = 6.8　Hz, 2H), 2.30 (m, 4H), 1.63 (m, 6H), 1.33 (m, 16H), 0.93 (t, J = 6.8 Hz, 3H) ppm.
중간체 60b: 1-(3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-(하이드록시메틸)프로필) 12-펜틸 도데칸다이오에이트
Figure pct00153
중간체 60b를 중간체 54c에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 60a 및 중간체 54b로부터 21% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ　4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.22 - 4.11 (m, 4H), 4.05 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.61 (t, J = 5.9　Hz, 2H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.39 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.40 (t, J = 7.5　Hz, 2H), 2.34 - 2.24 (m, 5H), 2.19 (m, 1H), 1.93 (td, J = 7.5, 5.4 Hz, 2H), 1.65 - 1.50 (m, 10H), 1.29 (m, 36H), 0.89 (m, 9H) ppm; MS: 737.68 m/z [M+Na].
실시예 60: 1-(3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카본일)옥시)메틸)프로필) 12-펜틸 도데칸다이오에이트
Figure pct00154
실시예 60을 실시예 1에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 60b 및 3-(다이에틸아미노)프로판-1-올로부터 65% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400　㎒, CDCl3) δ 4.47 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.24 - 4.09 (m, 8H), 4.05 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.55 (dt, J = 9.2, 6.7 Hz, 2H), 3.39 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.50 (m, 6H), 2.40 (m, 3H), 2.29 (td, J = 7.6, 5.8 Hz, 4H), 1.91 (td, J = 7.6, 5.5 Hz, 2H), 1.80 (dq, J = 8.7, 6.7　Hz, 2H), 1.68 - 1.49 (m, 10H), 1.38 - 1.24 (m, 36H), 1.00 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.89 (m, 9H) ppm; MS: 873.67 m/z [M+H].
실시예 61의 합성
중간체 61a: 12-(헵틸옥시)-12-옥소도데칸산
Figure pct00155
중간체 61a를 중간체 54a에 대해 사용한 방법을 이용하여 도데칸다이온산 및 헵탄-1-올로부터 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 4.05 (t, J = 6.8　Hz, 2H), 2.31 (m, 4H), 1.61 (m, 6H), 1.30 (m, 20H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H) ppm.
중간체 61b: 1-(3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-(하이드록시메틸)프로필) 12-헵틸 도데칸다이오에이트
Figure pct00156
중간체 61b를 중간체 54c에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 61a 및 중간체 54b로부터 33% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ　4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.22 - 4.12 (m, 4H), 4.05 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.64 - 3.59 (m, 2H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.39 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.40 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.35 - 2.23 (m, 5H), 2.19 (m, 1H), 1.93 (td, J = 7.5, 5.5 Hz, 2H), 1.66 - 1.50 (m, 10H), 1.37 - 1.23 (m, 40H), 0.87 (m, 9H) ppm; MS: 765.68 m/z [M+Na].
실시예 61: 1-(3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카본일)옥시)메틸)프로필) 12-헵틸 도데칸다이오에이트
Figure pct00157
실시예 61을 실시예 1에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 61b 및 3-(다이에틸아미노)프로판-1-올로부터 69% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400　㎒, CDCl3) δ 4.47 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.22 - 4.09 (m, 8H), 4.05 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.55 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.39 (dt, J = 9.3, 6.6 Hz, 2H), 2.50 (m, 6H), 2.40 (m, 3H), 2.29 (td, J = 7.6, 6.3 Hz, 4H), 1.91 (td, J = 7.6, 5.5 Hz, 2H), 1.80 (m, 2H), 1.66 - 1.49 (m, 10H), 1.37 - 1.24 (m, 40H), 1.00 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 901.72 m/z [M+H].
실시예 62의 합성
중간체 62a: 메틸 6-하이드록시헥사노에이트
Figure pct00158
MeOH(1000㎖) 중 HCl 중의 옥세판-2-온(100g, 876m㏖)의 혼합물을 70℃에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 수성 NaHCO3의 첨가에 의해 pH 8로 조절하고, 이어서, EtOAc(3×1000㎖)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(50㎖)로 세척하고 나서, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과 후, 진공 하에 농축시켜 100g(685m㏖, 78% 수율)의 조질의 생성물을 무색 오일로서 제공하고, 이는 추가 정제가 필요하지 않았다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 3.65 (m, 5H), 2.33 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.69 - 1.57 (m, 4H), 1.41 (m, 3H) ppm.
중간체 62b: 메틸 6-옥소헥사노에이트
Figure pct00159
DCM(1200㎖) 중 중간체 62a(93g, 636m㏖)의 용액에 Et3N(266㎖, 1.91㏖)을 0℃에서 첨가하였다. 이어서, DMSO(497㎖) 중 피리딘삼산화황(203g, 1.27㏖)을 0℃에서 적가하였다. 얻어진 반응 혼합물을 15℃에서 2시간 동안 교반하고, 물(1000㎖)로 희석시키고 나서, DCM(2×1000㎖)으로 추출하였다). 합한 유기층을 염수(1000㎖)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과 후, 진공 하에 농축시켰다. 실리카겔 크로마토그래피(석유 에터 중의 0 내지 5% EtOAc)를 이용하여 조질의 잔사를 정제하여 63g(437m㏖, 69% 수율)의 목적하는 생성물을 제공하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 9.77 (m, 1H), 3.67 (s, 3H), 2.47 (m, 2H), 2.33 (m, 2H), 1.67 (m, 4H) ppm.
중간체 62c: 메틸 6,6-다이메톡시헥사노에이트
Figure pct00160
MeOH(300㎖) 중 중간체 62b(60g, 416m㏖)의 용액에 H2SO4(2.22㎖, 4.08g, 41.6m㏖)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 80℃에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 감압 하에 잔사를 제공하고, 포화 NaHCO3으로 pH 7까지 희석시키고 나서, EtOAc(3×500㎖)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(500㎖)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과 후, 진공 하에 농축시켰다. 실리카겔 크로마토그래피(석유 에터 중의 0 내지 5% EtOAc)를 이용하여 조질의 잔사를 정제하여 30g(158m㏖, 38% 수율)의 목적하는 생성물을 무색 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 4.36 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 3.67 (s, 3H), 3.32 (s, 6H), 2.32 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.67 - 1.60 (m, 4H), 1.35 (m, 2H) ppm.
중간체 62d: 메틸 6,6-비스(옥틸옥시)헥사노에이트
Figure pct00161
옥탄-1-올(80㎖) 중 중간체 62c(30g, 158m㏖)의 용액에 KHSO4(10.7g, 78.9m㏖)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 80℃에서 12시간 동안 교반하고, 석유 에터(150㎖)로 희석시키고, 실리카겔 크로마토그래피(석유 에터)를 이용하여 직접 정제하여 35g(90.5m㏖, 57% 수율)의 목적하는 생성물을 무색 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 4.46 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 3.67 (s, 3H), 3.57 (m, 2H), 3.40 (m, 2H), 2.32 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.67 - 1.55 (m, 8H), 1.36 - 1.28 (m, 22H), 0.80 (t, J = 6.8 Hz, 6H) ppm.
중간체 62e: 6,6-비스(옥틸옥시)헥산산
Figure pct00162
MeOH(150㎖) 중 중간체 62d(35g, 90.5m㏖)의 용액에 H2O(50㎖) 중 NaOH(10.9g, 272m㏖)의 용액을 첨가하였다. 15℃에서 5시간 동안 교반 시, 반응 혼합물을 감압 하에 농축시키고, 물(150㎖)로 희석시키고 나서, 석유 에터(200㎖)로 추출하였다. 유기층을 염수(200㎖)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고 나서, 여과 후, 진공 하에 농축시켰다. 실리카겔 크로마토그래피(석유 에터 중의 0 내지 5% EtOAc)를 이용하여 조질의 잔사를 정제하여 9.5g(25.5m㏖, 28% 수율)의 목적하는 생성물을 황색 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 4.47 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 3.56 (m, 2H), 3.40 (m, 2H), 2.37 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.69 - 1.55 (m, 8H), 1.33 (m, 22H), 0.89 (t, J = 6.8　Hz, 6H) ppm; MS: 371.3[M-H].
중간체 62f: 3-((6,6-비스(옥틸옥시)헥산오일)옥시)-2-(하이드록시메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00163
중간체 62f를 중간체 1d에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 1a 및 중간체 62e로부터 34% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.45 - 5.29 (m, 4H), 4.47 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 4.26 - 4.11 (m, 4H), 3.63 (t, J = 5.9 Hz, 2H), 3.57 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.41 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.78 (m, 2H), 2.35 (td, J = 7.6, 6.4 Hz, 4H), 2.28 (t, J = 6.3 Hz, 1H), 2.21 (m, 1H), 2.07 (q, J = 6.8 Hz, 4H), 1.72 - 1.53 (m, 9H), 1.45 - 1.23 (m, 38H), 0.90 (m, 9H) ppm; MS: 745.74[M+Na].
실시예 62: 3-((6,6-비스(옥틸옥시)헥산오일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카본일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00164
실시예 62를 실시예 1에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 62f 및 3-(다이에틸아미노)프로판-1-올로부터 47% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400　㎒, CDCl3) δ 5.43 - 5.27 (m, 4H), 4.44 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 4.22 - 4.07 (m, 8H), 3.55 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.39 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.51 (q, J = 6.9 Hz, 6H), 2.41 (m, 1H), 2.31 (td, J = 7.6, 5.4 Hz, 4H), 2.04 (q, J = 6.8　Hz, 4H), 1.81 (m, 2H), 1.60 (m, 10H), 1.44 - 1.20 (m, 36H), 1.00 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 881.76 m/z [M+H].
실시예 63의 합성
중간체 63a: 헵타데칸-9-올
Figure pct00165
THF(400㎖) 중 노난알(40g, 281.22m㏖)의 용액에 브로모(옥틸) 마그네슘(1 M, 309.34㎖)을 -40℃에서 첨가하였다. 혼합물을 16℃에서 2시간 동안 교반하였다. 잔사를 포화 NH4Cl(500㎖)에 붓고, 에틸 아세테이트(3×700㎖)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(800㎖)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과 후, 진공 하에 농축시켰다. 조질의 잔사를 실리카겔 크로마토그래피(석유 에터 중 0 내지 1.5% EtOAc)를 이용하여 32g(124.8m㏖, 44% 수율)의 목적하는 생성물을 백색 고체로서 제공하였다. 1H NMR (400　㎒, CDCl3) δ 3.52 (m, 1H), 1.42 - 1.21 (m, 28H), 0.81 (t, J = 6.6 Hz, 6H) ppm.
중간체 63b: 5-(헵타데칸-9-일옥시)-5-옥소펜탄산
Figure pct00166
중간체 54a에 대해 사용한 방법을 이용하여 펜탄다이온산 및 중간체 63a로부터 중간체 63b를 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, MeOD) δ 4.90 (m, 1H), 2.36 (m, 4H), 1.91 (m, 2H), 1.54 (m, 4H), 1.29 (m, 24H) 0.90 (t, J = 6.6 Hz, 6H) ppm.
중간체 63c: 헵타데칸-9-일(3-하이드록시-2-((((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔오일)옥시)메틸)프로필) 글루타레이트
Figure pct00167
중간체 63c를 중간체 1d에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 1a 및 중간체 63b로부터 41% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ　5.43 - 5.26 (m, 4H), 4.86 (m, 1H), 4.22 - 4.08 (m, 4H), 3.61 (t, J = 5.9 Hz, 2H), 2.77 (m, 2H), 2.43 - 2.28 (m, 6H), 2.26 - 2.16 (m, 2H), 2.04 (q, J = 6.8 Hz, 4H), 1.95 (m, 2H), 1.65 - 1.58 (m, 2H), 1.50 (m, 4H), 1.40 - 1.18 (m, 37H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 721.84 m/z [M+H].
실시예 63: 3-(((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카본일)옥시)-2-((((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔오일)옥시)메틸)프로필 헵타데칸-9-일 글루타레이트
Figure pct00168
실시예 63을 실시예 1에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 63c 및 3-(다이에틸아미노)프로판-1-올로부터 59% 수율로 합성하였다. 1H NMR (500　㎒, CDCl3) δ 5.42 - 5.28 (m, 4H), 4.86 (m, 1H), 4.21 - 4.08 (m, 8H), 2.76 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.50 (q, J = 7.0 Hz, 6H), 2.46 - 2.27 (m, 7H), 2.04 (d, J = 6.2 Hz, 4H), 1.94 (m, J = 7.5 Hz, 2H), 1.80 (m, J = 6.8 Hz, 2H), 1.60 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.50 (q, J = 6.2 Hz, 4H), 1.35 (t, J = 7.1 Hz, 4H), 1.33 - 1.22 (m, 34H), 1.00 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 879.78 m/z [M+H].
실시예 64의 합성
중간체 64a: 7-(헵타데칸-9-일옥시)-7-옥소헵탄산
Figure pct00169
중간체 54a에 대해 사용한 방법을 이용하여 헵탄다이온산 및 중간체 63a로부터 중간체 64를 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, MeOD) δ 4.90 (m, 1H), 2.30 (m, 4H), 1.62 (m, 4H), 1.53 (m, 4H), 1.29 (m, 26H), 0.90 (t, J = 6.8 Hz, 6H) ppm.
중간체 64b: 1-(헵타데칸-9-일) 7-(3-하이드록시-2-((((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔오일)옥시)메틸)프로필) 헵탄다이오에이트
Figure pct00170
중간체 64b를 중간체 1d에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 1a 및 중간체 64a로부터 43% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.42 - 5.27 (m, 4H), 4.85 (m, 1H), 4.22 - 4.12 (m, 4H), 3.61 (t, J = 5.9 Hz, 2H), 2.76 (dd, J = 7.2, 5.9 Hz, 2H), 2.36 - 2.24 (m, 6H), 2.19 (m, 1H), 2.04 (t, J = 3.5 Hz, 4H), 1.69 - 1.58 (m, 6H), 1.49 (t, J = 6.2 Hz, 4H), 1.41 - 1.19 (m, 40H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 749.83 m/z [M+H].
실시예 64: 1-(3-(((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카본일)옥시)-2-((((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔오일)옥시)메틸)프로필) 7-(헵타데칸-9-일) 헵탄다이오에이트
Figure pct00171
실시예 64를 실시예 1에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 64b 및 3-(다이에틸아미노)프로판-1-올로부터 63% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400　㎒, CDCl3) δ 5.42 - 5.26 (m, 4H), 4.85 (m, 1H), 4.22 - 4.07 (m, 8H), 2.76 (m, 2H), 2.50 (m, 6H), 2.41 (m, 1H), 2.35 - 2.24 (m, 7H), 2.04 (q, J = 6.2 Hz, 4H), 1.80 (m, 2H), 1.63 (m, 7H), 1.49 (q, J = 6.1 Hz, 4H), 1.38 - 1.24 (m, 38H), 1.00 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 907.61 m/z [M+H].
실시예 65의 합성
중간체 65a: 3-((2-헥실데칸오일)옥시)-2-(하이드록시메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00172
중간체 65a를 중간체 1d에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 1a 및 2-헥실데칸산으로부터 40% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400　㎒, CDCl3) δ 5.45 - 5.25 (m, 4H), 4.25 - 4.10 (m, 4H), 3.61 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.39 - 2.29 (m, 3H), 2.27 - 2.16 (m, 2H), 2.04 (q, J = 6.8 Hz, 4H), 1.60 (m, 4H), 1.50 - 1.16 (m, 36H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 607.77 m/z [M+H].
실시예 65: 3-(((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카본일)옥시)-2-(((2-헥실데칸오일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00173
실시예 65를 실시예 1에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 65a 및 3-(다이에틸아미노)프로판-1-올로부터 63% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400　㎒, CDCl3) δ 5.43 - 5.27 (m, 4H), 4.22 - 4.07 (m, 8H), 2.77 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.50 (q, J = 7.1 Hz, 6H), 2.42 (m, 1H), 2.36 - 2.26 (m, 3H), 2.09 - 2.00 (m, 4H), 1.80 (m, 2H), 1.63 - 1.51 (m, 4H), 1.43 (m, 2H), 1.39 - 1.19 (m, 34H), 1.00 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.87 (m, 9H) ppm; MS: 765.68 m/z [M+H].
실시예 66의 합성
중간체 66a: 헵타데칸-9-온
Figure pct00174
DCM(300㎖) 중 중간체 63a(32.8g, 127m㏖)의 용액에 데스-마틴 페리오디난(81.4g, 192m㏖)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 15℃에서 5시간 동안 교반하고, 진공 하에 농축시키고, 실리카겔 크로마토그래피(석유 에터)를 이용하여 직접 정제하여 20g(70.5m㏖, 56% 수율)의 목적하는 생성물을 백색 고체로서 제공하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 2.39 (t, J = 7.4 Hz, 4H), 1.56 (m, 4H), 1.30 (m, 20H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 6H) ppm.
중간체 66b: 메틸 3-옥틸운데크-2-엔오에이트
Figure pct00175
DMF(75㎖) 중 메틸 2-다이메톡시포스포릴아세테이트(2 당량)의 용액에 NaH(2 당량)를 15℃에서 첨가하였다. 1시간 동안 교반 시, 중간체 66a(7.5g, 29.48m㏖, 1 당량)를 첨가하고, 반응 혼합물을 추가 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 90 내지 110℃까지 가온시키고, 10 내지 48시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물에 붓고 나서, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기층을 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과 후, 진공 하에 농축시켰다. 조질의 잔사를 실리카겔 크로마토그래피를 이용하여 정제하여 12g(38.65m㏖, 66% 수율)의 목적하는 생성물을 황색 오일로서 제공하였다.
중간체 66c: 메틸 3-옥틸운데카노에이트
Figure pct00176
EtOH(75㎖) 중 중간체 66b(7.5g, 24m㏖)의 용액에 N2 하에 Pd/C(1g)를 첨가하였다. 현탁액을 진공 하에 탈기시키고, H2로 3회 퍼지하였다. 혼합물을 H2(15 psi) 하에 15℃에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과시키고, MeOH(1 ℓ)로 세척하였하였다. 여과액을 진공 하에 농축시키고, 실리카겔 크로마토그래피(석유 에터)를 이용하여 직접 정제하여 10g(32.00m㏖, 66% 수율)의 목적하는 생성물을 무색 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 3.59 (s, 3H), 2.16 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 1.77 (br m, 1H), 1.19 (m, 28H), 0.81 (t, J = 6.8 Hz, 6H) ppm.
중간체 66d: 3-옥틸운데칸산
Figure pct00177
EtOH(50㎖) 및 H2O(50㎖) 중 중간체 66c(10g, 32.0m㏖)의 용액에 LiOH·H2O (2.69g, 64.0) 및 NaOH(2.56g, 64.0m㏖)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 60℃까지 가온시키고, 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시켜 EtOH를 제거하고, 이어서, 물(30㎖)에 부었다. 얻어진 혼합물을 1M HCl(aq.)을 이용하여 pH 6까지 산성화시키고, 이어서, 에틸 아세테이트(3×60㎖)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(2×40㎖)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과 후, 진공 하에 농축시켰다. 실리카겔 크로마토그래피(석유 에터 중의 0 내지 50% EtOAc)를 이용하여 조질의 잔사를 정제하여 3.6g(12.4m㏖, 38% 수율)의 목적하는 생성물을 무색 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400　㎒, CDCl3) δ 2.20 (br m, 2H), 1.82 (br m, 1H), 1.31 (m, 28H), 0.89 (t, J = 6.8　Hz, 6H) ppm.
중간체 66e: 3-하이드록시-2-(((3-옥틸운데칸오일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00178
중간체 66e를 중간체 1d에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 1a 및 중간체 66d로부터 39% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ　5.45 - 5.26 (m, 4H), 4.24 - 4.10 (m, 4H), 3.61 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.32 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.28 - 2.14 (m, 4H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 4H), 1.83 (m, 1H), 1.61 (m, 2H), 1.28 (m, 42H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 649.67 m/z [M+H].
실시예 66: 3-(((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카본일)옥시)-2-(((3-옥틸운데칸오일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00179
실시예 66을 실시예 1에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 66e 및 3-(다이에틸아미노)프로판-1-올로부터 53% 수율로 합성하였다. 1H NMR (500　㎒, CDCl3) δ 5.43 - 5.28 (m, 4H), 4.19 - 4.13 (m, 8H), 2.77 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.50 (q, J = 7.0 Hz, 6H), 2.42 (m, 1H), 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.24 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 2.05 (m, 4H), 1.80 (m, 3H), 1.61 (m, 2H), 1.42 - 1.15 (m, 42H), 1.00 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 807.58 m/z [M+H].
실시예 67의 합성
중간체 67a: 메틸 3-헵틸데크-2-에노에이트
Figure pct00180
THF(0.4M) 중 NaH(14.13g, 353.36m㏖, 2 당량)의 용액에 0℃에서 메틸 2-다이메톡시포스포릴아세테이트(64.35g, 353.36m㏖, 2 당량)를 서서히 첨가하였다. 1시간 동안 교반 시, 펜타데칸-8-온(40g, 176.68m㏖)을 서서히 첨가하고, 반응 혼합물을 15℃까지 가온시켰다. 1시간 동안 추가 교반한 후에, 반응 혼합물을 70℃까지 가열하고, 48시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0℃까지 냉각시키고, 물로 희석시키고, 석유 에터로 추출하였다. 합한 유기층을 염수로 세척하고, 무수 황산나트륨 또는 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과 후, 진공 하에 농축시켰다. 조질의 잔사를 실리카겔 크로마토그래피를 이용하여 정제하여 20g(56.65m㏖, 32% 수율)의 목적하는 생성물을 무색 오일로서 제공하였다.
중간체 67b: 3-헵틸데크-2-엔-1-올
Figure pct00181
THF(200㎖) 중 중간체 67a(21.5g, 76.1m㏖)의 용액에 DIBAL(1 M, 228.4㎖)을 0℃에서 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반하고, 이어서, 15℃에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물(20㎖) 0℃에서 희석시키고, 이어서, 추가 200㎖로 희석시킨 후에 EtOAc(2×200㎖)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(200㎖)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과 후, 진공 하에 농축시켰다. 실리카겔 크로마토그래피(석유 에터 중의 0 내지 2% EtOAc)를 이용하여 조질의 잔사를 정제하여 17g(40.1m㏖, 53% 수율)의 목적하는 생성물을 무색 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.39 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 4.16 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 3.65 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 2.03 (m, 4H), 1.35 - 1.28 (m, 20H), 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 6H) ppm.
중간체 67c: 3-헵틸데크-2-엔알
Figure pct00182
DMSO(1.5 내지 3.5M) 중 IBX(1.5-3.5 M)의 교반 현탁액에 30℃에서 THF (0.5 내지 1M) 중 중간체 67b(17g, 66.8m㏖, 1 당량)를 첨가하였다. 30℃에서 적어도 2시간 동안 교반 시, 반응 혼합물을 석유 에터로 희석시키고, 물 및 염산로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과 후, 진공 하에 농축시켰다. 조질의 잔사를 실리카겔 크로마토그래피를 이용하여 정제하여 12g(47.5m㏖, 71% 수율)의 목적하는 생성물을 무색 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 9.99 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 5.86 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 2.55 (m, 2H), 2.21 (m, 2H) 1.52 (m, 4H), 1.30 (m, 16H), 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 6H) ppm.
중간체 67d: 메틸 (E)-5-헵틸도데카-2,4-다이에노에이트
Figure pct00183
중간체 67d를 67a에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 67c 및 메틸 2-다이메톡시포스포릴아세테이트로부터 44% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 7.60 (dd, J = 15.0 Hz, 11.8 Hz, 1H), 5.97 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 5.79 (d, J = 15.2　Hz, 1H), 3.75 (s, 3H), 2.27 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.13 (t, J = 7.6 Hz, 2H) 1.48 - 1.29 (m, 20H), 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 6H) ppm.
중간체 67e: 메틸 5-헵틸도데카노에이트
Figure pct00184
MeOH(100㎖) 중 중간체 67d(8g, 20.75m㏖)의 용액에 Pd/C(10g, 339.59 umol, 33.96㎕, 10% 순도)를 첨가하였다. 현탁액을 진공 하에 탈기시키고, H2로 몇 회 퍼지하였다. 혼합물을 H2(15 psi) 하에 15℃에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과시키고, 진공 하에 농축시켜 6g(15.36m㏖, 74% 수율)의 목적하는 생성물을 무색 오일로서 제공하였고, 이는 추가 정제가 필요하지 않았다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 3.68 (s, 3H), 2.29 (t, J = 7.6　Hz, 2H), 1.59 (m, 2H), 1.28 (m, 27H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 6H) ppm.
중간체 67f: 5-헵틸도데칸산
Figure pct00185
THF(120㎖) 중 중간체 67e(6g, 15.36m㏖)의 용액에 물(60㎖) 중 NaOH(3.07g, 76.79m㏖)의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 60℃에서 5시간 동안 교반하고, 물(20㎖)로 희석시키고, 1　M HCl을 이용하여 pH 4까지 중화시키고, EtOAc(3×20㎖)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(20㎖)로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 여과 후, 진공 하에 농축시켰다. 실리카겔 크로마토그래피(석유 에터 중의 0 내지 2% EtOAc)를 이용하여 조질의 잔사를 정제하여 3.51g(11.68m㏖, 76.03% 수율)의 목적하는 생성물을 무색 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 ㎒, MeOD) δ 2.27 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.59 (m, 2H), 1.29 (m, 27H), 0.91 (t, J = 6.8 Hz, 6H) ppm; MS: 297.2 m/z [M-H].
중간체 67g: 3-((5-헵틸도데칸오일)옥시)-2-(하이드록시메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00186
중간체 67g를 중간체 1d에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 1a 및 중간체 67f로부터 42% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.44 - 5.26 (m, 4H), 4.17 (m, 4H), 3.61 (t, J = 5.9 Hz, 2H), 2.76 (m, 2H), 2.31 (q, J = 7.3 Hz, 4H), 2.26 - 2.13 (m, 2H), 2.04 (q, J = 6.8 Hz, 4H), 1.59 (m, 5H), 1.41 - 1.16 (m, 39H), 0.88 (m, 9H) ppm. MS: 649.67 m/z [M+H].
실시예 67: 3-(((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카본일)옥시)-2-(((5-헵틸도데칸오일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00187
실시예 67을 실시예 1에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 67g 및 3-(다이에틸아미노)프로판-1-올로부터 51% 수율로 합성하였다. 1H NMR (500　㎒, CDCl3) δ 5.42 - 5.28 (m, 4H), 4.22 - 4.08 (m, 8H), 2.77 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.50 (q, J = 7.0 Hz, 6H), 2.42 (m, 1H), 2.29 (m, 4H), 2.04 (m, 4H), 1.80 (m, 2H), 1.59 (m, 4H), 1.40 - 1.20 (m, 42H), 1.00 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 807.53 m/z [M+H].
실시예 68의 합성
중간체 68a: 메틸 3-헥실논-2-에노에이트
Figure pct00188
중간체 68a를 66b에 대해 사용한 방법을 이용하여 트라이데칸-7-온 및 메틸 2-다이메톡시포스포릴아세테이트로부터 55% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.63 (s, 1H), 3.68 (s, 3H), 2.60 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 2.14 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.45 - 1.27 (m, 16H), 0.89 (t, J = 6.4 Hz, 6H) ppm.
중간체 68b: 3-헵틸데크-2-엔-1-올
Figure pct00189
중간체 68b를 중간체 67b에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 68a로부터 49% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.38 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 4.14 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 2.01 (m, 4H), 1.39 - 1.27 (m, 16H), 0.88 (t, J = 6.6 Hz, 6H) ppm.
중간체 68c: 3-헵틸데크-2-엔알
Figure pct00190
중간체 68c를 중간체 67c에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 68b로부터 73% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 9.99 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 5.85 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 2.55 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 2.21 (t, J = 7.2 Hz, 2H) 1.49 (m, 4H), 1.31 (m, 12H), 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 6H) ppm.
중간체 68d: (E)-7-헥실트라이데카-4,6-다이엔산
Figure pct00191
HMPA(8㎖) 및 THF(104㎖) 중 중간체 68c(9g, 40.1m㏖)의 용액에 0℃에서 NaHMDS(1 M, 160.4㎖)를 첨가하였다. THF(28㎖) 중 3-카복시프로필(트라이페닐)포스포늄(22.42g, 64.18m㏖)을 반응 혼합물에 첨가하고, 이를 추가로 15℃에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물(200㎖)에 붓고 나서, 2N HCl(aq.)로 산성화시키고, EtOAc(4×150㎖)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(200㎖)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과 후, 진공 하에 농축시켰다. 실리카겔 크로마토그래피(석유 에터 중의 1 내지 100% EtOAc)를 이용하여 조질의 잔사를 정제하여 8g(19.0m㏖, 24% 수율)의 목적하는 생성물을 황색 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 6.25 (m, 1H), 6.05 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 5.30 (m, 1H), 2.59 - 2.45 (m, 4H), 2.13-2.07 (m, 4H), 1.40 - 1.29 (m, 16H), 0.89 (t, J = 6.6 Hz, 6H) ppm; MS: 295.2 [M+H].
중간체 68e: 7-헥실트라이데칸산
Figure pct00192
MeOH(50㎖) 중 중간체 68d(4g, 13.6m㏖)의 용액에 Pd/C(0.4g, 13.58m㏖)를 N2 하에 첨가하였다. 현탁액을 진공 하에 탈기시키고, H2로 몇 회 퍼지하였다. 반응 혼합물을 H2(15 psi) 하에 35℃에서 12시간 동안 교반하고, 여과 후, MeOH(300㎖)로 세척하고, 진공 하에 농축시켰다. 조질의 잔사를 실리카겔 크로마토그래피(석유 에터)를 이용하여 정제하여 5.3g(16.0m㏖, 59% 수율)의 목적하는 생성물을 황색 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 2.35 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.65 (m, 2H), 1.25 (m, 27H), 0.89 (t, J = 6.6 Hz, 6H) ppm; MS: 297.2 m/z [M-H].
중간체 68f: 3-((7-헥실트라이데칸오일)옥시)-2-(하이드록시메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00193
중간체 68f를 중간체 1d에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 1a 및 중간체 68e로부터 60% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.45 - 5.27 (m, 4H), 4.17 (m, 4H), 3.61 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.32 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.25 - 2.14 (m, 2H), 2.04 (q, J = 6.8 Hz, 4H), 1.68 - 1.55 (m, 5H), 1.40 - 1.15 (m, 39H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 649.72 m/z [M+H].
실시예 68: 3-(((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카본일)옥시)-2-(((7-헥실트라이데칸오일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00194
실시예 68을 실시예 1에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 68f 및 3-(다이에틸아미노)프로판-1-올로부터 43% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400　㎒, CDCl3) δ 5.43 - 5.27 (m, 4H), 4.22 - 4.07 (m, 8H), 2.77 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.55 - 2.46 (m, 6H), 2.46 - 2.37 (m, 1H), 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.04 (m, 4H), 1.86 - 1.75 (m, 2H), 1.61 (t, J = 7.3 Hz, 4H), 1.42 - 1.11 (m, 41H), 1.00 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 807.72 m/z [M+H].
실시예 69의 합성
중간체 69a: (Z)-11-(논-2-엔-1-일옥시)-11-옥소운데칸산
Figure pct00195
중간체 69a를 중간체 54a에 대해 사용한 방법을 이용하여 운데칸다이온 및 (Z)-논-2-엔-1-올로부터 36% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ　5.65 (m, 1H), 5.52 (m, 1H), 4.61 (dd, J = 6.9, 1.2 Hz, 2H), 2.32 (m, 4H), 2.09 (m, 2H), 1.61 (m, 4H), 1.41 - 1.20 (m, 18H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H) ppm.
중간체 69b: (Z)-1-(3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-(하이드록시메틸)프로필) 11-(논-2-엔-1-일) 운데칸다이오에이트
Figure pct00196
중간체 69b를 중간체 54c에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 69a 및 중간체 54b로부터 35% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ　5.64 (m, 1H), 5.52 (m, 1H), 4.62 (d, J = 6.7 Hz, 2H), 4.49 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.24 - 4.10 (m, 4H), 3.67 - 3.52 (m, 4H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.41 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.30 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 2.21 (m, 2H), 2.14 - 2.05 (m, 2H), 1.93 (td, J = 7.5, 5.4　Hz, 2H), 1.57 (m, 9H), 1.40 - 1.21 (m, 36H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 777.78 m/z [M+Na].
실시예 69: (Z)-1-(3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카본일)옥시)메틸)프로필) 11-(논-2-엔-1-일) 운데칸다이오에이트
Figure pct00197
실시예 69를 실시예 1에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 69b 및 3-(다이에틸아미노)프로판-1-올로부터 19% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400　㎒, CDCl3) δ 5.62 (m, 1H), 5.53 (m, 1H), 4.61 (d, J = 7.0, 1.3 Hz, 2H), 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.22 - 4.09 (m, 8H), 3.55 (m, 2H), 3.39 (m, 2H), 2.56 (q, J = 7.2 Hz, 6H), 2.47 - 2.35 (m, 3H), 2.29 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.09 (m, 2H), 1.97 - 1.78 (m, 4H), 1.65 - 1.49 (m, 8H), 1.40 - 1.24 (m, 35H), 1.03 (t, J = 7.2 Hz, 6H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 913.37 m/z [M+H].
실시예 70의 합성
중간체 70a: ((Z)-13-(논-2-엔-1-일옥시)-13-옥소트라이데칸산
Figure pct00198
중간체 70a를 중간체 54a에 대해 사용한 방법을 이용하여 트라이데칸다이온 및 (Z)-논-2-엔-1-올로부터 40% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ　5.62 (m, 1H), 5.50 (m, 1H), 4.59 (dd, J = 6.8, 1.2 Hz, 2H), 2.29 (m, 4H), 2.07 (m, 2H), 1.59 (m, 4H), 1.39 - 1.18 (m, 22H), 0.85 (t, J = 6.8 Hz, 3H) ppm.
중간체 70b: (Z)-1-(3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-(하이드록시메틸)프로필) 13-(논-2-엔-1-일) 트라이데칸다이오에이트
Figure pct00199
중간체 70b를 중간체 54c에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 70a 및 중간체 54b로부터 34% 수율로 합성하였다. 1H NMR (500 ㎒, CDCl3) δ　5.64 (m, 1H), 5.52 (m, 1H), 4.62 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 4.49 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.17 (m, 4H), 3.62 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.41 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.31 (q, J = 7.9 Hz, 4H), 2.25 - 2.15 (m, 2H), 2.09 (q, J = 7.3 Hz, 2H), 1.93 (td, J = 7.5, 5.4 Hz, 2H), 1.58 (m, 8H), 1.39 - 1.21 (m, 41H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 805.63 m/z [M+Na].
실시예 70: (Z)-1-(3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카본일)옥시)메틸)프로필) 13-(논-2-엔-1-일) 트라이데칸다이오에이트
Figure pct00200
실시예 70을 실시예 1에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 70b 및 3-(다이에틸아미노)프로판-1-올로부터 15% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400　㎒, CDCl3) δ 5.64 (m, 1H), 5.51 (m, 1H), 4.61 (d, J = 6.9, 1.2 Hz, 2H), 4.48 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.22 - 4.09 (m, 8H), 3.55 (m, 2H), 3.40 (m, 2H), 2.51 (q, J = 7.0 Hz, 6H), 2.46 - 2.35 (m, 3H), 2.34 - 2.26 (m, 4H), 2.15 - 2.04 (m, 2H), 1.97 - 1.87 (m, 2H), 1.86 - 1.75 (m, 4H), 1.67 - 1.49 (m, 8H), 1.40 - 1.23 (m, 40H), 1.01 (t, J = 7.2 Hz, 6H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 942.04 m/z [M+H].
실시예 71 내지 74의 합성
실시예 1에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 59b 및 아미노 알코올 또는 다이아민 시약으로부터 다음의 실시예를 합성하였다.
실시예 71: 1-(3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-(((((1-메틸피페리딘-3-일)메톡시)카본일)옥시)메틸)프로필) 9-데실 노난다이오에이트
Figure pct00201
19% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.19 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 4.14 (dt, J = 6.0, 1.4 Hz, 4H), 4.05 (t, J = 6.7 Hz, 3H), 3.96 (dd, J = 10.6, 7.3 Hz, 1H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.78 (m, 2H), 2.47 - 2.36 (m, 3H), 2.33 - 2.23 (m, 7H), 2.07 - 1.86 (m, 4H), 1.79 - 1.50 (m, 16H), 1.29 (m, 38H), 1.00 (m, 1H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 899.87 m/z [M+H].
실시예 72: 1-(3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-(((((1-에틸피페리딘-3-일)메톡시)카본일)옥시)메틸)프로필) 9-데실 노난다이오에이트
Figure pct00202
19% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.19 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 4.14 (dt, J = 6.0, 1.4 Hz, 4H), 4.05 (td, J = 6.9, 6.4, 3.7 Hz, 3H), 3.96 (dd, J = 10.7, 7.2 Hz, 1H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.87 m, 2H), 2.48 - 2.36 (m, 5H), 2.34 - 2.24 (m, 4H), 2.05 - 1.85 (m, 3H), 1.79 - 1.50 (m, 16H), 1.39 - 1.20 (m, 40H), 1.12 - 0.97 (m, 3H), 0.87 (m, 9H) ppm; MS: 913.46 m/z [M+H].
실시예 73: 1-(3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((2-(다이에틸아미노)에틸)카바모일)옥시)메틸)프로필) 9-데실 노난다이오에이트
Figure pct00203
14% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.22 (br s, 1H), 4.48 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.20 - 4.08 (m, 6H), 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.21 (br m, 2H), 2.52 (q, J = 7.1, 6.2 Hz, 6H), 2.40 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.29 (td, J = 7.6, 5.9 Hz, 4H), 1.92 (td, J = 7.6, 5.5 Hz, 2H), 1.76 - 1.49 (m, 13H), 1.39 - 1.20 (m, 40H), 1.00 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 886.69 m/z [M+H].
실시예 74: 1-(3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((2-(1-메틸피롤리딘-2-일)에톡시)카본일)옥시)메틸)프로필) 9-데실 노난다이오에이트
Figure pct00204
26% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 4.48 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.28 - 4.09 (m, 8H), 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.05 (m, 1H), 2.46 - 2.36 (m, 3H), 2.34 - 2.24 (m, 7H), 2.21 - 1.87 (m, 4H), 1.84 - 1.43 (m, 12H), 1.40 - 1.18 (m, 40H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 899.38 m/z [M+H].
실시예 75의 합성
실시예 75: 1-(3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-(((4-(다이에틸아미노)부탄오일)옥시)메틸)프로필) 9-데실 노난다이오에이트
Figure pct00205
실시예 75를 실시예 25에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 59b 및 4-(다이에틸아미노)부탄산로부터 61% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400　㎒, CDCl3) δ 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.12 (dd, J = 6.1, 1.6 Hz, 6H), 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.50 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 2.45 - 2.24 (m, 10H), 1.92 (m, 2H), 1.75 (m, 2H), 1.65 - 1.50 (m, 12H), 1.38 - 1.20 (m, 40H), 1.00 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.88 (m, 8H) ppm; MS: 885.43 m/z [M+H].
실시예 76의 합성
중간체 76a: 1-데실 9-(3-하이드록시-2-(하이드록시메틸)프로필) 노난다이오에이트
Figure pct00206
DCM(0.2M) 중 중간체 59a(15g, 45.6m㏖, 1 당량), (2,2-다이메틸-1,3-다이옥산-5-일)메탄올(1-1.2 당량), DMAP(0.2 당량) 및 DIPEA(1.5-3 당량)의 용액에 rt에서 EDC·HCl(1.5 당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 적어도 16시간 동안, 물로 희석시키고, 1M HCl 및 5% 중탄산나트륨으로 순차적으로 세척하고, 황산마그네슘으로 건조시키고 나서, 여과 후, 진공 하에 농축시켰다. 조질의 아세토나이드-보호된 중간체를 MeOH 중에 재현탁시키고, Dowex®　50W X8 수지를 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 rt에서 적어도 12시간 동안 교반하고, 여과 후, MeOH로 세척하고 나서, 진공 하에 농축시켰다. 조질의 잔사를 실리카겔 크로마토그래피(헥산 중 EtOAc의 구배)를 이용하여 정제하여 12.2g(29.3m㏖, 65% 수율)의 목적하는 생성물을 백색 고체로서 제공하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ　4.24　(d, J = 6.3 Hz, 2H), 4.04 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.76 (m, 4H), 2.52 (br s, 2H), 2.30 (dt, J = 16.1, 7.5 Hz, 4H), 2.03 (m, 1H), 1.61 (m, 6H), 1.38 - 1.20 (m, 20H), 0.87 (t, J = 6.8　Hz, 3H) ppm; MS: 439.56 m/z [M+Na].
중간체 76b: 1-데실 9-(3-((7-(헵타데칸-9-일옥시)-7-옥소헵탄오일)옥시)-2-(하이드록시메틸)프로필) 노난다이오에이트
Figure pct00207
중간체 76b를 중간체 1d에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 76a 및 중간체 64a로부터 37% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 4.85 (m, 1H), 4.21 - 4.12 (m, 4H), 4.04 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.61 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 2.37 - 2.24 (m, 8H), 2.18 (m, 1H), 1.63 (m, 11H), 1.49 (m, 7H), 1.39 - 1.19 (m, 42H), 0.87 (m, 9H) ppm; MS: 797.96 m/z [M+H].
실시예 76: 1-데실 9-(3-(((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카본일)옥시)-2-(((7-(헵타데칸-9-일옥시)-7-옥소헵탄오일)옥시)메틸)프로필) 노난다이오에이트
Figure pct00208
실시예 76을 실시예 1에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 76b 및 3-(다이에틸아미노)프로판-1-올로부터 22% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400　㎒, CDCl3) δ 4.85 (m, 1H), 4.22 - 4.10 (m, 8H), 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.55 - 2.50 (m, 6H), 2.41 (m, 1H), 2.35 - 2.24 (m, 8H), 1.81 (m, 2H), 1.70 - 1.55 (m, 12H), 1.50 (m, 4H), 1.41 - 1.23 (m, 44H), 1.00 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 956.17 m/z [M+H].
실시예 77의 합성
중간체 77a: 1-데실 9-(3-((5-(헵타데칸-9-일옥시)-5-옥소펜탄오일)옥시)-2-(하이드록시메틸)프로필) 노난다이오에이트
Figure pct00209
중간체 77a를 중간체 1d에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 76a 및 중간체 63b로부터 26% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ　4.86 (m, 1H), 4.23 - 4.13 (m, 4H), 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.62 (t, J = 5.5 Hz, 2H), 2.33 (m, 8H), 2.19 (m, 1H), 1.95 (m, 2H), 1.61 (m, 8H), 1.50 (m, 4H), 1.38 - 1.19 (m, 42H), 0.87 (m, 9H) ppm; MS: 769.91 m/z [M+H].
실시예 77: 1-데실 9-(3-(((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카본일)옥시)-2-(((5-(헵타데칸-9-일옥시)-5-옥소펜탄오일)옥시)메틸)프로필) 노난다이오에이트
Figure pct00210
실시예 77을 실시예 1에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 77a 및 3-(다이에틸아미노)프로판-1-올로부터 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 4.87 (m, 1H), 4.16 (m, 8H), 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.51 (m, 6H), 2.46 - 2.24 (m, 9H), 1.94 (m, 2H), 1.87 - 1.76 (m, 2H), 1.69 - 1.57 (m, 6H), 1.49 (m, 4H), 1.40 - 1.17 (m, 44H), 1.00 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.89 (m, 9H) ppm; MS: 928.07 m/z [M+H].
실시예 78의 합성
중간체 78a: 4,4-비스(헵틸옥시)부탄나이트릴
Figure pct00211
중간체 78a를 중간체 1b에 대해 사용한 방법을 이용하여 4,4-다이에톡시부탄나이트릴 및 헵탄-1-올로부터 99% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 4.55 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 3.60 (dt, J = 9.3, 6.6 Hz, 2H), 3.43 (dt, J = 9.3, 6.6　Hz, 2H), 2.42 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.94 (td, J = 7.4, 5.3 Hz, 2H), 1.57 (m, 4H), 1.40 - 1.23 (m, 16H), 0.88 (m, 6H) ppm.
중간체 78b: 4,4-비스(헵틸옥시)부탄산
Figure pct00212
중간체 78b를 중간체 1c에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 78a로부터 92% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 8.85 (br s, 1H), 4.46 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 3.52 (dt, J = 9.4, 6.8 Hz, 2H), 3.39 (dt, J = 9.3, 6.8 Hz, 2H), 2.26 (t, J = 7.6　Hz, 2H), 1.85 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 1.53 (m, 4H), 1.29 (m, 16H), 0.94 - 0.80 (m, 6H) ppm; MS: 315 m/z [M-H].
중간체 78c: 1-(3-((4,4-비스(헵틸옥시)부탄오일)옥시)-2-(하이드록시메틸)프로필) 9-데실 노난다이오에이트
Figure pct00213
중간체 78c를 중간체 1d에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 76a 및 중간체 78b로부터 46% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ　4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.23 - 4.11 (m, 4H), 4.04 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.65 - 3.50 (m, 4H), 3.39 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.40 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.29 (m, 5H), 2.19 (m, 1H), 1.93 (td, J = 7.5, 5.4 Hz, 2H), 1.68 - 1.49 (m, 11H), 1.38 - 1.19 (m, 34H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 737.82 m/z [M+Na].
실시예 78: 1-(3-((4,4-비스(헵틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카본일)옥시)메틸)프로필) 9-데실 노난다이오에이트
Figure pct00214
실시예 78을 실시예 1에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 78c 및 3-(다이에틸아미노)프로판-1-올로부터 35% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400　㎒, CDCl3) δ 4.48 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.22 - 4.09 (m, 8H), 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.56 (m, 2H), 3.40 (m, 2H), 2.51 (m, 6H), 2.46 - 2.35 (m, 3H), 2.29 (m, 4H), 1.92 (m, 2H), 1.81 (m, 2H), 1.66 - 1.49 (m, 12H), 1.39 - 1.23 (m, 34H), 1.00 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 873.52 m/z [M+H].
실시예 79의 합성
중간체 79a: 4,4-비스(노닐옥시)부탄나이트릴
Figure pct00215
중간체 79a를 중간체 1b에 대해 사용한 방법을 이용하여 4,4-다이에톡시부탄나이트릴 및 노난-1-올로부터 16% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 4.55 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 3.60 (dt, J = 9.2, 6.6 Hz, 2H), 3.43 (dt, J = 9.3, 6.6　Hz, 2H), 2.42 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.94 (td, J = 7.4, 5.3 Hz, 2H), 1.57 (m, 4H), 1.38 - 1.24 (m, 24H), 0.88 (t, J = 6.7 Hz, 6H) ppm.
중간체 79b: 4,4-비스(노닐옥시)부탄산
Figure pct00216
중간체 79b를 중간체 1c에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 79a로부터 100% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.32 (br s, 1H), 4.44 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 3.49 (dt, J = 9.3, 6.9 Hz, 2H), 3.38 (dt, J = 9.4, 6.9 Hz, 2H), 2.10 (t, J = 7.6　Hz, 2H), 1.78 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 1.53 (m, 4H), 1.27 (m, 24H), 0.88 (t, J = 6.6 Hz, 6H) ppm; MS: 371 m/z [M-H].
중간체 79c: 1-(3-((4,4-비스(노닐옥시)부탄오일)옥시)-2-(하이드록시메틸)프로필) 9-데실 노난다이오에이트
Figure pct00217
중간체 79c를 중간체 1d에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 76a 및 중간체 79b로부터 43% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ　4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.23 - 4.12 (m, 4H), 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.67 - 3.51 (m, 4H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.40 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.30 (dt, J = 11.9, 7.6 Hz, 5H), 2.19 (m, 1H), 1.93 (td, J = 7.6, 5.4 Hz, 2H), 1.66 - 1.48 (m, 11H), 1.37 - 1.20 (m, 42H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 793.91 m/z [M+Na].
실시예 79: 1-(3-((4,4-비스(노닐옥시)부탄오일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카본일)옥시)메틸)프로필) 9-데실 노난다이오에이트
Figure pct00218
실시예 79를 실시예 1에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 79c 및 3-(다이에틸아미노)프로판-1-올로부터 35% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400　㎒, CDCl3) δ 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.22 - 4.10 (m, 8H), 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.55 (m, 2H), 3.39 (m, 2H), 2.50 (m, 6H), 2.45 - 2.35 (m, 3H), 2.29 (m, 4H), 1.92 (m, 2H), 1.86 - 1.74 (m, 3H), 1.66 - 1.49 (m, 10H), 1.35 - 1.23 (m, 43H), 1.00 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.87 (m, 9H) ppm; MS: 929.60 m/z [M+H].
실시예 80 내지 81의 합성
실시예 1에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 76b 및 아미노 알코올 또는 다이아민 시약으로부터 다음의 실시예를 합성하였다.
실시예 80: 1-데실 9-(3-((7-(헵타데칸-9-일옥시)-7-옥소헵탄오일)옥시)-2-((((2-(1-메틸피롤리딘-2-일)에톡시)카본일)옥시)메틸)프로필) 노난다이오에이트
Figure pct00219
48% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 4.85 (m, 1H), 4.26 - 4.09 (m, 8H), 4.04 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.05 (m, 1H), 2.41 (m, 1H), 2.34 - 2.26 (m, 11H), 2.19 - 1.89 (m, 4H), 1.83 - 1.43 (m, 18H), 1.40 - 1.17 (m, 46H), 0.87 (m, 9H) ppm; MS: 954.23 m/z [M+H].
실시예 81: 1-데실 9-(3-(((2-(다이에틸아미노)에틸)카바모일)옥시)-2-(((7-(헵타데칸-9-일옥시)-7-옥소헵탄오일)옥시)메틸)프로필) 노난다이오에이트
Figure pct00220
43% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.21 (br t, J = 5.2 Hz, 1H), 4.85 (m, 1H), 4.12 (d, J = 6.0 Hz, 6H), 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.21 (br q, J = 5.8 Hz, 2H), 2.51 (q, J = 7.1, 6.3 Hz, 6H), 2.43 - 2.23 (m, 8H), 1.62 (m, 11H), 1.50 (q, J = 6.1 Hz, 4H), 1.40 - 1.20 (m, 46H), 0.99 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.87 (m, 9H) ppm; MS: 940.46 m/z [M+H].
실시예 82의 합성
실시예 82: 1-데실 9-(3-((4-(다이메틸아미노)부탄오일)옥시)-2-(((7-(헵타데칸-9-일옥시)-7-옥소헵탄오일)옥시)메틸)프로필) 노난다이오에이트
Figure pct00221
실시예 82를 실시예 25에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 76b 및 4-(다이메틸아미노)부탄산으로부터 55% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400　㎒, CDCl3) δ 4.85 (m, 1H), 4.12 (dd, J = 6.0, 2.3 Hz, 6H), 4.04 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.42 - 2.23 (m, 13H), 2.20 (s, 6H), 1.77 (m, 2H), 1.62 (m, 11H), 1.49 (q, J = 6.0　Hz, 4H), 1.40 - 1.19 (m, 45H), 0.87 (m, 9H) ppm; MS: 911.44 m/z [M+H].
실시예 83의 합성
중간체 83a: (Z)-1-(3-하이드록시-2-(하이드록시메틸)프로필) 9-(논-2-엔-1-일) 노난다이오에이트
Figure pct00222
중간체 83a를 76a에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 54a 및 2-(하이드록시메틸)프로판-1,3-다이올로부터 84% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400　㎒, CDCl3) δ 5.65 (m, 1H), 5.51 (m, 1H), 4.61 (dd, J = 6.9, 1.2 Hz, 2H), 4.24 (d, J = 6.3 Hz, 2H), 3.76 (m, 4H), 2.52 (br s, 2H), 2.31 (m, 4H), 2.12 - 1.98 (m, 3H), 1.61 (m, 4H), 1.40 - 1.21 (m, 14H), 0.87 (t, J = 6.8 Hz, 3H) ppm.
중간체 83b: (Z)-1-(3-((4,4-비스(노닐옥시)부탄오일)옥시)-2-(하이드록시메틸)프로필) 9-(논-2-엔-1-일) 노난다이오에이트
Figure pct00223
중간체 83b를 중간체 1d에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 83a 및 중간체 79b로부터 33% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ　5.64 (m, 1H), 5.51 (m, 1H), 4.61 (dd, J = 6.9, 1.2 Hz, 2H), 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.17 (m, 4H), 3.62 (br m, 2H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.40 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.30 (m, 5H), 2.19 (m, 1H), 2.09 (m, 2H), 1.93 (td, J = 7.5, 5.4 Hz, 2H), 1.66 - 1.50 (m, 10H), 1.39 - 1.21 (m, 36H), 0.0.87 (m, 9H) ppm; MS:　777.87 m/z [M+Na].
실시예 83: (Z)-1-(3-((4,4-비스(노닐옥시)부탄오일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카본일)옥시)메틸)프로필) 9-(논-2-엔-1-일) 노난다이오에이트
Figure pct00224
실시예 83을 실시예 1에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 83b 및 3-(다이에틸아미노)프로판-1-올로부터 60% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400　㎒, CDCl3) δ 5.62 (m, 1H), 5.51 (m, 1H), 4.61 (dd, J = 6.8, 1.2 Hz, 2H), 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.21 - 4.09 (m, 8H), 3.55 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.39 (dt, J = 9.3, 6.7　Hz, 2H), 2.51 (m, 6H), 2.45 - 2.35 (m, 3H), 2.29 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.09 (m, 2H), 1.92 (td, J = 7.6, 5.5 Hz, 2H), 1.81 (m, 2H), 1.67 - 1.48 (m, 8H), 1.42 - 1.20 (m, 38H), 1.00 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 913.71 m/z [M+H].
실시예 84의 합성
중간체 84a: (Z)-1-(3-((4,4-비스(헵틸옥시)부탄오일)옥시)-2-(하이드록시메틸)프로필) 9-(논-2-엔-1-일) 노난다이오에이트
Figure pct00225
중간체 84a를 중간체 1d에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 83a 및 중간체 78b로부터 38% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ　5.64 (m, 1H), 5.51 (m, 1H), 4.61 (dd, J = 6.9, 1.2 Hz, 2H), 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.23 - 4.12 (m, 4H), 3.62 (br t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7　Hz, 2H), 2.40 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.30 (td, J = 7.5, 5.8 Hz, 5H), 2.19 (m, 1H), 2.09 (m, 2H), 1.93 (td, J = 7.5, 5.4 Hz, 2H), 1.66 - 1.50 (m, 8H), 1.39 - 1.25 (m, 30H), 0.87 (m, 9H) ppm; MS: 721.65[M+Na].
실시예 84: (Z)-1-(3-((4,4-비스(헵틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카본일)옥시)메틸)프로필) 9-(논-2-엔-1-일) 노난다이오에이트
Figure pct00226
실시예 84를 실시예 1에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 84a 및 3-(다이에틸아미노)프로판-1-올로부터 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.64 (m, 1H), 5.51 (m, 1H), 4.61 (dd, J = 6.8, 1.2 Hz, 2H), 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.22 - 4.10 (m, 8H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.39 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.50 (m, 6H), 2.46 - 2.35 (m, 3H), 2.30 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 2.09 (m, 2H), 1.92 (m, 2H), 1.80 (dq, J = 8.2, 6.6　Hz, 2H), 1.58 (m, 8H), 1.40 - 1.21 (m, 30H), 1.00 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.89 (m, 9H) ppm; MS: 857.54 m/z [M+H].
실시예 85의 합성
중간체 85a: (Z)-1-(3-((7-(헵타데칸-9-일옥시)-7-옥소헵탄오일)옥시)-2-(하이드록시메틸)프로필) 9-(논-2-엔-1-일) 노난다이오에이트
Figure pct00227
중간체 85a를 중간체 1d에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 83a 및 중간체 64a로부터 37% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.64 (m, 1H), 5.51 (m, 1H), 4.85 (m, 1H), 4.61 (dd, J = 6.9, 1.2 Hz, 2H), 4.22 - 4.12 (m, 4H), 3.61 (m, 2H), 2.30 (m, 9H), 2.19 (m, 1H), 2.09 (m, 2H), 1.64 (m, 8H), 1.49 (m, 4H), 1.41 - 1.18 (m, 40H), 0.87 (m, 9H) ppm; MS: 781.73 m/z [M+H].
실시예 85: (Z)-1-(3-(((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카본일)옥시)-2-(((7-(헵타데칸-9-일옥시)-7-옥소헵탄오일)옥시)메틸)프로필) 9-(논-2-엔-1-일) 노난다이오에이트
Figure pct00228
실시예 85를 실시예 1에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 85a 및 3-(다이에틸아미노)프로판-1-올로부터 48% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400　㎒, CDCl3) δ 5.64 (m, 1H), 5.51 (m, 1H), 4.85 (m, 1H), 4.61 (dd, J = 6.8, 1.2　Hz, 2H), 4.24 - 4.09 (m, 8H), 2.51 (m, 6H), 2.41 (m, 1H), 2.35 - 2.21 (m, 8H), 2.09 (m, 2H), 1.80 (m, 2H), 1.69 - 1.55 (m, 10H), 1.50 (q, J = 6.2 Hz, 4H), 1.40 - 1.18 (m, 38H), 1.00 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 939.19 m/z [M+H].
실시예 86 내지 88의 합성
중간체 86a: (Z)-1-(3-((5-(헵타데칸-9-일옥시)-5-옥소펜탄오일)옥시)-2-(하이드록시메틸)프로필) 9-(논-2-엔-1-일) 노난다이오에이트
Figure pct00229
중간체 86a를 중간체 1d에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 83a 및 중간체 63b로부터 39% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ　5.64 (m, 1H), 5.51 (m, 1H), 4.86 (m, 1H), 4.61 (dd, J = 7.0, 1.2 Hz, 2H), 4.23 - 4.12 (m, 4H), 3.62 (t, J = 4.4 Hz, 2H), 2.44 - 2.24 (m, 9H), 2.19 (m, 1H), 2.09 (m, 2H), 1.95 (m, 2H), 1.61 (m, 5H), 1.50 (m, 4H), 1.38 - 1.20 (m, 37H), 0.87 (m, 9H) ppm; MS:　753.74 m/z [M+H].
실시예 1에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 86a 및 아미노 알코올 또는 다이아민 시약으로부터 다음의 실시예를 합성하였다.
실시예 86: (Z)-1-(3-(((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카본일)옥시)-2-(((5-(헵타데칸-9-일옥시)-5-옥소펜탄오일)옥시)메틸)프로필) 9-(논-2-엔-1-일) 노난다이오에이트
Figure pct00230
48% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.65 (m, 1H), 5.51 (m, 1H), 4.86 (m, 1H), 4.61 (dd, J = 6.9, 1.3 Hz, 2H), 4.22 - 4.09 (m, 8H), 2.50 (q, J = 7.1 Hz, 6H), 2.46 - 2.25 (m, 9H), 2.09 (m, 2H), 1.94 (m, 2H), 1.86 - 1.74 (m, 3H), 1.61 (m, 4H), 1.50 (m, 4H), 1.40 - 1.23 (m, 37H), 1.00 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.87 (m, 9H) ppm; MS: 912.23 m/z [M+H].
실시예 87: 1-데실 9-(3-((5-(헵타데칸-9-일옥시)-5-옥소펜탄오일)옥시)-2-((((2-(1-메틸피롤리딘-2-일)에톡시)카본일)옥시)메틸)프로필) 노난다이오에이트
Figure pct00231
50% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 4.86 (m, 1H), 4.27 - 4.08 (m, 8H), 4.04 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.05 (m, 1H), 2.48 - 2.24 (m, 12H), 2.20 - 1.88 (m, 6H), 1.82 - 1.41 (m, 15H), 1.37 - 1.21 (m, 43H), 0.87 (m, 9H) ppm; MS: 925.43 m/z [M+H].
실시예 88: 1-데실 9-(3-(((2-(다이에틸아미노)에틸)카바모일)옥시)-2-(((5-(헵타데칸-9-일옥시)-5-옥소펜탄오일)옥시)메틸)프로필) 노난다이오에이트
Figure pct00232
49% 수율; 1H NMR (500 ㎒, CDCl3) δ 5.23 (br t, J = 5.3 Hz, 1H), 4.86 (m, 1H), 4.12 (m, 6H), 4.04 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.20 (br q, J = 5.9 Hz, 2H), 2.51 (q, J = 7.0 Hz, 6H), 2.41 - 2.25 (m, 9H), 1.93 (m, 2H), 1.61 (m, 6H), 1.50 (m, 4H), 1.33 - 1.23 (m, 44H), 0.99 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.87 (m, 9H) ppm; MS: 912.43 m/z [M+H].
실시예 89의 합성
실시예 89: 1-데실 9-(3-((4-(다이메틸아미노)부탄오일)옥시)-2-(((5-(헵타데칸-9-일옥시)-5-옥소펜탄오일)옥시)메틸)프로필) 노난다이오에이트
Figure pct00233
실시예 89를 실시예 25에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 86a 및 4-(다이메틸아미노)부탄산으로부터 43% 수율로 합성하였다. 1H NMR (500　㎒, CDCl3) δ 4.91 - 4.82 (m, 1H), 4.12 (m, 6H), 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.42 - 2.23 (m, 13H), 2.20 (s, 6H), 1.94 (m, 2H), 1.75 (m, 2H), 1.61 (m, 6H), 1.49 (m, 4H), 1.37 - 1.16 (m, 44H), 0.87 (m, 9H) ppm; MS: 883.85 m/z [M+H].
실시예 90의 합성
중간체 90a: 11-클로로-11-옥소운데칸산
Figure pct00234
THF(0.6M) 중 운데칸다이온(15g, 69.36m㏖, 1 당량)의 용액에 염화옥살릴(1.1 내지 1.3 당량)을 첨가하였다. 첨가 후, 혼합물을 교반하고, DMF(0.01 내지 0.05 당량)를 적가하였다. 얻어진 혼합물을 25℃에서 2시간 동안 교반하고, 이어서, 농축시켜 16g(47.0m㏖, 99% 수율)의 목적하는 조질의 생성물을 황색 오일로서 제공하였고, 이는 추가 정제가 필요하지 않았다.
중간체 90b: 11-(데실옥시)-11-옥소운데칸산
Figure pct00235
THF(0.45M) 중 중간체 90a(16.28g, 69.36m㏖, 1 당량)의 용액에 데칸-1-올(1.1 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 2시간 동안 교반하고, 이어서, 진공 하에 농축시켰다. 조질의 잔사를 칼럼 크로마토그래피(석유 에터 중 EtOAc의 구배)에 의해 정제하고, 필요하다면, 석유 에터에서 재결정화시켜 5.5g(15.5m㏖, 22% 수율)의 목적하는 생성물을 백색 고체로서 제공하였다. 1H　NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 4.06 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.37 - 2.28 (m, 4H), 1.62 (m, 6H), 1.28 (m, 24H), 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 3H) ppm; MS: 355.2 m/z [M-H].
중간체 90c: 1-(3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-(하이드록시메틸)프로필) 11-데실 운데칸다이오에이트
Figure pct00236
중간체 90c를 중간체 54c에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 90b 및 중간체 54b로부터 39% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ　4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.18 (m, 4H), 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.64 - 3.51 (m, 4H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.41 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.34 - 2.23 (m, 5H), 2.19 (m, 1H), 1.93 (td, J = 7.6, 5.5 Hz, 2H), 1.65 - 1.50 (m, 10H), 1.37 - 1.21 (m, 44H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 793.73 m/z [M+Na].
실시예 90: 1-(3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카본일)옥시)메틸)프로필) 11-데실 운데칸다이오에이트
Figure pct00237
실시예 90을 실시예 1에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 90c 및 3-(다이에틸아미노)프로판-1-올로부터 59% 수율로 합성하였다. 1H NMR (500　㎒, CDCl3) δ 4.47 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.21 - 4.08 (m, 8H), 4.05 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.55 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.39 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.50 (q, J = 7.0 Hz, 6H), 2.46 - 2.36 (m, 3H), 2.29 (q, J = 7.7 Hz, 4H), 1.92 (m, 2H), 1.80 (m, 2H), 1.65 - 1.51 (m, 10H), 1.36 - 1.24 (m, 44H), 1.00 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.87 (m, 9H) ppm. MS: 929.93 m/z [M+H].
실시예 91의 합성
중간체 91a: 13-클로로-13-옥소트라이데칸산
Figure pct00238
중간체 91a를 90a에 대해 사용한 방법을 이용하여 트라이데카노다이온산으로부터 정량적 수율로 합성하였다.
중간체 91b: 13-(데실옥시)-13-옥소트라이데칸산
Figure pct00239
중간체 91b를 중간체 90b에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 91a 및 데칸-1-올로부터 17% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 4.06 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.37 - 2.27 (m, 4H), 1.64 (m, 6H), 1.27 (m, 28H), 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 3H) ppm; MS: 383.3 m/z [M-H].
중간체 91c: 1-(3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-(하이드록시메틸)프로필) 13-데실 트라이데칸다이오에이트
Figure pct00240
중간체 91c를 중간체 54c에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 91b 및 중간체 54b로부터 40% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ　4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.23 - 4.12 (m, 4H), 4.05 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.65 - 3.51 (m, 4H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.41 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.34 - 2.22 (m, 5H), 2.19 (m, 1H), 1.93 (td, J = 7.5, 5.4 Hz, 2H), 1.58 (m, 10H), 1.38 - 1.20 (m, 48H), 0.87 (m, 9H) ppm; MS: 821.77 m/z [M+Na].
실시예 91: 1-(3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카본일)옥시)메틸)프로필) 13-데실 트라이데칸다이오에이트
Figure pct00241
실시예 91을 실시예 1에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 91c 및 3-(다이에틸아미노)프로판-1-올로부터 56% 수율로 합성하였다. 1H NMR (500　㎒, CDCl3) δ 4.48 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.21 - 4.08 (m, 8H), 4.05 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.39 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.50 (q, J = 7.1 Hz, 6H), 2.46 - 2.36 (m, 3H), 2.29 (q, J = 7.8 Hz, 4H), 1.92 (m, 2H), 1.81 (m, 2H), 1.65 - 1.52 (m, 10H), 1.36 - 1.22 (m, 48H), 1.00 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS:　958.01 m/z [M+H].
실시예 92의 합성
중간체 92a: 9-클로로-9-옥소노난산
Figure pct00242
중간체 92a를 90a에 대해 사용한 방법을 이용하여 노난다이온산으로부터 정량적 수율로 합성하였다.
중간체 92b: 9-(도데실옥시)-9-옥소노난산
Figure pct00243
중간체 92b를 중간체 90b에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 92a 및 도데칸-1-올로부터 31% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 4.06 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.37 - 2.28 (m, 4H), 1.63 (m, 6H), 1.37 - 1.27 (m, 24H), 0.89 (t, J = 6.8　Hz, 3H) ppm; MS: 355.2 m/z [M-H].
중간체 92c: 1-(3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-(하이드록시메틸)프로필) 9-도데실 노난다이오에이트
Figure pct00244
중간체 92c를 중간체 54c에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 92b 및 중간체 54b로부터 43% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ　4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.23 - 4.12 (m, 4H), 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.65 - 3.51 (m, 4H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.41 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.30 (dt, J = 12.0, 7.6 Hz, 5H), 2.19 (m, 1H), 1.93 (td, J = 7.5, 5.5 Hz, 2H), 1.66 - 1.48 (m, 11H), 1.37 - 1.22 (m, 43H), 0.87 (m, 9H) ppm; MS: 793.77 m/z [M+Na].
실시예 92: 1-(3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카본일)옥시)메틸)프로필) 9-도데실 노난다이오에이트
Figure pct00245
실시예 92를 실시예 1에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 92c 및 3-(다이에틸아미노)프로판-1-올로부터 53% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400　㎒, CDCl3) δ 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.22 - 4.09 (m, 8H), 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.39 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.50 (m, 6H), 2.45 - 2.35 (m, 3H), 2.34 - 2.24 (m, 4H), 1.92 (m, 2H), 1.80 (m, 2H), 1.71 - 1.51 (m, 10H), 1.37 - 1.21 (m, 44H), 1.00 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.87 (m, 9H) ppm; MS: 929.53 m/z [M+H].
실시예 93의 합성
중간체 93a: 9-옥소-9-(테트라데실옥시)노난산
Figure pct00246
중간체 93a를 중간체 90b에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 92a 및 테트라데칸-1-올로부터 11% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 4.06 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.37 - 2.28 (m, 4H), 1.62 (m, 6H), 1.33 - 1.26 (m, 30H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H) ppm; MS: 383.3 m/z [M-H].
중간체 93b: 1-(3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-(하이드록시메틸)프로필) 9-테트라데실 노난다이오에이트
Figure pct00247
중간체 93b를 중간체 54c에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 93a 및 중간체 54b로부터 45% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ　4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.23 - 4.12 (m, 4H), 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.65 - 3.50 (m, 4H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.41 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.35 - 2.24 (m, 5H), 2.19 (m, 1H), 1.93 (td, J = 7.5, 5.5 Hz, 2H), 1.66 - 1.49 (m, 11H), 1.38 - 1.21 (m, 46H), 0.87 (m, 9H) ppm; MS: 822.00 m/z [M+Na].
실시예 93: 1-(3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카본일)옥시)메틸)프로필) 9-테트라데실 노난다이오에이트
Figure pct00248
실시예 93을 실시예 1에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 93b 및 3-(다이에틸아미노)프로판-1-올로부터 47% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400　㎒, CDCl3) δ 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.22 - 4.08 (m, 8H), 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.39 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.50 (q, J = 7.1 Hz, 6H), 2.45 - 2.35 (m, 3H), 2.29 (m, 4H), 1.92 (m, 2H), 1.81 (m, 2H), 1.67 - 1.49 (m, 12H), 1.37 - 1.21 (m, 47H), 1.00 (t, J = 7.1 Hz, 5H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS:　943.03 m/z [M+H].
실시예 94의 합성
중간체 94a: 9-옥소-9-(운데칸-2-일옥시)노난산
Figure pct00249
중간체 94a를 중간체 90b에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 92a 및 운데칸-2-올로부터 30% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 4.90 (m, 1H), 2.35 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.27 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.66 - 1.30 (m, 26H), 1.20 (d, J = 6.0 Hz, 3H), 0.89 (t, J = 7.0 Hz, 3H) ppm; MS: 341.2 m/z [M-H].
중간체 94b: 1-(3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-(하이드록시메틸)프로필) 9-(운데칸-2-일) 노난다이오에이트
Figure pct00250
중간체 94b를 중간체 54c에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 94a 및 중간체 54b로부터 39% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ　4.88 (m, 1H), 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.23 - 4.11 (m, 4H), 3.66 - 3.52 (m, 4H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.41 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.35 - 2.23 (m, 5H), 2.19 (m, 1H), 1.93 (td, J = 7.5, 5.4 Hz, 2H), 1.66 - 1.22 (m, 50H), 1.19 (d, J = 6.2 Hz, 3H), 0.87(m, 9H) ppm; MS: 779.78 m/z [M+Na].
실시예 94: 1-(3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카본일)옥시)메틸)프로필) 9-(운데칸-2-일) 노난다이오에이트
Figure pct00251
실시예 94를 실시예 1에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 94b 및 3-(다이에틸아미노)프로판-1-올로부터 63% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400　㎒, CDCl3) δ 4.89 (m, 1H), 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.22 - 4.07 (m, 8H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.39 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.55 - 2.45 (m, 6H), 2.45 - 2.35 (m, 3H), 2.34 - 2.22 (m, 4H), 1.92 (m, 2H), 1.81 (m, 2H), 1.64 - 1.26 (m, 50H), 1.19 (d, J = 6.3 Hz, 3H), 1.00 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 915.44 m/z [M+H].
실시예 95의 합성
중간체 95a: 도데칸-3-올
Figure pct00252
THF(100㎖) 중 데칸알(12.8㎖, 64m㏖)의 용액에 브로모(에틸)마그네슘(3M, 19.20㎖) -78℃에서 적가하였다. 얻어진 반응 혼합물을 25℃에서 2시간 동안 교반하고, 물(200㎖)로 희석시키고 나서, EtOAc(2×200㎖)으로 추출하였다). 합한 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과 후, 진공 하에 농축시켰다. 실리카겔 크로마토그래피(석유 에터 중의 2 내지 2.5% EtOAc)를 이용하여 조질의 잔사를 정제하여 6.9g(37m㏖, 64% 수율)의 목적하는 생성물을 무색 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 3.53 (m, 1H), 1.49 - 1.27 (m, 18H), 0.95 (t, J = 7.4 Hz, 3H), 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 3H) ppm.
중간체 95b: 9-(도데칸-3-일옥시)-9-옥소노난산
Figure pct00253
중간체 95b를 중간체 90b에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 92a 및 도데칸-3-올로부터 38% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 4.82 (m, 1H), 2.37 - 2.27 (m, 4H), 1.63 (m, 8H), 1.34 - 1.26 (m, 20H), 0.88 (m, 6H) ppm; MS: 355.2 m/z [M-H].
중간체 95c: 1-(3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-(하이드록시메틸)프로필) 9-(도데칸-3-일) 노난다이오에이트
Figure pct00254
중간체 95c를 중간체 54c에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 95b 및 중간체 54b로부터 42% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ　4.80 (m, 1H), 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.23 - 4.10 (m, 4H), 3.66 - 3.50 (m, 4H), 3.39 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.40 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.36 - 2.24 (m, 5H), 2.19 (m, 1H), 1.93 (td, J = 7.6, 5.4 Hz, 2H), 1.67 - 1.46 (m, 11H), 1.38 - 1.18 (m, 40H), 0.87 (m, 12H) ppm; MS: 793.77 m/z [M+Na].
실시예 95: 1-(3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카본일)옥시)메틸)프로필) 9-(도데칸-3-일) 노난다이오에이트
Figure pct00255
실시예 95를 실시예 1에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 95c 및 3-(다이에틸아미노)프로판-1-올로부터 63% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400　㎒, CDCl3) δ 4.82 (m, 1H), 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.22 - 4.07 (m, 8H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.50 (q, J = 6.9 Hz, 6H), 2.45 - 2.35 (m, 3H), 2.29 (q, J = 7.5 Hz, 4H), 1.92 (m, 2H), 1.81 (m, 2H), 1.68 - 1.47 (m, 11H), 1.37 - 1.23 (m, 41H), 1.00 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.87 (m, 12H) ppm; MS: 929.03 m/z [M+H].
실시예 96의 합성
중간체 96a: (2,2,5-트라이메틸-1,3-다이옥산-5-일)메틸 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00256
DCM(50㎖) 중 (2,2,5-트라이메틸-1,3-다이옥산-5-일)메탄올(2g, 12.4m㏖), 리놀렌산(4.23㎖, 13.6m㏖), DMAP(302㎎, 2.48m㏖) 및 DIPEA(4.32㎖, 24.8m㏖)의 용액에 rt에서 EDC·HCl(3.56g, 18.6m㏖)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 rt에서 48시간 동안 교반하고, 이어서, 물(25㎖)로 희석시켰다. 유기층을 수집하고, 물(25㎖)로 세척하고 나서, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 조질의 잔사를 실리카겔 크로마토그래피(헥산 중 0 내지 100% EtOAc)를 이용하여 정제하여 2.16g(5.11m㏖, 41% 수율)의 목적하는 생성물을 맑은 오일로서 제공하였다. MS: 867.22 m/z [M+Na].
중간체 96b: 3-하이드록시-2-(하이드록시메틸)-2-메틸프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00257
중간체 96a(2.16g, 5.11m㏖)를 메탄올(50㎖) 중에 용해시키고, Dowex 50x8 수지를 첨가하였다. 얻어진 반응 혼합물을 16시간 동안 rt에서, 여과 후, 진공 하에 농축시켰다. 조질의 잔사를 실리카겔 크로마토그래피(헥산 중 0 내지 60% EtOAc)를 이용하여 정제하여 1.43g(3.73m㏖, 73% 수율)의 목적하는 생성물을 맑은 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.44 - 5.27 (m, 4H), 4.20 (s, 2H), 3.58 (dd, J = 11.3, 4.2 Hz, 2H), 3.51 (dd, J = 11.3, 4.9 Hz, 2H), 2.81 - 2.74 (m, 2H), 2.71 (m, 2H), 2.36 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.05 (dt, J = 8.5, 6.7 Hz, 4H), 1.69 - 1.56 (m, 2H), 1.40 - 1.25 (m, 14H), 0.89 (m, 3H), 0.84 (s, 3H) ppm.
중간체 96c: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-(하이드록시메틸)-2-메틸프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00258
중간체 96c를 중간체 1d에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 96b 및 중간체 1c로부터 67% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.44 - 5.27 (m, 4H), 4.49 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.02 (d, J = 2.7 Hz, 4H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7　Hz, 2H), 3.44 - 3.36 (m, 4H), 2.80 - 2.74 (m, 2H), 2.42 (t, J = 7.5 Hz, 3H), 2.33 (t, J = 7.6　Hz, 2H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 4H), 1.94 (td, J = 7.5, 5.4 Hz, 2H), 1.69 - 1.50 (m, 7H), 1.40 - 1.20 (m, 34H), 0.95 (s, 3H), 0.88 (m, 9H) ppm.
실시예 96: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카본일)옥시)메틸)-2-메틸프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00259
실시예 96을 실시예 1에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 96c 및 3-(다이에틸아미노)프로판-1-올로부터 32% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400　㎒, CDCl3) δ 5.44 - 5.27 (m, 4H), 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.18 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 4.06 (s, 2H), 4.01 (m, 4H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.51 (q, J = 7.1 Hz, 6H), 2.40 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.31 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 5H), 1.92 (td, J = 7.6, 5.5 Hz, 2H), 1.81 (m, 2H), 1.67 - 1.49 (m, 12H), 1.42 - 1.19 (m, 38H), 1.05 - 0.96 (m, 9H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 867.22 m/z [M+H].
실시예 97의 합성
중간체 97a: 2,3-다이하이드록시프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00260
DCM(172㎖) 중 글리세롤(1.59g, 17.3m㏖)의 용액에 rt에서 리놀렌산(35.6m㏖), DMAP(423㎎, 3.47m㏖) 및 DIPEA(7.23㎖, 41.6m㏖)를 첨가하였다. EDC·HCl(8.05g, 41.6m㏖)을 15분에 걸쳐 3부분으로 첨가한 후에, DMF(1㎖)를 첨가하였다. 얻어진 반응 혼합물을 16시간 동안 교반하고, 물, 1M HCl 및 5% NaHCO3로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고 나서, 진공 하에 농축시켰다. 조질의 잔사를 실리카겔 크로마토그래피(헥산 중 EtOAc의 구배)를 이용하여 정제하여 2.10g(5.9m㏖, 34% 수율)의 목적하는 생성물을 제공하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.44 - 5.27 (m, 4H), 4.24 - 4.06 (m, 2H), 3.92 (m, 1H), 3.69 (m, 1H), 3.59 (dt, J = 11.0, 5.1 Hz, 1H), 2.76 (m, 2H), 2.67 (d, J = 4.9 Hz, 1H), 2.34 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.25 (m, 1H), 2.04 (m, 4H), 1.63 (m, 2H), 1.41 - 1.22 (m, 14H), 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 3H) ppm.
중간체 97b: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-하이드록시프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00261
중간체 97b를 중간체 1d에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 97a 및 중간체 1c로부터 11% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.35 (m, 4H), 4.50 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.23 - 4.05 (m, 5H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.77 (m, 2H), 2.55 (d, J = 4.6 Hz, 1H), 2.44 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.35 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 4H), 1.95 (td, J = 7.4, 5.5 Hz, 2H), 1.70 - 1.51 (m, 8H), 1.39 - 1.21 (m, 34H), 0.88 (m, 9H) ppm.
실시예 97: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-(((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카본일)옥시)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00262
아세토나이트릴(5㎖) 중 중간체 96b(170㎎, 0.25m㏖)의 용액에 rt에서 피리딘(40㎕, 0.5m㏖) 및 4-나이트로페닐 클로로포메이트(70㎎, 0.35m㏖)를 첨가하였다. 4시간 동안 교반 시, 3-다이에틸아미노-1-프로판올(111㎕, 0.75m㏖)을 첨가하고, 얻어진 반응 혼합물을 추가 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 헥산(10㎖)에 추출하고, 물로 세척하고 나서, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 조질의 잔사를 실리카겔 크로마토그래피(헥산 중 0 내지 100% EtOAc)를 이용하여 정제하여 52㎎(0.062m㏖, 25% 수율)의 목적하는 생성물을 맑은 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.36 (m, 4H), 5.08 (m, 1H), 4.48 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.34 (m, 2H), 4.25 - 4.13 (m, 4H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.56 - 2.46 (m, 6H), 2.41 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.36 - 2.28 (m, 2H), 2.05 (q, J = 6.9 Hz, 4H), 1.92 (td, J = 7.6, 5.5 Hz, 2H), 1.82 (m, 2H), 1.67 - 1.52 (10H), 1.40 - 1.23 (m, 34H), 1.01 (t, J = 7.1　Hz, 6H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 840.03 m/z [M+H].
실시예 98의 합성
중간체 98a: 2-((2,2-다이메틸-1,3-다이옥산-5-일)메톡시)-N,N-다이에틸에탄-1-아민
Figure pct00263
0℃에서 무수 DCM(1.7 내지 4.3M) 중 95% 수소화나트륨(2.5 당량)의 혼합물에 무수 DCM(0.45 내지 1.1M) 중 (2,2-다이메틸-1,3-다이옥산-5-일)메탄올(1 당량)의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 15분 동안 교반한 후에, (2-브로모에틸)다이에틸아민 하이드로브로마이드(1.23g, 4.78m㏖, 1.4 당량)를 첨가하였다. 반응물을 rt로 가온시키고, 2시간 동안 교반한 후에, 0℃로 재냉각시키고, 물로 희석시키고 나서, EtOAc로 추출하였다. 유기층을 수집하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 진공 하에 농축시켜 370㎎(1.50m㏖, 44% 수율)의 목적하는 생성물을 맑은 오일로서 얻었고, 이를 추가로 정제하지 않았다. 1H NMR (500 ㎒, CDCl3) δ 3.95 (m, 2H), 3.75 (m, 2H), 3.51 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.47 (d, J = 6.7 Hz, 2H), 2.64 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 2.57 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 1.98 (m, 1H), 1.42 (s, 3H), 1.40 (s, 3H) 1.02 (t, J = 7.1 Hz, 6H) ppm; MS: 246.40 [M+H].
중간체 98b: 3-(2-(다이에틸아미노)에톡시)-2-(하이드록시메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00264
1,4-다이옥산(10㎖, 40 당량) 중 4 N HCl을 중간체 98a(1　당량)에 있는 그대로 첨가하였다. 얻어진 반응 혼합물을 rt에서 2시간 동안 교반하고, 이어서, 진공 하에 농축시켜 아세토나이드-탈보호된 중간체를 제공하였다. 조질의 잔사를, 리놀렌산(0.9 내지 1.5 당량), DIPEA(2 내지 3.2 당량) 및 DMAP(0.15 내지 0.26 당량)를 DCM(0.2 내지 0.3 M) 중에 용해시켰다. EDC-HCl(1.2 내지 1.9 당량)을 용액에 첨가하고, 반응 혼합물을 16시간 동안 rt에서 교반하였다. 반응 혼합물을 진공 하에 농축시키고, 이어서, 실리카겔 크로마토그래피(헥산 중 0 내지 100% EtOAc, 이어서, DCM 중 0 내지 10% MeOH)를 이용하여 정제하여 550㎎(2 단계에 대해 78% 수율)의 목적하는 생성물을 백색 검으로서 제공하였다. MS: 469.08 m/z [M+H].
실시예 98: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((2-(다이에틸아미노)에톡시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00265
DCM(0.1 내지 0.5M) 중 중간체 98b(1 당량), DIPEA(1.5 당량), DMAP(0.2 당량) 및 중간체 1c(1 당량)의 용액에 EDC-HCl(1.5 당량)을 rt에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 16시간 동안 rt에서 교반하였고, 진공 하에 농축시키고, 실리카겔 크로마토그래피(0.1% 수산화암모늄과 함께 DCM 중 0 내지 10% MeOH)를 이용하여 정제하였다. 생성물 분획을 풀링하고, 진공 하에 농축시키고 나서, 50㎖의 톨루엔으로 공비혼합하여(3회) 잔여 수산화암모늄을 제거하고, 174㎎(0.22m㏖, 19% 수율)의 목적하는 생성물을 연한 황색 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.43 - 5.28 (m, 4H), 4.48 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.18 - 4.07 (m, 4H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.52 - 3.32 (m, 6H), 2.77 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.63 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 2.55 (q, J = 7.2 Hz, 4H), 2.39 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.29 (m, 3H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 4H), 1.92 (td, J = 7.6, 5.5 Hz, 2H), 1.57 (m, 7H), 1.31 (m, 33H), 1.02 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.93 - 0.84 (m, 9H) ppm; MS: 795.56 M+H (ESI+).
실시예 99의 합성
중간체 99a: 3-((2,2-다이메틸-1,3-다이옥산-5-일)메톡시)-N,N-다이에틸프로판-1-아민
Figure pct00266
중간체 99a를 중간체 98a에 대해 사용한 방법을 이용하여 (3-브로모프로필)다이에틸아민 하이드로브로마이드 및 (2,2-다이메틸-1,3-다이옥산-5-일)메탄올로부터 77% 수율로 합성하였다. MS: 260.58 [M+H].
중간체 99b: 3-(3-(다이에틸아미노)프로폭시)-2-(하이드록시메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00267
중간체 99b를 중간체 98b에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 99a 및 리놀렌산으로부터 50% 수율로(2 단계) 합성하였다. MS: 483.12 [M+H].
실시예 99: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((3-(다이에틸아미노)프로폭시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00268
실시예 99를 실시예 98에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 99b 및 중간체 1c으로부터 20% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.42 - 5.27 (m, 4H), 4.48 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.13 (m, 4H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.46 - 3.34 (m, 6H), 2.77 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.56 - 2.43 (m, 6H), 2.39 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.29 (m, 3H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 4H), 1.93 (m, 2H), 1.64 (m, 9H), 1.36 - 1.26 (m, 33H), 1.01 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 809.74 [M+H].
실시예 100의 합성
중간체 100a: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((4-나이트로펜옥시)카본일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00269
DCM(30㎖) 중 중간체 1d(3g, 1.0 당량) 및 (4-나이트로페닐)카보클로리데이트(1.74g, 2.0 당량)의 용액을 0℃에서 피리딘(1.05㎖, 3.0 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 2시간 동안 N2 분위기 하에 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시키고, DCM을 제거하였다. 잔사를 H2O로 희석시키고, EtOAc로 2× 추출하였다. 합한 유기층을 감압 하에 농축시켜 잔사를 제공하였다. 잔사를 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 생성물을 무색 오일(2.5g, 67%)로서 얻었다.
실시예 100: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((2-(피롤리딘-1-일)에틸)카바모일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00270
MeCN(9㎖) 중 중간체 100a(500㎎, 1.0 당량)의 용액에 2-피롤리딘-1-일에탄아민(133㎎, 2.0 당량), 피리딘(94㎕, 2.0 당량) 및 DMAP(71㎎, 1.0 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 5시간 동안 N2 분위기 하에 교반하였다. 혼합물을 감압 하에 농축시키고, 용매를 제거하였다. 잔사를 EtOAc로 희석시키고, 1 N NaHCO3로 5× 세척하고, H2O로 3× 세척하였다. 유기층을 Na2SO4로 건조시키고, 여과 후, 여과액을 감압 하에 농축시켜 잔사를 제공하였다. 잔사를 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 생성물을 무색 오일(150㎎, 31%)로서 얻었다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.36 - 5.22 (m, 4H), 5.20 (d, J = 15.9 Hz, 1H), 4.42 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.05 (t, J = 5.4 Hz, 6H), 3.49 (dt, J = 9.4, 6.7 Hz, 2H), 3.38 - 3.30 (m, 2H), 3.21 (q, J = 5.8 Hz, 2H), 2.70 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.51 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 2.43 (d, J = 6.2 Hz, 4H), 2.33 (dd, J = 9.7, 5.5 Hz, 3H), 2.23 (t, J = 7.6 Hz, 3H), 1.98 (q, J = 6.9 Hz, 4H), 1.85 (td, J = 7.6, 5.5 Hz, 2H), 1.70 (q, J = 3.3 Hz, 4H), 1.57 - 1.44 (m, 12H), 1.23 (ddt, J = 18.4, 10.5, 6.3 Hz, 37H), 0.84 - 0.78 (m, 9H). MS: 836.3 m/z [M+H].
실시예 101 내지 103의 합성
실시예 100에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 100a 및 아미노 알코올 또는 다이아민 시약으로부터 다음의 실시예를 합성하였다.
실시예 101
실시예 101: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((2-(피페리딘-1-일)에틸)카바모일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00271
32% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.36 - 5.17 (m, 4H), 4.41 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.18 - 4.02 (m, 8H), 3.49 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.33 (dt, J = 9.3, 6.6 Hz, 2H), 2.68 (dt, J = 19.3, 6.5 Hz, 4H), 2.50 (q, J = 7.2 Hz, 4H), 2.40 - 2.28 (m, 3H), 2.23 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.98 (q, J = 6.9 Hz, 4H), 1.85 (td, J = 7.6, 5.5 Hz, 2H), 1.61 - 1.44 (m, 12H), 1.32 - 1.14 (m, 35H), 0.96 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.82 (td, J = 6.9, 4.0 Hz, 9H). MS: 850.3 m/z [M+H].
실시예 102
실시예 102: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((3-(피페리딘-1-일)프로폭시)카본일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00272
91% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.36 - 5.21 (m, 4H), 4.41 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.16 - 4.00 (m, 8H), 3.49 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.33 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.70 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.40 - 2.19 (m, 11H), 1.98 (q, J = 6.8 Hz, 4H), 1.89 - 1.74 (m, 4H), 1.60 - 1.43 (m, 14H), 1.41 - 1.08 (m, 36H), 0.82 (td, J = 6.9, 4.0 Hz, 9H). MS: 865.3 m/z [M+H].
실시예 103
실시예 103: 3-(((2-(아제판-1-일)에틸)카바모일)옥시)-2-(((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00273
47% 수율; 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.67 (s, 1H), 5.42 - 5.29 (m, 4H), 4.48 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.12 (qt, J = 6.2, 4.1, 3.7 Hz, 7H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 3.44 - 3.38 (m, 2H), 3.27 (q, J = 5.6 Hz, 2H), 2.71 (ddt, J = 30.8, 24.9, 12.7 Hz, 8H), 2.35 (dt, J = 37.4, 7.7 Hz, 6H), 2.27 - 1.99 (m, 13H), 1.92 (td, J = 7.6, 5.5 Hz, 2H), 1.60 (ddt, J = 24.3, 21.1, 6.7 Hz, 14H), 1.40 - 1.19 (m, 35H), 0.88 (td, J = 6.8, 4.0 Hz, 9H). MS: 864.3 m/z [M+H].
실시예 107의 합성
중간체 107a: 3-(2-((3r,5r,7r)-아다만탄-1-일)아세톡시)-2-(하이드록시메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00274
DCM(40㎖) 중 중간체 1a(4g, 1.0 당량)의 용액에 EDCI(2.5g, 1.2 당량)를 첨가하고 나서, DMAP(132㎎, 0.1 당량) 및 DIPEA(3.78㎖, 2.0 당량-(1-아다만틸)아세트산(2.11g, 1.0 당량)을 상기 혼합물에 0℃에서 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 2시간 동안 N2 분위기 하에 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시키고, DCM을 제거하였다. 잔사를 H2O로 희석시키고, EtOAc로 2× 추출하였다. 합한 유기층을 감압 하에 농축시켜 잔사를 제공하였다. 잔사를 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 생성물을 무색 오일(4g, 68%)로서 얻었다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.37 - 5.20 (m, 4H), 4.19 - 4.01 (m, 4H), 3.56 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 2.70 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.25 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.13 (dt, J = 11.6, 5.8 Hz, 2H), 2.04 - 1.95 (m, 6H), 1.90 (q, J = 3.2 Hz, 3H), 1.64 (dt, J = 12.3, 3.0 Hz, 3H), 1.55 (dd, J = 15.4, 2.5 Hz, 11H), 1.33 - 1.15 (m, 15H), 0.87 - 0.77 (m, 3H).
중간체 107b: 3-(2-((3r,5r,7r)-아다만탄-1-일)아세톡시)-2-((((4-나이트로펜옥시)카본일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00275
DCM(30㎖) 중 중간체 107a(3g, 1.0 당량), (4-나이트로페닐) 카보클로리데이트(3.3g, 3.0 당량)의 용액에 0℃에서 피리딘(1.3㎖, 3.0 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 2 내지 5시간 동안 N2 분위기 하에 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시키고, 용매를 제거하였다. 잔사를 헥산으로 희석시키고, 여과 후, 여과액을 감압 하에 농축시켜 잔사를 제공하였다. 잔사를 실리카겔 크로마토그래피에 의해 정제하여 생성물을 무색 오일(3g, 76% 수율)로서 얻었다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 8.31 (dd, J = 9.3, 3.1 Hz, 2H), 7.41 (dd, J = 9.3, 3.0 Hz, 2H), 5.37 (dtp, J = 11.1, 7.1, 3.9 Hz, 4H), 4.39 (dd, J = 6.0, 3.0 Hz, 2H), 4.23 (dt, J = 9.5, 4.1 Hz, 4H), 2.80 (d, J = 6.5 Hz, 2H), 2.54 (ddt, J = 11.6, 8.5, 4.3 Hz, 1H), 2.35 (td, J = 7.6, 3.0 Hz, 2H), 2.17 - 1.95 (m, 9H), 1.78 - 1.58 (m, 15H), 1.42 - 1.26 (m, 15H), 0.91 (td, J = 6.8, 3.0 Hz, 3H).
실시예 107: 3-(2-((3r,5r,7r)-아다만탄-1-일)아세톡시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카본일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00276
MeCN(10㎖) 중 중간체 107b(1g, 1.0 당량)의 용액에 3-(다이에틸아미노)프로판-1-올(555㎎, 3.0 당량), 피리딘(342㎕, 2.0 당량) 및 DMAP(17㎎, 0.1 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 12시간 동안 N2 분위기 하에 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시키고, 용매를 제거하였다. 잔사를 H2O로 희석시키고, EtOAc로 3× 추출하였다. 유기층을 Na2SO4로 건조시키고, 여과 후, 여과액을 감압 하에 농축시켜 잔사를 제공하였다. 잔사를 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 생성물을 연한 황색 오일(432㎎, 44%)로서 얻었다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.28 (tt, J = 11.2, 5.5 Hz, 4H), 4.21 - 3.97 (m, 8H), 2.70 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.40 (dq, J = 29.5, 6.5, 6.0 Hz, 7H), 2.24 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.98 (dd, J = 14.6, 7.7 Hz, 6H), 1.94 - 1.85 (m, 3H), 1.74 (p, J = 6.8 Hz, 2H), 1.68 - 1.46 (m, 16H), 1.24 (d, J = 6.6 Hz, 14H), 0.94 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.82 (t, J = 6.7 Hz, 3H). MS: 703.3 m/z [M+H].
실시예 113의 합성
중간체 113a: 1-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-3-하이드록시프로판-2-온
Figure pct00277
THF(150㎖) 중 1,3-다이하이드록시프로판-2-온(20g, 1.0 당량)의 혼합물에 이미다졸(15.12g, 1.0 당량)을 첨가하였다. 이어서, THF(150㎖) 중 TBSCl(1.0 당량)의 혼합물을 상기 혼합물에 0℃에서 적가하였다. 혼합물을 15℃에서 2시간 동안 N2 하에 교반하였다. 완료 시, 반응 혼합물을 물에 붓고 나서, EtOAc로 3× 추출하였다. 합한 유기상을 염수로 2× 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과 후, 진공 하에 농축시켰다. 반응 혼합물을 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 생성물을 무색 오일(5.5g, 12%)로서 얻었다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 4.47 (s, 2H), 4.28 (s, 2H), 0.91 - 0.87 (m, 12H), 0.14 - 0.01 (m, 9H).
중간체 113b: 3-((tert-뷰틸다이메틸실릴)옥시)-2-옥소프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00278
DCM(55㎖) 중 중간체 113a (5.5g, 1.0 당량), EDCI(6.19g, 1.2 당량), DMAP(658㎎, 0.2 당량) 및 DIPEA(14.06㎖, 3.0 당량)의 혼합물에 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔산(7.6㎖, 1.0 당량)을 첨가하였다. 반응물을 15℃에서 12시간 동안 N2 하에 교반하였다. 완료 시, 반응 혼합물을 물에 붓고 나서, DCM으로 3× 추출하였다. 합한 유기상을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과 후, 진공 하에 농축시켰다. 잔사를 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 생성물을 무색 오일(7g, 56%)로서 얻었다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.33 - 5.18 (m, 4H), 4.85 (s, 2H), 4.16 (s, 2H), 2.67 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.32 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.94 (q, J = 6.9 Hz, 4H), 1.57 (q, J = 7.3 Hz, 2H), 1.32 - 1.13 (m, 14H), 0.87 - 0.74 (m, 12H).
중간체 113c: 3-하이드록시-2-옥소프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00279
THF(70㎖) 중 중간체 113b(7.0g, 1.0 당량)의 용액에 0 내지 15℃에서 HF-피리딘(6.76㎖, 5.0 당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 15℃에서 교반하였다. 이어서, 혼합물을 물에 붓고, EtOAc로 3× 추출하였다. 합한 유기상을 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과 후, 진공 하에 농축시켰다. 잔사를 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 생성물을 무색 오일(3g, 57%)로서 얻었다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.35 (tp, J = 11.2, 3.6, 3.2 Hz, 4H), 4.76 (s, 1H), 4.37 (s, 1H), 2.93 (s, 1H), 2.77 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.43 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.39 - 2.31 (m, 1H), 2.05 (p, J = 7.1, 6.4 Hz, 4H), 1.65 (dp, J = 11.8, 6.4, 5.4 Hz, 2H), 1.41 - 1.22 (m, 15H), 0.88 (t, J = 6.7 Hz, 3H).
중간체 113d: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-옥소프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00280
DCM(30㎖) 중 중간체 113c(3g, 1.0 당량), EDCI(1.96g, 1.2 당량), DMAP(208㎎, 0.2 당량) 및 DIPEA(4.45㎖, 3.0 당량)의 용액에 중간체 1c(2.93g, 1.0 당량)를 첨가하였다. 이어서, 반응 혼합물을 15℃에서 12시간 동안 N2 하에 교반하였다. 잔사를 물에 붓고 나서, DCM으로 3× 추출하였다. 합한 유기상을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과 후, 진공 하에 농축시켰다. 잔사를 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 생성물을 무색 오일(4g, 69%)로서 얻었다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.43 - 5.26 (m, 4H), 4.74 (d, J = 1.9 Hz, 4H), 4.50 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.11 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 3.56 (dt, J = 9.3, 6.6 Hz, 2H), 3.40 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.76 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.50 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.41 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.04 (d, J = 5.9 Hz, 6H), 1.96 (dd, J = 7.5, 5.5 Hz, 2H), 1.65 (p, J = 7.2 Hz, 2H), 1.55 (q, J = 6.9 Hz, 4H), 1.40 - 1.19 (m, 33H), 0.87 (td, J = 6.8, 3.9 Hz, 8H).
중간체 113e: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-하이드록시프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00281
THF(80㎖), H2O(40㎖) 및 톨루엔(20㎖) 중 중간체 113d(4g, 1.0 당량)의 용액에 5℃에서 NaBH4(1.11g, 5.0 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 5℃에서 5시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 포화 NH4Cl에 붓고 나서, 에틸 아세테이트로 2× 추출하였다. 합한 유기상을 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과 후, 진공 하에 농축시켰다. 잔사를 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 생성물을 무색 오일(2.5g, 62%)로서 얻었다.
중간체 113f: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-(((4-나이트로펜옥시)카본일)옥시)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00282
DCM(25㎖) 중 중간체 113e(2.5g, 1.0 당량) 및 (4-나이트로페닐) 카보클로리데이트(1.48g, 2.0 당량)의 용액에 DMAP(4㎎, 0.01 당량) 및 피리딘(5.93㎖, 20 당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 5시간 동안 15℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시키고, 용매를 제거하였다. 조질의 생성물(무색 오일)을 추가 정제를 위해 다음 단계에서 직접 사용하였다(2.4g, 79%).
실시예 113: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-(((2-(다이에틸아미노)에틸)카바모일)옥시)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트
Figure pct00283
MeCN(10㎖) 중 중간체 113f(800㎎, 1.0 당량) 및 N',N'-다이에틸에탄-1,2-다이아민(664㎕, 5.0 당량)의 용액에 피리딘(1.53㎖, 20 당량) 및 DMAP(12㎎, 0.1 당량)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 15℃에서 12시간 동안 교반하였다. 혼합물을 물에 붓고, EtOAc로 3× 추출하였다. 합한 유기상을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과 후, 진공 하에 농축시켰다. 잔사를 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 생성물을 무색 오일(320㎎, 41%)로서 얻었다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.33 (ddt, J = 19.7, 13.2, 7.4 Hz, 4H), 5.19 - 5.09 (m, 1H), 4.47 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.25 (dt, J = 11.5, 3.8 Hz, 2H), 4.17 (dd, J = 11.9, 5.7 Hz, 2H), 3.55 (dt, J = 9.4, 6.7 Hz, 2H), 3.38 (dt, J = 9.2, 6.7 Hz, 2H), 3.21 (q, J = 5.7 Hz, 2H), 2.76 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.51 (q, J = 7.3 Hz, 5H), 2.39 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.03 (q, J = 6.9 Hz, 3H), 1.91 (td, J = 7.6, 5.5 Hz, 2H), 1.57 (dt, J = 21.9, 7.1 Hz, 5H), 1.29 (q, J = 10.3, 5.5 Hz, 25H), 0.99 (t, J = 7.1 Hz, 4H), 0.87 (td, J = 6.7, 3.9 Hz, 6H). MS: 825.4 m/z [M+H].
실시예 114의 합성
중간체 114a: 3-하이드록시-2-(하이드록시메틸)프로필 스테아레이트
Figure pct00284
DCM(25㎖) 중 (2,2-다이메틸-1,3-다이옥산-5-일)메탄올(1.53g, 10.5m㏖), 스테아르산(3g, 10.5m㏖), DMAP(256㎎, 2.1m㏖) 및 DIPEA(4.39㎖, 25.2m㏖)의 용액에 rt에서 EDC-HC1(2.41g, 12.6m㏖)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 rt에서 24시간 동안 교반하고, 이어서, 물(25㎖)로 희석시켰다. 유기층을 수집하고, 1 HCl(10㎖), 포화 NaHCO3 용액(10㎖), 이어서, 물(10㎖)로 세척하였다. 유기층을 수집하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 이어서, 진공 하에 농축시켰다. 조질의 잔사를 메탄올 중에 용해시키고, 샘플이 완전히 용해될 때까지 헥산 중에 용해시키고, Dowex® 50x8 수지를 첨가하였다. 얻어진 반응 혼합물을 24시간 동안 rt에서, 여과 후, 진공 하에 농축시켜 2.74g(7.35m㏖, 70% 수율)의 목적하는 생성물을 백색 고체로서 제공하였다. 1H NMR (CDCl3, 400㎒) δ 4.27 (d, J = 6.3 Hz, 2H), 3.77 (m, 4H), 2.33 (m, 2H), 2.10 (s, 2H), 2.03 (m, 1H), 1.62 (m, 2H), 1.25 (m, 29H), 0.87 (t, J = 6.7 Hz, 3H); MS: 373.32 m/z [M+H].
중간체 114b: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-(하이드록시메틸)프로필 스테아레이트
Figure pct00285
중간체 114b를 중간체 1d에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 114a 및 중간체 1c로부터 43% 수율로 합성하였다. 1H NMR (CDCl3, 400㎒) δ 4.49 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.17 (m, 4H), 3.62 (t, J = 5.5 Hz, 2H), 3.56 (m, 2H), 3.40 (m, 2H), 2.41 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.32 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.20 (m, 2H), 1.62 (m, 2H), 1.55 (m, 6H), 1.27 (m, 49H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 9H); MS: 721.78 m/z [M+Na].
실시예 114: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카본일)옥시)메틸)프로필 스테아레이트
Figure pct00286
실시예 114를 실시예 1에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 114b 및 3- (다이에틸아미노)프로판-1-올로부터 30% 수율로 합성하였다. 1H NMR (CDCl3, 400㎒) δ 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.17 (m, 8H), 3.56 (m, 2H), 3.40 (m, 2H), 2.52 (s, 5H), 2.40 (m, 3H), 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.92 (m, 2H), 1.82 (s, 2H), 1.57 (m, 7H), 1.26 (m, 48H), 1.02 (t, J = 6.8 Hz, 6H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 857.14 m/z [M+H].
실시예 115의 합성
중간체 115a: 3-하이드록시-2-(하이드록시메틸)프로필 올리에이트
Figure pct00287
DCM(25㎖) 중 (2,2-다이메틸-1,3-다이옥산-5-일)메탄올(1.53g, 10.5m㏖), 올레산(3.37g, 10.5m㏖), DMAP(256㎎, 2.1m㏖) 및 DIPEA(4.39㎖, 25.2m㏖)의 용액에 rt에서 EDC-HCl(2.41g, 12.6m㏖)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 rt에서 24시간 동안 교반하고, 이어서, 물(25㎖)로 희석시켰다. 유기층을 수집하고, 1 HCl(10㎖), 포화 NaHCO3 용액(10㎖), 이어서, 물(10㎖)로 세척하였다. 유기층을 수집하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 이어서, 진공 하에 농축시켰다. 조질의 잔사를 메탄올 중에 용해시키고, Dowex® 50x8 수지를 첨가하였다. 얻어진 반응 혼합물을 24시간 동안 rt에서, 여과 후, 진공 하에 농축시켜 2.76g(7.44m㏖, 70% 수율)의 목적하는 생성물을 맑은 오일로서 제공하였다. 1H NMR (CDCl3, 400㎒) δ 5.35 (m, 2H), 4.27 (d, J = 6.3 Hz, 2H), 3.77 (m, 4H), 2.33 (t, 7.5 Hz, 2H), 2.02 (m, 6H), 1.62 (m, 2H), 1.29 (m, 20H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H); MS: 371.29 m/z [M+H].
중간체 115b: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-(하이드록시메틸)프로필 올리에이트
Figure pct00288
중간체 115b를 중간체 1d에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 115a 및 중간체 1c로부터 45% 수율로 합성하였다. 1H NMR (CDCl3, 400㎒) δ 5.34 (m, 2H), 4.49 (t, J = 5.5 Hz, 1H) 4.18 (m, 4H), 3.62 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.56 (m, 2H), 3.40 (m, 2H), 2.41 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.32 (m, 2H), 2.20 (m, 2H), 2.01 (q, J = 6.2 Hz, 4H), 1.94 (m, 2H), 1.61 (q, J = 7.3 Hz, 2H), 1.56 (m, 6H), 1.29 (m, 42H), 0.87 (m, 9H); MS: 720.52 m/z [M+Na].
실시예 115: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카본일)옥시)메틸)프로필 올리에이트
Figure pct00289
실시예 115를 실시예 1에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 115b 및 3- (다이에틸아미노)프로판-1-올로부터 40% 수율로 합성하였다. 1H NMR (CDCl3, 400㎒) δ 5.34 (m, 2H), 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.17 (m, 8H), 3.56 (m, 2H), 3.40 (m, 2H), 2.52 (s, 5H), 2.40 (m, 3H), 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.00 (m, 4H), 1.92 (m, 2H), 1.82 (m, 2H), 1.57 (m, 7H), 1.26 (m, 40H), 1.02 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.88 (m, 9H) ppm; MS: 855.37 m/z [M+H].
실시예 116의 합성
중간체 116a: 3-하이드록시-2-(하이드록시메틸)프로필(9Z,12Z,15Z)-옥타데카-9,12,15-트라이에노에이트
Figure pct00290
DCM(25㎖) 중 (2,2-다이메틸-1,3-다이옥산-5-일)메탄올(1.53g, 10.5m㏖), 리놀렌산(3.28g, 10.5m㏖), DMAP(256㎎, 2.1m㏖) 및 DIPEA(4.39㎖, 25.2m㏖)의 용액에 rt에서 EDC-HC1(2.41g, 12.6m㏖)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 rt에서 24시간 동안 교반하고, 이어서, 물(25㎖)로 희석시켰다. 유기층을 수집하고, 1 HCl(10㎖), 포화 NaHCO3 용액(10㎖), 이어서, 물(10㎖)로 세척하였다. 유기층을 수집하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 이어서, 진공 하에 농축시켰다. 조질의 잔사를 메탄올 중에 용해시키고, Dowex® 50x8 수지를 첨가하였다. 얻어진 반응 혼합물을 24시간 동안 rt에서, 여과 후, 진공 하에 농축시켜 2.36g(6.43m㏖, 60% 수율)의 목적하는 생성물을 맑은 오일로서 제공하였다. 1H NMR (CDCl3, 400㎒) δ 5.36 (m, 6H), 4.27 (d, J= 6.3 Hz, 2H), 3.77 (m, 4H), 2.81 (m, 4H), 2.33 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.06 (m, 6H), 1.62 (m, 2H), 1.31 (m, 9H), 0.98 (t, J = 7.5 Hz, 3H); MS: 367.29 m/z [M+H].
중간체 116b: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-(하이드록시메틸)프로필(9Z,12Z,15Z)-옥타데카-9,12,15-트라이에노에이트
Figure pct00291
중간체 116b를 중간체 1d에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 116a 및 중간체 1c로부터 45% 수율로 합성하였다. 1H NMR (CDCl3, 400㎒) δ 5.36 (m , 6H), 4.49 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.18 (m, 4H), 3.62 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.56 (m, 2H), 3.40 (m, 2H), 2.81 (m, 4H), 2.41 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.32 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.20 (m, 2H), 2.07 (m, 4H), 1.93 (m, 2H), 1.62 (m, 2H), 1.56 (m, 6H), 1.31 (m, 30H), 0.98 (t, J = 7.5 Hz, 3H), 0.88 (t, J = 6.9 Hz, 6H); MS: 715.93 m/z [M+Na].
실시예 116: 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부탄오일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카본일)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z,15Z)-옥타데카-9,12,15-트라이에노에이트
Figure pct00292
실시예 116을 실시예 1에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 116b 및 3- (다이에틸아미노)프로판-1-올로부터 31% 수율로 합성하였다. 1H NMR (CDCl3, 400㎒) δ 5.34 (m, 6H), 4.48 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.17 (m, 8H), 3.56 (m, 2H), 3.40 (m, 2H), 2.81 (m, 4H) 2.52 (s, 5H), 2.40 (m, 3H), 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.08 (m, 4H), 1.92 (m, 2H), 1.82 (m, 2H), 1.57 (m, 8H), 1.29 (m, 28H), 0.99 (m, 8H), 0.88 (m, 6H) ppm; MS: 851.32 m/z [M+H].
실시예 117의 합성
중간체 117a: 헵타데칸-9-일(3-(((4-나이트로펜옥시)카본일)옥시)-2-((((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔오일)옥시)메틸)프로필) 글루타레이트
Figure pct00293
DCM(0.05 내지 0.2M) 중 중간체 63a(1.0 당량) 및 (4-나이트로페닐) 카보클로리데이트(2.0 당량)의 혼합물에 피리딘(2.0 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 5시간 동안 비활성 분위기 하에 교반하였다. 완료 시, 혼합물을 진공 하에 농축시키고, 얻어진 잔사를 헥산으로 희석시키고, 여과시켰다. 여과액을 농축시켜 색이 있는 잔사를 얻었고, 이를 추가 정제 없이 다음 단계에서 직접 사용하였다(47%).
실시예 117: 3-(((2-(다이에틸아미노)에틸)카바모일)옥시)-2-((((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔오일)옥시)메틸)프로필 헵타데칸-9-일 글루타레이트
Figure pct00294
MeCN(0.1M) 중 중간체 117a(1.0 당량)의 혼합물에 N',N'-다이에틸에탄-1,2-다이아민(2.0 당량), 피리딘(2.0 당량) 및 DMAP(1.0 당량)를 비활성 분위기 하에 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 12시간 동안 비활성 분위기 하에 교반하였고, 이 시점 후에 혼합물을 진공 하에 농축시켰다. 얻어진 잔사를 EtOAc로 희석시키고, 1 N NaHCO3로 5× 세척하고, H2O로 3× 세척하였다. 유기층을 Na2SO4로 건조시키고, 여과 후, 진공 하에 농축시키고, 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 연한 황색 오일(36%)로서 얻었다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.36 - 5.21 (m, 5H), 4.79 (p, J = 6.2 Hz, 1H), 4.06 (t, J = 5.9 Hz, 6H), 3.20 (s, 2H), 2.70 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.49 (d, J = 25.8 Hz, 6H), 2.36 - 2.20 (m, 8H), 1.97 (dd, J = 7.8, 5.9 Hz, 5H), 1.87 (p, J = 7.5 Hz, 3H), 1.54 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.43 (d, J = 6.5 Hz, 4H), 1.35 - 1.06 (m, 42H), 0.98 (s, 6H), 0.81 (td, J = 6.8, 4.9 Hz, 9H). MS: 863.7 m/z [M+H].
실시예 118의 합성
중간체 118a: 1-(헵타데칸-9-일) 7-(3-(((4-나이트로펜옥시)카본일)옥시)-2-((((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔오일)옥시)메틸)프로필) 헵탄다이오에이트
Figure pct00295
중간체 118a를 중간체 117a에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 64b로부터 61% 수율로 합성하였다.
실시예 118: 1-(3-(((2-(다이에틸아미노)에틸)카바모일)옥시)-2-((((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔오일)옥시)메틸)프로필) 7-(헵타데칸-9-일) 헵탄다이오에이트
Figure pct00296
실시예 118을 실시예 117에 대해 사용한 방법을 이용하여 중간체 118a로부터 96% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 5.28 (dtt, J = 17.4, 10.8, 6.0 Hz, 4H), 5.15 (s, 1H), 4.79 (p, J = 6.2 Hz, 1H), 4.05 (d, J = 6.1 Hz, 6H), 3.14 (q, J = 5.9 Hz, 2H), 2.70 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.45 (q, J = 6.8 Hz, 6H), 2.37 - 2.18 (m, 7H), 1.98 (q, J = 7.0 Hz, 4H), 1.56 (q, J = 7.9 Hz, 6H), 1.43 (q, J = 6.3 Hz, 4H), 1.21 (d, J = 18.3 Hz, 40H), 0.93 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 0.81 (q, J = 6.4 Hz, 9H). MS: 891.8 m/z [M+H].
실시예 119 - pKa 측정
각각의 아민 지질의 pKa를 다음을 적용하여 문헌[Jayaraman, et al. (Angewandte Chemie, 2012)]의 방법에 따라 결정하였다. pKa를 에탄올 중의 비제형화된 아민 지질에 대해 2.94mM의 농도로 결정하였다. 지질을 0.1M 인산염 완충제(Boston Bioproducts) 중에서 100μM로 희석시켰고, 여기서 pH는 2.0 내지 12.0 범위였다. 321㎚ 및 448㎚의 여기 및 방출 파장을 이용하여 형광 강도를 측정하였다. 표 1은 열거한 화합물에 대한 pKa 측정을 나타낸다.
Figure pct00297
Figure pct00298
실시예 120 - 물질 및 방법
생체내 편집을 위한 LNP 조성물
이온화 가능한 지질(예를 들어, 아민 지질), DSPC, 콜레스테롤 및 PEG-2k-DMG로 이루어진 4-성분 지질 시스템에서 다양한 아민을 이용하여 LNP를 제조하였다. LNP의 지질 성분에서 지질의 몰 농도를 50/9/38/3의 아민 지질/DSPC/콜레스테롤/PEG-2k-DMG의 ㏖%로 사용하였다. 마우스에서의 간 편집 백분율에 대한 분석에서, 마우스 서열을 표적화하는 Cas9 mRNA 및 화학적으로 변형된 sgRNA를 LNP에서, 1:1 w/w 비 또는 1:2 w/w 비, 또는 1:1.3 w/w 비로 제형화하였다.
LNP 제형
지질 성분을 이하에 기재하는 지질 성분 몰비로 100% 에탄올 중에 용해시켰다. 화학적으로 변형된 sgRNA 및 Cas9 mRNA를 합하고, 25mM 시트르산염, 100mM NaCl, pH 5.0 중에 용해시켜, 대략 0.45㎎/㎖의 총 RNA 화물의 농도를 초래하였다. 이하에 기재하는 바와 같이 1:1 w/w 비, 1:2 w/w 비, 또는 1:1.3 w/w 비로 화학적으로 변형된 sgRNA: Cas9 mRNA의 비를 이용하여, 약 6의 N/P 비로 LNP를 제형화하였다.
에탄올 중의 지질을 2 용적의 RNA 용액 및 1 용적의 물과 충돌 제트 혼합(impinging jet)함으로써 LNP를 형성하였다. 에탄올 중 지질을 2 용적의 RNA 용액과의 교차 혼합을 통해 혼합하였다. 물의 네 번째 스트림을 인라인 티(inline tee)를 교차 통과하는 배출 스트림과 혼합한다. (예를 들어, WO2016010840, 도 2 참조) 대안적으로, 제조업자의 프로토콜에 따라 Precision Nanosystems NanoAssemblr™ Benchtop Instrument를 이용하여, 지질과 RNA 용액의 미세유체 혼합에 의해 LNP를 형성하였다. 상이한 유동비를 이용하여 혼합하는 동안 수성 대 유기 용매의 2:1 비를 유지하였다. LNP를 1시간 동안 실온에 두고, 물(대략 1:1 v/v)로 추가로 희석시켰다. 희석된 LNP를 편평한 시트 카트리지(Sartorius, 100kD MWCO) 상에서 접선 유동 여과를 이용하여 농축시키고, 이어서, 정용여과에 의해 50mM 트리스, 45mM NaCl, 5%(w/v) 수크로스, pH 7.5(TSS)에 완충제 교환하였다. 대안적으로, PD-10 탈염 칼럼(GE)을 이용하여 TSS로의 최종 완충제 교환을 완료하였다. 필요하다면, Amicon 100kDa 원심분리 필터(Millipore)를 이용하는 원심분리에 의해 조성물을 농축시켰다. 얻어진 혼합물을, 이어서, 0.2㎛ 멸균 필터를 이용하여 여과시켰다. 최종 LNP를 추가 사용까지 4℃ 또는 -80℃에서 저장하였다.
LNP 조성 분석
동적 광 산란("DLS")을 사용하여 본 개시내용의 LNP의 다분산도("pdi") 및 크기를 특성규명한다. DLS는 샘플에 대한 광원 처리로부터 초래되는 광 산란을 측정한다. DLS 측정으로부터 결정한 바와 같은 PDI는 집단 내 입자 크기 분포(대략의 평균 입자 크기)를 나타내며, 완벽하게 균일한 집단은 PDI가 0이다.
전기영동 광 산란을 사용하여 특정된 pH에서 LNP의 표면 전하를 특성규명한다. 표면 전하, 또는 제타 전위는 LNP 현탁액 중 입자 간의 정전기적 반발력/인력 규모의 척도이다.
비대칭-장흐름 분리기(Asymetric-Flow Field Flow Fractionation) - 다중각 광산란(Multi-Angle Light Scattering)(AF4-MALS)을 사용하여 유체 역학적 반경에 의한 조성물 내 입자를 분리하고, 이어서, 분획화된 입자의 분자량, 유체역학적 반경 및 평균 제곱근 반경을 측정한다. 이는 분자량 및 크기 분포뿐만 아니라 2차 특징, 예컨대, 부르카르트-스톡마이어 플롯(Burchard-Stockmeyer Plot)(입자의 내부 코어 밀도를 시사하는 평균 제곱근(root mean square: "rms") 반경 대 시간에 따른 유체역학적 반경의 비) 및 rms 형태 플롯(rms 반경의 log 대 분자량의 log, 여기서 얻어진 선형 적합도의 기울기는 연신율에 대한 조밀도를 제공함)을 평가하는 능력을 허용한다.
나노입자 추적 분석(Nanoparticle tracking analysis)(NTA, Malvern Nanosight)을 사용하여 입자 크기 분포뿐만 아니라 입자 농도를 결정할 수 있다. LNP 샘플을 적절하게 희석시키고, 현미경 슬라이드 상에 주입한다. 입자가 시계를 통해 서서히 주입됨에 따라 카메라는 산란된 광을 기록한다. 영상을 포착한 후에, 나노입자 추적 분석은 픽셀을 추적하고 확산 계수를 계산함으로써 영상을 처리한다. 이 확산 계수를 입자의 유체역학적 반경으로 전환할 수 있다. 기기는 또한 분석에서 계수된 개개 입자 수를 계수하여 입자 농도를 제공한다.
초저온-전자 현미경("초저온-EM")을 사용하여 LNP의 입자 크기, 형태 및 구조적 특징을 결정할 수 있다.
LNP의 지질 조성 분석을 액체 크로마토그래피로부터 결정한 후에 하전 에어로졸 검출(LC-CAD)로 결정할 수 있다. 이 분석은 이론적 지질 함량에 대한 실제 지질 함량의 비교를 제공할 수 있다.
LNP 조성물을 평균 입자 크기, 다분산도(pdi), 총 RNA 함량, RNA의 캡슐화 효율 및 제타 전위에 대해 분석한다. LNP 조성물을 지질 분석, AF4-MALS, NTA, 및/또는 초저온-EM에 의해 추가로 특성규명할 수 있다. Malvern Zetasizer DLS 기기 또는 Wyatt NanoStar를 이용하여 평균 입자 크기 및 다분산도를 동적광산란(dynamic light scattering: DLS)에 의해 측정한다. DLS로 측정하기 전에 LNP 샘플을 PBS 완충제로 희석시켰다. 평균 입자 크기의 강도-기반 측정인 Z-평균 직경을 수 평균 직경 및 pdi와 함께 보고한다. Malvern Zetasizer 또는 Wyatt NanoStar 기기를 또한 사용하여 LNP의 제타 전위를 측정한다. 측정 전에 0.1X PBS, pH 7.4에서 샘플을 1:17로(50㎕을 800㎕로) 희석시킨다.
형광-기반 분석(Ribogreen®, ThermoFisher Scientific)을 사용하여 총 RNA 농도 및 유리 RNA를 결정한다. 캡슐화 효율을 (총 RNA - 유리 RNA)/총 RNA로서 계산한다. LNP 샘플을 0.2% Triton-X 100을 함유하는 1x TE 완충제로 적절하게 희석시켜 유리 RNA를 결정하기 위해 총 RNA 또는 1× TE 완충제를 결정하였다. 조성물을 제조하기 위해 사용하고 1x TE 완충제 +/- 0.2% Triton-X 100에서 희석시킨 출발 RNA 용액을 이용함으로써 표준 곡선을 준비한다. 이어서, 희석시킨 RiboGreen® 염료(제조업자의 지침에 따름)를 각각의 표준 및 샘플에 첨가하고 대략 10분 동안 광의 부재 하에 실온에서 인큐베이션시켰다. SpectraMax M5 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices)를 사용하여 여기, 오토 컷오프 및 방출 파장을 각각 488㎚, 515㎚ 및 525㎚로 설정한 샘플을 판독한다. 총 RNA 및 유리 RNA를 적절한 표준 곡선으로부터 결정한다.
캡슐화 효율을 (총 RNA - 유리 RNA)/총 RNA로서 계산한다. DNA-기반 화물 성분의 캡슐화 효율을 결정하기 위해 동일 절차를 사용할 수 있다. 형광-기반 분석에서, 단일-가닥 DNA에 대해 Oligreen 염료를 사용할 수 있고, 이중-가닥 DNA에 대해, Picogreen 염료를 사용할 수 있다. 대안적으로, 역상 이온쌍(RP-IP) HPLC 방법에 의해 총 RNA 농도를 결정할 수 있다. Triton X-100을 사용하여 LNP를 붕괴시켜, RNA를 방출한다. 이어서, RNA를 RP-IP HPLC에 의한 지질 성분 크로마토그래피로부터 분리시키고, 260㎚에서 UV 흡광도를 이용하여 표준 곡선에 대해 정량화하였다.
AF4-MALS를 사용하여 분자량 및 크기 분포뿐만 아니라 해당 계산으로부터의 2차 통계학을 살펴본다. LNP를 적절하게 희석시키고, 이들에 중점을 둔 HPLC 오토샘플러를 이용하여 AF4 분리 통로에 주입하고, 이어서, 통로를 가로지르는 직교류의 기하급수적 구배를 이용하여 용리시킨다. 모든 유체를 HPLC 펌프 및 Wyatt Eclipse 기기로 구동시켰다. AF4 채널로부터 용리하는 입자는 UV 검출기, 다각 광산란 검출기, 준탄성 광산란 검출기 및 차등 굴절 지수 검출기를 통해 유동한다. 검출기 신호로부터의 분자량 및 rms 반경을 결정하기 위해 Debye 모델을 이용함으로써 미가공 데이터를 가공한다.
하전된 에어로졸 검출기(CAD)에 결합된 HPLC에 의해 LNP 중 지질 성분을 정량적으로 분석한다. 역상 HPLC에 의해 4가지 지질 성분의 크로마토그래피 분리를 달성한다. CAD는 모든 비휘발 화합물을 검출하는 파괴적 질량-기반 검출기이며, 신화는 분석물 구조와 상관없이 일치된다.
Cas9 mRNA 및 gRNA 화물
시험관내 전사에 의해 Cas9 mRNA(예를 들어, 서열번호 3) 화물을 준비하였다. 다음과 같은 방법을 이용하여 선형화된 플라스미드 DNA 주형 및 T7 RNA 중합효소를 이용하여 시험관내 전사에 의해 1× NLS를 포함하는 캡핑 및 폴리아데닐화된 Cas9 mRNA를 생성하였다. T7 프로모터 및 100nt 폴리(A/T) 영역을 함유하는 플라스미드 DNA를 37℃에서 2시간 동안 XbaI와 다음의 조건: 200ng/㎕ 플라스미드, 2 U/㎕ XbaI (NEB), 및 1× 반응 완충제와 함께 인큐베이션시킴으로써 선형화한다. 65℃에서 20분 동안 반응물을 가열함으로써 XbaI를 비활성화시킨다. 실리카 맥시 스핀 칼럼(Epoch Life Sciences)을 이용하여 선형화된 플라스미드를 효소 및 완충제 염으로부터 정제하고, 아가로스겔에 의해 분석하여 선형화를 확인하였다. 다음의 조건으로 37℃에서 4시간 동안 Cas9 변형된 mRNA를 생성하는 IVT 반응을 수행한다: 50ng/㎕ 선형화된 플라스미드; 각각 2mM의 GTP, ATP, CTP, 및 N1-메틸 슈도-UTP(N1-methyl pseudo-UTP)(Trilink); 10mM ARCA(Trilink); 5U/㎕ T7 RNA 중합효소(T7 RNA polymerase)(NEB); 1U/㎕ 뮤린 RNase 저해제(Murine RNase inhibitor)(NEB); 0.004U/㎕ 무기 이콜라이 파이로포스파타제(Inorganic E. coli pyrophosphatase)(NEB); 및 1Х 반응 완충제. 4시간의 인큐베이션 후에, TURBO DNase(ThermoFisher)를 0.01U/㎕의 최종 농도로 첨가하고, 반응물을 추가 30분 동안 인큐베이션시켜 DNA 주형을 제거한다. TFF 또는 LiCl 침전-함유 방법을 이용하여 Cas9 mRNA를 정제하였다.
선형화된 플라스미드 DNA 주형 및 T7 RNA 중합효소를 이용하여 시험관내 전사에 의해 서열번호 6 및 1× NLS를 포함하는 캡핑 및 폴리아데닐화된 Cas9 mRNA를 생성하였다. T7 프로모터 및 90 내지 100nt의 폴리(A/T) 영역을 포함하는 플라스미드 DNA를 완료까지 37℃에서 XbaI와 함께 인큐베이션시킴으로써 선형화시킨다. 효소 및 완충제 염으로부터 선형화된 플라스미드를 정제하였다. 다음의 조건으로 37℃에서 1.5 또는 2시간 동안 Cas9 변형된 mRNA를 생성하는 IVT 반응을 수행한다: 50ng/㎕ 선형화된 플라스미드; 각각 5mM의 GTP, ATP, CTP, 및 N1-메틸 슈도-UTP(Trilink); 25mM ARCA(Trilink); 5U/㎕ T7 RNA 중합효소; 1U/㎕ 뮤린 RNase 저해제; 0.004 U/㎕ 무기 이콜라이 파이로포스파타제; 및 1× 반응 완충제. 이어서, TURBO DNase(ThermoFisher)를 첨가하여 DNA 주형을 제거한다.
제조업자의 프로토콜에 따라 RNeasy Maxi 키트(Qiagen)를 이용하여 효소 및 뉴클레오타이드로부터 mRNA를 정제하였다. 대안적으로, 제조업자의 프로토콜에 따라 MEGAclear 키트(Invitrogen)를 이용하여 mRNA를 정제하였다. 대안적으로, LiCl 침전, 아세트산암모늄 침전 및 아세트산나트륨 침전을 이용하여 mRNA를 정제한다. 대안적으로, LiCl 침전 방법 다음에 접선유동여과에 의한 정제로 mRNA를 정제한다. 대안적으로, 접선유동여과와 조합하여 LiCl 침전에 의해 RNA를 정제하였다. 260㎚(Nanodrop)에서 광 흡광도를 측정함으로써 전사체 농도를 결정하고, Fragment Analyzer (Agilent)에 의한 모세관전기이동에 의해 전사체를 분석하였다.
다음의 실시예에서 sgRNA를 포스포르아미다이트를 이용하는 공지된 방법에 의해 화학적으로 합성하였다.
생체내 LNP 전달
마우스 연구
6 내지 10주령 범위의 CD-1 암컷 마우스를 각 연구에 사용하였다. 동물의 체중을 재고, 그룹 평균 체중을 기준으로 투약 용액을 준비하기 위해 체중에 따라 그룹화하였다. 동물당 0.2㎖의 용적(킬로그램 체중당 대략 10㎖)으로 옆 꼬리 정맥을 통해 LNP를 투약하였다. 적어도 24시간 동안 유해 효과에 대해 투약 후 주기적으로 동물을 관찰하였다.
간에서의 생체내 편집을 측정하는 연구를 위해, 달리 언급되지 않는 한, CD-1 암컷 마우스에 0.1㎎/㎏로 투약하였다. 동물을 아이소플루란 마취 하에 심장천자를 통해 방혈에 의해 6 또는 7일에 안락사시켰다. DNA 추출 및 분석을 위해 간 조직을 각 동물로부터 수집하였다. 혈액을 혈청 분리기 관에 또는 본 명세서에 기재된 바와 같이 혈장에 대해 완충된 시스트산나트륨을 함유하는 관에 수집하였다. 차세대 서열분석(NGS)에 의한 편집을 위해 마우스의 코호트를 측정하였다.
랫트 연구
6 내지 7주령 범위의 스프래그 돌리 암컷 랫트를 각 연구에 사용하였다. 각 동물의 체중을 재고, 체중을 기준으로 투약 용액을 준비하였다. 동물당 0.35㎖의 용적(킬로그램 체중당 대략 2㎖)으로 옆 꼬리 정맥을 통해 LNP를 투약하였다. 적어도 24시간 동안 유해 효과에 대해 투약 후 주기적으로 동물을 관찰하였다.
간에서의 생체내 편집을 측정하는 연구를 위해, 동물에 0.1㎎/㎏ 또는 0.3㎎/㎏로 투약하였다. 투약 후 6일에 CO2 질식으로 동물을 안락사시켰다. 부검 시, NGS에 의한 편집 분석을 위해 간을 수집하고, 혈청 TTR 측정을 위해 혈청 세퍼레이터관에 혈액을 수집하였다.
NGS 서열분석
간략하게, 게놈 내 표적 위치에서 편집 효율을 정량적으로 결정하기 위해, 게놈 DNA를 단리시키고, 심층 서열분석을 이용하여 유전자 편집에 의해 도입된 삽입 및 결실의 존재를 확인하였다.
표적 부위(예를 들어, B2M 내) 주위의 PCR 프라이머를 설계하고, 관심 대상의 게놈 영역을 증폭시켰다. 서열분석을 위한 필수 화학을 더하기 위해 제조업자의 프로토콜(Illumina)에 따라 추가적인 PCR을 수행하였다. Illumina MiSeq 기기 상에서 앰플리콘을 서열분석하였다. 저품질 스코어를 갖는 것을 제거한 후에 마우스 또는 랫트 기준 게놈(예를 들어, GRCm38)에 대해 판독을 정렬하였다. 판독을 포함하는 얻어진 파일을 기준 게놈(BAM 파일)에 대해 맵핑하고, 관심 대상의 표적 영역과 중복된 판독을 선택하고, 삽입, 치환 또는 결실을 포함하는 판독 수에 대한 야생형 판독 수를 계산하였다.
편집 백분율(예를 들어, "삽입결실 효율" 또는 "삽입결실 백분율")을 야생형을 포함하는 서열 판독의 총 수에 대한 삽입 또는 결실을 갖는 서열의 총 수로서 정의한다.
트랜스타이레틴(TTR) ELISA 분석
혈액을 수집하고, 혈청을 표시한 바와 같이 단리시켰다. 마우스 프레알부민(Mouse Prealbumin)(트랜스타이레틴) ELISA 키트(Aviva Systems Biology, 카탈로그 OKIA00111)를 이용하여 총 마우스 TTR 혈청 수준을 결정하였다. 간략하게, 혈청을 키트 샘플 희석제를 이용하여 0.1㎎/㎏ 용량에 대해 10,000-배 및 0.3㎎/㎏에 대해 10,000-배 및 2,500-배의 최종 희석으로 연속 희석시켰다. 희석 샘플을 ELISA 플레이트에 첨가한 다음에, 제조업자의 지침에 따라 분석을 수행하였다.
실시예 121 - 생체내 편집에 의한 지질 효능 평가
본 발명자들은 다양한 아민 지질 화합물을 포함하는 제형으로 전달되는 물질에 대해 생체내 편집 효율을 평가하였다. 마우스 TTR 유전자를 표적화하는 G282(서열번호 1) 또는 마우스 B2M 유전자를 표적화하는 G650(서열번호 2) 중 하나를 이용하여 편집을 측정하였다. 생체내 편집 실험을 통한 효능에 대해 상기 기재한 지질을 평가하였다. sgRNA 대 Cas9 mRNA의 1:1 또는 1:1.3 w/w 비로, 약 6의 N/P 비로 LNP를 제형화하였다. LNP의 지질 성분에서 지질의 몰 농도를 50/9/38/3의 아민 지질/DSPC/콜레스테롤/PEG-2k-DMG의 ㏖%로 사용하였다. 최종 LNP를 특성규명하여 상기 제공한 방법에 따라 캡슐화 효율, 다분산도 및 평균 입자 크기를 결정하였다. 평균 입자 크기, 다분산도(PDI), 총 RNA 함량 및 RNA의 캡슐화 효율의 분석을 표 2에 나타낸다.
Figure pct00299
Figure pct00300
Figure pct00301
Figure pct00302
표 3은 NGS에 의해 측정한 바와 같은 마우스 간의 편집 백분율을 나타낸다.
Figure pct00303
Figure pct00304
Figure pct00305
Figure pct00306
실시예 122 - 간에서의 편집의 용량 반응
편집이 용량 반응인지의 여부를 평가하기 위해, 다양한 LNP 용량 수준에서 생체내에서 실험을 수행하였다. TTR을 표적화하는 sgRNA(G282, 서열번호 1; 또는 G502, 서열번호 4)를 갖는 LNP로서 실시예 120의 Cas9 mRNA를 제형화하였다. 대안적으로, B2M을 표적화하는 sgRNA(G650,서열번호 2)를 갖는 LNP로서 실시예 120의 Cas9 mRNA를 제형화하였다. 이들 LNP를 표 4에 나타낸 바와 같이 sgRNA 및 Cas9 mRNA의 w/w 비로 제형화하였다. 6.0의 50/9/38/3 및 N/P 비의 아민 지질/DSPC/콜레스테롤/PEG-2k-DMG의 ㏖%의 지질 몰 조성으로 직교류 절차를 이용하여 LNP를 제형화하였다.
LNP 조성물을 실시예 120에 기재한 바와 같이 RNA의 평균 입자 크기, 다분산도(PDI), 총 RNA 함량 및 캡슐화 효율에 대해 분석하였다.
RNA의 평균 입자 크기, 다분산도(PDI), 총 RNA 함량 및 캡슐화 효율의 분석을 표 4에 나타낸다.
Figure pct00307
표 5에 구체화되고 간에서의 편집에 대해 평가한 바와 같이 CD-1 암컷 마우스에 i.v.로 투약하였다. 결과를 도 1a 내지 도 1d 및 표 5에 나타낸다.
Figure pct00308
Figure pct00309
실시예 123 - G502 실험에 대한 삽입결실% 형성을 제공하는 TTR 간 편집 및 혈청 TTR 수준
본 발명자들은 다양한 아민 지질 화합물을 포함하는 제형으로 전달되는 물질에 대해 편집 효율을 측정함으로써 생체내 전달을 평가하였다. TTR 마우스 유전자를 표적화하는 sgRNA(서열번호 4)를 갖는 LNP로서 Cas9 mRNA(서열번호 6)를 제형화하였다. sgRNA 대 Cas9 mRNA의 1:2 w/w 비로, 약 6의 N/P 비로 LNP를 제형화하였다. LNP의 지질 성분에서 지질의 몰 농도를 50/9/38/3의 아민 지질/DSPC/콜레스테롤/PEG-2k-DMG의 ㏖%로 사용하였다. 최종 LNP 조성을 특성규명하고, 실시예 120에 기재한 바와 같이 분석하였다. RNA의 평균 입자 크기, 다분산도(PDI), 총 RNA 함량 및 캡슐화 효율의 분석을 표 6에 나타낸다.
Figure pct00310
CD-1 암컷 마우스에 0.1㎎/㎏로 i.v. 투약하고, 간에서의 편집에 대해 평가하고, 순환 TTR 수준을 측정하였다. 결과를 도 2, 도 3 및 표 7에 나타낸다.
Figure pct00311
실시예 124 - G650 실험에 대한 삽입결실% 형성을 제공하는 TTR 간 편집 및 혈청 TTR 수준
간, 비장 및 골수에 대한 생체내 전달을 다양한 아민 지질 화합물을 포함하는 제형으로 전달되는 물질에 대해 편집 효율을 측정함으로써 평가하였다. TTR 마우스 유전자를 표적화하는 sgRNA(서열번호 6)를 갖는 LNP로서 Cas9 mRNA(G650, 서열번호 2)를 제형화하였다. sgRNA 대 Cas9 mRNA의 1:2 w/w 비로, 약 6의 N/P 비로 LNP를 제형화하였다. LNP의 지질 성분에서 지질의 몰 농도를 50/9/38/3의 아민 지질/DSPC/콜레스테롤/PEG-2k-DMG의 ㏖%로 사용하였다. 최종 LNP 조성을 특성규명하고, 실시예 120에 기재한 바와 같이 분석하였다. RNA의 평균 입자 크기, 다분산도(PDI), 총 RNA 함량 및 캡슐화 효율의 분석을 표 8에 나타낸다.
Figure pct00312
CD-1 암컷 마우스에 0.1, 0.3 또는 1㎎/㎏로 i.v. 투약하고, 간, 비장 및 골수에서의 편집에 대해 평가하였다. 결과를 표 9에 나타낸다.
Figure pct00313
실시예 125 랫트 연구에서의 전달.
랫트 모델에서의 생체내 전달을 다양한 아민 지질 화합물을 포함하는 제형으로 전달되는 물질에 대해 편집 효율을 측정함으로써 평가하였다. Cas9 mRNA(서열번호 6)을 TTR 랫트 유전자를 표적화하는 sgRNA(G534, 서열번호 5)를 갖는 LNP로서 제형화하였다. LNP를 제형화하고, 실시예 123에 기재한 바와 같이 특성규명하였다. RNA의 평균 입자 크기, 다분산도(PDI), 총 RNA 함량 및 캡슐화 효율의 분석을 표 10에 나타낸다.
Figure pct00314
스프래그 돌리 암컷 랫트에 i.v.로 0.1 또는 0.3㎎/㎏에 투약하고, 간에서의 편집을 위해 평가하였다. 결과를 도 4 및 표 11에 나타낸다.
Figure pct00315
Figure pct00316
Figure pct00317
Figure pct00318
Figure pct00319
Figure pct00320
Figure pct00321
Figure pct00322
Figure pct00323
Figure pct00324
SEQUENCE LISTING <110> INTELLIA THERAPEUTICS, INC. <120> IONIZABLE AMINE LIPIDS AND LIPID NANOPARTICLES <130> WO/2020/219876 <140> PCT/US2020/029812 <141> 2020-04-25 <150> US 62/843,854 <151> 2019-05-06 <150> US 62/838,551 <151> 2019-04-25 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 2 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2 gacaagcacc agaaagacca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 3 <211> 4516 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3 gggucccgca gucggcgucc 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gacacauacg acgacgaccu 900 ggacaaccug cuggcacaga ucggagacca guacgcagac cuguuccugg cagcaaagaa 960 ccugagcgac gcaauccugc ugagcgacau ccugagaguc aacacagaaa ucacaaaggc 1020 accgcugagc gcaagcauga ucaagagaua cgacgaacac caccaggacc ugacacugcu 1080 gaaggcacug gucagacagc agcugccgga aaaguacaag gaaaucuucu ucgaccagag 1140 caagaacgga uacgcaggau acaucgacgg aggagcaagc caggaagaau ucuacaaguu 1200 caucaagccg auccuggaaa agauggacgg aacagaagaa cugcugguca agcugaacag 1260 agaagaccug cugagaaagc agagaacauu cgacaacgga agcaucccgc accagaucca 1320 ccugggagaa cugcacgcaa uccugagaag acaggaagac uucuacccgu uccugaagga 1380 caacagagaa aagaucgaaa agauccugac auucagaauc ccguacuacg ucggaccgcu 1440 ggcaagagga aacagcagau ucgcauggau gacaagaaag agcgaagaaa caaucacacc 1500 guggaacuuc gaagaagucg ucgacaaggg agcaagcgca cagagcuuca ucgaaagaau 1560 gacaaacuuc gacaagaacc ugccgaacga aaagguccug ccgaagcaca gccugcugua 1620 cgaauacuuc acagucuaca acgaacugac aaaggucaag uacgucacag aaggaaugag 1680 aaagccggca uuccugagcg gagaacagaa gaaggcaauc gucgaccugc uguucaagac 1740 aaacagaaag gucacaguca agcagcugaa ggaagacuac uucaagaaga ucgaaugcuu 1800 cgacagcguc gaaaucagcg gagucgaaga cagauucaac gcaagccugg gaacauacca 1860 cgaccugcug aagaucauca aggacaagga cuuccuggac aacgaagaaa acgaagacau 1920 ccuggaagac aucguccuga cacugacacu guucgaagac agagaaauga ucgaagaaag 1980 acugaagaca uacgcacacc uguucgacga caaggucaug aagcagcuga agagaagaag 2040 auacacagga uggggaagac ugagcagaaa gcugaucaac ggaaucagag acaagcagag 2100 cggaaagaca auccuggacu uccugaagag cgacggauuc gcaaacagaa acuucaugca 2160 gcugauccac gacgacagcc ugacauucaa ggaagacauc cagaaggcac aggucagcgg 2220 acagggagac agccugcacg aacacaucgc aaaccuggca ggaagcccgg caaucaagaa 2280 gggaauccug cagacaguca aggucgucga cgaacugguc aaggucaugg gaagacacaa 2340 gccggaaaac aucgucaucg aaauggcaag agaaaaccag acaacacaga agggacagaa 2400 gaacagcaga gaaagaauga agagaaucga agaaggaauc aaggaacugg gaagccagau 2460 ccugaaggaa cacccggucg aaaacacaca gcugcagaac gaaaagcugu accuguacua 2520 ccugcagaac ggaagagaca uguacgucga ccaggaacug gacaucaaca gacugagcga 2580 cuacgacguc gaccacaucg ucccgcagag cuuccugaag gacgacagca ucgacaacaa 2640 gguccugaca agaagcgaca agaacagagg aaagagcgac aacgucccga gcgaagaagu 2700 cgucaagaag augaagaacu acuggagaca gcugcugaac gcaaagcuga ucacacagag 2760 aaaguucgac aaccugacaa aggcagagag aggaggacug agcgaacugg acaaggcagg 2820 auucaucaag agacagcugg ucgaaacaag acagaucaca aagcacgucg cacagauccu 2880 ggacagcaga augaacacaa aguacgacga aaacgacaag cugaucagag aagucaaggu 2940 caucacacug aagagcaagc uggucagcga cuucagaaag gacuuccagu ucuacaaggu 3000 cagagaaauc aacaacuacc accacgcaca cgacgcauac cugaacgcag ucgucggaac 3060 agcacugauc aagaaguacc cgaagcugga aagcgaauuc gucuacggag acuacaaggu 3120 cuacgacguc agaaagauga ucgcaaagag cgaacaggaa aucggaaagg caacagcaaa 3180 guacuucuuc uacagcaaca ucaugaacuu cuucaagaca gaaaucacac uggcaaacgg 3240 agaaaucaga aagagaccgc ugaucgaaac aaacggagaa acaggagaaa ucgucuggga 3300 caagggaaga gacuucgcaa cagucagaaa gguccugagc augccgcagg ucaacaucgu 3360 caagaagaca gaaguccaga caggaggauu cagcaaggaa agcauccugc cgaagagaaa 3420 cagcgacaag cugaucgcaa gaaagaagga cugggacccg aagaaguacg gaggauucga 3480 cagcccgaca gucgcauaca gcguccuggu cgucgcaaag gucgaaaagg gaaagagcaa 3540 gaagcugaag agcgucaagg aacugcuggg aaucacaauc auggaaagaa gcagcuucga 3600 aaagaacccg aucgacuucc uggaagcaaa gggauacaag gaagucaaga aggaccugau 3660 caucaagcug ccgaaguaca gccuguucga acuggaaaac ggaagaaaga gaaugcuggc 3720 aagcgcagga gaacugcaga agggaaacga acuggcacug ccgagcaagu acgucaacuu 3780 ccuguaccug gcaagccacu acgaaaagcu gaagggaagc ccggaagaca acgaacagaa 3840 gcagcuguuc gucgaacagc acaagcacua ccuggacgaa aucaucgaac agaucagcga 3900 auucagcaag agagucaucc uggcagacgc aaaccuggac aagguccuga gcgcauacaa 3960 caagcacaga gacaagccga ucagagaaca ggcagaaaac aucauccacc uguucacacu 4020 gacaaaccug ggagcaccgg cagcauucaa guacuucgac acaacaaucg acagaaagag 4080 auacacaagc acaaaggaag uccuggacgc aacacugauc caccagagca ucacaggacu 4140 guacgaaaca agaaucgacc ugagccagcu gggaggagac ggaggaggaa gcccgaagaa 4200 gaagagaaag gucuagcuag ccaucacauu uaaaagcauc ucagccuacc augagaauaa 4260 gagaaagaaa augaagauca auagcuuauu caucucuuuu ucuuuuucgu ugguguaaag 4320 ccaacacccu gucuaaaaaa cauaaauuuc uuuaaucauu uugccucuuu ucucugugcu 4380 ucaauuaaua aaaaauggaa agaaccucga gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4440 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4500 aaaaaaaaaa aucuag 4516 <210> 4 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4 acacaaauac caguccagcg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 5 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5 acgcaaauau caguccagcg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 6 <211> 4140 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 6 auggacaaga aguacuccau cggccuggac aucggcacca acuccguggg cugggccgug 60 aucaccgacg aguacaaggu gcccuccaag aaguucaagg ugcugggcaa caccgaccgg 120 cacuccauca agaagaaccu gaucggcgcc cugcuguucg acuccggcga gaccgccgag 180 gccacccggc ugaagcggac cgcccggcgg cgguacaccc ggcggaagaa ccggaucugc 240 uaccugcagg agaucuucuc caacgagaug gccaaggugg acgacuccuu cuuccaccgg 300 cuggaggagu ccuuccuggu ggaggaggac aagaagcacg agcggcaccc caucuucggc 360 aacaucgugg acgagguggc cuaccacgag aaguacccca ccaucuacca ccugcggaag 420 aagcuggugg acuccaccga caaggccgac cugcggcuga ucuaccuggc ccuggcccac 480 augaucaagu uccggggcca cuuccugauc gagggcgacc ugaaccccga caacuccgac 540 guggacaagc uguucaucca gcuggugcag accuacaacc agcuguucga ggagaacccc 600 aucaacgccu ccggcgugga cgccaaggcc auccuguccg cccggcuguc caagucccgg 660 cggcuggaga accugaucgc ccagcugccc ggcgagaaga agaacggccu guucggcaac 720 cugaucgccc ugucccuggg ccugaccccc aacuucaagu ccaacuucga ccuggccgag 780 gacgccaagc ugcagcuguc caaggacacc uacgacgacg accuggacaa ccugcuggcc 840 cagaucggcg accaguacgc cgaccuguuc cuggccgcca agaaccuguc cgacgccauc 900 cugcuguccg acauccugcg ggugaacacc gagaucacca aggccccccu guccgccucc 960 augaucaagc gguacgacga gcaccaccag gaccugaccc ugcugaaggc ccuggugcgg 1020 cagcagcugc ccgagaagua caaggagauc uucuucgacc aguccaagaa cggcuacgcc 1080 ggcuacaucg acggcggcgc cucccaggag gaguucuaca aguucaucaa gcccauccug 1140 gagaagaugg acggcaccga ggagcugcug gugaagcuga accgggagga ccugcugcgg 1200 aagcagcgga ccuucgacaa cggcuccauc ccccaccaga uccaccuggg cgagcugcac 1260 gccauccugc ggcggcagga ggacuucuac cccuuccuga aggacaaccg ggagaagauc 1320 gagaagaucc ugaccuuccg gauccccuac uacgugggcc cccuggcccg gggcaacucc 1380 cgguucgccu ggaugacccg gaaguccgag gagaccauca cccccuggaa cuucgaggag 1440 gugguggaca agggcgccuc cgcccagucc uucaucgagc ggaugaccaa cuucgacaag 1500 aaccugccca acgagaaggu gcugcccaag cacucccugc uguacgagua cuucaccgug 1560 uacaacgagc ugaccaaggu gaaguacgug accgagggca ugcggaagcc cgccuuccug 1620 uccggcgagc agaagaaggc caucguggac cugcuguuca agaccaaccg gaaggugacc 1680 gugaagcagc ugaaggagga cuacuucaag aagaucgagu gcuucgacuc cguggagauc 1740 uccggcgugg aggaccgguu caacgccucc cugggcaccu accacgaccu gcugaagauc 1800 aucaaggaca aggacuuccu ggacaacgag gagaacgagg acauccugga ggacaucgug 1860 cugacccuga cccuguucga ggaccgggag augaucgagg agcggcugaa gaccuacgcc 1920 caccuguucg acgacaaggu gaugaagcag cugaagcggc ggcgguacac cggcuggggc 1980 cggcuguccc ggaagcugau caacggcauc cgggacaagc aguccggcaa gaccauccug 2040 gacuuccuga aguccgacgg cuucgccaac cggaacuuca ugcagcugau ccacgacgac 2100 ucccugaccu ucaaggagga cauccagaag gcccaggugu ccggccaggg cgacucccug 2160 cacgagcaca ucgccaaccu ggccggcucc cccgccauca agaagggcau ccugcagacc 2220 gugaaggugg uggacgagcu ggugaaggug augggccggc acaagcccga gaacaucgug 2280 aucgagaugg cccgggagaa ccagaccacc cagaagggcc agaagaacuc ccgggagcgg 2340 augaagcgga ucgaggaggg caucaaggag cugggcuccc agauccugaa ggagcacccc 2400 guggagaaca cccagcugca gaacgagaag cuguaccugu acuaccugca gaacggccgg 2460 gacauguacg uggaccagga gcuggacauc aaccggcugu ccgacuacga cguggaccac 2520 aucgugcccc aguccuuccu gaaggacgac uccaucgaca acaaggugcu gacccggucc 2580 gacaagaacc ggggcaaguc cgacaacgug cccuccgagg agguggugaa gaagaugaag 2640 aacuacuggc ggcagcugcu gaacgccaag cugaucaccc agcggaaguu cgacaaccug 2700 accaaggccg agcggggcgg ccuguccgag cuggacaagg ccggcuucau caagcggcag 2760 cugguggaga cccggcagau caccaagcac guggcccaga uccuggacuc ccggaugaac 2820 accaaguacg acgagaacga caagcugauc cgggagguga aggugaucac ccugaagucc 2880 aagcuggugu ccgacuuccg gaaggacuuc caguucuaca aggugcggga gaucaacaac 2940 uaccaccacg cccacgacgc cuaccugaac gccguggugg gcaccgcccu gaucaagaag 3000 uaccccaagc uggaguccga guucguguac ggcgacuaca agguguacga cgugcggaag 3060 augaucgcca aguccgagca ggagaucggc aaggccaccg ccaaguacuu cuucuacucc 3120 aacaucauga acuucuucaa gaccgagauc acccuggcca acggcgagau ccggaagcgg 3180 ccccugaucg agaccaacgg cgagaccggc gagaucgugu gggacaaggg ccgggacuuc 3240 gccaccgugc ggaaggugcu guccaugccc caggugaaca ucgugaagaa gaccgaggug 3300 cagaccggcg gcuucuccaa ggaguccauc cugcccaagc ggaacuccga caagcugauc 3360 gcccggaaga aggacuggga ccccaagaag uacggcggcu ucgacucccc caccguggcc 3420 uacuccgugc uggugguggc caagguggag aagggcaagu ccaagaagcu gaaguccgug 3480 aaggagcugc ugggcaucac caucauggag cgguccuccu ucgagaagaa ccccaucgac 3540 uuccuggagg ccaagggcua caaggaggug aagaaggacc ugaucaucaa gcugcccaag 3600 uacucccugu ucgagcugga gaacggccgg aagcggaugc uggccuccgc cggcgagcug 3660 cagaagggca acgagcuggc ccugcccucc aaguacguga acuuccugua ccuggccucc 3720 cacuacgaga agcugaaggg cucccccgag gacaacgagc agaagcagcu guucguggag 3780 cagcacaagc acuaccugga cgagaucauc gagcagaucu ccgaguucuc caagcgggug 3840 auccuggccg acgccaaccu ggacaaggug cuguccgccu acaacaagca ccgggacaag 3900 cccauccggg agcaggccga gaacaucauc caccuguuca cccugaccaa ccugggcgcc 3960 cccgccgccu ucaaguacuu cgacaccacc aucgaccgga agcgguacac cuccaccaag 4020 gaggugcugg acgccacccu gauccaccag uccaucaccg gccuguacga gacccggauc 4080 gaccuguccc agcugggcgg cgacggcggc ggcuccccca agaagaagcg gaagguguga 4140

Claims (84)

  1. 하기 화학식 II의 화합물 또는 이의 염,
    Figure pct00325

    식 중,
    X1은 O, NR1 또는 직접 결합이며,
    X2는 C2-5 알킬렌이고,
    X3은 C(=O) 또는 직접 결합이며,
    R1은 H 또는 Me이고,
    R3은 C1-3 알킬이며,
    R2는 C1-3 알킬이거나, 또는
    R2는 이들이 부착된 질소 원자 및 X2의 1 내지 3개의 탄소 원자와 함께 4-, 5- 또는 6-원 고리를 형성하거나, 또는
    X1은 NR1이고, R1 및 R2는 이들이 부착된 질소 원자와 함께 5- 또는 6-원 고리를 형성하거나, 또는
    R2는 R3 및 이들이 부착된 질소 원자와 함께 5-, 6- 또는 7-원 고리를 형성하고,
    Y1은 C2-12 알킬렌이며,
    Y2는 (배향 중 하나에서)
    Figure pct00326
    , (배향 중 하나에서)
    Figure pct00327
    , 및 (배향 중 하나에서)
    Figure pct00328
    로부터 선택되고,
    n은 0 내지 3이며,
    R4는 C1-15 알킬이고,
    Z1은 C1-6 알킬렌 또는 직접 결합이며,
    Z2는 (배향 중 하나에서)
    Figure pct00329
    이거나 또는 존재하지 않고, 단, Z1이 직접 결합이라면, Z2는 존재하지 않으며;
    R5는 C5-9 알킬 또는 C6-10 알콕시이고,
    R6은 C5-9 알킬 또는 C6-10 알콕시이며,
    W는 메틸렌 또는 직접 결합이고, 그리고
    R7은 H 또는 Me이고,
    단, R3 및 R2가 C2 알킬이고, X1이 O이며, X2는 선형 C3 알킬렌이고, X3은 C(=O)이며, Y1은 선형 C6 알킬렌이고, (Y2)n-R4는
    Figure pct00330
    이며, R4는 선형 C5 알킬이고, Z1은 C2 알킬렌이며, Z2는 존재하지 않고, W는 메틸렌이고, R7이 H라면, R5 및 R6은 C8 알콕시가 아니다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 I의 화합물 또는 이의 염인, 화합물,
    Figure pct00331

    식 중,
    X1은 O, NR1 또는 직접 결합이며,
    X2는 C2-5 알킬렌이고,
    X3은 C(=O) 또는 직접 결합이며,
    R1은 H 또는 Me이고,
    R3은 C1-3 알킬이며,
    R2는 C1-3 알킬이거나, 또는
    R2는 이들이 부착된 질소 원자 및 X2의 1 내지 3개의 탄소 원자와 함께 4-, 5- 또는 6-원 고리를 형성하거나, 또는
    X1은 NR1이고, R1 및 R2는 이들이 부착된 질소 원자와 함께 5- 또는 6-원 고리를 형성하거나, 또는
    R2는 R3 및 이들이 부착된 질소 원자와 함께 5-, 6- 또는 7-원 고리를 형성하고,
    Y1은 C2-12 알킬렌이며,
    Y2는
    Figure pct00332
    로부터 선택되고,
    R4는 C3-15 알킬이며,
    Z1은 C1-6 알킬렌 또는 직접 결합이며,
    Z2는 (배향 중 하나에서)
    Figure pct00333
    이거나 또는 존재하지 않고, 단, Z1이 직접 결합이라면, Z2는 존재하지 않으며;
    R5는 C5-9 알킬 또는 C6-10 알콕시이고,
    R6은 C5-9 알킬 또는 C6-10 알콕시이며,
    W는 메틸렌 또는 직접 결합이고, 그리고
    R7은 H 또는 Me이고,
    단, R3 및 R2가 C2 알킬이고, X1이 O이며, X2는 선형 C3 알킬렌이고, X3은 C(=O)이며, Y1은 선형 C6 알킬렌이고, Y2는
    Figure pct00334
    이며, R4는 선형 C4 알킬이고, Z1은 C2 알킬렌이며, Z2는 존재하지 않고, W는 메틸렌이고, R7이 H라면, R5 및 R6은 C8 알콕시가 아니다.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, X2는 선형 C2 알킬렌인, 화합물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, X2는 선형 C3 알킬렌인, 화합물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, X2는 선형 C4 알킬렌인, 화합물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, R3은 C1 알킬인, 화합물.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, R3은 C2 알킬인, 화합물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, R2는 C1 알킬인, 화합물.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, R2는 C2 알킬인, 화합물.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, R2는 질소 원자 및 X2의 1 내지 2개의 탄소 원자와 함께 5-원 고리를 형성하는, 화합물.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, R2는 질소 원자 및 X2의 1 내지 3개의 탄소 원자와 함께 6-원 고리를 형성하는, 화합물.
  12. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, R2 및 R3은 질소 원자와 함께 5-원 고리를 형성하는, 화합물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, X1은 NH인, 화합물.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, X1은 직접 결합인, 화합물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, Y1은 선형 C3-10 알킬렌인, 화합물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, Y1은 선형 C4-8 알킬렌인, 화합물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, Y1은 선형 C5-7 알킬렌인, 화합물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, R4는 선형 C4-14 알킬인, 화합물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, R4는 선형 C6-12 알킬인, 화합물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, Z1은 선형 C2-4 알킬렌인, 화합물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, R5 및 R6은 각각 독립적으로 선형 C5-9 알킬인, 화합물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, R5 및 R6은 각각 독립적으로 선형 C6-8 알킬인, 화합물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, R5 및 R6은 각각 독립적으로 선형 C7-9 알콕시인, 화합물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, Y2는
    Figure pct00335
    인, 화합물.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, Y1은 선형 C7 알킬렌이고, Y2는
    Figure pct00336
    이며, n = 1이고, R4는 선형 C10 알킬인, 화합물.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, Z2는
    Figure pct00337
    인, 화합물.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, Z1, Z2 및 R5는 에스터 및 아세탈의 탄소 및 산소를 포함하는 6 내지 18개의 원자의 선형 쇄를 형성하도록 선택된, 화합물.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, Y1, Y2 및 R4는, 존재한다면, 에스터(들)의 탄소 및 산소 원자를 포함하는, 14 내지 24개 원자의 선형 쇄를 형성하도록 선택된, 화합물.
  29. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 하기로부터 선택되는, 화합물 또는 이들의 염:
    Figure pct00338

    Figure pct00339

    Figure pct00340

    Figure pct00341

    Figure pct00342

    Figure pct00343

    Figure pct00344

    Figure pct00345

    Figure pct00346

    Figure pct00347

    Figure pct00348

    Figure pct00349

    Figure pct00350

    Figure pct00351

    Figure pct00352

    Figure pct00353

    Figure pct00354

    Figure pct00355

    Figure pct00356

    Figure pct00357

    Figure pct00358
    .
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염은 약제학적으로 허용 가능한 염인, 화합물.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물의 양성자화된 형태의 pKa는 약 5.1 내지 약 8.0인, 화합물.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물의 양성자화된 형태의 pKa는 약 5.7 내지 약 7.6인, 화합물.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물의 양성자화된 형태의 pKa는 약 6 내지 약 7.6인, 화합물.
  34. 지질 성분에 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 상기 조성물은 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 화합물의 약 50%를 포함하는 지질 성분을 포함하는, 조성물.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 조성물은 LNP 조성물인, 조성물.
  37. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 성분은 헬퍼 지질 및 PEG 지질을 포함하는, 조성물.
  38. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 성분은 헬퍼 지질, PEG 지질 및 중성 지질을 포함하는, 조성물.
  39. 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 동결보호제를 더 포함하는, 조성물.
  40. 제34항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 완충제를 더 포함하는, 조성물.
  41. 제34항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 생물학적 활성제를 포함하는 수성 성분을 포함하는, 조성물.
  42. 제41항에 있어서, 상기 생물학적 활성제는 폴리펩타이드를 포함하는, 조성물.
  43. 제41항에 있어서, 상기 생물학적 활성제는 핵산을 포함하는, 조성물.
  44. 제43항에 있어서, 상기 핵산 성분은 RNA를 포함하는, 조성물.
  45. 제43항 또는 제44항에 있어서, 상기 조성물은 N/P 비가 약 3 내지 10인, 조성물.
  46. 제45항에 있어서, 상기 N/P 비는 약 6±1인, 조성물.
  47. 제45항에 있어서, 상기 N/P 비는 약 6±0.5인, 조성물.
  48. 제45항에 있어서, 상기 N/P 비는 약 6인, 조성물.
  49. 제34항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 성분을 포함하되, 상기 RNA 성분은 mRNA를 포함하는, 조성물.
  50. 제49항에 있어서, 상기 RNA 성분은 RNA-가이드된 DNA-결합제, 예컨대, Cas 뉴클레아제 mRNA를 암호화하는 서열을 포함하는, 조성물.
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서, 상기 RNA 성분은 클래스 2 Cas 뉴클레아제 mRNA를 포함하는, 조성물.
  52. 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA 성분은 Cas9 뉴클레아제 mRNA를 포함하는, 조성물.
  53. 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA 성분은 변형된 RNA를 포함하는, 조성물.
  54. 제49항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA 성분은 gRNA 핵산을 포함하는, 조성물.
  55. 제54항에 있어서, 상기 gRNA 핵산은 gRNA인, 조성물.
  56. 제49항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA 성분은 클래스 2 Cas 뉴클레아제 mRNA 및 gRNA를 포함하는, 조성물.
  57. 제54항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA 핵산은 이중-가이드 RNA(dgRNA)이거나 이를 암호화하는, 조성물.
  58. 제54항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA 핵산은 단일-가이드 RNA(sgRNA)이거나 이를 암호화하는, 조성물.
  59. 제54항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA는 변형된 gRNA인, 조성물.
  60. 제59항에 있어서, 상기 변형된 gRNA는 5' 말단에서 처음 5개의 뉴클레오타이드 중 하나 이상에서 변형을 포함하는, 조성물.
  61. 제59항 또는 제60항에 있어서, 상기 변형된 gRNA는 3' 말단에서 마지막 5개의 뉴클레오타이드 중 하나 이상에서 변형을 포함하는, 조성물.
  62. 제41항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 주형 핵산을 더 포함하는, 조성물.
  63. 세포에 생물학적 활성제를 전달하는 방법으로서, 상기 세포를 제34항 내지 제62항 중 어느 한 항의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  64. 제63항에 있어서, 상기 세포는 간 세포(liver cell), 예컨대, 간세포(hepatocyte)인, 방법.
  65. 세포를 제34항 내지 제62항 중 어느 한 항의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 유전자 편집 방법.
  66. 세포를 제34항 내지 제62항 중 어느 한 항의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, DNA 절단 방법.
  67. 제66항에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 단일 가닥 DNA 틈을 생성하는, 방법.
  68. 제66항에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 이중-가닥 DNA 파손을 생성하는, 방법.
  69. 제63항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 클래스 2 Cas mRNA 및 gRNA 핵산을 포함하는, 방법.
  70. 제63항 또는 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 주형 핵산을 상기 세포에 도입하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 세포를 주형 핵산을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  72. 제63항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  73. 제63항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 조성물을 인간에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  74. 제63항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 조성물을 세포에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  75. 제74항에 있어서, 상기 세포는 진핵 세포인, 방법.
  76. 제63항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 mRNA, gRNA, gRNA 핵산 및 주형 핵산 중 하나 이상을 포함하는 제1 LNP 조성물 및 제2 LNP 조성물로 제형화된 mRNA를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  77. 제76항에 있어서, 상기 제1 LNP 조성물과 제2 LNP 조성물은 동시에 투여되는, 방법.
  78. 제76항에 있어서, 상기 제1 LNP 조성물 및 제2 LNP 조성물은 순차적으로 투여되는, 방법.
  79. 제76항에 있어서, 상기 방법은 단일 LNP 조성물로 제형화된 상기 mRNA 및 상기 gRNA 핵산을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  80. 제63항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 편집은 유전자 넉아웃(gene knockout)을 초래하는, 방법.
  81. 제63항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 편집은 유전자 교정(gene correction)을 초래하는, 방법.
  82. 제63항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 조성물을 간 세포(liver cell)에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  83. 제63항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 조성물을 간세포(hepatocyte)에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  84. 제63항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 조성물을 간에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
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