CN116194477A

CN116194477A - 冠状病毒s蛋白的结合剂

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Publication number: CN116194477A
Application number: CN202180061820.XA
Authority: CN
Inventors: K·贝克曼; A·卡尔; S·普拉斯尔; C·保尔曼; C·施塔德勒; G·法尔克; L·菲舍尔; A·穆伊克; U·沙欣; C·沙夫
Original assignee: Biotechnology Europe Inc
Current assignee: Biotechnology Europe Inc
Priority date: 2020-08-06
Filing date: 2021-07-29
Publication date: 2023-05-30
Also published as: US20230287088A1; KR20230065256A; JP2023536340A; CA3187061A1; AU2021322046A1; EP4192859A1; WO2022029011A1

Abstract

本公开涉及一种包含第一和第二结合结构域的结合剂，其中所述第一结合结构域能够与冠状病毒刺突蛋白(S蛋白)结合，所述第二结合结构域能够与冠状病毒S蛋白结合，并且其中所述第一和第二结合结构域与冠状病毒S蛋白的不同表位结合。此外，本公开涉及一种能够与冠状病毒刺突蛋白(S蛋白)结合的抗体。本公开还涉及编码本文公开的结合剂，特别是抗体的核酸如RNA，以及用所述核酸转化或转染的宿主细胞。此外，本公开涉及所述结合剂、抗体或核酸的医学用途。本文所述的药剂和医学用途尤其适用于预防或治疗受试者的冠状病毒感染。

Description

冠状病毒S蛋白的结合剂

技术领域

本公开涉及一种包含第一和第二结合结构域的结合剂,其中所述第一结合结构域能够与冠状病毒刺突(spike)蛋白(S蛋白)结合，所述第二结合结构域能够与冠状病毒S蛋白结合，并且其中所述第一和第二结合结构域与所述冠状病毒S蛋白的不同表位结合。此外，本公开涉及一种能够与冠状病毒刺突蛋白(S蛋白)结合的抗体。在一实施方案中，所述结合剂，特别是本文所述的抗体与S蛋白的S1亚基结合，特别是与S蛋白的S1亚基的受体结合结构域(RBD)结合。本公开还涉及编码本文公开的结合剂，特别是抗体的核酸如RNA，以及用所述核酸转化或转染的宿主细胞。此外，本公开涉及所述结合剂、抗体或核酸的医学用途。本文所述的药剂和医学用途尤其适用于预防或治疗受试者的冠状病毒感染。具体而言，在一实施方案中，本公开涉及方法，其包括向受试者给药编码本文公开的结合剂，特别是抗体的RNA。向受试者给药编码本文公开的结合剂或抗体的RNA可以提供(通过适当的靶细胞表达RNA后)本文公开的结合剂用于阻断或中和冠状病毒。

背景技术

SARS-CoV-2(严重急性呼吸综合征冠状病毒2)的基因序列已为WHO和公众可知(MN908947.3)，并且该病毒分类为β冠状病毒亚科。通过序列分析，系统发生树显示与严重急性呼吸综合征(SARS)病毒分离株的关系比与另一种感染人的冠状病毒即中东呼吸综合征(MERS)病毒的关系更紧密。2月2日，在包括德国在内的24个国家中，全球确认了总计14,557例病例，并且随后自我维持的人与人之间的病毒传播导致SARS-CoV-2成为全球性流行病。

冠状病毒是正义单链RNA((+)ssRNA)包膜病毒，其编码总共4种结构蛋白，刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核壳蛋白(N)。刺突蛋白(S蛋白)负责受体识别，附着至细胞，通过内体途径感染以及由病毒和内体膜融合驱动的基因组释放。虽然不同家族成员之间的序列不同，但是在S蛋白内有保守区域和基序，使得可以将S蛋白分为两个子结构域：S1和S2。S2与其跨膜结构域负责膜融合，而S1结构域识别病毒特异性受体并与靶宿主细胞结合。在几个冠状病毒分离株内，鉴定了受体结合结构域(RBD)。

目前尚无针对SARS-CoV-2的治疗药物，但是迫切需要。

发明内容

本发明提供对冠状病毒刺突蛋白(S蛋白)的结合具有至少双特异性的结合剂，即，它们能够与冠状病毒S蛋白的至少两个不同表位结合。此外，本发明提供与冠状病毒S蛋白结合的抗体，如单特异性、二价抗体。本文所述的结合剂，包括抗体，可以阻断冠状病毒S蛋白与其靶受体ACE2的相互作用。结合剂和编码这些结合剂的核酸可以用于治疗或预防受试者的冠状病毒感染。特别地，可以给药编码本文公开的结合剂的RNA以提供(通过适当的靶细胞表达RNA后)结合剂来靶向冠状病毒S蛋白，特别是SARS-CoV-2S蛋白。

因此，本文所述的药物组合物可以包含作为有效成分的单链RNA，其可以在进入受体细胞后翻译为相应的蛋白。除了编码结合剂序列的野生型或密码子优化的序列，RNA还可以包含一个或多个结构元件，这些结构元件针对RNA在稳定性和翻译效率方面的最大效力进行了优化(5'帽、5'UTR、3'UTR、poly(A)-尾)。在一实施方案中，RNA包含所有这些元件。

本文所述的RNA可以与蛋白和/或脂质(优选脂质)复合，以产生用于给药的RNA-颗粒。如果使用不同RNA的组合，可以将RNA一起或分别与蛋白和/或脂质复合以产生用于给药的RNA-颗粒。

在一方面，本发明提供一种结合剂，其至少包含与冠状病毒刺突蛋白(S蛋白)结合的第一结合结构域以及与冠状病毒S蛋白结合的第二结合结构域，其中所述第一和第二结合结构域与冠状病毒S蛋白的不同表位结合。

在一实施方案中，所述结合剂是多特异性如双特异性结合剂。

在一实施方案中，第一结合结构域包含重链可变区(VH)。在一实施方案中，VH包含HCDR3，其包含选自SEQ ID NO:4、12、20、28、36、44、52、60、68、76、84、92、100、108、116和124的序列。在一实施方案中，VH包含HCDR2，其包含选自SEQ ID NO:3、11、19、27、35、43、51、59、67、75、83、91、99、107、115和123的序列。在一实施方案中，VH包含HCDR1，其包含选自SEQ IDNO:2、10、18、26、34、42、50、58、66、74、82、90、98、106、114和122的序列。在一实施方案中，VH选自：

(i)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:2的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO:3的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:4的序列；

(ii)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:10的序列，HCDR2，其包含SEQ IDNO:11的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:12的序列；

(iii)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:18的序列，HCDR2，其包含SEQ IDNO:19的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:20的序列；

(iv)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:26的序列，HCDR2，其包含SEQ IDNO:27的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:28的序列；

(v)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:34的序列，HCDR2，其包含SEQ IDNO:35的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:36的序列；

(vi)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:42的序列，HCDR2，其包含SEQ IDNO:43的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:44的序列；

(vii)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:50的序列，HCDR2，其包含SEQ IDNO:51的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:52的序列；

(viii)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:58的序列，HCDR2，其包含SEQ IDNO:59的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:60的序列；

(ix)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:66的序列，HCDR2，其包含SEQ IDNO:67的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:68的序列；

(x)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:74的序列，HCDR2，其包含SEQ IDNO:75的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:76的序列；

(xi)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:82的序列，HCDR2，其包含SEQ IDNO:83的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:84的序列；

(xii)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:90的序列，HCDR2，其包含SEQ IDNO:91的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:92的序列；

(xiii)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:98的序列，HCDR2，其包含SEQ IDNO:99的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:100的序列；

(xiv)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:106的序列，HCDR2，其包含SEQ IDNO:107的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:108的序列；

(xv)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:114的序列，HCDR2，其包含SEQ IDNO:115的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:116的序列；以及

(xvi)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:122的序列，HCDR2，其包含SEQ IDNO:123的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:124的序列。

在一实施方案中，第一结合结构域包含轻链可变区(VL)。在一实施方案中，VL包含LCDR3，其包含选自SEQ ID NO:8、16、24、32、40、48、56、64、72、80、88、96、104、112、120和128的序列。在一实施方案中，VL包含LCDR2，其包含选自SEQ ID NO:7、15、23、31、39、47、55、63、71、79、87、95、103、111、119和127的序列。在一实施方案中，VL包含LCDR1，其包含选自SEQID NO:6、14、22、30、38、46、54、62、70、78、86、94、102、110、118和126的序列。在一实施方案中，VL选自：

(i)VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:6的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:7的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:8的序列；

(ii)VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:14的序列，LCDR2，其包含SEQ IDNO:15的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:16的序列；

(iii)VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:22的序列，LCDR2，其包含SEQ IDNO:23的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:24的序列；

(iv)VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:30的序列，LCDR2，其包含SEQ IDNO:31的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:32的序列；

(v)VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:38的序列，LCDR2，其包含SEQ IDNO:39的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:40的序列；

(vi)VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:46的序列，LCDR2，其包含SEQ IDNO:47的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:48的序列；

(vii)VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:54的序列，LCDR2，其包含SEQ IDNO:55的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:56的序列；

(viii)VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:62的序列，LCDR2，其包含SEQ IDNO:63的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:64的序列；

(ix)VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:70的序列，LCDR2，其包含SEQ IDNO:71的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:72的序列；

(x)VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:78的序列，LCDR2，其包含SEQ IDNO:79的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:80的序列；

(xi)VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:86的序列，LCDR2，其包含SEQ IDNO:87的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:88的序列；

(xii)VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:94的序列，LCDR2，其包含SEQ IDNO:95的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:96的序列；

(xiii)VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:102的序列，LCDR2，其包含SEQID NO:103的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:104的序列；

(xiv)VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:110的序列，LCDR2，其包含SEQ IDNO:111的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:112的序列；

(xv)VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:118的序列，LCDR2，其包含SEQ IDNO:119的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:120的序列；以及

(xvi)VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:126的序列，LCDR2，其包含SEQ IDNO:127的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:128的序列。

在一实施方案中，第一结合结构域包含选自以下的VH和VL：

(i)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:2的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO:3的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:4的序列，以及VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ IDNO:6的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:7的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:8的序列；

(ii)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:10的序列，HCDR2，其包含SEQ IDNO:11的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:12的序列，以及VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:14的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:15的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:16的序列；

(iii)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:18的序列，HCDR2，其包含SEQ IDNO:19的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:20的序列，以及VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:22的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:23的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:24的序列；

(iv)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:26的序列，HCDR2，其包含SEQ IDNO:27的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:28的序列，以及VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:30的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:31的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:32的序列；

(v)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:34的序列，HCDR2，其包含SEQ IDNO:35的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:36的序列，以及VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:38的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:39的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:40的序列；

(vi)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:42的序列，HCDR2，其包含SEQ IDNO:43的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:44的序列，以及VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:46的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:47的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:48的序列；

(vii)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:50的序列，HCDR2，其包含SEQ IDNO:51的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:52的序列，以及VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:54的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:55的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:56的序列；

(viii)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:58的序列，HCDR2，其包含SEQ IDNO:59的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:60的序列，以及VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:62的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:63的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:64的序列；

(ix)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:66的序列，HCDR2，其包含SEQ IDNO:67的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:68的序列，以及VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:70的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:71的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:72的序列；

(x)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:74的序列，HCDR2，其包含SEQ IDNO:75的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:76的序列，以及VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:78的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:79的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:80的序列；

(xi)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:82的序列，HCDR2，其包含SEQ IDNO:83的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:84的序列，以及VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:86的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:87的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:88的序列；

(xii)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:90的序列，HCDR2，其包含SEQ IDNO:91的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:92的序列，以及VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:94的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:95的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:96的序列；

(xiii)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:98的序列，HCDR2，其包含SEQ IDNO:99的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:100的序列，以及VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:102的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:103的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:104的序列；

(xiv)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:106的序列，HCDR2，其包含SEQ IDNO:107的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:108的序列，以及VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:110的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:111的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:112的序列；

(xv)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:114的序列，HCDR2，其包含SEQ IDNO:115的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:116的序列，以及VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:118的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:119的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:120的序列；以及

(xvi)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:122的序列，HCDR2，其包含SEQ IDNO:123的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:124的序列，以及VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:126的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:127的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:128的序列。

在一实施方案中，第一结合结构域包含VH，所述VH包含与选自SEQ ID NO:1、9、17、25、33、41、49、57、65、73、81、89、97、105、113和121的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列。

在一实施方案中，第一结合结构域包含VL，所述VL包含与选自SEQ ID NO:5、13、21、29、37、45、53、61、69、77、85、93、101、109、117和125的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列。

在一实施方案中，第一结合结构域包含选自以下的VH和VL：

(i)VH，其包含与SEQ ID NO:1的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，以及VL，其包含与SEQ ID NO:5的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(ii)VH，其包含与SEQ ID NO:9的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，以及VL，其包含与SEQ ID NO:13的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(iii)VH，其包含与SEQ ID NO:17的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，以及VL，其包含与SEQ ID NO:21的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(iv)VH，其包含与SEQ ID NO:25的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，以及VL，其包含与SEQ ID NO:29的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(v)VH，其包含与SEQ ID NO:33的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，以及VL，其包含与SEQ ID NO:37的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(vi)VH，其包含与SEQ ID NO:41的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，以及VL，其包含与SEQ ID NO:45的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(vii)VH，其包含与SEQ ID NO:49的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，以及VL，其包含与SEQ ID NO:53的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(viii)VH，其包含与SEQ ID NO:57的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，以及VL，其包含与SEQ ID NO:61的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(ix)VH，其包含与SEQ ID NO:65的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，以及VL，其包含与SEQ ID NO:69的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(x)VH，其包含与SEQ ID NO:73的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，以及VL，其包含与SEQ ID NO:77的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(xi)VH，其包含与SEQ ID NO:81的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，以及VL，其包含与SEQ ID NO:85的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(xii)VH，其包含与SEQ ID NO:89的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，以及VL，其包含与SEQ ID NO:93的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(xiii)VH，其包含与SEQ ID NO:97的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，以及VL，其包含与SEQ ID NO:101的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(xiv)VH，其包含与SEQ ID NO:105的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，以及VL，其包含与SEQ ID NO:109的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(xv)VH，其包含与SEQ ID NO:113的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，以及VL，其包含与SEQ ID NO:117的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；以及

(xvi)VH，其包含与SEQ ID NO:121的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，以及VL，其包含与SEQ ID NO:125的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列。

在一实施方案中，第一结合结构域包含抗体的VH和VL，所述抗体与包含如上所述的VH或VL或者两者组合的抗体竞争冠状病毒S蛋白结合和/或具有包含如上所述的VH或VL或者两者组合的抗体对冠状病毒S蛋白具有特异性。

在一实施方案中，第二结合结构域包含ACE2蛋白的胞外域(ECD)或其变体，或者ACE2蛋白的ECD的片段或其变体。在一实施方案中，ACE2蛋白的ECD的变体或者ACE2蛋白的ECD的片段或其变体与冠状病毒S蛋白结合。在一实施方案中，第二结合结构域包含与SEQID NO:129的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列。

在一实施方案中，第二结合结构域包含重链可变区(VH)。在一实施方案中，第二结合结构域的VH包含HCDR3，其包含选自SEQ ID NO:4、12、20、28、36、44、52、60、68、76、84、92、100、108、116和124的序列。在一实施方案中，第二结合结构域的VH包含HCDR2，其包含选自SEQ ID NO:3、11、19、27、35、43、51、59、67、75、83、91、99、107、115和123的序列。在一实施方案中，第二结合结构域的VH包含HCDR1，其包含选自SEQ ID NO:2、10、18、26、34、42、50、58、66、74、82、90、98、106、114和122的序列。在一实施方案中，第二结合结构域的VH选自：

在一实施方案中，第二结合结构域包含轻链可变区(VL)。在一实施方案中，第二结合结构域的VL包含LCDR3，其包含选自SEQ ID NO:8、16、24、32、40、48、56、64、72、80、88、96、104、112、120和128的序列。在一实施方案中，第二结合结构域的VL包含LCDR2，其包含选自SEQ ID NO:7、15、23、31、39、47、55、63、71、79、87、95、103、111、119和127的序列。在一实施方案中，第二结合结构域的VL包含LCDR1，其包含选自SEQ ID NO:6、14、22、30、38、46、54、62、70、78、86、94、102、110、118和126的序列。在一实施方案中，第二结合结构域的VL选自：

在一实施方案中，第二结合结构域包含选自以下的VH和VL：

在一实施方案中，第二结合结构域包含VH，所述VH包含与选自SEQ ID NO:1、9、17、25、33、41、49、57、65、73、81、89、97、105、113和121的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列。

在一实施方案中，第二结合结构域包含VL，所述VL包含与选自SEQ ID NO:5、13、21、29、37、45、53、61、69、77、85、93、101、109、117和125的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列。

在一实施方案中，第二结合结构域包含选自以下的VH和VL：

在一实施方案中，第二结合结构域包含抗体的VH和VL，所述抗体与包含如上所述的VH或VL或者两者组合的抗体竞争冠状病毒S蛋白结合和/或对冠状病毒S蛋白具有包含如上所述的VH或VL或者两者组合的抗体的特异性。

在本文所述结合剂的一个实施方案中：

(i)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:122的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO:123的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:124的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:126的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:127的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:128的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:34的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO:35的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:36的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:38的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:39的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:40的序列；

(ii)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:122的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO:123的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:124的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:126的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:127的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:128的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:2的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO:3的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:4的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:6的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:7的序列，和LCDR3，其包含SEQID NO:8的序列；

(iii)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:122的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO:123的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:124的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:126的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:127的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:128的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:10的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO:11的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:12的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:14的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:15的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:16的序列；

(iv)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:122的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO:123的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:124的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:126的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:127的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:128的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:26的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO:27的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:28的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:30的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:31的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:32的序列；

(v)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:122的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO:123的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:124的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:126的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:127的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:128的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:42的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO:43的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:44的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:46的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:47的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:48的序列；

(vi)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:34的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO:35的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:36的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:38的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:39的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:40的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:122的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO:123的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:124的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:126的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:127的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:128的序列；

(vii)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:26的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO:27的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:28的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:30的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:31的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:32的序列，

(viii)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:42的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO:43的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:44的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:46的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:47的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:48的序列，

(ix)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:2的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO:3的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:4的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:6的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:7的序列，和LCDR3，其包含SEQID NO:8的序列，

(x)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:10的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO:11的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:12的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:14的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:15的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:16的序列，

(xi)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:122的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO:123的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:124的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:126的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:127的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:128的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:18的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO:19的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:20的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:22的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:23的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:24的序列；

(xii)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:122的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO:123的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:124的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:126的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:127的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:128的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:50的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO:51的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:52的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:54的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:55的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:56的序列；

(xiii)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:122的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO:123的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:124的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:126的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:127的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:128的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:106的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO:107的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:108的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:110的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:111的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:112的序列；

(xiv)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:18的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO:19的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:20的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:22的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:23的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:24的序列，

(xv)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:50的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO:51的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:52的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:54的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:55的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:56的序列，

(xvi)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:106的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO:107的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:108的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:110的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:111的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:112的序列，

(xvii)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:106的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO:107的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:108的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:110的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:111的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:112的序列，

(xviii)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:106的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO:107的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:108的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:110的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:111的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:112的序列，

(xix)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:106的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO:107的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:108的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:110的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:111的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:112的序列，

(xx)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:18的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO:19的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:20的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:22的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:23的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:24的序列，

(xxi)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:50的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO:51的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:52的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:54的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:55的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:56的序列，

(xxii)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:42的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO:43的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:44的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:46的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:47的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:48的序列，

(xxiii)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:122的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO:123的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:124的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:126的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:127的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:128的序列，

并且第二结合结构域包含与SEQ ID NO:129的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(xxiv)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:18的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO:19的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:20的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:22的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:23的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:24的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:82的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO:83的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:84的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:86的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:87的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:88的序列；

(xxv)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:82的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO:83的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:84的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:86的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:87的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:88的序列，

(xxvi)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:82的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO:83的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:84的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:86的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:87的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:88的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:50的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO:51的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:52的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:54的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:55的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:56的序列；或者

(xxvii)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:50的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO:51的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:52的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:54的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:55的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:56的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:82的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO:83的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:84的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:86的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:87的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:88的序列。

在本文所述结合剂的一个实施方案中：

(i)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO:121的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO:125的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO:33的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO:37的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(ii)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO:121的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO:125的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO:1的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO:5的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(iii)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO:121的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO:125的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO:9的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO:13的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(iv)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO:121的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO:125的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO:25的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO:29的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(v)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO:121的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO:125的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO:41的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO:45的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(vi)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO:33的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO:37的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO:121的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO:125的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(vii)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO:25的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO:29的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

(viii)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO:41的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO:45的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

(ix)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO:1的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO:5的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

(x)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO:9的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO:13的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

(xi)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO:121的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO:125的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO:17的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO:21的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(xii)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO:121的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO:125的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO:49的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO:53的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(xiii)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO:121的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO:125的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO:105的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO:109的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(xiv)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO:17的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO:21的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

(xv)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO:49的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO:53的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

(xvi)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO:105的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO:109的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

(xvii)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO:105的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO:109的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

(xviii)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO:105的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO:109的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

(xix)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO:105的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO:109的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

(xx)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO:17的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO:21的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

(xxi)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO:49的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO:53的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

(xxii)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO:41的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO:45的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

(xxiii)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO:121的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO:125的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

(xxiv)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO:17的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO:21的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO:81的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO:85的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(xxv)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO:81的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO:85的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

(xxvi)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO:81的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO:85的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO:49的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO:53的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；或者

(xxvii)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO:49的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO:53的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO:81的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO:85的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列。

在一实施方案中，本文所述的结合剂包含重链和轻链，形成第一结合结构域。在一实施方案中，本文所述的结合剂包含两条重链和两条轻链，其中每条重链与其中一条轻链一起形成第一结合结构域。在一实施方案中，重链包含VH。在一实施方案中，轻链包含VL。在一实施方案中，重链包含片段可结晶(Fc)区。在一实施方案中，重链与轻链相关联。在一实施方案中，重链以共价和/或非共价方式关联。在一实施方案中，两条重链相同，并且两条轻链相同。

在一实施方案中，结合剂包括全长抗体或全长抗体样分子，其包含第一结合结构域。

在一实施方案中，结合剂包含两个第一结合结构域。在一实施方案中，两个第一结合结构域与相同表位结合。

在一实施方案中，第二结合结构域包含单链可变片段(scFv)。

在一实施方案中，第一和第二结合结构域直接或通过接头共价连接。在一实施方案中，接头包含甘氨酸-丝氨酸(GS)接头。在一实施方案中，甘氨酸-丝氨酸接头包含(G₄S)₁接头。在一实施方案中，甘氨酸-丝氨酸接头包含(G₄S)₂接头。在一实施方案中，甘氨酸-丝氨酸接头包含(G₄S)₃接头。在一实施方案中，甘氨酸-丝氨酸接头包含(G₄S)₄接头。在一实施方案中，甘氨酸-丝氨酸接头包含(G₄S)₅接头。

在一实施方案中，结合剂包含两条重链和两条轻链，形成包含两个第一结合结构域的全长抗体或全长抗体样分子，其中每条轻链连接至第二结合结构域。在一实施方案中，每条轻链的C-末端连接至第二结合结构域的N-末端。在一实施方案中，每条轻链的N-末端连接至第二结合结构域的C-末端。

在一实施方案中，结合剂包含：

(i)第一多肽，其包含重链(HC)，以及

(ii)第二多肽，其包含轻链(LC)，并且进一步包含ACE2蛋白的胞外域(ECD)或其变体，或者ACE2蛋白的ECD的片段或其变体。

在一实施方案中，结合剂包含：

(i)第一多肽，其包含重链(HC)，以及

(ii)第二多肽，其包含轻链(LC)，并且进一步包含scFv。

在一实施方案中，结合剂包含抗体，所述抗体包含第一结合臂和第二结合臂，其中

a.第一结合臂包含：

(i)第一多肽，其包含重链(HC)，以及

(ii)第二多肽，其包含轻链(LC)，并且进一步包含ACE2蛋白的胞外域(ECD)或其变体，或者ACE2蛋白的ECD的片段或其变体，并且；

b.第二结合臂包含：

(i)第一多肽，其包含重链(HC)，以及

a.第一结合臂包含：

(i)第一多肽，其包含重链(HC)，以及

(ii)第二多肽，其包含轻链(LC)，并且进一步包含scFv，并且；

b.第二结合臂包含：

(i)第一多肽，其包含重链(HC)，以及

(ii)第二多肽，其包含轻链(LC)，并且进一步包含scFv。

在一实施方案中，第一结合臂的第一多肽和第二结合臂的第一多肽相同。在一实施方案中，第一结合臂的第二多肽和第二结合臂的第二多肽相同。

在结合剂的某些优选实施方案中：

(i)第一多肽包含与SEQ ID NO:133的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列，

并且第二多肽包含与SEQ ID NO:134的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列；

(ii)第一多肽包含与SEQ ID NO:135的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列，

并且第二多肽包含与SEQ ID NO:136的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列；

(iii)第一多肽包含与SEQ ID NO:137的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列，

并且第二多肽包含与SEQ ID NO:138的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列；

(iv)第一多肽包含与SEQ ID NO:139的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列，

并且第二多肽包含与SEQ ID NO:140的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列；

(v)第一多肽包含与SEQ ID NO:143的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列，

并且第二多肽包含与SEQ ID NO:144的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列；

(vi)第一多肽包含与SEQ ID NO:145的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列，

并且第二多肽包含与SEQ ID NO:146的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列；

(vii)第一多肽包含与SEQ ID NO:147的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列，

并且第二多肽包含与SEQ ID NO:148的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列；

(viii)第一多肽包含与SEQ ID NO:149的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列，

并且第二多肽包含与SEQ ID NO:150的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列；

(ix)第一多肽包含与SEQ ID NO:153的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列，

并且第二多肽包含与SEQ ID NO:154的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列；

(x)第一多肽包含与SEQ ID NO:155的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列，

并且第二多肽包含与SEQ ID NO:156的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列；

(xi)第一多肽包含与SEQ ID NO:157的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列，

并且第二多肽包含与SEQ ID NO:158的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列；

(xii)第一多肽包含与SEQ ID NO:159的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列，

并且第二多肽包含与SEQ ID NO:160的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列；

(xiii)第一多肽包含与SEQ ID NO:161的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列，

并且第二多肽包含与SEQ ID NO:162的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列；

(xiv)第一多肽包含与SEQ ID NO:163的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列，

并且第二多肽包含与SEQ ID NO:164的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列；

(xv)第一多肽包含与SEQ ID NO:165的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列，

并且第二多肽包含与SEQ ID NO:166的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列；

(xvi)第一多肽包含与SEQ ID NO:167的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列，

并且第二多肽包含与SEQ ID NO:168的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列；

(xvii)第一多肽包含与SEQ ID NO:169的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列，

并且第二多肽包含与SEQ ID NO:170的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列；

(xviii)第一多肽包含与SEQ ID NO:171的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列，

并且第二多肽包含与SEQ ID NO:172的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列；

(xix)第一多肽包含与SEQ ID NO:173的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列，

并且第二多肽包含与SEQ ID NO:174的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列；

(xx)第一多肽包含与SEQ ID NO:175的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列，

并且第二多肽包含与SEQ ID NO:176的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列；

(xxi)第一多肽包含与SEQ ID NO:177的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列，

并且第二多肽包含与SEQ ID NO:178的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列；

(xxii)第一多肽包含与SEQ ID NO:179的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列，

并且第二多肽包含与SEQ ID NO:180的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列；

(xxiii)第一多肽包含与SEQ ID NO:181的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列，

并且第二多肽包含与SEQ ID NO:182的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列；

(xxiv)第一多肽包含与SEQ ID NO:183的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列，

并且第二多肽包含与SEQ ID NO:184的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列；

(xxv)第一多肽包含与SEQ ID NO:185的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列，

并且第二多肽包含与SEQ ID NO:186的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列；

(xxvi)第一多肽包含与SEQ ID NO:187的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列，

并且第二多肽包含与SEQ ID NO:188的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列；

(xxvii)第一多肽包含与SEQ ID NO:189的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列，

并且第二多肽包含与SEQ ID NO:190的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列；

(xxviii)第一多肽包含与SEQ ID NO:191的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列，

并且第二多肽包含与SEQ ID NO:192的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列；

(xxix)第一多肽包含与SEQ ID NO:193的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列，

并且第二多肽包含与SEQ ID NO:194的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列；

(xxx)第一多肽包含与SEQ ID NO:195的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列，

并且第二多肽包含与SEQ ID NO:196的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列；

(xxxi)第一多肽包含与SEQ ID NO:205的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列，

并且第二多肽包含与SEQ ID NO:206的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列；

(xxxii)第一多肽包含与SEQ ID NO:207的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列，

并且第二多肽包含与SEQ ID NO:208的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列；

(xxxiii)第一多肽包含与SEQ ID NO:209的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列，

并且第二多肽包含与SEQ ID NO:210的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列；或者

(xxxiv)第一多肽包含与SEQ ID NO:211的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列，

并且第二多肽包含与SEQ ID NO:212的序列或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列。

在一实施方案中，重链(HC)包含重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)。在一实施方案中，重链恒定区(CH)包含恒定区结构域1区(CH1)、铰链区、恒定区结构域2区(CH2)和恒定区结构域3区(CH3)。在一实施方案中，轻链(LC)包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。

在一实施方案中，重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)一起提供第一结合结构域。在一实施方案中，同一结合臂上的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)一起提供第一结合结构域。在一实施方案中，ACE2蛋白的胞外域(ECD)或其变体，或者ACE2蛋白的ECD的片段或其变体提供第二结合结构域。在一实施方案中，scFv提供第二结合结构域。

在另一方面，本发明提供一种抗体，其包含重链可变区(VH)，其中所述VH包含选自以下的一个或多个：

(i)HCDR3，其包含选自SEQ ID NO:4、12、20、28、36、44、52、60、68、76、84、92、100、108和116的序列；

(ii)HCDR2，其包含选自SEQ ID NO:3、11、19、27、35、43、51、59、67、75、83、91、99、107和115的序列；以及

(iii)HCDR1，其包含选自SEQ ID NO:2、10、18、26、34、42、50、58、66、74、82、90、98、106和114的序列。

在一实施方案中，VH选自：

(xiv)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:106的序列，HCDR2，其包含SEQ IDNO:107的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:108的序列；以及

(xv)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:114的序列，HCDR2，其包含SEQ IDNO:115的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:116的序列。

在另一方面，本发明提供一种抗体，其包含轻链可变区(VL)，其中所述VL包含选自以下的一个或多个：

(i)LCDR3，其包含选自SEQ ID NO:8、16、24、32、40、48、56、64、72、80、88、96、104、112和120的序列；

(ii)LCDR2，其包含选自SEQ ID NO:7、15、23、31、39、47、55、63、71、79、87、95、103、111和119的序列；以及

(iii)LCDR1，其包含选自SEQ ID NO:6、14、22、30、38、46、54、62、70、78、86、94、102、110和118的序列。

在一实施方案中，VL选自：

(xiv)VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:110的序列，LCDR2，其包含SEQ IDNO:111的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:112的序列；以及

(xv)VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:118的序列，LCDR2，其包含SEQ IDNO:119的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:120的序列。

在本文所述抗体的一实施方案中，所述抗体包含选自以下的VH和VL：

(xiv)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:106的序列，HCDR2，其包含SEQ IDNO:107的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:108的序列，以及VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:110的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:111的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:112的序列；以及

(xv)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:114的序列，HCDR2，其包含SEQ IDNO:115的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO:116的序列，以及VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:118的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO:119的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO:120的序列。

在本文所述抗体的一实施方案中，所述抗体包含VH，所述VH包含与选自SEQ IDNO:1、9、17、25、33、41、49、57、65、73、81、89、97、105和113的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列。

在本文所述抗体的一实施方案中，所述抗体包含VL，所述VL包含与选自SEQ IDNO:5、13、21、29、37、45、53、61、69、77、85、93、101、109和117的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列。

(xiv)VH，其包含与SEQ ID NO:105的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，以及VL，其包含与SEQ ID NO:109的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；以及

(xv)VH，其包含与SEQ ID NO:113的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，以及VL，其包含与SEQ ID NO:117的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列。

在一实施方案中，抗体包含：

(i)第一多肽，其包含重链(HC)，以及

(ii)第二多肽，其包含轻链(LC)。

在一实施方案中，抗体包含第一结合臂和第二结合臂，其中

a.第一结合臂包含：

(i)第一多肽，其包含重链(HC)，以及

(ii)第二多肽，其包含轻链(LC)，并且；

b.第二结合臂包含：

(i)第一多肽，其包含重链(HC)，以及

(ii)第二多肽，其包含轻链(LC)。

在一实施方案中，重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)一起提供第一结合结构域。在一实施方案中，同一结合臂上的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)一起提供第一结合结构域。

在一实施方案中，本文所述的抗体可以是本文所述的结合分子的一部分，与亲本抗体相比，可以将其修饰以诱导Fc介导的效应子功能。在本发明的一实施方案中，对重链恒定区进行修饰，从而使抗体诱导Fc介导的效应子功能的程度低于除包含未修饰的重链外相同的抗体。在一实施方案中，通过与IgG Fc(Fcγ)受体结合、与C1q结合或诱导Fc介导的FcR交联来测量Fc介导的效应子功能。在一实施方案中，通过与C1q结合来测量Fc介导的效应子功能。在一实施方案中，已对重链恒定区进行修饰，从而使C1q与抗体的结合与亲本抗体相比减少，优选减少至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或100％，其中C1q结合优选通过ELISA确定。在一实施方案中，在第一和第二重链恒定区的至少一个中，根据EU编号对应于人IgG1重链中位置L234和L235的位置中的一个或多个氨基酸分别不是L和L。在一实施方案中，在第一和第二重链恒定区中，根据EU编号对应于人IgG1重链中位置L234和L235的位置分别是A和A。

在另一方面，本发明提供一种重组核酸，其编码本文所述的结合剂或本文所述的抗体。在一实施方案中，重组核酸是RNA。

在另一方面，本发明提供用本文所述的重组核酸转染的细胞。在一实施方案中，所述细胞表达结合剂或抗体。

在另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本文所述的结合剂、本文所述的抗体或本文所述的重组核酸。

在另一方面，本发明提供本文所述的结合剂、本文所述的抗体或本文所述的重组核酸用于治疗用途。在一实施方案中，治疗用途包括对受试者的冠状病毒感染的治疗性或预防性治疗。在一实施方案中，治疗用途包括中和受试者体内的冠状病毒。在一实施方案中，受试者是人。

在本文所述的结合剂、本文所述的抗体、本文所述的重组核酸、本文所述的细胞或本文所述的药物组合物的一实施方案中，所述冠状病毒是β冠状病毒。

在本文所述的结合剂、本文所述的抗体、本文所述的重组核酸、本文所述的细胞或本文所述的药物组合物的一实施方案中，冠状病毒是沙贝病毒(sarbecovirus)。

在本文所述的结合剂、本文所述的抗体、本文所述的重组核酸、本文所述的细胞或本文所述的药物组合物的一实施方案中，冠状病毒是SARS-CoV-1和/或SARS-CoV-2。

在另一方面，本发明提供一种治疗或预防冠状病毒感染的方法，其包括向受试者给药本文所述的结合剂、本文所述的抗体、本文所述的重组核酸或本文所述的药物组合物。冠状病毒的实施方案如本文所述。

在一方面，本发明涉及用于本文所述方法的本文所述的药剂或组合物。

本文还证明通过给药RNA可以在体内表达IgG-scFv双特异性结合剂，并且IgG-scFv双特异性结合剂被正确组装和折叠。因此，本发明还涉及以下示例性实施方案：

1.一种组合物或药物制品，其包含：

(i)第一RNA，其编码包含免疫球蛋白重链的第一多肽链；以及

(ii)第二RNA，其编码包含免疫球蛋白轻链和单链Fv(scFv)的第二多肽链。

2.实施方案1的组合物或药物制品，其中所述scFv连接至所述轻链的N-末端或C-末端。

3.实施方案1或2的组合物或药物制品，其中所述scFv连接至所述轻链的C-末端。

4.实施方案1-3中任一项的组合物或药物制品，其中所述免疫球蛋白重链包含重链的可变区(VH)，并且所述免疫球蛋白轻链包含轻链的可变区(VL)。

5.实施方案1-4中任一项的组合物或药物制品，其中所述免疫球蛋白重链与所述免疫球蛋白轻链相互作用形成第一结合结构域。

6.实施方案1-5中任一项的组合物或药物制品，其中所述免疫球蛋白重链的重链可变区(VH)与所述免疫球蛋白轻链的轻链可变区(VL)相互作用形成第一结合结构域。

7.实施方案1-6中任一项的组合物或药物制品，其中两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链形成全长抗体。

8.实施方案1-7中任一项的组合物或药物制品，其中所述scFv包含免疫球蛋白的重链可变区(VH)和免疫球蛋白的轻链可变区(VL)。

9.实施方案1-8中任一项的组合物或药物制品，其中所述scFv的VH与所述scFv的VL相互作用形成第二结合结构域。

10.实施方案9的组合物或药物制品，其中所述第一结合结构域和所述第二结合结构域结合不同表位，其中所述不同表位存在于相同或不同抗原上。

11.实施方案1-10中任一项的组合物或药物制品，其中两条第一多肽链和两条第二多肽链形成全长抗体，其中scFv连接至每条轻链。

12.实施方案1-11中任一项的组合物或药物制品，其中所述第一多肽链包含重链的恒定区1(CH1)或其功能变体，并且第二多肽链包含轻链的恒定区(CL)或其功能变体。

13.实施方案12的组合物或药物制品，其中所述第一多肽链进一步包含重链的恒定区2(CH2)或其功能变体，并且任选地进一步包含重链的恒定区3(CH3)或其功能变体。

14.实施方案1-13中任一项的组合物或药物制品，其中所述免疫球蛋白是抗体。

15.实施方案1-14中任一项的组合物或药物制品，其中所述免疫球蛋白是IgG。

16.实施方案15的组合物或药物制品，其中所述IgG是人IgG。

17.实施方案1-16中任一项的组合物或药物制品，其中所述第一多肽链按照从N-末端至C-末端的顺序包含

VH-CH1，其中所述CH可以任选地进行修饰。

18.实施方案1-17中任一项的组合物或药物制品，其中所述第一多肽链按照从N-末端至C-末端的顺序包含

VH-CH1-CH2，其中所述CH可以任选地进行修饰。

19.实施方案1-18中任一项的组合物或药物制品，其中所述第一多肽链按照从N-末端至C-末端的顺序包含

VH-CH1-CH2-CH3，其中所述CH可以任选地进行修饰。

20.实施方案1-19中任一项的组合物或药物制品，其中所述第二多肽链按照从N-末端至C-末端的顺序包含

VL-CL-VH(scFv)-VL(scFv)；或

VL-CL-VL(scFv)-VH(scFv)。

21.实施方案20的组合物或药物制品，其中VH与VL相互作用形成结合结构域，并且VH(scFv)与VL(scFv)相互作用形成结合结构域。

22.实施方案1-21中任一项的组合物或药物制品，其中所述scFv通过肽接头连接至轻链。

23.实施方案20-22中任一项的组合物或药物制品，其中所述CL通过肽接头连接至VH(scFv)或VL(scFv)。

24.实施方案22或23的组合物或药物制品，其中所述肽接头包括GS接头。

25.实施方案1-24中任一项的组合物或药物制品，其中所述scFv的VH和VL通过肽接头互相连接。

26.实施方案25的组合物或药物制品，其中所述肽接头包括GS接头。

27.实施方案26的组合物或药物制品，其中所述肽接头包含氨基酸序列(G₄S)₄或其功能变体。

28.实施方案20-27中任一项的组合物或药物制品，其中所述第一多肽链上的CH1与所述第二多肽链上的CL相互作用。

29.实施方案1-28中任一项的组合物或药物制品，其中所述第一RNA和/或所述第二RNA包含修饰的核苷代替尿苷。

30.实施方案29的组合物或药物制品，其中所述修饰的核苷选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。

31.实施方案1-30中任一项的组合物或药物制品，其中所述第一RNA和/或所述第二RNA包含帽。

32.实施方案31的组合物或药物制品，其中所述帽包括m₂ ^7,3’-OGppp(m₁ ^2’-O)ApG。

33.实施方案1-32中任一项的组合物或药物制品，其中所述第一RNA和/或所述第二RNA包含5’UTR。

34.实施方案33的组合物或药物制品，其中所述5’UTR包含SEQ ID NO:199的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:199的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列。

35.实施方案1-34中任一项的组合物或药物制品，其中所述第一RNA和/或所述第二RNA包含3’UTR。

36.实施方案35的组合物或药物制品，其中所述3’UTR包含SEQ ID NO:201的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:201的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列。

37.实施方案1-36中任一项的组合物或药物制品，其中所述第一RNA和/或所述第二RNA包含poly-A序列。

38.实施方案37的组合物或药物制品，其中所述poly-A序列包含至少100个核苷酸。

39.实施方案37或38的组合物或药物制品，其中所述poly-A序列包含SEQ ID NO:202的核苷酸序列。

40.实施方案1-39中任一项的组合物或药物制品，其中所述RNA配制为液体、配制为固体或其组合。

41.实施方案1-40中任一项的组合物或药物制品，其中所述RNA配制或待配制用于注射。

42.实施方案1-41中任一项的组合物或药物制品，其中所述RNA配制或待配制用于静脉内给药。

43.实施方案1-42中任一项的组合物或药物制品，其中所述RNA配制或待配制为颗粒。

44.实施方案50的组合物或药物制品，其中所述颗粒是液体纳米颗粒(LNP)。

45.实施方案44的组合物或药物制品，其中所述LNP颗粒包含阳离子脂质、中性脂质(例如，磷脂)、聚合物缀合的脂质(例如，聚乙二醇化脂质)和类固醇(例如，胆固醇)。

46.实施方案1-45中任一项的组合物或药物制品，其是药物组合物。

47.实施方案46的组合物或药物制品，其中所述药物组合物进一步包含一种或多种药学可接受的载剂、稀释剂和/或赋形剂。

48.实施方案1-47中任一项的组合物或药物制品，其中所述药物制品是试剂盒。

49.实施方案48的组合物或药物制品，其中所述RNA和任选存在的颗粒形成组分在不同的小瓶中。

50.实施方案1-49中任一项的组合物或药物制品用于制药用途。

51.实施方案50的组合物或药物制品，其中所述制药用途包括疾病或病症的治疗性或预防性治疗。

52.实施方案1-51中任一项的组合物或药物制品，用于在受试者中表达结合剂。

53.实施方案52的组合物或药物制品，其中所述结合剂是至少双特异性的结合剂。

54.实施方案52或53的组合物或药物制品，其中所述结合剂是如本文所述的结合剂。

55.一种在受试者中表达结合剂的方法，其包括向所述受试者给药如实施方案1-54中任一项所示的第一RNA和第二RNA。

56.实施方案54的方法，其中所述第一RNA和所述第二RNA同时或顺序给药。

57.一种在受试者中表达结合剂的方法，包括向所述受试者给药实施方案1-54中任一项的组合物或药物制品。

58.实施方案55-57中任一项的方法，其中所述结合剂是如本文所述的结合剂。

59.实施方案1-54中任一项所示的第一RNA和第二RNA或者实施方案1-54中任一项的组合物或药物制品，用于实施方案55-58中任一项的方法。

附图说明

图1：具有人ACE-2胞外域的抗S1抗体融合构建体的概述

将含有突变R273Q、H345L、H374N、H378N的ACE-2的ECD(aa 18-615)在N-端或C-端与含有LS(M428L/N434S)突变或不含突变的抗S1抗体轻链和抗S1重链融合(A)。在其他构建体中，将修饰的ACE-2ACD与含有LS(M428L/N434S)突变或不含突变的Fc(CH2-CH3)结构域融合(B)。

图2：用抗S1抗体-ACE2融合蛋白的SARS-CoV2-S1-RBD ELISA

在ELISA中测试抗S1抗体-ACE2融合蛋白与固定的SARS-CoV2-S1-RBD蛋白的结合。(A)将抗S1抗体(408/413)、抗S1抗体-ACE2融合蛋白和作为对照的ACE-2-hFc(402/403)以连续稀释的方式进行测试，覆盖20,000-0.013ng/ml的浓度范围。(B)EC50值显示为使用XLfit进行曲线拟合后确定的。

图3：用抗S1抗体-ACE2融合蛋白的SARS-CoV2-S1-RBD–ACE-2中和测定

在中和ELISA中测试抗S1抗体-ACE2融合蛋白对ACE-2–SARS-CoV2-S1-RBD相互作用的抑制。(A)将抗S1抗体(408/413)、抗S1抗体-ACE2融合蛋白和作为对照的ACE-2-hFc(402/403)以连续稀释的方式进行测试，分别覆盖从30,000至3.7或0.019ng/ml的浓度范围。(B)IC50值显示为使用XLfit进行曲线拟合后确定的。

图4：抗S1抗体-ACE2融合构建体的假病毒中和活性

在假病毒中和测试(pVNT)中测试抗S1抗体(413)、ACE-2-hFc(402)和抗S1抗体-ACE2融合蛋白。图中显示通过GFP表达测量的感染细胞的数量(Y-轴)。测试样品的浓度范围为100-0.046μg/ml。IC50值显示为使用GraphPad Prism进行曲线拟合后确定的。

图5：抗S1抗体-ACE2融合蛋白对活性三聚体SARS-CoV-2S和SARS-CoV-2S1-RBD蛋白的亲和性

显示的是使用两种不同密度的SARS-CoV-2S活性三聚体蛋白(A)或SARS-CoV-2S1-RBD蛋白(B)通过SPR测量的抗S1抗体(413)、ACE-2-hFc(402)和抗S1抗体-ACE2融合蛋白的结合和解离速率以及K_D。

图6：用B-细胞上清液中的抗体的SARS-CoV2-S1 ELISA

在ELISA中测试B-细胞上清液中的抗SARS-CoV2-S1抗体与固定的SARS-CoV2-S1蛋白的结合。(A)显示的是通过定量ELISA测量的每种B-细胞上清液中的兔抗体浓度。(B)将B-细胞上清液和作为对照的ACE-2-mFc以1:3的连续稀释进行测试，并且根据确定的rIgG含量绘制浓度(见实施例6A)。(C)表1：包被浓度3μg/ml的SARS-CoV-2S1结合ELISA中来自B-细胞上清液的抗S1兔抗体的EC50数据。表2：包被浓度0.85μg/ml的SARS-CoV-2S1结合ELISA中来自B-细胞上清液的抗S1兔抗体的EC50数据。EC50值显示为使用XLfit进行曲线拟合后确定的。

图7：用B-细胞上清液中的抗体的SARS-CoV2-S1–ACE-2中和测定

在中和ELISA中测试B-细胞上清液中的抗SARS-CoV2-S1抗体对ACE-2–SARS-CoV2-S1相互作用的抑制。(A)将B-细胞上清液和作为对照的ACE-2-mFc以1:3的连续稀释进行测试，并且根据确定的rIgG含量绘制浓度(见实施例6A)。(B)IC50值显示为使用XLfit进行曲线拟合后确定的。

图8：用本发明的纯化抗体的SARS-CoV2-S、SARS-CoV2-S1-RBD和SARS-CoV-S1-RBDELISA

在ELISA中测试本发明的纯化嵌合抗体与固定的SARS-CoV2-S活性三聚体、SARS-CoV2-S1-RBD或SARS-CoV-S1-RBD的结合。(A)将纯化嵌合抗体以及ACE-2-hFc(402/403)、抗S1抗体-ACE2融合蛋白(406)和作为对照的抗S1抗体(408)以连续稀释的方式进行测试，覆盖1,000-0.0006ng/ml的浓度。(B)EC50值显示为使用XLfit进行曲线拟合后确定的。

图9：用本发明的纯化抗体的SARS-CoV2-S1-RBD–ACE-2中和测定

在中和ELISA中测试本发明的纯化嵌合抗体对ACE-2–SARS-CoV2-S1-RBD相互作用的抑制。(A)将纯化嵌合抗体以及ACE-2-hFc(402/403)、抗S1抗体-ACE2融合蛋白(406)和作为对照的抗S1抗体(408)以连续稀释的方式进行测试，覆盖30,000-0.019ng/ml的浓度。(B)IC50值显示为使用XLfit进行曲线拟合后确定的。

图10：本发明的纯化抗体的假病毒中和活性

在假病毒中和测试(pVNT)中测试本发明的纯化嵌合抗体。(A)将嵌合抗体以及抗S1抗体(413)、ACE2-hFc(403)和抗S1抗体-ACE2融合蛋白(411)以连续稀释的方式进行测试，浓度为100-0.049μg/ml或30-0.01μg/ml。图中显示通过GFP表达测量的每孔感染细胞的数量(Y-轴)。本发明所选抗体的IC50和IC90值总结于(B)中。

图11：本发明的抗体间的SARS-CoV2-S1-RBD表位竞争

在竞争性ELISA中测试纯化嵌合抗体对SARS-CoV2-S1-RBD表位结合的竞争。表中总结了一种嵌合抗体与另一种嵌合抗体的不同组合。竞争性抗体标记为+，非竞争性抗体标记为–，不确定的抗体对标记为nd。

图12：双特异性抗S1抗体的概述

将抗S1抗体或本发明的抗体衍生的scFv(新-scFv)分别与抗S1抗体或本发明的抗体的轻链偶联。或者，将新-scFv与本发明的另一抗体的轻链偶联。

图13：说明RNA-构建体和编码的抗S1抗体-ACE2融合RiboMab的模块方案。

(A)在IVT-mRNA水平，重链(HC，顶部)和轻链ACE2胞外域(ECD)融合(LC-ACE2，底部)的设计。(B)翻译的抗S1抗体-ACE2-RiboMab，左，RiboMab_411，右，RiboMab_406的图示。曲线代表甘氨酸-丝氨酸[(Gly4Ser)4]接头。

ACE2，血管紧张素转换酶2；a-S1，抗刺突蛋白1；CL，恒定轻链区；CH，恒定重链区；ECD，胞外域；Fc，片段可结晶区；GS，(Gly4Ser)4接头；HC，重链；LC，轻链；LS，甲硫氨酸428亮氨酸和天冬酰胺434丝氨酸取代；Poly(A)，poly(A)尾；Sec，分泌信号；UTR，非翻译区；VH，可变重链结构域；VL，可变轻链结构域。

图14：抗S1抗体-ACE2融合RiboMab的体外表达。

通过电穿孔用所示IVT-mRNA质量相关比例的RiboMab_411或RiboMab_406的重链(HC)和轻链ACE2 ECD融合物(LC-ACE2)或者仅用RNA缓冲液(模拟(Mock))瞬时转染人胚胎肾细胞系HEK 293T/17。在电穿孔后48小时收获含有分泌的RiboMab的HEK 293T/17细胞培养上清液(SN)并进行(A)Gyros免疫测定定量和(B,C)蛋白印迹分析。(A)用荧光标记的抗人IgG检测抗体通过Gyros夹心免疫测定分析所示HC:LC-ACE2比例转染后SN中的RiboMab浓度(x-轴)。(B,C)进行蛋白印迹分析以检测翻译的RiboMab。将22.5ng纯化的参考蛋白ID 411(参考蛋白)、7.5μL模拟或7.5μL含有RiboMab的SN加样并在(B)非还原和(C)还原条件下通过聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳(4–15％聚丙烯酰胺)进行分离。应用了两种不同的分子量标准品(MW std.1和2)。用两种多克隆辣根过氧化物酶缀合的山羊抗人IgG、Fcy-片段特异性(1:2,000)和κLC特异性(1:200)抗体的混合物检测蛋白。

Fc，IgG的片段可结晶区；HC，重链；IB，免疫印迹；IgG；免疫球蛋白G；LC，轻链；MWstd.，分子量标准品；SN，上清液。

图15：抗S1抗体-ACE2融合RiboMab的体内药代动力学的估计。

每组12只雌性Balb/cJRj小鼠接受单次静脉内注射30μg编码RiboMab_406、RiboMab_411或萤光素酶(阴性对照)的RNA-LNP。每个时间点抽取4只小鼠的血液样品。如图所示，在给药后6、24、48、96和240小时(0.25-10天)的血清样品中通过Gyros免疫测定测量RiboMab浓度。浓度在y-轴上以log10标度作图。误差棒是平均值的标准误差(n＝4)。

图16：体内表达的抗S1抗体-ACE2融合RiboMab的蛋白印迹分析。

在给药后6小时从注射了30μg编码RiboMab_406或RiboMab_411的RNA-LNP的雌性Balb/cJRj小鼠提取血清并进行蛋白印迹分析。稀释于缓冲液中的纯化的参考蛋白ID 411(参考蛋白)或未经处理的小鼠的血清(血清中的参考蛋白)用作阳性对照。注射了编码萤光素酶的RNA-LNP的小鼠血清用作阴性对照。在(A)非还原和(B)还原条件下通过聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳(4–15％)分离10ng参考蛋白或5μL血清样品。应用了两种不同的分子量标准品(MW std.1和2)。用两种多克隆辣根过氧化物酶缀合的山羊抗人IgG、Fcy-片段特异性(1:2,000)和κLC特异性(1:200)抗体的混合物检测蛋白。

Fc，IgG的片段可结晶区；h，人；HC，重链；IB，免疫印迹；IgG；免疫球蛋白G；LC，轻链；MW std.，分子量标准品；SN，上清液。

图17：RiboMab_411和406的假病毒中和活性。

在假病毒中和测试中测试HEK 293T/17细胞培养SN中的RiboMab_406和RiboMab_411。仅用HC转染的细胞的SN用作模拟对照(模拟1，RiboMab_406的HC，模拟2，RiboMab_411的HC)。以连续稀释的方式测试样品，最终浓度为30-0.23μg/mL。图中显示通过GFP表达测量的每孔感染细胞的数量(Y-轴)。下表显示IC50值(μg/mL)。

图18：双特异性抗S1抗体-scFv融合蛋白与重组SARS-CoV2 S1-RBD蛋白的结合

在ELISA中测试抗S1抗体-scFv融合蛋白与固定的SARS-CoV2-S1-RBD蛋白的结合。(A)将抗S1抗体(408)、本发明的抗体和抗S1抗体-scFv融合蛋白以连续稀释的方式进行测试，覆盖1,000-0.001ng/ml的浓度。(B)EC50值显示为使用XLfit进行曲线拟合后确定的。

图19：用抗S1抗体-scFv融合蛋白的SARS-CoV2-S1-RBD–ACE-2中和测定

在中和ELISA中测试抗S1抗体-scFv融合蛋白对ACE-2–SARS-CoV2-S1-RBD相互作用的抑制。(A)将抗S1抗体(408)、本发明的抗体和抗S1抗体-scFv融合蛋白以连续稀释的方式进行测试，分别覆盖30,000-0.019ng/ml的浓度。(B)IC50和IC90值显示为使用XLfit进行曲线拟合后确定的。

图20：本发明的S1靶向抗体对SARS-CoV-2S1-RBD的亲和性

显示的是使用固定的SARS-CoV-2S1-RBD蛋白通过SPR测量的抗S1抗体(413)和本发明的抗体的结合和解离速率以及K_D。

图21：双特异性抗体的假病毒中和

在假病毒中和测试(pVNT)中测试纯化的双特异性抗体构建体465和467。(A)图中显示通过GFP表达测量的每孔感染细胞的数量(Y-轴)。本发明所选抗体的IC50和IC90值总结于(B)中。

图22：双特异性抗体的假病毒中和

在假病毒中和测试(pVNT)中测试纯化的双特异性抗体构建体。(A)图中显示通过GFP表达测量的每孔感染细胞的数量(Y-轴)。本发明抗体的IC50和IC90值总结于(B)中。

图23：双特异性抗体的假病毒中和

在假病毒中和测试(pVNT)中测试纯化的双特异性抗体构建体498、500、501和502。(A)图中显示通过GFP表达测量的每孔感染细胞的数量(Y-轴)。本发明抗体的IC50和IC90值总结于(B)中。

图24：本发明的S1靶向抗体470对SARS-CoV-2S1-RBD的亲和性

显示的是使用固定的SARS-CoV-2S1-RBD蛋白在多循环动力学SPR分析中测量的本发明的抗S1抗体470的结合和解离速率以及K_D。在两种不同的流动细胞上记录多循环动力学，每种细胞重复3次。

图25：说明编码IgG RiboMab的RNA-构建体的模块方案。

(A)在IVT-mRNA水平上编码IgG RiboMab的重链(HC，顶部)和轻链(LC，底部)抗SARS-CoV-2的设计。(B)翻译的IgG RiboMab蛋白的说明。

CL，恒定轻链区；CH，恒定重链区；Fc，片段可结晶区；HC，重链；LC，轻链；LALA，亮氨酸至丙氨酸(密码子234)和亮氨酸至丙氨酸(密码子235)取代；LS，甲硫氨酸至亮氨酸(密码子428)和天冬酰胺至丝氨酸(密码子434)取代；Poly(A)，poly(A)尾；Sec，分泌信号；UTR，非翻译区；VH，可变重链结构域；VL，可变轻链结构域。

图26：抗SARS-CoV-2IgG RiboMab的体外表达。

通过电穿孔用所示RiboMab的1.5:1的IVT-mRNA质量相关比例的重链(HC)和轻链瞬时转染人胚胎肾细胞系HEK 293T/17。在电穿孔后48小时收获含有分泌的RiboMab的HEK293T/17细胞培养上清液(SN)并进行Gyros免疫测定定量。用荧光标记的抗人IgG检测抗体通过Gyros夹心免疫测定分析所示HC:LC比例转染后SN中的RiboMab浓度(x-轴)。

Ref.，参照物(包括LALA和LS突变的抗S1 IgG抗体)。

图27：体外表达的抗SARS-CoV-2IgG RiboMab候选物的假病毒中和活性。

在假病毒中和测试中测试含有如各图x-轴所示的抗SARS-CoV-2RiboMab的HEK293T/17细胞培养SN。以连续稀释的方式测试样品，最终浓度为30,000-7.3ng/mL。(A)图中显示通过萤光素酶表达测量的每孔感染细胞的数量(Y-轴)，以相对发光单位(RLU)表示。误差棒是平均值的标准误差(技术一式三份)。水平虚线表示病毒对照的基准(以RLU计)。(B)显示RiboMab和RiboMab IgG参考蛋白的IC50和IC90值(ng/mL)的表。

IC50，半数最大抑制浓度；IC90，抑制90％假病毒复制所需的浓度；ID，识别号；IgG，免疫球蛋白γ；NC，不可计算；ref.，参照物；RLU，相对发光单位。

图28：所选抗SARS-CoV-2IgG RiboMab的体内药代动力学估计。

每组4只雌性Balb/cJRj小鼠接受单次静脉内注射30μg编码RiboMab_445、RiboMab_447、RiboMab_470、RiboMab_472、抗SARS-CoV-2RiboMab IgG参照物或萤光素酶(阴性对照)的RNA-LNP。抗S1抗体(蛋白ID 408)参照物作为蛋白参照物以100μg的剂量给药。每个时间点抽取4只小鼠的血液样品。在给药后24、96、168、216、336和504小时(如x-轴所示的第1-21天)制备的血清样品中通过Gyros免疫测定测量RiboMab浓度。在阴性对照组(萤光素酶RNA-LNP，数据未显示)中没有检测到蛋白。浓度在y-轴上以log10标度作图。误差棒代表平均值的标准误差(技术一式四份)。

ID，识别号；IgG，免疫球蛋白γ。

图29：体内表达的抗SARS-CoV-2IgG RiboMab候选物的假病毒中和活性。

在使用野生型SARS-CoV-2刺突蛋白的假病毒中和测试中测试含有如各图x-轴所示的抗SARS-CoV-2RiboMab的Balb/cJRj小鼠血清样品。将样品以12-点、2-倍(RiboMab_447)或3-倍(RiboMab_445/470/472)连续稀释进行测试。每个样品的起始浓度不同，在大约30-60μg/mL的范围中。图中显示通过萤光素酶表达测量的每孔感染细胞的数量(Y-轴)。误差棒代表平均值的标准误差(技术一式三份)。(B)显示血清中RiboMab和蛋白参照物(蛋白ID 408)的IC50和IC90值(ng/mL)的表。

IC50，半数最大抑制浓度；IC90，抑制90％假病毒复制所需的浓度；ID，识别号；ref.，参照物；RLU，相对发光单位。

图30：说明RNA-构建体和编码的双特异性IgG-scFv RiboMab的模块方案。

(A)在IVT-mRNA水平上编码双特异性IgG-scFv RiboMab的重链(HC，顶部)和轻链(LC-scFv，底部)抗SARS-CoV-2的设计。VH#1和VL#1使用来自第一抗SARS-CoV-2抗体的编码序列，而VH#2和VL#2编码序列源自第二抗SARS-CoV-2特异性抗体。(B)翻译的IgG-scFvRiboMab蛋白的说明。曲线代表甘氨酸-丝氨酸(GS)接头。VH#2和VL#2之间的粗线表示稳定scFv的二硫键。

CL，恒定轻链区；CH，恒定重链区；ds，二硫键；Fc，片段可结晶区；HC，重链；GS，甘氨酸-丝氨酸接头；LC，轻链；LALA，亮氨酸至丙氨酸(密码子234)和亮氨酸至丙氨酸(密码子235)取代；LS，甲硫氨酸至亮氨酸(密码子428)和天冬酰胺至丝氨酸(密码子434)取代；Poly(A)，poly(A)尾；Sec，分泌信号；scFv，单链可变片段；UTR，非翻译区；VH，可变重链结构域；VL，可变轻链结构域。

图31：所选抗SARS-CoV-2双特异性IgG-scFv RiboMab的体内药代动力学估计。

每组4只雌性Balb/cJRj小鼠接受单次静脉内注射30μg编码RiboMab_498、RiboMab_500、RiboMab_502或萤光素酶(阴性对照)的RNA-LNP。抗S1抗体(蛋白ID 408)参照物作为蛋白参照物以250μg的剂量给药。每个时间点抽取4只小鼠的血液样品。在给药后6、24、48、96、168、336和504小时(如x-轴所示的第0.25-21天)制备的血清样品中通过Gyros免疫测定测量RiboMab浓度。在阴性对照组(萤光素酶RNA-LNP，数据未显示)中没有检测到蛋白。浓度在y-轴上以log10标度作图。误差棒代表平均值的标准误差(技术一式四份)。

ID，识别号；IgG，免疫球蛋白γ。

图32：体内表达的抗SARS-CoV-2双特异性IgG-scFv RiboMab候选物的假病毒中和活性。

每组2只雌性Balb/cJRj小鼠接受单次静脉内注射30μg编码RiboMab_498、RiboMab_500、RiboMab_502或萤光素酶(阴性对照)的RNA-LNP。抗S1抗体(蛋白ID 408)参照物作为蛋白参照物以250μg的剂量给药。给药后24小时抽取两只小时的血液样品。在使用野生型的SARS-CoV-2刺突蛋白变体B.1.1.7、B.1.351和B.1.617的假病毒中和测试中测试含有抗SARS-CoV-2RiboMab的小鼠血清样品。将野生型、B.1.1.7和B.1.351变体的样品以12-点、4-倍连续稀释进行测试，最终浓度范围为5,000-0.0012ng/mL。将B.1.617变体的样品以14-点、4-倍连续稀释进行测试，浓度范围为20,000-0.0003ng/mL。(A)显示所示RiboMab和针对所示假病毒变体的pVNT测定的IC50值的图。误差棒是平均值的标准误差(技术一式三份)。(B)显示血清中的RiboMab针对所示假病毒变体的IC50和IC90值(ng/mL)的表。IC50，半数最大抑制浓度；IC90，抑制90％假病毒复制所需的浓度；RLU，相对发光单位；WT，野生型。

图33：小鼠血清中双特异性IgG-scFv RiboMab蛋白完整性

在给药30μg编码RiboMab_498、RiboMab_500或RiboMab_502的RNA-LNP后24小时从雌性Balb/cJRj小鼠采集血清。(A)血清样品的蛋白印迹分析。注射了编码萤光素酶的RNA-LNP的小鼠血清用作阴性对照(neg.对照)。在非还原条件下通过聚丙烯酰胺梯度凝胶(4–15％)电泳分离10ng参考蛋白或11.25μL每种血清样品。用多克隆辣根过氧化物酶缀合的山羊抗人IgG抗体(H+L)检测蛋白。(B)表中显示基于ImageLab软件定量的体内表达的RiboMabIgG-scFv蛋白的质量分析(单体与高分子量与低分子量蛋白物质)。单体IgG-scFv是期望的蛋白产物。

H，重链；ID，识别号；IgG，免疫球蛋白γ；kD，千道尔顿；L，轻链；MW，分子量；scFv，单链可变片段；std.，标准品。

序列描述

下表提供本文引用的某些序列的列表。

表1.基于重链和轻链可变区(HC VR,LC VR)和互补决定区(CDR)的SEQ ID NO的本文所述抗体的列表。

表2.基于重链和轻链SEQ ID NO以及最终蛋白的简短描述的本文所述结合剂的列表。

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具体实施方式

虽然下文详细描述了本公开，但是应当理解本公开并不限于本文描述的特定方法、方案和试剂，因为这些可以变化。还应当理解本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不是为了限制本公开的范围，本公开的范围仅受所附权利要求书的限制。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本领域技术人员通常理解的相同的含义。

优选地，本文使用的术语如"A multilingual glossary of biotechnologicalterms:(IUPAC Recommendations)",H.G.W.Leuenberger,B.Nagel,and H.

Eds.,Helvetica Chimica Acta,CH-4010Basel,Switzerland,(1995)所述定义。

除非另有说明，否则本公开的实施会采用化学、生物化学、细胞生物学、免疫学和重组DNA技术的常规方法，其在所述领域的文献中解释(参见，例如，Molecular Cloning:ALaboratory Manual,2^nd Edition,J.Sambrook et al.eds.,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor 1989)。

在下文中会描述本公开的元素。这些元素用具体实施方案列出，但是，应当理解它们可以以任何方式和任何数量组合以产生额外的实施方案。以前描述的实例和实施方案不应当理解为将本公开仅限于明确描述的实施方案。本说明书应当理解为公开并涵盖组合明确描述的实施方案与任何数量的公开元素的实施方案。此外，除非上下文另有指示，否则所有描述的元素的任何排列和组合都应当视为由本说明书公开。

术语“约”表示近似或接近，并且在一实施方案中在本文示出的数值或范围的上下文中表示列举或声称的数值或范围的±20％、±10％、±5％或±3％。

在描述本公开的上下文中(特别是在权利要求的上下文中)使用的术语“一个”和“这个”以及相似指称应当理解为覆盖单数和复数，除非在本文中另有指明或与上下文明显矛盾。本文中值的范围的列举仅为了用作单独提到落在所述范围内的每个不同值的速记方法。除非本文另有说明，否则每个单独的值如其在本文中单独列举地加入本说明书。除非本文另有说明或其他地方显然违背上下文，否则本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序进行。本文提供的任何和所有实例或者示例性语言(例如，“如”)的使用仅为了更好地说明本公开，并不对权利要求书的范围构成限制。本说明书中任何语言都不应当理解为表明对于本公开的实施必要的任何未要求保护的元素。

除非另有明确说明，否则在本文件的上下文中术语“包含”用来表示除了由“包含”引入的列表成员，还可以任选地存在其他成员。但是，作为本公开的具体实施方案，考虑术语“包含”涵盖不存在其他成员的可能性，即，为了这个实施方案的目的，“包含”可以理解为具有“由…组成”或“基本上由…组成”的含义。

在这个说明书的整个正文中引用了几个文件。本文引用的每个文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指导等)，无论上文或下文，均整体援引加入本文。本文中的任何内容均不应理解为承认本公开无权先于这样的公开。

定义

在下文中，将提供适用于本公开的所有方面的定义。除非另有说明，否则以下术语具有以下含义。任何未定义的术语均具有其公认的含义。

本文使用的术语如“降低”、“减少”、“抑制”或“损害”涉及总体降低或引起总体降低的能力，优选在水平上降低至少5％、至少10％、至少20％、至少50％、至少75％或甚至更多。这些术语包括完全或基本上完全抑制，即降低至0或基本上至0。

术语如“增加”、“增强”或“超过”优选涉及增加或增强至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少80％、至少100％、至少200％、至少500％或甚至更多。

根据本公开，术语“肽”包含寡肽和多肽，并且是指包含通过肽键互相连接的约2个或更多个、约3个或更多个、约4个或更多个、约6个或更多个、约8个或更多个、约10个或更多个、约13个或更多个、约16个或更多个、约20个或更多个以及多达约50个、约100个或约150个连续氨基酸的物质。术语“蛋白”或“多肽”是指大的肽，特别是具有至少约150个氨基酸的肽，但是术语“肽”、“蛋白”和“多肽”在本文中通常用作同义词。

关于氨基酸序列(肽或蛋白)，“片段”涉及氨基酸序列的一部分，即，代表在N-末端和/或C-末端变短的氨基酸序列的序列。可以例如通过缺少开放阅读框3'端的截短的开放阅读框的翻译获得在C-末端缩短的片段(N-末端片段)。可以例如通过缺少开放阅读框5'端的截短的开放阅读框的翻译获得在N-末端缩短的片段(C-末端片段)，只要截短的开放阅读框包含用来起始翻译的起始密码子。氨基酸序列的片段包含例如来自氨基酸序列的氨基酸残基的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％。氨基酸序列的片段优选包含来自氨基酸序列的至少6个、特别是至少8个、至少12个、至少15个、至少20个、至少30个、至少50个或至少100个连续氨基酸。

本文中的“变体”表示由于至少一个氨基酸修饰而与亲本氨基酸序列不同的氨基酸序列。亲本氨基酸序列可以是天然存在的或野生型(WT)氨基酸序列，或者可以是野生型氨基酸的修饰形式。优选地，与亲本氨基酸序列相比，变体氨基酸序列具有至少一个氨基酸修饰，例如，与亲本相比，具有1至约20个氨基酸修饰，并且优选1至约10个或1至约5个氨基酸修饰。

本文中的“野生型”或“WT”或“天然”表示在自然界中发现的氨基酸序列，包括等位基因变异。野生型氨基酸序列、肽或蛋白具有未被故意修饰的氨基酸序列的片段。

为了本公开的目的，氨基酸序列(肽、蛋白或多肽)的“变体”包含氨基酸插入变体、氨基酸添加变体、氨基酸缺失变体和/或氨基酸取代变体。术语“变体”包括所有突变体、剪接变体、翻译后修饰变体、构象、同种型、等位基因变体、物种变体和物种同源物，特别是天然存在的那些。特别地，术语“变体”包括氨基酸序列的片段。

氨基酸插入变体包括在特定氨基酸序列中插入单个或两个或更多个氨基酸。在具有插入的氨基酸序列变体的情况下，将一个或多个氨基酸残基插入氨基酸序列中的特定位点，然而适当筛选所得产物的随机插入也是可以的。氨基酸添加变体包含一个或多个氨基酸的氨基-和/或羧基-末端融合，如1、2、3、5、10、20、30、50或更多个氨基酸。氨基酸缺失变体的特征在于从序列去除一个或多个氨基酸，如去除1、2、3、5、10、20、30、50或更多个氨基酸。缺失可以在蛋白的任何位置。在蛋白的N-末端和/或C-末端包含缺失的氨基酸缺失变体也称作N-末端和/或C-末端截短变体。氨基酸取代变体的特征在于去除序列中的至少一个残基并在其位置插入另一残基。优先考虑在同源蛋白或肽之间不保守的氨基酸序列位置中的修饰和/或用具有相似特性的其他氨基酸代替氨基酸。优选地，肽和蛋白变体中的氨基酸改变是保守的氨基酸改变，即，相似带电荷或不带电荷的氨基酸的取代。保守的氨基酸改变包括在它们的侧链中相关的氨基酸家族之一的取代。天然存在的氨基酸一般分为4个家族：酸性(天冬氨酸、谷氨酸)，碱性(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，非极性(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，和不带电荷的极性(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)氨基酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时共同归类为芳香氨基酸。在一实施方案中，保守氨基酸取代涉及以下组内的取代：

甘氨酸、丙氨酸；

缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；

天冬氨酸、谷氨酸；

天冬酰胺、谷氨酰胺；

丝氨酸、苏氨酸；

赖氨酸、精氨酸；以及

苯丙氨酸、酪氨酸。

优选地，给定氨基酸序列和所述给定氨基酸序列变体的氨基酸序列之间的相似性程度，相同性程度优选是至少约60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。优选对参考氨基酸序列的整个长度的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的氨基酸区域给出相似性或相同性程度。例如，如果参考氨基酸序列由200个氨基酸组成，优选对至少约20、至少约40、至少约60、至少约80、至少约100、至少约120、至少约140、至少约160、至少约180或约200个氨基酸给出相似性或相同性程度，在一些实施方案中，连续氨基酸。在一些实施方案中，对参考氨基酸序列的整个长度给出相似性或相同性程度。可以用本领域已知的工具进行确定序列相似性，优选序列相同性的比对，优选利用最佳序列比对，例如，利用Align，利用标准设置，优选EMBOSS::needle、Matrix:Blosum62、Gap Open 10.0、Gap Extend 0.5。

“序列相似性”表示相同或代表保守氨基酸取代的氨基酸的百分比。两个氨基酸序列之间的“序列相同性”表示所述序列之间相同的氨基酸的百分比。两个核酸序列之间的“序列相同性”表示所述序列之间相同的核苷酸的百分比。

特别地，术语“％相同”、“％相同性”或相似术语是指在待比较的序列之间的最佳比对中相同的核苷酸或氨基酸的百分比。所述百分比纯粹是统计上的，并且两个序列之间的差异可以但不必一定随机分布在待比较的序列的整个长度上。通常在对区段或“比较窗口”最佳比对之后，通过比较序列进行两个序列的比较，以便鉴定相应序列的局部区域。可以手动或者借助于Smith and Waterman,1981,Ads App.Math.2,482的局部同源性算法，借助于Neddleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48,443的局部同源性算法，借助于Pearsonand Lipman,1988,Proc.Natl Acad.Sci.USA88,2444的相似性搜索方法，或借助于使用所述算法的计算机程序(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics ComputerGroup,575Science Drive,Madison,Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA)进行用于比较的最佳比对。在一些实施方案中，利用BLASTN或BLASTP算法确定两个序列的百分比相同性，可在美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站(例如，在blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PAGE_TYPE＝BlastSearch&BLAST_SPEC＝blast2seq&LINK_LOC＝align2seq)上获得。在一些实施方案中，用于NCBI网站上的BLASTN算法的算法参数包括：(i)期望阈值设置为10；(ii)字长设置为28；(iii)查询范围中的最大匹配设置为0；(iv)匹配/错配评分设置为1，-2；(v)缺口成本设置为线性；以及(vi)用于低复杂度区域的过滤器。在一些实施方案中，用于NCBI网站上的BLASTP算法的算法参数包括：(i)期望阈值设置为10；(ii)字长设置为3；(iii)查询范围中的最大匹配设置为0；(iv)矩阵设置为BLOSUM62；(v)缺口成本设置为存在：11，延伸：1；以及(vi)条件成分评分矩阵调整。

通过确定待比较的序列对应的相同位置的数目，用这个数目除以比较的位置数目(例如，参考序列中的位置数目)，并将这个结果乘以100，获得百分比相同性。

在一些实施方案中，对参考序列整个长度的至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的区域给出相似性或相同性程度。例如，如果参考核酸序列由200个核苷酸组成，对至少约100、至少约120、至少约140、至少约160、至少约180或约200个核苷酸给出相同性程度，在一些实施方案中，连续核苷酸。在一些实施方案中，对参考序列的整个长度给出相似性或相同性程度。

根据本公开，同源氨基酸序列表现出氨基酸残基的至少40％、特别是至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％以及优选至少95％、至少98或至少99％相同性。

技术人员可以容易地制备本文描述的氨基酸序列变体，例如，通过重组DNA操作。例如，Sambrook等人(1989)详细描述了用于制备具有取代、添加、插入或缺失的肽或蛋白的DNA序列的操作。此外，本文描述的肽和氨基酸变体可以借助已知的肽合成技术容易地制备，例如，通过固相合成和相似方法。

在一实施方案中，氨基酸序列(肽或蛋白)的片段或变体优选是“功能片段”或“功能变体”。氨基酸序列的术语“功能片段”或“功能变体”是指表现出与其来源的氨基酸序列相同或相似的一种或多种功能特性的任何片段或变体，即，它是功能上等同的。关于结合剂如抗体，一种特定功能是片段或变体来源的氨基酸序列表现出的一种或多种结合活性。如本文所用，术语“功能片段”或“功能变体”特别是指这样的变体分子或序列，其包含与亲本分子或序列的氨基酸序列相比改变一个或多个氨基酸的氨基酸序列，并且仍能够完成亲本分子或序列的一种或多种功能，例如，结合靶分子。在一实施方案中，亲本分子或序列的氨基酸序列中的修饰不显著影响或改变分子或序列的特征。在不同实施方案中，功能片段或功能变体的功能可以降低但仍显著存在，例如，功能变体的结合可以是亲本分子或序列的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。但是，在其他实施方案中，与亲本分子或序列相比，可以增强功能片段或功能变体的结合。

氨基酸序列(肽、蛋白或多肽)“源自”指定氨基酸序列(肽、蛋白或多肽)是指第一氨基酸序列的来源。优选地，源自特定氨基酸序列的氨基酸序列具有与该特定氨基酸序列或其片段相同、基本上相同或同源的氨基酸序列。源自特定氨基酸序列的氨基酸序列可以是该特定序列或其片段的变体。例如，本领域普通技术人员会理解，可以改变适合用于本文的序列，从而它们的序列不同于其来源的天然存在的序列或天然序列，同时保留天然序列的期望活性。

如本文所用，“指导材料”或“说明书”包括可以用来传达本发明的组合物和方法的可用性的出版物、记录、图表或任何其他表达介质。本发明的试剂盒的指导材料可以例如粘帖至包含本发明的组合物的容器，或者与包含组合物的容器一起运输。或者，指导材料可以与容器分开运输，目的是指导材料和化合物由接受者合作使用。

“分离的”表示从自然状态改变或去除。例如，天然存在于活动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是从其自然状态的共存材料部分或完全分离的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白可以以基本上纯的形式存在，或者可以存在于非天然环境中，例如，宿主细胞。

在本发明的上下文中术语“重组”表示通过“遗传工程制备”。优选地，在本发明的上下文中“重组对象”如重组核酸不是天然存在的。

如本文所用的术语“天然存在”是指物体可以在自然中发现这一事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中且可以分离自自然来源并且尚未被人在实验室中有意修饰的肽或核酸是天然存在的。

如本文所用的“生理pH”是指约7.5的pH。

术语“遗传修饰”或简单地“修饰”包括用核酸转染细胞。术语“转染”涉及将核酸，特别是RNA，引入细胞。为了本发明的目的，术语“转染”还包括将核酸引入细胞或这种细胞摄取核酸，其中细胞可以存在于受试者中，例如，患者。因此，根据本发明，用于转染本文所述核酸的细胞可以存在于体外或体内，例如细胞可以形成器官的部分、组织和/或患者的生物体。根据本发明，转染可以是瞬时或稳定的。对于转染的一些应用，如果转染的遗传物质仅瞬时表达是足够的。可以将RNA转染入细胞以瞬时表达其编码的蛋白。因为转染过程中引入的核酸通常不整合入核基因组，外源核酸会通过有丝分裂稀释或降解。允许核酸的游离扩增的细胞大大降低稀释速率。如果期望转染的核酸实际上保留在细胞及其子细胞的基因组中，必须进行稳定转染。这种稳定的转染可以通过使用基于病毒的系统或基于转座子的系统进行转染来实现。通常，将编码结合剂如抗体的核酸瞬时转染入细胞。可以将RNA转染入细胞以瞬时表达其编码的蛋白。

冠状病毒

冠状病毒是有包膜的、正义的、单链RNA((+)ssRNA)病毒。它们具有已知RNA病毒中最大的基因组(26–32kb)，并且在系统发生上分为4个属(α、β、γ和δ)，而β冠状病毒进一步细分4个谱系(A、B、C和D)。冠状病毒感染广泛的鸟类和哺乳动物物种，包括人。一些人冠状病毒一般引起轻度呼吸道疾病，尽管在婴儿、老年人和免疫受损的人中严重程度可能更高。分别属于β冠状病毒谱系C和B的中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)和严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)具有高致病性。在过去15年内，这两种病毒都从动物宿主进入了人类群体，并且导致高病死率的爆发。SARS-CoV-2(MN908947.3)属于β冠状病毒谱系B。它与SARS-CoV具有至少70％序列相似性。

一般来说，冠状病毒具有4种结构蛋白，即，包膜(E)、膜(M)、核壳(N)和刺突(S)。E和M蛋白在病毒装配中具有重要功能，而N蛋白对于病毒RNA合成是必需的。关键糖蛋白S负责病毒结合和进入靶细胞。S蛋白合成为单链无活性前体，在生成细胞中被弗林蛋白酶样宿主蛋白酶切割为两个非共价结合的亚基S1和S2。S1亚基包含受体结合结构域(RBD)，其识别宿主细胞受体。S2亚基包含融合肽、两个七肽重复和跨膜结构域，需要所有这些以通过经历大的构象重排来介导病毒和宿主细胞膜的融合。S1和S2亚基三聚化形成大的融合前刺突。

SARS-CoV-2的S前体蛋白可以被蛋白水解切割为S1(685aa)和S2(588aa)亚基。S1亚基包含受体结合结构域(RBD)，其介导病毒通过宿主血管紧张素转化酶2(ACE2)受体进入敏感细胞。“RBD结构域”通常包含SEQ ID NO:197的氨基酸327-528的氨基酸序列。

结合剂

本公开描述了能够与冠状病毒刺突蛋白(S蛋白)的表位结合的抗体，如单特异性、二价抗体。此外，本公开描述了包含第一和第二结合结构域的双特异性或多特异性结合剂,其中所述第一结合结构域能够与冠状病毒刺突蛋白(S蛋白)结合，所述第二结合结构域能够与冠状病毒S蛋白结合，并且其中所述第一和第二结合结构域与所述冠状病毒S蛋白的不同表位结合。结合剂，包括本文所述的抗体，特别是与冠状病毒S蛋白的RBD结构域结合。

在一实施方案中，本文所述的结合剂或抗体是分离的。在一实施方案中，本文所述的结合剂或抗体是重组分子。

术语“表位”是指结合剂识别的分子或抗原如冠状病毒S蛋白的一部分或片段。例如，表位可以被抗体或任何其他结合蛋白识别。表位可以包括抗原的连续或不连续部分，并且可以长度为约5-约100，如约5-约50，更优选约8-约30，最优选约8-约25个氨基酸，例如，表位优选长度可以为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。在一实施方案中，表位长度为约10-约25个氨基酸。术语“表位”包括结构表位。

术语“免疫球蛋白”是指一类结构相关的糖蛋白，由两对多肽链组成，一对轻(L)低分子量链和一对重(H)链，所有四条链通过二硫键相互连接。免疫球蛋白的结构已得到很好的表征。参见例如Fundamental Immunology Ch.7(Paul,W.,ed.,2nd ed.Raven Press,N.Y.(1989))。简单地说，每条重链通常包含重链可变区(在本文中缩写为V_H或VH)和重链恒定区(在本文中缩写为C_H或CH)。重链恒定区通常包含3结构域CH1、CH2和CH3。铰链区是重链的CH1和CH2结构域之间的区域，具有高度柔性。铰链区的二硫键是IgG分子中两条重链之间相互作用的一部分。每条轻链通常包含轻链可变区(在本文中缩写为V_L或VL)和轻链恒定区(在本文中缩写为C_L或CL)。轻链恒定区通常包含一个结构域CL。VH和VL域可以进一步细分为高变性区域(或高变区，其可能在结构定义的环的序列和/或形式中是高变的)，也称作互补决定区(CDR)，散布于更保守的、称作框架区(FR)的区域中。每个VH和VL通常包含3个CDR和4个FR，从氨基-末端至羧基-末端按照以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(还参见Chothia and Lesk J.Mol.Biol.196,901-917(1987))。除非另有说明或与上下文相矛盾，本发明中提到的恒定区中的氨基酸位置是按照EU-编号(Edelman et al.,ProcNatl Acad Sci U S A.1969May；63(1):78-85；Kabat et al.,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Edition.1991NIH Publication No.91-3242)。一般来说，本文所述的CDR是Kabat定义的。

如本文所用的术语“对应于位置…的氨基酸”是指人IgG1重链中的氨基酸位置编号。其他免疫球蛋白中的相应氨基酸位置可以通过与人IgG1的比对找到。因此，一个序列中“对应于”另一个序列中的氨基酸或片段的氨基酸或片段是使用标准序列比对程序如ALIGN、ClustalW或类似程序，通常在默认设置下与另一氨基酸或片段对齐，并且与人IgG1重链具有至少50％、至少80％、至少90％或至少95％相同性的氨基酸或片段。如何比对序列或序列中的片段，从而确定本发明的氨基酸序列在序列中的相应位置在本领域中是公知的。

本发明的上下文中的术语“抗体”(Ab)是指免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的片段或其中任何一种的衍生物，其具有与抗原结合，优选特异性结合的能力。在一实施方案中，结合发生在典型的生理条件下，具有明显的时间半衰期，如至少约30分钟，至少约45分钟，至少约小时，至少约2小时，至少约4小时，至少约8小时，至少约12小时，约24小时或更多，约48小时或更多，约3、4、5、6、7天等，或者任何其他相关的功能定义的时间(如足以诱导、促进、增强和/或调节与抗原结合的抗体相关的生理反应的时间)。免疫球蛋白分子的重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。如本文所用，术语“抗原结合区”、“结合区”或“结合结构域”是指与抗原相互作用的区域或结构域，通常包括VH区和VL区。当在本文中使用时，术语抗体不仅包括单特异性抗体，而且还包括多特异性抗体，其包含多个，如两个或更多个，例如三个或更多个不同的抗原结合区。抗体(Ab)的恒定区可以介导免疫球蛋白结合至宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(如效应细胞)和补体系统的组分如C1q，补体激活经典途径中的第一组分。如上所述，除非另有说明或与上下文相矛盾，如本文所用的术语抗体包括抗体的片段，其是抗原结合片段，即，保留与抗原特异性结合的能力，以及抗体衍生物，即，衍生自抗体的构建体。已显示抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实现。术语“抗体”内涵盖的抗原结合片段的实例包括(i)Fab’或Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段，或者如WO2007059782(Genmab)中描述的单价抗体；(ii)F(ab')₂片段，包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，基本上由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，基本上由抗体单臂的VL和VH结构域组成，(v)dAb片段(Ward et al.,Nature 341,544-546(1989))，其基本上由VH结构域组成，也称作结构域抗体(Holt et al；Trends Biotechnol-.2003Nov；21(11):484-90)；(vi)骆驼(camelid)或纳米抗体(Nanobody)分子(Revets et al；Expert Opin Biol Ther.2005Jan；5(1):111-24)和(vii)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由不同基因编码，但是可以利用重组方法通过合成接头将它们连接，使得它们能够制备为单一蛋白链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称作单链抗体或单链Fv(scFv)，参见例如Birdetal.,Science 242,423-426(1988)和Huston et al.,PNAS USA85,5879-5883(1988))。除非另有说明或上下文明确指出，这类单链抗体涵盖在术语抗体内。虽然这类片段一般包括在抗体的含义内，但是它们共同且各自独立地成为本发明的独特特征，表现出不同的生物学特性和效用。在本发明的背景下，这些和其他有用的抗体片段，以及这类片段的双特异性形式，在本文中进一步讨论。还应当理解，除非另有说明，术语抗体还包括多克隆抗体，单克隆抗体(mAb)，抗体样多肽，如嵌合抗体和人源化抗体，以及通过任何已知技术，如酶切、肽合成和重组技术提供的保留与抗原特异性结合能力的抗体片段(抗原结合片段)。

短语“单链Fv”或“scFv”是指其中将传统双链抗体的重链和轻链的可变结构域(VH和VL)连接成一条链的抗体。任选地，在两条链之间插入接头(通常是肽)以允许适当的折叠和创建活性结合位点。

抗体可以具有任何同种型。如本文所用，术语“同种型”是指重链恒定区基因编码的免疫球蛋白类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM)。当本文提到特定同种型如IgG1时，该术语并不限于具体同种型序列，例如特定IgG1序列，而是用来表示与其他同种型相比，抗体在序列上更接近该同种型，例如IgG1。因此，例如本发明的IgG1抗体可以是天然存在的IgG1抗体的序列变体，包括恒定区中的变化。

在各种实施方案中，抗体是IgG1抗体，更特别是IgG1，κ或IgG1，λ同种型(即IgG1,κ,λ)，IgG2a抗体(例如IgG2a,κ,λ)，IgG2b抗体(例如IgG2b,κ,λ)，IgG3抗体(例如IgG3,κ,λ)或IgG4抗体(例如IgG4,κ,λ)。

如本文所用的术语“单克隆抗体”是指单一分子组成的抗体分子制品。单克隆抗体组合物显示出对特定表位的单一结合特异性和亲和性。因此，术语“人单克隆抗体”是指显示出单一结合特异性的抗体，其具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。人单克隆抗体可以由杂交瘤产生，杂交瘤包括获得自转基因或转染色体(transchromosomal)非人动物如转基因小鼠的B细胞，其基因组包含人重链转基因和轻链转基因，与永生化细胞融合。

如本文所用的术语“嵌合抗体”是指一种抗体，其中可变区源自非人物种(例如源自啮齿动物)，恒定区源自不同的物种，如人。开发用于治疗应用的嵌合单克隆抗体以减少抗体免疫原性。在嵌合抗体的上下文中使用的术语“可变区”或“可变结构域”是指包含免疫球蛋白重链和轻链的CDR和框架区的区域。可以通过使用如Sambrook et al.,1989,Molecular Cloning:A laboratory Manual,New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Ch.15所述的标准DNA技术产生嵌合抗体。嵌合抗体可以是遗传或酶促工程化的重组抗体。产生嵌合抗体在技术人员的知识范围内，因此，根据本发明产生嵌合抗体可以通过本文所述以外的其他方法进行。

如本文所用的术语“人源化抗体”是指遗传工程化的非人抗体，其含有人抗体恒定结构域和非人可变结构域，修饰所述非人可变结构域以与人可变结构域有高水平的序列同源性。这可以通过将共同形成抗体结合位点的6个非人抗体互补决定区(CDR)移植到同源的人受体框架区(FR)上来实现(参见WO92/22653和EP0629240)。为了完全重建亲本抗体结合亲和性和特异性，可能需要将来自亲本抗体(即非人抗体)的框架残基替换到人框架区中(回复突变)。结构同源性建模可能有助于识别框架区中对抗体的结合特性重要的氨基酸残基。因此，人源化抗体可以包含非人CDR序列，主要是人框架区任选包含一个或多个氨基酸回复突变为非人氨基酸序列，以及完全人恒定区。任选地，额外的氨基酸修饰(不必是回复突变)可以用于获得具有优选特征的人源化抗体，如亲和性和生化特性。

如本文所用的术语“人抗体”是指具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或者通过体内体细胞突变引入的突变)。但是，如本文所用，术语“人抗体”不意图包括这样的抗体，其中已将源自另一哺乳动物物种如小鼠或大鼠的种系的CDR序列移植至人框架序列上。人单克隆抗体可以通过各种技术制备，包括常规单克隆抗体方法，例如，Kohler and Milstein,Nature 256:495(1975)的标准体细胞杂交技术。虽然优选体细胞杂交方法，原则上，可以采用制备单克隆抗体的其他技术，例如，B-淋巴细胞的病毒或致癌性转化或者利用人抗体基因文库的噬菌体展示技术。用于制备分泌人单克隆抗体的杂交瘤的合适动物系统是小鼠系统。小鼠中的杂交瘤制备是非常成熟的方法。分离免疫的脾细胞用于融合的免疫方案和技术是本领域已知的。融合配对物(例如，小鼠骨髓瘤细胞)和融合方法也是已知的。因此人单克隆抗体可以使用携带部分人免疫系统而不是小鼠或大鼠系统的转基因或转染色体小鼠或大鼠来产生。因此，在一实施方案中，人抗体获得自转基因动物，如小鼠或大鼠，其携带人种系免疫球蛋白序列而不是动物免疫球蛋白序列。在这类实施方案中，抗体来源于引入动物体内的人种系免疫球蛋白序列，但最终的抗体序列是所述人种系免疫球蛋白序列通过体细胞超突变进一步修饰和通过内源性动物抗体机制的亲和力成熟的结果，参见例如Mendez et al.1997Nat Genet.15(2):146-56。在本文中使用时，除非与上下文相矛盾，术语“Fab-臂”、“结合臂”或“臂”包括一个重链-轻链对，并且在本文中与“半分子”可互换使用。

在抗体的上下文中使用时，术语“全长”表示所述抗体不是片段，而是包含自然界中通常发现的特定同种型的所有结构域，例如IgG1抗体的VH、CH1、CH2、CH3、铰链、VL和CL结构域。

在本文中使用时，除非与上下文相矛盾，术语“Fc区”是指由免疫球蛋白重链的两个Fc序列组成的抗体区域，其中所述Fc序列包含至少铰链区、CH2结构域和CH3结构域。

如本文所用，在抗体与预定抗原或表位结合的上下文中，术语“结合”或“能够结合”通常是以对应于约10^-7M或更小的K_D的亲和力结合，如约10^-8M或更小，如约10^-9M或更小，约10^-10M或更小，或者约10^-11M或更小，当使用生物层干涉法(BLI)确定时，或者例如，当使用表面等离子共振(SPR)技术在BIAcore 3000仪器中使用抗原作为配体和抗体作为分析物确定时。抗体与预定抗原结合的亲和力对应于比其与预定抗原或密切相关抗原以外的非特异性抗原(例如，BSA、酪蛋白)结合的亲和力至少低10倍的K_D，如至少低100倍，如至少低1,000倍，如至少低10,000倍，如至少低100,000倍。亲和力低的量取决于抗体的K_D，因此当抗体的K_D非常低时(即，抗体是高特异性的)，那么对抗原的亲和力低于对非特异性抗原的亲和力的程度可能是至少10,000倍。

如本文所用，术语“k_d”(sec^-1)是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率常数。所述值也称作k_off值。

如本文所用，术语“K_D”(M)是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。

本发明还设想包含本文所述抗体的VL区、VH区或者一个或多个CDR的功能变体的抗体。在抗体的背景中使用的VL、VH或CDR的功能变体仍然允许抗体保留“参考”或“亲本”抗体的至少相当一部分(至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多)的亲和力和/或特异性/选择性，在某些情况下，这样的抗体可能具有比亲本抗体更大的亲和力、选择性和/或特异性。

这类功能变体通常与亲本抗体保持显著的序列相同性。

示例性变体包括那些主要通过保守取代而与亲本抗体的VH和/或VL和/或CDR区不同的变体；例如，变体中多达10个，如9、8、7、6、5、4、3、2或1个取代是保守氨基酸残基置换。

本文所述抗体序列如VL区或VH区的功能变体，或者与本文所述抗体序列如VL区或VH区有一定程度的同源性或相同性的抗体序列，优选包含非CDR序列中的修饰或变化，而CDR序列优选保持不变。

如本文所用的术语“特异性”具有以下含义，除非与上下文相矛盾。如果两种抗体与相同抗原和相同表位结合，则它们具有“相同特异性”。

术语“竞争(compete)”和“竞争(competition)”可以指第一抗体和第二抗体之间对相同抗原的竞争。或者，术语“竞争(compete)”和“竞争(competition)”还可以指抗体和内源性配体之间竞争结合内源性配体的相应受体。如果抗体阻止内源性配体与其受体结合，则称这样的抗体阻断配体与其受体的内源性相互作用，因此与内源性配体竞争。本领域技术人员熟知如何测试抗体竞争结合靶抗原。这种方法的一个实例包括所谓的交叉竞争测定，其可以例如作为ELISA或通过流式细胞术进行。或者，可以使用生物层干涉法确定竞争。

竞争结合靶抗原的抗体可以结合抗原上的不同表位，其中表位相互之间非常接近，以至于与一个表位结合的第一抗体阻止第二抗体与另一表位的结合。然而，在其他情况下，两种不同抗体可以结合抗原上的相同表位，并且在竞争性结合测定中竞争结合。在本文中认为与相同表位结合的这类抗体具有相同特异性。因此，在一实施方案中，认为与相同表位结合的抗体与靶分子上的相同氨基酸结合。抗体与靶抗原上的相同表位结合可以通过本领域技术人员已知的标准丙氨酸扫描实验或抗体-抗原结晶实验来确定。优选地，与冠状病毒S蛋白的不同表位结合的抗体或结合结构域不相互竞争结合它们各自的表位。

如上所述，本领域已描述了各种形式的抗体。本发明的结合剂原则上可以包含任何同种型的抗体。同种型的选择通常由所需的Fc介导的效应子功能指导，如ADCC诱导，或者要求没有Fc介导的效应子功能的抗体(“惰性”抗体)。示例性同种型是IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。可以使用人轻链恒定区κ或λ中的任一个。本发明的抗体的效应子功能可以通过同种型转换来改变，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM抗体，用于各种治疗用途。在一实施方案中，本发明的抗体的两条重链都是IgG1同种型的，例如IgG1,κ。任选地，重链可以在铰链和/或CH3区中进行修饰，如本文其他地方所述。

优选地，每个抗原结合区或结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，并且其中所述可变区分别包含三个CDR序列，CDR1、CDR2和CDR3，以及四个框架序列，FR1、FR2、FR3和FR4。此外，优选地，抗体包含两个重链恒定区(CH)和两个轻链恒定区(CL)。

在一实施方案中，结合剂包括全长抗体，如全长IgG1抗体。

在其他实施方案中，结合剂包含抗体片段，如Fab’或Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段，如WO2007059782(Genmab)中描述的单价抗体，F(ab')₂片段，Fd片段，Fv片段，dAb片段，骆驼或纳米抗体，或者分离的互补决定区(CDR)。

在本发明的上下文中，术语“结合剂”是指能够与期望的抗原结合的任何物质(agent)。在本发明的某些实施方案中，结合剂是或包含抗体、抗体片段或任何其他结合蛋白，或者它们的任何组合。一个优选组合是抗体的组合，例如，全长抗体，与冠状病毒S蛋白的第一表位结合，特别是共价偶联至一个或多个如两个与冠状病毒S蛋白的不同表位结合的结合蛋白。在一实施方案中，结合蛋白包含ACE2蛋白的胞外域(ECD)或其变体，或者ACE2蛋白的ECD的片段或其变体。在一实施方案中，结合蛋白包含抗体片段如scFv。结合剂还可以包含合成的、修饰的或非天然存在的部分，特别是非肽部分。例如，这类部分可以连接期望的抗原结合功能或区域如抗体或抗体片段。在一实施方案中，结合剂是包含抗体结合CDR或可变区的合成构建体。

天然存在的抗体一般是单特异性的，即它们与单一抗原结合。本发明提供与冠状病毒S蛋白上的不同表位结合的结合剂。这类结合剂至少是双特异性或多特异性的，如三特异性、四特异性等。因此，结合剂可以包含如本文所述的两种或更多种抗体或其片段。特别地，本文所述的结合剂可以是人工蛋白，其包含两种不同抗体、一种抗体和一种不同抗体的片段以及两种不同抗体的片段(所述两种不同抗体的片段形成两个结合结构域)。

根据本发明，双特异性结合剂，特别是双特异性蛋白，如双特异性抗体是具有两种不同结合特异性并因此可以与两种表位结合的分子。特别地，如本文所用的术语“双特异性抗体”是指包含两个抗原结合位点的抗体，第一结合位点对第一表位具有亲和性，第二结合位点对不同于第一表位的第二表位具有结合亲和性。

本发明的上下文中的术语“双特异性”是指具有两个不同的抗原结合区与不同的表位结合的物质，特别是相同抗原上的不同表位，例如冠状病毒S蛋白。

“多特异性结合剂”是具有两种以上不同结合特异性的分子。

双特异性抗体的许多不同形式和用途是本领域已知的，并且由Kontermann；DrugDiscov Today,2015Jul；20(7):838-47和；MAbs,2012Mar-Apr；4(2):182-97进行了综述。

本发明的双特异性结合剂不限于任何特定的双特异性形式或生产方法。

可以用于本发明的双特异性抗体分子的实例包括：(i)具有两个臂的单一抗体，所述臂包含不同的抗原结合区；(ii)对两个不同表位具有特异性的单链抗体，例如，通过由额外的肽接头串联连接的两个scFv；(iii)双可变结构域抗体(DVD-Ig)，其中每条轻链和重链包含两个通过短肽连接串联的可变结构域(Wu et al.,Generation andCharacterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin(DVD-Ig^TM)Molecule,In:Antibody Engineering,Springer Berlin Heidelberg(2010))；(iv)化学连接的双特异性(Fab’)2片段；(v)Tandab，它是两个单链双抗体的融合物，导致对每个靶抗原有两个结合位点的四价双特异性抗体；(vi)flexibody，它是scFv与双抗体的组合，导致多价分子；(vii)所谓的“对接和锁定”分子，基于蛋白激酶A中的“二聚化和对接结构域”，当应用于Fab时，其可以产生三价双特异性结合蛋白，由连接至不同Fab片段的两个相同Fab片段组成的；(viii)所谓的蝎子分子，包含，例如，融合至人Fab-臂的两个末端的两个scFv；以及(ix)双抗体。

在本发明的一实施方案中，本发明的结合剂是双抗体或交叉体。在一实施方案中，本发明的结合剂是通过受控的Fab-臂交换获得的双特异性抗体(如WO2011131746(Genmab)中所述)。

本发明的不同类别的结合剂的实例包括但不限于：(i)具有互补的CH3结构域的IgG样分子，以迫使异源二聚化；(ii)重组IgG样双靶向分子，其中分子的两侧各自包含至少两种不同抗体的Fab片段或Fab片段的一部分；(iii)IgG融合分子，其中将全长IgG抗体与额外的Fab片段或Fab片段的一部分融合；(iv)Fc融合分子，其中将单链Fv分子或稳定的双抗体与重链恒定结构域、Fc区或其部分融合；(v)Fab融合分子，其中将不同的Fab-片段融合在一起，与重链恒定结构域、Fc区或其部分融合；以及(vi)基于ScFv和双抗体的和重链抗体(例如，结构域抗体、纳米抗体)，其中不同的单链Fv分子或不同的双抗体或不同的重链抗体(例如结构域抗体、纳米抗体)相互融合，或者与另一蛋白或载体分子融合至重链恒定区、Fc区或其部分。

具有互补的CH3结构域分子的IgG样分子的实例包括但不限于Triomab/Quadroma分子(Trion Pharma/Fresenius Biotech；Roche,WO2011069104)，所谓的旋钮入孔(Knobs-into-Holes)分子(Genentech,WO9850431)，CrossMAbs(Roche,WO2011117329)和静电匹配分子(Amgen,EP1870459和WO2009089004；Chugai,US201000155133；Oncomed,WO2010129304)，LUZ-Y分子(Genentech,Wranik et al.J.Biol.Chem.2012,287(52):43331-9,doi:10.1074/jbc.M112.397869.Epub 2012Nov 1)，DIG-体和PIG-体分子(Pharmabcine,WO2010134666,WO2014081202)，链交换工程结构域体(SEEDbody)分子(EMDSerono,WO2007110205)，Biclonics分子(Merus,WO2013157953)，FcΔAdp分子(Regeneron,WO201015792)，双特异性IgG1和IgG2分子(Pfizer/Rinat,WO11143545)，Azymetric支架分子(Zymeworks/Merck,WO2012058768)，mAb-Fv分子(Xencor,WO2011028952)，二价双特异性抗体(WO2009080254)以及

分子(Genmab,WO2011131746)。

重组IgG样双靶向分子的实例包括但不限于双靶向(DT)-Ig分子(WO2009058383)，二合一抗体(Genentech；Bostrom,et al 2009.Science 323,1610–1614.)，交联Mab(Karmanos Cancer Center)，mAb2(F-Star,WO2008003116)，Zybody分子(Zyngenia；LaFleur et al.MAbs2013Mar-Apr；5(2):208-18)，具有共同轻链的方法(Crucell/Merus,US7,262,028)，κλBodies(NovImmune,WO2012023053)以及CovX-体(CovX/Pfizer；Doppalapudi,V.R.,et al 2007.Bioorg.Med.Chem.Lett.17,501–506.)。

IgG融合分子的实例包括但不限于双可变结构域(DVD)-Ig分子(Abbott,US7,612,181)，双结构域双头抗体(Unilever；Sanofi Aventis,WO20100226923)，IgG样双特异性分子(ImClone/Eli Lilly,Lewis et al.Nat Biotechnol.2014Feb；32(2):191-8)，Ts2Ab(MedImmune/AZ；Dimasi et al.J Mol Biol.2009Oct 30；393(3):672-92)和BsAb分子(Zymogenetics,WO2010111625)，HERCULES分子(Biogen Idec,US007951918)，scFv融合分子(Novartis)，scFv融合分子(Changzhou Adam Biotech Inc,CN 102250246)以及TvAb分子(Roche,WO2012025525,WO2012025530)。

Fc融合分子的实例包括但不限于ScFv/Fc融合物(Pearce et al.,Biochem MolBiol Int.1997Sep；42(6):1179-88)，SCORPION分子(Emergent BioSolutions/Trubion,Blankenship JW et al.AACR 100th Annual meeting 2009(Abstract#5465)；Zymogenetics/BMS,WO2010111625)，双亲和重定向技术(Fc-DART)分子(MacroGenics,WO2008157379,WO2010080538)以及双(ScFv)2-Fab分子(National Research Center forAntibody Medicine–China)。

Fab融合双特异性抗体的实例包括但不限于F(ab)2分子(Medarex/AMGEN；Deo etal J Immunol.1998Feb 15；160(4):1677-86.)，双作用或双Fab分子(Genentech,Bostrom,et al2009.Science 323,1610–1614.)，Dock-and-Lock(DNL)分子(ImmunoMedics,WO2003074569,WO2005004809)，二价双特异性分子(Biotecnol,Schoonjans,JImmunol.2000Dec 15；165(12):7050-7.)以及Fab-Fv分子(UCB-Celltech,WO 2009040562A1)。

基于ScFv、双抗体和结构域抗体的实例包括但不限于双特异性T细胞参与器(BiTE)分子(Micromet,WO2005061547)，串联双抗体分子(TandAb)(Affimed)Le Gall etal.,Protein Eng Des Sel.2004Apr；17(4):357-66.)，双亲和重定向技术(DART)分子(MacroGenics,WO2008157379,WO2010080538)，单链双抗体分子(Lawrence,FEBSLett.1998Apr3；425(3):479-84)，TCR样抗体(AIT,ReceptorLogics)，人血清白蛋白ScFv融合物(Merrimack,WO2010059315)和COMBODY分子(Epigen Biotech,Zhu et al.ImmunolCell Biol.2010Aug；88(6):667-75.)，双靶向纳米抗体(Ablynx,Hmila et al.,FASEBJ.2010)以及双靶向重链唯一结构域抗体。

在一方面，本发明的双特异性抗体包含第一Fc序列和第二Fc序列，所述第一Fc序列包含第一CH3区，所述第二Fc序列包含第二CH3区，其中所述第一和第二CH3区的序列不同，并且使得所述第一和第二CH3区之间的异源二聚体相互作用强于所述第一和第二CH3区各自的同源二聚体相互作用。WO2011131746和WO2013060867(Genmab)提供了关于这些相互作用的更多细节以及如何实现这些相互作用，其援引加入本文。

本发明的双特异性抗体的制备可以使用传统方法如杂交瘤和化学缀合方法(Marvin and Zhu(2005)Acta Pharmacol Sin 26:649)。在宿主细胞中共表达两种抗体，由不同重链和轻链组成，除了期望的双特异性抗体，还导致可能的抗体产物的混合物，然后可以通过例如亲和层析或类似方法分离。

在共表达不同抗体构建体时，还可以使用有利于形成功能性双特异性产物的策略，例如Lindhofer等人描述的方法(1995J Immunol 155:219)。产生不同抗体的大鼠和小鼠杂交瘤的融合导致有限数量的异源二聚体蛋白，因为优先的物种限制的重/轻链配对。促进异源二聚体形成而不是同源二聚体的另一策略是“旋钮入孔”策略，其中在第一重链肽上引入突起，在第二重链肽上引入相应的空腔，这样突起可以被定位在这两条重链界面的空腔中，从而促进异源二聚体形成并阻碍同源二聚体形成。通过用较大的侧链从第一多肽的界面代替小氨基酸侧链来构建“突起”。通过用较小的氨基酸侧链代替大氨基酸侧链在第二多肽的界面上产生与突起相同或相似大小的补偿“空腔”(美国专利5,731,168)。EP1870459(Chugai)和WO2009089004(Amgen)描述了在宿主细胞中共表达不同抗体结构域时有利于异源二聚体形成的其他策略。在这些方法中，用带电荷的氨基酸代替两个CH3结构域中形成CH3-CH3界面的一个或多个残基，从而使同源二聚体形成在静电上不利，而异源二聚化在静电上有利。WO2007110205(Merck)描述了另一策略，其中利用IgA和IgG CH3结构域之间的差异来促进异源二聚化。

WO2008119353(Genmab)中描述了另一种产生双特异性抗体的体外方法，其中双特异性抗体是通过两个单特异性IgG4-或IgG4-样抗体在还原条件下温育时的“Fab-臂”或“半分子”交换(重链和连接的轻链互换)形成的。得到的产物是具有两个Fab臂的双特异性抗体，这两个Fab臂可能包含不同序列。

术语“双特异性抗体”包括双抗体。双抗体是二价的双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单一多肽链上表达，但是使用很短的接头而不允许相同链上的两个结构域之间配对，从而强迫结构域与另一链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点(参见例如，Holliger,P.,et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448；Poljak,R.J.,et al.(1994)Structure 2:1121-1123)。双特异性抗体还包括双特异性单链抗体。术语“双特异性单链抗体”表示包含两个结合结构域的单个多肽链。特别地，本发明的术语“双特异性单链抗体”或“单链双特异性抗体”或相关术语优选表示将至少两个抗体可变区连接在单个多肽链中，不含完整免疫球蛋白中存在的恒定和/或Fc部分而产生的抗体构建体。例如，双特异性单链抗体可以是这样的构建体，其具有总计两个抗体可变区，例如两个VH区，每个能够与单独的表位特异性地结合，并且通过短的多肽间隔物相互连接，从而使两个抗体可变区与它们之间的间隔物作为单个连续多肽链存在。双特异性单链抗体的另一实例可以是具有三个抗体可变区的单个多肽链。这里，两个抗体可变区，例如一个VH和一个VL，可以形成scFv，其中两个抗体可变区通过合成的多肽接头相互连接，后者通常是遗传工程化的，以便达到最小免疫原性，同时保持最大的抗蛋白水解能力。这个scFv能够与特定表位特异性地结合，并且连接至另一抗体可变区，例如VH区，能够结合与scFv结合的不同的表位。双特异性单链抗体的另一实例可以是具有四个抗体可变区的单个多肽链。这里，前两个抗体可变区，例如VH区和VL区，可以形成一个scFv，能够与一个表位结合，而第二VH区和VL区可以形成第二scFv，能够与另一个表位结合。在单个连续多肽链内，一个特异性的单个抗体可变区可以有利地被合成的多肽接头分开，而各自的scFv可以有利地被如上文所述的短多肽间隔物分开。根据一实施方案，双特异性抗体的第一结合结构域包含一个抗体可变结构域，优选VHH结构域。根据本发明的一实施方案，双特异性抗体的第一结合结构域包含两个抗体可变结构域，优选scFv，即VH-VL或VL-VH。根据本发明的一实施方案，双特异性抗体的第二结合结构域包含一个抗体可变结构域，优选VHH结构域。根据本发明的一实施方案，双特异性抗体的第二结合结构域包含两个抗体可变结构域，优选scFv，即VH-VL或VL-VH。在其最小形式中，本发明的双特异性抗体的抗体可变区的总数因此只有两个。例如，这样的抗体可以包含两个VH或两个VHH结构域。根据一实施方案，双特异性抗体的第一结合结构域和第二结合结构域各自包含一个抗体可变结构域，优选VHH结构域。根据一实施方案，双特异性抗体的第一结合结构域和第二结合结构域各自包含两个抗体可变结构域，优选scFv，即VH-VL或VL-VH。在这个实施方案中，结合剂优选包含(i)第一抗体的重链可变结构域(VH)，(ii)第一抗体的轻链可变结构域(VL)，(iii)第二抗体的重链可变结构域(VH)以及(iv)第二抗体的轻链可变结构域(VL)。

在一实施方案中，本发明的双特异性分子包含两个Fab区，各自针对冠状病毒S蛋白的不同表位。在一实施方案中，本发明的分子是抗原结合片段(Fab)2复合物。Fab2复合物包含两个Fab片段，一个Fab片段包含Fv结构域，即VH和VL结构域，对冠状病毒S蛋白的一个表位有特异性，另一个Fab片段包含对冠状病毒S蛋白的另一个表位有特异性的Fv结构域。每个Fab片段可以包含两条单链，VL-CL模块和VH-CH模块。或者，每个单独的Fab片段可以排列在单链中，优选VL-CL-CH-VH，并且单独的可变和恒定结构域可以用肽接头连接。一般来说，单独的单链和Fab片段可以通过二硫键、粘合结构域、化学连接和/或肽接头连接。双特异性分子还可以包含两个以上的Fab片段，特别地，所述分子可以是Fab3、Fab4，或者对2、3、4或更多个不同表位具有特异性的多聚体Fab复合物。本发明还包括化学连接的Fab。

在一实施方案中，本发明的结合剂包括各种类型的二价和三价单链可变片段(scFv)，模仿两种抗体可变结构域的融合蛋白。可以通过连接两个scFv工程化二价(或双价)单链可变片段(二-scFv、双-scFv)。这可以通过用两个VH和两个VL区制备单肽链进行，产生串联scFv。本发明还包括含有两个以上scFv结合结构域的多特异性分子。这使得该分子可能包括多种抗原特异性，并且是三特异性、四特异性或多特异性分子，或者该分子是包含一个以上对相同抗原具有特异性的scFv结合结构域的双特异性分子。特别地，本发明的分子可以是多特异性单链Fv。

另一种可能性是产生具有接头肽的scFv，所述接头肽太短，两个可变区无法折叠在一起(约5个氨基酸)，迫使scFv二聚化。这种类型称作双抗体。更短的接头(一个或两个氨基酸)导致形成三聚体，即所谓的三链抗体(triabody)或三体(tribody)。四体(Tetrabody)也已产生。它们对其靶标表现出比双抗体更高的亲和力。

双特异性抗体片段的特别优选的实例包括双抗体(Kipriyanov,Int.J.Cancer 77(1998),763-772)，它是一种小的双价和双特异性抗体片段。双抗体包含同一多肽链(VH-VL)上的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，这两个结构域通过肽接头连接，所述肽接头太短，不允许在同一链上的两个结构域之间配对。这迫使其与另一条链的互补结构域配对，并且促进具有两个功能性抗原结合位点的二聚体分子的组装。

在一实施方案中，本发明的双特异性或多特异性分子包含免疫球蛋白的可变(VH,VL)和恒定结构域(C)。在一实施方案中，双特异性分子是微抗体(minibody)，优选包含通过每条链的恒定结构域(C)相互连接的两条单一VH-VL-C链的微抗体。根据这个方面，将相应的可变重链区(VH)、相应的可变轻链区(VL)和恒定结构域(C)从N-末端到C-末端按照VH(表位1)-VL(表位1)-(C)和VH(表位2)-VL(表位2)-C的顺序排列，其中C优选是CH3结构域，表位1是指冠状病毒S蛋白的第一表位，表位2是指冠状病毒S蛋白的第二表位。恒定结构域的配对导致微抗体的形成。

根据另一方面，本发明的双特异性结合剂为双特异性单链抗体构建体的形式，其中所述构建体包含或由至少两个结合结构域组成。在一实施方案中，每个结合结构域包含一个来自抗体重链的可变区(“VH区”)，其中第一结合结构域的VH区与冠状病毒S蛋白的表位1特异性地结合，第二结合结构域的VH区与冠状病毒S蛋白的表位2特异性地结合。两个结合结构域任选地通过短多肽间隔物相互连接。每个结合结构域可以额外地包含一个来自抗体轻链的可变区(“VL区”)，每个第一和第二结合结构域内的VH区和VL区通过足够长的肽接头相互连接，以允许第一结合结构域的VH区和VL区以及第二结合结构域的VH区和VL区相互配对。

在一实施方案中，本文所述的结合剂包含抗体，例如，全长抗体，其包含第一结合结构域。在一实施方案中，本文所述的结合剂包含抗体片段如scFv，其包含第二结合结构域，与包含第一结合结构域的抗体共价连接。在一实施方案中，结合剂包含与抗体轻链的N-末端或C-末端共价连接的抗体片段，如scFv。

在一实施方案中，本文所述的结合剂包含抗体，例如，全长抗体，其包含第一结合结构域。在一实施方案中，本文所述的结合剂包含ACE2蛋白的胞外域(ECD)或其变体，或者ACE2蛋白的ECD的片段或其变体，其包含第二结合结构域，所述第二结合结构域与包含第一结合结构域的抗体共价连接。在一实施方案中，结合剂包含ACE2蛋白的胞外域(ECD)或其变体，或者ACE2蛋白的ECD的片段或其变体，与抗体轻链的N-末端或C-末端共价连接。

抗体和抗体片段或者ACE2蛋白的胞外域(ECD)或其变体，或者ACE2蛋白的ECD的片段或其变体可以通过GS-接头如(Gly4Ser)1、(Gly4Ser)2、(Gly4Ser)3、(Gly4Ser)4或(Gly4Ser)5连接。

血管紧张素转换酶2(ACE2)属于二肽基羧肽酶的血管紧张素转换酶家族，是一种跨膜蛋白，存在于大多数器官中，在心血管系统、肠道、肾和肺中检测到最高水平的ACE2。最主要的是，ACE2附着在肺II型肺泡细胞、小肠的肠上皮细胞、动脉和静脉内皮细胞以及动脉平滑肌细胞的细胞膜上。ACE2是肾素-血管紧张素系统(RAS)的关键调节因子，并且作为血管紧张素转换酶1(ACE)活性的平衡因子。通过ACE活性切割血管紧张素I导致血管紧张素II的产生，这触发强烈的血管收缩、炎症、细胞增殖、肥大和纤维化。ACE2催化血管紧张素II裂解为血管紧张素1-7，血管紧张素1-7活性通过促进血管舒张和心脏保护而导致对血管紧张素II的不利影响的平衡。因此，ACE2对RAS诱导的损伤具有保护作用，并且ACE2的部分丧失与心脏病的易感性增加有关，而在患有肺动脉高血压的患者中静脉输注重组人ACE2的临床试验导致血浆血管紧张素II/血管紧张素1-7比例的降低和治疗效果。此外，已显示ACE2在肺部损伤中发挥保护作用。小鼠急性呼吸窘迫综合征(ARDS)模型显示ACE2表达的缺失导致血管通透性增强，肺水肿加重和肺功能恶化，而用具有催化活性的重组ACE2蛋白治疗会改善野生型和ACE2敲除小鼠中的急性肺损伤症状。此外，一旦呼吸系统疾病过程开始，ACE2和肾素-血管紧张素的其他组分可能在控制急性肺衰竭的严重程度方面发挥核心作用。

ACE2是805个氨基酸的I型跨膜蛋白，包含短的细胞质结构域、跨膜结构域和大的胞外结构域。ACE2的催化结构域位于胞外结构域的胞外域(ECD)，导致ACE2活性位点处于代谢循环肽如血管紧张素II的状态。人ACE2的胞外区包含两个结构域，锌金属肽酶结构域(残基19-611)和位于C-末端的第二结构域(残基612-740)。金属肽酶结构域可以进一步分为两个催化亚结构域，N-末端亚结构域I和C-末端亚结构域II，这两个亚结构域在活性部位裂缝的底部连接。多个氨基酸残基已鉴定为在ACE2底物结合和活性中发挥重要作用。例如，Arg273与ACE2抑制剂MLN-4760的C-末端形成盐桥，因此推测Arg273参与结合ACE2底物的C-末端。将Arg273突变为谷氨酰胺(R273Q)导致该位置的侧链从正电荷变为中性电荷，导致ACE2活性丧失，表明Arg273的正电荷侧链对底物结合至关重要。另一个氨基酸残基His345通过作为关键氢键供体/受体在ACE2活性中发挥重要作用，并且已证明与MLN-4760的C-末端和仲胺基团形成氢键。将His345突变为亮氨酸(H345L)导致与野生型ACE2相比时，活性降低约300倍。最后，另外两个氨基酸残基His374和His378是构成锌配位球的三个氨基酸中的两个，因此在协调ACE2的锌结合位点中发挥至关重要的作用。

2003年，ACE2鉴定为严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV-1)的受体和严重急性呼吸综合征(SARS)发病机制的重要因子。ACE2 ECD的区域，包括第一α-螺旋和Lys353以及β-折叠5的N-末端近端残基，以高亲和力与SARS-CoV-1刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)相互作用。SARS-CoV-1刺突蛋白和细胞相关的ACE2蛋白之间的这种相互作用是SARS-CoV-1活性的关键组成部分，并且与SARS-CoV-1感染人气道上皮有关。此外，SARS-CoV-1与ACE2的结合通过ACE2内吞作用导致细胞表面ACE2减少，SARS-CoV-1和ACE2脱落，从而导致失去ACE2介导的组织保护作用。与SARS-CoV-1RBD相比，新型严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的RBD表现出73％相似性，并且还被证明与ACE2结合以促进病毒进入细胞。与SARS-CoV-1相似，SARS-CoV-2通过其刺突蛋白的RBD与ACE2蛋白结合。然而，SARS-CoV-1和SARS-CoV-2的受体结合基序(RBM)在ACE2结合脊中环的构象上存在结构差异。这些结构差异导致SARS-CoV-2RBM中的Asn487和Ala475之间形成额外的主链氢键，导致脊的构象更加紧凑，并且含有Ala475的环向ACE2靠近。与SARS-CoV-1RBM相比，这种差异通过更多的额外氢键使SARS-CoV-2RBM与ACE2的N-末端螺旋之间产生更多接触。因此，与SARS-CoV-1RBM和ACE2的相互作用相比，SARS-CoV-2RBM形成更大的结合界面，与ACE2的接触更多，结合更有利，一些研究表明与SARS-CoV-1RBM相比，它对ACE2的结合亲和力高出10–20倍。

在一实施方案中，术语“ACE2”或“ACE2蛋白”涉及人ACE2或其变体，或者ACE2的片段或其变体。在一实施方案中，“ACE2”或“ACE2蛋白”包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列，与SEQ ID NO:130的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:130的氨基酸序列的片段，或者与SEQ ID NO:130的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列。在一实施方案中，“ACE2”或“ACE2蛋白”包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列。

在一实施方案中，术语“ACE2的胞外域”、“ACE2蛋白的胞外域”、“ACE2胞外域”或相似术语涉及ACE2的胞外域或其变体，或者ACE2的胞外域的片段或其变体。

在一实施方案中，术语“ACE2的胞外域”涉及人ACE2的胞外域或其变体，或者人ACE2的胞外域的片段或其变体。在一实施方案中，ACE2的胞外域包含SEQ ID NO:130的氨基酸18-615的氨基酸序列，与SEQ ID NO:130的氨基酸18-615的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:130的氨基酸18-615的氨基酸序列的片段，或者与SEQ ID NO:130的氨基酸18-615的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列。在一实施方案中，ACE2的胞外域包含SEQ ID NO:130的氨基酸18-615的氨基酸序列。

ACE2的胞外域或其变体，或者ACE2的胞外域的片段或其变体可以包含例如避免酶促活性和/或底物结合的修饰。

因此，在一实施方案中，ACE2的胞外域或其变体，或者ACE2的胞外域的片段或其变体被修饰，使ACE2的胞外域或其变体，或者ACE2的胞外域的片段或其变体发挥酶促活性和/或结合底物的程度相对于除了不含修饰，其他相同的ACE2的胞外域或其变体，或者ACE2的胞外域的片段或其变体要低。

可以修饰的氨基酸位置的实例包括位置R273、H345、H374和H378。

因此，在一实施方案中，对应于R273、H345、H374和H378的至少一个位置中的氨基酸可以分别是Q、L、N和N。在一实施方案中，对应于R273、H345、H374和H378的位置中的氨基酸是Q、L、N和N。

在一实施方案中，ACE2的胞外域包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列，与SEQ ID NO:129的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:129的氨基酸序列的片段，或者与SEQ ID NO:129的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列。在一实施方案中，ACE2的胞外域包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列。

在一实施方案中，ACE2的胞外域或其变体，或者ACE2的胞外域的片段或其变体与冠状病毒S蛋白结合。

在本发明的一些实施方案中，除了抗原结合区，本发明的结合剂还包含由两条重链的Fc序列组成的Fc区。

第一和第二Fc序列可以是任何同种型，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，并且可以包含一个或多个突变或修饰。在一实施方案中，第一和第二Fc序列各自是IgG4同种型或由其衍生而来，任选地具有一个或多个突变或修饰。在另一实施方案中，第一和第二Fc序列各自是IgG1同种型或由其衍生而来，任选地具有一个或多个突变或修饰。在另一实施方案中，Fc序列中的一个是IgG1同种型，另一个是IgG4同种型，或者由这些各自的同种型衍生而来，任选地具有一个或多个突变或修饰。

在本发明的一实施方案中，一个或两个Fc序列是效应子功能缺陷的。例如，Fc序列可以是IgG4同种型，或者非IgG4类型，例如IgG1、IgG2或IgG3，已将其突变，从而使介导效应子功能如ADCC的能力降低或甚至消除。例如Dall'Acqua WF et al.,JImmunol.177(2):1129-1138(2006)和Hezareh M,J Virol.；75(24):12161-12168(2001)中已描述这类突变。在另一实施方案中，一个或两个Fc序列包含IgG1野生型序列。

本发明的上下文中的术语“效应子功能”包括由免疫系统的组分介导的任何功能，其导致例如杀死病变细胞如肿瘤细胞，或者抑制肿瘤生长和/或抑制肿瘤发展，包括抑制肿瘤传播和转移。优选地，本发明的上下文中的效应子功能是T细胞介导的效应子功能。这类功能包括ADCC、ADCP或CDC。

抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是指细胞毒性效应细胞通过非吞噬过程杀伤抗体包被的靶细胞，其特征在于细胞毒性颗粒内容物的释放或细胞死亡诱导分子的表达。ADCC独立于免疫补体系统，免疫补体系统也裂解靶标，但是不需要任何其他细胞。ADCC是通过靶标结合抗体(属于IgG或IgA或IgE类别)与某些Fc受体(FcR)的相互作用触发的，Fc受体(FcR)是存在于效应细胞表面的糖蛋白，结合免疫球蛋白(Ig)的Fc区。介导ADCC的效应细胞包括自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和树突细胞。ADCC是一种快速效应子机制，其效力取决于许多参数(靶细胞表面上抗原的密度和稳定性；抗体亲和力和FcR-结合亲和力)。涉及人IgG1(治疗性抗体中使用最多的IgG亚类)的ADCC高度依赖于其Fc部分的糖基化谱和Fcγ受体的多态性。

抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)是许多抗体疗法的一个关键作用机制。它定义为一个高度调节的过程，抗体通过将其Fc结构域连接至吞噬细胞上的特定受体，并引发吞噬作用，从而消除结合的靶标。与ADCC不同，ADCP可以由单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和树突细胞通过FcγRIIa、FcγRI和FcγRIIIa介导，其中巨噬细胞上的FcγRIIa(CD32a)代表主要途径。

补体依赖性细胞毒性(CDC)是另一种可以由抗体引导的细胞杀伤方法。IgM是补体激活的最有效同种型。IgG1和IgG3在通过经典的补体激活途径引导CDC方面也都非常有效。优选地，在这个级联中，抗原-抗体复合物的形成导致参与的抗体分子如IgG分子的C_H2结构域上近距离的多个C1q结合位点暴露(C1q是补体C1的三个子成分之一)。优选地，这些暴露的C1q结合位点将以前低亲和力的C1q-IgG相互作用转化为高亲和力的C1q-IgG相互作用，这触发一系列涉及其他补体蛋白的事件，并且导致效应细胞趋化/激活剂C3a和C5a的蛋白水解释放。优选地，补体级联以膜攻击复合物的形成而结束，该复合物在细胞膜上产生空隙，促进水和溶质自由进出细胞。

本发明的抗体(任选作为双特异性或多特异性结合剂的一部分)可以包含Fc区中的修饰。当抗体包含这类修饰时，它可能成为惰性或非激活的抗体。如本文所用的术语“惰性”、“惰性的”或“非激活的”是指Fc区，其至少不能结合任何Fcγ受体，不能诱导Fc介导的FcR的交联，或不能通过单个抗体的两个Fc区诱导FcR介导的靶抗原的交联，或者不能结合C1q。人源化或嵌合CD137或PD-L1抗体的Fc区的惰性有利地使用单特异性形式的抗体进行测试。

可以构建几个变体以使抗体的Fc区失去与Fcγ(gamma)受体和C1q相互作用的活性，用于治疗性抗体开发。本文描述了这类变体的实例。

因此，在一实施方案中，抗体包含第一和第二重链，其中一条或两条重链被修饰，使得抗体诱导Fc介导的效应子功能的程度相对于除了包含未修饰的第一和第二重链之外相同的抗体要低。Fc介导的效应子功能可以通过确定与Fcγ受体结合、与C1q结合或诱导Fc介导的FcR交联来测量。

在一实施方案中，已对重链和轻链恒定序列进行修饰，从而使C1q与抗体的结合与未修饰的抗体相比减少至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或100％，其中C1q结合通过ELISA来确定。

因此，可以修饰在与C1q和Fcγ受体的相互作用中起主导作用的Fc区中的氨基酸。

例如在IgG1同种型抗体中，可以修饰的氨基酸位置的实例包括位置L234和L235。

因此，在一实施方案中，对应于L234和L235的至少一个位置中的氨基酸可以分别是A和A。此外，L234F和L235E氨基酸取代可以导致Fc区与Fcγ受体和C1q的相互作用消失(Canfield et al.,1991,J.Exp.Med.(173):1483-91；Duncan et al.,1988,Nature(332):738-40)。因此，在一实施方案中，对应于L234和L235的位置中的氨基酸可以分别是F和E。D265A氨基酸取代可以减少与所有Fcγ受体的结合并防止ADCC(Shields et al.,2001,J.Biol.Chem.(276):6591-604)。因此，在一实施方案中，对应于D265的位置中的氨基酸可以是A。通过突变位置D270、K322、P329和P331可以消除与C1q的结合。将这些位置突变为D270A或K322A或P329A或P331A可以使抗体缺乏CDC活性(Idusogie EE,et al.,2000,JImmunol.164:4178-84)。因此，在一实施方案中，对应于D270、K322、P329和P331的至少一个位置中的氨基酸可以分别是A、A、A和A。

最小化Fc区与Fcγ受体和C1q的相互作用的一种可选方法是通过去除抗体的糖基化位点。将位置N297突变为例如Q、A或E去除对IgG-Fcγ受体相互作用至关重要的糖基化位点。因此，在一实施方案中，对应于N297的位置中的氨基酸可以是G、Q、A或E(Leabman etal.,2013,MAbs；5(6):896-903)。另一种最小化Fc区与Fcγ受体的相互作用的可选方法可以通过以下突变获得；P238A、A327Q、P329A或E233P/L234V/L235A/G236del(Shields etal.,2001,J.Biol.Chem.(276):6591-604)。

另外，据认为人IgG2和IgG4亚类在与C1q和Fcγ受体相互作用方面天然受损，尽管已报道它们与Fcγ受体的相互作用(Parren et al.,1992,J.Clin Invest.90:1537-1546；Bruhns et al.,2009,Blood 113:3716-3725)。消除这些残余相互作用的突变可以在两种同种型中进行，从而减少与FcR结合相关的不必要的副作用。对于IgG2，这些包括L234A和G237A，而对于IgG4，包括L235E。因此，在一实施方案中，人IgG2重链中对应于L234和G237的位置中的氨基酸可以分别是A和A。在一实施方案中，人IgG4重链中对应于L235的位置中的氨基酸可以是E。

进一步最小化IgG2抗体中与Fcγ受体和C1q相互作用的其他方法包括WO2011066501和Lightle,S.,et al.,2010,Protein Science(19):753-62中描述的那些方法。

抗体的铰链区在与Fcγ受体和补体的相互作用方面也很重要(Brekke et al.,2006,JImmunol 177:1129-1138；Dall’Acqua WF,et al.,2006,J Immunol 177:1129-1138)。因此，铰链区的突变或缺失可以影响抗体的效应子功能。

在一实施方案中，抗体包含第一和第二免疫球蛋白重链，其中在所述第一和第二免疫球蛋白重链的至少一个中，对应于人IgG1重链中位置L234、L235、D265、N297和P331的位置中的一个或多个氨基酸分别不是L、L、D、N和P。

在一实施方案中，在第一和第二重链中，对应于人IgG1重链中位置L234、L235、D265、N297和P331的位置中的一个或多个氨基酸分别不是L、L、D、N和P。

在本发明的一实施方案中，在所述第一和第二重链中，对应于人IgG1重链中位置D265的位置中的氨基酸不是D。

因此，在本发明的一实施方案中，在所述第一和第二重链中，对应于人IgG1重链中位置D265的位置中的氨基酸选自：A和E。

在本发明的另一实施方案中，在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链中位置L234和L235的位置中的氨基酸分别不是L和L。

在本发明的一个特定实施方案中，在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链中位置L234和L235的位置中的氨基酸分别是F和E。

在本发明的一实施方案中，在所述第一和第二重链中，对应于人IgG1重链中位置L234和L235的位置中的氨基酸分别是F和E。

在本发明的一个特定实施方案中，在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链中位置L234、L235和D265的位置中的氨基酸分别是F、E和A。

在本发明的一个特别优选的实施方案中，在所述第一和第二重链中，对应于人IgG1重链中位置L234、L235和D265的位置中的氨基酸分别是F、E和A。

本发明的抗体可以包含修饰，特别是在Fc区中，增加抗体的稳定性。因此，在一实施方案中，抗体包含第一和第二重链，其中一条或两条重链被修饰，使得抗体的稳定性相对于除了包含未修饰的第一和第二重链之外相同的抗体而言得到提高。例如在IgG1同种型抗体中，可以修饰的氨基酸位置的实例包括位置M428和N434。

因此，在一实施方案中，对应于M428和N434的至少一个位置中的氨基酸可以分别是L和S。在一实施方案中，对应于M428和N434的位置中的氨基酸可以是L和S。

根据某些实施方案，本文所述结合剂或抗体的多肽链可以包含信号肽。

这类信号肽是这样的序列，其通常显示约15-30个氨基酸的长度，并且优选位于多肽链的N-末端，但不限于此。如本文定义的信号肽优选允许将例如RNA编码的多肽链转运至限定的细胞区室，优选细胞表面、内质网(ER)或内体-溶酶体区室。

如本文定义的信号肽序列包括但不限于免疫球蛋白的信号肽序列，例如，免疫球蛋白重链可变区的信号肽序列或免疫球蛋白轻链可变区的信号肽序列，其中所述免疫球蛋白可以是人免疫球蛋白。

在另一实施方案中，将本文所述的结合剂或抗体连接或缀合至一个或多个治疗部分，如细胞因子、免疫抑制剂、免疫刺激分子和/或放射性同位素。这类缀合物在本文中称作“免疫缀合物”或“药物缀合物”。包括一种或多种细胞毒素的免疫缀合物称作“免疫毒素”。

在一实施方案中，将第一和/或第二Fc序列与药物或前药缀合，或者含有药物或前药的受体基团。这样的受体基团可以是例如非天然氨基酸。

核酸

如本文所用，术语“多核苷酸”或“核酸”意图包括DNA和RNA如基因组DNA、cDNA、mRNA，重组产生和化学合成的分子。核酸可以是单链或双链的。RNA包括体外转录的RNA(IVTRNA)或合成的RNA。根据本发明，多核苷酸优选是分离的。

核酸可以包含在载体中。如本文所用的术语“载体”包括技术人员已知的任何载体，包括质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体(如λ噬菌体)、病毒载体(如逆转录病毒、腺病毒或杆状病毒载体)或者人工染色体载体(如细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)或P1人工染色体(PAC))。载体包括表达载体以及克隆载体。表达载体包含质粒以及病毒载体，并且一般包含期望的编码序列以及在特定宿主生物体(例如，细菌、酵母、植物、昆虫或哺乳动物)或体外表达系统中表达可操作地连接的编码序列所必需的适当DNA序列。克隆载体一般用来工程化和扩增某个期望的DNA片段，并且可以缺少表达期望的DNA片段所需要的功能序列。

在本发明的所有方面的一实施方案中，在治疗的受试者的细胞中表达编码本文所述结合剂，例如抗体或者双特异性或多特异性结合剂的RNA，以提供结合剂。如果结合剂包含一条以上的多肽链，不同的多肽链可以由相同或不同的RNA分子编码。

本文描述的核酸可以是重组和/或分离的分子。

在本公开中，术语“RNA”涉及包括核糖核苷酸残基的核酸分子。在优选的实施方案中，RNA包含全部或大部分核糖核苷酸残基。如本文所用，“核糖核苷酸”是指在β-D-呋喃核糖(β-D-ribofuranosyl)基团的2'位置具有羟基的核苷酸。RNA涵盖但不限于双链RNA、单链RNA、分离的RNA如部分纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA，以及通过添加、缺失、取代和/或改变一个或多个核苷酸而不同于天然存在的RNA的修饰的RNA。这类改变可以指将非核苷酸物质添加至内部RNA分子或RNA的末端。本文中还考虑RNA中的核苷酸可以是非标准核苷酸，如化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。对于本公开，认为这些改变的RNA是天然存在的RNA的类似物。

在本公开的某些实施方案中，RNA是与编码肽或蛋白的RNA转录物有关的信使RNA(mRNA)。如本领域中建立的，mRNA一般包含5'非翻译区(5'-UTR)、肽编码区和3'非翻译区(3'-UTR)。在一些实施方案中，RNA是通过体外转录或化学合成产生的。在一实施方案中，mRNA是利用DNA模板通过体外转录产生的，其中DNA是指包含脱氧核糖核苷酸的核酸。

在一实施方案中，RNA是体外转录的RNA(IVT-RNA)，并且可以通过适当DNA模板的体外转录获得。用于控制转录的启动子可以是任何RNA聚合酶的任何启动子。用于体外转录的DNA模板可以通过克隆核酸，特别是cDNA，并将其引入用于体外转录的适当载体来获得。cDNA可以通过RNA的逆转录获得。

在本公开的某些实施方案中，RNA是“复制子RNA”或简单地是“复制子”，特别是“自我复制RNA”或“自我扩增RNA”。在一特别优选的实施方案中，复制子或自我复制RNA源自或包含源自ssRNA病毒的元件，特别是正链ssRNA病毒如甲病毒。甲病毒是正链RNA病毒的典型代表。甲病毒在感染细胞的细胞质中复制(甲病毒生命周期的综述参见Joséet al.,FutureMicrobiol.,2009,vol.4,pp.837–856)。许多甲病毒的总基因组长度通常范围在11,000和12,000个核苷酸之间，并且基因组RNA通常具有5’-帽和3’poly(A)尾。甲病毒的基因组编码非结构蛋白(参与病毒RNA的转录、修饰和复制以及蛋白修饰)和结构蛋白(形成病毒颗粒)。在基因组中通常有两个开放阅读框(ORF)。4个非结构蛋白(nsP1–nsP4)通常由在基因组5′末端附近开始的第一ORF一起编码，而甲病毒结构蛋白由第二ORF一起编码，所述第二ORF位于第一ORF下游并延伸至基因组的3’端附近。通常，第一ORF比第二ORF大，比例大概为2:1。在甲病毒感染的细胞中，仅编码非结构蛋白的核酸序列从基因组RNA翻译，而编码结构蛋白的遗传信息可从亚基因组转录物翻译，其为类似于真核信使RNA的RNA分子(mRNA；Gould etal.,2010,Antiviral Res.,vol.87pp.111–124)。感染之后，即在病毒生命周期的早期，(+)链基因组RNA直接充当信使RNA，用于翻译编码非结构多蛋白(nsP1234)的开放阅读框。已建议将甲病毒衍生的载体用于将外来遗传信息递送至靶细胞或靶生物体中。在简单的方法中，编码甲病毒结构蛋白的开放阅读框被编码所关注的蛋白的开放阅读框代替。基于甲病毒的反式复制(trans-replication)系统依赖于两个单独的核酸分子上的甲病毒核苷酸序列元件：一个核酸分子编码病毒复制酶，而另一个核酸分子能够被所述复制酶反式复制(因此命名为反式复制系统)。反式复制需要在给定宿主细胞中存在这两种核酸分子。能够被复制酶反式复制的核酸分子必须包含某些甲病毒序列元件以允许甲病毒复制酶进行识别和RNA合成。

在一实施方案中，本文描述的RNA可以具有修饰的核苷。在一些实施方案中，RNA包含修饰的核苷，以代替至少一个(例如，每个)尿苷。

如本文所用，术语“尿嘧啶”描述可以在RNA的核酸中出现的核碱基之一。尿嘧啶的结构是：

如本文所用，术语“尿苷”描述可以在RNA中出现的核苷之一。尿苷的结构是：

UTP(尿苷5’-三磷酸)具有以下结构：

假-UTP(假尿苷5’-三磷酸)具有以下结构：

“假尿苷”是修饰的核苷的一个实例，其是尿苷的异构体，其中尿嘧啶通过碳-碳键而不是氮-碳糖苷键连接至戊糖环。

另一示例性修饰的核苷是N1-甲基-假尿苷(m1Ψ)，其具有以下结构：

/>

N1-甲基-假-UTP具有以下结构：

另一示例性修饰的核苷是5-甲基-尿苷(m5U)，其具有以下结构：

在一些实施方案中，本文描述的RNA中的一个或多个尿苷被修饰的尿苷代替。在一些实施方案中，修饰的核苷是修饰的尿苷。

在一些实施方案中，RNA包含修饰的核苷，以代替至少一个尿苷。在一些实施方案中，RNA包含修饰的核苷，以代替每个尿苷。

在一些实施方案中，修饰的核苷独立地选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方案中，修饰的核苷包含假尿苷(ψ)。在一些实施方案中，修饰的核苷包含N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在一些实施方案中，修饰的核苷包含5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方案中，RNA可以包含一种以上类型的修饰的核苷，并且修饰的核苷独立地选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方案中，修饰的核苷包含假尿苷(ψ)和N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在一些实施方案中，修饰的核苷包含假尿苷(ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方案中，修饰的核苷包含N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方案中，修饰的核苷包含假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。

在一些实施方案中，代替RNA中的一个或多个(例如，全部)尿苷的修饰的核苷可以是以下任何一种或多种：3-甲基-尿苷(m³U)、5-甲氧基-尿苷(mo⁵U)、5-氮杂-尿苷、6-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-尿苷(s²U)、4-硫代-尿苷(s⁴U)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基-尿苷(ho⁵U)、5-氨基烯丙基-尿苷、5-卤代-尿苷(例如，5-碘-尿苷或5-溴-尿苷)、尿苷5-氧乙酸(cmo⁵U)、尿苷5-氧乙酸甲基酯(mcmo⁵U)、5-羧基甲基-尿苷(cm⁵U)、1-羧基甲基-假尿苷、5-羧基羟基甲基-尿苷(chm⁵U)、5-羧基羟基甲基-尿苷甲基酯(mchm⁵U)、5-甲氧基羰基甲基-尿苷(mcm⁵U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿苷(mcm⁵s²U)、5-氨基甲基-2-硫代-尿苷(nm⁵s²U)、5-甲基氨基甲基-尿苷(mnm⁵U)、1-乙基-假尿苷、5-甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(mnm⁵s²U)、5-甲基氨基甲基-2-硒代-尿苷(mnm⁵se²U)、5-氨甲酰基甲基-尿苷(ncm⁵U)、5-羧基甲基氨基甲基-尿苷(cmnm⁵U)、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(cmnm⁵s²U)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿苷(τm⁵U)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷(τm5s2U)、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷)、5-甲基-2-硫代-尿苷(m⁵s²U)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m¹s⁴ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m³ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷(D)、二氢假尿苷、5,6-二氢尿苷、5-甲基-二氢尿苷(m⁵D)、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷(acp³U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷(acp³ψ)、5-(异戊烯基氨基甲基)尿苷(inm⁵U)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫代-尿苷(inm⁵s²U)、α-硫代-尿苷、2′-O-甲基-尿苷(Um)、5,2′-O-二甲基-尿苷(m⁵Um)、2′-O-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫代-2′-O-甲基-尿苷(s²Um)、5-甲氧基羰基甲基-2′-O-甲基-尿苷(mcm⁵Um)、5-氨甲酰基甲基-2′-O-甲基-尿苷(ncm⁵Um)、5-羧基甲基氨基甲基-2′-O-甲基-尿苷(cmnm⁵Um)、3,2′-O-二甲基-尿苷(m³Um)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2′-O-甲基-尿苷(inm⁵Um)、1-硫代-尿苷、脱氧胸苷、2′-F-阿糖-尿苷(2′-F-ara-uridine)、2′-F-尿苷、2′-OH-阿糖-尿苷(2′-OH-ara-uridine)、5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷、5-[3-(1-E-丙烯基氨基)尿苷或本领域已知的任何其他修饰的尿苷。

在一实施方案中，RNA包含其他修饰的核苷，或者包含进一步修饰的核苷，例如，修饰的胞苷。例如，在一实施方案中，在RNA中，5-甲基胞苷部分或完全，优选完全取代胞苷。在一实施方案中，RNA包含5-甲基胞苷以及选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)中的一种或多种。在一实施方案中，RNA包含5-甲基胞苷和N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在一些实施方案中，RNA包含5-甲基胞苷代替每个胞苷，以及N1-甲基-假尿苷(m1ψ)代替每个尿苷。

在一些实施方案中，本公开的RNA包含5’-帽。在一实施方案中，本公开的RNA没有无帽的5'-三磷酸。在一实施方案中，RNA可以通过5'-帽类似物修饰。术语“5'-帽”是指在mRNA分子的5'端上发现的结构，并且一般由通过5'-至5'-三磷酸键连接至mRNA的鸟苷核苷酸组成。在一实施方案中，这个鸟苷在7-位置甲基化。提供具有5'-帽或5'-帽类似物的RNA可以通过体外转录来实现，其中将5'-帽共转录表达至RNA链中，或者可以利用加帽酶转录后连接至RNA。

在一些实施方案中，RNA的构件(building block)帽是m₂ ^7,3’-OGppp(m₁ ^2’-O)ApG(有时也称作m₂ ^7,3`OG(5’)ppp(5’)m^2’-OApG)，其具有以下结构：

以下是示例性Cap1 RNA，其包含RNA和m₂ ^7,3`OG(5’)ppp(5’)m^2’-OApG：

以下是另一示例性Cap1 RNA(没有帽类似物)：

在一些实施方案中，用“Cap0”结构修饰RNA，在一些实施方案中，使用帽类似物抗反向帽(anti-reverse cap)(ARCA Cap(m₂ ^7,3`OG(5’)ppp(5’)G))，其具有以下结构：

以下是包含RNA和m₂ ^7,3`OG(5’)ppp(5’)G的示例性Cap0 RNA：

在一些实施方案中，利用具有以下结构的帽类似物β-S-ARCA(m₂ ^7,2`OG(5’)ppSp(5’)G)产生“Cap0”结构：

以下是包含β-S-ARCA(m₂ ^7,2`OG(5’)ppSp(5’)G)和RNA的示例性Cap0 RNA：

β-S-ARCA的“D1”非对映体或“β-S-ARCA(D1)”是β-S-ARCA的非对映体，与β-S-ARCA的D2非对映体(β-S-ARCA(D2))相比其在HPLC柱上首先洗脱，因此表现出较短的保留时间(参见WO 2011/015347，援引加入本文)。

特别优选的帽是β-S-ARCA(D1)(m₂ ^7,2'^-OGppSpG)或m₂ ^7,3’-OGppp(m₁ ^2’-O)ApG。

在一些实施方案中，本公开的RNA包含5'-UTR和/或3'-UTR。术语“非翻译区”或“UTR”涉及DNA分子中的区域，其转录但不翻译为氨基酸序列，或者涉及RNA分子(如mRNA分子)中的相应区域。非翻译区(UTR)可以存在于开放阅读框的5'(上游)(5'-UTR)和/或开放阅读框的3'(下游)(3'-UTR)。如果存在，5'-UTR位于5'端，蛋白编码区的起始密码子的上游。5'-UTR位于5'-帽(如果存在)的下游，例如直接与5'-帽相邻。如果存在，3'-UTR位于3'端，蛋白编码区的终止密码子的下游，但是术语“3'-UTR”优选不包括poly(A)序列。因此，3'-UTR位于poly(A)序列(如果存在)的上游，例如直接与poly(A)序列相邻。

在一些实施方案中，RNA包含5’-UTR，所述5’-UTR包含SEQ ID NO:199的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:199的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列。

在一些实施方案中，RNA包含3’-UTR，所述3’-UTR包含SEQ ID NO:200或201的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:200或201的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列。

特别优选的5’-UTR包含SEQ ID NO:199的核苷酸序列。特别优选的3’-UTR包含SEQID NO:200或201的核苷酸序列。

在一些实施方案中，本公开的RNA包含3'-poly(A)序列。

如本文所用，术语“poly(A)序列”或“poly-A尾”是指腺苷酸残基的不间断或间断序列，其通常位于RNA分子的3'端。Poly(A)序列是本领域技术人员已知的，并且可以跟随本文描述的RNA中的3’-UTR。不间断的poly(A)序列的特征在于连续的腺苷酸残基。在自然界中，不间断的poly(A)序列是典型的。本文公开的RNA可以具有转录之后通过不依赖于模板的RNA聚合酶连接至RNA的游离3'端的poly(A)序列，或者由DNA编码并由模板依赖性RNA聚合酶转录的poly(A)序列。

已证实约120个A核苷酸的poly(A)序列对转染的真核细胞中的RNA水平以及从存在于poly(A)序列上游(5’)的开放阅读框翻译的蛋白水平具有有益影响(Holtkamp etal.,2006,Blood,vol.108,pp.4009-4017)。

poly(A)序列可以具有任何长度。在一些实施方案中，poly(A)序列包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：至少20、至少30、至少40、至少80或至少100以及多达500、多达400、多达300、多达200或多达150个A核苷酸，特别是约120个A核苷酸。在这种情况下，“基本上由…组成”表示poly(A)序列中的大多数核苷酸，通常poly(A)序列中核苷酸数量的至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％是A核苷酸，但是允许剩余的核苷酸是除A核苷酸以外的核苷酸，如U核苷酸(尿苷酸)、G核苷酸(鸟苷酸)或C核苷酸(胞苷酸)。在这种情况下，“由…组成”表示poly(A)序列的所有核苷酸，即，poly(A)序列中核苷酸数量的100％是A核苷酸。术语“A核苷酸”或“A”是指腺苷酸。

在一些实施方案中，基于在与编码链互补的链中包含重复的dT核苷酸(脱氧胸苷酸)的DNA模板，在RNA转录期间，例如，在制备体外转录的RNA期间，连接poly(A)序列。编码poly(A)序列的DNA序列(编码链)称作poly(A)盒。

在一些实施方案中，DNA编码链中存在的poly(A)盒基本上由dA核苷酸组成，但是被4种核苷酸(dA、dC、dG和dT)的随机序列中断。这样的随机序列的长度可以是5-50、10-30或10-20个核苷酸。在WO 2016/005324 A1中公开了这样的盒，其援引加入本文。WO 2016/005324 A1中公开的任何poly(A)盒均可以用于本发明。涵盖这样的poly(A)盒，其基本上由dA核苷酸组成，但是被具有均等分布的4种核苷酸(dA、dC、dG、dT)且具有例如5-50个核苷酸长度的随机序列中断，在DNA水平上在大肠杆菌(E.coli)中表现出质粒DNA的恒定增殖，并且在RNA水平上仍与支持RNA稳定性和翻译效率方面的有益特性相关。因此，在一些实施方案中，本文描述的RNA分子中包含的poly(A)序列基本上由A核苷酸组成，但是被4种核苷酸(A、C、G、U)的随机序列中断。这样的随机序列的长度可以是5-50、10-30或10-20个核苷酸。

在一些实施方案中，在poly(A)序列的3'端侧翼没有除A核苷酸以外的核苷酸，即，poly(A)序列在其3'端未被A以外的核苷酸掩盖或跟随。

在一些实施方案中，poly(A)序列可以包含至少20、至少30、至少40、至少80或至少100以及多达500、多达400、多达300、多达200或多达150个核苷酸。在一些实施方案中，poly(A)序列可以基本上由至少20、至少30、至少40、至少80或至少100以及多达500、多达400、多达300、多达200或多达150个核苷酸组成。在一些实施方案中，poly(A)序列可以由至少20、至少30、至少40、至少80或至少100以及多达500、多达400、多达300、多达200或多达150个核苷酸组成。在一些实施方案中，poly(A)序列包含至少100个核苷酸。在一些实施方案中，poly(A)序列包含约150个核苷酸。在一些实施方案中，poly(A)序列包含约120个核苷酸。

在一些实施方案中，RNA包含poly(A)序列，所述poly(A)序列包含SEQ ID NO:202的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:202的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列。

特别优选的poly(A)序列包含SEQ ID NO:202的核苷酸序列。

根据本公开，结合剂优选作为单链、5'-加帽的mRNA给药，其在进入给药RNA的受试者的细胞时翻译为相应的蛋白。优选地，RNA包含在稳定性和翻译效率方面为RNA的最大效力优化的结构元件(5'-帽、5'-UTR、3'-UTR、poly(A)序列)。

在一实施方案中，β-S-ARCA(D1)用作RNA的5'端的特定加帽结构。在一实施方案中，m₂ ^7,3’-OGppp(m₁ ^2’-O)ApG用作RNA的5'端的特定加帽结构。在一实施方案中，5'-UTR序列源自人α-珠蛋白mRNA，并且任选地具有优化的“Kozak序列”以提高翻译效率。在一实施方案中，将源自“分裂的氨基末端增强子(amino terminal enhancer of split)”(AES)mRNA(称作F)和线粒体编码的12S核糖体RNA(称作I)的两个序列元件的组合(FI元件)置于编码序列和poly(A)序列之间以确保更高的最大蛋白水平和延长的mRNA持久性。

通过对赋予RNA稳定性并增加总蛋白表达的序列的离体选择过程鉴定了这些序列(参见WO 2017/060314，援引加入本文)。

在一实施方案中，将源自人β-珠蛋白mRNA的两个重复的3'-UTR置于编码序列和poly(A)序列之间以确保更高的最大蛋白水平和延长的mRNA持久性。在一实施方案中，使用长度为110个核苷酸的poly(A)序列，其由一段30个腺苷残基，随后10个核苷酸接头序列和另一70个腺苷残基组成。设计这个poly(A)序列以增强RNA稳定性和翻译效率。

在本发明的所有方面的一实施方案中，在治疗的受试者的细胞中表达编码结合剂的RNA以提供结合剂。在本发明的所有方面的一实施方案中，在受试者的细胞中瞬时表达所述RNA。在本发明的所有方面的一实施方案中，RNA是体外转录的RNA。在本发明的所有方面的一实施方案中，结合剂的表达入细胞外空间，即，结合剂是分泌的。

在本公开的上下文中，术语“转录”涉及一个过程，其中将DNA序列中的遗传密码转录为RNA。随后，可以将RNA翻译为肽或蛋白。

根据本发明，术语“转录”包括“体外转录”，其中术语“体外转录”涉及一个过程，其中RNA，特别是mRNA，在不含细胞的系统中体外合成，优选使用适当的细胞提取物。优选地，将克隆载体用于产生转录物。这些克隆载体一般指定为转录载体，并且根据本发明涵盖在术语“载体”内。根据本发明，本发明中使用的RNA优选是体外转录的RNA(IVT-RNA)，并且可以通过适当DNA模板的体外转录获得。用于控制转录的启动子可以是任何RNA聚合酶的任何启动子。RNA聚合酶的特别实例包括T7、T3和SP6 RNA聚合酶。优选地，本发明的体外转录由T7或SP6启动子控制。用于体外转录的DNA模板可以通过克隆核酸，特别是cDNA，并将其引入用于体外转录的适当载体来获得。cDNA可以通过RNA的逆转录获得。

关于RNA，术语“表达”或“翻译”涉及细胞核糖体中的过程，通过这个过程mRNA链指导氨基酸序列的组装以产生肽或蛋白。

在一实施方案中，给药本文描述的RNA之后，例如，配制为RNA脂质颗粒，将RNA的至少一部分递送至靶细胞。在一实施方案中，将RNA的至少一部分递送至靶细胞的胞质溶胶。在一实施方案中，通过靶细胞翻译RNA以产生其编码的肽或蛋白。因此，本公开还涉及一种将RNA递送至受试者中的靶细胞的方法，所述方法包括将本文描述的RNA颗粒给予受试者。在一实施方案中，将RNA递送至靶细胞的胞质溶胶。在一实施方案中，通过靶细胞翻译RNA以产生RNA编码的肽或蛋白。

“编码”是指多核苷酸(如基因、cDNA或mRNA)中特定核苷酸序列的固有特性，以便用作模板用于在生物过程中合成其他聚合物或大分子，所述聚合物或大分子具有确定的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列以及由此所致的生物学特性。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白，则该基因编码该蛋白。其核苷酸序列与mRNA序列相同且通常在序列表中提供的编码链以及用作基因或cDNA转录模板的非编码链均可以称作编码该基因或者cDNA的蛋白或其他产物。

在一实施方案中，根据本发明给药的编码结合剂的RNA是非免疫原性的。

如本文所用的术语“非免疫原性RNA”是指这样的RNA，其在给予例如哺乳动物时不诱导免疫系统应答，或者诱导的应答比不同之处仅在于尚未进行使非免疫原性RNA成为非免疫原性的修饰和处理的相同RNA诱导的弱，即，比标准RNA(stdRNA)诱导的弱。在一优选实施方案中，通过将修饰的核苷掺入RNA并去除双链RNA(dsRNA)，使得在本文中也称作修饰的RNA(modRNA)的非免疫原性RNA成为非免疫原性，所述修饰的核苷抑制RNA介导的先天免疫受体激活。

为了通过掺入修饰的核苷使非免疫原性RNA成为非免疫原性，可以使用任何修饰的核苷，只要其降低或抑制RNA的免疫原性。特别优选抑制RNA介导的先天免疫受体激活的修饰的核苷。在一实施方案中，修饰的核苷包括用包含修饰的核碱基的核苷置换一个或多个尿苷。在一实施方案中，修饰的核碱基是修饰的尿嘧啶。在一实施方案中，包含修饰的核碱基的核苷选自3-甲基-尿苷(m³U)、5-甲氧基-尿苷(mo⁵U)、5-氮杂-尿苷、6-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-尿苷(s²U)、4-硫代-尿苷(s⁴U)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基-尿苷(ho⁵U)、5-氨基烯丙基-尿苷、5-卤代-尿苷(例如，5-碘-尿苷或5-溴-尿苷)、尿苷5-氧乙酸(cmo⁵U)、尿苷5-氧乙酸甲基酯(mcmo⁵U)、5-羧基甲基-尿苷(cm⁵U)、1-羧基甲基-假尿苷、5-羧基羟基甲基-尿苷(chm⁵U)、5-羧基羟基甲基-尿苷甲基酯(mchm⁵U)、5-甲氧基羰基甲基-尿苷(mcm⁵U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿苷(mcm⁵s²U)、5-氨基甲基-2-硫代-尿苷(nm⁵s²U)、5-甲基氨基甲基-尿苷(mnm⁵U)、1-乙基-假尿苷、5-甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(mnm⁵s²U)、5-甲基氨基甲基-2-硒代-尿苷(mnm⁵se²U)、5-氨甲酰基甲基-尿苷(ncm⁵U)、5-羧基甲基氨基甲基-尿苷(cmnm⁵U)、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(cmnm⁵s²U)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿苷(τm⁵U)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷(τm5s2U)、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷)、5-甲基-2-硫代-尿苷(m⁵s²U)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m¹s⁴ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m³ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷(D)、二氢假尿苷、5,6-二氢尿苷、5-甲基-二氢尿苷(m⁵D)、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷(acp³U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷(acp³ψ)、5-(异戊烯基氨基甲基)尿苷(inm⁵U)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫代-尿苷(inm⁵s²U)、α-硫代-尿苷、2′-O-甲基-尿苷(Um)、5,2′-O-二甲基-尿苷(m⁵Um)、2′-O-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫代-2′-O-甲基-尿苷(s²Um)、5-甲氧基羰基甲基-2′-O-甲基-尿苷(mcm⁵Um)、5-氨甲酰基甲基-2′-O-甲基-尿苷(ncm⁵Um)、5-羧基甲基氨基甲基-2′-O-甲基-尿苷(cmnm⁵Um)、3,2′-O-二甲基-尿苷(m³Um)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2′-O-甲基-尿苷(inm⁵Um)、1-硫代-尿苷、脱氧胸苷、2′-F-阿糖-尿苷、2′-F-尿苷、2′-OH-阿糖-尿苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷以及5-[3-(1-E-丙烯基氨基)尿苷。在一特别优选的实施方案中，包含修饰的核碱基的核苷是假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5U)，特别是N1-甲基-假尿苷。

在一实施方案中，用包含修饰的核碱基的核苷置换一个或多个尿苷包括置换至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少75％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的尿苷。

在使用T7 RNA聚合酶通过体外转录(IVT)合成mRNA期间，由于酶的非常规活性，产生大量异常产物，包括双链RNA (dsRNA)。dsRNA诱导炎性细胞因子并激活效应酶，导致蛋白合成抑制。可以利用无孔或多孔的C-18聚苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)基质通过例如离子对反相HPLC从RNA(如IVT RNA)去除dsRNA。或者，可以使用基于酶的方法，使用特异性水解dsRNA但不水解ssRNA的大肠杆菌RNaseIII，从而从IVT RNA制品消除dsRNA污染物。此外，可以通过使用纤维素材料将dsRNA与ssRNA分离。在一实施方案中，使RNA制品与纤维素材料接触，并且在允许dsRNA结合至纤维素材料且不允许ssRNA结合至纤维素材料的条件下将ssRNA与纤维素材料分离。

当术语在本文中使用时，“去除”或“除去”是指第一物质群体(如非免疫原性RNA)的特征为与第二物质群体(如dsRNA)的附近分离，其中第一物质群体不必完全没有第二物质，并且第二物质群体不必完全没有第一物质。但是，与未分离的第一物质和第二物质的混合物相比，特征在于去除第二物质群体的第一物质群体具有可测量的更低含量的第二物质。

在一实施方案中，从非免疫原性RNA去除dsRNA包括去除dsRNA，从而非免疫原性RNA组合物中10％以下、5％以下、4％以下、3％以下、2％以下、1％以下、0.5％以下、0.3％以下或0.1％以下的RNA是dsRNA。在一实施方案中，非免疫原性RNA不含或基本上不含dsRNA。在一些实施方案中，非免疫原性RNA组合物包含核苷修饰的单链RNA的纯化制品。例如，在一些实施方案中，核苷修饰的单链RNA的纯化制品基本上不含双链RNA(dsRNA)。在一些实施方案中，相对于所有其他核酸分子(DNA、dsRNA等)，纯化的制品是至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少99.9％核苷修饰的单链RNA。

在一实施方案中，与具有相同序列的标准RNA相比，非免疫原性RNA在细胞中的翻译效率更高。在一实施方案中，相对于其未修饰的对应物，翻译增强的倍数是2倍。在一实施方案中，翻译增强的倍数是3倍。在一实施方案中，翻译增强的倍数是4倍。在一实施方案中，翻译增强的倍数是5倍。在一实施方案中，翻译增强的倍数是6倍。在一实施方案中，翻译增强的倍数是7倍。在一实施方案中，翻译增强的倍数是8倍。在一实施方案中，翻译增强的倍数是9倍。在一实施方案中，翻译增强的倍数是10倍。在一实施方案中，翻译增强的倍数是15倍。在一实施方案中，翻译增强的倍数是20倍。在一实施方案中，翻译增强的倍数是50倍。在一实施方案中，翻译增强的倍数是100倍。在一实施方案中，翻译增强的倍数是200倍。在一实施方案中，翻译增强的倍数是500倍。在一实施方案中，翻译增强的倍数是1000倍。在一实施方案中，翻译增强的倍数是2000倍。在一实施方案中，倍数是10-1000倍。在一实施方案中，倍数是10-100倍。在一实施方案中，倍数是10-200倍。在一实施方案中，倍数是10-300倍。在一实施方案中，倍数是10-500倍。在一实施方案中，倍数是20-1000倍。在一实施方案中，倍数是30-1000倍。在一实施方案中，倍数是50-1000倍。在一实施方案中，倍数是100-1000倍。在一实施方案中，倍数是200-1000倍。在一实施方案中，翻译增强了任何其他显著的量或量的范围。

在一实施方案中，与具有相同序列的标准RNA相比，非免疫原性RNA表现出明显更低的先天免疫原性。在一实施方案中，非免疫原性RNA表现出比其未修饰的对应物少2倍的先天免疫应答。在一实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是3倍。在一实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是4倍。在一实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是5倍。在一实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是6倍。在一实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是7倍。在一实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是8倍。在一实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是9倍。在一实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是10倍。在一实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是15倍。在一实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是20倍。在一实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是50倍。在一实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是100倍。在一实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是200倍。在一实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是500倍。在一实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是1000倍。在一实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是2000倍。

术语“表现出明显更少的先天免疫原性”是指先天免疫原性的可检测的减少。在一实施方案中，该术语是指减少，使得可以给药有效量的非免疫原性RNA而不触发可检测的先天免疫应答。在一实施方案中，该术语是指减少，使得可以重复给药非免疫原性RNA而不引发先天免疫应答，这足以可检测地减少非免疫原性RNA编码的蛋白的产生。在一实施方案中，所述减少使得可以重复给药非免疫原性RNA而不引发先天免疫应答，这足以消除非免疫原性RNA编码的蛋白的可检测的产生。

“免疫原性”是外来物质(如RNA)在人或其他动物体内引起免疫应答的能力。先天免疫系统是免疫系统的组成部分，其是相对非特异性和即时的。它是脊椎动物免疫系统的两个主要组成部分(连同适应性免疫系统)之一。

如本文所用，“内源”是指来自生物体、细胞、组织或系统内部或者在生物体、细胞、组织或系统内部产生的任何物质。

如本文所用，术语“外源”是指从生物体、细胞、组织或系统外部引入或者在生物体、细胞、组织或系统外部产生的任何物质。

如本文所用的术语“表达”定义为特定核苷酸序列的转录和/或翻译。

如本文所用，术语“连接”、“融合的”或“融合”可互换使用。这些术语是指两个或更多个元件或组件或结构域连接在一起。

密码子优化/G/C含量的增加

在一些实施方案中，本文描述的结合剂的氨基酸序列由这样的编码序列编码，其与野生型编码序列相比是密码子优化和/或其G/C含量增加的。这还包括实施方案，其中与野生型编码序列的相应序列区域相比，编码序列的一个或多个序列区域是密码子优化和/或G/C含量增加的。在一实施方案中，密码子优化和/或G/C含量的增加优选不改变编码的氨基酸序列的序列。

术语“密码子优化”是指改变核酸分子的编码区中的密码子以反映宿主生物体的典型密码子使用，而优选不改变核酸分子编码的氨基酸序列。在本发明的上下文中，优选使用本文描述的RNA分子对编码区进行密码子优化以在待治疗的受试者中最佳表达。密码子优化是基于以下发现：翻译效率还由细胞中tRNA出现的不同频率决定。因此，可以修饰RNA的序列，从而插入可获得频繁出现的tRNA的密码子以代替“稀有密码子”。

在本发明的一些实施方案中，与野生型RNA的相应编码序列的G/C含量相比，本文描述的RNA的编码区的鸟苷/胞嘧啶(G/C)含量增加，其中与野生型RNA编码的氨基酸序列相比，所述RNA编码的氨基酸序列优选是未修饰的。RNA序列的这种修饰是基于以下事实：待翻译的任何RNA区域的序列对于该mRNA的高效翻译都很重要。具有增加的G(鸟苷)/C(胞嘧啶)含量的序列比具有增加的A(腺苷)/U(尿嘧啶)含量的序列更稳定。关于几个密码子编码一个和相同氨基酸(所谓的遗传密码的简并性)的事实，可以确定对于稳定性最有利的密码子(所谓的替代密码子使用)。取决于RNA编码的氨基酸，与其野生型序列相比，对于RNA序列的修饰有各种可能性。特别地，包含A和/或U核苷酸的密码子可以通过用其他密码子取代这些密码子来修饰，所述其他密码子编码相同氨基酸但不含A和/或U或者包含较低量的A和/或U核苷酸。

在各种实施方案中，与野生型RNA的编码区的G/C含量相比，本文描述的RNA的编码区的G/C含量增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少55％或甚至更多。

包含核酸的颗粒

本文描述的核酸(如编码结合剂的RNA)可以配制为颗粒来给药。

在本公开的上下文中，术语“颗粒”涉及由分子或分子复合物形成的结构化实体。在一实施方案中，术语“颗粒”涉及微米或纳米大小的结构，如分散在介质中的微米或纳米大小的致密结构。在一实施方案中，颗粒是包含核酸的颗粒，如包含DNA、RNA或其混合物的颗粒。

带正电荷的分子(如聚合物和脂质)与带负电荷的核酸之间的静电相互作用参与颗粒形成。这导致核酸颗粒的复合和自发形成。在一实施方案中，核酸颗粒是纳米颗粒。

如本公开所用，“纳米颗粒”是指具有适合肠胃外给药的平均直径的颗粒。

“核酸颗粒”可以用来将核酸递送至所关注的靶位点(例如，细胞、组织、器官等)。核酸颗粒可以由至少一种阳离子或阳离子可电离的脂质或者脂质样材料、至少一种阳离子聚合物(如鱼精蛋白)或其混合物以及核酸形成。核酸颗粒包括基于脂质纳米颗粒(LNP)和基于lipoplex(LPX)的制剂。

不受任何理论的束缚，认为阳离子或阳离子可电离的脂质或者脂质样材料和/或阳离子聚合物与核酸结合在一起形成聚集体，并且这种聚集导致胶体稳定的颗粒。

在一实施方案中，本文描述的颗粒进一步包含除阳离子或阳离子可电离的脂质或脂质样材料以外的至少一种脂质或脂质样材料，除阳离子聚合物以外的至少一种聚合物，或者它们的混合物。

在一些实施方案中，核酸颗粒包含一种以上类型的核酸分子，其中核酸分子的分子参数可以互相相似或不同，例如关于摩尔质量或基本结构要素如分子结构、加帽、编码区或其他特征。

本文描述的核酸颗粒的平均直径在一实施方案中可以为约30nm-约1000nm、约50nm-约800nm、约70nm-约600nm、约90nm-约400nm、约100nm-约300nm。

本文描述的核酸颗粒可以表现出约0.5以下、约0.4以下、约0.3以下或约0.2或更少的多分散性指数。举例来说，核酸颗粒可以表现出在约0.1至约0.3或约0.2至约0.3的范围内的多分散性指数。

关于RNA脂质颗粒，N/P比例给出脂质中的氮基团比RNA中的磷酸基团数量的比例。它与电荷比例相关，因为氮原子(取决于pH)通常带正电荷，而磷酸基团带负电荷。当存在电荷平衡时，N/P比例取决于pH。脂质制剂通常以4以上，多至12的N/P比例形成，因为认为带正电荷的纳米颗粒有利于转染。在那种情况下，认为RNA完全结合至纳米颗粒。

本文描述的核酸颗粒可以使用广泛的方法制备，所述方法可以包括从至少一种阳离子或阳离子可电离的脂质或脂质样材料和/或至少一种阳离子聚合物获得胶体，并且将胶体与核酸混合以获得核酸颗粒。

如本文所用的术语“胶体”涉及其中分散的颗粒不沉淀的均匀混合物的类型。混合物中的不溶性颗粒是微观的，粒径在1-1000纳米之间。该混合物可以称为胶体或胶体悬浮液。有时术语“胶体”仅指混合物中的颗粒而不是整个悬浮液。

对于包含至少一种阳离子或阳离子可电离的脂质或脂质样材料和/或至少一种阳离子聚合物的胶体的制备，常规用于制备脂质体囊泡并适当调整的方法可适用于本文。制备脂质体囊泡的最常用方法享有以下基本步骤：(i)将脂质溶于有机溶剂中，(ii)干燥所得的溶液，以及(iii)将干燥的脂质水合(使用各种水性介质)。

在膜水合方法中，首先将脂质溶于合适的有机溶剂中，然后干燥以在烧瓶底部产生薄膜。使用适当的水性介质将获得的脂质膜水合以产生脂质体分散体。此外，可以包括额外的缩小步骤。

反相蒸发是用于制备脂质体囊泡的膜水合的可选方法，其涉及在水相和包含脂质的有机相之间形成油包水乳液。为了系统均质化，需要对这个混合物进行简短的超声处理。在减压下去除有机相产生乳状凝胶，其随后变为脂质体悬浮液。

术语“乙醇注射技术”是指这样的过程，其中通过针头将包含脂质的乙醇溶液快速注射至水性溶液中。这个行为将脂质分散在整个溶液中，并且促进脂质结构形成，例如脂质囊泡形成如脂质体形成。一般来说，本文描述的RNA lipoplex颗粒可通过将RNA添加至胶体脂质体分散体来获得。在一实施方案中，利用乙醇注射技术，如下形成这种胶体脂质体分散体：在搅拌下将包含脂质(如阳离子脂质)和额外脂质的乙醇溶液注射至水性溶液中。在一实施方案中，本文描述的RNA lipoplex颗粒无需挤出步骤即可获得。

术语“挤出”是指产生具有固定的横截面轮廓的颗粒。特别地，其是指颗粒的缩小，由此迫使颗粒通过具有限定孔的过滤器。

具有不含有机溶剂特征的其他方法也可以根据本公开用于制备胶体。

LNP通常包含4种组分：可电离的阳离子脂质，中性脂质如磷脂，类固醇如胆固醇和聚合物缀合的脂质如聚乙二醇(PEG)-脂质。每种组分负责有效载荷保护，并且实现有效的细胞内递送。LNP可以通过将溶于乙醇的脂质与水性缓冲液中的核酸快速混合来制备。

术语“平均直径”是指通过动态激光散射(DLS)并使用所谓的累积量算法进行数据分析而测得的颗粒的平均流体动力学直径，其结果是提供具有一定长度尺寸的所谓的Z_average，以及无量纲的多分散性指数(PI)(Koppel,D.,J.Chem.Phys.57,1972,pp 4814-4820,ISO 13321)。这里颗粒的“平均直径”、“直径”或“大小”与Z_average的这个值同义使用。

“多分散性指数”优选基于动态光散射测量，通过“平均直径”的定义中提到的所谓的累积量分析来计算。在某些先决条件下，可以将其作为纳米颗粒整体大小分布的度量。

以前已描述了不同类型的包含核酸的颗粒适合递送颗粒形式的核酸(例如Kaczmarek,J.C.et al.,2017,Genome Medicine 9,60)。对于非病毒核酸递送媒介物，核酸的纳米颗粒包裹物理上保护核酸免于降解，并且取决于特定化学，可以辅助细胞摄取和内体逃逸。

本公开描述了包含核酸、至少一种阳离子或阳离子可电离的脂质或脂质样材料和/或至少一种与核酸缔合的阳离子聚合物以形成核酸颗粒的颗粒，以及包含这类颗粒的组合物。核酸颗粒可以包含通过非共价相互作用以不同形式与颗粒复合的核酸。本文描述的颗粒不是病毒颗粒，特别是传染性病毒颗粒，即，它们不能病毒式地感染细胞。

合适的阳离子或阳离子可电离的脂质或脂质样材料以及阳离子聚合物是形成核酸颗粒的那些，并且包括在术语“颗粒形成组分”或“颗粒形成剂”中。术语“颗粒形成组分”或“颗粒形成剂”涉及与核酸缔合以形成核酸颗粒的任何组分。这类组分包括可以是核酸颗粒的一部分的任何组分。

阳离子聚合物

鉴于它们高度的化学柔韧性，聚合物是用于基于纳米颗粒的递送的常用材料。通常，阳离子聚合物用来将带负电荷的核酸静电凝聚为纳米颗粒。这些带正电荷的基团通常由胺组成，所述胺在5.5-7.5的pH范围内改变它们的质子化状态，据认为这引起离子失衡，导致内体破裂。聚合物如聚-L-赖氨酸、聚酰胺胺(polyamidoamine)、鱼精蛋白和聚乙烯亚胺以及天然存在的聚合物(如壳聚糖)全部已应用于核酸递送，并且适合作为本文的阳离子聚合物。此外，一些研究者已合成了专门用于核酸递送的聚合物。特别地，聚(β-氨基酯)由于其易于合成和生物可降解性而在核酸递送中获得了广泛应用。这类合成聚合物也适合作为本文的阳离子聚合物。

如本文所用，“聚合物”具有其通常的含义，即，包含通过共价键连接的一个或多个重复单元(单体)的分子结构。重复单元可以全部相同，或者在某些情况下，聚合物内可以存在一种以上类型的重复单元。在某些情况下，聚合物是生物衍生的，即，生物聚合物如蛋白。在某些情况下，聚合物中还可以存在额外的部分，例如靶向部分，如本文中描述的那些。

如果聚合物内存在一种以上类型的重复单元，则将该聚合物称为“共聚物”。应当理解本文中采用的聚合物可以是共聚物。形成共聚物的重复单元可以以任何方式排列。例如，重复单元可以以随机顺序、交替顺序排列，或者作为“嵌段”共聚物，即，包含一个或多个区域，每个区域包含第一重复单元(例如，第一嵌段)，以及一个或多个区域，每个包含第二重复单元(例如，第二嵌段)，等等。嵌段共聚物可以具有两个(二嵌段共聚物)、三个(三嵌段共聚物)或更多数量的不同嵌段。

在某些实施方案中，聚合物是生物相容的。生物相容性聚合物是在中等浓度下通常不会导致显著的细胞死亡的聚合物。在某些实施方案中，生物相容性聚合物是生物可降解的，即，聚合物能够在生理环境内如体内化学和/或生物降解。

在某些实施方案中，聚合物可以是鱼精蛋白或聚亚烷基亚胺，特别是鱼精蛋白。

术语“鱼精蛋白”是指富含精氨酸并发现在各种动物(如鱼)的精细胞中代替体细胞组蛋白特别与DNA关联的任何相对低分子量的强碱性蛋白。特别地，术语“鱼精蛋白”是指在鱼精子中发现的蛋白，其是强碱性的，在水中可溶，通过加热不凝结，并且在水解时主要产生精氨酸。在纯化形式中，它们用于胰岛素的长效制剂以及中和肝素的抗凝作用。

根据本公开，如本文所用的术语“鱼精蛋白”意指包含获得自或源自天然或生物来源的任何鱼精蛋白氨基酸序列，包括其片段以及所述氨基酸序列的多聚体形式或其片段以及(合成的)多肽，所述多肽是人工的，专门设计用于特定目的，并且不可以从天然或生物来源分离。

在一实施方案中，聚亚烷基亚胺包含聚乙烯亚胺和/或聚丙烯亚胺，优选聚乙烯亚胺。优选的聚亚烷基亚胺是聚乙烯亚胺(PEI)。PEI的平均分子量优选0.75·10²-10⁷Da，优选1000-10⁵Da，更优选10000-40000Da，更优选15000-30000Da，甚至更优选20000-25000Da。

根据本公开优选线性聚亚烷基亚胺如线性聚乙烯亚胺(PEI)。

预期用于本文的阳离子聚合物(包括聚阳离子聚合物)包括能够静电结合核酸的任何阳离子聚合物。在一实施方案中，预期用于本文的阳离子聚合物包括核酸可以与其缔合的任何阳离子聚合物，例如通过与核酸形成复合物或者形成其中包围或包裹核酸的囊泡。

本文描述的颗粒还可以包含除阳离子聚合物以外的聚合物，即，非阳离子聚合物和/或阴离子聚合物。阴离子和中性聚合物在本文中统称为非阳离子聚合物。

脂质和脂质样材料

术语“脂质”和“脂质样材料”在本文中广泛定义为包含一个或多个疏水部分或基团以及任选地还包含一个或多个亲水部分或基团的分子。包含疏水部分和亲水部分的分子也常称作两亲分子。脂质通常难溶于水。在水性环境中，两亲性质允许分子自组装为有组织的结构和不同的相。那些相之一由脂质双层组成，因为它们存在于水性环境中的囊泡、多层/单层脂质体或膜中。可以通过包含非极性基团来赋予疏水性，所述非极性基团包括但不限于长链饱和和不饱和脂肪烃基团以及被一个或多个芳香族、脂环族或杂环基团取代的这类基团。亲水基团可以包含极性和/或带电荷的基团，并且包括碳水化合物、磷酸根、羧基、硫酸根、氨基、巯基、硝基、羟基和其他类似基团。

如本文所用，术语“两亲性”是指具有极性部分和非极性部分的分子。通常，两亲性化合物具有连接至长疏水尾的极性头。在一些实施方案中，极性部分可溶于水，而非极性部分不溶于水。此外，极性部分可以具有形式上的正电荷或形式上的负电荷。或者，极性部分可以具有形式上的正电荷和负电荷，并且可以是两性离子或内盐。为了本公开的目的，两亲性化合物可以是但不限于一种或多种天然或非天然脂质和脂质样化合物。

术语“脂质样材料”、“脂质样化合物”或“脂质样分子”涉及在结构和/或功能上与脂质相关但在严格意义上可以不视为脂质的物质。例如，该术语包括在水性环境中存在于囊泡、多层/单层脂质体或膜中时能够形成两亲性层的化合物，并且包括表面活性剂或者具有亲水和疏水部分的合成化合物。一般来说，该术语是指分子，其包含具有不同结构组织的亲水和疏水部分，其可以与脂质结构组织相似或不相似。如本文所用，术语“脂质”解释为涵盖脂质和脂质样材料，除非本文另有说明或明显与上下文矛盾。

可以包括在两亲性层中的两亲性化合物的具体实例包括但不限于磷脂、氨基脂质和鞘脂。

在某些实施方案中，两亲性化合物是脂质。术语“脂质”是指一组有机化合物，其特征在于不溶于水，但可溶于许多有机溶剂。一般来说，脂质可以分为8类：脂肪酸、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂、糖脂、聚酮(源自酮酰亚基的缩合)、固醇脂质和萜醇(prenol)脂质(源自异戊二烯亚基的缩合)。尽管有时将术语“脂质”用作脂肪的同义词，但脂肪是称作甘油三酯的脂质亚组。脂质还涵盖分子如脂肪酸和它们的衍生物(包括甘油三酯、甘油二酯、单甘油酯和磷脂)，以及包含固醇的代谢物如胆固醇。

脂肪酸或脂肪酸残基是由以羧酸基团终止的烃链形成的一组不同分子；这种排列赋予分子极性、亲水末端，以及不溶于水的非极性、疏水末端。通常长度为4-24个碳的碳链可以是饱和或不饱和的，并且可以连接至包含氧、卤素、氮和硫的官能团。如果脂肪酸包含双键，则可能具有顺式或反式几何异构现象，这显著影响分子的构型。顺式双键使脂肪酸链弯曲，这种作用与链中更多的双键混合在一起。脂肪酸类别中的其他主要脂质类别是脂肪酯和脂肪酰胺。

甘油脂包括单、二和三取代的甘油，最著名的是甘油的脂肪酸三酯，称作甘油三酯。词语“三酰甘油”有时与“甘油三酯”同义使用。在这些化合物中，甘油的三个羟基通常被不同脂肪酸各自酯化。甘油脂的其他亚类由糖基甘油代表，其特征在于存在通过糖苷键连接至甘油的一个或多个糖残基。

甘油磷脂是两亲性分子(包含疏水区和亲水区)，其包含甘油核心，所述甘油核心通过酯键连接至两个脂肪酸衍生的“尾部”，并且通过磷酸酯键连接至一个“头部”基团。通常称作磷脂(尽管鞘磷脂也被分类为磷脂)的甘油磷脂的实例包括磷脂酰胆碱(也称作PC、GPCho或卵磷脂)、磷脂酰乙醇胺(PE或GPEtn)和磷脂酰丝氨酸(PS或GPSer)。

鞘脂是一个复杂的化合物家族，其享有一个共同结构特征，鞘氨醇碱(sphingoidbase)骨架。哺乳动物中的主要鞘氨醇碱通常称作鞘氨醇。神经酰胺(N-酰基-鞘氨醇碱)是鞘氨醇碱衍生物的主要亚类，其具有酰胺连接的脂肪酸。脂肪酸通常是饱和或单不饱和的，具有16-26个碳原子的链长度。哺乳动物的主要磷脂鞘酯是鞘磷脂(神经酰胺磷酸胆碱)，而昆虫主要包含神经酰胺磷酸乙醇胺，真菌则具有植物神经酰胺磷酸肌醇和包含甘露糖的头基。鞘糖脂是一个多样化的分子家族，其包括一个或多个通过糖苷键连接至鞘氨醇碱的糖残基。这些的实例包括简单和复杂的鞘糖脂如脑苷脂和神经节苷脂。

固醇脂质，如胆固醇及其衍生物，或者生育酚及其衍生物，与甘油磷脂和鞘磷脂一起是膜脂质的重要组分。

糖脂描述其中脂肪酸直接连接至糖骨架，形成与膜双层相容的结构的化合物。在糖脂中，单糖取代甘油脂和甘油磷脂中存在的甘油骨架。最熟悉的糖脂是革兰氏阴性细菌中脂多糖的脂质A组分的酰化葡糖胺前体。典型的脂质A分子是葡糖胺的二糖，其由多达七个脂肪-酰基链衍生而成。在大肠杆菌生长中需要的最小脂多糖是Kdo2-脂质A，用两个3-脱氧-D-甘露-辛酮糖酸(3-deoxy-D-manno-octulosonic acid,Kdo)残基糖基化的葡糖胺的六酰化二糖。

聚酮是通过经典酶以及与脂肪酸合成酶享有机理特征的迭代和多模块酶聚合乙酰基和丙酰基亚基合成的。它们包含来自动物、植物、细菌、真菌和海洋来源的大量次级代谢物和天然产物，并且具有很大的结构多样性。许多聚酮是环状分子，其骨架通常通过糖基化、甲基化、羟基化、氧化或其他过程进一步修饰。

根据本公开，脂质和脂质样材料可以是阳离子、阴离子或中性的。中性脂质或脂质样材料在所选pH下以不带电荷或中性的两性离子形式存在。

阳离子或阳离子可电离的脂质或脂质样材料

本文描述的核酸颗粒可以包含至少一种阳离子或阳离子可电离的脂质或脂质样材料作为颗粒形成剂。预期用于本文的阳离子或阳离子可电离的脂质或脂质样材料包括能够静电结合核酸的任何阳离子或阳离子可电离的脂质或脂质样材料。在一实施方案中，预期用于本文的阳离子或阳离子可电离的脂质或脂质样材料可以与核酸缔合，例如通过与核酸形成复合物或者形成其中包围或包裹核酸的囊泡。

如本文所用，“阳离子脂质”或“阳离子脂质样材料”是指具有净正电荷的脂质或脂质样材料。阳离子脂质或脂质样材料通过静电相互作用结合带负电荷的核酸。一般来说，阳离子脂质具有亲脂性部分，如固醇、酰基链、二酰基或更多个酰基链，并且脂质的头基通常带有正电荷。

在某些实施方案中，阳离子脂质或脂质样材料仅在某些pH下，特别是在酸性pH下具有净正电荷，而在不同的，优选较高的pH如生理pH下，其优选没有净正电荷，优选没有电荷，即，其是中性的。与在生理pH下保持阳离子状态的颗粒相比，据认为这种可电离的行为通过帮助内体逃逸和降低毒性来增强效力。

为了本公开的目的，除非与语境矛盾，否则术语“阳离子脂质或脂质样材料”包含这类“阳离子可电离的”脂质或脂质样材料。

在一实施方案中，阳离子或阳离子可电离的脂质或脂质样材料包含头基，所述头基包括至少一个带正电荷或能够质子化的氮原子(N)。

阳离子脂质的实例包括但不限于1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium propane，DOTAP)；N,N-二甲基-2,3-二油基氧基丙胺(N,N-dimethyl-2,3-dioleyloxypropylamine，DODMA)、1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane，DOTMA)、3-(N—(N′,N′-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰基)胆固醇(3-(N—(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl)cholesterol，DC-Chol)、二甲基双十八烷基铵(dimethyldioctadecylammonium，DDAB)；1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(1,2-dioleoyl-3-dimethylammonium-propane，DODAP)；1,2-二酰基氧基-3-二甲基铵丙烷(1,2-diacyloxy-3-dimethylammonium propane)；1,2-二烷氧基-3-二甲基铵丙烷(1,2-dialkyloxy-3-dimethylammonium propane)；双十八烷基二甲基氯化铵(dioctadecyldimethyl ammonium chloride，DODAC)、1,2-二硬脂基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(1,2-distearyloxy-N,N-dimethyl-3-aminopropane，DSDMA)、2,3-二(十四烷基氧基)丙基-(2-羟基乙基)-二甲基氨鎓(2,3-di(tetradecoxy)propyl-(2-hydroxyethyl)-dimethylazanium，DMRIE)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine，DMEPC)、l,2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷(l,2-dimyristoyl-3-trimethylammonium propane，DMTAP)、1,2-二油基氧基丙基-3-二甲基-羟基乙基溴化铵(1,2-dioleyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxyethylammonium bromide，DORIE)、和2,3-二油酰基氧基-N-[2(精胺羧酰胺)乙基]-N,N-二甲基-l-丙胺鎓三氟乙酸盐(2,3-dioleoyloxy-N-[2(spermine carboxamide)ethyl]-N,N-dimethyl-l-propanamium trifluoroacetate，DOSPA)、1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(1,2-dilinoleyloxy-N,N-dimethylaminopropane，DLinDMA)、1,2-二亚油烯基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(1,2-dilinolenyloxy-N,N-dimethylaminopropane，DLenDMA)、双十八烷基酰氨基甘氨酰基精胺(dioctadecylamidoglycyl spermine，DOGS)、3-二甲基氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁烷-4-氧基)-1-(顺式,顺式-9,12-十八碳二烯基氧基)丙烷(3-dimethylamino-2-(cholest-5-en-3-beta-oxybutan-4-oxy)-1-(cis,cis-9,12-oc-tadecadienoxy)propane，CLinDMA)、2-[5′-(胆甾-5-烯-3-β-氧基)-3′-氧杂戊氧基)-3-二甲基-1-(顺式,顺式-9′,12′-十八碳二烯氧基)丙烷(2-[5′-(cholest-5-en-3-beta-oxy)-3′-oxapentoxy)-3-dimethyl-1-(cis,cis-9′,12′-octadecadienoxy)propane，CpLinDMA)、N,N-二甲基-3,4-二油基氧基苄胺(N,N-dimethyl-3,4-dioleyloxybenzylamine，DMOBA)、1,2-N,N′-二油基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(1,2-N,N′-dioleylcarbamyl-3-dimethylaminopropane，DOcarbDAP)、2,3-二亚油酰基氧基-N,N-二甲基丙胺(2,3-Dilinoleoyloxy-N,N-dimethylpropylamine，DLinDAP)、1,2-N,N′-二亚油基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(1,2-N,N′-Dilinoleylcarbamyl-3-dimethylaminopropane，DLincarbDAP)、1,2-二亚油酰基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(1,2-Dilinoleoylcarbamyl-3-dimethylaminopropane，DLinCDAP)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(2,2-dilinoleyl-4-dimethylaminomethyl-[1,3]-dioxolane，DLin-K-DMA)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(2,2-dilinoleyl-4-dimethylaminoethyl-[1,3]-dioxolane，DLin-K-XTC2-DMA)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(2,2-dilinoleyl-4-(2-dimethylaminoethyl)-[1,3]-dioxolane，DLin-KC2-DMA)、三十七烷基-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-yl-4-(dimethylamino)butanoate，DLin-MC3-DMA)、N-(2-羟基乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷基氧基)-1-丙胺鎓溴化物(N-(2-Hydroxyethyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(tetradecyloxy)-1-propanaminium bromide，DMRIE)、(±)-N-(3-氨基丙基)-N,N-二甲基-2,3-双(顺式-9-十四烯基氧基)-1-丙胺鎓溴化物((±)-N-(3-aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(cis-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminium bromide，GAP-DMORIE)、(±)-N-(3-氨基丙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十二烷基氧基)-1-丙胺鎓溴化物((±)-N-(3-aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(dodecyloxy)-1-propanaminium bromide，GAP-DLRIE)、(±)-N-(3-氨基丙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷基氧基)-1-丙胺鎓溴化物((±)-N-(3-aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(tetradecyloxy)-1-propanaminium bromide，GAP-DMRIE)、N-(2-氨基乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷基氧基)-1-丙胺鎓溴化物(N-(2-Aminoethyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(tetradecyloxy)-1-propanaminium bromide，βAE-DMRIE)、N-(4-羧基苄基)-N,N-二甲基-2,3-双(油酰基氧基)丙烷-1-胺鎓(N-(4-carboxybenzyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(oleoyloxy)propan-1-aminium，DOBAQ)、2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(2-({8-[(3β)-cholest-5-en-3-yloxy]octyl}oxy)-N,N-dimethyl-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-yloxy]propan-1-amine，Octyl-CLinDMA)、1,2-二肉豆蔻酰基-3-二甲基铵-丙烷(1,2-dimyristoyl-3-dimethylammonium-propane，DMDAP)、1,2-二棕榈酰-3-二甲基铵-丙烷(1,2-dipalmitoyl-3-dimethylammonium-propane，DPDAP)、N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基-丙基)氨基]丁基羧酰胺基)乙基]-3,4-二[油基氧基]-苯甲酰胺(N1-[2-((1S)-1-[(3-aminopropyl)amino]-4-[di(3-amino-propyl)amino]butylcarboxamido)ethyl]-3,4-di[oleyloxy]-benzamide，MVL5)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine，DOEPC)、2,3-双(十二烷基氧基)-N-(2-羟基乙基)-N,N-二甲基丙烷-1-溴化铵(2,3-bis(dodecyloxy)-N-(2-hydroxyethyl)-N,N-dimethylpropan-1-amonium bromide，DLRIE)、N-(2-氨基乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷基氧基)丙烷-1-胺鎓溴化物(N-(2-aminoethyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(tetradecyloxy)propan-1-aminium bromide，DMORIE)、二((Z)-壬-2-烯-1-基)8,8'-((((2(二甲基氨基)乙基)硫代)羰基)氮烷二基)二辛酸酯(di((Z)-non-2-en-1-yl)8,8'-((((2(dimethylamino)ethyl)thio)carbonyl)azanediyl)dioctanoate，ATX)、N,N-二甲基-2,3-双(十二烷基氧基)丙烷-1-胺(N,N-dimethyl-2,3-bis(dodecyloxy)propan-1-amine，DLDMA)、N,N-二甲基-2,3-双(十四烷基氧基)丙烷-1-胺(N,N-dimethyl-2,3-bis(tetradecyloxy)propan-1-amine，DMDMA)、二((Z)-壬-2-烯-1-基)-9-((4-(二甲基氨基丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(Di((Z)-non-2-en-1-yl)-9-((4-(dimethylaminobutanoyl)oxy)heptadecanedioate，L319)、N-十二烷基-3-((2-十二烷基氨甲酰基-乙基)-{2-[(2-十二烷基氨甲酰基-乙基)-2-{(2-十二烷基氨甲酰基-乙基)-[2-(2-十二烷基氨甲酰基-乙基氨基)-乙基]-氨基}-乙基氨基)丙酰胺(N-Dodecyl-3-((2-dodecylcarbamoyl-ethyl)-{2-[(2-dodecylcarbamoyl-ethyl)-2-{(2-dodecylcarbamoyl-ethyl)-[2-(2-dodecylcarbamoyl-ethylamino)-ethyl]-amino}-ethylamino)propionamide，lipidoid 98N₁₂-5)、1-[2-[双(2-羟基十二烷基)氨基]乙基-[2-[4-[2-[双(2羟基十二烷基)氨基]乙基]哌嗪-1-基]乙基]氨基]十二烷-2-醇(1-[2-[bis(2-hydroxydodecyl)amino]ethyl-[2-[4-[2-[bis(2hydroxydodecyl)amino]ethyl]piperazin-1-yl]ethyl]amino]dodecan-2-ol，lipidoid C12-200)。

在一些实施方案中，阳离子脂质可以包含颗粒中存在的总脂质的约10摩尔(mol)％-约100摩尔％、约20摩尔％-约100摩尔％、约30摩尔％-约100摩尔％、约40摩尔％-约100摩尔％或约50摩尔％-约100摩尔％。

额外的脂质或脂质样材料

本文描述的颗粒还可以包含除阳离子或阳离子可电离的脂质或脂质样材料以外的脂质或脂质样材料，即，非阳离子脂质或脂质样材料(包括非阳离子可电离的脂质或脂质样材料)。阴离子和中性脂质或脂质样材料在本文中统称为非阳离子脂质或脂质样材料。通过添加除可电离/阳离子脂质或脂质样材料以外的其他疏水部分如胆固醇和脂质来优化核酸颗粒的制剂，可以增强颗粒稳定性和核酸递送的效力。

可以掺入额外的脂质或脂质样材料，其可以影响或不影响核酸颗粒的总电荷。在某些实施方案中，额外的脂质或脂质样材料是非阳离子脂质或脂质样材料。非阳离子脂质可以包含例如一种或多种阴离子脂质和/或中性脂质。如本文所用，“阴离子脂质”是指在所选pH下带负电荷的任何脂质。如本文所用，“中性脂质”是指在所选pH下以不带电荷或中性的两性离子形式存在的多种脂质物质中的任一种。在优选的实施方案中，额外的脂质包含以下中性脂质组分之一：(1)磷脂，(2)胆固醇或其衍生物；或者(3)磷脂以及胆固醇或其衍生物的混合物。胆固醇衍生物的实例包括但不限于胆甾烷醇、胆甾烷酮、胆甾烯酮、粪固醇、胆固醇基-2'-羟基乙基醚、胆固醇基-4'-羟基丁基醚、生育酚及其衍生物，以及它们的混合物。

可以使用的特定磷脂包括但不限于磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸或鞘磷脂。这类磷脂特别包括二酰基磷脂酰胆碱，如二硬脂酰基磷脂酰胆碱(distearoylphosphatidylcholine,DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(dioleoylphosphatidylcholine,DOPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(dimyristoylphosphatidylcholine,DMPC)、双十五酰基磷脂酰胆碱(dipentadecanoylphosphatidylcholine)、二月桂酰基磷脂酰胆碱(dilauroylphosphatidylcholine)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(dipalmitoylphosphatidylcholine,DPPC)、二花生四烯酰基磷脂酰胆碱(diarachidoylphosphatidylcholine,DAPC)、二二十二酰基磷脂酰胆碱(dibehenoylphosphatidylcholine,DBPC)、二二十三酰基磷脂酰胆碱(ditricosanoylphosphatidylcholine,DTPC)、二二十四酰基磷脂酰胆碱(dilignoceroylphatidylcholine,DLPC)、棕榈酰油酰基-磷脂酰胆碱(palmitoyloleoyl-phosphatidylcholine,POPC)、1,2-二-O-十八烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1,2-di-O-octadecenyl-sn-glycero-3-phosphocholine,18:0Diether PC)、1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1-oleoyl-2-cholesterylhemisuccinoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1-hexadecyl-sn-glycero-3-phosphocholine,C16Lyso PC)和磷脂酰乙醇胺，特别是二酰基磷脂酰乙醇胺，如二油酰基磷脂酰乙醇胺(dioleoylphosphatidylethanolamine,DOPE)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(distearoyl-phosphatidylethanolamine,DSPE)、二棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺(dipalmitoyl-phosphatidylethanolamine,DPPE)、二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺(dimyristoyl-phosphatidylethanolamine,DMPE)、二月桂酰基-磷脂酰乙醇胺(dilauroyl-phosphatidylethanolamine,DLPE)、二植烷酰基-磷脂酰乙醇胺(diphytanoyl-phosphatidylethanolamine,DPyPE)，以及具有不同疏水链的其他磷脂酰乙醇胺脂质。

在某些优选的实施方案中，额外的脂质是DSPC或DSPC和胆固醇。

在某些实施方案中，核酸颗粒包括阳离子脂质和额外的脂质。

在一实施方案中，本文描述的颗粒包括聚合物缀合的脂质如聚乙二醇化的脂质。术语“聚乙二醇化的脂质”是指包含脂质部分和聚乙二醇部分的分子。聚乙二醇化的脂质是本领域已知的。

不希望受理论束缚，与至少一种额外脂质的量相比，至少一种阳离子脂质的量可能影响重要的核酸颗粒特征，如电荷、粒径、稳定性、组织选择性和核酸的生物活性。因此，在一些实施方案中，至少一种阳离子脂质比至少一种额外脂质的摩尔比是约10:0至约1:9、约4:1至约1:2或约3:1至约1:1。

在一些实施方案中，非阳离子脂质特别是中性脂质(如一种或多种磷脂和/或胆固醇)可以包含颗粒中存在的总脂质的约0摩尔％至约90摩尔％、约0摩尔％至约80摩尔％、约0摩尔％至约70摩尔％、约0摩尔％至约60摩尔％或约0摩尔％至约50摩尔％。

Lipoplex颗粒

在本公开的某些实施方案中，本文描述的RNA可以存在于RNA lipoplex颗粒中。

在本公开的上下文中，术语“RNA lipoplex颗粒”涉及包含脂质，特别是阳离子脂质和RNA的颗粒。带正电荷的脂质体和带负电荷的RNA之间的静电相互作用导致RNAlipoplex颗粒的复合(complexation)和自发形成。带正电荷的脂质体一般可以利用阳离子脂质如DOTMA和额外的脂质如DOPE合成。在一实施方案中，RNA lipoplex颗粒是纳米颗粒。

在某些实施方案中，RNA lipoplex颗粒包括阳离子脂质和额外的脂质。在一示例性实施方案中，阳离子脂质是DOTMA，额外的脂质是DOPE。

在一些实施方案中，至少一种阳离子脂质比至少一种额外的脂质的摩尔比是约10:0至约1:9、约4:1至约1:2或约3:1至约1:1。在具体实施方案中，所述摩尔比可以是约3:1、约2.75:1、约2.5:1、约2.25:1、约2:1、约1.75:1、约1.5:1、约1.25:1或约1:1。在一示例性实施方案中，至少一种阳离子脂质比至少一种额外的脂质的摩尔比是约2:1。

本文描述的RNA lipoplex颗粒的平均直径在一实施方案中可以为约200nm-约1000nm、约200nm-约800nm、约250-约700nm、约400-约600nm、约300nm-约500nm或约350nm-约400nm。在具体实施方案中，RNA lipoplex颗粒的平均直径为约200nm、约225nm、约250nm、约275nm、约300nm、约325nm、约350nm、约375nm、约400nm、约425nm、约450nm、约475nm、约500nm、约525nm、约550nm、约575nm、约600nm、约625nm、约650nm、约700nm、约725nm、约750nm、约775nm、约800nm、约825nm、约850nm、约875nm、约900nm、约925nm、约950nm、约975nm或约1000nm。在一实施方案中，RNA lipoplex颗粒的平均直径为约250nm-约700nm。在另一实施方案中，RNA lipoplex颗粒的平均直径为约300nm-约500nm。在一示例性实施方案中，RNA lipoplex颗粒的平均直径为约400nm。

本文描述的RNA lipoplex颗粒和包含RNA lipoplex颗粒的组合物可用于在肠胃外给药之后，特别是静脉内给药之后，将RNA递送至靶组织。可以利用脂质体制备RNAlipoplex颗粒，所述脂质体可以通过将脂质在乙醇中的溶液注射至水或合适的水相中来获得。在一实施方案中，水相具有酸性pH。在一实施方案中，水相包含乙酸，例如，约5mM的量。通过将脂质体与RNA混合，脂质体可以用于制备RNA lipoplex颗粒。在一实施方案中，脂质体和RNA lipoplex颗粒包含至少一种阳离子脂质和至少一种额外的脂质。在一实施方案中，至少一种阳离子脂质包含1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane，DOTMA)和/或1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane，DOTAP)。在一实施方案中，至少一种额外的脂质包含1,2-二-(9Z-十八烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(1,2-di-(9Z-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，DOPE)、胆固醇(cholesterol，Chol)和/或1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DOPC)。在一实施方案中，至少一种阳离子脂质包含1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane，DOTMA)，而至少一种额外的脂质包含1,2-二-(9Z-十八烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(1,2-di-(9Z-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，DOPE)。在一实施方案中，脂质体和RNA lipoplex颗粒包含1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane，DOTMA)和1,2-二-(9Z-十八烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(1,2-di-(9Z-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，DOPE)。

脂质纳米颗粒(LNP)

在一实施方案中，本文描述的核酸如RNA以脂质纳米颗粒(LNP)的形式给药。LNP可以包含能够形成颗粒的任何脂质，一个或多个核酸分子附着在所述脂质上，或者一个或多个核酸分子包裹在所述脂质中。

在一实施方案中，LNP包含一种或多种阳离子脂质，以及一种或多种稳定脂质。稳定脂质包括中性脂质和聚乙二醇化的脂质。

在一实施方案中，LNP包含阳离子脂质、中性脂质、类固醇、聚合物缀合的脂质；以及RNA，包裹在脂质纳米颗粒内或与脂质纳米颗粒缔合。

在一实施方案中，LNP包含40-55摩尔百分比、40-50摩尔百分比、41-49摩尔百分比、41-48摩尔百分比、42-48摩尔百分比、43-48摩尔百分比、44-48摩尔百分比、45-48摩尔百分比、46-48摩尔百分比、47-48摩尔百分比或47.2-47.8摩尔百分比的阳离子脂质。在一实施方案中，LNP包含约47.0、47.1、47.2、47.3、47.4、47.5、47.6、47.7、47.8、47.9或48.0摩尔百分比的阳离子脂质。

在一实施方案中，中性脂质以5-15摩尔百分比、7-13摩尔百分比或9-11摩尔百分比的浓度存在。在一实施方案中，中性脂质以约9.5、10或10.5摩尔百分比的浓度存在。

在一实施方案中，类固醇以30-50摩尔百分比、35-45摩尔百分比或38-43摩尔百分比的浓度存在。在一实施方案中，类固醇以约40、41、42、43、44、45或46摩尔百分比的浓度存在。

在一实施方案中，LNP包含1-10摩尔百分比、1-5摩尔百分比或1-2.5摩尔百分比的聚合物缀合的脂质。

在一实施方案中，LNP包含40-50摩尔百分比的阳离子脂质；5-15摩尔百分比的中性脂质；35-45摩尔百分比的类固醇；1-10摩尔百分比的聚合物缀合的脂质；以及RNA，包裹在脂质纳米颗粒内或与脂质纳米颗粒缔合。

在一实施方案中，基于脂质纳米颗粒中存在的脂质的总摩尔来确定摩尔百分比。

在一实施方案中，中性脂质选自DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE、DOPG、DPPG、POPE、DPPE、DMPE、DSPE和SM。在一实施方案中，中性脂质选自DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE和SM。在一实施方案中，中性脂质是DSPC。

在一实施方案中，类固醇是胆固醇。

在一实施方案中，聚合物缀合的脂质是聚乙二醇化的脂质。在一实施方案中，聚乙二醇化的脂质具有以下结构：

或者其药学可接受的盐、互变异构体或立体异构体，其中：

R¹²和R¹³各自独立地是包含10-30个碳原子的直链或支化的、饱和或不饱和的烷基链，其中所述烷基链任选地被一个或多个酯键中断；并且w的平均值为30-60。在一实施方案中，R¹²和R¹³各自独立地是包含12-16个碳原子的直链、饱和的烷基链。在一实施方案中，w的平均值为40-55。在一实施方案中，平均w为约45。在一实施方案中，R¹²和R¹³各自独立地是包含约14个碳原子的直链、饱和的烷基链，并且w的平均值为约45。

在一些实施方案中，LNP的阳离子脂质组分具有式(III)的结构：

或者其药学可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中：

L¹或L²之一是–O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)_x-、-S-S-、-C(＝O)S-、

SC(＝O)-、-NR^aC(＝O)-、-C(＝O)NR^a-、NR^aC(＝O)NR^a、-OC(＝O)NR^a-或-NR^aC(＝O)O-，并且L¹或L²中的另一个是–O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)_x-、-SS-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NR^aC(＝O)-、-C(＝O)NR^a-、NR^aC(＝O)NR^a、-OC(＝O)NR^a-或-NR^aC(＝O)O-或直接的键；

G¹和G²各自独立地是未取代的C₁-C₁₂亚烷基或C₁-C₁₂亚烯基；

G³是C₁-C₂₄亚烷基、C₁-C₂₄亚烯基、C₃-C₈亚环烷基、C₃-C₈亚环烯基；

R^a是H或C₁-C₁₂烷基；

R¹和R²各自独立地是C₆-C₂₄烷基或C₆-C₂₄烯基；

R³是H、OR⁵、CN、-C(＝O)OR⁴、-OC(＝O)R⁴或–NR⁵C(＝O)R⁴；

R⁴是C₁-C₁₂烷基；

R⁵是H或C₁-C₆烷基；并且

x是0、1或2。

在式(III)的一些前述实施方案中，脂质具有以下结构(IIIA)或(IIIB)之一：

其中：

A是3-8元环烷基或亚环烷基环；

在每次出现时，R⁶独立地是H、OH或C₁-C₂₄烷基；

n是1-15的整数。

在式(III)的一些前述实施方案中，脂质具有结构(IIIA)，并且在其他实施方案中，脂质具有结构(IIIB)。

在式(III)的其他实施方案中，脂质具有以下结构(IIIC)或(IIID)之一：

其中y和z各自独立地是1-12的整数。

在式(III)的任何前述实施方案中，L¹或L²之一是O(C＝O)。例如，在一些实施方案中，L¹和L²各自是O(C＝O)。在前述任一项的一些不同实施方案中，L¹和L²各自独立地是(C＝O)O或O(C＝O)-。例如，在一些实施方案中，L¹和L²各自是(C＝O)O。

在式(III)的一些不同实施方案中，脂质具有以下结构(IIIE)或(IIIF)之一：

在式(III)的一些前述实施方案中，脂质具有以下结构(IIIG)、(IIIH)、(IIII)或(IIIJ)之一：

在式(III)的一些前述实施方案中，n是2-12的整数，例如2-8或2-4。例如，在一些实施方案中，n是3、4、5或6。在一些实施方案中，n是3。在一些实施方案中，n是4。在一些实施方案中，n是5。在一些实施方案中，n是6。

在式(III)的一些其他前述实施方案中，y和z各自独立地是2-10的整数。例如，在一些实施方案中，y和z各自独立地是4-9或4-6的整数。

在式(III)的一些前述实施方案中，R⁶是H。在其他前述实施方案中，R⁶是C₁-C₂₄烷基。在其他实施方案中，R⁶是OH。

在式(III)的一些实施方案中，G³是未取代的。在其他实施方案中，G3是取代的。在各种不同实施方案中，G³是线性C₁-C₂₄亚烷基或线性C₁-C₂₄亚烯基。

在式(III)的一些其他前述实施方案中，R¹或R²或两者是C₆-C₂₄烯基。例如，在一些实施方案中，R¹和R²各自独立地具有以下结构：

其中：

在每次出现时，R^7a和R^7b独立地是H或C₁-C₁₂烷基；并且

a是2-12的整数，

其中各自选择R^7a、R^7b和a，从而R¹和R²各自独立地包含6-20个碳原子。例如，在一些实施方案中，a是5-9或8-12的整数。

在式(III)的一些前述实施方案中，R⁷的至少一次出现是H。例如，在一些实施方案中，在每次出现时R^7a是H。在前述其他不同实施方案中，R^7b的至少一次出现是C₁-C₈烷基。例如，在一些实施方案中，C₁-C₈烷基是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基或正辛基。

在式(III)的不同实施方案中，R¹或R²或两者具有以下结构之一：

在式(III)的一些前述实施方案中，R³是OH、CN、-C(＝O)OR⁴、-OC(＝O)R⁴或–NHC(＝O)R⁴。在一些实施方案中，R⁴是甲基或乙基。

在各种不同实施方案中，式(III)的阳离子脂质具有下表所示的结构之一。

式(III)的代表性化合物

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在一些实施方案中，LNP包含式(III)的脂质、RNA、中性脂质、类固醇和聚乙二醇化的脂质。在一些实施方案中，式(III)的脂质是化合物III-3。在一些实施方案中，中性脂质是DSPC。在一些实施方案中，类固醇是胆固醇。在一些实施方案中，聚乙二醇化的脂质是ALC-0159。

ALC-0159：

在一些实施方案中，阳离子脂质以约40-约50摩尔百分比的量存在于LNP中。在一实施方案中，中性脂质以约5-约15摩尔百分比的量存在于LNP中。在一实施方案中，类固醇以约35-约45摩尔百分比的量存在于LNP中。在一实施方案中，聚乙二醇化的脂质以约1-约10摩尔百分比的量存在于LNP中。

在一些实施方案中，LNP包含约40-约50摩尔百分比的量的化合物III-3，约5-约15摩尔百分比量的DSPC，约35-约45摩尔百分比量的胆固醇，以及约1-约10摩尔百分比量的ALC-0159。

在一些实施方案中，LNP包含约47.5摩尔百分比的量的化合物III-3，约10摩尔百分比量的DSPC，约40.7摩尔百分比量的胆固醇，以及约1.8摩尔百分比量的ALC-0159。

N/P值优选是至少约4。在一些实施方案中，N/P值的范围为4-20、4-12、4-10、4-8或5-7。在一实施方案中，N/P值是约6。

药物组合物

本文描述的药剂(agent)可以在药物组合物或药物中给药，并且可以以任何合适的药物组合物的形式给药。

在一实施方案中，本文描述的药物组合物是针对受试者中的冠状病毒的组合物。

在本发明的所有方面的一实施方案中，本文描述的组分如编码结合剂的RNA可以在药物组合物中给药，药物组合物可以包含药学可接受的载剂，并且可以任选地包含一种或多种佐剂、稳定剂等。在一实施方案中，药物组合物用于治疗性或预防性治疗，例如，用于治疗或预防冠状病毒感染。

术语“药物组合物”涉及包含治疗有效物质，优选与药学可接受的载剂、稀释剂和/或赋形剂一起的制剂。通过向受试者给药药物组合物，所述药物组合物可用于治疗、预防或降低疾病或病症的严重程度。药物组合物在本领域中也称作药物制剂。

本公开的药物组合物一般以“药学有效量”和“药学可接受的制剂”应用。

术语“药学可接受的”是指物质的无毒性，其不与药物组合物的活性组分的作用相互作用。

术语“药学有效量”或“治疗有效量”是指单独或与进一步的剂量一起实现期望反应或期望效果的量。在治疗特定疾病的情况下，期望的反应优选涉及抑制疾病过程。这包括减缓疾病的发展，以及特别地，中断或逆转疾病的发展。治疗疾病中的期望反应还可以是延迟所述疾病或所述疾病状况的发生或者防止所述疾病或所述疾病状况的发生。本文描述的组合物的有效量取决于待治疗的疾病状况，疾病的严重程度，患者的个体参数，包括年龄、生理状况、尺寸和体重，治疗的持续时间，伴随疗法的类型(如果存在)，给药的具体途径以及相似因素。因此，本文描述的组合物的给药剂量可以取决于许多这样的参数。在用初始剂量患者中的反应不足的情况下，可以使用更高剂量(或者通过不同的、更局部化的给药途径有效达到的更高剂量)。

本公开的药物组合物可以包含盐、缓冲剂、防腐剂和任选存在的其他治疗剂。在一实施方案中，本公开的药物组合物包含一种或多种药学可接受的载剂、稀释剂和/或赋形剂。

用于本公开的药物组合物的合适的防腐剂包括但不限于苯扎氯铵、氯代丁醇、对羟基苯甲酸酯和硫柳汞。

如本文所用的术语“赋形剂”是指可以存在于本公开的药物组合物中但不是活性成分的物质。赋形剂的实例包括但不限于载剂、粘合剂、稀释剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂、增香剂或着色剂。

术语“稀释剂”涉及稀释(diluting)和/或稀释(thinning)剂。此外，术语“稀释剂”包括流体、液体或固体悬浮液和/或混合介质中的任何一种或多种。合适的稀释剂的实例包括乙醇、甘油和水。

术语“载剂”是指可以是天然的、合成的、有机的、无机的组分，其中组合了活性组分以促进、增强或实现药物组合物的给药。如本文所用的载剂可以是一种或多种相容的固体或液体填充剂、稀释剂或包裹物质，其适合给予受试者。合适的载剂包括但不限于无菌水、林格氏液、乳酸林格氏液、无菌氯化钠溶液、等渗盐水、聚亚烷基二醇、氢化萘以及特别的生物相容性丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯/聚氧-丙烯共聚物。在一实施方案中，本公开的药物组合物包括等渗盐水。

用于治疗用途的药学可接受的载剂、赋形剂或稀释剂是药学领域公知的，并且例如在Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.(A.R Gennaroedit.1985)中进行了描述。

药物载剂、赋形剂或稀释剂可以根据预期的给药途径和标准药物实践进行选择。

在一实施方案中，本文描述的药物组合物可以静脉内、动脉内、皮下、皮内或肌肉内给药。在某些实施方案中，将药物组合物配制用于局部给药或全身给药。全身给药可以包括肠道给药，其包括通过胃肠道吸收，或者肠胃外给药。如本文所用，术语“肠胃外给药”是指以通过胃肠道以外的任何方式给药，如通过静脉内注射。在一优选实施方案中，将药物组合物配制用于肌肉内给药。在另一实施方案中，将药物组合物配制用于全身给药，例如，用于静脉内给药。

如本文所用的术语“共给药”表示向同一患者给药不同化合物或组合物的过程。不同化合物或组合物可以同时、基本上同时或顺序给药。

治疗

本发明提供阻断冠状病毒S蛋白与ACE2结合的方法和药剂，特别是中和受试者中冠状病毒S蛋白与ACE2的结合。本文所述的方法可以包括给药有效量的组合物，所述组合物包含编码本文所述结合剂的RNA。

在一实施方案中，本文所述的方法和药剂在受试者中提供对冠状病毒、冠状病毒感染或者与冠状病毒相关的疾病或病症的中和效应。因此本发明提供用于治疗或预防与冠状病毒相关的感染、疾病或病症的方法和药剂。

如本文所用，术语“中和”是指其中结合剂与病毒的生物活性位点如受体结合蛋白结合，从而抑制细胞的病毒感染的事件。特别地，术语“中和”是指可以消除或显著降低所关注的病毒的毒力(例如感染细胞的能力)的结合剂。

在一实施方案中，将本文所述的方法或药剂给药至患有与冠状病毒相关的感染、疾病或病症的受试者。在一实施方案中，将本文所述的方法或药剂给药至有发展与冠状病毒相关的感染、疾病或病症的风险的受试者。例如，可以将本文所述的方法和药剂给药至有与冠状病毒接触风险的受试者。在一实施方案中，可以将本文所述的方法和药剂给药至生活、旅行或预期旅行至冠状病毒流行的地理区域的受试者。在一实施方案中，将本文所述的方法和药剂给药至与生活、旅行或预期旅行至冠状病毒流行的地理区域的另一个人接触或预期接触的受试者。在一实施方案中，将本文所述的方法和药剂给药至已知通过其职业或其他接触而暴露于冠状病毒的受试者。在一实施方案中，冠状病毒是SARS-CoV-1或SARS-CoV-2。在一实施方案中，冠状病毒是SARS-CoV-2。

可以将本发明的治疗化合物或组合物预防性地(即，为了防止疾病或病症)或治疗性地(即，为了治疗疾病或病症)给药至患有或有风险(或易于)发展疾病或病症的受试者。可以利用标准临床方法鉴定这类受试者。在本发明的上下文中，预防性给药发生在显示疾病的明显临床症状之前，从而预防疾病或病症或者延迟其发展。在医学领域的上下文中，术语“预防”涵盖减少疾病引起的死亡率或发病率负担的任何活动。预防可以发生在一级、二级和三级预防水平。虽然一级预防避免疾病的发展，但是预防的二级和三级水平涵盖旨在预防疾病发展和症状出现以及通过恢复功能和减少疾病相关并发症来减少已建立的疾病的负面影响的活动。

在一些实施方案中，本发明的药剂或组合物的给药可以通过单次给药进行或通过多次给药加强。

术语“疾病”是指影响个体身体的异常状况。疾病通常理解为与特定症状或体征有关的医学状况。疾病可以由源自外部来源的因素引起，如传染病，或者其可以由内部功能失调引起，如自身免疫性疾病。在人中，“疾病”通常更广泛地用来指引起患病个体的疼痛、功能障碍、窘迫、社会问题或死亡或者与个体接触的人的相似问题的任何状况。在这个更广泛的意义上，其有时包括损伤、残疾、病症、综合征、感染、分离的症状、偏差行为以及结构和功能的非典型变化，但是在其他上下文中和为了其他目的，这些可以认为是可区分的类别。疾病通常不仅在身体上，而且还在情感上影响个体，因为感染和患有许多疾病可以改变一个人的人生观和一个人的性格。

在本文中，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”或“治疗性干预”涉及为了对抗疾病状况如疾病或病症的目的而对受试者的管理和护理。该术语旨在包括对受试者遭受的给定疾病状况的全范围治疗，如给药治疗有效的化合物以减轻症状或并发症，延迟疾病、病症或疾病状况的发展，减轻或缓解症状和并发症，和/或治愈或消除疾病、病症或疾病状况以及预防疾病状况，其中预防应理解为为了对抗疾病、疾病状况或病症的目的而对个体的管理和护理，并且包括给药活性化合物以预防症状或并发症的发生。

术语“治疗性治疗”涉及改善健康状态和/或延长(增加)个体寿命的任何治疗。治疗可以消除个体中的疾病，阻止或减缓个体中疾病的发展，抑制或减缓个体中疾病的发展，减少个体中症状的频率或严重程度，和/或减少目前患有或以前患有疾病的个体中的复发。

术语“预防性治疗”或“预防治疗”涉及意图防止疾病在个体中发生的任何治疗。术语“预防性治疗”或“预防治疗”在本文中可互换使用。

术语“个体”和“受试者”在本文中可互换使用。它们是指可以患有或易患疾病或病症但是可能有或可能没有疾病或病症的人或另一哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、羊、马或灵长类)。在许多实施方案中，个体是人。除非另有说明，术语“个体”和“受试者”不表示特定年龄，因此涵盖成年人、老年人、儿童和新生儿。在本公开的实施方案中，“个体”或“受试者”是“患者”。

术语“患者”表示治疗的个体或受试者，特别是患病的个体或受试者。

在本公开的一实施方案中，目的是预防或治疗冠状病毒感染。

术语“传染病”是指可以从个体传播至个体或从生物体传播至生物体的任何疾病，并且是由微生物因子引起的(例如普通感冒)。传染病是本领域已知的，并且包括例如病毒性疾病、细菌性疾病或寄生虫性疾病，所述疾病分别是由病毒、细菌和寄生虫引起的。在这方面，传染病可以是例如肝炎、性传播疾病(例如衣原体病或淋病)、结核病、HIV/获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、白喉、乙型肝炎、丙型肝炎、霍乱、严重急性呼吸综合征(SARS)、禽流感和流感。

本文参考的文件和研究的引用并不旨在承认任何前述内容是相关的现有技术。关于这些文件内容的所有陈述都是基于申请人可获得的信息，并且不构成对这些文件内容正确性的任何承认。

提出以下描述以使本领域普通技术人员能够制备和使用各种实施方案。特定设备、技术和应用的描述仅作为实例提供。对本文描述的实例的各种修改对于本领域普通技术人员会显而易见，并且在不背离各种实施方案的精神和范围的情况下，本文中定义的一般原理可以应用于其他实例和应用。因此，各种实施方案不是为了限制本文描述和示出的实例，而是与符合权利要求的范围一致。

实施例

实施例1：SARS-CoV-2和SARS-CoV S1蛋白靶向分子的产生

为了产生具有强效结合以及SARS-CoV和SARS-CoV-2病毒中和活性的分子，将以前描述的抗SARS-CoV S1蛋白特异性抗体(抗S1抗体；ter Meulen et al,2006)的轻链N-末端或C-末端融合至ACE2胞外域(aa 18-615)。将突变R273Q、H345L、H374N、H378N引入ACE2胞外域以避免酶促活性和底物结合(Guy et al,2005)。在一些构建体的抗S1抗体重链中引入LS(M428L/N434S)突变，据描述该突变导致体内的半衰期更长(Zalevsky et al 2009)。将编码这些蛋白构建体的质粒DNA转染至HEK-293FreeStyle^TM细胞中，并且通过蛋白-A亲和性和随后的大小排阻色谱从培养上清液纯化蛋白。图1提供关于所产生的构建体的概述。

实施例2：抗S1抗体-ACE2融合蛋白与重组SARS-CoV2 S1-RBD蛋白的结合

在ELISA中确定抗S1抗体-ACE2融合蛋白与SARS-CoV2 S1-RBD蛋白的结合效力。

将小鼠-Fc标记的SARS-CoV2 S1-RBD(Sino Biologicals)重组蛋白以PBS中2.5μg/ml的浓度包被在384-孔Nunc MaxiSorp^TM平底板上，在室温下放置60分钟。用PBS 0.1％Tween(洗涤缓冲液)洗涤3次后，用PBS、2％BSA、0.05％Tween在室温下封闭60分钟，再洗涤3次，在PBS、0.5％BSA、0.05％Tween(ELISA缓冲液)中加入抗S1抗体-ACE2融合蛋白，浓度为20,000-0.013ng/ml，并且将板在室温下温育60分钟。作为对照，使用具有人-Fc标签的重组ACE-2胞外域。用洗涤缓冲液洗涤3次后，在ELISA缓冲液中加入辣根过氧化物酶偶联的检测抗人IgG、Fcγ片段特异性F(ab’)₂片段(Jackson Immuno Research)，稀释度为1:2,500。将板在室温下温育60分钟，用洗涤缓冲液洗涤6次，然后加入TMB溶液(Thermo FisherScientific)。6分钟后加入HCl，并且使用Tecan Infinite M1000读数仪记录450和620nm波长处的吸光度。通过使用Excel(Microsoft)和XLfit(IDBS)获得拟合曲线和EC50计算。图2显示抗S1抗体-ACE2融合蛋白与SARS-CoV2 S1-RBD蛋白结合，EC50值为7-10.2ng/ml。

实施例3：通过抗S1抗体-ACE2融合蛋白中和SARS-CoV2-S1-RBD与ACE2的结合

在竞争性ELISA中研究抗S1抗体-ACE2融合蛋白中和SARS-CoV2 S1-RBD与ACE-2胞外域结合的效力。将His标记的人ACE-2胞外域(Sino Biologicals)重组蛋白以PBS中2.5μg/ml的浓度包被在384-孔Nunc MaxiSorp^TM平底板上，在室温下放置60分钟。用PBS 0.1％Tween(洗涤缓冲液)洗涤3次后，将MaxiSorp^TM板用PBS、2％BSA、0.05％Tween在室温下封闭60分钟。在单独的聚丙烯384-孔板(Corning)中，将PBS、0.5％BSA、0.05％Tween(ELISA缓冲液)中稀释的浓度为30,000-0.01ng/ml的抗S1抗体-ACE2蛋白与30ng/ml小鼠-Fc标记的SARS-CoV2 S1-RBD(Sino Biologicals)重组蛋白在室温下预温育60分钟。作为对照，使用具有人-Fc标签的重组ACE-2胞外域。用洗涤缓冲液洗涤3次后，将来自Corning板的预温育混合物转移至MaxiSorp^TM板上，并且在室温下温育60分钟。用洗涤缓冲液洗涤3次后，在ELISA缓冲液中加入辣根过氧化物酶偶联的检测抗小鼠IgG F(ab’)₂片段(Cytiva)，稀释度为1:1,000。将板在室温下温育60分钟，用洗涤缓冲液洗涤6次，然后加入TMB溶液(ThermoFisher Scientific)。15分钟后加入HCl，并且使用Tecan Infinite M1000读数仪记录450和620nm波长处的吸光度。通过使用Excel(Microsoft)和XLfit(IDBS)获得拟合曲线和IC50计算。图3中的数据证实，在测试的浓度下，抗S1抗体(408,413)并没有明显阻断S1-RBD与ACE2胞外域的相互作用，而hFc标记的ACE2胞外域(402,403)阻断相互作用，IC50值>4μg/ml。相反，抗S1抗体-ACE2融合蛋白抑制这种相互作用，IC50值为32.4-97.8ng/ml，因此在这个测定中，其效力比ACE2-hFc提高了约>40倍。

实施例4：抗S1抗体-ACE2融合蛋白的假病毒中和活性

为了确定抗S1抗体-ACE2蛋白的病毒中和活性，进行了假病毒中和测试(pVNT)。复制缺陷的水疱性口炎病毒(VSV)缺少VSV包膜糖蛋白VSV-G的遗传信息，但是包含绿色荧光蛋白(GFP)的开放阅读框(ORF)，用于SARS-CoV2-S假病毒产生。根据已发表的方案产生VSV假型(PMID:32142651)。

对于pVNT测定，将Vero-76细胞解冻，在测定培养基(DMEM/10％FBS)中稀释至2.67×10⁵个细胞/mL，并且以4×10⁴个细胞/孔接种在96-孔平底板中。将细胞在37℃和7.5％CO₂下温育4-6小时。将VSV/SARS CoV2假病毒解冻并稀释以获得4.8×10³感染单位[IU]/mL。将30μL稀释的假病毒加入含有30μl抗S1抗体-ACE2融合蛋白、抗S1抗体或ACE-2-hFc的孔中，终浓度为200-0.092μg/ml。将假病毒/测试蛋白混合物在400rpm的微孔板摇床上RT温育10min。然后将假病毒/测试蛋白稀释混合物加入接种的Vero-76细胞中(MOI:0.003)，然后在37℃和5％CO₂下温育16-24小时。将血清样品的每种稀释液在重复的孔中测试。温育之后，从培养箱取出细胞培养板，放置在IncuCyte活细胞分析系统中，并且在分析之前温育30min。使用4×物镜进行明视野和GFP荧光的全孔扫描。使用GraphPad Prism软件进行曲线拟合和IC50计算。图4证实，抗S1抗体(413)和ACE2-hFC(402)在测试的浓度下对假病毒感染Vero-76细胞没有显著影响，而抗S1抗体-ACE2融合蛋白以剂量依赖性方式抑制感染，IC50值为5.847-36.29μg/ml。

实施例5：抗S1抗体-ACE2融合蛋白的结合亲和力

通过表面等离子共振测量确定ACE-2-hFc(402)、抗S1抗体(413)和抗S1-mAB-ACE2融合蛋白(406,409,410,411,412)与SARS-CoV-2S1蛋白的生化亲和力。将SARS-CoV-2S1蛋白(HIS标签，活性三聚体；Acro Biosystems#SPN-C52H8)通过抗HIS-标签抗体以两种不同密度(Rmax～100RU和Rmax～620RU)固定在CM5传感器芯片表面。在另一个实验系列中，将偶联至小鼠Fc-标签的SARS-CoV-2S1-RBD蛋白(Sino Biologicals#40592-V05H)通过抗小鼠-Fc抗体以两种不同密度(Rmax～20RU和Rmax～250RU)固定在CM5传感器芯片表面。在Biacore T200 SPR仪器上分析固定的SARS-CoV-2S1蛋白(活性三聚体)或SARS-CoV-2S1-RBD蛋白与可溶性抗S1抗体-ACE2融合蛋白相互作用的动力学。使用Langmuir 1:1结合模型确定动力学数据。图5A和B显示，与抗S1抗体(413)相比，融合蛋白406、411和412与SARS-CoV-2S1蛋白(活性三聚体)或SARS-CoV-2S1-RBD蛋白的结合具有较慢的结合速率(on-rate)，但是也有较慢的解离速率(off-rate)。与ACE-2-Fc(402)相比，融合蛋白的解离速率也显著较慢。因此，一旦融合蛋白406、411和412与S1蛋白结合，与单独的抗S1抗体或ACE-2-Fc相比，它们与S1蛋白保持结合的时间更长，并且可能比可溶性ACE-2-Fc蛋白更持久地阻断病毒表达的S1蛋白和细胞表达的ACE-2受体之间的相互作用。

实施例6：SARS-CoV-2S1-RBD结合、中和抗体的产生

为了获得新的抗S1抗体，用重组SARS-CoV-2S1-RBD-mFc蛋白或S1-RBD编码mRNA免疫新西兰白兔。通过FACS分离单个B-细胞并培养，以在培养基上清液中获得单克隆抗体。培养7天后，将B-细胞上清液与B-细胞分离，进行结合和功能测定。将B-细胞在RNA提取RLT缓冲液中裂解用于RNA提取、RT-PCR以及抗体重链和轻链可变区的Sanger测序。

实施例7：B-细胞上清液中的抗体与SARS-CoV2-S1蛋白的结合

为了确定B-细胞上清液中单克隆抗体的浓度，进行定量夹心ELISA。简单地说，将B-细胞上清液1:10、1:30、1:100、1:300、1:100和1:3,000稀释，在用山羊抗兔-IgG抗体(Sigma-Aldrich)包被的平板上温育。使用来自驴的辣根过氧化物酶连接的物种特异性抗兔-IgG F(ab)₂片段(GE Healthcare)检测捕获的兔IgG。使用Tecan Infinite M1000仪器记录450/620nm处的OD，并且与用纯化的兔IgG(Sigma Aldrich)获得的标准曲线相关联。图6A中总结了B-细胞上清液中单克隆抗体的计算rIgG浓度。

已在ELISA中测试B-细胞上清液中的本发明的抗S1抗体与SARS-CoV2 S1蛋白的结合效力。将人-Fc标记的SARS-CoV2 S1重组蛋白(Sino Biologicals)以PBS中0.875或3μg/ml的浓度包被在384-孔Nunc MaxiSorp^TM平底板上，在室温下放置60分钟。用PBS 0.1％Tween(洗涤缓冲液)洗涤3次后，用PBS、2％BSA、0.05％Tween在室温下封闭60分钟，再洗涤3次，在PBS、0.5％BSA、0.05％Tween(ELISA缓冲液)中加入含有抗S1抗体的B-细胞上清液，浓度为1,000-0.04ng/ml，并且将板在室温下温育60分钟。作为对照，使用具有小鼠-Fc标签的重组ACE-2胞外域(Sino Biologicals)，浓度为5,000-2ng/ml。用洗涤缓冲液洗涤3次后，将辣根过氧化物酶偶联的检测抗兔IgG F(ab’)₂片段(Cytiva)或对照辣根过氧化物酶偶联的检测抗小鼠IgG F(ab’)₂片段(Cytiva)分别以1:4,000或1:1,000的稀释度加入ELISA缓冲液中。将板在室温下温育60分钟，用洗涤缓冲液洗涤6次，然后加入TMB溶液(Thermo FisherScientific)。6分钟后加入HCl，并且使用Tecan Infinite M1000读数仪记录450和620nm波长处的吸光度。通过使用Excel(Microsoft)和XLfit(IDBS)获得拟合曲线和EC50计算。图6B和C中的数据表明，所有分泌在单克隆B-细胞上清液中的抗体均以剂量依赖性方式与SARS-CoV2 S1重组蛋白结合，并且与mFc标记的ACE-2胞外域相比具有更低的EC50值。

实施例8：通过B-细胞上清液中的抗体中和SARS-CoV2-S1–ACE-2相互作用

在竞争性ELISA中研究B-细胞上清液中的本发明的抗S1抗体中和SARS-CoV2 S1与ACE-2胞外域结合的效力。将小鼠-Fc标记的人ACE-2胞外域(Sino Biologicals)重组蛋白以PBS中2.5μg/ml的浓度包被在384-孔Nunc MaxiSorp^TM平底板上，在室温下放置60分钟。用PBS 0.1％Tween(洗涤缓冲液)洗涤3次后，将MaxiSorp^TM板用PBS、2％BSA、0.05％Tween在室温下封闭60分钟。在单独的聚丙烯384-孔板(Corning)中，将浓度为2,000-0.08ng/ml的含有抗S1抗体的B-细胞上清液与PBS、0.5％BSA、0.05％Tween(ELISA缓冲液)中稀释的60ng/ml人-Fc标记的SARS-CoV2 S1(Sino Biologicals)重组蛋白在室温下预温育60分钟。作为对照，使用具有小鼠-Fc标签的重组ACE-2胞外域(Sino Biologicals)。用洗涤缓冲液洗涤3次后，将来自Corning板的预温育抗S1抗体/S1蛋白混合物转移至MaxiSorp^TM板上，并且在室温下温育60分钟。用洗涤缓冲液洗涤3次后，在ELISA缓冲液中加入辣根过氧化物酶偶联的检测抗人IgG、Fcγ片段特异性F(ab’)₂片段(Jackson Immuno Research)，稀释度为1:5,000。将板在室温下温育60分钟，用洗涤缓冲液洗涤6次，然后加入TMB溶液(Thermo FisherScientific)。15分钟后加入HCl，并且使用Tecan Infinite M1000读数仪记录450和620nm波长处的吸光度。通过使用Excel(Microsoft)和XLfit(IDBS)获得拟合曲线和IC50计算。图7A和B中的数据表明，所有分泌在单克隆B-细胞上清液中的抗体均以剂量依赖性方式阻断SARS-CoV2 S1和ACE-2重组蛋白之间的相互作用，并且与mFc标记的ACE-2胞外域相比具有显著更低的EC50值。

实施例9：纯化的hIgG1-LALA-LS嵌合抗体与SARS-CoV2-S/S1-RBD和SARS-CoV-S1-RBD重组蛋白的结合

将本发明抗体的可变区序列与hIgG1恒定轻链和重链序列进行框内克隆，以获得嵌合抗体构建体。在hIgG1重链序列中引入突变L234A和L235A，据描述这些突变减少Fcγ受体结合(Hezareh et al.2001)，以及LS(M428L/N434S)突变。将编码嵌合轻链和重链的质粒DNA共转染至HEK-293FreeStyle^TM细胞中，并且通过蛋白-A亲和性和随后的大小排阻色谱从培养上清液纯化抗体。

在ELISA中确定本发明的嵌合抗S1抗体与SARS-CoV S1-RBD、SARS-CoV2 S(活性三聚体)和SARS-CoV2 S1-RBD蛋白结合的效力。将His标记的SARS-CoV S1-RBD(SinoBiologicals)、His标记的SARS-CoV2 S活性三聚体(AcroBiosystems)和小鼠-Fc标记的SARS-CoV2 S1-RBD(Sino Biologicals)重组蛋白以PBS中1μg/ml、1μg/ml和2.5μg/ml的浓度包被在384-孔Nunc MaxiSorp^TM平底板上，在室温下放置60分钟。用PBS 0.1％Tween(洗涤缓冲液)洗涤3次后，用PBS、2％BSA、0.05％Tween在室温下封闭60分钟，再洗涤3次，在PBS、0.5％BSA、0.05％Tween(ELISA缓冲液)中加入嵌合抗S1抗体，浓度为20,000-0.006ng/ml，并且将板在室温下温育60分钟。作为对照，使用具有人-Fc标签的重组ACE-2胞外域(402/403)、抗S1-ACE2融合构建体406和抗S1抗体408。用洗涤缓冲液洗涤3次后，在ELISA缓冲液中加入辣根过氧化物酶偶联的检测抗人IgG、Fcγ片段特异性F(ab’)₂片段(JacksonImmuno Research)，稀释度为1:2,500。将板在室温下温育60分钟，用洗涤缓冲液洗涤6次，然后加入TMB溶液(Thermo Fisher Scientific)。6分钟后加入HCl，并且使用TecanInfinite M1000读数仪记录450和620nm波长处的吸光度。通过使用Excel(Microsoft)和XLfit(IDBS)获得拟合曲线和EC50计算。图8A和B中的数据证实，测试的本发明的嵌合抗体全部与SARS-CoV2 S(活性三聚体)和SARS-CoV2 S1-RBD结合，具有相似的效力，EC50值在3.4和11.2ng/ml之间。这些EC50低于对ACE2-hFc和抗S1-ACE2融合构建体406测量的值。嵌合抗体P043.A.00047.H08和P043.A.00117.C08也能够与SARS-CoV S1-RBD结合，计算的EC50分别为8.1和88.5ng/ml。

实施例10：通过本发明的嵌合抗体中和SARS-CoV2-S1-RBD与ACE2结合

如实施例3所述在竞争性ELISA中研究本发明的纯化、嵌合抗体在中和SARS-CoV2S1-RBD与ACE-2胞外域结合中的效力。所有嵌合抗体均以剂量依赖性方式阻断ACE-2与SARS-CoV2 S1-RBD的相互作用。EC50值范围为19.2-115ng/ml。通过本发明的嵌合抗体观察到的抑制明显比用ACE2-hFc(402/403)观察到的抑制更强(图9A和B)。

实施例11：本发明的纯化抗体的假病毒中和活性

为了确定本发明的嵌合抗体抑制S1蛋白引导的病毒感染细胞的效力，如实施例4所述进行假病毒中和测试(pVNT)，但有以下调整。

对于pVNT测定，将Vero-76细胞解冻，在测定培养基(DMEM/10％FBS)中稀释至0.5×10⁶个细胞/mL，并且以1×10⁴个细胞/孔接种在384-孔平底组织培养板(Corning)中。将细胞在37℃和5％CO₂下温育4-6小时。将VSV/SARS CoV2假病毒解冻并稀释以获得12×10³感染单位[IU]/mL。将10μL稀释的假病毒加入384-孔V-底板(Corning)的孔中，其含有10μl本发明的嵌合抗体或者分子403、413和411，终浓度范围为100-0.05μg/ml。在一些实验中，在30-0.01μg/ml的浓度范围内测试本发明的所选抗体(图10B)。将假病毒/测试抗体混合物在1,200rpm的微孔板摇床上RT温育10min。然后将假病毒/测试蛋白稀释混合物加入接种的Vero-76细胞中，然后在37℃和5％CO₂下温育16-24小时。将血清样品的每种稀释液在一式三份的孔中测试。温育之后，将细胞培养板从培养箱中取出，用测定培养基中稀释的5μg/mlHoechst 33342(Thermo Fisher Scientific)染色，置于CellInsight CX5程序系统中，并且在分析之前温育10min。使用4×物镜进行Hoechst和GFP荧光的全孔扫描。使用Excel(Microsoft)和XLfit(IDBS)进行曲线拟合。图10证实抗S1抗体(413)和ACE2-hFC(403)并不明显影响假病毒感染Vero-76细胞，而抗S1抗体-ACE2融合蛋白(411)和本发明的许多嵌合抗体以剂量依赖性方式抑制感染。大多数嵌合抗体表现出比蛋白411更强的中和活性，在较低的浓度下就能实现完全中和。在图10B中总结了本发明的所选抗体的IC50和IC90值。

实施例12：本发明的抗体间的SARS-CoV2-S1-RBD表位竞争

在竞争性ELISA中测试每种嵌合抗体与本发明的任何其他嵌合抗体在与SARS-CoV2 S1-RBD结合时的干扰。

将一种抗体以PBS中2.5μg/ml的浓度包被在384-孔Nunc MaxiSorp^TM平底板上，在室温下放置60分钟。用PBS 0.1％Tween(洗涤缓冲液)洗涤3次后，将MaxiSorp^TM板用PBS、2％BSA、0.05％Tween在室温下封闭60分钟。在单独的聚丙烯384-孔板(Corning)中，将浓度为20,000-0.01ng/ml的其他抗体与PBS、0.5％BSA、0.05％Tween(ELISA缓冲液)中的150ng/ml小鼠-Fc标记的SARS-CoV2 S1-RBD(Sino Biologicals)重组蛋白在室温下预温育60分钟。用洗涤缓冲液洗涤3次后，将来自Corning板的预温育混合物转移至MaxiSorp^TM板上，并且在室温下温育60分钟。用洗涤缓冲液洗涤3次后，在ELISA缓冲液中加入辣根过氧化物酶偶联的抗小鼠IgG F(ab’)₂片段(Cytiva)，稀释度为1:1,000。将板在室温下温育60分钟，用洗涤缓冲液洗涤6次，然后加入TMB溶液(Thermo Fisher Scientific)。6分钟后加入HCl，并且使用Tecan Infinite M1000读数仪记录450和620nm波长处的吸光度。图11总结了竞争性ELISA数据的结果，(+)表示两个测试抗体之间的S1结合竞争，(-)表示两个测试抗体的同时结合。P043.A.00047.H08是本发明测试的嵌合抗体集合中唯一在测定中只与自身竞争而不与其他抗体竞争的抗体，包括抗S1-mAB。相反，本发明的所有其他嵌合抗体确实相互竞争，表明它们在S1-RBD蛋白上有重叠的表位。本发明的嵌合抗体均不与抗S1 mAB竞争。

实施例13：基于IVT-mRNA的抗S1抗体-ACE2融合RiboMab的产生

a.抗体IVT-mRNA模板载体的克隆和IVT-mRNA合成

为了通过体外转录的信使RNA(IVT-mRNA)产生抗S1抗体-ACE2融合RiboMab，我们使用标准技术将全人抗S1抗体-ACE2融合抗体ID 406和ID 411(在实施例1中描述)的DNA序列亚克隆至IVT-mRNA模板载体pST1-hAg-MCS-FI-A30LA70(BioNTechRNAPharmaceuticals,Mainz,Germany)中。人α珠蛋白(hAg)5’UTR前导序列已在其他地方描述，FI序列在专利申请"3’UTR Sequences for Stabilization of RNA"(PCT/EP2016/073814)中描述。poly(A)尾编码区(A30LA70)由30个腺嘌呤密码子、接头(L)和进一步的70个腺嘌呤密码子组成(PCT/EP2015/065357)。所有抗体结构域均源自人IgG1。为了形成抗S1抗体-ACE2融合RiboMab，克隆以下构建体：

RiboMab_406:

pST1–5’hAg–Sec–V_H ^anti-S1–C_H1–C_H2–C_H3^{(Met434Leu,Asn428Ser)}–FI–A30LA70(HC)

pST1–5’hAg–Sec–V_L ^anti-S1–C_L–(G₄S)₄–ACE2-ECD–FI–A30LA70(LC-ACE2)

RiboMab_411:

pST1–5’hAg–Sec–V_H ^anti-S1–C_H1–C_H2–C_H3–FI–A30LA70 (HC)

pST1–5’hAg–Sec–V_L ^anti-S1–C_L–(G₄S)₄–ACE2-ECD–FI–A30LA70 (LC-ACE2)

5’hAg，来自人α-珠蛋白的5’UTR；A，腺嘌呤；Asn，天冬酰胺；CL，恒定轻链区；CH，恒定重链区；ECD，ACE2的胞外域；FI，3’UTR序列；(G₄S)₄，甘氨酸-丝氨酸接头编码序列；HC，重链；Leu，亮氨酸；LC，轻链；Met，甲硫氨酸；pST1，DNA模板载体；Sec，分泌信号；Ser，丝氨酸；VH，可变重链结构域；VL，可变轻链结构域。

b.IVT-mRNA合成

为了产生体外转录的模板，使用IIs类限制性内切酶将质粒DNA在poly(A)尾编码区下游线性化，从而产生转录RNA的模板，在poly(A)-尾之后没有额外的核苷酸(Holtkamp,S.et al.(2006)Blood 108(13),4009–4017)。纯化线性化的模板DNA，用分光光度法定量，然后用T7 RNA聚合酶进行体外转录，基本上如以前所述(Grudzien-Nogalska,E.et al.(2013):Synthetic mRNAs with superior translation and stability properties.In:Methods in molecular biology(Clifton,N.J.)969,55–72)。为了最小化免疫原性，掺入N1-甲基假尿苷-5’-三磷酸(TriLink Biotechnologies,San Diego,CA,USA)，简称m1ΨTP，代替UTP(Kariko,K.et al.(2008)Mol.Ther.16(11),1833–1840)，并且通过纤维素纯化去除双链RNA(

M.et al.(2019)Nucleic acids 15,26–35)。用Cap1-结构的CleanCap413对RNA进行加帽。为此，在7.5mM ATP、CTP、m1ΨTP、GTP和1.5mM CleanCap413的存在下进行体外转录。使用磁性颗粒纯化RNA(Berensmeier,S.(2006):Magneticparticles for the separation and purification of nucleic acids.In:Appliedmicrobiology and biotechnology 73(3),495–504)。通过分光光度法和2100生物分析仪(Agilent,Santa Clara,CA,USA)的分析评价RNA浓度和质量。图13示出了形成完整的抗体分子所需的两个IVT-mRNA的简图。

实施例14：抗S1抗体-ACE2融合RiboMab在体外的表达和蛋白完整性

a.生产细胞的电穿孔

为了从IVT-mRNA产生抗S1抗体-ACE2融合RiboMab，将每mL 1x10⁷个对数期生长的HEK 293T/17细胞(ATCC

LGC Standards GmbH,Wesel,Germany)用于电穿孔。将X-Vivo 15培养基(LONZATechnologies,Basel,Switzerland)中的细胞与10mM Hepes/0.1mM EDTA缓冲液(模拟)或100μg/mL编码抗体的IVT-mRNA混合物在4mm间隙比色杯(VWR,Darmstadt,Germany)中结合。RNA混合物中所含的编码HC和LC-ACE2的mRNA的质量比分别为0:1、0.6:1、0.8:1、1:1或1:0。立即用BTX ECM830(BTX Harvard Apparatus,Holliston,MA,USA)对细胞进行电穿孔，设置如下：250V，2次脉冲，5ms。随后将活细胞在Expi293^TM培养基(Gibco Thermo Fischer Scientific,Darmstadt,Germany)中以2x10⁶/mL的密度接种在12-孔组织培养板(/>

Greiner Bio-One,Frickenhausen,Germany)中。培养48小时后，通过离心(10min,300xg)收获上清液并储存在4℃下直至分析。

b.通过免疫测定定量生产细胞培养上清液中的抗S1抗体-ACE2融合RiboMab

使用Gyros xPand^TMXPA1025设备(Gyros Protein Technologies AB,Uppsala,Sweden)定量来自电穿孔HEK 293T/17细胞的SN中的抗S1抗体-ACE2融合RiboMab。如果没有特别说明，所有材料均来自Gyros Protein Technologies AB。根据制造商的方案，用

huIgG Kit–Low Titer进行夹心免疫测定。试剂盒组分与/>

Bioaffy1000HC CD一起使用，蛋白浓度在20–9,000ng/mL的动态范围内。

所有样品和试剂均以12,000xg离心4min以沉淀任何聚集物。将含有相应RiboMab分子的SN在试剂E缓冲液中1:2稀释。根据Gyrolab装载清单将制备的标准品、质控品、试剂和稀释的样品装载到96-孔板上。用

huIgG Low Titer试剂盒方法v2产生数据，并且使用/>

Evaluator软件评价结果。

当HC与LC-ACE2 mRNA质量比为0.6:1时，产生最高的抗S1抗体-ACE2融合RiboMab浓度，约为5μg/mL。0.8:1的比例导致约2.5μg/mL，1:1的比例导致约2μg/mL。总的来说，RiboMab_411和RiboMab_406的表达量相同(图14A)。

c.生产细胞培养上清液中抗S1抗体-ACE2融合物的蛋白印迹分析

将HEK 293T/17细胞(实施例13a)的SN用于分析抗S1抗体-ACE2融合RiboMab的翻译和分泌。将SN和参考蛋白(在模拟SN中添加)用水和4xLaemmli缓冲液(Bio-RadLaboratories,Dreieich,Germany)补齐至终体积21.5μL，并且在没有(非还原，图14B)或有(还原，图14C)1M二硫苏糖醇(DTT，终浓度0.1M，Carl Roth GmbH&Co.KG,Karlsruhe,Germany)的情况下加热至95℃5min。使用4–15％Criterion^TMTGX Stain-Free^TMGel(Bio-Rad)，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离制备的SN和相应的纯化参考蛋白ID 411。作为分子量标准，应用分子量范围分别为10–250kD和31–460kD的Precision Plus Protein^TM全蓝预染蛋白标准品(Bio-Rad)和Novex^TMHiMark^TM预染蛋白标准品(Hi-Mark,Invitrogen/ThermoFisher Scientific)。根据本领域技术人员已知的标准程序进行蛋白印迹分析(图14B,C)。将硝酸纤维素膜(Bio-Rad)用5％牛奶溶液(Carl Roth GmbH&Co.KG)封闭1小时。用3％BSAFraction V溶液(Eurobio Scientific,Les Ulis,France)中稀释的多克隆抗体过氧化物酶AffiniPure山羊抗人IgG，Fcγ片段特异性的(1:2,000稀释；Jackson ImmunoResearch,Cambridge,UK)和山羊抗人κ轻链交叉吸附二抗，HRP(1:200稀释；Invitrogen/ThermoFisher Scientific,Darmstadt,Germany)混合物检测蛋白。随后将膜用Clarity Western过氧化物试剂和Clarity Western Luminol/Enhancer试剂(Bio-Rad)的1:1混合物温育，并且用VILBER Fusion X成像设备(Vilber Lourmat,Eberhardzell,Germany)进行记录。用Image Lab软件(Bio-Rad)分析数据。与内部分子量标准相比，在非还原条件下分别在约200–460kD(全抗体)和100kD(LC-ACE2)处检测到RiboMab_411和RiboMab_406的信号，在还原条件下分别在100kD(LC-ACE2)和50kD(HC)处检测到RiboMab_411和RiboMab_406的信号。

总的来说，两种抗S1抗体-ACE2融合RiboMab都能有效地从IVT-mRNA翻译并分泌至SN中。

实施例15：抗S1抗体-ACE2融合RiboMab在小鼠中的药代动力学行为的估计

为了确定抗S1抗体-ACE2融合RiboMab在小鼠体内的近似半衰期和清除率，我们使用11周龄的雌性Balb/cJRj(Janvier Labs,Le Genest-Saint-Isle,France)小鼠。对于注射，HC与LC-ACE2比例为0.925:1的RNA混合物，已包裹在靶向肝的阳离子脂质纳米颗粒(LNP)中(Jayaraman,M.et al.(2012),Angewandte Chemie(International ed.inEnglish)51(34),8529–8533)。每只小鼠静脉内注射30μg编码RiboMab_406或RiboMab_411的RNA-LNP。每个RNA-LNP组包括12只小鼠，4只小鼠对应一个取血时间点。注射前14天放血的小鼠血清用作基线。取血的其他时间点设置为6、24、48、96、240小时。将血液直接收集在Microvette 500Z凝胶管(Sarstedt,Nürmbrecht,Germany)中，并且通过离心分离血清，如本领域技术人员所知。收获血清，立即在液氮中速冻，并且储存在-65至-85℃下直至使用。

使用Gyros xPand^TMXPA1025免疫测定设备(Gyros Protein Technologies AB)定量小鼠血清中的抗S1抗体-ACE2融合RiboMab浓度。如果没有特别说明，所有材料均来自Gyros Protein Technologies AB。根据制造商的方案，使用

Generic PK试剂盒或

Generic TK试剂盒进行夹心免疫测定。捕获抗体(试剂A，包括在/>

GenericTK试剂盒中)和检测抗体抗κ轻链Alexa/>

647(Abcam,Cambridge,UK)分别与/>

Bioaffy 1000HC CD一起用于动态范围为0.5–1,000ng/mL的蛋白浓度，或者与/>

Bioaffy 20HC CD一起用于动态范围为40-80.000ng/mL的蛋白浓度。

将样品在试剂F(包括在Gyrolab Generic TK试剂盒中)中至少按体积1:10稀释。用

Generic PK试剂盒方法v1或/>

Generic TK试剂盒方法v1产生数据。

如图15证明的，在静脉注射后6小时内达到30–40μg/mL的最大抗S1抗体-ACE2融合RiboMab血清浓度(RiboMab_406和RiboMab_411，分别)。在注射后96小时检测到5–7μg/mL(RiboMab_411和RiboMab_406，分别)。此后测量的RiboMab浓度低于1ng/mL。

总的来说，两种RiboMab在体内的表达相似，并且表现出相似的药代动力学行为。如实施例14b所述，HC与LC-ACE2的最佳比例为0.6:1，预期达到较高的RiboMab浓度。值得注意的是，在Balb/cJRj小鼠中不能分析RiboMab_406的Fc部分中的LS-突变带来的半衰期延长。为了研究LS突变驱动的半衰期延长，必须使用人新生儿Fc受体(FcRn)-转基因小鼠品系。

实施例16：抗S1抗体-ACE2融合RiboMab在体内的表达和蛋白完整性

通过蛋白印迹分析研究Balb/cJRj小鼠血清(实施例15)中分泌的抗S1抗体-ACE2融合RiboMab_406和_411的完整性，原理如实施例14c所述，区别在于在样品分离前通过Melon Gel^TM(Thermo Fisher Scientific)纯化血清。装载10ng纯化的参考蛋白ID 411，有或没有未经处理的小鼠的血清。作为阴性对照，使用来自注射了编码萤光素酶的RNA-LNP的Balb/cJRj小鼠的血清。

与内部分子量标准相比，在非还原(图16A)条件下分别在约200–460kD(全抗体)和100kD(LC-ACE2)处检测到RiboMab的信号，在还原条件下(图16B)分别在约100kD(LC-ACE2)和50kD(HC)处检测到RiboMab的信号。在一只小鼠(RiboMab_406，小鼠#4)中，我们检测到与完全抗S1抗体-ACE2融合RiboMab相同强度的条带，在非还原条件下大概是不含ACE2的人抗S1抗体的重量(～170kD)，以及在还原条件下额外的游离LC(25kD)，支持仅IgG分子的假设。

总之，两种RiboMab在体外和体内的表达都是相当的，表现出稳定的生产，并且以相似的方式从小鼠系统循环中清除。

实施例17：RiboMab_411和406的假病毒中和活性。

为了确定RiboMab_406和411的病毒中和活性，进行了pVNT。用编码RiboMab_406或411的RNA电穿孔的HEK 293T/17细胞的上清液用作测试项目，仅用各自的HC电穿孔的HEK293T/17细胞的上清液用作模拟对照(实施例14a中描述的电穿孔)。所有SN均用AmiconUltra-0.5 30KDa(Merck Millipore,Darmstadt,Germany)浓缩60倍。

如实施例4所述进行测定。将30μL稀释的假病毒加入孔中，孔中含有30μL在SN中的抗S1抗体-ACE2融合RiboMab_411或406，2-倍、8-点连续稀释，范围为60-0.46μg/mL(终浓度＝30-0.23μg/mL)，以及模拟SN。将假病毒/测试稀释混合物加入接种的Vero-76细胞中(MOI:0.003)，然后在37℃和5％CO₂下温育24小时。

图17证实模拟SN并不显著影响假病毒感染Vero-76细胞，而抗S1抗体-ACE2融合RiboMab_411和406以剂量依赖性方式抑制感染，IC50值范围为1.34-4.54μg/mL。

实施例18：双特异性抗S1抗体-scFv融合蛋白与重组SARS-CoV2 S1-RBD蛋白的结合

为了测试双特异性抗S1抗体-scFv融合蛋白与SARS-CoV2 S1-RBD蛋白的结合，如实施例2所述进行ELISA。作为对照，使用抗S1抗体和本发明的抗体。图18A和B显示抗S1抗体-scFv融合蛋白以剂量依赖性方式与SARS-CoV2 S1-RBD蛋白结合，当与抗S1抗体(408)和本发明的抗体(444、446、449、450和451)相比时，具有基本相似的EC50值。

实施例19：通过抗S1抗体-scFv融合蛋白中和SARS-CoV2-S1-RBD与ACE2的结合

如实施例3所述在竞争性ELISA中研究抗S1抗体-scFv融合蛋白中和SARS-CoV2S1-RBD与ACE-2胞外域结合的效力。作为对照，使用抗S1抗体和本发明的抗体。图19A和B证实递增浓度的抗S1抗体-scFv融合蛋白增加抑制ACE-2ECD与SARS-CoV2S1-RBD蛋白的相互作用。相比之下，在使用抗S1抗体对照时仅观察到轻微的抑制。与本发明的抗体(444、446、449、450和451)相比，抗S1抗体-scFv融合蛋白表现出明显较低的IC90值，因此更有效地阻断ACE-2S1-RBD相互作用。

实施例20：本发明的S1靶向抗体的结合亲和力

通过表面等离子共振测量确定本发明的S1靶向抗体的生化亲和力。将偶联至小鼠Fc-标签的SARS-CoV-2S1-RBD蛋白(Sino Biologicals#40592-V05H)通过抗小鼠-Fc抗体以Rmax～10RU的密度固定在CM5传感器芯片表面。在Biacore T200 SPR仪器上分析SARS-CoV-2S1-RBD蛋白与本发明的S1靶向抗体相互作用的动力学。使用Langmuir1:1结合模型确定动力学数据。图20显示本发明的抗体的K_D值范围为115-1360pM。与其他测试的抗体相比，蛋白样品ID 447的抗体表现出特别低的解离速率，为0.672x10^-4s^-1。

实施例21：抗S1抗体-scFv融合蛋白的假病毒中和活性

为了确定双特异性抗S1抗体-scFv融合抗体抑制S1蛋白引导的病毒感染细胞的效力，如实施例11所述进行假病毒中和测试(pVNT)。双特异性抗体的测试浓度范围为30-0.01μg/ml。图21显示双特异性抗体465和467有效地阻断S1介导的假病毒感染。图21B总结了IC50和IC90值。图22显示用构建体478、480、481、482和483实现了有效中和，IC90值范围为0.57-0.28μg/ml。

实施例22：抗S1抗体-scFv融合蛋白498、500、501和502的假病毒中和活性

为了确定双特异性抗S1抗体-scFv融合抗体498、500、501和502抑制S1蛋白引导的病毒感染细胞的效力，如实施例11所述进行假病毒中和测试(pVNT)。双特异性抗体的测试浓度范围为6000-0.03ng/ml。图23显示双特异性抗体498和502提供最有效的中和，IC90值分别为29.4和51.4ng/ml。

实施例23：本发明的S1靶向抗体470的结合亲和力

通过表面等离子共振测量确定本发明的S1靶向抗体470的生化亲和力。将偶联至小鼠Fc-标签的SARS-CoV-2S1-RBD蛋白(Sino Biologicals#40592-V05H)通过抗小鼠-Fc抗体以Rmax～10RU的密度固定在CM5传感器芯片表面。在Biacore T200 SPR仪器上，采用多循环动力学在两种不同的流动细胞上测量3个重复，分析SARS-CoV-2S1-RBD蛋白与本发明的S1靶向抗体470相互作用的定性和定量亲和力。使用Langmuir1:1结合模型确定动力学数据。图24显示来自多循环动力学的本发明抗体470的计算平均K_D值为10.4pM。

实施例24：DNA模板和编码抗SARS-Cov-2 IgG RiboMab的IVT-mRNA的产生

a.抗体IVT-mRNA模板载体的克隆

为了通过体外转录的信使RNA(IVT-mRNA)产生嵌合抗SARS-Cov-2 IgG RiboMab，使用标准技术将兔抗SARS-Cov-2抗体ID 443、445、447、451、470和472(表1中列出)的VH和VL DNA序列亚克隆至IVT-mRNA模板载体pST1-hAg-MCS-FI-A30LA70(BioNTech SE,Mainz,Germany)中。实施例13a中描述了进一步的细节。除了兔VH和VL结构域外，所有其他抗体结构域均源自人IgG1。为了形成抗SARS-Cov-2 IgG RiboMab，克隆以下构建体：

本发明的RiboMab_443/445/447/451/470/472和抗SARS-Cov-2 IgG参照物：

pST1–5’hAg–Sec–VH–CH1–CH2^{(Leu234Ala,Leu235Ala)}–CH3^{(Met434Leu,Asn428Ser)}–FI–A30LA70

(HC)

pST1–5’hAg–Sec–VL–CL–FI–A30LA70(LC)

5’hAg，来自人α-珠蛋白的5’UTR；A，腺嘌呤；Ala；丙氨酸；Asn，天冬酰胺；CL，恒定轻链区；CH，恒定重链区；FI，3’UTR序列；HC，重链；L，接头；Leu，亮氨酸；LC，轻链；Met，甲硫氨酸；pST1，DNA模板载体；Sec，分泌信号；Ser，丝氨酸；VH，可变重链结构域；VL，可变轻链结构域。

b.IVT-mRNA合成

在实施例13b下描述了IVT-mRNA的产生。图25示出了形成完整抗体分子和IgGRiboMab本身(图25B)所需的两个IVT-mRNA(图25A)的简图。

实施例25：抗SARS-CoV-2IgG RiboMab的体外表达和蛋白完整性

a.生产细胞的电穿孔

如实施例14a所述从IVT-mRNA产生抗SARS-CoV-2IgG RiboMab。RNA混合物包含分别编码HC和LC的mRNA，质量比为1.5:1。

b.生产细胞培养上清液中抗SARS-CoV-2IgG RiboMab的基于免疫测定的定量

原则上如实施例14b所述定量来自电穿孔HEK 293T/17细胞的SN中的抗SARS-CoV-2IgG RiboMab。用

Bioaffy 1000HC CD和Gyrolab huIgG Kit-Low Titer组分试剂A(捕获试剂)和试剂B(检测试剂)在4–3,000ng/mL的动态范围内确定蛋白浓度。用

huIgG Low Titer试剂盒方法v1产生数据。

抗SARS-CoV-2IgG RiboMab浓度范围为大约2-8μg/mL，RiboMab_443显示最高表达率，RiboMab_472显示最低表达率(图26)。

实施例26：体外表达的抗SARS-CoV-2IgG RiboMab的假病毒中和活性

为了确定通过电穿孔由HEK 293/T17(#CL-11268^TM，美国典型培养物保藏中心[ATCC])体外表达的抗SARS-CoV-2IgG RiboMab_443/445/447/451/470和472(实施例25)的病毒中和活性，进行了pVNT测定。复制缺陷的VSV缺少VSV包膜糖蛋白VSV-G的遗传信息，但是包含萤光素酶蛋白的ORF，用于SARS-CoV-2-S(S＝刺突蛋白)假病毒产生。这里，只使用携带SARS-CoV-2的野生型刺突蛋白的假病毒。根据已发表的方案产生VSV假型(PMID:32142651)。

所有SN样品用Amicon Ultra-0.5离心过滤单元浓缩，截留值为30KDa(MerckMillipore,Darmstadt,Germany)，以获得HEK 293/T17细胞培养SN样品中大约相似的RiboMab浓度，为200-300μg/mL。

对于pVNT测定，将VERO 76细胞(#CL-1587^TM，美国典型培养物保藏中心)解冻并在测定培养基(DMEM[Gibco/ThermoFisher Scientific,Darmstadt,Germany]/10％FBS[Merck/Sigma-Aldrich,Darmstadt,Germany])中稀释至5×10⁵个细胞/mL，在20μL测定培养基中以1×10⁴个细胞每孔的密度接种在白色384-孔平底板(Greiner Bio-One GmbH,Frickenhausen,Germany)中。将细胞在37℃和7.5％CO₂下温育4小时。将VSV/SARS-CoV-2假病毒解冻并稀释以获得约50IU每孔。在96-孔V-底板(Greiner Bio-One GmbH,Frickenhausen,Germany)中，将含有抗SARS-CoV-2IgG RiboMab的SN在测定培养基中进行12-步、2-倍连续稀释，每次稀释共40μL。在384-深孔底板(Greiner Bio-One GmbH,Frickenhausen,Germany)的每孔合并10μL稀释的假病毒和10μL每个RiboMab稀释度，最终IgG RiboMab浓度范围为15-7x10^-3μg/ml(RiboMab_443)或30-1x10^-2μg/mL(所有其他RiboMab)。将假病毒/RiboMab混合物一式三份在微孔板摇床上以1,200rpm温育10min，然后不摇动再温育5min。将这些假病毒/RiboMab稀释混合物中的10μL加入接种的VERO 76细胞中，然后在37℃和5％CO₂下温育18小时。温育之后，将细胞培养板从培养箱取出并平衡至室温。每孔加入30μL的BioGlo^TM萤光素溶液(Promega,Germany)，在室温下避光温育5min。在Tecan Infinite M200 Pro酶标仪(Tecan,

Switzerland)中测量相对发光光单位(RLU)。在这里发光对于病毒感染的抑制是反向指示的。使用GraphPad Prism软件进行曲线拟合。使用XLfit add-in(IDBS)for Excel(Microsoft)进行IC50和IC90计算。

图27A证实体外表达的本发明的抗SARS-Cov-2 IgG RiboMab以剂量依赖性方式抑制感染，IC50值范围为132.4-406.1ng/ml(图27B)。IgG RiboMab参照物(对应于ID 408)在测试浓度下没有明显影响假病毒感染VERO 76细胞。IC90值范围为449.1-7,243.2ng/mL，RiboMab_470表现出最低IC90。

实施例27：抗SARS-CoV-2IgG RiboMab在小鼠中的药代动力学行为的估计

a.RNA-LNP施用于小鼠和血清制备

为了研究IgG RiboMab在小鼠中的药代动力学行为，使用9周龄的雌性Balb/cJRj(Janvier Labs,Le Genest-Saint-Isle,France)小鼠。对于注射，HC与LC的RNA混合物比例为1.5:1，已包裹在靶向肝的阳离子脂质纳米颗粒(LNP)中(Jayaraman,M.et al.(2012),Angewandte Chemie(International ed.in English)51(34),8529–8533)。将RNA-LNP的储备溶液(1mg/mL)在室温下解冻，并且用1xDPBS(Gibco/ThermoFisher Scientific,Germany)稀释用于注射。将30μg编码本发明的RiboMab_445、RiboMab_447、RiboMab_470或RiboMab_472的RNA-LNP以每只小鼠150μL的体积静脉内注射。30μg编码萤光素酶的RNA-LNP用作阴性对照，100μg的蛋白ID 408用作IgG蛋白参照物。每种RNA-LNP的组大小包含4只小鼠。取血时间点设定为24、96、168、216、336和504小时(1、4、7、9、14和21天)。将血液直接收集在Microvette 500Z凝胶管(Sarstedt,Nürmbrecht,Germany)中，并且通过离心分离血清，如训练有素的实验室人员所知。收获血清，立即在液氮中速冻，并且储存在-65至-85℃下直至使用。

b.小鼠血清中抗SARS-CoV-2IgG RiboMab的基于免疫测定的定量

使用Gyros xPand^TMXPA1025免疫测定设备(Gyros Protein Technologies AB,Uppsala,Sweden)定量小鼠血清中的抗SARS-CoV-2IgG RiboMab浓度。如果没有特别说明，所有材料均来自Gyros Protein Technologies AB。根据制造商的方案，使用

Generic PK或TK试剂盒进行夹心免疫测定。捕获试剂(试剂A，包括在/>

PK或TK试剂盒中)和检测抗体(试剂B，包括在/>

PK或TK试剂盒中)分别与/>

Bioaffy1000HC CD一起用于在1.4–333ng/mL的动态范围内的蛋白浓度，或者与/>

Bioaffy20HC CD一起用于在111-243,000ng/mL的动态范围内的蛋白浓度。

将样品在试剂F(包括在

PK试剂盒中)中至少按体积1:10稀释。用

Generic PK或TK试剂盒方法v1产生数据。

如图28中证实的，在静脉内注射后24小时(RiboMab_472)或96小时(本发明的所有其他RiboMab)达到1.6mg/mL(RiboMab_445)、686μg/mL(RiboMab_447)、741μg/mL(RiboMab_470)和627μg/mL(RiboMab_472)的最大抗SARS-CoV-2IgG RiboMab血清浓度。长达504小时可以检测到RiboMab_445、447和470，长达336小时可以检测到RiboMab_472。IgG RiboMab参照物(基于蛋白ID 408，在CH2中包括LALA突变)表现出610μg/mL的Cmax(注射后24小时)，可检测时间长达168小时。IgG蛋白参照物(蛋白ID 408)表现出快速清除，可检测时间为168小时。在编码萤光素酶的RNA-LNP对照组中未检测到蛋白。

总的来说，所有4种测试的本发明的抗SARS-CoV-2IgG RiboMab由用新抗体序列(实施例6)产生的RNA编码，在体内均以高滴度表达。除RiboMab_447外，本发明的所有IgGRiboMab均表现出高滴度至少21天。

实施例28：体内表达的抗SARS-CoV-2IgG RiboMab的假病毒中和活性

为了确定体内表达的抗SARS-CoV-2IgG RiboMab_445/447/470和472(实施例27a)的病毒中和活性，如实施例26所述进行pVNT测定，但有以下改变：(i)RNA-LNP注射后24小时收获的每组2只小鼠的含RiboMab小鼠血清(没有离心浓缩步骤)用作测试项目。应用12-步、3-倍(RiboMab_445/470/472)或2-倍(RiboMab_447)连续稀释。每只小鼠的起始浓度不同，最低为30.6μg/mL(RiboMab_470)，最高为59.8μg/mL(RiboMab_445和472)。因此，连续稀释范围为大约31-2x10^-4μg/mL(RiboMab_470)、60-3x10^-4μg/mL(RiboMab_445和472)和35-2x10^-2μg/mL(RiboMab_447)。

图29A证实体内表达的本发明的抗SARS-Cov-2 IgG RiboMab以剂量依赖性方式抑制感染，IC50值范围为大约47-582ng/ml(两个生物重复的平均值，图29B)。IgG RiboMab参照物(对应于ID 408的序列)引起显著较高的IC50，没有可计算的IC90。在测试浓度下，IgG参考蛋白ID 408没有明显影响SARS-CoV-2野生型假病毒感染VERO 76细胞。IC90值范围为297-5,458ng/mL(两个生物重复的平均值)，RiboMab_470表现出最低IC90。

实施例29：DNA模板载体和编码抗SARS-CoV-2IgG-scFv双特异性RiboMab的IVT-mRNA的产生

a.抗体IVT-mRNA模板载体的克隆

为了产生嵌合抗SARS-CoV-2-抗体IgG-scFv双特异性RiboMab，选择并合并RiboMab_443/445和470(实施例25-28)的VH和VL序列(在下文和图30中显示为VH^#1、VL^#1和VH^#2、VL^#2)。IgG-scFv分子的想法是通过同时与SARS-CoV-2刺突蛋白的两个表位结合来加速中和。为了产生编码HC和具有连接的单链可变片段的轻链(IgG-scFv)的IVT-mRNA，利用标准技术将兔抗SARS-CoV-2抗体ID 443、445和470(表2中列出)的VH和VL DNA序列亚克隆至IVT-mRNA模板载体pST1-hAg-MCS-FI-A30LA70(BioNTech RNAPharmaceuticals,Mainz,Germany)中。实施例13a中描述了关于克隆的进一步细节。为了连接scFv结构域与LC以及连接scFv中的VH和VL，使用甘氨酸-丝氨酸接头。除了兔VH和VL结构域外，所有其他抗体结构域均源自人IgG1。为了形成本发明的抗SARS-CoV-2IgG-scFv双特异性RiboMab，克隆以下构建体：

RiboMab_498、500和502：

pST1–5’hAg–Sec–VH^#1–CH1–CH2^{(Leu234Ala,Leu235Ala)}–CH3^{(Met434Leu,Asn428Ser)}–FI–A30LA70(HC)

pST1–5’hAg–Sec–VL^#1–CL–GS–VH^#2–GS–VL^#2–FI–A30LA70 (LC-scFv)

#1，第一抗SARS-CoV-2抗体的抗原结合序列；#2，第二抗SARS-CoV-2抗体的抗原结合序列；5’hAg，来自人α-珠蛋白的5’UTR；A，腺嘌呤；Ala；丙氨酸；Asn，天冬酰胺；CL，恒定轻链区；CH，恒定重链区；FI，3’UTR序列；GS，甘氨酸-丝氨酸接头编码序列；HC，重链；L，接头；Leu，亮氨酸；LC，轻链；Met，甲硫氨酸；pST1，DNA模板载体；scFv，单链可变片段；Sec，分泌信号；Ser，丝氨酸；VH，可变重链结构域；VL，可变轻链结构域。

所得的RiboMab包含来自ID 443(IgG)和ID 470(scFv)，命名为RiboMab_498，ID470(IgG)和ID 443(scFv)，命名为RiboMab_500，以及ID 445(IgG)和ID 470(scFv)，命名为RiboMab_502的VH、VL结构域。

b.IVT-mRNA合成

在实施例13b下描述了IVT-mRNA的产生。图30A示出了形成完整的抗体分子(图30B)所需的两个IVT-mRNA的简图。

实施例30：抗SARS-CoV-2IgG-scFv双特异性RiboMab在小鼠中的代动力学行为的估计

a.RNA-LNP施用于小鼠和血清制备

为了研究IgG-scFv双特异性RiboMab在小鼠中的药代动力学行为，使用7周龄的雌性Balb/cJRj(Janvier Labs,Le Genest-Saint-Isle,France)小鼠。对于注射，HC与LC-scFv的RNA混合物比例为0.8:1，已包裹在靶向肝的阳离子脂质纳米颗粒(LNP)中(Jayaraman,M.et al.(2012),Angewandte Chemie(International ed.in English)51(34),8529–8533)。将RNA-LNP的储备溶液(1mg/mL)在室温下解冻，并且用1xDPBS(Gibco/ThermoFisherScientific,Germany)稀释用于注射。将30μg编码本发明的RiboMab_498、RiboMab_500和RiboMab_502的RNA-LNP以每只小鼠100μL的体积静脉内注射。30μg编码萤光素酶的RNA-LNP用作阴性对照，250μg的蛋白ID 408用作IgG蛋白参照物。每种RNA-LNP的组大小包含4只小鼠。取血时间点设定为6、24、48、96、168、336和504小时(0.25、1、2、4、7、14和21天)。将血液直接收集在Microvette 500Z凝胶管(Sarstedt,Nürmbrecht,Germany)中，并且通过离心分离血清，如训练有素的实验室人员所知。收获血清，立即在液氮中速冻，并且储存在-65至-85℃下直至使用。

b.小鼠血清中抗SARS-CoV-2IgG-scFv双特异性RiboMab的基于免疫测定的定量

如实施例27b所述使用Gyros xPand^TMXPA1025免疫测定设备(Gyros ProteinTechnologies AB,Uppsala,Sweden)定量小鼠血清中的抗SARS-CoV-2IgG-scFv双特异性RiboMab浓度。

如图31中证实的，在静脉内注射后96小时内达到460μg/mL(RiboMab_498)、521μg/mL(RiboMab_500)和608μg/mL(RiboMab_502)的最大抗SARS-CoV-2IgG-scFv RiboMab血清浓度。长达504小时(21天)可以检测到RiboMab_500和502，长达336小时(14天)可以检测到RiboMab_498。IgG蛋白参照物(蛋白ID 408)表现出336小时的可检测性。在编码萤光素酶的RNA-LNP对照组中未检测到蛋白。

总的来说，所有三种测试的本发明的SARS-CoV-2IgG-scFv双特异性RiboMab由用新抗SARS-CoV-2刺突蛋白抗体序列(实施例6)产生的RNA编码，在小鼠体内以高滴度表达，半衰期约为10-11天。

实施例31：体内表达的抗SARS-CoV-2IgG-scFv双特异性RiboMab的假病毒中和活性

为了确定体内表达的本发明的抗SARS-CoV-2IgG-scFv双特异性RiboMab_498/500和502的病毒中和活性，在如实施例30a所述的相同条件下在Balb/cJRj小鼠中产生RiboMab，但是每个测试项目仅两只小鼠。在静脉内注射后24小时将小鼠处死以产生用于pVNT测定的最大血清体积，如实施例26所述进行pVNT测定，但有以下改变：(i)含RiboMab的小鼠血清(没有浓缩步骤)用作测试项目，进行12-步、4-倍连续稀释，浓度范围为5-1x10^-6μg/mL。(ii)除了携带SARS-CoV-2的野生型刺突蛋白的假病毒，还测试了携带B.1.1.7(α变体)、B.1.315(β变体)和B.1.617刺突蛋白的假病毒。(iii)使用BMG酶标仪(BMG LABTECHGmbH,Ortenberg,Germany)进行RLU读出。

图32A比较了本发明的双特异性IgG-scFv RiboMab对不同SARS-CoV-2变体的IC50值。RiboMab_500对所有测试的病毒刺突蛋白变体总体上表现出最高的中和效力，IC50值在12.9至66.4ng/mL之间(图32B)。RiboMab_498和502对野生型和B.1.1.7变体表现出高中和效力，具有低IC50值(5.4-10.4ng/mL)，但是对B.1.351(161.7-349.4ng/mL)和B.1.617(62.9-141.4ng/mL)具有明显更高的IC50值。对于所有SARS-CoV-2刺突蛋白变体，RiboMab_498的IC90值范围为17.4-4,885ng/mL，RiboMab_500的IC90值范围为63.6-591.4ng/mL，RiboMab_502的IC90值范围为55.8-2,072ng/mL。

总的来说，本发明的RiboMab_500证实总体上最高的病毒中和效力。

实施例32：体内表达的抗SARS-CoV-2IgG-scFv双特异性RiboMab的完整性

小鼠血清中抗SARS-Cov-2 IgG-scFv双特异性RiboMab的蛋白印迹分析

将RNA-LNP注射后24小时产生的小鼠血清样品(实施例30)用于本发明的抗SARS-CoV-2IgG-scFv RiboMab的分析。将血清样品在Melon凝胶纯化缓冲液(Thermo FisherScientific,Darmstadt,Germany)中1:100稀释。DPBS(Thermo Fisher Scientific)中的纯化的ID 500蛋白用作参考蛋白。将所有样品用DPBS和4x Laemmli缓冲液(Bio-RadLaboratories,Dreieich,Germany)加满至最终体积15μL，并且在非还原条件下加热至95℃保持5min。使用4–15％Criterion^TMTGX Stain-Free^TMGel(Bio-Rad)，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离加热处理的样品和相应的纯化参考蛋白ID 500。作为分子量标准品，使用分子量范围为10–250kD的Precision Plus Protein^TMDual Xtra预染蛋白标准品(Bio-Rad)。由训练有素的实验室人员根据标准程序进行蛋白印迹分析(图33A)。将硝酸纤维素膜(Bio-Rad)用5％牛奶溶液(Carl Roth GmbH&Co.KG)封闭1小时。使用3％BSA级分V溶液(EurobioScientific,Les Ulis,France)中稀释的过氧化物酶缀合的山羊抗人IgG(H+L)(1:500稀释；Jackson ImmunoResearch,Cambridge,UK)混合物检测印迹膜上的蛋白条带。随后将膜用Clarity Western过氧化物试剂和Clarity Western Luminol/Enhancer试剂(Bio-Rad)的1:1混合物温育，并且在VILBER Fusion X成像设备(Vilber Lourmat,Eberhardzell,Germany)上成像。用Image Lab软件(Bio-Rad)分析数据。与内部分子量标准相比，在大约250kD(全抗体)处检测到RiboMab信号。

使用ImageLab软件(Bio-Rad,Dreieich,Germany)对单体蛋白、高分子量和低分子量(HMW,LMW)物质的部分进行定量。对于相对蛋白定量，定义单个蛋白条带的区域并积分包含像素的信号。如图33B中总结的，检测的RiboMab_498、500和502的单体物质分别为87.5％、94.4％和86.7％，HMW物质分别为4.7％、2.6％和6.6％，LMW分别为7.8、3.0和6.7％。值得注意的是，LMW物质条带对应于纯化的重组IgG-scFv蛋白ID 500的模式，因此属于正常的抗体模式。

总的来说，本发明的IgG-scFv双特异性RiboMab正确组装并折叠成主要的单体蛋白，HMW物质的形成最少。

Claims

1.一种结合剂，其至少包含与冠状病毒刺突蛋白(S蛋白)结合的第一结合结构域以及与冠状病毒S蛋白结合的第二结合结构域，其中所述第一和第二结合结构域与所述冠状病毒S蛋白的不同表位结合。

2.权利要求1的结合剂，其中所述结合剂是多特异性如双特异性结合剂。

3.权利要求1或2的结合剂，其中所述第一结合结构域包含重链可变区(VH)。

4.权利要求3的结合剂，其中所述VH包含HCDR3，其包含选自SEQ ID NO：4、12、20、28、36、44、52、60、68、76、84、92、100、108、116和124的序列。

5.权利要求3或4的结合剂，其中所述VH包含HCDR2，其包含选自SEQ ID NO：3、11、19、27、35、43、51、59、67、75、83、91、99、107、115和123的序列。

6.权利要求3-5中任一项的结合剂，其中所述VH包含HCDR1，其包含选自SEQ ID NO：2、10、18、26、34、42、50、58、66、74、82、90、98、106、114和122的序列。

7.权利要求3-6中任一项的结合剂，其中所述VH选自：

(i)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：2的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：3的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：4的序列；

(ii)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：10的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：11的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：12的序列；

(iii)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：18的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：19的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：20的序列；

(iv)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：26的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：27的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：28的序列；

(v)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：34的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：35的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：36的序列；

(vi)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：42的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：43的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：44的序列；

(vii)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：50的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：51的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：52的序列；

(viii)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：58的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：59的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：60的序列；

(ix)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：66的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：67的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：68的序列；

(x)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：74的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：75的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：76的序列；

(xi)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：82的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：83的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：84的序列；

(xii)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：90的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：91的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：92的序列；

(xiii)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：98的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：99的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：100的序列；

(xiv)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：106的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：107的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：108的序列；

(xv)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：114的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：115的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：116的序列；以及

(xvi)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：122的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：123的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：124的序列。

8.权利要求1-7中任一项的结合剂，其中所述第一结合结构域包含轻链可变区(VL)。

9.权利要求8的结合剂，其中所述VL包含LCDR3，其包含选自SEQ ID NO：8、16、24、32、40、48、56、64、72、80、88、96、104、112、120和128的序列。

10.权利要求8或9的结合剂，其中所述VL包含LCDR2，其包含选自SEQ ID NO：7、15、23、31、39、47、55、63、71、79、87、95、103、111、119和127的序列。

11.权利要求8-10中任一项的结合剂，其中所述VL包含LCDR1，其包含选自SEQ ID NO：6、14、22、30、38、46、54、62、70、78、86、94、102、110、118和126的序列。

12.权利要求8-11中任一项的结合剂，其中所述VL选自：

(i)VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：6的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：7的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：8的序列；

(ii)VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：14的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：15的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：16的序列；

(iii)VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：22的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：23的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：24的序列；

(iv)VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：30的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：31的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：32的序列；

(v)VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：38的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：39的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：40的序列；

(vi)VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：46的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：47的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：48的序列；

(vii)VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：54的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：55的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：56的序列；

(viii)VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：62的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：63的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：64的序列；

(ix)VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：70的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：71的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：72的序列；

(x)VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：78的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：79的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：80的序列；

(xi)VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：86的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：87的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：88的序列；

(xii)VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：94的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：95的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：96的序列；

(xiii)VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：102的序列，LCDR2，其包含SEQ IDNO：103的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：104的序列；

(xiv)VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：110的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：111的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：112的序列；

(xv)VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：118的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：119的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：120的序列；以及

(xvi)VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：126的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：127的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：128的序列。

13.权利要求1-12中任一项的结合剂，其中所述第一结合结构域包含选自以下的VH和VL：

(i)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：2的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：3的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：4的序列，以及VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：6的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：7的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：8的序列；

(ii)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：10的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：11的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：12的序列，以及VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ IDNO：14的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：15的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：16的序列；

(iii)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：18的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：19的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：20的序列，以及VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQID NO：22的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：23的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：24的序列；

(iv)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：26的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：27的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：28的序列，以及VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ IDNO：30的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：31的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：32的序列；

(v)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：34的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：35的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：36的序列，以及VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ IDNO：38的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：39的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：40的序列；

(vi)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：42的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：43的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：44的序列，以及VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ IDNO：46的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：47的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：48的序列；

(vii)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：50的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：51的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：52的序列，以及VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQID NO：54的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：55的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：56的序列；

(viii)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：58的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：59的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：60的序列，以及VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQID NO：62的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：63的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：64的序列；

(ix)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：66的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：67的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：68的序列，以及VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ IDNO：70的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：71的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：72的序列；

(x)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：74的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：75的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：76的序列，以及VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ IDNO：78的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：79的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：80的序列；

(xi)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：82的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：83的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：84的序列，以及VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ IDNO：86的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：87的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：88的序列；

(xii)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：90的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：91的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：92的序列，以及VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQID NO：94的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：95的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：96的序列；

(xiii)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：98的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：99的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：100的序列，以及VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQID NO：102的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：103的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：104的序列；

(xiv)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：106的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：107的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：108的序列，以及VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQID NO：110的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：111的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：112的序列；

(xv)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：114的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：115的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：116的序列，以及VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQID NO：118的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：119的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：120的序列；以及

(xvi)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：122的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：123的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：124的序列，以及VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQID NO：126的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：127的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：128的序列。

14.权利要求1-13中任一项的结合剂，其中所述第一结合结构域包含VH，所述VH包含与选自SEQ ID NO：1、9、17、25、33、41、49、57、65、73、81、89、97、105、113和121的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列。

15.权利要求1-14中任一项的结合剂，其中所述第一结合结构域包含VL，所述VL包含与选自SEQ ID NO：5、13、21、29、37、45、53、61、69、77、85、93、101、109、117和125的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列。

16.权利要求1-15中任一项的结合剂，其中所述第一结合结构域包含选自以下的VH和VL：

(i)VH，其包含与SEQ ID NO：1的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，以及VL，其包含与SEQ IDNO：5的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(ii)VH，其包含与SEQ ID NO：9的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，以及VL，其包含与SEQ IDNO：13的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(iii)VH，其包含与SEQ ID NO：17的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，以及VL，其包含与SEQ ID NO：21的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(iv)VH，其包含与SEQ ID NO：25的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，以及VL，其包含与SEQ IDNO：29的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(v)VH，其包含与SEQ ID NO：33的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，以及VL，其包含与SEQ IDNO：37的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(vi)VH，其包含与SEQ ID NO：41的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，以及VL，其包含与SEQ IDNO：45的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(vii)VH，其包含与SEQ ID NO：49的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，以及VL，其包含与SEQ ID NO：53的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(viii)VH，其包含与SEQ ID NO：57的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，以及VL，其包含与SEQ ID NO：61的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(ix)VH，其包含与SEQ ID NO：65的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，以及VL，其包含与SEQ IDNO：69的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(x)VH，其包含与SEQ ID NO：73的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，以及VL，其包含与SEQ IDNO：77的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(xi)VH，其包含与SEQ ID NO：81的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，以及VL，其包含与SEQ IDNO：85的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(xii)VH，其包含与SEQ ID NO：89的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，以及VL，其包含与SEQ ID NO：93的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(xiii)VH，其包含与SEQ ID NO：97的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，以及VL，其包含与SEQ ID NO：101的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(xiv)VH，其包含与SEQ ID NO：105的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，以及VL，其包含与SEQ ID NO：109的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(xv)VH，其包含与SEQ ID NO：113的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，以及VL，其包含与SEQ ID NO：117的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；以及

(xvi)VH，其包含与SEQ ID NO：121的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，以及VL，其包含与SEQ ID NO：125的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列。

17.权利要求1-16中任一项的结合剂，其中所述第二结合结构域包含ACE2蛋白的胞外域(ECD)或其变体，或者ACE2蛋白的ECD的片段或其变体。

18.权利要求1-17中任一项的结合剂，其中所述ACE2蛋白的ECD的变体或者ACE2蛋白的ECD的片段或其变体与冠状病毒S蛋白结合。

19.权利要求17或18的结合剂，其中所述第二结合结构域包含与SEQ ID NO：129的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列。

20.权利要求1-16中任一项的结合剂，其中所述第二结合结构域包含重链可变区(VH)。

21.权利要求20的结合剂，其中所述第二结合结构域的VH包含HCDR3，其包含选自SEQID NO：4、12、20、28、36、44、52、60、68、76、84、92、100、108、116和124的序列。

22.权利要求20或21的结合剂，其中所述第二结合结构域的VH包含HCDR2，其包含选自SEQ ID NO：3、11、19、27、35、43、51、59、67、75、83、91、99、107、115和123的序列。

23.权利要求20-22中任一项的结合剂，其中所述第二结合结构域的VH包含HCDR1，其包含选自SEQ ID NO：2、10、18、26、34、42、50、58、66、74、82、90、98、106、114和122的序列。

24.权利要求20-23中任一项的结合剂，其中所述第二结合结构域的VH选自：

25.权利要求1-16或20-24中任一项的结合剂，其中所述第二结合结构域包含轻链可变区(VL)。

26.权利要求25的结合剂，其中所述第二结合结构域的VL包含LCDR3，其包含选自SEQID NO：8、16、24、32、40、48、56、64、72、80、88、96、104、112、120和128的序列。

27.权利要求25或26的结合剂，其中所述第二结合结构域的VL包含LCDR2，其包含选自SEQ ID NO：7、15、23、31、39、47、55、63、71、79、87、95、103、111、119和127的序列。

28.权利要求25-27中任一项的结合剂，其中所述第二结合结构域的VL包含LCDR1，其包含选自SEQ ID NO：6、14、22、30、38、46、54、62、70、78、86、94、102、110、118和126的序列。

29.权利要求25-28中任一项的结合剂，其中所述第二结合结构域的VL选自：

30.权利要求1-16或20-29中任一项的结合剂，其中所述第二结合结构域包含选自以下的VH和VL：

31.权利要求1-16或20-30中任一项的结合剂，其中所述第二结合结构域包含VH，所述VH包含与选自SEQ ID NO：1、9、17、25、33、41、49、57、65、73、81、89、97、105、113和121的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列。

32.权利要求1-16或20-31中任一项的结合剂，其中所述第二结合结构域包含VL，所述VL包含与选自SEQ ID NO：5、13、21、29、37、45、53、61、69、77、85、93、101、109、117和125的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列。

33.权利要求1-16或20-32中任一项的结合剂，其中所述第二结合结构域包含选自以下的VH和VL：

34.权利要求1-33中任一项的结合剂，其中：

(i)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：122的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：123的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：124的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：126的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：127的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：128的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：34的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：35的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：36的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：38的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：39的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：40的序列；

(ii)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：122的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：123的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：124的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：126的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：127的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：128的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：2的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：3的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：4的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：6的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：7的序列，和LCDR3，其包含SEQID NO：8的序列；

(iii)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：122的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：123的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：124的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：126的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：127的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：128的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：10的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：11的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：12的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：14的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：15的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：16的序列；

(iv)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：122的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：123的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：124的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：126的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：127的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：128的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：26的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：27的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：28的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：30的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：31的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：32的序列；

(v)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：122的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：123的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：124的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：126的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：127的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：128的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：42的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：43的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：44的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：46的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：47的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：48的序列；

(vi)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：34的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：35的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：36的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：38的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：39的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：40的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：122的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：123的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：124的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：126的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：127的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：128的序列；

(vii)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：26的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：27的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：28的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：30的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：31的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：32的序列，

(viii)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：42的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：43的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：44的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：46的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：47的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：48的序列，

(ix)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：2的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：3的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：4的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：6的序列，LCDR2，其包含SEQ IDNO：7的序列，和LCDR3，其包含SEQID NO：8的序列，

(x)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：10的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：11的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：12的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：14的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：15的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：16的序列，

(xi)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：122的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：123的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：124的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：126的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：127的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：128的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：18的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：19的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：20的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：22的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：23的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：24的序列；

(xii)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：122的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：123的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：124的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：126的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：127的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：128的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：50的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：51的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：52的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：54的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：55的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：56的序列；

(xiii)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：122的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：123的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：124的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：126的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：127的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：128的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：106的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：107的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：108的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：110的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：111的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：112的序列；

(xiv)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：18的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：19的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：20的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：22的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：23的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：24的序列，

(xv)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：50的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：51的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：52的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：54的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：55的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：56的序列，

(xvi)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：106的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：107的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：108的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：110的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：111的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：112的序列，

(xvii)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：106的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：107的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：108的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：110的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：111的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：112的序列，

(xviii)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：106的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：107的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：108的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：110的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：111的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：112的序列，

(xix)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：106的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：107的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：108的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：110的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：111的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：112的序列，

(xx)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：18的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：19的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：20的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：22的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：23的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：24的序列，

(xxi)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：50的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：51的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：52的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：54的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：55的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：56的序列，

(xxii)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：42的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：43的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：44的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：46的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：47的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：48的序列，

(xxiii)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：122的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：123的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：124的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：126的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：127的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：128的序列，

并且第二结合结构域包含与SEQ ID NO：129的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(xxiv)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：18的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：19的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：20的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：22的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：23的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：24的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：82的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：83的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：84的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：86的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：87的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：88的序列；

(xxv)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：82的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：83的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：84的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：86的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：87的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：88的序列，

(xxvi)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：82的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：83的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：84的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：86的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：87的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：88的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：50的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：51的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：52的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：54的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：55的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：56的序列；或者

(xxvii)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：50的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：51的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：52的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：54的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：55的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：56的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：82的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：83的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：84的序列，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：86的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：87的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：88的序列。

35.权利要求1-34中任一项的结合剂，其中：

(i)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO：121的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO：125的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO：33的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO：37的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(ii)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO：121的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO：125的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO：1的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO：5的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(iii)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO：121的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO：125的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO：9的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO：13的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(iv)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO：121的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO：125的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO：25的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO：29的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(v)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO：121的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO：125的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO：41的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO：45的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(vi)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO：33的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO：37的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO：121的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO：125的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(vii)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO：25的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO：29的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

(viii)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO：41的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO：45的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

(ix)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO：1的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO：5的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

(x)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO：9的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO：13的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

(xi)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO：121的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO：125的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO：17的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO：21的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(xii)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO：121的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO：125的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO：49的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO：53的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(xiii)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO：121的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO：125的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO：105的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO：109的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(xiv)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO：17的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO：21的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

(xv)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO：49的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO：53的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

(xvi)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO：105的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO：109的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

(xvii)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO：105的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO：109的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

(xviii)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO：105的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO：109的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

(xix)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO：105的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO：109的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

(xx)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO：17的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO：21的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

(xxi)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO：49的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO：53的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

(xxii)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO：41的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO：45的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

(xxiii)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO：121的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO：125的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

(xxiv)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO：17的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO：21的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO：81的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO：85的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；

(xxv)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO：81的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO：85的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

(xxvi)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO：81的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO：85的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO：49的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO：53的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；或者

(xxvii)第一结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO：49的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO：53的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，

并且第二结合结构域包含VH和VL，所述VH包含VH与SEQ ID NO：81的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO：85的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列。

36.权利要求1-35中任一项的结合剂，其包含重链和轻链，形成第一结合结构域。

37.权利要求1-36中任一项的结合剂，其包含两条重链和两条轻链，其中每条重链与轻链之一一起形成第一结合结构域。

38.权利要求36或37的结合剂，其中所述重链包含VH。

39.权利要求36-38中任一项的结合剂，其中所述轻链包含VL。

40.权利要求36-39中任一项的结合剂，其中所述重链包含片段可结晶(Fc)区。

41.权利要求36-40中任一项的结合剂，其中重链与轻链相关联。

42.权利要求37-41中任一项的结合剂，其中所述重链以共价和/或非共价方式关联。

43.权利要求37-42中任一项的结合剂，其中所述两条重链相同，并且所述两条轻链相同。

44.权利要求36-43中任一项的结合剂，其包含全长抗体或全长抗体样分子，所述全长抗体或全长抗体样分子包含第一结合结构域。

45.权利要求1-44中任一项的结合剂，其包含两个第一结合结构域。

46.权利要求45的结合剂，其中所述两个第一结合结构域与相同表位结合。

47.权利要求1-16或20-46中任一项的结合剂，其中所述第二结合结构域包含单链可变片段(scFv)。

48.权利要求1-47中任一项的结合剂，其中所述第一和第二结合结构域直接或通过接头共价连接。

49.权利要求48的结合剂，其中所述接头是甘氨酸-丝氨酸(GS)接头。

50.权利要求1-49中任一项的结合剂，其包含两条重链和两条轻链，形成包含两个第一结合结构域的全长抗体或全长抗体样分子，其中每条轻链连接至第二结合结构域。

51.权利要求50的结合剂，其中每条轻链的C-末端连接至第二结合结构域的N-末端。

52.权利要求50的结合剂，其中每条轻链的N-末端连接至第二结合结构域的C-末端。

53.一种抗体，其包含重链可变区(VH)，其中所述VH包含选自以下的一个或多个：

(i)HCDR3，其包含选自SEQ ID NO：4、12、20、28、36、44、52、60、68、76、84、92、100、108和116的序列；

(ii)HCDR2，其包含选自SEQ ID NO：3、11、19、27、35、43、51、59、67、75、83、91、99、107和115的序列；以及

(iii)HCDR1，其包含选自SEQ ID NO：2、10、18、26、34、42、50、58、66、74、82、90、98、106和114的序列。

54.权利要求53的抗体，其中所述VH选自：

(xiv)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：106的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：107的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：108的序列；以及

(xv)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：114的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：115的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：116的序列。

55.一种抗体，其包含轻链可变区(VL)，其中所述VL包含选自以下的一个或多个：

(i)LCDR3，其包含选自SEQ ID NO：8、16、24、32、40、48、56、64、72、80、88、96、104、112和120的序列；

(ii)LCDR2，其包含选自SEQ ID NO：7、15、23、31、39、47、55、63、71、79、87、95、103、111和119的序列；以及

(iii)LCDR1，其包含选自SEQ ID NO：6、14、22、30、38、46、54、62、70、78、86、94、102、110和118的序列。

56.权利要求55的抗体，其中所述VL选自：

(xiv)VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：110的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：111的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：112的序列；以及

(xv)VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：118的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：119的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：120的序列。

57.权利要求53-56中任一项的抗体，其中所述抗体包含选自以下的VH和VL：

(xiv)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：106的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：107的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：108的序列，以及VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQID NO：110的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：111的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：112的序列；以及

(xv)VH，所述VH包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：114的序列，HCDR2，其包含SEQ ID NO：115的序列，和HCDR3，其包含SEQ ID NO：116的序列，以及VL，所述VL包含：LCDR1，其包含SEQID NO：118的序列，LCDR2，其包含SEQ ID NO：119的序列，和LCDR3，其包含SEQ ID NO：120的序列。

58.权利要求53-57中任一项的抗体，其中所述抗体包含VH，所述VH包含与选自SEQ IDNO：1、9、17、25、33、41、49、57、65、73、81、89、97、105和113的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列。

59.权利要求53-58中任一项的抗体，其中所述抗体包含VL，所述VL包含与选自SEQ IDNO：5、13、21、29、37、45、53、61、69、77、85、93、101、109和117的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列。

60.权利要求53-59中任一项的抗体，其中所述抗体包含选自以下的VH和VL：

(xiv)VH，其包含与SEQ ID NO：105的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，以及VL，其包含与SEQ ID NO：109的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列；以及

(xv)VH，其包含与SEQ ID NO：113的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列，以及VL，其包含与SEQ ID NO：117的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同性的序列。

61.一种重组核酸，其编码权利要求1-52中任一项的结合剂或权利要求53-60中任一项的抗体。

62.权利要求61的重组核酸，其是RNA。

63.一种细胞，其用权利要求61或62的重组核酸转染。

64.权利要求63的细胞，其中所述细胞表达所述结合剂或抗体。

65.一种药物组合物，其包含权利要求1-52中任一项的结合剂、权利要求53-60中任一项的抗体或者权利要求61或62的重组核酸。

66.权利要求1-52中任一项的结合剂、权利要求53-60中任一项的抗体或者权利要求61或62的重组核酸用于治疗用途。

67.权利要求66的结合剂、抗体或重组核酸，其中所述治疗用途包括对受试者的冠状病毒感染的治疗性或预防性治疗。

68.权利要求66或67的结合剂、抗体或重组核酸，其中所述治疗用途包括中和受试者中的冠状病毒。

69.权利要求67或68的结合剂、抗体或重组核酸，其中所述受试者是人。

70.权利要求1-52和66-69中任一项的结合剂，权利要求53-60和66-69中任一项的抗体，权利要求61、62和66-69中任一项的重组核酸，权利要求63或64的细胞，或者权利要求65的药物组合物，其中所述冠状病毒是β冠状病毒。

71.权利要求1-52和66-70中任一项的结合剂，权利要求53-60和66-70中任一项的抗体，权利要求61、62和66-70中任一项的重组核酸，权利要求63、64和70中任一项的细胞，或者权利要求65或70的药物组合物，其中所述冠状病毒是沙贝病毒。

72.权利要求1-52和66-71中任一项的结合剂，权利要求53-60和66-71中任一项的抗体，权利要求61、62和66-71中任一项的重组核酸，权利要求63、64、70和71中任一项的细胞，或者权利要求65、70或71中任一项的药物组合物，其中所述冠状病毒是SARS-CoV-1和/或SARS-CoV-2。

73.一种治疗或预防冠状病毒感染的方法，其包括向受试者给药权利要求1-52中任一项的结合剂、权利要求53-60中任一项的抗体、权利要求61或62的重组核酸或者权利要求65的药物组合物。