CN111212911A - 与tb7.7特异性结合的dna适体及其用途 - Google Patents
与tb7.7特异性结合的dna适体及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111212911A CN111212911A CN201880062228.XA CN201880062228A CN111212911A CN 111212911 A CN111212911 A CN 111212911A CN 201880062228 A CN201880062228 A CN 201880062228A CN 111212911 A CN111212911 A CN 111212911A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tuberculosis
- biosensor
- dna aptamer
- dna
- aptamer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/551—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being inorganic
- G01N33/553—Metal or metal coated
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
- G01N33/5695—Mycobacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/16—Aptamers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及一种与7.7kDa结核特异性抗原(TB7.7)特异性结合的DNA适体;一种用于诊断结核的生物传感器,其包括所述DNA适体;以及一种用于提供用于诊断结核的信息的方法。本发明人发现,根据本发明的DNA适体不仅具有与TB7.7蛋白的特异性结合潜能,而且结合亲和力也优异。因此可以预期,本发明的DNA适体在使用时比使用抗体的常规ELISA方法表现出更大的稳定性。因此,该适体预期有益地应用于开发用于诊断结核的组合物、用于诊断结核的生物传感器以及用于提供用于诊断结核的信息的方法。
Description
技术领域
本发明涉及用于蛋白检测的适体,更具体地,涉及与已知在结核分枝杆菌H37Rv中表达的7.7kDa结核特异性抗原(TB7.7)特异性结合的DNA适体。
背景技术
结核是由结核分枝杆菌感染导致的常见致命疾病。结核的症状包括由于厌食、高烧和伴有血痰的咳嗽引起的突然的体重减轻。诊断方法包括X射线检查、痰液涂片检查和聚合酶链反应(PCR),最后通过它们的组合来诊断结核。众所周知,结核在包括非洲地区在内的发展中国家经常发生,最近被认为是一种已根除的疾病。但是,根据世界卫生组织的统计数据,这是一种可怕的疾病,在2015年全球死亡致因中排名前10位,尤其是,韩国在结核发病率和死亡率方面以压倒性的数量位居经合组织(OECD)国家之首。因此,韩国制定了国家结核管控指南,最大的问题是潜伏性结核的诊断,潜伏性结核患者的人数估计为20亿,相当于世界人口的三分之一。10%的潜伏性结核发展为活动性结核,在其症状发作之前进行早期诊断和治疗很重要。
当前,潜伏性结核的诊断基于两种测试:结核菌素皮肤测试(TST)和干扰素-γ释放测定(IGRA)。TST至少需要48小时到72小时,并且可能会因BCG疫苗接种或感染非结核分枝杆菌而显示假阳性结果。IGRA是一种间接诊断方法,其中将患者的血液添加到附着有结核分枝杆菌特异性抗原的管中,接着刺激16小时,然后测量干扰素-γ的分泌。与TST相比,由于使用了结核分枝杆菌特异性抗原,假阳性结果的概率很低,但是考虑到结核的流行地区大多炎热或潮湿,缺乏稳定性便是一个缺点。另外,通过在血液中的刺激间接测量干扰素-γ的分泌,因此存在诸如敏感性降低之类的缺点。
同时,TB7.7也称为Rv2654c并且已知在结核分枝杆菌H37Rv中表达,这导致尤其对人类致命的结核。目前尚不确切知道在感染期间诱发宿主疾病的机制,但通过IGRA推测TB7.7与ESAT6形成复合物,该复合物被用作针对干扰素-γ分泌的结核分枝杆菌特异性抗原,以介导Th1细胞免疫应答。
适体是对特定物质具有高特异性和亲和力的单链DNA(ssDNA)或RNA,由于对特定物质的亲和力非常高且稳定,近来已得到积极开发,并且其在治疗剂和诊断传感器中的应用在积极进行中(参见韩国专利登记号10-1279585)。适体可以使用相对简单的方法合成,并且可以靶向细胞、蛋白,甚至靶向小的有机物,因此有可能开发使用适体的新型检测方法,并且由于与先前开发的抗体相比,其特异性和稳定性更高,有可能将其应用于治疗剂、药物递送系统和诊断性生物传感器的开发,因此,继续对其进行研究。
发明内容
技术问题
由于付出了巨大的努力来开发能够替代针对7.7kDa结核特异性抗原(TB7.7)的抗体的适体,本发明的发明人生产了对TB7.7蛋白具有特异性结合能力的DNA适体,从而基于该发现完成了本发明。
因此,本发明的目的是提供一种与7.7kDa结核特异性抗原(TB7.7)特异性结合的DNA适体,其中DNA适体由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的核苷酸序列组成。
本发明的另一个目的是提供一种用于诊断结核的组合物,其包括DNA适体。
本发明的又一个目的是提供一种用于诊断结核的生物传感器,其包括对7.7kDa结核特异性抗原(TB7.7)具有特异性的DNA适体;以及其上固定有DNA适体的板,其中DNA适体由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的核苷酸序列组成。
本发明的又一个目的是提供一种提供用于诊断结核的信息的方法,该方法包括:(1)用生物传感器处理受试者样本;以及(2)测量与生物传感器结合的7.7kDa结核特异性抗原(TB7.7)的水平。
然而,本发明要解决的技术问题不限于上述技术问题,并且根据以下描述,其他未提及的技术问题对本领域普通技术人员来说将变得显而易见。
技术方案
根据本发明的一个方面,提供一种与7.7kDa结核特异性抗原(TB7.7)特异性结合的DNA适体,其中所述DNA适体由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的核苷酸序列组成。
在本发明的一个实施方案中,TB7.7可以在结核分枝杆菌H37Rv中表达,但是本发明不限于此。
本发明还提供一种用于诊断结核的组合物,其包括所述DNA适体。
本发明还提供一种用于诊断结核的生物传感器,其包括:对7.7kDa结核特异性抗原(TB7.7)具有特异性的DNA适体;以及其上固定有DNA适体的板,其中所述DNA适体由SEQID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的核苷酸序列组成。
在本发明的一个实施方案中,所述板可以由金属电极层和金属纳米颗粒层组成,并且优选地,金属可以是金(Au),但是本发明不限于此。
本发明还提供一种提供用于诊断结核的信息的方法,所述方法包括:(1)用生物传感器处理受试者样本;以及(2)测量与所述生物传感器结合的7.7kDa结核特异性抗原(TB7.7)的水平。
本发明还提供一种诊断结核的方法,所述方法包括使DNA适体与受试者样本接触。
本发明还提供一种诊断结核的方法,所述方法包括:用生物传感器处理受试者样本;以及测量与所述生物传感器结合的TB7.7的水平。
在本发明的一个实施方案中,所述受试者样本可以是需要诊断结核的个体的血液,并且所述血液可以是全血、血清、血浆或血液单核细胞。
本发明还提供DNA适体用于诊断结核的用途,所述DNA适体与7.7kDa结核特异性抗原(TB7.7)特异性结合。
发明的有益效果
根据本发明的DNA适体具有对7.7kDa结核特异性抗原(TB7.7)蛋白的特异性结合能力,并且其结合能力优异,因此在结核的诊断中可以排除假阴性反应(false-negativeresponse)。另外,本发明的DNA适体与靶(TB7.7)具有高亲和力,并且对除靶以外的物质具有高排他性,使得在结核的诊断中可以排除假阳性反应。因此,与使用现有抗体的ELISA方法相比,当使用本发明的DNA适体时,可以预期有优异的稳定性,因此,该适体有望有效地应用于:用于开发诊断结核的组合物、用于诊断结核的生物传感器、提供用于诊断结核的信息的方法等。
附图说明
图1a示出了扩增TB7.7基因的结果,图1b示出了确认(confirm)重组TB7.7蛋白的过表达的结果(1泳道表示诱导过表达之前,2泳道表示通过用IPTG处理获得的过表达诱导结果),以及图1c示出了观察通过FPLC获得的高纯度重组TB7.7蛋白的结果。
图2示出了确认单链DNA(ssDNA)和TB7.7之间的结合程度(%)的结果以及选择过程运行的结果。
图3a、3b和3c分别示出了通过荧光测量确认TG4、TG5和TG6适体序列的Kd值的结果。
图4是使用DNA适体检测TB7.7蛋白的生物传感器的示意图。
图5示出了在相同的适体浓度下改变间隔物浓度的同时测量阻抗值的结果。
图6a和6b示出了使用TG4适体获得的TB7.7检测结果。
图7示出了显示针对TB7.7蛋白的结合特异性实验中的相对阻抗值根据与每种蛋白的反应而变化的结果。
图8示出了显示当从正常个体和结核患者分离的血清样本用TG4适体处理时阻抗值变化的结果。
具体实施方式
由于付出了巨大的努力来开发能够替代针对7.7kDa结核特异性抗原(TB7.7)的抗体的适体,本发明的发明人在细菌表达系统中表达了TB7.7,纯化了表达的TB7.7,以及通过指数富集(SELEX)技术,利用对配体的系统进化选择了适体,建立了DNA适体的序列和结构,以及确认了本发明中产生的DNA适体与7.7kDa结核特异性抗原(TB7.7)蛋白特异性结合的能力,从而基于该发现完成了本发明。
在下文中,将详细描述本发明。
本发明提供一种与7.7kDa结核特异性抗原(TB7.7)特异性结合的DNA适体,其中DNA适体由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的核苷酸序列组成。
在本发明中,“7.7kDa结核特异性抗原(TB7.7)”是由结核分枝杆菌产生的蛋白,也称为Rv2654c。已知TB7.7与ESAT6和CFP10蛋白一起用于分枝杆菌的淋巴细胞刺激中。
如本文所用,术语“适体”是指对特定物质具有高特异性和亲和性的单链DNA(ssDNA)或RNA。使用先前开发的抗体的方法利用生物体的免疫系统,因此花费相对大量的时间和成本,并且由于这些抗体是蛋白,因此其稳定性有时是有问题的,而适体可以使用相对简单的方法合成并且靶向细胞、蛋白,甚至靶向小的有机物,从而能够开发使用适体的新检测方法,并且由于DNA适体与以前开发的抗体相比具有很高的特异性和稳定性,因此将其用于对TB7.7蛋白的特异性检测。适体优选地可以由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ IDNO:8的核苷酸序列组成,更优选地可以由SEQ ID NO:6的核苷酸序列组成,但是本发明不限于此。
本发明还提供一种用于诊断结核的组合物,其包括DNA适体。
除了DNA适体外,本发明的组合物还可包含药理或生理学可接受的载体、赋形剂和稀释剂,并且可包含在该组合物中的载体、赋形剂和稀释剂的实例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、无定形纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、甲基羟基苯甲酸酯、丙基羟基苯甲酸酯、滑石粉、硬脂酸镁、矿物油等。当配制时、该组合物可以进一步包含常用的填充剂、增稠剂、粘合剂、崩解剂、表面活性剂、抗凝剂、润滑剂、湿润剂、香料、乳化剂、防腐剂等。
本发明还提供一种用于诊断结核的生物传感器,包括:对7.7kDa结核特异性抗原(TB7.7)具有特异性的DNA适体;以及其上固定有DNA适体的板,其中DNA适体由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的核苷酸序列组成。
其上固定有本发明的DNA适体的板可以由金属电极层和金属纳米颗粒层组成,并且电极层和纳米颗粒的材料可以被电场或磁场吸引,并且可以是任何能够改变电场的特性的材料,优选金(Au),但是本发明不限于此。
在本发明的一个实施方案中,通过表达和纯化7.7kDa结核特异性抗原(TB7.7)蛋白来鉴定特异性结合序列(参见实施例1至3),并且筛选与TB7.7蛋白具有强结合能力的适体(参见实施例4)。另外,基于上述实验结果,通过荧光测量蛋白与适体之间的结合力(参见实施例5),并且通过其结果,使用EIS方法,利用发现的DNA适体来制造用于检测TB7.7的生物传感器。还确认了生物传感器对TB7.7蛋白也具有非常高的结合特异性,因此可以用作一种提供用于诊断结核的信息的方法(参见实施例7)。
因此,本发明提供一种提供用于诊断结核的信息的方法,该方法包括:(1)用生物传感器处理受试者样本;以及(2)测量与生物传感器结合的7.7kDa结核特异性抗原(TB7.7)的水平。
在本发明中,受试者不受限制,只要该受试者是需要诊断结核的个体即可,并且个体包括哺乳动物和非哺乳动物,并且哺乳动物包括小鼠、牲畜、人类等,但是优选人类。
另外,在本发明中,受试者样本可以是需要诊断结核的个体的血液,并且血液可以是全血、血清、血浆或血液单核细胞。
实施例
在下文中,将描述示例性实施例以帮助理解本发明。然而,提供以下实施例以促进对本发明的理解,而无意于限制本发明的范围。
实施例1.TB7.7基因克隆
为了扩增7.7kDa结核特异性抗原(TB7.7)的基因,使用正向引物和反向引物,该正向引物包括BamH1限制酶识别序列[5'-CCC GGA TCC ATG AGC GGC CAC GCG TTG3'(SEQ IDNO:1)],该反向引物包括Xho1限制酶识别序列[5'CCC CCC TCG AGT CAC GGC GGA TCA CCCC3'(SEQ ID NO:2)]。
结核分枝杆菌H37Rv的基因组DNA用作基因扩增的模板,并且使用i-pfu聚合酶通过聚合酶链反应(PCR)扩增。PCR的各过程如下:1)于98℃孵育20秒,作为使双链DNA变性为模板的过程;2)于55℃孵育20秒,作为用引物使模板退火的过程;3)于72℃孵育30秒,作为延伸新链的过程,以及重复这些过程的循环30次。
通过与限制酶和DNA连接酶反应,将扩增的TB7.7基因克隆到含有(His)6-标签的pET32a载体中,以及用该载体转化BL21(DE3)大肠杆菌细胞。结果,如图1a所示,确认了TB7.7基因被扩增。
实施例2.TB7.7蛋白的表达
将用TB7.7基因转化的BL21(DE3)细胞在Luria Bertani(LB)培养基中培养,并于37℃培养,直到在UV 600nm处的光密度(OD)达到0.563。此后,加入异丙基-硫代-b-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)至最终浓度为20mM以诱导该蛋白的表达,然后于37℃孵育4小时。通过SDSPAGE确认该蛋白的表达,以及使用离心机将细胞从培养基中分离,并用PBS(10mM磷酸钠,150mM NaCl,pH 8.0)缓冲液洗涤一次。结果,如图1b所示,确认了重组TB7.7蛋白被过表达。
实施例3.TB7.7蛋白的纯化
为了以高纯度纯化在细菌细胞BL21(DE3)中表达的TB7.7蛋白,将细胞在细胞裂解缓冲液(20mM Tris,500mM NaCl,0.5mMβ-巯基乙醇,5%甘油,pH 8.0)中裂解,然后用超声仪超声15分钟使其破裂。使用离心机以18,000rpm分离40分钟,以便从细胞分离处于水溶液状态的蛋白。
此外,为了获得高纯度蛋白,利用了镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)和(His)6-标签氨基酸之间的结合特性。具体地,如图1所示,将Ni-NTA柱连接至快速蛋白液相色谱(FPLC)系统,并且将水溶液状态的TB7.7流入该柱中,从而使TB7.7与其结合。由于与Ni-NTA柱结合的蛋白的(His)6-标签与咪唑化合物竞争性结合,以将靶蛋白与柱分离,因此将洗脱缓冲液(20mM Tris,500mM NaCl,0.5mMβ-巯基乙醇,5%甘油,300mM咪唑,pH 8.0)依次流入柱,从而分离出高纯度的TB7.7。
此外,进行另外的纯化以从分离的蛋白中获得更高纯度的蛋白,并将MonoQ柱(其是根据蛋白的pI值进行分离的离子交换柱)连接到FPLC系统,然后使蛋白水溶液流入其中。在与柱结合后,再次分离TB7.7,同时依次流入洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl,1M NaCl,0.5mMβ-巯基乙醇,5%甘油,pH 8.00),从而提高纯度。结果,如图1c所示,可以观察到高纯度的重组TB7.7蛋白。
实施例4.使用SELEX筛选用于TB7.7蛋白的适体
4-1.单链DNA(ssDNA)文库的制备
设计了合成文库[5'-CACCTAATACGACTCACTATAGCGGATCCGA-N40-CTGGCTCGAACAAGCTTGC-3'(SEQ ID NO:3)],其两端具有用于PCR扩增和克隆的引物的结合序列,并且中间具有含40个随机DNA碱基的90个序列。另外,为了PCR扩增和ssDNA产生,使用了正向引物[5'-CAC CTA ATA CGA CTC ACT ATA GCG GA-3'(SEQ ID NO:4)],反向引物[5'-GCA AGC TTG TTC GAG CCA G-3'(SEQ ID NO:5)],以及生物素偶联的反向引物(5'-生物素-GCA AGC TTG TTC GAG CCA G-3')。此处使用的所有寡核苷酸均由Bionics(韩国)合成并进行PAGE纯化。
4-2.将TB7.7固定在Ni-NTA磁珠上
使用Dynalbeads(挪威Invitrogen)将纯化的TB7.7固定在珠上,这些珠是磁珠,其表面覆盖有钴并与蛋白的His标签结合。
具体而言,将1,500皮摩尔蛋白溶解在100μL蛋白结合缓冲液(20mM Tris,50mMNaCl,5mM KCl,5mM MgCl2、0.01%吐温20,pH 8.0)中,使用外部磁体,用结合缓冲液洗涤20μL珠,然后使它们之间在室温下发生反应1小时,从而将蛋白固定在这些珠上。
4-3.选择对TB7.7具有特异性的适体
进行了使用磁性的特定分离方法,以选择对TB7.7具有特异性的适体。
具体而言,首先,为了形成最稳定的ssDNA结构,将溶解于100μL结合缓冲液中的ssDNA文库(100皮摩尔)于90℃孵育3分钟,然后于4℃预孵育30分钟。随后,在将ssDNA文库与固定在磁珠上的TB7.7蛋白轻轻摇动的同时,使它们之间发生反应1小时。然后,将这些珠用结合缓冲液洗涤两次以除去不与结合至这些珠的TB7.7蛋白结合的ssDNA。
之后,为了从磁珠中分离结合蛋白的ssDNA,用洗脱缓冲液(20mM Tris,50mMNaCl,5mM KCl,5mM MgCl2、0.01%吐温20,300mM咪唑,pH 8.0)洗脱蛋白和结合蛋白的ssDNA。使用乙醇沉淀洗脱的ssDNA,然后将其溶于60μL蒸馏水中,之后使用正向引物和生物素偶联的反向引物通过使用i-pfu聚合酶(韩国Intron Biotechnology)的PCR进行扩增。为了产生用于后续选择过程的ssDNA,在偶联缓冲液(5mM Tris-HCl,0.5mM EDTA,1M NaCl,0.0025%吐温20,pH 7.5)存在下,将生物素偶联的PCR产物与涂覆有与生物素结合的链霉亲和素的磁珠一起孵育1小时。孵育后,为了仅分离出ssDNA,将所得产物用100μl的200mMNaOH孵育5分钟,仅获得了使用外部磁体选择的ssDNA。此外,在下一个选择中使用第一个选择的ssDNA重复选择。此时,为了严格选择,进一步降低了ssDNA的量和TB7.7的浓度,并使用UV光谱仪(Biochrom Libra S22光谱仪)测量重复选择中洗脱的ssDNA的浓度,以确认剩余ssDNA和TB7.7之间的结合程度,并进行选择过程。结合度(%)示于图2。
4-4.适体测序
使用未修饰的正向引物和反向引物通过PCR扩增第13次重复选择的ssDNA,并将其克隆到pENTR/TOPO载体(美国Invitrogen的TOPO TA克隆试剂盒)中,然后将大肠杆菌TOP10细胞(美国Invitrogen)用该载体转化。使用Miniprep试剂盒(德国MACHEREY-NAGEL)纯化插入有ssDNA的克隆物,之后测序(韩国COSMO Genetech)。结果,分析了下面表1中所示的TG4适体序列(SEQ ID NO:6)、TG5适体序列(SEQ ID NO:7)和TG6适体序列(SEQ ID NO:8)。
表1
实施例5.使用荧光测量法测量蛋白与适体之间的结合力
将16μg的TB7.7与10μL磁珠混合,然后在100μL的结合缓冲液(20mM Tris,50mMNaCl,5mM KCl,5mM MgCl2,pH 8.0)中孵育1小时。为了分离未结合的TB7.7,用结合缓冲液洗涤两次。随后,将所得混合物与各种浓度的Cy3标记的适体一起孵育1小时,并通过洗涤除去未结合的适体。通过仅分离与TB7.7结合的Cy3标记的ssDNA,通过荧光测量(美国PerkinElmer的1420Victor Multilabel计数器)来测量与固定有TB7.7的磁珠结合的Cy3标记的ssDNA适体的量。结果,如图3a至3c以及下面的表2所示,测量具有TG4、TG5或TG6碱基序列的DNA适体的Kd值。通过这些结果,确认了TG4是最稳定的并且表现出最低的Kd值,因此被用于随后的实验。
表2
适体 | Kd(nM) |
TG4 | 37.5±2.5 |
TG5 | 106.3±68.6 |
TG6 | 34.3±7.7 |
实施例6.检测条件的优化和生物传感器的制造
为了使用实施例4中发现的DNA适体来检测TB7.7,使用电化学阻抗谱(EIS)技术设计了具有优异检测灵敏度的生物传感器。图4是使用本发明的DNA适体检测TB7.7蛋白的生物传感器的示意图。
首先,将金纳米颗粒吸附到金电极上,然后将DNA适体结合到电极上,从而完成了用于检测TB7.7的生物传感器的制造。这样,当金电极施加有金纳米颗粒时,其表面积增加,因此更多的DNA适体可以结合到电极上。随后,当添加含有TB7.7的样本并且使适体和TB7.7彼此结合时,TB7.7蛋白阻断了电子的流动,因此观察到阻抗增加的现象,并且此时,由于阻抗增加和结合的TB7.7蛋白的量之间存在相关性,因此可进行定量分析。
然后,为了在使用DNA适体制造生物传感器之前提高选择性和检测灵敏度,进行了优化几种条件的过程。适体以各种浓度固定在生物传感器上,并且蛋白以相同的量附着在其上。另外,在相同的适体浓度下改变间隔物的浓度的同时测量阻抗值。结果,如图5所示,当适体的浓度为0.5μM并且不使用间隔物时,显示了最佳阻抗值。
根据以上结果,基于优化的条件,使用选定的TG4适体检测到重组TB7.7。结果,如图6a和6b所示,根据奈奎斯特方程式确认,随着TB7.7的浓度增加(10fM至10nM),阻抗值增加(参见图6a)。将根据奈奎斯特方程式获得的阻抗值设为y轴,将TB7.7浓度的Log值设为x轴,从而得到曲线图,确认了使用制造的生物传感器定量地进行了TB7.7检测,并且检测极值为0.64fM(参见图6b)。
实施例7.用于TB7.7检测的适体的结合特异性的确认
为了将DNA适体用作生物传感器,重要的是其与血液中靶TB7.7以外的各种蛋白不发生反应的结合特异性,因此为了确认DNA适体是否与TB7.7选择性结合,检查了其与各种蛋白样本的结合特异性。此时,将每种蛋白以10pM的浓度与PBS混合并用于检测。
结果,如图7所示,确认了DNA适体对TB7.7蛋白具有优异的特异性。特别地,已经确认,尽管已知ESAT6和CFP10在具有结核分枝杆菌的宿主中过表达,并且是结核分枝杆菌特异性蛋白,确认了它不与在本发明中开发的DNA适体结合。这意味着本发明的DNA适体与TB7.7以高结合特异性反应。
此外,为了确认这是否适用于临床样本,在固定有TG4适体的电极上处理正常个体和结核患者的10ng/ml每种血清样本,结果如图8所示,确认了,与正常个体相比,结核患者的阻抗值更高。
以上结果表示,本发明开发的DNA适体不仅对TB7.7具有非常高的结合特异性,还可以作为生物传感器在复杂的生物样本中使用。
作为参考,本发明的序列表显示在下表3中。
表3
仅出于说明目的提供本发明的上述描述,并且本发明所属领域的普通技术人员将理解,在不改变本发明的技术精神或基本特征的情况下,可以容易地将本发明修改为其他特定形式。因此,上述实施方案的提供应被解释为仅出于说明的目的,而不是出于限制的目的。
工业适用性
本发明的DNA适体靶向在结核分枝杆菌中表达的TB7.7,并且对该靶表现出高亲和力,而对除该靶之外的物质表现出低结合能力,因此,当用于诊断结核时,排除了假阴性反应和假阳性反应,从而获得更准确的诊断结果。因此,本发明的DNA适体、用于使用该DNA适体来诊断结核的组合物、用于诊断结核的生物传感器、诊断结核的方法等能够在诊断结核中提供高可靠性结果,因此,有望替代使用现有抗体的ELISA方法和使用现有适体的诊断结核的方法而广泛用于诊断结核。
<110> MD奥图斯公司
<120> 特异性结合TB7.7(7.7 kDa结核特异性抗原)的DNA适体及其用途
<130> MPCT18-055
<150> KR 1020170123385
<151> 2017-09-25
<160> 8
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TB7.7正向引物
<400> 1
cccggatcca tgagcggcca cgcgttg 27
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TB7.7反向引物
<400> 2
cccccctcga gtcacggcgg atcacccc 28
<210> 3
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ssDNA文库
<400> 3
cacctaatac gactcactat agcggatccg anctggctcg aacaagcttg c 51
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 4
cacctaatac gactcactat agcgga 26
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 5
gcaagcttgt tcgagccag 19
<210> 6
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TG4适体
<400> 6
cacctaatac gactcactat agcggatccg aaagttgtta gtagacttag gggagggtta 60
aagtggggtg gctggctcga acaagcttgc 90
<210> 7
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TG5适体
<400> 7
cacctaatac gactcactat agcggatcag aatttctgta attaagcgat aaattgctta 60
ataggcactc tctggctcga acaagcttgc 90
<210> 8
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TG6适体
<400> 8
cacctaatac gactcactat agcggatccg acacgaagga tactcagtag tacccaggtt 60
ggtagggtag cctggctcga acaagcttgc 90
Claims (10)
1.一种与7.7kDa结核特异性抗原(TB7.7)特异性结合的DNA适体,其中所述DNA适体由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的核苷酸序列组成。
2.根据权利要求1所述的DNA适体,其中所述TB7.7在结核分枝杆菌H37Rv中表达。
3.一种用于诊断结核的组合物,所述组合物包括根据权利要求1所述的DNA适体。
4.一种用于诊断结核的生物传感器,所述生物传感器包括:对7.7kDa结核特异性抗原(TB7.7)具有特异性的DNA适体;以及其上固定有所述DNA适体的板,其中所述DNA适体由SEQID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的核苷酸序列组成。
5.根据权利要求4所述的生物传感器,其中所述板由金属电极层和金属纳米颗粒层组成。
6.根据权利要求5所述的生物传感器,其中所述金属包括金(Au)。
7.一种提供用于诊断结核的信息的方法,所述方法包括:
(1)用根据权利要求4所述的生物传感器处理受试者样本;以及
(2)测量与所述生物传感器结合的7.7kDa结核特异性抗原(TB7.7)的水平。
8.一种诊断结核的方法,所述方法包括使根据权利要求1或2所述的DNA适体与受试者样本接触。
9.一种诊断结核的方法,所述方法包括:用根据权利要求4所述的生物传感器处理受试者样本;以及测量与所述生物传感器结合的7.7kDa结核特异性抗原(TB7.7)的水平。
10.DNA适体用于诊断结核的用途,所述DNA适体与7.7kDa结核特异性抗原(TB7.7)特异性结合并由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的核苷酸序列组成。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR10-2017-0123385 | 2017-09-25 | ||
KR1020170123385A KR101923198B1 (ko) | 2017-09-25 | 2017-09-25 | Tb7.7에 특이적으로 결합하는 dna 압타머 및 이의 용도 |
PCT/KR2018/011067 WO2019059645A1 (ko) | 2017-09-25 | 2018-09-19 | Tb7.7에 특이적으로 결합하는 dna 압타머 및 이의 용도 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN111212911A true CN111212911A (zh) | 2020-05-29 |
CN111212911B CN111212911B (zh) | 2023-09-22 |
Family
ID=64561567
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201880062228.XA Active CN111212911B (zh) | 2017-09-25 | 2018-09-19 | 与tb7.7特异性结合的dna适体及其用途 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11634717B2 (zh) |
KR (1) | KR101923198B1 (zh) |
CN (1) | CN111212911B (zh) |
WO (1) | WO2019059645A1 (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113195722A (zh) * | 2018-12-19 | 2021-07-30 | Md保健株式会社 | 与基孔肯雅热病毒e2特异性结合的dna适体及其用途 |
CN113227378A (zh) * | 2018-12-19 | 2021-08-06 | Md保健株式会社 | 与登革病毒ediii特异性结合的dna适配体及其用途 |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111218449A (zh) * | 2020-01-17 | 2020-06-02 | 上海孚清生物科技有限公司 | 一种结核分枝杆菌核酸适配子及其制备方法 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011014989A1 (zh) * | 2009-08-05 | 2011-02-10 | 中国人民解放军第三O九医院 | 靶向结核分枝杆菌Ag85B的寡核苷酸适配子及其制备方法和应用 |
CN103122033A (zh) * | 2011-11-21 | 2013-05-29 | 厦门大学 | 一种嵌合重组抗原及其用途 |
US20140342936A1 (en) * | 2011-12-15 | 2014-11-20 | Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) | Methods and kits for diagnosing latent tuberculosis infection |
CN105829891A (zh) * | 2013-12-16 | 2016-08-03 | 国立血清研究所 | 用于改进的体内或体外细胞介导的结核病免疫诊断的诊断试剂 |
CN105944094A (zh) * | 2016-06-14 | 2016-09-21 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种基于菊粉-壳聚糖修饰的结核分枝杆菌亚单位疫苗及其制备方法 |
CN106405113A (zh) * | 2016-09-13 | 2017-02-15 | 深圳市达科为生物工程有限公司 | 一种用于检测潜在结核的特异性标志物及其应用 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB2489504A (en) * | 2011-03-31 | 2012-10-03 | Sapient Sensors | A device for identifying the presence of a specific target molecule or biomarker by sensing an electrical property |
KR101698654B1 (ko) | 2014-12-24 | 2017-01-20 | 포항공과대학교 산학협력단 | En2에 특이적으로 결합하는 dna 압타머 및 이의 용도 |
-
2017
- 2017-09-25 KR KR1020170123385A patent/KR101923198B1/ko active IP Right Grant
-
2018
- 2018-09-19 WO PCT/KR2018/011067 patent/WO2019059645A1/ko active Application Filing
- 2018-09-19 US US16/649,856 patent/US11634717B2/en active Active
- 2018-09-19 CN CN201880062228.XA patent/CN111212911B/zh active Active
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011014989A1 (zh) * | 2009-08-05 | 2011-02-10 | 中国人民解放军第三O九医院 | 靶向结核分枝杆菌Ag85B的寡核苷酸适配子及其制备方法和应用 |
CN103122033A (zh) * | 2011-11-21 | 2013-05-29 | 厦门大学 | 一种嵌合重组抗原及其用途 |
US20140342936A1 (en) * | 2011-12-15 | 2014-11-20 | Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) | Methods and kits for diagnosing latent tuberculosis infection |
CN105829891A (zh) * | 2013-12-16 | 2016-08-03 | 国立血清研究所 | 用于改进的体内或体外细胞介导的结核病免疫诊断的诊断试剂 |
CN105944094A (zh) * | 2016-06-14 | 2016-09-21 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种基于菊粉-壳聚糖修饰的结核分枝杆菌亚单位疫苗及其制备方法 |
CN106405113A (zh) * | 2016-09-13 | 2017-02-15 | 深圳市达科为生物工程有限公司 | 一种用于检测潜在结核的特异性标志物及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
PARK HC等: "Development of detection system using ssDNA aptamer to Tuberculosis Antigens CFP10 and TB7.7(Rv2654c)", 《APPLIED BIOCHEMISTRY AND BIOTECHNOLOGY》 * |
ROTHERHAM LS等: "Selection and application of ssDNA aptamers to detect active TB from sputum samples", 《PLOS ONE》 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113195722A (zh) * | 2018-12-19 | 2021-07-30 | Md保健株式会社 | 与基孔肯雅热病毒e2特异性结合的dna适体及其用途 |
CN113227378A (zh) * | 2018-12-19 | 2021-08-06 | Md保健株式会社 | 与登革病毒ediii特异性结合的dna适配体及其用途 |
CN113195722B (zh) * | 2018-12-19 | 2023-11-24 | Md保健株式会社 | 与基孔肯雅热病毒e2特异性结合的dna适体及其用途 |
CN113227378B (zh) * | 2018-12-19 | 2023-11-24 | Md保健株式会社 | 与登革病毒ediii特异性结合的dna适配体及其用途 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR101923198B1 (ko) | 2018-11-28 |
WO2019059645A1 (ko) | 2019-03-28 |
US20200407722A1 (en) | 2020-12-31 |
CN111212911B (zh) | 2023-09-22 |
US11634717B2 (en) | 2023-04-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Sypabekova et al. | Selection, characterization, and application of DNA aptamers for detection of Mycobacterium tuberculosis secreted protein MPT64 | |
JP5524990B2 (ja) | pLDHに特異的に結合するDNAアプタマー、マラリア診断用組成物およびマラリア診断キット | |
CN111212911B (zh) | 与tb7.7特异性结合的dna适体及其用途 | |
US9000137B2 (en) | Nucleic acid aptamers against plasmodium lactate dehydrogenase and histidine-rich protein II and uses thereof for malaria diagnosis | |
US11619633B2 (en) | DNA aptamer specifically binding to ESAT6, and use thereof | |
CN113195722B (zh) | 与基孔肯雅热病毒e2特异性结合的dna适体及其用途 | |
Mukama et al. | An update on aptamer-based multiplex system approaches for the detection of common foodborne pathogens | |
CN113227377B (zh) | 与黄热病病毒ediii特异性结合的dna适体及其用途 | |
US11008604B2 (en) | Analyte detection on a solid support by nucleic acid amplification coupled to an immunoassay | |
CN113227378B (zh) | 与登革病毒ediii特异性结合的dna适配体及其用途 | |
US20170137895A1 (en) | Methods of identifying enzymes and microorganisms | |
US11028396B2 (en) | DNA aptamer specifically binding to CFP10, and use thereof | |
KR102403628B1 (ko) | 시료의 표적분자 집단에 대한 프로파일을 얻는 방법 | |
US20140256581A1 (en) | Viral nanoarrys and sensors comprising the same | |
WO2014166558A1 (en) | Dna aptamers to diagnose mycobacterium tuberculosis bacteria and treat tuberculosis disease, specific for m. tuberculosis bacteria | |
KR102063292B1 (ko) | α-시누클레인 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도 | |
KR102063291B1 (ko) | 베타 세크리타제 단백질에 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 및 이의 용도 | |
JP2009055812A (ja) | 試料からの抗酸菌の分離回収方法 | |
KR20220077546A (ko) | 시료의 표적분자 집단에 대한 프로파일을 얻는 방법 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |