WO2011014989A1 - 靶向结核分枝杆菌Ag85B的寡核苷酸适配子及其制备方法和应用 - Google Patents

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ag85b
mycobacterium tuberculosis
wash
aptamer
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吴雪琼
王博
阳幼荣
张俊仙
梁艳
傅瑜
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中国人民解放军第三O九医院
北京市结核病胸部肿瘤研究所
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    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/205—Aptamer

Definitions

  • the invention relates to a targeted M. tuberculosis Ag85B oligonucleotide aptamer and a preparation method and application thereof, and belongs to the technical field of tuberculosis medical immunology and detection.
  • tuberculosis epidemic and drug resistance in our country are quite serious, and the number of tuberculosis patients ranks second in the world, second only to India.
  • the number of deaths per year is about 130,000, ranking first among infectious diseases.
  • the sensitivity of clinical specimen smears is low, and the positive rate is only 20-30%; the traditional Roche culture positive rate is low, only about 30%, and it takes 4-8 weeks.
  • the serological diagnosis of tuberculosis is mainly the detection of tuberculosis antibodies and antigens.
  • tuberculosis and disease progression and the detection of tuberculosis antigens
  • the antigen binds to the corresponding antibody in vivo to form a circulating immune complex Compound (CIC), which limits the sensitivity of antigen detection in serum.
  • CIC circulating immune complex Compound
  • SELEX systemat ic evolution of l igands by exponential enrichment
  • the phylogenetic technique of exponentially enriched ligands is a new combinatorial chemistry technique established by Tuerk and Gold in 1990 to study the combination of small molecule nucleic acids and target substances.
  • the basic principle is to chemically synthesize a single-stranded oligonucleotide library (RNA or ssDNA library) in vitro with a fixed sequence at both ends and a random sequence of 20 to 40 oligonucleotides in the middle.
  • the large-capacity random oligonucleotide library interacts with the target molecule, and the oligonucleotide which specifically binds to the target molecule is isolated, and combined with the in vitro amplification technique to obtain exponential enrichment, so after multiple rounds of screening, Finally, an oligonucleotide with high affinity and specificity to the target substance is obtained, which is called an "aptamer”.
  • aptamer molecule in addition to GC, AU base pairing, and the existence of GU and other even base pairs, hairpin, pseudoknot, bulge, G-four
  • a variety of spatial structures, such as G- quartet, can form a relatively stable rigid structure that interacts with target molecules by hydrogen bonding, van der Waals forces, or the like, or is chimeric or coated to form a stable complex.
  • SELEX technology has the advantages of large library capacity, wide target molecules, high affinity, and high specificity. In theory, almost any target molecule can use SELEX technology to select the matching oligonucleotide aptamer, such as metal.
  • oligonucleotide aptamers can be screened by SELEX technology.
  • the oligonucleotide aptamer has a very high affinity and specificity with the target molecule, and the binding dissociation constant (Kd) can reach nM, even pM level, and has a smaller molecular weight and can penetrate into the cell faster than the antibody. It can be used in clinical diagnosis, disease treatment and basic research. It can be cleared more quickly in the blood, can be stably synthesized, and is easy to be modified.
  • tuberculosis infection or tuberculosis can produce related proteins and appear in the blood circulation by: (1) Mycobacterium tuberculosis produces secreted proteins in the environment of the disease; (2) Tuberculosis of the tuberculosis is caused by the body's immunity Solvent production of bacterial proteins; (3) bacteria stimulate the body to produce related reactive proteins (including antibodies); (4) under the action of bacteria, the body cells collapse to explain the release of tissue proteins, tissue leakage proteins.
  • tuberculosis antigen can be used as direct evidence for the presence of M. tuberculosis, which can avoid the "false negative" of humoral immunity test or cellular immunoassay caused by low immune response level in tuberculosis patients. Therefore, tuberculosis-related proteins can be found in the serum of tuberculosis patients as a diagnostic marker.
  • SELEX technology has been used to discover the binding site of cAMP receptor protein (CRP Mt ) to genomic DNA and its role in gene expression regulation. SELEX technology has also been used to screen for tuberculosis inhibition.
  • CRP Mt cAMP receptor protein
  • oligonucleotide aptamers may be more suitable for the differential diagnosis of structural analogs or cross-antigens that are indistinguishable from monoclonal antibodies.
  • Ag85B protein is a secreted protein of Mycobacterium tuberculosis and has good antigenicity. Whether it is Ag85B antigen or its antibody, the level of blood circulation in tuberculosis patients is significantly higher than that in healthy control group (including BCG vaccine), active tuberculosis. The level of Ag85B protein in the patient's serum was 50 to 150 times higher than that of other mycobacterial disease patients and healthy controls. Detection of Ag85B antigen levels can distinguish between active tuberculosis and BCG vaccination or previous infection, as well as distinguishing between tuberculosis and non-tuberculous mycobacterial disease. Therefore, by screening and obtaining an oligonucleotide aptamer targeting M.
  • tuberculosis Ag85B protein the detection of M. tuberculosis Ag85B antigen level in human serum can improve the sensitivity and specificity of tuberculosis antigen detection, thereby improving The accuracy of the diagnosis of tuberculosis.
  • One of the objects of the present invention is to provide an oligonucleotide aptamer targeting Mycobacterium tuberculosis Ag85B in order to overcome the deficiencies of the prior art.
  • An oligonucleotide aptamer targeting Mycobacterium tuberculosis Ag85B characterized in that the nucleotide sequence of the oligonucleotide aptamer is shown in the following table (see sequence 1-13 in the sequence listing) ).
  • CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA AP-6 GCAATGGTACGGTACTTCCTTTTCTGTCTAGTTGTATTTACTCTTGGTATTATG CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing an oligonucleotide aptamer targeting the above M. tuberculosis Ag85B.
  • a method for preparing an oligonucleotide aptamer targeting Mycobacterium tuberculosis Ag85B the steps of which are as follows:
  • a further object of the present invention is to provide an oligonucleotide aptamer targeting the above M. tuberculosis Ag85B for use in the preparation of a M. tuberculosis detection reagent.
  • BSA blocking PBST-1% BSA 200 ⁇ 1 per well, incubate for 1 hour at 37 °C, and wash the plate 3 times with PBST for 3 minutes each time;
  • a method for preparing an oligonucleotide aptamer targeting Mycobacterium tuberculosis Ag85B the steps of which are as follows:
  • ssDNA random single-stranded DNA
  • primers Construction of random single-stranded DNA (ssDNA) library and primers: Random single-stranded DNA (ssDNA) library: 5'-GCAATGGTACGGTACTTCC (N35) CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3 ' ; Upstream primer: 5'-GCAATGGTACGGTACTTCC-3'; downstream primer: prime-labeled upstream primer: 5'-biotin-GCAATGGTACGGTACTTCC-3'; the random single-stranded DNA (ssDNA) library and primers were synthesized by a primer company;
  • the ssDNA library was amplified into a dsDNA library, stored, and the next round of screened ssDNA library was amplified using the dsDNA library as a template:
  • the reaction procedure is set to: 95 ° C, lmin, 94 ° C, 30 sec, 37 ° C, lmin, 58
  • the fourth round of amplification conditions Take 10 ⁇ ⁇ of the previous round of screening product as a template, upstream primer 37. 5 pmol, downstream primer 37. 5 pmol, 0.2 mmol of IL dNTP, 10 times DNA polymerase reaction buffer and DNA polymerase 2
  • One active unit add double distilled water to make the total volume 100 ⁇ ; then put into the PCR instrument, the reaction procedure is: 95 °C lmin, 94 °C 30 sec, 37 °C 30 sec, 60 °C 40 sec 3 cycles of amplification; 3 cycles of amplification products were used as templates, biotinylated upstream primers 37. 5 pmol, downstream primers 37.
  • 5th to 8th round of amplification conditions Take ⁇ ⁇ ⁇ Previous round of screening product as template, upstream primer 37. 5pmol, downstream primer 37. 5pmol, 0. 2mmol IL dNTP, 10 times DNA polymerase reaction buffer and DNA polymerization Enzyme 2 active units, add double distilled water to make the total volume 100 ⁇ 1 ; then put into the PCR instrument, the reaction procedure is: 95 ° C lmin, 94 ° C 30 sec, 55 ° C 30 sec, 60 ° C 40sec, amplification for 3 cycles; taking 3 cycles of amplification product as template, biotinylated upstream primer 37. 5pmol, downstream primer 37. 5pmol, 0.
  • the reaction procedure is: 95 ° C lmin, 94 ° C 30 sec, 55 ° C 30 sec 60 °C 40sec, the fifth round of amplification 24 cycles, the sixth round of amplification 30 cycles, the seventh round of amplification 27 cycles, the eighth round of amplification 24 cycles, the last 60 ° C extension 2 min;
  • PCR amplification product purification and recovery The PCR amplification product of each round in step (2) is electrophoresed with 7M urea 8% denaturing PAGE, and then stained with 0.5 W g/ml ethidium bromide solution. Put it on the shop The squirting tube is smashed into a 1.5 ml centrifuge tube; the PCR product is cut into a 1.5 ml centrifuge tube; Add 3 volumes of gel elution buffer (0.5 M NH4Ac, 0.2% SDS, ImM EDTA, pH 8.
  • the Ag85B protein was diluted to 112 pmol/well with a coating buffer, added to the plate, sealed at 4 ° C overnight, and washed three times with PBST for 3 minutes each time;
  • B. BSA blocking PBST-1% BSA 200 ⁇ 1 per well, incubate for 1 hour at 37 °C, and wash the plate 3 times with PBST for 3 minutes each time;
  • the PCR amplification products selected from the first round to the eighth round are extracted with phenol and chloroform, and purified by ethanol precipitation to determine the DNA content;
  • the absorbance 0D values of the aptamers screened from the first round to the eighth round are as follows: 0, 0, 0. 347, 0. 440, 2. 964, 3. 175, 3. 178, 3. 23, indicating The eighth round of aptamer library has the highest affinity with Mycobacterium tuberculosis Ag85B;
  • the ssDNA obtained by the eighth round of screening was amplified by PCR with the upstream primer and the downstream primer into dsDNA, and the PAGE gel was used to purify the recovered product for DNA cloning and sequencing.
  • the cloned transformant was identified as positive by PCR, and 100 clones were picked and cultured. , preservation, randomly picking 57 clones of single growth colonies for DNA sequencing; the obtained random region sequences are as follows:
  • A. Synthesis of Ag85B aptamer Considering the homology information and secondary structure of each sequence, ⁇ 1, No. 37, No. 47, No. 48, No. 49, No. 50, The DNA sequences of the aptamer clones No. 51, No. 52, No. 53, No. 54, No. 55, No. 56, No. 57 were named as: AP-1, AP-2, AP-3, AP- 4, AP-5, AP-6, AP-7, AP-8, AP-9, AP-10, AP-11, AP-12, AP- 13, synthesize these 13 aptamers according to conventional methods. ;
  • GCAATGGTACGGTACTTCC CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA
  • Ap-1 aptamer dissociation constant Kd value The ELONA method was used to detect the absorbance of different concentrations of AP-1 and Ag85B protein 0M92, and then the offset dissociation constant Kd of AP_1 and Ag85B protein was calculated by Origin Pro 7.5 software. The value was 119.57 ⁇ 52. 95 nM.
  • the screening conditions of the rounds are as follows:
  • the lng/ml rabbit anti-tuberculosis mycobacterium Ag85B polyclonal antibody IgG was used as a capture antibody-coated microplate, and placed at 4 ° C overnight; the next day, the plate was washed 3 times with PBST for 3 minutes each time;
  • BSA blocking PBST- 1% BSA 200 ⁇ 1 per well, incubate for 1 hour at 37 °C, wash the plate 3 times with PBST for 3 minutes each time;
  • the reaction was terminated with 2 mol/L concentrated sulfuric acid, and the absorbance at a wavelength of 492 nm was measured by a microplate reader;
  • tuberculosis MPT64 protein was detected by AP-1 aptamer EL0NA method, and its 0M92nm was 0, indicating the application of AP-1 aptamer EL0NA method.
  • Mycobacterium tuberculosis Ag85B has high specificity;
  • E. Detection of Mycobacterium tuberculosis Ag85B in body fluid samples using the AP-1 aptamer EL0NA method a. Using AP-1 aptamer ELONA method to detect 100 cases of healthy people (including 41 cases of PPD skin test negative and 59 cases of PPD skin test positive), 59 cases of non-tuberculosis respiratory disease and 83 cases of tuberculosis patients with serum tuberculosis 034 ⁇ 0. 17, 0. 250 ⁇ 0. 41. The bacterium has a 0D 492nm of 0. 034 ⁇ 0. 14, 0. 056 ⁇ 0. 17, 0. 250 ⁇ 0. 41.
  • the AP-1 aptamer EL0NA method was used to detect the Mycobacterium tuberculosis Ag85B in the serum of tuberculosis patients.
  • the sensitivity is 30. 1%, wherein the sensitivity of the sputum patient is 12%, and the sensitivity of the serotonin test is 57.6%, the specificity is 98.1%, the positive predictive value is 89.3%, the negative predictive value 72. 9%, the total accuracy rate was 74.8%.
  • A1 blank control
  • B1—H1 100, 80, 60, 50, 20, 10, 1 ng/ml of Mycobacterium tuberculosis Ag85B protein
  • A2—H2 No. 1-8 serum of tuberculosis patients
  • A3 — H3 No. 1-8 Serum of patients with non-tuberculous respiratory diseases
  • A5 -H5 No. 1-8 Serum of healthy humans with positive skin test .
  • the AP-1 aptamer EL0NA method was used to detect M. tuberculosis Ag85B in cerebrospinal fluid of 4 patients with non-tuberculous meningitis and 28 patients with tuberculous meningitis. The results are shown in Figure 5.
  • the AP-1 aptamer EL0NA was applied. The method detects the results of Mycobacterium tuberculosis Ag85B in human cerebrospinal fluid.
  • Al, A2 blank control; Bl, B2: positive control; Cl, C2: negative control; A3, A4, B3, B4, C3, C4, D3, D4: knot Nuclear cerebrospinal fluid; A5, A6, B5, B6, C5, C6, D5, D6: Non-tuberculous cerebrospinal fluid.
  • Figure 6 is the application of AP-1 aptamer EL0NA method to detect human ascites Results of Mycobacterium tuberculosis Ag85B.
  • the present invention screens and obtains oligonucleotide aptamers AP-1, AP-2, AP-3, AP-4, AP-5, AP-6, AP-7, which target the M. tuberculosis Ag85B protein, AP-8, AP-9, AP-10, AP-11, AP-12, AP-13, used to detect the level of Mycobacterium tuberculosis Ag85B in human serum, can replace antibodies, improve body fluid specimens (including serum, pleural effusion) , cerebrospinal fluid, ascites, etc.) The sensitivity and specificity of tuberculosis antigen detection, thereby improving the accuracy of tuberculosis diagnosis.
  • the invention establishes a method for preparing a high affinity DNA aptamer targeting a specific antigen of Mycobacterium tuberculosis, and can prepare an aptamer of a plurality of target molecules for diagnosis and treatment of tuberculosis.
  • the established AP-1 aptamer EL0NA method can semi-quantitatively detect antigen levels in body fluid samples (including serum, pleural effusion, cerebrospinal fluid, ascites, etc.) of tuberculosis patients, and can be used for rapid diagnosis of tuberculosis in only half a day.
  • body fluid samples including serum, pleural effusion, cerebrospinal fluid, ascites, etc.
  • the inventors have shown that the sensitivity of detecting sera of tuberculosis patients using the AP-1 aptamer EL0NA method is 30.1%, wherein the sensitivity of the sputum patient is 12%, and the sensitivity of the sputum patient detection is 57.6%, specific The prevalence was 98.1%, the positive predictive value was 89.3%, the negative predictive value was 72.9%, and the total accuracy was 74.8%. There were no false positives in tuberculosis patients and BCG vaccinates who were positive for PPD skin test.
  • the Mycobacterium tuberculosis antigen was also detected from tuberculous pleural effusion, cerebrospinal fluid, and ascites using the AP-1 aptamer EL0NA method, with positive rates of 18.2%, 3.6%, and 33.3%, respectively.
  • an oligonucleotide aptamer targeting Mycobacterium tuberculosis Ag85B can be prepared synthetically or by PCR amplification at a relatively low cost.

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Description

靶向结核分枝杆菌 Ag85B的寡核苷酸适配子及其制备方法和应用 技术领域
本发明涉及靶向结核分枝杆菌 Ag85B寡核苷酸适配子及其制备方法和应用， 属于结核病医学免疫学和检测技术领域。
背景技术
我国的结核病疫情和耐药情况都相当严重， 结核病人数位居世界第二， 仅次 于印度。 现有肺结核病人 451万， 其中传染性肺结核病人 196万， 每年新增结核 病例 140万， 每年死亡人数约 13万， 在传染病中居第一位。 目前临床上常规应 用的诊断方法中， 临床标本涂片检测的灵敏度低， 阳性率只有 20-30%; 传统的罗 氏培养阳性率低， 只有 30 %左右， 而且需 4-8周时间。 结核病血清学诊断主要是 结核抗体和抗原的检测， 抗结核抗体检测只是一种辅助诊断手段； 尽管应用免疫 学技术检测结核病抗原已有 20 多年的历史， 在检测技术和研究思路都有较大的 进展， 但体液标本中结核抗原的检测灵敏度仍较低， 主要存在以下问题： ①缺乏 高效价的特异性抗体， 目前国外虽在近几年已有应用特异性结核抗原免疫动物， 并纯化出高效抗体的研究报道， 但基本上均属小样本量研究， 缺少大标本量的临 床评估； ②对于结核分枝杆菌抗原特性及与疾病的进展的关系缺乏全面、 深入的 了解， 使结核抗原检测中靶特异性抗原选择存在一定的局限性； ③血清中结核分 枝杆菌抗原量较低， 一方面是由结核分枝杆菌进入结核病患者体内的特异性结核 循环抗原量较低， 另一方面是结核抗原与相应的抗体在体内结合形成循环免疫复 合物 (CIC) , 使血清中抗原检测的敏感性受到限制。 目前全国 451 万活动性肺结 核病人中， 菌阳肺结核病人检出率低， 菌阴肺结核病人占 55. 6%, 漏诊率高， 延 误诊断。 此外， 肺外结核、 小儿结核诊断也十分困难。 因此， 从不同的体液标本 中检测结核病特异的抗原， 建立快速、 敏感、 高效的结核病诊断、 鉴别诊断方法 对于结核病疫情的控制具有极其重要的意义。
SELEX (systemat ic evolution of l igands by exponential enrichment) 技 术即指数级富集配体的系统进化技术， 是 1990年 Tuerk 和 Gold 建立的一种新 型组合化学技术， 是研究小分子核酸与靶物质相结合的部位、 序列及空间构象与 功能的有效方法。 其基本原理是体外化学合成一个单链寡核苷酸文库 （RNA 或 ssDNA 文库）， 其两端为固定序列， 中间含 20〜40个寡核苷酸的随机序列， 利用 大容量的随机寡核苷酸库与靶分子相互作用， 从中分离到与靶分子特异结合的寡 核苷酸， 并结合体外扩增技术， 使其得到指数级富集， 如此经过多轮筛选， 最终 得到与靶物质亲和力高、 特异性强的寡核苷酸， 称之为 "适配子 (aptamer) " 。 适配子分子中除 G-C、 A-U碱基配对外， 还有 G-U等变偶碱基对的存在， 可以形 成发夹 ( hairpin), 假结 (pseudoknot ), 凸环 (bulge ), G-四分体（G- quartet ) 等多种空间结构， 可形成具有相当稳定的刚性结构， 它们通过氢键、 范德华力等 与靶分子相互作用， 或嵌合或包被， 形成稳定的复合物。 SELEX技术具有库容量 大、 靶分子广泛、 亲和力高、 特异性强等优点， 理论上来说几乎任何一个靶分子 都可以利用 SELEX技术筛选出与之相匹配的寡核苷酸适配子， 如金属离子、 有机 染料、 氨基酸、 细胞因子、 辅因子、 氨基糖苷、 抗生素、 碱基类似物、 核苷酸和 多肽等， 其中蛋白类靶分子最多， 完整的病毒颗粒和细菌病原体， 甚至完整的细 胞也可以通过 SELEX技术筛选出高亲和力的寡核苷酸适配子。 寡核苷酸适配子与 靶分子具有极高的亲和力和特异性， 结合的解离常数 （Kd) 可以达 nM， 甚至 pM 水平， 与抗体相比， 具有分子量小、 能更快地渗入细胞、 更迅速在血液中清除、 能够稳定合成、 便于修饰等特点， 可应用于临床诊断、 疾病治疗和基础研究等方 面。
结核分枝杆菌侵入人体后的致病机制及其引起的病理学改变均以蛋白质表 达及蛋白质间的相互作用为基础， 宿主主要通过免疫反应及炎症反应完成其对病 原体的防御。 因此， 结核菌感染或结核病可通过以下途径产生相关蛋白质并出现 在血液循环中： （1 ) 结核分枝杆菌在病灶环境中产生分泌蛋白； （2 ) 在机体免疫 力作用下结核菌菌体崩解产生菌体蛋白； （3 ) 细菌刺激机体产生相关的反应性蛋 白 （包括抗体）； (4) 在细菌作用下机体细胞崩解释放组织蛋白、 组织漏出蛋白。 结核抗原的检测可以作为结核分枝杆菌存在的直接证据， 可以避免结核病患者由 于免疫应答水平低下导致的体液免疫检测或细胞免疫检测的 "假阴性" 。 因此， 在结核病患者血清中可发现结核病相关蛋白作为诊疗标志物。 目前在结核适配子 研究方面， 可见利用 SELEX技术发现 cAMP受体蛋白 （CRPMt) 与基因组 DNA结合 位点及其在基因表达调控中的作用的报道； 也已应用 SELEX技术筛选出能抑制结 核分枝杆菌感染的结核分枝杆菌 H37Rv DNA 适配子 （专利申请号 200610019671. 8 ) , 及其分泌性抗原 CFP10、 ESAT- 6和 MPT64的适配子。 而应用 寡核苷酸适配子检测抗原是一种新型的检测技术， 单独或与抗体组合应用于多种 诊断模式已显示出其独特的优越性， 特别是可以弥补抗体在诊断领域中应用的不 足， 寡核苷酸适配子可能更适合用于单克隆抗体难以区分的结构类似物或交叉抗 原的鉴别诊断。 但是迄今为止尚未见国内外关于结核分枝杆菌分泌性抗原 Ag85B 适配子及应用寡核苷酸适配子检测结核抗原的报道。
Ag85B蛋白是结核分枝杆菌分泌蛋白质，具有良好的抗原性，无论是 Ag85B 抗 原还是其抗体， 它们在结核患者血循环中的水平都要明显高于健康对照组 （包括 卡介苗接种者）， 活动性结核患者血清中的 Ag85B 蛋白水平比其它分枝杆菌疾病 患者和健康对照组高 50〜150 倍。检测 Ag85B抗原水平可以区别活动期的结核病 与卡介苗的免疫接种或是既往感染， 也可将结核病与非结核分枝杆菌病区别开 来。 因此， 通过筛选并获得靶向结核分枝杆菌 Ag85B蛋白的寡核苷酸适配子， 应 用于检测人血清中结核分枝杆菌 Ag85B抗原水平， 可提高结核抗原检测的灵敏度 和特异性， 从而提高结核病诊断的准确率。
发明内容
本发明的目的之一是为了克服已有技术的不足， 提供靶向结核分枝杆菌 Ag85B的寡核苷酸适配子。
本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：
一种靶向结核分枝杆菌 Ag85B的寡核苷酸适配子， 其特征在于： 所述寡核苷 酸适配子的核苷酸序列如下表所示 （见序列表中的序列 1-13)。
寡核苷 适配子的核苷酸序列
酸适配
子名称
AP-1 GCAATGGTACGGTACTTCCAACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT
CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA
AP-2 GCAATGGTACGGTACTTCCAACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCG
CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA
AP-3 GCAATGGTACGGTACTTCCAACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCC
CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA
AP-4 GCAATGGTACGGTACTTCCTTTTTTTTTGTGTTGTCGTGATATTGTAACCTGT
CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA
AP-5 GCAATGGTACGGTACTTCCTTAACTTTTTTTGATGTTTATGTCGGTTTGCTATG
CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA AP-6 GCAATGGTACGGTACTTCCTTTTCTGTCTAGTTGTATTTACTCTTGGTATTATG CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA
AP-7 GCAATGGTACGGTACTTCCTTTTGGAAATTCTTTTTGTACTAGAATAATACCAC
CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA
AP-8 GCAATGGTACGGTACTTCCTTTTTATATCAGTCTTAATATTGTGTTCTGTTGAC
CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA
AP-9 GCAATGGTACGGTACTTCCTTTTTCCTGTAATATTCGTCTTTTGATGTTGTCTA
CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA
AP-10 GCAATGGTACGGTACTTCCTATCTTCATCGGCAGGATGCCTATGCGCAGGTTTG
CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA
AP-11 GCAATGGTACGGTACTTCCATTGGCGTTTGTTAGGACTGATGTTCGAGAAACCG
CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA
AP-12 GCAATGGTACGGTACTTCCGGTTATTCTGTATTGTTGAATTGTTCTAGTGGTTT
CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA
AP-13 GCAATGGTACGGTACTTCCGTTATTCAATTAAGTCGGGTTTATTGTGTGCGTTG
CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA
本发明的另一目的是提供一种上述靶向结核分枝杆菌 Ag85B的寡核苷酸适配 子的制备方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：
一种靶向结核分枝杆菌 Ag85B的寡核苷酸适配子的制备方法， 其步骤如下：
( 1 ) 随机单链 DNA ( ssDNA) 文库的构建和引物；
( 2 ) PCR扩增制备随机 ssDNA 文库；
( 3 ) SELEX筛选；
(4 ) 亲和力测定：
( 5 ) DNA克隆和测序；
(6 ) 适配子的合成和鉴定。
本发明的再一目的是提供上述靶向结核分枝杆菌 Ag85B的寡核苷酸适配子在 制备结核分枝杆菌检测试剂方面的应用。
一种优选技术方案， 其特征在于： 所述应用包括下列步骤：
( 1 ) 以 lng/ml兔抗结核分枝杆菌 Ag85B多克隆抗体 IgG为捕获抗体包被微孔 板， 置 4°C过夜； 次日用 PBST洗板 3次， 每次 3分钟；
(2) BSA封闭： 每孔加 PBST-1% BSA 200μ1, 至 37°C孵育 1小时， 用 PBST洗板 3次， 每次 3分钟；
(3) 加入未稀释的待测体液标本， 37°C孵育 40 min-lh; 用 SELEX洗涤液 洗涤 3— 5次；
(4) 加入 L25wg 5， 端生物素化的报告适配子， 37°C孵育 40 min—lh; 用 SELEX洗涤液洗涤 3— 5次；
(5) 加入 200μ1 1:1000稀释的链霉亲和素标记辣根过氧化物酶 37°C孵育 30 min; 用 SELEX洗涤液洗涤 3— 5次；
(6) 加入邻苯二胺 （0- Phenylenediamine, 0PD), 显色 15 min;
(7) 用 2 mol/L浓硫酸终止反应， 通过酶标仪测定波长 492nm 的吸光度。 下面通过具体实施方式对本发明做进一步说明， 但并不意味着对本发明保护 范围的限制。
具体实施方式
实施例 1
一种靶向结核分枝杆菌 Ag85B的寡核苷酸适配子的制备方法， 其步骤如下：
(1) 随机单链 DNA (ssDNA) 文库的构建和引物： 随机单链 DNA (ssDNA) 文 库 的 构 建 和 引 物 ： 随 机 单 链 DNA ( ssDNA ) 文 库 ： 5' -GCAATGGTACGGTACTTCC (N35) CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3 ' ； 上游引物： 5'- GCAATGGTACGGTACTTCC- 3' ； 下 游 引 物 ： 素标记的上游引物： 5'-biotin-GCAATGGTACGGTACTTCC-3'； 所述随机单链 DNA (ssDNA) 文库和引物通过引物公司合成；
(2) 随机单链 DNA (ssDNA) 文库的 PCR扩增制备：
将 ssDNA文库扩增成 dsDNA文库， 保存， 并以 dsDNA文库为模板扩增出下一 轮筛选的 ssDNA文库：
第一轮扩增条件： 随机单链 謹 文库 0.25w g、 生物素标记的上游引物
37.5pmol、 下游引物 37.5pmol、 0.2mmol I L dNTP、 10 μ 1 10倍 DNA聚合酶反应 缓冲液和 DNA聚合酶 2个活性单位， 加入双蒸水使总体积为 100 μ 1; 然后放入 PCR扩增仪中， 反应程序设定为： 95°C ， lmin, 94 °C, 30 sec, 37 °C, lmin, 58
°C， 40sec, 27个循环， 最后 58°C延伸 2 min， 得 PCR扩增产物； 第二、 三轮扩增条件： 取 ΙΟ μ Ι 上一轮筛选产物作为模板， 上游引物 37. 5pmol、 下游引物 37. 5pmol、 0. 2mmol I L dNTP、 10倍 DNA聚合酶反应缓冲液 和 DNA聚合酶 2个活性单位， 加入双蒸水使总体积为 100 μ 1 ; 然后放入 PCR扩增 仪中， 反应程序为： 95°C， lmin; 94 °C , 30 sec; 37 °C , lmin; 58 °C , 40sec; 扩增 3个循环；取 3个循环的扩增产物为模板，生物素标记的上游引物 37. 5pmol、 下游引物 37. 5pmol、 0. 2mmol I L dNTP、 10倍 DNA聚合酶反应缓冲液和 DNA聚合 酶 2个活性单位， 加入双蒸水使总体积为 100 μ ΐ ; 然后放入 PCR扩增仪中， 反应 程序为： 95°C lmin, 94 °C 30 sec, 37 °C lmin, 58 °C 40sec， 第二轮扩增进行 24个循环， 第三轮扩增进行 27个循环， 最后 58°C延伸 2 min;
第四轮扩增条件： 取 10 μ ΐ上一轮筛选产物作为模板， 上游引物 37. 5pmol、 下游引物 37. 5pmol、 0. 2mmol I L dNTP、 10倍 DNA聚合酶反应缓冲液和 DNA聚合 酶 2个活性单位， 加入双蒸水使总体积为 100 μ ΐ ; 然后放入 PCR扩增仪中， 反应 程序为： 95°C lmin, 94 °C 30 sec, 37 °C 30 sec, 60 °C 40sec， 扩增 3个循环； 取 3 个循环的扩增产物为模板， 生物素标记的上游引物 37. 5pmol、 下游引物 37. 5pmol、 0. 2mmol I L dNTP、 10倍 DNA聚合酶反应缓冲液和 DNA聚合酶 2个活 性单位， 加入双蒸水使总体积为 100 μ ΐ ; 然后放入 PCR扩增仪中， 反应程序为： 95 °C lmin, 94 °C 30 sec, 37 °C 30 sec, 60 °C 40sec， 30个循环， 最后 60°C延 伸 2 min;
第五至八轮扩增条件： 取 ΙΟ μ Ι 上一轮筛选产物作为模板， 上游引物 37. 5pmol、 下游引物 37. 5pmol、 0. 2mmol I L dNTP、 10倍 DNA聚合酶反应缓冲液 和 DNA聚合酶 2个活性单位， 加入双蒸水使总体积为 100 μ 1 ; 然后放入 PCR扩增 仪中， 反应程序为： 95°C lmin, 94 °C 30 sec, 55 °C 30 sec, 60 °C 40sec， 扩 增 3个循环； 取 3个循环的扩增产物为模板， 生物素标记的上游引物 37. 5pmol、 下游引物 37. 5pmol、 0. 2mmol I L dNTP、 10倍 DNA聚合酶反应缓冲液和 DNA聚合 酶 2个活性单位， 加入双蒸水使总体积为 100 μ 1 ; 然后放入 PCR扩增仪中， 反应 程序为： 95°C lmin, 94 °C 30 sec, 55 °C 30 sec, 60 °C 40sec， 第五轮扩增 24 个循环， 第六轮扩增 30个循环， 第七轮扩增 27个循环， 第八轮扩增 24个循环， 最后 60°C延伸 2 min;
(3 ) SELEX筛选：
A. PCR扩增产物纯化回收： 将步骤 （2) 中每一轮的 PCR扩增产物用 7M尿 素 8%变性 PAGE进行电泳， 置 0. 5 W g/ml溴化乙锭溶液中染色后， 将其放在铺 好保鲜膜的长波紫外灯上， 打开紫外灯， 在防护罩防护下， 用锐利刀片切取呈橘 红色条带的 PCR扩增产物切下， 将胶条切碎， 移入 1. 5ml离心管中； 加入 3倍体 积的凝胶洗脱缓冲液 （0. 5M NH4Ac, 0. 2%SDS, ImM EDTA, pH 8. 0)， 于 37°C震 荡洗脱 7小时以上； 将洗脱液吸到新的 1. 5ml离心管中， 不要将凝胶吸出； 重复 洗脱一次；在洗脱液中加入 2. 5倍体积的无水乙醇， 1/10体积的 3M NaAc， pH5. 2, -70°C放置 3hr; 在 4°C下放置， 在 14， OOOrpm下离心 30min; 弃上清液， 沉淀， 用 4°C预冷的 70%乙醇洗一次， 在 4°C下放置， 在 14，000rpm下离心 30min; 弃上 清液， 沉淀于室温干燥； 将干燥好的 DNA溶于适量 SHMCK缓冲液 （SELEX 结合缓 冲液： 20 mmol/L Hepes pH 7. 35， 120 mmol/L NaCl, 5 mmol/L KC1, 1 mmol/L CaC12, 1 mmol/L MgC12, 1% BSA) 中； 将每一轮获得的 ssDNA贮存于 4°C保存； B.微孔板为介质的 SELEX筛选过程：用包被缓冲液（0. 05mol/L NaHC03, pH 9. 6) 稀释 Ag85B 蛋白， 然后包被于 96 孔酶联板孔中， 在 4°C下放置， 过夜，同 时设空白对照孔 （只加包被液）； 弃去包被液， 用 PBS-T洗涤液洗板 3次， lmin/ 次； Ag85B蛋白包被孔和空白对照孔均以 3% BSA-PBS溶液 100 μ 1封闭， 37 V 孵育 2 h; 弃去封闭液， 加入每一轮获得的 ssDNA和 SELEX结合缓冲液（SHMCK缓 冲液） 共 200 μ 1到 Ag85B 蛋白包被孔， 与 Ag85B蛋白于 37 °C结合 40 min; 弃 结合缓冲液， 用 SELEX洗涤液 （SELEX结合缓冲液加 0. 05%吐温 20) 洗 6 次，每 次洗 lmin; 弃洗涤液， 加 SELEX洗脱液于 80 °C作用 lO min (第三轮及以后的筛 选作用 15min)，洗脱下与 Ag85B蛋白结合的 ssDNA;将洗脱下的 ssDNA收集到 1. 5ml 离心管中； 重复洗脱 1次； 经等体积的酚：氯仿抽提、 无水乙醇和 70%乙醇沉淀 后，将 ssDNA溶解于 20 μ 1 ΤΕ 缓冲液中， 作为下一轮筛选的 ssDNA模板； 如此 反复， 再进行第 9一 14轮；
( 4 ) 亲和力测定： 应用酶联寡聚核苷酸试验（ Enzyme-linked oligonucleotide assay, EL0NA)法测定适配子的亲和力：
A. 用包被缓冲液将 Ag85B蛋白稀释至 112 pmol/孔， 加入酶标板， 封口后 置 4°C包被过夜； 次日用 PBST洗板 3次， 每次 3分钟；
B. BSA封闭： 每孔加 PBST- 1% BSA 200μ1， 至 37°C孵育 1小时， 用 PBST洗 板 3次， 每次 3分钟；
C. 将第一轮至第八轮筛选的 PCR扩增产物， 用酚、 氯仿抽提， 用乙醇沉淀 纯化， 测定 DNA含量；
D. 按每孔 250 pmol ssDNA与 112 pmol Ag85蛋白包被孔在 200 μΐ SELEX 结合缓冲液中 37°C孵育 40 min, 用 SELEX洗涤液洗涤 6次；
E. 加入 200μ1 1 : 1000稀释的链霉亲和素标记辣根过氧化物酶 37°C孵育 30 min;
F. PBST洗涤 6次， 然后加入邻苯二胺 （0- Phenylenediamine, 0PD);
G. 37 显色15 1!1 ； 用 2 mol/L浓硫酸终止反应， 用酶标仪测定波长 492nm 的吸光度；
H. 第一轮至第八轮筛选的适配子的吸光度 0D值依次如下： 0、 0、 0. 347、 0. 440、 2. 964、 3. 175、 3. 178、 3. 23, 表明第八轮适配子库与结核分枝杆菌 Ag85B 的亲合力最大；
(5 ) 适配子的克隆和测序：
经第八轮筛选得到的 ssDNA,用上游引物和下游引物 PCR扩增成 dsDNA, PAGE 胶纯化回收产物， 进行 DNA克隆和测序； 克隆转化子经 PCR鉴定为阳性的克隆， 挑取 100个克隆培养、 保存， 从中随机挑取 57个克隆的单个生长菌落进行 DNA 测序； 获得的随机区序列如下：
15 AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT
16 AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT
17 AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT
18 AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT
19 AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT
20 AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT
21 AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT
22 AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT
23 AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT
24 AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT
25 AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT
26 AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT
27 AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT
28 AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT
29 AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT
30 AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT
31 AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT
32 AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT
33 AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT
34 AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT
35 AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT
36 AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCT
37 AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCG
38 AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCG
39 AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCG
40 AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCG
41 AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCG
42 AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCG
43 AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCG
44 AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCG 45 AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCG
46 AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCG
47 AACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCC
48 TTTTTTTTTGTGTTGTCGTGATATTGTAACCTGT
49 TTAACTTTTTTTGATGTTTATGTCGGTTTGCTATG
50 TTTTCTGTCTAGTTGTATTTACTCTTGGTATTATG
51 TTTTGGAAATTCTTTTTGTACTAGAATAATACCAC
52 TTTTTATATCAGTCTTAATATTGTGTTCTGTTGAC
53 TTTTTCCTGTAATATTCGTCTTTTGATGTTGTCTA
54 TATCTTCATCGGCAGGATGCCTATGCGCAGGTTTG
55 ATTGGCGTTTGTTAGGACTGATGTTCGAGAAACCG
56 GGTTATTCTGTATTGTTGAATTGTTCTAGTGGTTT
57 GTTATTCAATTAAGTCGGGTTTATTGTGTGCGTTG
( 6 ) 适配子的合成、 鉴定：
A. Ag85B适配子的合成： 综合考虑各条序列的同源性信息和二级结构， 选取 了 Νο· 1、 No. 37、 No. 47、 No. 48、 No. 49、 No. 50、 No. 51、 No. 52、 No. 53、 No. 54、 No. 55、 No. 56、 No. 57适配子克隆的 DNA序列分别命名为： AP- 1、 AP- 2、 AP- 3、 AP- 4、 AP- 5、 AP- 6、 AP- 7、 AP- 8、 AP- 9、 AP- 10、 AP- 11、 AP- 12、 AP- 13， 按常规 方法合成这 13个适配子；
B . 适配子亲和力测定： 应用生物素标记的引物扩增合成文库 Gp35、 第八轮 筛选的 PCR产物及上述合成的 AP- 1至 AP-11适配子， 通过 EL0NA方法检测适配 子与 Ag85B蛋白亲和力， 结果显示 AP-1适配子的亲和力最高。
11个适配子的亲和力测定
Figure imgf000011_0001
CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA
AP-3 GCAATGGTACGGTACTTCCAACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTCGGCCC 1. 208
CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA
AP-4 GCAATGGTACGGTACTTCCTTTTTTTTTGTGTTGTCGTGATATTGTAACCTGT 1. 046
CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA
AP-5 GCAATGGTACGGTACTTCCTTAACTTTTTTTGATGTTTATGTCGGTTTGCTATG 1. 143
CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA
AP-6 GCAATGGTACGGTACTTCCTTTTCTGTCTAGTTGTATTTACTCTTGGTATTATG 1. 056
CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA
AP-7 GCAATGGTACGGTACTTCCTTTTGGAAATTCTTTTTGTACTAGAATAATACCAC 1. 078
CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA
AP-8 GCAATGGTACGGTACTTCCTTTTTATATCAGTCTTAATATTGTGTTCTGTTGAC 1. 141
CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA
AP-9 GCAATGGTACGGTACTTCCTTTTTCCTGTAATATTCGTCTTTTGATGTTGTCTA 1. 205
CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA
AP-10 GCAATGGTACGGTACTTCCTATCTTCATCGGCAGGATGCCTATGCGCAGGTTTG 1. 079
CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA
AP-11 GCAATGGTACGGTACTTCCATTGGCGTTTGTTAGGACTGATGTTCGAGAAACCG 1. 102
CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA
合成文 0. 021
GCAATGGTACGGTACTTCC - CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA
库 Gp35
第 8轮 1. 354 筛选产
物
C. Ap-1适配子的解离常数 Kd值： 应用 ELONA方法检测不同浓度 AP-1与 Ag85B 蛋白结合的吸光度 0M92, 然后利用 Origin Pro 7. 5软件计算 AP_1与 Ag85B蛋白的 解离常数 Kd值为 119. 57 ± 52. 95nM。
不同浓度 AP-1与 Ag85B蛋白结合的吸光度
Figure imgf000012_0001
0. 5 0. 02
5 0. 034
10 0. 428
100 0. 793
360 1. 516
720 1. 695
所述各轮的筛选条件如下：
筛选 DNA文库用 Ag85B 蛋白 反 消 减 PCR 扩增 孵育时 轮数 量 （pmol/ 用量 (pmol/ 筛 物质 循 环 数 间（min)
孔） 孔） 靶 （轮）
标
1 3300 330 27 40
2 250 112 Ag85A 24 40
3 100 50 27 40
4 100 50 BSA Ag85A 30 30
5 50 25 BSA 24 30
6 50 25 BSA Ag85A 30 30
7 50 25 BSA 27 20
8 50 25 BSA 24 20
一种靶向结核分枝杆菌 Ag85B 的寡核苷酸适配子在制备结核分枝杆菌检测 试剂方面的应用， 其步骤如下：
A. 通过基因工程技术克隆、 表达、 纯化结核分枝杆菌 Ag85B: Ag85B重组质 粒在大肠杆菌中经 IPTG诱导 4小时后， 通过 SDS-PAGE分析可见特异的表达产物 带 （图 1所示， 是结核分枝杆菌 Ag85B蛋白 SDS - PAGE的纯化分析。）， 分子量 约为 31. 0 kDa左右， 光密度扫描分析表明占菌体总蛋白 30 %左右； 在变性条件 下纯化 Ag85B蛋白， 纯化后的样品经 SDS-PAGE分析显示只见一条回收的蛋白带， 未见其它杂带， 经光密度扫描分析表明其纯度为 95%以上； 如图 1所示， 为结核 分枝杆菌 Ag85B蛋白 SDS - PAGE的纯化分析图。其中， M: 蛋白分子量标准； 1， 3 : Ag85B基因工程菌 IPTG诱导后样品； 2 : 纯化的重组 Ag85B蛋白； 4: Ag85B基因 工程菌 IPTG诱导前样品。 B. 通过常规的动物免疫方法制备兔抗结核分枝杆菌 Ag85B多克隆抗体， 通 过酶联免疫试验 （ELISA) 鉴定抗体的滴度， 如图 2所示， 是通过 ELISA检测兔 抗结核分枝杆菌 Ag85B多克隆抗体的滴度， 其中， Al、 A2 (空白对照） 0M92分 别为 0、 0. 007； A3、 A4 (正常兔血清， 阴性对照） 0M92分别为 0. 018、 0. 021； Bl、 B2 ( 1号免疫兔血清） 0M92分别为 1. 473、 1. 652； B3、 B4 (2号免疫兔血 清） 0D492分别为 1. 785、 1. 778； B5、 B6 ( 3号免疫兔血清） 0D492分别为 1. 219、 1. 186; B7、 B8 (4号免疫兔血清) 0D492分别为 1. 433、 1. 433。 结果显示 4只免 疫兔血清均含有较高水平的抗结核分枝杆菌 Ag85B多克隆抗体。
C.建立应用 AP-1适配子 EL0NA法检测体液标本中结核分枝杆菌 Ag85B的方 法： 选择出现频率最多克隆的单个生长菌落所对应的 DNA适配子 AP-1建立 AP-1 适配子 EL0NA检测方法；
a.以 lng/ml兔抗结核分枝杆菌 Ag85B多克隆抗体 IgG为捕获抗体包被微孔 板， 置 4°C过夜； 次日用 PBST洗板 3次， 每次 3分钟；
b. BSA封闭： 每孔加 PBST- 1% BSA 200μ1 , 至 37°C孵育 1小时， 用 PBST洗 板 3次， 每次 3分钟；
c. 加入未稀释的待测体液标本， 37°C孵育 40 min— lh; 用 SELEX洗涤液洗 涤 3— 5次；
d. 加入 1. 25 μ § 5' 端生物素化的报告适配子， 37°C孵育 40 min— lh; 用 SELEX洗涤液洗涤 3— 5次；
e. 加入 200μ1 1： 1000稀释的链霉亲和素标记辣根过氧化物酶 37°C孵育 30 min; 用 SELEX洗涤液洗涤 3— 5次；
f. 加入邻苯二胺 (O-Phenylenediamine, 0PD), 显色 15 min;
g. 用 2 mol/L浓硫酸终止反应， 通过酶标仪测定波长 492nm 的吸光度；
D. 应用 AP-1适配子 EL0NA法检测结核分枝杆菌 Ag85B的敏感性和特异性： a. 应用 AP- 1适配子 EL0NA法检测 100、 80、 50、 40、 20、 10、 1 ng/ml的 结核分枝杆菌 Ag85B蛋白， 其 0D492醒分别为 0. 89、 0. 678、 0. 494、 0、 0、 0、 0， 表明应用 AP-1适配子 EL0NA法检测结核分枝杆菌 Ag85B的敏感性为 50 ng/ml ; b. 应用 AP-1适配子 EL0NA法检测 50 ng/ml的结核分枝杆菌 MPT64蛋白， 其 0M92nm为 0，表明应用 AP-1适配子 EL0NA法检测结核分枝杆菌 Ag85B具有较 高的特异性；
E. 应用 AP-1适配子 EL0NA法检测体液标本中结核分枝杆菌 Ag85B: a. 应用 AP-1适配子 ELONA法检测 100例健康人 （包括 41例 PPD皮试阴性 和 59例 PPD皮试阳性者）、 59例非结核呼吸疾病患者和 83例结核病患者血清中 结核分枝杆菌 Ag85B，其 0D492nm分别为 0. 034±0. 14、 0. 056±0. 17、 0. 250±0. 41。 以健康对照组和非结核呼吸疾病对照组的光密度平均值 + 2 倍标准差 (Mean ± 2SD ) 为正常界限值， 应用 AP-1适配子 EL0NA法检测结核病患者血清中 结核分枝杆菌 Ag85B的灵敏度为 30. 1%， 其中菌阴患者的灵敏度为 12%, 而菌阳 患者检测的灵敏度为 57. 6%, 特异性为 98. 1%, 阳性预测值 89. 3%， 阴性预测值 72. 9%, 总准确率为 74. 8%。
应用 AP-1适配子 EL0NA法检测 242例人血清中结核分枝杆菌 Ag85B的结果 认、 m 临床诊断 八 、 ，
Ag85B检测 合计
结核病组 非结核对照组
阳性 25 3 28
阴性 58 156 214
合计 83 159 242
如图 3所示，是应用 AP-1适配子 EL0NA法检测人血清中结核分枝杆菌 Ag85B 的结果。 其中： A1 : 空白对照； B1—H1 : 100、 80、 60、 50、 20、 10、 1 ng/ml的 结核分枝杆菌 Ag85B蛋白； A2— H2 : No. 1-8肺结核病患者血清； A3— H3 : No. 1-8 非结核呼吸疾病患者血清； A4— H4: No. 1-8 PPD皮肤试验阴性的健康人血清； A5 -H5 : No. 1-8 PPD皮肤试验阳性的健康人血清。
b. 应用 AP-1适配子 EL0NA法检测 2例非结核性胸膜炎患者和 22例结核性胸 膜炎患者胸水中结核分枝杆菌 Ag85B，其 0M92nm分别为 0. 04±0. 03, 0. 120±0. 18， 22例结核性胸水中 4例 0M92nm明显增高， 阳性率为 18. 2%, 结果所图 4所示， 是应用 AP-1适配子 EL0NA法检测人胸水中结核分枝杆菌 Ag85B的结果，其中， Al、 A2 : 空白对照； Bl、 B2 : 阳性对照； Cl、 C2 : 阴性对照； A3、 A4、 B3、 B4、 C3、 C4: 结核性胸水； A5、 A6、 B5、 B6、 C5、 C6 : 非结核性胸水。 结果表明该方法也 可从胸水中检测出结核分枝杆菌抗原。
c 应用 AP-1适配子 EL0NA法检测 4例非结核性脑膜炎患者和 28例结核性 脑膜炎患者脑脊液中结核分枝杆菌 Ag85B， 结果如图 5所示， 应用 AP-1适配子 EL0NA法检测人脑脊液中结核分枝杆菌 Ag85B的结果。 其中， Al、 A2 : 空白对照； Bl、 B2 : 阳性对照； Cl、 C2 : 阴性对照； A3、 A4、 B3、 B4、 C3、 C4、 D3、 D4: 结 核性脑脊液； A5、 A6、 B5、 B6、 C5、 C6、 D5、 D6 : 非结核性脑脊液。
结果表明： 仅 1例结核性脑脊液 0M92nm明显增高， 阳性率为 3. 6%， 结果表 明该方法也可从脑脊液中检测出结核分枝杆菌抗原。
d. 应用 AP-1适配子 EL0NA法检测 6例非结核性腹膜炎患者和 28例结核性 腹膜炎患者腹水中结核分枝杆菌 Ag85B，图 6为应用 AP-1适配子 EL0NA法检测人 腹水中结核分枝杆菌 Ag85B的结果。 Al、 A2 : 空白对照； Bl、 B2 : 阳性对照； Cl、 C2 : 阴性对照； A3、 A4、 B3、 B4、 C3、 C4: 非结核性腹水； A5、 A6、 B5、 B6、 C5、 C6 : 结核性腹水。
结果表明： 2例结核性腹水 0M92nm明显增高， 阳性率为 33. 3%， 结果表明 该方法也可从腹水中检测出结核分枝杆菌抗原。
工业应用性
本发明通过筛选并获得靶向结核分枝杆菌 Ag85B 蛋白的寡核苷酸适配子 AP- 1、 AP- 2、 AP- 3、 AP- 4、 AP- 5、 AP- 6、 AP- 7、 AP- 8、 AP- 9、 AP- 10、 AP- 11、 AP- 12、 AP-13 , 应用于检测人血清中结核分枝杆菌 Ag85B抗原水平， 可代替抗体， 提高 体液标本 （包括血清、 胸水、 脑脊液、 腹水等） 中结核抗原检测的灵敏度和特异 性， 从而提高结核病诊断的准确率。
本发明建立的一种制备靶向结核分枝杆菌特异性抗原的高亲和性 DNA适配子 的方法， 可制备多种靶分子的适配子， 用于结核病的诊断和治疗。
建立的 AP-1适配子 EL0NA方法可半定量地检测结核病人体液标本 （包括血 清、 胸水、 脑脊液、 腹水等） 中的抗原水平， 只需半天时间， 可用于结核病的快 速诊断。
本发明人研究证明应用 AP-1适配子 EL0NA方法检测结核病人血清的灵敏度 为 30. 1%， 其中菌阴患者的灵敏度为 12%, 而菌阳患者检测的灵敏度为 57. 6%, 特 异性为 98. 1%， 阳性预测值 89. 3%, 阴性预测值 72. 9%, 总准确率为 74. 8%。在 PPD 皮试阳性的结核感染者和卡介苗接种者中未出现假阳性。应用 AP-1适配子 EL0NA 方法也可从结核性胸水、 脑脊液、 腹水中检测出结核分枝杆菌抗原， 其阳性率分 别为 18. 2%、 3. 6%、 33. 3 %。
本发明的关键试剂——靶向结核分枝杆菌 Ag85B的寡核苷酸适配子可大规 模地合成或 PCR扩增制备， 且成本相对较低。

Claims

权利要求书
1、 一种靶向结核分枝杆菌 Ag85B的寡核苷酸适配子， 其特征在于： 所述寡 核苷酸适配子的核苷酸序列如序列表中的序列 1-13所示。
2、 根据权利要求 1所述的靶向结核分枝杆菌 Ag85B的寡核苷酸适配子的制 备方法， 包括下列步骤：
(1) 随机单链 DNA (ssDNA) 文库的构建和引物： 随机单链 DNA (ssDNA) 文 库： 5 ' - GCAATGGTACGGTACTTCC (N35) CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA- 3 '； 上游引物： 5 ' -GCAATGGTACGGTACTTCC-3 ' ； 下 游 引 物 ： 素标记的上游引物： 5'- biot in- GCAATGGTACGGTACTTCC- 3'；
(2) PCR 扩增制备随机 ssDNA 文库；
(3) SELEX筛选；
(4) 亲和力测定：
(5) DNA克隆和测序；
(6) 适配子的合成和鉴定。
3、 根据权利要求 1所述的靶向结核分枝杆菌 Ag85B的寡核苷酸适配子在制 备结核分枝杆菌检测试剂方面的应用。
4、 根据权利要求 4所述的靶向结核分枝杆菌 Ag85B的寡核苷酸适配子在制 备结核分枝杆菌检测试剂方面的应用， 包括下列步骤：
(1) 以 lng/ml兔抗结核分枝杆菌 Ag85B多克隆抗体 IgG为捕获抗体包被微孔 板， 置 4°C过夜； 次日用 PBST洗板 3次， 每次 3分钟；
(2) BSA封闭： 每孔加 PBST-1% BSA 200μ1, 至 37°C孵育 1小时， 用 PBST洗板 3次， 每次 3分钟；
(3) 加入未稀释的待测体液标本， 37°C孵育 40 min-lh; 用 SELEX洗涤液 洗涤 3— 5次；
(4) 加入 L25wg 5， 端生物素化的报告适配子， 37°C孵育 40 min—lh; 用 SELEX洗涤液洗涤 3— 5次；
(5) 加入 200μ1 1:1000稀释的链霉亲和素标记辣根过氧化物酶 37°C孵育 30 min; 用 SELEX洗涤液洗涤 3— 5次；
(6) 加入邻苯二胺 （0- Phenylenediamine, 0PD), 显色 15 min;
(7) 用 2 mol/L浓硫酸终止反应， 通过酶标仪测定波长 492nm 的吸光度。
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