CN106047882A - 一组特异性结合结核分枝杆菌的核酸适配体及其应用 - Google Patents

一组特异性结合结核分枝杆菌的核酸适配体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一组特异性结合结核分枝杆菌的核酸适配体及其应用。本发明的结核分枝杆菌标准株H37Rv的ssDNA适配体亲和性强、特异性高，该适配体能高特异性地检测出结核分枝杆菌，可以为检测结核分枝杆菌传感器的制备、结核病的实验室诊断提供有利依据。

Description

一组特异性结合结核分枝杆菌的核酸适配体及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学和医学微生物技术领域，涉及两个特异性结合结核分枝杆菌菌体的核酸适配体及其用途。
背景技术
结核病是严重危害人类健康的慢性传染病，是全球关注的公共卫生问题和社会问题。近年来，由于缺乏有效、廉价的诊断设备，加上耐药结核杆菌菌株的产生、人口流动等因素影响，使得全世界的结核病发病率有明显的上升，结核病的形势更加严峻。快速准确的早期诊断是防治结核病的有效措施和控制结核病传播的关键步骤之一。
目前X线胸片、涂片镜检法、培养法是结核病诊断最常用的方法。X线胸片是大量结核分枝杆菌产生后才能检测出来，且对HIV病人难以诊断。涂片镜检法简单快速，但检出率只有50％。培养法检出率很高，但耗时费力，而且无法特异性识别结核分枝杆菌，用于结核分枝杆菌的检测需要4～6周,并需要高水平的技术能力。而BACTEC MGIT 960全自动检测系统，将检测时间缩短到10天，但仍需对结核分枝杆菌的培养，而且无法对结核分枝杆菌进行特异性识别，无法区分卡介苗和结核分枝杆菌以及耻垢分枝杆菌。检测时间无法满足临床要求，且设备和试剂消耗很昂贵。多通道串联式压电石英晶体(MSPQC)传感器由于具有灵敏度高、稳定性强、成本低、易于操作等优点，在细菌的快速检测领域取得一定进展，主要是依据细菌生长代谢引起培养基的电参数变化，但代谢法对结核杆菌的检出时间只能缩短到7天。与噬菌体裂解法联合后检出时间缩短到30小时。但这两种方法的检出时间仍然受限于细菌的培养时间，同样无法对结核分枝杆菌进行特异性识别，无法区分卡介苗和结核分枝杆菌。免疫学方法基于抗原抗体的灵敏反应，大大提高了检测限，但是抗体在常温下的不稳定性限制了这些方法的推广使用。分子生物学法缩短了检出时间、提高了灵敏度，但由于需要苛刻的实验条件和昂贵的成本而无法得到普及。
适配体(Aptamers)的研究是一个新的热点领域，它是能够与许多目标分子(蛋白，药物，无机或有机分子)发生高亲合性和特异性结合的一类单链核酸(DNA or RNA)。至今发现高亲和特异性适配体的方法是利用配体指数富集系统展开。由于适配体与目标物(小分子、蛋白、全细胞、病毒、细菌)结合的高特异性以及高亲和性，在医学研究中被广泛应用于检测和药物研究等方面。结核分枝杆菌磷酸激酶2(PPK2)为靶标的适配体、结核分枝杆菌早期分泌蛋白CFP-10和ESAT-6为靶标的适配体，以及应用于小鼠体内结核分枝杆菌的防治的结核分枝杆菌的菌体适配体。但目前用于临床检测的结核分枝杆菌菌体适配体还未见报道。因此，有必要开发一种可特异性识别结核分枝杆菌并用于临床检测的适配体。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供可与结核分枝杆菌特异性结合的核酸适配体。
本发明特异性结合结核分枝杆菌的核酸适配体的核心序列如SEQ ID NO：1和SEQID NO：2所示。
所述核酸适配体序列如下：
5′-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-N35-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3′，其中N35为核心序列，核心序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。
本发明所述的特异性结合结核分枝杆菌的核酸适配体的核苷酸序列上的某一位置可以被磷酸化、氧甲基化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化。
本发明所述的特异性结合结核分枝杆菌的核酸适配体的核苷酸序列上可以结合有生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料、聚乙二醇、肽段、蛋白、酶或叶酸标记。
本发明所述的核酸适配体的核苷酸序列还可以包括以下三种序列中的任意一种：
(1)与前述的核酸适配体的核苷酸序列的同源性在60％以上；
(2)与前述的核酸适配体的核苷酸序列进行杂交的序列；
(3)前述的核酸适配体的核苷酸序列转录的RNA序列。
本发明的第二个目的在于提供本发明所述核酸适配体的应用，具体包括在制备结核病诊断试剂中的应用、在制备预防或治疗结核病药物中的应用。以及在制备检测结核分枝杆菌传感器中的探针的应用。
本发明采用下述方法获得特异性识别结核分枝杆菌H37Rv的DNA适配体：采用核酸适配体的体外SELEX筛选技术，以结核分枝杆菌为靶标，为了获得高特异性结合分枝杆菌的适配体，以耻垢分枝杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌的混合物为反筛靶标，从体外合成的随机寡聚DNA文库(5′-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-N35-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3′，N35为核心序列)中筛选出与结核分枝杆菌特异结合的核酸适配体，核心序列如下：
将筛选出来的序列用
引物P1(5′-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-3′)和
引物P2(5′-GATCC GGGCCTCATGTCGAA-3′)进行扩增。经过对称PCR扩增和不对称PCR扩增，程序为95℃5min，95℃30s，65℃30s，72℃30s，72℃5min，18-40个循环；循环次数根据具体的扩增效果进行调整。PCR产物通过3％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，胶纯化试剂盒进行回收(按照试剂盒产品说明书操作)。将PCR扩增产物纯化后取1μL，与载体PGM-T在T4DNA连接酶的作用下连接，再将其转化到感受态细胞，取适当体积均匀涂布于含有IPTG、x-gal、抗生素(Amp)的LA平板，12～16小时后用接种环挑取筛选平板上的单个白色菌落于含Amp的LB液体培养基，37℃培养过夜。取菌液lmL于离心管中，封膜后送上海生工生物技术有限公司(以下简称上海生工)测序。
本发明通过SELEX技术用不同于现有技术的反筛靶目标进行了筛选，从新的体外合成的随机寡聚DNA文库中筛选出与结核分枝杆菌特异结合的核酸适配体，得到了新的特异性极强的核酸适配体序列。本发明所述的核酸适配体序列选自天然存在或人工合成的序列，或任何其他来源的同样的序列。
本发明筛选出来的适配体可与结核分枝杆菌特异性结合，而且本发明所提供的核酸适配体序列与作为靶标的结核分枝杆菌具有非常强的亲和性，具有特异性强的优点；因此能高特异性地检测出结核分枝杆菌，可以为检测结核分枝杆菌制剂的制备、结核病的实验室诊断，以及制备预防或治疗结核病药物等提供有利依据。此外，所述序列可以大量快速地在体外合成，且制备方法简单，比较容易获得。
附图说明
图1为本发明具有高亲和力，能特异性识别结核分枝杆菌的适配体SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2核心序列的二级结构；
图2，左图为结核分枝杆菌与适配体的结合率，右图为流式细胞技术分析文库中适配体的富集情况；
图3为本发明制备的SWCNTs/Apt/IDE-MSPQC传感器检测结核分枝杆菌的机理图；
图4为本发明传感器的阻抗值变化曲线，(a)裸金叉指电极，(b)修饰上适配体后，(c)与碳纳米管结合后，(d)适配体捕获结核分枝杆菌，释放碳纳米管后；
图5为本发明SWCNTs/Apt/IDE-MSPQC传感器检测不同细菌的频移变化曲线，细菌浓度均为1×106cfu/mL：(a)空白对照，(b)大肠杆菌，(c)绿脓杆菌，(d)耻垢分支杆菌，(e)金黄色葡萄球菌，(f)卡介苗，(g)结核分枝杆菌。
具体实施方式
实施例1：构建随机单链DNA文库及引物
构建含78nt碱基序列的DNA文库(5′-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-N35-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3′)，上游引物为5′-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-3′，下游引物是5′-GAT CCGGGCCTCATGTCG AA-3′，N35为随机核心序列，库容量为435。以上文库及引物均由上海生工合成。
实施例2：SELEX筛选
前四轮，首先将ssDNA文库置于400μL选择缓冲液(50mM Tris-HCl(pH7.4)，100mMNaCl，5mM KCl，1mM MgCl2，0.1％NaN3)中，95℃加热5min，然后置于冰中冷却10min，备用；取结核分枝杆菌，用生理盐水洗涤，离心，弃上清液，反复三次；在盛有沉淀的离心管中，加入100μL上述备好的ssDNA文库溶液，37℃，孵育45min；6000rpm离心10min，弃去上清液。并用洗涤缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 7.4)，100mM NaCl，5mM KCl，1mM MgCl2，0.1％NaN3，0.2％牛血清白蛋白)洗涤3次，弃去上清液，加入100μL的双蒸水，置于95℃水浴锅，在5min，10000rpm离心15min,上清液即为与M.tuberculosis有特异结合的ssDNA序列。后十轮筛选中，ssDNA文库先与耻垢分枝杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌的混合物孵育，离心，收集上清液，再与结核分枝杆菌孵育，制备与结核分枝杆菌特异性结合地ssDNA序列。以此序列为模板进行对称和不对称PCR扩增，程序为95℃5min，95℃30s，65℃30s，72℃30s，72℃5min，18-40个循环；循环次数根据具体的扩增效果进行调整。PCR产物通过3％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，胶纯化试剂盒进行回收。经过14轮筛选后，已得到目标ssDNA单链，终止筛选。
实施例3：适配体文库与结核分枝杆菌的结合率
将第2、4、6、8、10、12、13、14轮得到的ssDNA库，用5’端修饰荧光素的上游引物和下游引物(Biotin-RP)，进行不对称PCR扩增，得到的ssDNA与结核分枝杆菌孵育后，离心，分别收集上清液和结合了ssDNA的细菌沉淀。用荧光分光光度计测定上清液的荧光值为F1。将结合了ssDNA的细菌沉淀，用100μL双蒸水重悬菌体，100℃水浴锅中加热10min，再放置高速离心机中10000rpm、4℃离心15min，收集上清移至新离心管，测定荧光值F2,结合率R＝F2/(Fl+F2)x100％，第13轮后结合率基本上稳定，表明ssDNA文库与结核分枝杆菌的结合已达到平衡，结束筛选。
实施例4：用流式细胞仪证明目标序列的富集程度
为了证明在筛选过程中目标序列的富集程度，用流式细胞仪监测了目标序列对结核分枝杆菌的捕获。首先用异硫氰酸荧光素(FITC)修饰的ssDNA文库(100nM)与靶标细菌(106cfu/mL)于200μL选择缓冲液中，置于摇床100rpm、37℃孵育40min。取上述样品置于流式细胞仪中，收集10000个细胞进行分析。通过检测说明随着筛选轮次的增加，高亲和力、高特性的适配体不断得到了富集。
实施例5：核酸适配体克隆
第14轮筛选产物的扩增和纯化：将第14轮筛选得到的ssDNA序列，进行PCR扩增。PCR产物yongUNIQ.10DNA胶回收试剂盒回收纯化。将PCR纯化产物克隆：取1μl扩增产物，与载体PGM-T在T4DNA连接酶的作用下连接，再将其转化到感受态细胞，取适当体积均匀涂布于含有IPTG、x-gal、抗生素(Amp)(它们分别购自于上海生工)的LA平板，倒置培养皿，于37℃培养12-16小时进行“蓝-白斑筛选”。挑选40个克隆子进行培养并从每个克隆子所培养的菌液中取lmL送往上海生工测序。用DNAMAN软件对所测得的核酸适配体序列一级结构的同源性进行分析，并用Mfold sever分析软件在线模拟其二级结构。
实施例6：适配体亲和力的测定
取不同浓度梯度的羧基荧光素(FAM)标记的适配体溶液(浓度依次为0-120nM)与固定量的结核分枝杆菌(107cfu/mL)在离心管中混匀，加入选择缓冲液至500μL，37℃、100r/min振荡孵育45min。8000rpm冷冻离心10min，弃上清，用500μL洗涤缓冲液(50mMTris-HCl(pH 7.4)，100mM NaCl，5mM KCl，1mM MgCl2，0.1％NaN3，0.2％牛血清白蛋白)，重悬菌体后离心，弃上清，重复洗涤3次。结合了适配体的菌体沉淀重悬于100μL无菌去离子水中，将离心管置于水浴锅中100℃处理5min，立即冰浴冷却至室温，10000rpm高速离心15min，取上清液移入微量比色皿中，用荧光分光光度计测其荧光值。利用软件Origin8.0对所得荧光值进行非线性回归分析，根据公式：Y＝X×Bmax/(Kd+X)计算出适配体的Kd值(其中Bmax为体系中最大荧光值，X为适配体浓度，Y为对应的荧光值)。结果表明，SEQ ID NO：1序列的亲和力最好。SEQ ID NO：2的亲和力次之，结果见表2。
实施例7：制备检测结核分枝杆菌传感器及应用
将实施例6筛选出的适配体巯基修饰后固定在在叉指金电极上，与碳纳米管通过π-π键连接作为探针，叉指金电极与多通道压电传感器相连，设计出SWCNTs/Apt/IDE-MSPQC传感器。当有结核分枝杆菌时，适配体与结核分枝杆菌特异性结合，碳纳米管脱离，从而引起叉指电极表面阻抗值的增加，传感器的频移值增加。该传感器可以在1h内检测出结核分枝杆菌，检测下限为100cfu/mL。结果见图4和5。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
表1：14轮筛选所加的H37Rv与ssDNA库量
表2：包含以下核心序列的12个适配体的解离平衡常数/nM

Claims (10)

1.一组特异性结合结核分枝杆菌的核酸适配体，所述核酸适配体的核心序列如SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所示。
2.根据权利要求1所述的特异性结合结核分枝杆菌的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体序列如下：
5′-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-N35-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3′，其中N35为核心序列，核心序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。
3.根据权利要求1所述的特异性结合结核分枝杆菌的核酸适配体，其特征在于，所述的核酸适配体的核苷酸序列上的某一位置被巯基化、磷酸化、氧甲基化、甲基化、氨基化或同位素化。
4.根据权利要求1所述的特异性结合结核分枝杆菌的核酸适配体，其特征在于，所述的核酸适配体的核苷酸序列上结合荧光物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、聚乙二醇、肽段、蛋白、酶或叶酸标记。
5.权利要求1-4任一项所述的核酸适配体在制备结核病诊断试剂中的应用。
6.权利要求1-4任一项所述的核酸适配体在制备预防或治疗结核病药物中的应用。
7.权利要求1-4任一项所述的核酸适配体在制备检测结核分枝杆菌传感器中的探针应用。
8.一组特异性结合结核分枝杆菌的核酸适配体，其特征在于，所述的核酸适配体的核苷酸序列包括以下三种序列中的任意一种：
(1)与权利要求1-4任一项所述的核酸适配体的核苷酸序列的同源性在60％以上；
(2)与权利要求1-4任一项所述的核酸适配体的核苷酸序列进行杂交的序列；
(3)权利要求1-4任一项所述的核酸适配体的核苷酸序列转录的RNA序列。
9.权利要求8所述的核酸适配体在制备结核病诊断试剂中的应用，或者在制备预防或治疗结核病药物中的应用。
10.权利要求8所述的核酸适配体在制备检测结核分枝杆菌传感器中的探针的应用。
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