CN111212912A - 与esat6特异性结合的dna适体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种与6kDa早期分泌性抗原靶(ESAT6)特异性结合的DNA适体；一种用于诊断结核的生物传感器，其包括所述DNA适体；以及一种用于提供用于诊断结核的信息的方法。本发明人发现，根据本发明的DNA适体不仅具有与ESAT6蛋白的特异性结合潜能，而且结合亲和力也优异。因此可以预期，本发明的DNA适体在使用时比使用抗体的常规ELISA方法表现出更大的稳定性。因此，该适体预期有益地应用于开发用于诊断结核的组合物、用于诊断结核的生物传感器以及用于提供用于诊断结核的信息的方法。

Description

与ESAT6特异性结合的DNA适体及其用途
技术领域
本发明涉及用于蛋白检测的适体，更具体地，涉及与已知在结核分枝杆菌H37Rv中表达的6kDa早期分泌性抗原靶(ESAT6)特异性结合的DNA适体。
背景技术
结核是由结核分枝杆菌感染导致的常见致命疾病。结核的症状包括由于厌食、高烧和伴有血痰的咳嗽引起的突然的体重减轻。诊断方法包括X射线检查、痰液涂片检查和聚合酶链反应(PCR)，最后通过它们的组合来诊断结核。众所周知，结核在包括非洲地区在内的发展中国家经常发生，最近被认为是一种已根除的疾病。但是，根据世界卫生组织的统计数据，这是一种可怕的疾病，在2015年全球死亡致因中排名前10位，尤其是，韩国在结核发病率和死亡率方面以压倒性的数量位居经合组织(OECD)国家之首。因此，韩国制定了国家结核管控指南，最大的问题是潜伏性结核的诊断，潜伏性结核患者的人数估计为20亿，相当于世界人口的三分之一。10％的潜伏性结核发展为活动性结核，在其症状发作之前进行早期诊断和治疗很重要。
当前，潜伏性结核的诊断基于两种测试：结核菌素皮肤测试(TST)和干扰素-γ释放测定(IGRA)。TST至少需要48小时到72小时，并且可能会因BCG疫苗接种或感染非结核分枝杆菌而显示假阳性结果。IGRA是一种间接诊断方法，其中将患者的血液添加到附着有结核分枝杆菌特异性抗原的管中，接着刺激16小时，然后测量干扰素-γ的分泌。与TST相比，由于使用了结核分枝杆菌特异性抗原，假阳性结果的概率很低，但是考虑到结核的流行地区大多炎热或潮湿，缺乏稳定性便是一个缺点。另外，通过在血液中的刺激间接测量干扰素-γ的分泌，因此存在诸如敏感性降低之类的缺点。
同时，已知ESAT6在结核分枝杆菌H37Rv中过表达，这导致对人类致命的结核。目前尚不确切知道在感染期间诱发宿主疾病的机制，但通过IGRA推测ESAT6与CFP10或者TB7.7形成复合物，该复合物被用作针对干扰素-γ分泌的结核分枝杆菌特异性抗原，以介导Th1细胞免疫应答。
适体是对特定物质具有高特异性和亲和力的单链DNA(ssDNA)或RNA，由于对特定物质的亲和力非常高且稳定，近来已得到积极开发，并且其在治疗剂和诊断传感器中的应用在积极进行中(参见韩国专利登记号10-1279585)。适体可以使用相对简单的方法合成，并且可以靶向细胞、蛋白，甚至靶向小的有机物，因此有可能开发使用适体的新型检测方法，并且由于与先前开发的抗体相比，其特异性和稳定性更高，有可能将其应用于治疗剂、药物递送系统和诊断性生物传感器的开发，因此，继续对其进行研究。
发明内容
技术问题
由于付出了巨大的努力来开发能够替代针对6kDa早期分泌性抗原靶(ESAT6)的抗体的适体，本发明的发明人生产了对ESAT6蛋白具有特异性结合能力的DNA适体，从而基于该发现完成了本发明。
因此，本发明的目的是提供一种与6kDa早期分泌性抗原靶(ESAT6)特异性结合的DNA适体，其中DNA适体由SEQ ID NO:6的核苷酸序列组成。
本发明的另一个目的是提供一种用于诊断结核的组合物，其包括DNA适体。
本发明的又一个目的是提供一种用于诊断结核的生物传感器，其包括对6kDa早期分泌性抗原靶(ESAT6)()具有特异性的DNA适体；以及其上固定有DNA适体的板，其中DNA适体由SEQ ID NO:6的核苷酸序列组成。
本发明的又一个目的是提供一种提供用于诊断结核的信息的方法，该方法包括：(1)用生物传感器处理受试者样本；以及(2)测量与生物传感器结合的6kDa早期分泌性抗原靶(ESAT6)的水平。
然而，本发明要解决的技术问题不限于上述技术问题，并且根据以下描述，其他未提及的技术问题对本领域普通技术人员来说将变得显而易见。
技术方案
根据本发明的一个方面，提供一种与6kDa早期分泌性抗原靶(ESAT6)特异性结合的DNA适体，其中所述DNA适体由SEQ ID NO:6的核苷酸序列组成。
在本发明的一个实施方案中，ESAT6可以在结核分枝杆菌H37Rv中表达，但是本发明不限于此。
本发明还提供一种用于诊断结核的组合物，其包括所述DNA适体。
本发明还提供一种用于诊断结核的生物传感器，其包括：对6kDa早期分泌性抗原靶(ESAT6)具有特异性的DNA适体；以及其上固定有DNA适体的板，其中所述DNA适体由SEQID NO:6的核苷酸序列组成。
在本发明的一个实施方案中，所述板可以由金属电极层和金属纳米颗粒层组成，并且优选地，金属可以是金(Au)，但是本发明不限于此。
本发明还提供一种提供用于诊断结核的信息的方法，所述方法包括：(1)用生物传感器处理受试者样本；以及(2)测量与所述生物传感器结合的6kDa早期分泌性抗原靶(ESAT6)的水平。
本发明还提供一种诊断结核的方法，所述方法包括使DNA适体与受试者样本接触。
本发明还提供一种诊断结核的方法，所述方法包括：用生物传感器处理受试者样本；以及测量与所述生物传感器结合的ESAT6的水平。
在本发明的一个实施方案中，所述受试者样本可以是需要诊断结核的个体的血液，并且所述血液可以是全血、血清、血浆或血液单核细胞。
本发明还提供DNA适体用于诊断结核的用途，所述DNA适体与6kDa早期分泌性抗原靶(ESAT6)特异性结合。
发明的有益效果
根据本发明的DNA适体具有对6kDa早期分泌性抗原靶(ESAT6蛋白)的特异性结合能力，并且其结合能力优异，因此在结核的诊断中可以排除假阴性反应(false-negativeresponse)。另外，本发明的DNA适体与靶(ESAT6)具有高亲和力，并且对除靶以外的物质具有高排他性，使得在结核的诊断中可以排除假阳性反应。因此，与使用现有抗体的ELISA方法相比，当使用本发明的DNA适体时，可以预期有优异的稳定性，因此，该适体有望有效地应用于：用于开发诊断结核的组合物、用于诊断结核的生物传感器、提供用于诊断结核的信息的方法等。
附图说明
图1示出了通过扩增ESAT6基因来确认(confirm)重组ESAT6蛋白的过表达的结果(Bef泳道表示诱导过表达之前，37A泳道表示通过用IPTG处理获得的过表达诱导结果)，以及观察通过FPLC获得的高纯度重组ESAT6蛋白的结果。
图2示出了确认单链DNA(ssDNA)和ESAT6之间的结合程度(％)的结果以及选择过程的结果。
图3示出了通过荧光测量确认适体序列的Kd值的结果。
图4示出了通过电泳迁移率变动分析(EMSA)方法确认EG10、EG11(44)和EG12适体是否与ESAT6蛋白结合的结果。
图5是使用DNA适体检测ESAT6蛋白的生物传感器的示意图。
图6a和6b示出了使用CG6适体获得的ESAT6检测结果。
图7示出了显示针对ESAT6蛋白的结合特异性实验中的相对阻抗值根据与每种蛋白的反应而变化的结果。
图8示出了显示当从正常个体和结核患者分离的血清样本用EG11(44)适体处理时阻抗值变化的结果。
具体实施方式
由于付出了巨大的努力来开发能够替代针对6kDa早期分泌性抗原靶(ESAT6)的抗体的适体，本发明的发明人在细菌表达系统中表达了ESAT6，纯化了表达的ESAT6，以及通过指数富集(SELEX)技术，利用对配体的系统进化选择了适体，建立了DNA适体的序列和结构，以及确认了本发明中产生的DNA适体与6kDa早期分泌性抗原靶(ESAT6)蛋白特异性结合的能力，从而基于该发现完成了本发明。
在下文中，将详细描述本发明。
本发明提供一种与6kDa早期分泌性抗原靶(ESAT6)特异性结合的DNA适体，其中DNA适体由SEQ ID NO:6的核苷酸序列组成。
在本发明中，“6kDa早期分泌性抗原靶(ESAT6)”是由结核分枝杆菌产生的6kDa早期分泌性抗原靶，是一种分泌性蛋白和一种强效T细胞抗原。ESAT6通过QuantiFERON-TBGold(其是一种全血干扰素γ测试)与CFP10和TB7.7一起用于结核诊断，也已知直接结合TLR2受体并抑制下游信号转导。
如本文所用，术语“适体”是指对特定物质具有高特异性和亲和性的单链DNA(ssDNA)或RNA。使用先前开发的抗体的方法利用生物体的免疫系统，因此花费相对大量的时间和成本，并且由于这些抗体是蛋白，因此其稳定性有时是有问题的，而适体可以使用相对简单的方法合成并且靶向细胞、蛋白，甚至靶向小的有机物，从而能够开发使用适体的新检测方法，并且由于DNA适体与以前开发的抗体相比具有很高的特异性和稳定性，因此将其用于对ESAT6蛋白的特异性检测。优选地，适体可以由SEQ ID NO:6的核苷酸序列组成，但是本发明不限于此。
本发明还提供一种用于诊断结核的组合物，其包括DNA适体。
除了DNA适体外，本发明的组合物还可包含药理或生理学可接受的载体、赋形剂和稀释剂，并且可包含在该组合物中的载体、赋形剂和稀释剂的实例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、无定形纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、甲基羟基苯甲酸酯、丙基羟基苯甲酸酯、滑石粉、硬脂酸镁、矿物油等。当配制时、该组合物可以进一步包含常用的填充剂、增稠剂、粘合剂、崩解剂、表面活性剂、抗凝剂、润滑剂、湿润剂、香料、乳化剂、防腐剂等。
本发明还提供一种用于诊断结核的生物传感器，包括：对6kDa早期分泌性抗原靶(ESAT6)具有特异性的DNA适体；以及其上固定有DNA适体的板，其中DNA适体由SEQ ID NO:6的核苷酸序列组成。
其上固定有本发明的DNA适体的板可以由金属电极层和金属纳米颗粒层组成，并且电极层和纳米颗粒的材料可以被电场或磁场吸引，并且可以是任何能够改变电场的特性的材料，优选金(Au)，但是本发明不限于此。
在本发明的一个实施方案中，通过表达和纯化6kDa早期分泌性抗原靶(ESAT6)蛋白来鉴定特异性结合序列(参见实施例1至3)，并且筛选与ESAT6蛋白具有强结合能力的适体(参见实施例4)。另外，基于上述实验结果，通过荧光测量蛋白与适体之间的结合力，并且通过EMSA方法测量适体是否实际上与ESAT6蛋白结合(参见实施例5和6)，并且通过其结果，使用EIS方法，利用发现的DNA适体来制造用于检测ESAT6的生物传感器。还确认了生物传感器对ESAT6蛋白也具有非常高的结合特异性，因此可以用作一种提供用于诊断结核的信息的方法(参见实施例8)。
因此，本发明提供一种提供用于诊断结核的信息的方法，该方法包括：(1)用生物传感器处理受试者样本；以及(2)测量与生物传感器结合的6kDa早期分泌性抗原靶(ESAT6)的水平。
在本发明中，受试者不受限制，只要该受试者是需要诊断结核的个体即可，并且个体包括哺乳动物和非哺乳动物，并且哺乳动物包括小鼠、牲畜、人类等，但是优选人类。
另外，在本发明中，受试者样本可以是需要诊断结核的个体的血液，并且血液可以是全血、血清、血浆或血液单核细胞。
实施例
在下文中，将描述示例性实施例以帮助理解本发明。然而，提供以下实施例以促进对本发明的理解，而无意于限制本发明的范围。
实施例1.ESAT6基因克隆
为了扩增6kDa早期分泌性抗原靶(ESAT6)的基因，使用正向引物和反向引物，该正向引物包括BamH1限制酶识别序列[5'-CCC GGATCC ATG ACA GAG CAG CAG TGG AAT TT3'(SEQ ID NO:1)]，该反向引物包括Hind3限制酶识别序列[5'CCC CCA AGC TTC TAT GCGAAC ATC CCA GTG A3'(SEQ ID NO:2)]。
结核分枝杆菌H37Rv的基因组DNA用作基因扩增的模板，并且使用i-pfu聚合酶通过聚合酶链反应(PCR)扩增。PCR的各过程如下：1)于98℃孵育20秒，作为使双链DNA变性为模板的过程；2)于57℃孵育20秒，作为用引物使模板退火的过程；3)于72℃孵育30秒，作为延伸新链的过程，以及重复这些过程的循环30次。
通过与限制酶和DNA连接酶反应，将扩增的ESAT6基因克隆到含有(His)6-标签的pET32a载体中，以及用该载体转化BL21(DE3)大肠杆菌细胞。
实施例2.ESAT6蛋白的表达
将用ESAT6基因转化的BL21(DE3)细胞在Luria Bertani(LB)培养基中培养，并于37℃培养，直到在UV 600nm处的光密度(OD)达到0.563。此后，加入异丙基-硫代-b-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)至最终浓度为20mM以诱导该蛋白的表达，然后于37℃孵育4小时。通过SDSPAGE确认该蛋白的表达，以及使用离心机将细胞从培养基中分离，并用PBS(10mM磷酸钠，150mM NaCl，pH 8.0)缓冲液洗涤一次。
实施例3.ESAT6蛋白的纯化
为了以高纯度纯化在细菌细胞BL21(DE3)中表达的ESAT6蛋白，将细胞在细胞裂解缓冲液(20mM Tris，500mM NaCl，0.5mMβ-巯基乙醇，5％甘油，pH 8.0)中裂解，然后用超声仪超声15分钟使其破裂。使用离心机以18,000rpm分离40分钟，以从细胞中分离处于水溶液状态的蛋白。
离心后，将沉淀物添加到含有8M尿素(8M尿素，20mM Tris-HCl，500mM NaCl，15mM咪唑，0.5mMβ-巯基乙醇，5％甘油，pH 8.0)的复性缓冲液中并允许在其中溶解。使用离心机以18,000rpm进行分离50分钟，以从细胞中分离以水溶液状态溶解的蛋白。
此外，为了获得高纯度蛋白，利用了镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)和(His)6-标签氨基酸之间的结合特性。具体地，如图1所示，将Ni-NTA柱连接至快速蛋白液相色谱(FPLC)系统，并且将水溶液状态的ESAT6流入该柱中，从而使ESAT6与其结合。由于与Ni-NTA柱结合的蛋白的(His)6-标签与咪唑化合物竞争性结合，以将靶蛋白与柱分离，因此将洗脱缓冲液(20mM Tris，500mM NaCl，0.5mMβ-巯基乙醇，5％甘油，300mM咪唑，pH 8.0)依次流入柱，从而分离出高纯度的ESAT6。
此外，进行另外的纯化以从分离的蛋白中获得更高纯度的蛋白，并将MonoQ柱(其是根据蛋白的pI值进行分离的离子交换柱)连接到FPLC系统，然后使蛋白水溶液流入其中。在与柱结合后，再次分离ESAT6，同时依次流入洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl，1M NaCl，0.5mMβ-巯基乙醇，5％甘油，pH 8.00)，从而提高纯度。结果，如图1所示，可以观察到高纯度的重组ESAT6蛋白。
实施例4.使用SELEX筛选用于ESAT6蛋白的适体
4-1.单链DNA(ssDNA)文库的制备
设计了合成文库[5'-CACCTAATACGACTCACTATAGCGGATCCGA-N40-CTGGCTCGAACAAGCTTGC-3'(SEQ ID NO:3)]，其两端具有用于PCR扩增和克隆的引物的结合序列，并且中间具有含40个随机DNA碱基的90个序列。另外，为了PCR扩增和ssDNA产生，使用了正向引物[5'-CAC CTA ATA CGA CTC ACT ATA GCG GA-3'(SEQ ID NO:4)]，反向引物[5'-GCA AGC TTG TTC GAG CCA G-3'(SEQ ID NO:5)]，以及生物素偶联的反向引物(5'-生物素-GCA AGC TTG TTC GAG CCA G-3')。此处使用的所有寡核苷酸均由Bionics(韩国)合成并进行PAGE纯化。
4-2.将ESAT6固定在Ni-NTA磁珠上
使用Dynalbeads(挪威Invitrogen)将纯化的ESAT6固定在珠上，这些珠是磁珠，其表面覆盖有钴并与蛋白的His标签结合。
具体而言，将1,500皮摩尔蛋白溶解在100μL蛋白结合缓冲液(20mM Tris，50mMNaCl，5mM KCl，5mM MgCl2、0.01％吐温20，pH 8.0)中，使用外部磁体，用结合缓冲液洗涤20μL珠，然后使它们之间在室温下发生反应1小时，从而将蛋白固定在这些珠上。
4-3.选择对ESAT6具有特异性的适体
进行了使用磁性的特定分离方法，以选择对ESAT6具有特异性的适体。
具体而言，首先，为了形成最稳定的ssDNA结构，将溶解于100μL结合缓冲液中的ssDNA文库(100皮摩尔)于90℃孵育3分钟，然后于4℃预孵育30分钟。随后，在将ssDNA文库与固定在磁珠上的ESAT6蛋白轻轻摇动的同时，使它们之间发生反应1小时。然后，将这些珠用结合缓冲液洗涤两次以除去不与结合至这些珠的ESAT6蛋白结合的ssDNA。
之后，为了从磁珠中分离结合蛋白的ssDNA，用洗脱缓冲液(20mM Tris，50mMNaCl，5mM KCl，5mM MgCl2、0.01％吐温20，300mM咪唑，pH 8.0)洗脱蛋白和结合蛋白的ssDNA。使用乙醇沉淀洗脱的ssDNA，然后将其溶于60μL蒸馏水中，之后使用正向引物和生物素偶联的反向引物通过使用i-pfu聚合酶(韩国Intron Biotechnology)的PCR进行扩增。为了产生用于后续选择过程的ssDNA，在偶联缓冲液(5mM Tris-HCl，0.5mM EDTA，1M NaCl，0.0025％吐温20，pH 7.5)存在下，将生物素偶联的PCR产物与涂覆有与生物素结合的链霉亲和素的磁珠一起孵育1小时。孵育后，为了仅分离出ssDNA，将所得产物用100μl的200mMNaOH孵育5分钟，仅获得了使用外部磁体选择的ssDNA。此外，在下一个选择中使用第一个选择的ssDNA重复选择。此时，为了严格选择，进一步降低了ssDNA的量和ESAT6的浓度，并使用UV光谱仪(Biochrom Libra S22光谱仪)测量重复选择中洗脱的ssDNA的浓度，以确认剩余ssDNA和ESAT6之间的结合程度，并进行选择过程。结合度(％)示于图2。
4-4.适体测序
使用未修饰的正向引物和反向引物通过PCR扩增第15次重复选择的ssDNA，并将其克隆到pENTR/TOPO载体(美国Invitrogen的TOPO TA克隆试剂盒)中，然后将大肠杆菌TOP10细胞(美国Invitrogen)用该载体转化。使用Miniprep试剂盒(德国MACHEREY-NAGEL)纯化插入有ssDNA的克隆物，之后测序(韩国COSMO Genetech)。结果，分析了下面表1中所示的EG11(44)适体序列(SEQ ID NO:6)。
表1
Figure BDA0002424773250000111
实施例5.使用荧光测量法测量蛋白与适体之间的结合力
将400皮摩尔的ESAT6与10μL磁珠混合，然后在100μL的结合缓冲液(20mM Tris，50mM NaCl，5mM KCl，5mM MgCl2，pH8.0)中孵育1小时。为了分离未结合的ESAT6，用结合缓冲液洗涤两次。随后，将所得混合物与各种浓度的Cy3标记的适体一起孵育，并通过洗涤除去未结合的适体。通过仅分离与ESAT6结合的Cy3标记的ssDNA，通过荧光测量(美国PerkinElmer的1420Victor Multilabel计数器)来测量与固定有ESAT6的磁珠结合的Cy3标记的ssDNA适体的量。结果，如下面图3和表2所示，测量具有EG11(44)碱基序列的DNA适体的Kd值。
表2
适体 Kd(nM)
EG11(44) 31.4±4.3
实施例6.使用EMSA测量与ESAT6蛋白的结合
为了测量通过实施例4的指数富集(SELEX)技术通过配体的系统进化而选择的EG11(44)适体是否实际上与ESAT6蛋白结合，本发明的发明人通过电泳迁移率测定(EMSA)方法确认了结合的存在或不存在。将5μM的重组ESAT6蛋白和1μM的EG11(44)、EG10和EG12适体在室温下于20μL的结合缓冲液中孵育1小时，然后在6％丙烯酰胺凝胶上电泳。作为SYBR绿色和考马斯亮蓝染色的结果，如图4所示，确认了开发的EG11(44)适体与ESAT6的结合优于EG10和EG12适体。
实施例7.检测条件的优化和生物传感器的制造
为了使用实施例4中发现的DNA适体来检测ESAT6，使用电化学阻抗谱(EIS)技术设计了具有优异检测灵敏度的生物传感器。图5是使用本发明的DNA适体检测ESAT6蛋白的生物传感器的示意图。
首先，将金纳米颗粒吸附到金电极上，然后将DNA适体结合到电极上，从而完成了用于检测ESAT6的生物传感器的制造。这样，当金电极涂覆有金纳米颗粒时，其表面积增加，因此更多的DNA适体可以结合到电极上。随后，当添加含有ESAT6的样本并且使适体和ESAT6彼此结合时，ESAT6蛋白阻断了电子的流动，因此观察到阻抗增加的现象，并且此时，由于阻抗增加和结合的ESAT6蛋白的量之间存在相关性，因此可进行定量分析。
然后，基于电化学，使用所选择的EG11(44)适体检测重组的ESAT6。结果，如图6a和6b所示，根据奈奎斯特方程式确认，随着ESAT6的浓度增加(1pM至10nM)，阻抗值增加(参见图6a)。将根据奈奎斯特方程式获得的阻抗值设为y轴，将ESAT6浓度的Log值设为x轴，从而得到曲线图，确认了使用制造的生物传感器定量地进行了ESAT6检测，并且检测极值为1.15fM(参见图6b)。
实施例8.用于ESAT6检测的适体的结合特异性的确认
为了将DNA适体用作生物传感器，重要的是其与血液中靶ESAT6以外的各种蛋白不发生反应的结合特异性，因此为了确认DNA适体是否与ESAT6选择性结合，检查了其与各种蛋白样本的结合特异性。此时，将每种蛋白以10pM的浓度与PBS混合并用于检测。
结果，如图7所示，确认了DNA适体对ESAT6蛋白具有优异的特异性。特别地，已经确认，尽管已知ESAT6在具有结核分枝杆菌的宿主中过表达并且是已知通过与ESAT6、CFP-10或TB7.7形成复合物起作用的结核分枝杆菌特异性蛋白，但是ESAT6不与在本发明中开发的DNA适体结合。这意味着本发明的DNA适体与ESAT6以高结合特异性反应。
此外，为了确认这是否适用于临床样本，在固定有EG11(44)适体的电极上处理正常个体和结核患者的10ng/ml每种血清样本，结果如图8所示，确认了，与正常个体相比，结核患者的阻抗值更高。
以上结果表示，本发明开发的DNA适体EG11(44)不仅对ESAT6具有非常高的结合特异性，还可以作为生物传感器在复杂的生物样本中使用。
作为参考，本发明的序列表显示在下表3中。
表3
Figure BDA0002424773250000131
Figure BDA0002424773250000141
仅出于说明目的提供本发明的上述描述，并且本发明所属领域的普通技术人员将理解，在不改变本发明的技术精神或基本特征的情况下，可以容易地将本发明修改为其他特定形式。因此，上述实施方案的提供应被解释为仅出于说明的目的，而不是出于限制的目的。
工业适用性
本发明的DNA适体靶向在结核分枝杆菌中表达的ESAT6，并且对该靶表现出高亲和力，而对除该靶之外的物质表现出低结合能力，因此，当用于诊断结核时，排除了假阴性反应和假阳性反应，从而获得更准确的诊断结果。因此，本发明的DNA适体、用于使用该DNA适体来诊断结核的组合物、用于诊断结核的生物传感器、诊断结核的方法等能够在诊断结核中提供高可靠性结果，因此，有望替代使用现有抗体的ELISA方法和使用现有适体的诊断结核的方法而广泛用于诊断结核。
<110> MD奥图斯公司
<120> 特异性结合ESAT6(6 kDa早期分泌性抗原靶)的DNA适体及其用途
<130> MPCT18-054
<150> KR 1020170123384
<151> 2017-09-25
<160> 6
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ESAT6正向引物
<400> 1
cccggatcca tgacagagca gcagtggaat tt 32
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ESAT6反向引物
<400> 2
cccccaagct tctatgcgaa catcccagtg a 31
<210> 3
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ssDNA文库
<400> 3
cacctaatac gactcactat agcggatccg anctggctcg aacaagcttg c 51
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 4
cacctaatac gactcactat agcgga 26
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 5
gcaagcttgt tcgagccag 19
<210> 6
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EG11(44)适体
<400> 6
cgaggtagct tacccgctta tgttcactgt gggttgctgg ctcg 44

Claims (10)

1.一种与6kDa早期分泌性抗原靶(ESAT6)特异性结合的DNA适体，其中所述DNA适体由SEQ ID NO:6的核苷酸序列组成。
2.根据权利要求1所述的DNA适体，其中所述ESAT6在结核分枝杆菌H37Rv中表达。
3.一种用于诊断结核的组合物，所述组合物包括根据权利要求1所述的DNA适体。
4.一种用于诊断结核的生物传感器，所述生物传感器包括：对6kDa早期分泌性抗原靶(ESAT6)具有特异性的DNA适体；以及其上固定有所述DNA适体的板，其中所述DNA适体由SEQID NO:6的核苷酸序列组成。
5.根据权利要求4所述的生物传感器，其中所述板由金属电极层和金属纳米颗粒层组成。
6.根据权利要求5所述的生物传感器，其中所述金属包括金(Au)。
7.一种提供用于诊断结核的信息的方法，所述方法包括：
(1)用根据权利要求4所述的生物传感器处理受试者样本；以及
(2)测量与所述生物传感器结合的6kDa早期分泌性抗原靶(ESAT6)的水平。
8.一种诊断结核的方法，所述方法包括使根据权利要求1或2所述的DNA适体与受试者样本接触。
9.一种诊断结核的方法，所述方法包括：用根据权利要求4所述的生物传感器处理受试者样本；以及测量与所述生物传感器结合的6kDa早期分泌性抗原靶(ESAT6)的水平。
10.DNA适体用于诊断结核的用途，所述DNA适体与6kDa早期分泌性抗原靶(ESAT6)特异性结合并由SEQ ID NO:6的核苷酸序列组成。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113227378A (zh) * 2018-12-19 2021-08-06 Md保健株式会社 与登革病毒ediii特异性结合的dna适配体及其用途

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102016668B1 (ko) * 2018-12-19 2019-08-30 주식회사 엠디헬스케어 치쿤군야 바이러스 e2에 특이적으로 결합하는 dna 압타머 및 이의 용도
CN111218449A (zh) * 2020-01-17 2020-06-02 上海孚清生物科技有限公司 一种结核分枝杆菌核酸适配子及其制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102719438A (zh) * 2012-07-12 2012-10-10 章晓联 一种能特异结合结核菌抗原的核酸适配子及其应用
CN106047882A (zh) * 2016-06-01 2016-10-26 湖南大学 一组特异性结合结核分枝杆菌的核酸适配体及其应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011014989A1 (zh) 2009-08-05 2011-02-10 中国人民解放军第三O九医院 靶向结核分枝杆菌Ag85B的寡核苷酸适配子及其制备方法和应用
GB2489504A (en) * 2011-03-31 2012-10-03 Sapient Sensors A device for identifying the presence of a specific target molecule or biomarker by sensing an electrical property
KR101698654B1 (ko) 2014-12-24 2017-01-20 포항공과대학교 산학협력단 En2에 특이적으로 결합하는 dna 압타머 및 이의 용도

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102719438A (zh) * 2012-07-12 2012-10-10 章晓联 一种能特异结合结核菌抗原的核酸适配子及其应用
CN106047882A (zh) * 2016-06-01 2016-10-26 湖南大学 一组特异性结合结核分枝杆菌的核酸适配体及其应用

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113227378A (zh) * 2018-12-19 2021-08-06 Md保健株式会社 与登革病毒ediii特异性结合的dna适配体及其用途
CN113227378B (zh) * 2018-12-19 2023-11-24 Md保健株式会社 与登革病毒ediii特异性结合的dna适配体及其用途

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