KR102063292B1

KR102063292B1 - α-시누클레인 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102063292B1
Application number: KR1020190016585A
Authority: KR
Inventors: 김양훈; 신우리; 오인환; 이진표
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2019-02-13
Filing date: 2019-02-13
Publication date: 2020-01-07

Abstract

본 발명은 α-시누클레인 단백질에 특이적으로 결합하고 특정 폴리뉴클레오티드 서열로 구성되는 DNA 앱타머 및 상기 DNA 앱타머의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 DNA 앱타머는 α-시누클레인(α-synuclein) 단백질에 특이적으로 강하게 결합하고, 이와 같은 결합은 인체 시료에서도 동일하게 나타남으로써, 상기 DNA 앱타머는 루이소체 질환의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

α-시누클레인 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도{DNA APTAMERS SPECIFICALLY BINDING TO α-SYNUCLEIN PROTEIN AND USE THEREOF}

본 발명은 α-시누클레인 단백질에 특이적으로 결합하고 특정 폴리뉴클레오티드 서열로 구성되는 DNA 앱타머 및 상기 DNA 앱타머의 용도에 관한 것이다.

루이소체(lewy body) 질환은 시누클레인병증으로도 알려져 있으며, 여기에는 파킨슨병, 다발성 시스템 위축증(MSA) 또는 루이소체를 갖는 치매 등이 포함된다. 또한, 루이소체 질환은 도파민 작용성 시스템의 퇴화, 인지 손상, 루이소체 및 루이 신경돌기의 형성 등의 특징을 나타낸다.

이와 같은 루이소체 질환의 하나인 파킨슨병(parkinson's disease)은 신경퇴행성 질환의 하나로, 치매 및 뇌졸중과 더불어 3대 노인성 질환의 하나이다. 파킨슨병은 일반적으로 인구 1,000명 당 1~2명 정도의 비율도 발병하는 것으로 추정되나, 최근 인구의 고령화에 따라 전 세계적으로 발병률이 증가하고 있다.

중뇌 흑질(substantia nigra) 부위의 도파민 세포 사멸이 파킨슨병의 직접적인 원인으로 잘 알려져 있다. 그러나, 도파민 세포를 사멸시키는 정확한 원인은 밝혀지지 않았으며, 유전적 요인 및 환경적 요인이 복합적으로 관여하는 것으로 예상된다. 파킨슨병은 몸이 떨리는 증상, 몸의 움직임이 느려지는 증상 및 몸이 굳는 증상의 3가지 증상을 보이며, 이들 증상은 파킨슨병의 진행에 따라 악화된다. 이외에도 신경계의 이상으로 배뇨장애, 변비, 수면장애 및 정서적 장애 등의 증상을 나타낸다.

파킨슨병은 생전에 부검 또는 생검을 통해 확인할 수 없어, 전적으로 전문인력을 통한 병력청취, 임상적 증상 및 신경학적 검사 소견에 의해 진단된다. 그러나, 진단 과정에서 파킨슨병과 혼동될 수 있는 다른 질환들로 잘못 진단되는 경우도 발생한다. 파킨슨병은 주로 약물 치료에 의존하고 있으나, 약물을 장기로 복용해야 하고 복용기간이 길어지면 내성이 생겨 다른 종류의 약물을 복용해야 효과를 나타낸다는 문제가 있다. 한편, 약물 치료 외에도 수술적 처지도 고려할 수 있으나, 수술 또한 영구적인 치료방법이 아니고 수술 후에도 파킨슨병이 재발할 수 있다.

이와 같이 파킨슨병은 그 치료방법의 부재로 이를 조기에 진단할 수 있는 방법의 개발이 요구된다. 이와 관련하여, 대한민국 특허공개 제10-2019-0009724호는 파킨슨병 동물 모델에서 특이적으로 발현이 감소 또는 증가되는 특정 서열을 갖는 miRNA를 이용하여 파킨슨병을 진단하는 방법을 개시하고 있다.

한편, α-시누클레인(α-synuclein) 단백질은 인간의 뇌에 풍부하게 존재하는 단백질로서, 심장, 근육 및 눈과 같이 다양한 조직에서 발견된다. 일반적으로 α-시누클레인 단백질은 신경세포의 말단에서 발견되는데, 정확한 기능은 밝혀지지 않았으나 신경전달물질의 방출에 관여하는 것으로 여겨진다. 최근 연구에 따르면, 정상인과 비교하여 파킨슨병 환자의 시료에서 α-시누클레인 단백질의 수치가 유의적으로 증가한 것이 확인되었다. 특히, 파킨슨병 환자는 α-시누클레인 단백질이 응집된 형태가 정상인에 비하여 5배 이상 증가하였다.

대한민국 특허공개 제10-2019-0009724호

본 발명의 목적은 α-시누클레인 단백질에 특이적으로 결합하고 특정 폴리뉴클레오티드 서열로 구성되는 DNA 앱타머를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 DNA 앱타머를 포함하는 루이소체(lewy body) 질환 진단용 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 진단용 조성물을 이용하여 루이소체 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 5로 기재된 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 코어서열을 포함하고 α-시누클레인(α-synuclein) 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 포함하는 루이소체(lewy body) 질환 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 진단용 조성물을 포함하는 루이소체 질환 진단용 키트를 제공한다.

나아가, 본 발명은 상기 진단용 조성물을 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 루이소체 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 DNA 앱타머는 α-시누클레인(α-synuclein) 단백질에 특이적으로 강하게 결합하고, 이와 같은 결합은 인체 시료에서도 동일하게 나타남으로써, 상기 DNA 앱타머는 루이소체 질환의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에서 랜덤 DNA 라이브러리 증폭 후 증폭된 PCR 산물(A), PCR 산물의 정제물(B), 및 비대칭 PCR 방법에 의해 증폭된 산물(C)을 아가로스 겔 전기영동을 통해 확인한 결과 도면이다(M: 사이즈마커).
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 수득된 DNA 앱타머와 α-시누클레인 단백질의 결합력을 SELEX 수행 횟수에 따라 확인한 결과 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서 수득된 DNA 앱타머와 α-시누클레인 단백질의 결합력을 나노드랍 방법으로 확인한 결과 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에서 선별된 5종류의 DNA 앱타머 구조를 이미지화한 결과 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에서 선별된 DNA 앱타머가 α-시누클레인 단백질에 특이적으로 결합하는 것을 나노드랍 방법으로 확인한 결과 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에서 선별된 DNA 앱타머가 α-시누클레인 단백질에 특이적으로 결합하는 것을 샌드위치 방법으로 확인한 결과 그래프(A) 및 상기 결과를 로그(log) 값으로 나타낸 그래프(B)이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에서 선별된 DNA 앱타머가 α-시누클레인 단백질에 특이적으로 결합하는 것을 샌드위치 방법으로 확인한 결과 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1 내지 5로 기재된 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 코어서열을 포함하고 α-시누클레인(α-synuclein) 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "α-시누클레인(α-synuclein) 단백질"은 약 140개의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드로서, KTKE 반복부 도메인, 비-아밀로이드 성분(NAC) 도메인 및 C-말단 산성 도메인으로 구성된다. 상기 α-시누클레인 단백질은 파킨슨병 환자에서 유의적으로 증가될 수 있다. 상기 α-시누클레인 단백질은 통상의 기술분야에 α-시누클레인 단백질이라고 알려진 어떠한 폴리펩티드 서열을 모두 포함할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 α-시누클레인 단백질은 서열번호 9로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "앱타머(aptamer)"는 특정 물질에 고친화성 및 특이성으로 결합할 수 있는 DNA 핵산분자를 의미한다. 상기 앱타머는 통상의 기술분야에 잘 알려진 방법으로 제조될 수 있고, 상기 방법은 필요에 따라 적절히 변형될 수 있다.

본 발명에 따른 DNA 앱타머는 서열번호 1 내지 5로 기재된 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 코어서열을 포함할 수 있다. 이때, 상기 DNA 앱타머는 코어서열의 5' 및 3' 말단에 추가로 염기서열을 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 DNA 앱타머는 코어서열의 5' 및 3' 말단에 각각 15 내지 25개, 15 내지 23개, 15 내지 20개, 15 내지 19개, 17 내지 25개, 17 내지 23개, 17 내지 20개, 17 내지 19개의 염기서열을 더 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 DNA 앱타머는 70 내지 90개, 70 내지 86개, 70 내지 80개, 70 내지 78개, 72 내지 90개, 72 내지 86개, 72 내지 80개 또는 72 내지 78개의 염기서열로 구성될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 코어서열의 5' 및 3' 말단에 추가로 포함되는 염기서열은 각각 서열번호 6 및 7로 기재된 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 DNA 앱타머는 이의 5' 및 3' 말단에 추가 염기서열을 포함하는, 서열번호 10 내지 14로 기재된 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

본 발명에 따른 DNA 앱타머 및 폴리뉴클레오티드는 이와 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상 상동성을 갖는 염기서열도 모두 포함할 수 있다.

상기 DNA 앱타머는 표적 물질에 대한 결합성 및 안정성을 높이기 위해, 각 뉴클레오티드의 당 잔기, 구체적으로 리보오스 또는 디옥시리보스가 수식될 수 있다. 상기 수식은 당 잔기의 2'위치, 3'위치 및 4'위치로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 산소 원자를 다른 원자로 치환한 것일 수 있다. 수식의 예로는 플루오로화, O-알킬화, O-알릴화, S-알킬화, S-알릴화, 아미노화 등이 포함될 수 있다. 상기와 같은 당 잔기의 변형은 통상적인 방법으로 수행될 수 있다.

또한, 상기 DNA 앱타머는 표적 물질에 대한 결합성을 높이기 위해, 핵산염기가 변형될 수 있다. 상기 핵산염기의 변형은 5위치의 피리미딘 변형, 6위치의 푸린 변형, 8위치의 푸린 변형, 환외(環外) 아민에서의 변형, 4-티오우리딘으로의 치환, 5-브로모로의 치환 또는 5-요오드-우리실로의 치환 등을 포함할 수 있다.

또한, 상기 DNA 앱타머는 뉴클레아제 및 가수분해효소 등에 대해 내성을 갖도록 인산기가 변형될 수 있다. 예를 들면, 상기 인산기는 티오에이트, 디티오에이트, 아미데이트, 포름아세탈, 3'-아민 등으로 치환될 수 있다. 나아가, 상기 DNA 앱타머는 3' 말단 또는 5' 말단의 변형을 포함할 수 있고, 상기 변형은 캡핑이나, 바이오티닐, 폴리에틸글리콜, 아미노산, 펩티드, 핵산, 뉴클레오시드, 미리스토일(myristoyl), 리소콜릭-올레일(lithocolic-oleyl), 도코사닐(docosanyl), 라우로일(lauroyl), 스테아로일(stearoyl), 팔미토일(palmitoyl), 올레오일(oleoyl), 리놀레오일(linoleoyl), 지질, 스테로이드, 콜레스테롤, 카페인, 비타민, 색소, 형광물질, 항암제, 독소, 효소, 방사성 물질, 비오틴 등이 부가된 것일 수 있다.

상기 DNA 앱타머는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 DNA 앱타머는 서열번호 1 내지 5로 기재된 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 코어서열을 포함하고 α-시누클레인 단백질에 특이적으로 결합할 수 있다. 이때, 상기 코어서열은 이의 5' 및 3' 말단에 추가로 염기서열을 더 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 5' 및 3' 말단에 추가되는 염기서열은 각각 서열번호 6 및 7로 기재된 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어, "루이소체(lewy body) 질환"은 도파민 작용성 시스템의 퇴화, 운동 변경, 인지 손상 및 루이소체의 형성을 특징으로 갖는 질환을 의미한다. 루이소체는 신경 세포에서 발견된 구형 단백질 침착물로서, 이에 의해 아세틸콜린 및 도파민과 같은 화학적 메신저의 작용을 중단시키는 뇌의 기능이 파괴될 수 있다. 상기 루이소체 질환은 파킨슨병, 다발성 시스템 위축증(MSA) 또는 루이소체를 갖는 치매일 수 있고, 구체적으로 파킨슨병일 수 있다.

상기 진단용 조성물에 포함되는 DNA 앱타머는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지된 접합체일 수 있다. 발색효소는 퍼록시다제, 알칼라인 포스파타제 또는 산성 포스파타제일 수 있고, 형광물질은 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2',7'-디클로로플루오레신-5-일, 2',7'-디클로로플루오레신-6-일, 디하이드로 테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸, Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(RITC), PE(Phycoerythrin) 또는 로다민일 수 있다.

또한, 상기 DNA 앱타머는 상기 DNA 앱타머에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함할 수 있다. 상기 리간드는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지된 접합체, 및 스트렙타비딘 또는 아비딘이 처리된 리간드일 수 있다. 본 발명의 진단용 조성물은 상기 서술한 바와 같은 시약 외에도 이들의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 더 포함할 수 있다.

상기 루이소체 질환은 파킨슨병, 다발성 시스템 위축증(MSA) 또는 루이소체를 갖는 치매일 수 있고, 구체적으로 파킨슨병일 수 있다.

본 발명에 따른 진단용 키트는 이에 포함되는 DNA 앱타머의 세척이나 복합체의 분리 등과 같은 이후 단계를 용이하게 하기 위해 고형 기질에 결합될 수 있다. 이때, 고형 기질로는 합성수지, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 또는 미세비드가 사용될 수 있다. 또한, 합성수지로는 폴리에스터, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, PVDF 또는 나일론 등이 사용될 수 있다.

또한, 상기 키트는 당업자에게 알려진 종래의 제조방법에 의해 제조될 수 있으며, 버퍼, 안정화제, 불활성 단백질 등을 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 시약의 양을 탐색하기 위해 검출체로서 부착된 형광물질의 형광을 검출함으로써 수행되는 형광법 또는 검출체로서 부착된 방사선 동위원소의 방사선을 검출함으로써 수행되는 방사선법을 통한 초고속 스크리닝(high throughput screening, HTS) 시스템, 검출체의 표지 없이 표면의 플라즈몬 공명 변화를 실시간으로 측정하는 SPR(surface plasmon resonance) 방법 또는 SPR 시스템을 영상화하여 확인하는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 방법을 이용할 수 있다.

본 발명에 따른 방법에 사용되는 진단용 조성물은 α-시누클레인 단백질에 특이적으로 결합하는 본 발명에 따른 DNA 앱타머를 포함할 수 있고, 상기 DNA 앱타머는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 방법에서, 상기 시료는 α-시누클레인 단백질을 검출하고자 하는 시료라면 모든 시료를 포함할 수 있다. 일례로, 상기 시료는 포유동물 유래 시료일 수 있고, 구체적으로 인간 유래 시료일 수 있다. 또한, 상기 시료는 혈액, 타액, 누액, 요액, 활액, 점액, 세포 및 조직으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

또한, 상기 시료는 본 발명에 따른 방법에 사용되기 전에 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 연속추출, 원심분리 또는 젤 전기영동 등의 방법을 이용하여 전처리될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다, 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명이 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 청구범위에 기재된 기술적 사상과 실질적으로 동일한 구성을 갖고 동일한 작용 효과를 이루는 것은 어떠한 것이라도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.

실시예 1. 랜덤 DNA 라이브러리의 증폭

α-시누클레인(α-synuclein) 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하기 위해, 먼저 하기에 기재된 바와 같이 DNA 라이브러리를 제조하였다.

구체적으로, dA:dG:dC:dT가 1.5:1.15:1.25:1의 비율로 포함된 40개의 랜덤 염기서열(N₄₀)을 포함하는 76 bp 크기의 주형 DNA(서열번호 8: 5'-ATACCAGCTTATTCAATTN₄₀AGATAGTAAGTGCAATCT-3')와 이에 대한 정방향 프라이머(서열번호 6: 5'-ATACCAGCTTATTCAATT-3') 및 5'-말단에 바이오티닐화된 역방향 프라이머(서열번호 7: 5'-AGATAGTAAGTGCAATCT-3')를 바이오니아 사(한국)에 주문제작하였다. 1 ㎕의 주형 DNA, 5 ㎕의 10x PCR 완충용액, 4 ㎕의 2.5 mM dNTP 혼합물, 2 ㎕의 25 μM 정방향 프라이머, 2 ㎕의 25 μM 역방향 프라이머, 0.25 ㎕의 ExTaq 중합효소(Takara, 일본)(1 unit/㎕) 및 35.75 ㎕의 증류수를 혼합하여 PCR 반응물을 준비하였다. 준비된 반응물을 하기 표 1에 기재된 바와 같은 조건으로 PCR을 수행하고, 수득된 PCR 산물을 PCR 정제키트(Qiagen, 미국)를 사용하여 정제하였다. 그 결과, PCR 산물과 PCR 정제키트로 정제된 DNA를 각각 2% 아가로스 겔 전기영동을 통해 확인하고, 그 결과를 도 1A 및 1B에 나타내었다.

초기 변성 단계	95℃, 5분	1회
변성 단계	95℃, 30초	20회
어닐링(annealing) 단계	55℃, 30초
연신(elongation) 단계	72℃, 30초
후기 연신 단계	72℃, 7분	1회

도 1A 및 1B에 나타난 바와 같이, PCR 증폭 및 정제에 의해 76 bp 크기의 PCR 산물이 생성 및 정제되었다.

실시예 2. 단일가닥 DNA의 증폭

상기 수득된 76 bp 크기의 PCR 산물로부터 DNA 앱타머를 제조하기 위해, 단일가닥 DNA(single-strand DNA, ssDNA)를 비대칭(asymmetric) PCR 방법으로 증폭시켰다.

먼저, 7 ㎕의 실시예 1에서 수득된 PCR 산물, 10 ㎕의 10× PCR 완충용액, 8 ㎕의 2.5 mM dNTP 혼합물, 10 ㎕의 25 μM 정방향 프라이머, 2 ㎕의 25 μM 역방향 프라이머, 0.5 ㎕의 ExTaq 중합효소(Takara, 일본)(1 unit/㎕) 및 62.5 ㎕의 증류수를 혼합하여 PCR 반응물을 준비하였다. 준비된 반응물을 하기 표 2에 기재된 바와 같은 조건으로 PCR을 수행하였다. 수득된 PCR 산물을 2% 아가로스 겔 전기영동을 통해 확인하고, 통상적인 방법으로 PCI 추출 및 에탄올 침전을 수행하여, ssDNA 풀을 회수하였다.

초기 변성 단계	95℃, 5분	1회
변성 단계	95℃, 30초	15회
어닐링(annealing) 단계	55℃, 30초
연신(elongation) 단계	72℃, 30초
후기 연신 단계	72℃, 7분	1회

구체적으로, 페놀:클로로포름:이소아밀알콜이 25:24:1의 부피비로 혼합된 PCI 용액을 PCR 산물과 동일 부피로 첨가하고, 강하게 교반하였다. 교반 후, 이를 4℃, 13,000 rpm의 조건하에서 15분 동안 원심분리하고 상층액을 수득하였다. 수득된 상층액에 이의 1/100 부피의 tRNA(Sigma aldrich, 미국) 및 3 부피의 100% 에탄올을 첨가하고 -70℃에서 1시간 이상 반응시켰다. 반응 후, 이를 4℃, 13,000 rpm의 조건하에서 20분 동안 원심분리하고 펠렛을 수득하였다. 수득된 펠렛을 65℃에서 건조시킨 뒤, 50 ㎕의 증류수에 현탁하여 ssDNA를 수득하였다. 수득된 ssDNA를 2% 아가로스 겔 전기영동을 통해 확인한 결과를 도 1C에 나타내었다.

도 1C에 나타난 바와 같이, 비대칭 PCR 방법에 의해 76 bp 크기의 ssDNA가 증폭되었다.

실시예 3. ssDNA의 회수

상기에서 수득된 ssDNA 중에서 바이오틴이 결합된 이중가닥 DNA(dsDNA) 및 ssDNA를 제거하고 순수한 정방향의 ssDNA를 확보하기 위해, 하기와 같이 가열-냉각(heating-cooling) 기법을 수행하였다.

구체적으로, 실시예 2에서 수득된 ssDNA에 50 ㎕의 증류수를 첨가한 후, 이를 85℃에서 5분 동안 반응시켜 dsDNA를 ssDNA로 변성시킨 후, 이를 4℃로 냉각하여 ssDNA를 수득하였다. 수득된 ssDNA는 즉시 4℃에 냉각시켰다. 냉각된 ssDNA에 50 ㎕의 스트렙타비딘 아가로즈 레진(streptavidin agarose resin, Thermo scientific, 미국)을 첨가하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, 상기 반응액을 4℃, 13,000 rpm의 조건하에서 10분 동안 원심분리하고, 상층액만을 취하였다. 수득된 상층액을 이용하여 상기 실시예 2에 기재된 바와 동일한 방법 및 조건으로 PCI 추출 및 에탄올 침전을 수행하여 ssDNA를 최종 수득하였다. 수득된 ssDNA를 10% 아가로스 겔 전기영동을 통해 확인하였다.

실시예 4. 3차원 구조의 DNA 앱타머 제작

실시예 3에서 수득된 40 ㎕의 ssDNA에 60 ㎕의 증류수 및 100 ㎕의 20 mM PBS(pH 7.2)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 85℃에서 5분 동안 끓여 변성시킨 후, 상온에서 1시간 이상 방치하여 서서히 식힘으로써, ssDNA로부터 3차원 구조의 DNA 앱타머를 제작하였다.

실시예 5. α-시누클레인 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머의 선별

5-1. α-시누클레인 단백질 고정 복합체의 제작

SELEX 기법을 이용하여 α-시누클레인 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하기 위해, 다음과 같은 방법으로 에폭시-활성화된 세파로스 6B 레진(epoxy-activated sepharose 6B resin)를 사용하여 α-시누클레인 단백질이 고정된 복합체를 제작하였다.

먼저, 아민기(-NH), 티올기(-SH) 및 하이드록시기(-OH)를 함유하는 리간드와 공유 결합을 형성하는, 0.01 g의 에폭시-활성화된 세파로스 6B 레진 파우더(GE Healthcare, 미국)를 1 ㎖의 증류수에 넣어 강하게 교반하였다. 교반 후, 이를 4℃, 13,000 rpm 조건하에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 상층액을 제거한 뒤, 500 ㎕의 커플링 완충액(coupling buffer)(100 mM NaHCO₃, 500 mM NaCl) 및 α-시누클레인 단백질(ab189694, Abcam, 미국)을 50 pmol이 되도록 10 mM PBS(pH 7.2)에 용해시킨 용해액을 첨가하여 반응시켰다. 반응이 끝난 뒤, 4℃, 13,000 rpm 조건하에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 제거함으로써, α-시누클레인 단백질이 고정된 에폭시-활성화된 세파로스 6B 레진을 제작하였다.

5-2. α-시누클레인 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머의 선별

α-시누클레인 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 SELEX를 수행하여 다음과 같이 선별하였다.

먼저, 200 ㎕의 실시예 4에서 제작된 3차원 구조의 DNA 앱타머를 실시예 5-1에서 제작된 α-시누클레인 단백질이 고정된 에폭시-활성화된 세파로스 6B 레진에 첨가하여 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 레진을 10 mM PBS(pH 7.2)를 이용하여 3회 세척함으로써 레진과 결합하지 않은 DNA 앱타머를 제거하였다. 세척한 레진에 10 mM PBS(pH 7.2)를 첨가하고, 85℃에서 5분 동안 방치함으로써, 레진에 결합된 DNA 앱타머를 변성시켰다. 이후, 이를 4℃, 13,000 rpm 조건하에서 10분 동안 원심분리하여 회수하였고, 회수는 2회 반복하였다. 순수한 DNA 앱타머만을 회수하기 위해, 수득된 DNA 앱타머를 이용하여 상기 실시예 2에 기재된 바와 동일한 방법 및 조건으로 PCI 추출 및 에탄올 침전을 수행함으로써, DNA 앱타머 풀을 수득하였다. 수득된 DNA 앱타머를 이용하여 상기와 동일한 조건 및 방법으로 SELEX를 4회 더 반복 수행함으로써, α-시누클레인 단백질에 대한 특이도가 향상된 DNA 앱타머 풀을 수득하였다.

5-3. 비특이적으로 결합하는 DNA 앱타머의 제거

α-시누클레인 단백질이 아닌, 에폭시-활성화된 세파로스 6B 레진에 결합하는 비특이적인 DNA 앱타머를 제거하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 이때, 실험은 실시예 5-2에서 수득된 5회의 SELEX를 통해 얻어진 DNA 앱타머 풀을 사용하여 수행되었고, α-시누클레인 단백질이 고정되지 않은 에폭시-활성화된 세파로스 6B 레진을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-2와 동일한 조건 및 방법으로 네가티브 SELEX(negative SELEX)을 수행하였다. 이때, DNA 앱타머는 상기 레진에 결합하지 않은 앱타머만을 수득하였다. 이후, 수득된 DNA 앱타머를 이용하여 다시 실시예 5-2의 과정을 3회 반복하여 최종적으로 α-시누클레인 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 수득하였다.

실시예 6. DNA 앱타머의 친화성 확인

α-시누클레인 단백질이 고정된 에폭시-활성화된 세파로스 6B 레진을 이용한 총 8회의 SELEX와 α-시누클레인 단백질이 고정되지 않은 에폭시-활성화된 세파로스 6B 레진을 이용한 1회의 네가티브 SELEX를 통해 각 라운드에서 수득된 DNA 앱타머의 α-시누클레인 단백질에 대한 친화성을 나노드랍(nano-drop) 방법으로 확인하였다.

구체적으로, 실시예 5에서 각 회별로 수득된 DNA 앱타머 샘플의 농도를 나노드롭(Nanodrop 2000 Micro spectrophotometer, Thermo scientific)을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 측정하였다. 이때, 대조군으로서는 실시예 5-3에서 네가티브 SELEX를 수행하여 수득한 DNA 앱타머를 사용하였다(NS).

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, α-시누클레인 단백질을 이용하여 SELEX를 7회 수행한 샘플(7R)이 165.6 ng/㎕, 8회 수행한 샘플(8R)이 121.4 ng/㎕의 농도를 나타내었다. 따라서, 상기로부터 SELEX를 7회 수행한 뒤 수득된 DNA 앱타머 풀이 α-시누클레인 단백질과 가장 특이적으로 결합함을 알 수 있었다.

실시예 7. DNA 앱타머의 서열 확인

상기에서 α-시누클레인 단백질과 가장 친화성을 높은것으로 확인된 7회의 SELEX 수득을 통해 얻은 DNA 앱타머의 서열을 다음과 같은 방법으로 확인하였다.

먼저, 상기 실시예 5에서 SELEX를 총 7회 수행하여 수득된 DNA 앱타머를 주형으로 정방향 프라이머(서열번호 6: 5'-ATACCAGCTTATTCAATT-3') 및 역방향 프라이머(서열번호 7: 5'-AGATAGTAAGTGCAATCT-3')를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 결과 이중가닥 형태의 DNA를 수득하고, 수득된 dsDNA는 T-블런트 클로닝 키트(SolGent, 한국)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 T-벡터에 클로닝하였다.

구체적으로, 1 ㎕의 T-벡터(10 ng/㎕), 4 ㎕의 PCR 산물(20 ng/㎕) 및 1 ㎕의 6× T-블런트 완충액을 25℃에서 5분 동안 반응시켰다. 반응 후, 6 ㎕의 반응물을 100 ㎕의 DH5α 수용성 균주와 혼합하고, 42℃에서 30초 동안 열충격을 가해 형질전환시켰다. 이를 2분 동안 얼음에 방치하고, 900 ㎕의 SOC 배지(2% 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM MgSO₄ 및 20 mM 글루코스)를 첨가하여 37℃에서 40분 동안 배양하였다. 200 ㎕의 배양액을 암피실린(Sigma Aldrich, 미국), 카나마이신(Sigma Aldrich, 미국), X-갈(X-gal, Sigma Aldrich, 미국) 및 IPTG(Thermo Scientific, 미국)가 포함된 LB 배양 플레이트에 스프레딩하였다. 이를 37℃에서 15시간 배양한 뒤, 생성된 콜로니 중 흰색 콜로니만 선별하여 통상적인 방법으로 DNA를 추출하고, 그 염기서열을 솔젠트 사(한국)에 의뢰하여 확인하였다.

그 결과, α-시누클레인 단백질에 특이적으로 결합하는 17종류의 DNA 앱타머 서열을 확인하였다.

실험예 1. α-시누클레인 단백질에 대한 DNA 앱타머의 친화력 확인-(1)

실시예 7에서 그 서열이 확인된 17종류의 DNA 앱타머 클론을 이용하여 상술한 바와 같이 3차원 구조를 갖는 DNA 앱타머를 제작하였다. 제작된 앱타머를 이용하여 실시예 6과 동일한 방법 및 조건으로 나노드랍을 수행하여 확인된 DNA 앱타머의 농도를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 3, 4, 9, 13 및 15번 DNA 앱타머 클론이 α-시누클레인 단백질과 결합력이 가장 우수한 것을 확인하였다. 확인된 5종류의 클론을 순서대로 SyAp_1, SyAp_2, SyAp_3, SyAp_4 및 SyAp_5로 각각 명명하고 그 서열을 하기 표 3에 나타내었다.

클론	서열	크기(bp)	서열번호
SyAp_1	TTCGTTACAACAGTACGGGAATACACGTCTCCTGCTTTGG	40	서열번호 1
SyAp_2	TTTATCACTGTCGGTGATGTTCCTTGGTGAGTGGGAGTTG	40	서열번호 2
SyAp_3	CGTCCGGGTTTGTGACAAGAAGCTAATATGCAGACACTCA	40	서열번호 3
SyAp_4	ATCGGTTGATCATGTTTGTGAAACGGACATTTTGTTTATA	40	서열번호 4
SyAp_5	TCATCAAGCTAAAGCGATATTCTCTCTTGCATCTATTTAG	40	서열번호 5

실험예 2. DNA 앱타머의 구조 확인

실험예 1에서 α-시누클레인 단백질과 높은 친화력으로 결합하는 서열번호 1 내지 5로 기재되는 염기서열을 갖는 DNA 앱타머의 구조를 DNA mfold 프로그램(Rensselear polytechnic institute)을 이용하여 이미지화한 결과를 도 4에 나타내었다.

실험예 3. α-시누클레인 단백질에 대한 DNA 앱타머의 친화력 확인-(2)

3-1. DNA 앱타머가 고정된 센서 칩의 제작

표면 플라즈마 공명(surface plasmon resonance, SPR) 실험을 통해 선별된 DNA 앱타머의 결합력을 정량적으로 확인하기 위해 상기 DNA 앱타머가 고정된 센서 칩을 다음과 같은 방법으로 제작하였다.

먼저, 스트렙트아비딘으로 표면이 코팅된 센서 칩 SA(GE healthcare, 영국)에 HBS-EP 완충액(GE healthcare, 영국)을 10 ㎕/min의 속도로 흘려주어 칩의 표면을 활성화시켜 준비하였다. 한편, 실험예 1에서 확인된 5종류 DNA 앱타머의 5'-말단에 비오틴(biotin)을 코팅하였다. 상기 표면이 활성화된 센서 칩 SA의 채널 2에 바이오틴이 코팅된 5종류 DNA 앱타머를 10 ㎕/min의 속도로 6분 동안 3회 흘려주어 센서 칩 SA에 스트렙트아비딘-바이오틴 결합을 통해 5종류의 DNA 앱타머를 고정시켰다.

3-2. DNA 앱타머의 친화력 확인

상기에서 제작된 5종류의 DNA 앱타머가 고정된 칩을 이용하여 선별된 DNA 앱타머와 α-시누클레인 단백질 사이의 결합력을 BIAcore 3000(BIACORE)을 사용하여 정량적으로 확인하였다.

먼저, α-시누클레인 단백질을 1× PBS 완충액에 농도별로 희석하여 준비하였다. 준비된 α-시누클레인 단백질을 아무것도 결합되지 않은 센서 칩(채널 1)과 5종류의 DNA 앱타머가 고정된 센서 칩(채널 2)에 5 ㎕/min의 속도로 10분 동안 흘려주었다. 그 결과, 5종류의 DNA 앱타머와 α-시누클레인 단백질 사이의 해리상수(K _D ) 값을 얻어 하기 표 4에 나타내었다.

클론	K _D 값(M)
SyAp_1	4.69×10^-9
SyAp_2	1.30×10^-8
SyAp_3	9.19×10^-10
SyAp_4	2.07×10^-9
SyAp_5	7.61×10^-11

표 4에 나타난 바와 같이, SyAp_3 클론이 α-시누클레인 단백질과 가장 높은 친화도를 갖는 것을 확인하였다.

실험예 4. α-시누클레인 단백질에 대한 DNA 앱타머의 특이성 확인-(1)

α-시누클레인 단백질과 가장 높은 친화도를 갖는 SyAp_3 클론을 이용하여 α-시누클레인 단백질에 대한 특이성을 다음과 같은 방법으로 확인하였다.

먼저, 알츠하이머 병과 관련된 것으로 알려진 단백질인 TTR(transthyretin), 인산화된 타우(phospho tau), β-세크레타제(β-secretase) 또는 β-아밀로이드(β-amyloid) 단백질, α-시누클레인 단백질, 또는 BSA(bovine serum albumin) 단백질을 동일한 농도별로 1× PBS 완충액에 희석하여 준비하였다. 준비된 단백질을 사용한 것을 제외하고는, 상기 실험예 2와 동일한 조건 및 방법으로 실험을 수행하였다. 그 결과, SyAp_3 클론의 DNA 앱타머와 상기 6종류의 단백질 사이의 해리상수(K _D ) 값을 얻어 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, SyAp_3 클론의 DNA 앱타머는 α-시누클레인 단백질을 제외한 다른 종류의 단백질에 대해서는 높은 해리상수 값을 나타냄으로써, α-시누클레인 단백질에 특이적으로 결합함을 확인하였다.

실험예 5. α-시누클레인 단백질 농도에 따른 DNA 앱타머의 결합 양상 확인

상기 선별된 DNA 앱타머를 이용하여 α-시누클레인 단백질의 농도에 따른 결합 양상을 다음과 같은 방법으로 확인하였다.

먼저, SyAp_1 클론의 DNA 앱타머는 아민기로, SyAp_4 클론의 DNA 앱타머는 Cy5 형광물질로 표지하고, 이들 각각을 1 μM의 농도가 되도록 100 ㎕의 10 mM PBS 완충액(pH 7.2)에 희석하여 희석액을 준비하였다. 준비된 SyAp_1 클론의 DNA 앱타머 희석액을 NOS 기(group)가 코팅된 플레이트의 웰에 첨가하고 상온에서 30분 동안 방치함으로써 SyAp_1 클론의 DNA 앱타머가 코팅된 웰을 제조하였다. 한편, α-시누클레인 단백질을 각각 0.312, 0.625, 1.25, 2 또는 5 ng/㎖의 농도가 되도록 1× PBS 완충액에 희석하여 준비하였다. 상기 DNA 앱타머가 코팅된 웰을 1× PBS 완충액으로 세척하고, 상기 준비된 α-시누클레인 단백질을 각각의 웰에 첨가하여 4℃에서 1시간 동안 교반하였다. 교반 후, 웰을 1× PBS 완충액으로 세척하고, 상기 준비된 SyAp_4 클론의 DNA 앱타머 희석액을 각 웰에 첨가하였다. 상기 SyAp_4 클론의 DNA 앱타머 희석액이 첨가된 플레이트를 빛을 차단한 상태로 상온에서 20분 동안 반응시킨 뒤, 1× PBS 완충액으로 세척하였다. 세척 후, 각 웰의 형광값을 여기(excitation) 646 ㎚ 및 방출(emission) 662 ㎚의 파장에서 ELISA 리더기(leader)로 측정하여, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 이때, 음성대조군으로서 NOS 기로 코팅만한 무처리군(A), Cy5 형광물질로 표지된 SyAp_4 클론의 DNA 앱타머 처리군(B), 및 아민기로 표지된 SyAp_1 클론의 DNA 앱타머 및 α-시누클레인 단백질 처리군(C)를 사용하였다.

도 6에 나타난 바와 같이, 음성대조군은 형광 값이 거의 측정되지 않은 반면, α-시누클레인 단백질을 첨가한 경우에만 농도 의존적으로 형광 값이 증가하였다.

실험예 6. α-시누클레인 단백질에 대한 DNA 앱타머의 특이성 확인-(2)

실험예 4에 기재된 것과 동일한 조건 및 방법을 이용하여 SyAp_1 및 SyAp_4 클론 DNA 앱타머의 특이성을 확인하였다. 이때, 첨가되는 단백질로는 100 nM의 TTR, 인산화된 타우, β-세크레타제, β-아밀로이드, α-시누클레인 또는 BSA 단백질을 사용하였다. ELISA 리더기로 측정된 형광 값을 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, SyAp_1 및 SyAp_4 클론 DNA 앱타머는 α-시누클레인 단백질에만 특이적으로 결합하였다.

실험예 7. 인체 시료로부터 α-시누클레인 단백질 검출능 확인

인체 시료로부터 상기 선별된 SyAp_1 및 SyAp_4 클론 DNA 앱타머가 α-시누클레인 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는지 여부를 실험예 4와 동일한 조건 및 방법으로 확인하였다. 이때, 1 ㎍의 α-시누클레인 단백질을 1× PBS 완충액이 아닌 3종류의 인간 혈청에 희석하여 각각 시료(A+시누클레인, B+시누클레인 또는 C+시누클레인)를 준비하였다. 또한, 상기 선별된 DNA 앱타머 대신 α-시누클레인 단백질에 대한 항체와 비교를 위하여 인간 α-시누클레인 ELISA 키트(ab210973, Abcam, 영국)를 사용하여 상기 단백질에 대한 검출능을 확인하였다. 이때, 대조군으로서는 α-시누클레인 단백질을 포함하지 않은 3종류의 인간 혈청(A, B, C)만을 사용하였다. 그 결과, 선별된 DNA 앱타머 또는 항체가 탐지할 수 있는 α-시누클레인 단백질의 양을 계산하여 하기 표 5에 나타내었다.

혈청	타입	항체 탐지(pg/㎖)	앱타머 탐지(pg/㎖)	P-값
A	정상	121.7±1.26	100.3±1.65	0.26
B	정상	82.2±0.31	84.7±2.41	0.31
C	정상	102.4±0.86	112.7±1.26	0.19
A+시누클레인	스파킹(spiking) 시누클린	972.1±7.66	1053.8±6.59	0.26
B+시누클레인	스파킹 시누클린	899.1±4.95	1019.5±7.49	0.41
C+시누클레인	스파킹 시누클린	877.0±5.99	1010.2±9.95	0.87

표 5에 나타난 바와 같이, 3종류의 인간 혈청에 α-시누클레인 단백질을 첨가하였을 때, 본 발명에 따른 DNA 앱타머가 항체를 사용한 경우보다 α-시누클레인 단백질을 효과적으로 검출하였다. 따라서, 상기로부터 본 발명에 따른 DNA 앱타머는 생체 시료로부터 α-시누클레인 단백질을 효과적으로 검출함으로써, 루이소체 질환의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> DNA APTAMERS SPECIFICALLY BINDING TO ALPHA-SYNUCLEIN PROTEIN AND USE THEREOF <130> DP-2019-0028-KR <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SyAp_1 <400> 1 ttcgttacaa cagtacggga atacacgtct cctgctttgg 40 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SyAp_2 <400> 2 tttatcactg tcggtgatgt tccttggtga gtgggagttg 40 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SyAp_3 <400> 3 cgtccgggtt tgtgacaaga agctaatatg cagacactca 40 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SyAp_4 <400> 4 atcggttgat catgtttgtg aaacggacat tttgtttata 40 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SyAp_5 <400> 5 tcatcaagct aaagcgatat tctctcttgc atctatttag 40 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 6 ataccagctt attcaatt 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 7 agatagtaag tgcaatct 18 <210> 8 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> template DNA <400> 8 ataccagctt attcaattnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnag 60 atagtaagtg caatct 76 <210> 9 <211> 114 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 mdvmkgskak gvvaaaktkg vaaagktkgv yvgsktkgvv hgvatvaktk vtnvggavvt 60 gvtavaktvg agsaaatgvk kdgkngagdm pvdpdneaye mpseegyqdy epea 114 <210> 10 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SyAp_1 aptamer <400> 10 ataccagctt attcaatttt cgttacaaca gtacgggaat acacgtctcc tgctttggag 60 atagtaagtg caatct 76 <210> 11 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SyAp_2 aptamer <400> 11 ataccagctt attcaatttt tatcactgtc ggtgatgttc cttggtgagt gggagttgag 60 atagtaagtg caatct 76 <210> 12 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SyAp_3 aptamer <400> 12 ataccagctt attcaattcg tccgggtttg tgacaagaag ctaatatgca gacactcaag 60 atagtaagtg caatct 76 <210> 13 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SyAp_4 aptamer <400> 13 ataccagctt attcaattat cggttgatca tgtttgtgaa acggacattt tgtttataag 60 atagtaagtg caatct 76 <210> 14 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SyAp_5 aptamer <400> 14 ataccagctt attcaatttc atcaagctaa agcgatattc tctcttgcat ctatttagag 60 atagtaagtg caatct 76

Claims

서열번호 1 내지 5로 기재된 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 코어서열을 포함하고 α-시누클레인(α-synuclein) 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머.
제1항에 있어서, 상기 DNA 앱타머는 코어서열의 5' 및 3' 말단에 각각 15 내지 25개의 염기서열을 더 포함하는, α-시누클레인 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머.
제2항에 있어서, 코어서열의 5' 말단에 포함되는 염기서열은 서열번호 6으로 기재된 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드인, α-시누클레인 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머.
제2항에 있어서, 코어서열의 3' 말단에 포함되는 염기서열은 서열번호 7로 기재된 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드인, α-시누클레인 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머.
제1항에 있어서, 상기 DNA 앱타머는 서열번호 10 내지 14로 기재된 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인, α-시누클레인 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머.
제1항의 DNA 앱타머를 포함하는 루이소체(lewy body) 질환 진단용 조성물.
제6항에 있어서, 상기 루이소체 질환은 파킨슨병, 다발성 시스템 위축증(MSA) 또는 루이소체를 갖는 치매인, 루이소체 질환 진단용 조성물.
제6항의 진단용 조성물을 포함하는 루이소체 질환 진단용 키트.
제6항의 진단용 조성물을 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 루이소체 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.