KR102063290B1 - 베타 아밀로이드 단백질에 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 및 이의 용도 - Google Patents

베타 아밀로이드 단백질에 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

코어 서열 및 코어 서열의 5'말단 및 3'말단에 각각 연결된 프라이머 서열을 포함하는 DNA 앱타머로서, 코어 서열은 서열번호 1 내지 서열번호 5 로 구성된 군에서 선택되는 염기서열로 이루어지고, 상기 DNA 앱타머의 전체 서열의 길이는 76 내지 80bp이고, 베타 아밀로이드에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머가 개시된다.

Description

베타 아밀로이드 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도{DNA Aptamer Specifically Binding to β-amyloid protein and Its Use}
본 발명은 베타 아밀로이드 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도에 관한 것이다.
급속한 고령화로 인하여 전 세계적으로 알츠하이머 환자가 급격하게 증가하고 있다. 글로벌 시장조사기관 GBI리서치의 2016년 보고에 따르면 세계적으로 알츠하이머 환자는 2015년 약 785만 명으로 집계되었으며, 2021년까지 17% 이상 증가하여 약 930만 명에 이를 것으로 전망되고 있다. 알츠하이머로 인한 사망자수에 대한 미국 질병관리본부 (CDC)의 공식집계는 2013년 기준으로 84,767명으로 발표되었지만, 알츠하이머환자 대부분이 알츠하이머로 인해 직접적으로 사망하는 것이 아닌 수많은 합병증으로 사망하여 실질적인 사망자 수는 이보다 많을 것으로 예상하고 있다.
국내의 경우 중앙치매센터의 보고에 따르면 전국치매역학조사를 통해 확인된 표준화 알츠하이머 유병률(연령, 성별, 교육, 지역 표준화)은 60세 이상 노인에서 2016년 기준 6.9%, 2017년 기준 7% 였다. 2017년 알츠하이머 환자 수는 약 72만 명에 달하였으며, 현재 국내의 알츠하이머 환자 증가 속도는 급속한 고령화 속도로 인하여 다른 OECD 국가의 증가 속도보다 4.5 배 가량 빠른 것으로 보고되고 있다.
알츠하이머 환자의 수는 증가하고 있지만 이를 조기 진단을 위한 명확한 기준이 부족하고, 전문가의 진찰, 인지기능평가, 뇌영상검사, 혈액 혹은 뇌척수액 검사 등을 종합하여 이루어지고 있다. 이러한 진단의 문제점으로 인하여 알츠하이머는 병증이 시작된 후 실질적 증상 발현으로 최종 진단을 받기까지 장기간이 소요되고 있어 적절한 치료시기를 놓치는 경우가 많다. 만일 알츠하이머를 조기진단하여 치료시기를 1년이라도 앞당길 수 있다면 세계적으로 유병률을 약 10% 낮출 수 있으며 이를 통해 세계적으로는 약 750만 명, 국내에서는 약 7만 명의 환자를 감소시킬 수 있을 것으로 예측되고 있다.
또한, 알츠하이머의 원인을 정확하게 치료할 수 있는 약물이 전무한 실정이다. 알츠하이머 치료제의 개발을 위해서는 세계적으로 30년간 약 3조원이라는 기하급수적인 금액이 투자되었지만 현재까지 괄목할만한 치료제의 개발 사례는 전무한 실정이다. 효과적인 알츠하이머 치료제를 성공적으로 개발하기 위해서는 새로운 바이오마커 기반의 질병 조기 검출 및 치료법의 개발을 위한 연구가 필수적이며, 상기한 바와 같은 새로운 차별화 전략을 바탕으로 한 치료제 개발연구가 필요한 실정이다.
β-amyloid(베타 아밀로이드, 이하 A β로 지칭될 수 있다.) 단백질은 알츠하이머 환자들에게 축적됨이 확인되어 알츠하이머의 원인으로 지목되고 있고, 현재도 질병의 결정적인 원인 물질 중 하나라고 알려져 있다. β-amyloid의 전구체인 amyloid precursor protein (APP)는 α-secretase, β-secretase, γ-secretase 3 가지 효소를 통하여 대사가 이루어지고, APP의 효소 절단 부위에 돌연변이에 의해 비정상적인 대사로 β-amyloid가 형성된다. APP의 대사 과정에 효소 절단 부위 돌연변이로 인하여 α-secretase, γ-secretase가 작용하지 않고, β-secretase, 및 γ-secretase가 작용하게 된다면 β-amyloid가 형성된다. 신경세포 내에서 형성된 β-amyloid는 monomer, oligomer, fibril, plaque로 점진적으로 형성되어 알츠하이머가 발병하게 된다. 형성된 β-amyloid plaque는 신경세포에 독성을 일으키며 신경세포를 손상시킨다. 특히 Aβ(베타 아밀로이드) plaque는 주로 Aβ1-40과 Aβ1-42가 긴 섬유를 형성하는 것이 알츠하이머의 병변에서 나타나는 것이 주요 특징이다 (Aβ1-40 양이 더 많음). Aβ(42)가 신경 독성 인 반면, Aβ1-40은 항산화제 분자로서 작용한다.
현재 알츠하이머의 근원적 치료를 위해 알츠하이머의 주원인이 되는 뇌조직 내 β-amyloid의 농도를 감소시키는 치료제가 개발되고 있다. 주로 Aβ생성 감소, Aβ응집 억제, Aβ분해 및 배설 촉진 등으로 나눌 수 있다. Aβ응집억제를 위하여 다앙? 약물이 개발되고 있으나, 대부분 임상단계에서 실패하고 있다. 전 세계 알츠하이머 치료제 개발 진행 상황을 임상 단계별로 보면, 후보물질 선정을 위한 탐색단계 23%, 동물실험을 통한 전임상 단계 54%, 임상 1상 10%, 임상 2상 9%, 임상 3상 3%로 진행되고 있는 것으로 보고되고 있다. 이와 같은 알츠하이머 치료제 파이프라인의 29%는 바이오 의약품을 기반으로 하고 있으며 나머지 71%는 합성의약품을 기반으로 하고 있다. 바이오 의약품 중에서는 펩타이드와 단일 클론 항체를 이용한 의약품의 비중이 가장 높게 나타났다. 이러한 단백질 기반의 의약품은 해당 세포 내로의 전달 효율이 현저하게 떨어지며, 면역 반응 및 거부반응, 세포 내에서의 형태 불안정 등이 문제되고 있다.
본 발명에서 활용하고자 하는 앱타머 (Aptamer)는 짧은 길이의 올리고머로서, 안정된 삼차구조를 형성하여 표적 물질과 항체 사이에 나타나는 친화도와 유사한 친화도를 나타내며, 표적물질과 특이적인 결합력을 가지는 특징을 가지고 있다. 또한 앱타머는 DNA나 RNA로 구성되어 있어 단백질로 이루어진 항체보다 안정적이며, 다양한 표적 물질 (단백질, 생균, 펩타이드, 금속, 화학물질 등)과 특이적으로 결합이 가능하다는 특징을 가지고 있다. 뿐만 아니라, 화학적 합성 기법을 이용해 제작이 가능하기 때문에 단시간, 저비용으로 대량 생산이 가능하며, 한번 제작, 생산 후 동일한 능력을 가지는 앱타머를 지속적으로 생산 가능한 탁월한 장점을 갖고 있다. 이와 더불어 주변의 pH와 온도에 매우 안정성이 높아 최근 표적 물질의 탐지 및 질환 진단 센서 개발 등 환경, 의료 등 다양한 분야에서의 활용 가능성이 높이 평가되고 있다.
대한민국 공개공보 10-2017-0096908 (2017.08.25)
본 발명의 실시 예에 따르면, 퇴행성 신경뇌질환과 관련된 단백질 중 베타 아밀로이드에 특이적으로 결합하는 압타머를 제공한다.
본 발명의 실시 예에 따른 DNA 앱타머는 코어 서열; 및 상기 코어 서열의 5'말단 및 3'말단에 각각 연결된 프라이머 서열을 포함하는 DNA 앱타머로서, 상기 코어 서열은 서열번호 1 내지 서열번호 5로 구성된 군에서 선택되는 염기서열로 이루어지고, 상기 DNA 앱타머의 전체 서열의 길이는 76 내지 80bp이고, 베타 아밀로이드에 특이적으로 결합한다.
상기 코어 서열의 5'말단에 연결된 프라이머 서열은 서열번호 6의 염기서열을 포함할 수 있고, 상기 코어 서열의 3'말단에 연결된 프라이머 서열은 서열번호 7의 염기서열을 포함할 수 있다.
상기 DNA 앱타머의 전체 서열의 길이는 76 내지 80bp, 76 내지 79bp, 76 내지 78bp, 76 내지 77bp, 또는 76bp 일 수 있다.
상기 코어 서열의 5'말단에 연결된 프라이머 서열은 서열번호 6의 염기서열로 이루어질 수 있고, 상기 코어 서열의 3'말단에 연결된 프라이머 서열은 서열번호 7의 염기서열로 이루어질 수 있고, 상기 DNA 앱타머의 전체 서열의 길이는 76bp 일 수 있다.
상기 DNA 앱타머는 베타 아밀로이드와 결합 시 해리상수값(Kd)이 0.01 내지 0.5 nM일 수 있다.
상기 DNA 앱타머는 알파 시누클레인(α-synuclein), 베타 세크레타제(β-secretase), 타우 단백질(Tau), TTR 단백질, 또는 BSA 단백질 중 어느 하나와 결합 시 해리상수값(Kd)이 1nM 이상일 수 있다.
본 발명의 실시 예에 따른 퇴행성 신경뇌질환 진단용 조성물은 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 실시 예에 따른 퇴행성 신경뇌질환 진단 키트는 상기 퇴행성 신경뇌질환 진단용 조성물을 포함한다.
본 발명의 실시 예에 따른 퇴행성 신경뇌질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법은 상기 진단용 조성물을 시료와 반응시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 실시 예에 따른 앱타머는 베타 아밀로이드 단백질에 특이적으로 결합할 수 있다.
본 발명의 실시 예에 따른 앱타머는 혈액 내 베타 아밀로이드 단백질을 정확하게 검출할 수 있다.
본 발명의 실시 예에 따른 앱타머는 알츠하이머의 진단 또는 예후 판단의 용도로 사용될 수 있다.
본 발명의 실시 예에 따른 앱타머는 베타 아밀로이드에 대한 항체보다 신속하고 경제적으로 대량 생산이 가능하므로 항체를 대체할 수 있다.
도 1은 랜덤 DNA 앱타머 풀을 PCR을 이용하여 증폭한 dsDNA, 비대칭 PCR 을 이용하여 증폭한 ssDNA, 및 스트렙트아비딘 아가로스 레진 (streptavidin agarose resin)을 이용하여 선택적 회수한 ssDNA를 아크릴아마이드 겔을 이용한 전기영동 기법으로 크기를 확인한 결과이다.
레인 M: 100 bp DNA 마커
레인 1: DNA 앱타머 풀을 PCR 기법을 이용하여 증폭된 dsDNA
레인 2: 증폭된 DNA 앱타머 풀을 비대칭 PCR로 증폭한 ssDNA
레인 3: 스트렙트아비딘 아가로스 레진을 이용하여 회수한 ssDNA
도 2은 본 발명의 실시 예에 따른 SELEX에서 각 라운드에서 회수된 앱타머의 양을 Nanodrop spectrophotometer를 이용하여 정량적으로 나타낸 결과이다.
도 3는 본 발명의 실시 예에 따른 SELEX 과정에서 선별된 20개의 앱타머 후보군을 Post-SELEX를 진행하여 회수한 DNA 앱타머 양을 나타낸 결과이다.
도 4 내지 도 8은 본 발명의 실시 예에 따른 앱타머의 2차 구조를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 실시 예에 따른 앱타머의 베타 아밀로이드에 대한 특이적 결합력을 해리 상수로 측정한 실험 결과이다.
도 10 및 도 11은 본 발명의 실시 예에 따른 앱타머의 베타 아밀로이드 농도에 따른 결합력을 형광도로 측정한 결과이다.
도 12는 본 발명의 실시 예에 따른 앱타머의 베타 아밀로이드에 대한 특이적 결합력을 형광도로 측정한 실험 결과이다.
본 발명의 실시 예에 따른 DNA 앱타머는 코어 서열; 및 상기 코어 서열의 5'말단 및 3'말단에 각각 연결된 프라이머 서열을 포함하는 DNA 앱타머로서, 상기 코어 서열은 서열번호 1 내지 서열번호 5로 구성된 군에서 선택되는 염기서열로 이루어지고, 상기 DNA 앱타머의 전체 서열의 길이는 76 내지 80bp이고, 베타 아밀로이드에 특이적으로 결합한다.
상기 코어 서열의 5'말단에 연결된 프라이머 서열은 서열번호 6의 염기서열을 포함할 수 있고, 상기 코어 서열의 3'말단에 연결된 프라이머 서열은 서열번호 7의 염기서열을 포함할 수 있다.
상기 DNA 앱타머의 전체 서열의 길이는 76 내지 80bp, 76 내지 79bp, 76 내지 78bp, 76 내지 77bp, 또는 76bp 일 수 있다.
상기 코어 서열의 5'말단에 연결된 프라이머 서열은 서열번호 6의 염기서열로 이루어질 수 있고, 상기 코어 서열의 3'말단에 연결된 프라이머 서열은 서열번호 7의 염기서열로 이루어질 수 있고, 상기 DNA 앱타머의 전체 서열의 길이는 76bp 일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "앱타머(aptamer)"는 그 자체로 안정한 삼차구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성을 가지고 특이적으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일 가닥 핵산 분자이다. 상기 앱타머는 통상의 기술 분야에서 잘 알려진 방법으로 제조될 수 있고, 상기 방법은 필요에 따라 적절히 변형될 수 있다.
상기 DNA 앱타머는 코어서열로서 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나의 서열로 구성될 수 있다. 상기 DNA 앱타머는 베타 아밀로이드에 특이적으로 결합하는 특성을 유지하는 한, 상기 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나의 서열과 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상 상동성을 가질 수 있다.
상기 코어 서열, 코어 서열의 5' 말단 및 3'말단에 연결된 프라이머 서열로 이루어지는 DNA 앱타머는 서열번호 8 내지 12의 서열로 이루어지는 DNA 앱타머일 수 있다.
상기 베타 아밀로이드(β-amyloid 또는 Aβ로 표시할 수 있다)는 퇴행성 신경뇌질환(neurodegenerative disorder)의 생체 표지자일 수 있으며, 예를 들면 알츠하이머의 생체 표지자일 수 있다.
상기 베타 아밀로이드는 서열목록 14의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 서열목록 14의 아미노산 서열로 구성되거나, 서열목록 14의 아미노산 서열과 상동성을 갖는 서열일 수 있다.
상기 퇴행성 신경뇌질환은 베타 아밀로이드의 발현량 측정으로 진단할 수 있는 질환들 또는 베타 아밀로이드, 베타 세크리타제, 알파 시누클레인, Tau, TTR, BSA의 발현량 차이를 측정함으로써 진단할 수 있는 질환들을 포함하며, 예를 들면 혈관성 치매, 혈관성 인지장애, 알츠하이머, 파킨슨병, 루이체 치매, 전측두엽 퇴행을 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 DNA 앱타머는 표적 물질에 대한 결합성 및 안전성을 높이기 위해, 각 뉴클레오티드의 당 잔기, 구체적으로 디옥시리보스가 수식될 수 있다. 상기 수식은 당 잔기의 2'위치, 3'위치 및 4'위치로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 산소 원자를 다른 원자로 치환한 것일 수 있다. 수식의 예로는 플루오로화, O-알킬화, O-알릴화, S-알킬화, 아미노화 등이 포함될 수 있다. 상기와 같은 당 잔기의 변형은 통상적인 방법으로 수행될 수 있다.
또한, 상기 DNA 앱타머는 표적 물질에 대한 결합성을 높이기 위해, 핵산 염기가 변형될 수 있다. 상기 핵산 염기의 변형은 5번 위치의 피리미딘 변형, 6번 위치의 푸린 번형, 8번 위치의 푸린 변형, 환외(環外) 아민에서의 변형, 4-티오우리딘으로의 치환, 5-브로모로의 치환 또는 5-요오드-우라실로의 치환 등을 포함할 수 있다.
상기 DNA 앱타머는 뉴클레아제 및 가수분해효소 등에 대해 내성을 갖도록 인산기가 변형될 수 있다. 예를 들면, 상기 인산기는 티오에이트, 디티오에이트, 아미데이트, 포름아셀탈, 3'-아민 등으로 치환될 수 있다. 나아가, 상기 DNA 앱타머는 3'말단 또는 5'말단의 변형을 포함할 수 있고, 상기 변형은 캡핑이나, 바이오티닐, 폴리에틸글리콜, 아미노산, 펩티드, 핵산, 뉴클레오시드,미리스토일(myristoyl), 리소콜릭-올레일(lithocolic-oleyl), 도코사닐(docosanyl), 라우로일(lauroyl), 스테아로일(stearoyl), 올레오일(oleoyl), 리놀레오일(linoleoyl), 지질, 스테로이드, 콜레스테롤, 카페인, 비타민, 색소, 형광물질, 항암제, 독소, 효소, 방사성 물질, 비오틴 등이 부가된 것일 수 있다.
상기 DNA 앱타머는 베타 아밀로이드와 결합 시 해리상수값(Kd)이 0.001 내지 0.9 nM, 0.005 내지 0.9 nM, 0.01 내지 0.9 nM, 0.001 내지 0.8 nM, 0.005 내지 0.8 nM, 0.01 내지 0.8 nM, 0.001 내지 0.7 nM, 0.005 내지 0.7 nM, 0.01 내지 0.7 nM, 0.001 내지 0.6 nM, 0.005 내지 0.6 nM, 0.01 내지 0.6 nM, 0.001 내지 0.5 nM, 0.005 내지 0.5 nM, 0.01 내지 0.5 nM, 0.001 내지 0.4 nM, 0.005 내지 0.4 nM, 또는 0.01 내지 0.4 nM 일 수 있다.
상기 DNA 앱타머는 알파 시누클레인(α-synuclein), 베타 세크리타제(β-secretase), 타우 단백질(Tau), TTR 단백질, 또는 BSA 단백질 중 어느 하나와 결합 시 해리상수값(Kd)이 1 nM 이상, 2 nM 이상, 3 nM 이상, 4 nM 이상, 5 nM 이상, 6 nM 이상, 7 nM 이상, 8 nM 이상, 9 nM 이상, 10nM 이상, 11 nM 이상, 또는 12 nM 이상일 수 있다.
본 발명의 실시 예에 따른 DNA 앱타머는 퇴행성 신경뇌질환과 연관된 단백질들과의 결합시 해리상수 값에 있어서, 베타 아밀로이드와의 해리상수값과 알파 시누클레인, 베타 세크리타제, 타우, TTR, BSA 단백질들과의 해리상수 값이 차이가 있을 수 있고, 이로 인해 베타 아밀로이드와 특이적 결합력을 가질 수 있다.
본 발명의 실시 예에 따른 퇴행성 신경뇌질환 진단용 조성물은 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함한다.
상기 DNA 앱타머는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
본 발명의 실시 예에 따른 퇴행성 신경뇌질환 진단 키트는 상기 퇴행성 신경뇌질환 진단용 조성물을 포함한다.
상기 DNA 앱타머는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
상기 퇴행성 신경뇌질환 진단 키트에 포함되는 상기 DNA 앱타머는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지된 접합체일 수 있다. 발색효소는 퍼록시다제, 알칼라인 포스파타제 또는 산성 포스파타제일 수 있고, 형광물질은 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2', 7'-디클로로플루오레신-5-일, 2', 7'-디클로로플루오레신-6-일, 디하이드로 테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸, Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(RITC), PE(Phycoerythrin) 또는 로다민일 수 있다.
또한, 상기 DNA 앱타머는 상기 DNA 앱타머에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함할 수 있다. 상기 리간드는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지된 접합체, 및 스트렙타비딘 또는 아비딘이 처리된 리간드일 수 있다. 상기 검출용 조성물은 상기 서술한 바와 같은 시약 외에도 이들의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 더 포함할 수 있다.
상기 검출용 조성물을 포함하는 키트는 이에 포함되는 DNA 앱타머의 세척이나 복합체의 분리 등과 같은 이후 단계를 용이하게 하기 위해 고형 기질에 결합될 수 있다. 이때, 고형 기질로는 합성수지, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 또는 미세비드가 사용될 수 있다. 또한, 합성수지로는 폴리에스터, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, PVDF 또는 나일론 등이 사용될 수 있다.
또한, 상기 키트는 당업자에게 알려진 종래의 제조방법에 의해 제조될 수 있으며, 버퍼, 안정화제, 불활성 단백질 등을 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 시약의 양을 탐색하기 위해 검출체로서 부착된 형광물질의 형광을 검출함으로써 수행되는 형광법 또는 검출체로서 부착된 방사선 동위원소의 방사선을 검출함으로써 수행되는 방사선법을 통한 초고속 스크리닝(high throughput screening, HTS) 시스템, 검출체의 표지 없이 표면의 플라즈몬 공명 변화를 실시간으로 측정하는 SPR(surface plasmon resonance) 방법 또는 SPR 시스템을 영상화하여 확인하는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 방법을 이용할 수 있다.
나아가, 본 발명은 본 발명에 따른 진단용 조성물을 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 퇴행성 신경뇌질환에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 DNA 앱타머는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
상기 퇴행성 신경뇌질환에 필요한 정보를 제공하는 방법은 환자의 생물학적 시료에 상기 DNA 앱타머를 반응시키는 단계; 상기 시료에서 DNA 앱타머 및 베타 아밀로이드 단백질의 결합 정도를 측정하는 단계; 상기 시료에서 앱타머 및 베타 아밀로이드 단백질의 결합 정도가 정상 시료보다 높은 경우, 상기 환자를 퇴행성 신경뇌질환 환자로 판단하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 퇴행성 신경뇌질환 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법은 정상인으로부터 얻은 생물학적 시료에 베타 아밀로이드 특이적 DNA 앱타머의 결합 정도를 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 상기 생물학적 시료는 베타 아밀로이드를 검출하고자 하는 생체 시료라면 모든 시료를 포함할 수 있고, 예를 들면 조직, 세포, 전혈, 혈액, 타액, 뇌척수액 및 뇨를 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 퇴행성 신경뇌질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법은 베타 아밀로이드 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 단백질 발현수준은 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 측정할 수 있으며, 예를 들면 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석 법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법 (immunoprecipitation), 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence), 오우크테로니 (ouchterlony), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), 또는 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
이와 같이 DNA 앱타머를 이용하여 시료 내 베타 아밀로이드 단백질의 존재 여부 또는 과발현 여부를 확인하는 경우, 기존의 단일클론항체를 이용한 검출보다 현저하게 우수한 민감도를 나타낼 수 있다.
이하 본 발명의 실시 예를 통하여 보다 자세히 설명한다. 그러나 이들 실시 예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명이 하기 실시 예로 한정되는 것은 아니다.
실시 예 1: DNA 앱타머 제작 과정
1-1. PCR을 이용한 DNA 랜덤 라이브러리 증폭
β-amyloid에 특이적으로 결합하는 단일 가닥의 DNA 앱타머를 제작하기 위하여 AGTC를 dA : dG : dC : dT = 1.5 : 1.15 : 1.25 : 1 비율로 포함하고, 임의로 배열된 40bp의 코어 서열을 포함하는 76 bp의 주형 DNA (5’-ATACCAGCTTATTCAATT -N40- AGATAGTAAGTGCAATCT-3', 서열목록 13)와 이를 76 bp로 증폭할 수 있는 프라이머 한 쌍을 Bioneer (Korea)에 주문 제작하였다 (정방향 프라이머 : 5‘-ATACCAGCTTATTCAATT-3’, 바이오티닐화된 (biotinylated) 역방향 프라이머 : 5’-바이오틴-AGATAGTAAGTGCAATCT-3‘).
임의의 DNA 라이브러리는 PCR (Bioneer, Korea)을 이용하여 증폭하였다. PCR에 의한 76 bp DNA 라이브러리의 증폭을 위한 반응 조성은 주형 DNA 1 ㎕, 10X PCR 완충용액 5 ㎕, 각 2.5 mM dNTP 혼합물 4 ㎕, 25 uM 정방향 프라이머 2 ㎕, 25 uM 바이오티닐화된 역방향 프라이머 2 ㎕, Ex Taq 중합효소 (TaKaRa, Japan) 0.25 ㎕ (1 unit/㎕)와 35.75 ㎕의 증류수로 이루어져 있다. PCR 반응 조건은 먼저 95℃에서 5분간 변성시키고, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 그리고 72℃에서 30초간 반응을 20 주기 반복한 후, 72℃에서 7분간 추가로 신장시키는 반응을 이용하였다. PCR 반응 후 4 ㎕를 취하여, 2% 아가로스 겔 전기영동을 통하여 증폭 산물을 확인하였다 (도 1의 레인 1 참조). PCR을 통하여 확보된 DNA 라이브러리는 PCR 정제 키트(Qiagen, USA)를 이용하여 정제한 후 증류수 50 ㎕를 이용하여 회수하였다.
1-2. 비대칭 (Asymmetric) PCR 기법을 활용한 ssDNA 증폭
PCR 기법을 이용하여 증폭한 dsDNA 중 ssDNA만을 증폭하기 위하여 비대칭 PCR를 수행하였다. 비대칭 PCR 반응 조성은 상기 1-1 단계를 통하여 획득한 주형 DNA 7 ㎕, 10X PCR 완충용액 10 ㎕, 2.5 mM dNTP 혼합물 8 ㎕, 25 uM 정방향 프라이머 10 ㎕, 25 uM 바이오티닐화된 역방향 프라이머 2 ㎕, Ex Taq 중합효소 (Takara, Japan) 0.5 ㎕ (1 unit/㎕)와 62.5 ㎕의 증류수로 이루어져 있다.
비대칭 PCR 반응 조건은 먼저 95℃에서 5분간 변성시키고, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 그리고 72℃에서 30초간 반응을 15 주기 반복한 후, 72℃에서 7분간 추가 신장시키는 반응을 이용하였다.
PCR 반응 후 4 ㎕를 취하여, 2% 아가로스 겔을 이용하여 정확한 크기의 밴드가 나타나는지 확인하였으며, 나머지 DNA는 순수한 DNA 앱타머 풀을 회수하기 위하여 통상적으로 사용하는 PCI 추출 및 에탄올 침전법을 활용하였다.
반응액을 동일 부피의 PCI (Phenol : Chloroform : Isoamylalcohol = 25 : 24 : 1) 용액을 처리하고 강하게 교반한 뒤, 4℃에서 13,000 rpm으로 15분간 원심 분리하여 상층액 만을 회수하였다. 상층액에 1/100 부피의 tRNA (sigma aldrich, USA), 3 부피의 100％ 에탄올을 첨가하여 -70℃에서 1시간 이상 반응시켰다. 반응 후에는 4℃에서 13,000 rpm으로 20분간 원심 분리하여 DNA만을 회수하였다. 회수한 DNA는 65℃에서 건조시킨 후, 50 ㎕의 증류수에 녹였다. 회수한 DNA 중 4 ㎕를 취하여 2% 아가로스 겔 전기영동을 통하여 정확한 크기의 밴드가 나타나는지 확인하였다. (도 1의 레인 2 참조)
1-3. 가열-냉각 (heating-cooling) 기법을 활용한 ssDNA 제작 및 회수
비대칭 PCR을 이용하여 증폭한 PCR 산물 중 바이오틴이 붙어 있는 dsDNA 및 ssDNA를 제거하고 순수한 정방향의 ssDNA만을 확보하기 위하여, 상기 1-2 단계에서 획득한 DNA 50 ㎕에 증류수 50 ㎕를 첨가 후, 가열-냉각 (heating-cooling) 기법을 이용하여 dsDNA를 ssDNA로 변성 (Denaturation) 하였다. dsDNA를 85℃에서 5분 동안 반응하여 ssDNA로 변성시킨 후, 반응 종료 후 즉시 반응액을 4℃로 냉각시켜 ssDNA를 제작하였다.
그 이후, 스트렙트아비딘(Pierce, USA) 50 ㎕를 첨가 하여 상온에서 1시간 동안 반응하였다. 반응이 끝난 후, 반응액은 4℃, 13,000 rpm의 원심분리기를 이용하여 10 분간 원심분리한 후, 상층액 만을 회수하여 ssDNA를 확보하였다. 반응액에서 순수한 ssDNA를 확보하기 위하여 PCI 추출 및 에탄올 침전법을 활용하였다. 반응액을 동일 부피의 PCI (Phenol : Chloroform : Isoamylalcohol = 25 : 24 : 1) 용액을 처리하고 강하게 교반한 뒤, 4℃에서 13,000rpm으로 15분간 원심 분리하여 상층액을 회수하였다. 상층액에 1/100 부피의 tRNA (sigma aldrich, USA), 3 부피의 100％ 에탄올을 첨가하여 -70℃에서 1시간 이상 반응시켰다. 반응 후에는 4℃에서 13,000 rpm으로 20분간 원심 분리하여 ssDNA만을 회수하였다. 회수한 ssDNA는 65℃에서 건조시킨 후, 50 ㎕의 증류수에 녹였다. 회수한 ssDNA 중 10 ㎕를 취하여 10% 아크릴아마이드 겔 전기영동을 통하여 정확한 크기의 밴드가 나타나는지 확인하였다(도 1의 레인 3 참조).
실시예 2: β-amyloid 단백질에 특이적으로 결합하는 ssDNA 앱타머의 선별
2-1. SELEX에 이용되는 각 용액 조성 및 단백질 준비
2X 앱타머 선별 용액: 20 mM PBS (pH 7.2)
1X 앱타머 선별 용액: 10 mM PBS (pH 7.2).
Coupling buffer: 100 mM NaHCO3, 500 mM NaCl
β-amyloid: abcam사에서 구입한 beta-Amyloid Peptide (1-42) (human) (ab120301) 단백질을 50 pmol로 1X 앱타머 선별용액을 준비하였다.
2-2. Epoxy-activated sepharose 6B의 활성화를 통한 β-amyloid 고정 복합체 제작
β-amyloid에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하기 위하여 1 ㎖의 증류수에 아민기(-NH), 티올기(-SH), 하이드록시기(-OH)를 함유하는 리간드와 공유 결합을 형성하는 epoxy-activated sepharose 6B(GE Healthcare, USA) powder 0.01g을 첨가하고 강하게 교반한 뒤, 4℃에서 13,000 rpm으로 10분간 원심 분리하여 상층액을 제거하였다. 이후, 기 제작한 Coupling buffer 500 ㎕와 표적 β-amyloid 단백질을 50 pmol 첨가하여 10분 동안 반응을 진행하였다. 반응을 통해 β-amyloid 단백질을 epoxy-activated sepharose 6B resin에 고정을 진행한 후, 4℃에서 13,000 rpm으로 10분간 원심 분리하여 resin에 결합하지 않은 β-amyloid을 제거하였다.
2-3. SELEX에 이용될 ssDNA의 앱타머 구조 제작 및 β-amyloid 고정 복합체와 ssDNA 앱타머의 결합
β-amyloid 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하기 위하여 기 제작 확보한 ssDNA 40 ㎕에 증류수 60 ㎕를 첨가하고, 2X 앱타머 선별 용액을 100 ㎕를 첨가한 후 85℃에서 5분간 끓여 변성(Denaturation) 시키고, 상온에서 서서히 식혀 ssDNA 앱타머의 안정한 3차원 구조를 형성시켰다.
안정적으로 3차원 구조가 완성된 ssDNA 앱타머 200 ㎕를 상기 2-2 단계에서 제작한 베타 아밀로이드와 결합한 resin에 첨가하여 1시간 동안 결합을 유도하였다.
2-4. SELEX 방법을 통한 β-amyloid에 결합하는 ssDNA 앱타머의 선별
Epoxy-activated sepharose 6B에 고정된 β-amyloid과 결합하지 않은 ssDNA 앱타머를 제거하기 위하여 1X 앱타머 선별용액을 이용하여 3회 세척하여 모두 제거하였다. β-amyloid에 특이적으로 결합한 ssDNA 앱타머는 1X 앱타머 선별용액 200 ㎕를 첨가하여 85℃에서 5분간 반응시켜 변성시킨 뒤, 원심분리(4℃, 13,000 rpm, 10 분)를 통해 회수하였다. 회수과정은 총 2회 실시되었으며, 순수한 DNA 앱타머 풀을 회수하기 위하여 PCI 추출 및 에탄올 침전법을 수행한 뒤, 50 ㎕의 증류수에 현탁하는 것으로 회수하였다.
2-5. Negative SELEX을 통한 비특이적 ssDNA 앱타머 제거
β-amyloid이 아닌 Epoxy-activated sepharose 6B에 비특이적으로 흡착하는 ssDNA 앱타머를 제거하기 위하여 SELEX 6회와 7회 사이에는 β-amyloid이 고정되어 있지 않은 Epoxy-activated sepharose 6B를 활용하여 negative SELEX을 진행하였다. 1X 앱타머 선별용액을 첨가한 epoxy-activated sepharose 6B에 상온에서 식힌 ssDNA 앱타머를 1시간 동안 반응시킨 후 epoxy-activated sepharose 6B에 결합하지 않고 나온 ssDNA 앱타머 용액을 7회 SELEX에 이용하였다. 이후, SELEX는 10회까지 진행하였으며, SELEX의 결합 조건은 횟수가 증가할수록 ssDNA 앱타머 양과 반응 시간을 줄였으며, 횟수가 거듭될수록 반응 조건을 거칠게 하여 목표 물질인 β-amyloid에 특이적으로 결합하는 앱타머를 얻고자 하였다.
실시예 3: β-amyloid 단백질에 특이적으로 결합하는 최적 SELEX 라운드 선별을 위한 친화성 테스트
SELEX를 10 라운드까지 마친 후 SELEX 진행 여부 및 각 라운드에서 용리된 ssDNA 앱타머의 친화성을 정량적으로 확인하기 위하여 각 라운드에서 회수된 β-amyloid 에 특이적으로 결합한 ssDNA의 농도를 나노드랍(Nano-drop)을 이용하여 측정하였다. 나노드랍(Nano-drop)을 활용하여 각 라운드에서 용리된 ssDNA 앱타머 농도를 측정한 결과, 8 라운드가 699.4 ng/㎕, 9 라운드의 농도가 687.4 ng/㎕ 이고, 10 라운드의 농도는 664.1 ng/㎕로 9 라운드의 결과 보다 농도가 떨어지는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통하여 β-amyloid 단백질에 가장 특이적으로 결합하는 최적 앱타머 풀은 9 라운드 풀임을 확인할 수 있었다 (도 2).
실시예 4: β-amyloid 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군 클로닝
나노드랍(Nano-drop)을 통하여 β-amyloid 과 결합 효율이 가장 높은 것으로 판단되는 9 라운드의 ssDNA 앱타머에 대해 정방향 프라이머 : 5‘-ATACCAGCTTATTCAA TT-3’, 역방향 프라이머 : 5’-AGATAGTAAGTGCAATCT-3‘를 이용한 PCR 수행으로 dsDNA를 획득하였다. 이렇게 획득한 dsDNA는 Solgent의 T-블런트 클로닝 키트를 이용하여 클로닝을 수행하였다. 클로닝은 T-벡터 (10 ng/㎕) 1㎕와 PCR 산물 (20 ng/㎕) 4㎕, 6× T-블런트 buffer 1 ㎕를 섞어서 25℃에서 5 분 동안 반응시키는 조건을 이용하였다. T-블런트 클로닝 반응액 6 ㎕는 100 ㎕의 DH5α와 섞은 후 42℃에서 30초 동안 열충격(heat shock)을 가하여 형질 전환시킨 후, 2분 동안 얼음에서 반응시켰다. 이후 여기에 900 ㎕의 SOC 배지 (2% tryptone, 0.5% yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM glucose)를 첨가한 후, 37℃에서 40 분 동안 배양한다. 배양 후, 200㎕의 용액을 취하여 앰피실린(ampicillin, 50㎍/㎖), 카나마이신(kanamycin, 50㎍/㎖), X-gal(50㎍/㎖), IPTG (5㎍/㎖)이 포함되어 있는 LB 배양 플레이트 (LB plate)에 스프레딩하고 37℃에서 15시간 동안 배양시킨 후 흰색 콜로니만을 선별하여 솔젠트 (Solgent, Korea)에 의뢰하여 앱타머의 염기서열을 결정하였다. 서열 분석을 통하여 중복되지 않은 β-amyloid 결합 DNA 앱타머 서열 20개를 확보할 수 있었다.
실시예 5: 나노드랍을 이용한 β-amyloid 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군의 친화도 테스트
β-amyloid에 최적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하기 위하여 상기 실시예 4를 통해 확보한 앱타머 서열을 가지는 클론을 이용하여 ssDNA 앱타머를 제작하였다. 각각의 서열을 가지는 앱타머는 동일한 농도로 제작하여 SELEX를 재진행(post SELEX)하여 회수된 앱타머의 농도를 나노드랍을 이용하여 측정하였다.(도 3 참조)
하기 표 1은 상기 post SELEX 및 나노 드랍을 진행한 결과 선별된 5개의 앱타머 서열을 나타낸 것이다. 하기 표 1의 5개 서열은 실시 예 4의 서열에 있어서 Aβ-1 (도 3의 1번), Aβ-2 (도 3의 7번), Aβ-3 (도 3의 11번), Aβ-4 (도 3의 14번), Aβ-5 (도 3의 18번)이다.
명칭 서열번호 선별된 서열 서열크기(bp)
Aβ-1 서열번호 1 CGCCTATCGGAGAGCTACCGACTGCGCGCTTTGAGTTCCG 40
Aβ-2 서열번호 2 CCCCGGTAACTTTCAAACCAGCATCAGTAACTCTGAGTTG 40
Aβ-3 서열번호 3 ACGGAGGTTGCTTATTCTCTGTAGTCGCACCTTTTTGGCT 40
Aβ-4 서열번호 4 CCTTGCGCCCTGACAACGTGAGAAGTCTCCACACTCTGGG 40
Aβ-5 서열번호 5 CGAGTTGATGTGTGGTGACTTTTACCTTATAAACTTTTAC 40
실시예 6: β-amyloid 단백질 결합 DNA 앱타머의 구조 결정
β-amyloid 결합 DNA 앱타머 후보군들의 구조는 Rensselear polytechnic institute에서 제공하는 DNA mfold 프로그램을 활용하여 이미지화 할 수 있었다 (도 4 내지 도 8 참조).
실시예 7: SPR을 통한 β-amyloid 단백질 결합 DNA 앱타머의 검출능 테스트
7-1. β-amyloid과 결합하는 DNA 앱타머 후보군의 친화도 테스트를 위한 앱타머 고정칩 제작 실험
상기 실시 예 5 에서 β-amyloid에 대한 친화도가 높은 것으로 확인된 앱타머에 대하여 β-amyloid 검출능을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 SPR 검출 시스템 기기인 BIAcore X100(BIACORE)을 이용하여 표면 플라즈몬 공명 (Surface Plasmon Resonance, SPR) 실험을 실시하였다. SPR 실험을 위하여 표면이 스트렙트아비딘으로 코팅된 센서 칩 SA (GE Healthcare)를 이용하였다. 우선 스트렙트아비딘이 고정된 센서칩에 앱타머를 고정시키기 위하여 Aβ-1, Aβ-2, Aβ-3, Aβ-4, Aβ-5 앱타머의 5′에 바이오틴을 표지하여 ssDNA를 제작하였다. 센서칩 SA의 표면은 HBS-EP buffer (GE Healthcare)를 10 ㎕/min으로 흘려주어 표면을 활성화시킨 후에 기제작한 바이오틴이 표지된 앱타머를 스트렙트아비딘으로 코팅된 센서 칩 SA 채널 2에 10 ㎕/min으로 6분 동안 3회 흘려줌으로써 센서 칩 SA에 스트렙트아비딘-바이오틴 결합을 통해 앱타머를 고정시켰다.
7-2. 최적 β-amyloid 결합 DNA 앱타머의 표적 β-amyloid과의 친화력 평가
β-amyloid 특이결합 앱타머의 정략적 친화도 평가를 위하여 β-amyloid 단백질을 1X PBS buffer에 농도별로 희석하여 준비하였다. 제작한 β-amyloid은 아무것도 결합시키지 않은 센서칩 (채널 1), β-amyloid 결합 DNA 앱타머가 고정된 센서칩 (채널 2)에 농도별로 희석한 β-amyloid 용액을 5 ㎕/min의 속도로 10분 동안 처리하여 β-amyloid 단백질과 DNA 앱타머 후보군간의 친화도를 정량화 할 수 있었다. 표적 β-amyloid 단백질과 DNA 앱타머 후보군의 해리상수 (KD, dissociation) 수득 결과는 아래의 표 2에 나타내었다.
클론 명칭 서열번호 KD value(M)
Aβ-1 서열번호 1 6.62 x 10-11
Aβ-2 서열번호 2 1.35 x 10-10
Aβ-3 서열번호 3 2.43 x 10-11
Aβ-4 서열번호 4 7.99 x 10-11
Aβ-5 서열번호 5 5.50 x 10-10
7-3. β-amyloid 결합 DNA 앱타머의 특이성 평가를 위한 결합력 평가
β-amyloid 결합 앱타머인 Aβ-3와 표적 β-amyloid 단백질이 아닌 다른 단백질과의 정략적 친화도 평가를 위하여 알츠하이머 질병과 관련된 단백질(BSA, Tau, β-secretase, TTR, α-synuclein)을 동일한 농도별로 1X PBS buffer에 희석하여 준비하였다. 제작한 대조군 단백질은 아무것도 결합시키지 않은 센서칩 (채널 1), β-amyloid 결합 DNA 앱타머가 고정된 센서칩 (채널 2)에 준비한 β-amyloid 단백질과 대조군 단백질들을 5 ㎕/min의 속도로 10 분 동안 처리하여 표적 β-amyloid 단백질이 아닌 다른 단백질과의 DNA 앱타머 후보군간의 친화도를 정량화 할 수 있었다 (도 9). β-amyloid 단백질 결합 DNA 앱타머 후보군의 해리상수 (KD, dissociation) 수득 결과, 표적 β-amyloid 단백질은 낮은 해리상수가 관찰되었으나 표적 단백질이 아닌 대조군 단백질에서는 높은 값의 해리상수가 관찰 되었다.
실시예 8: SPR을 통한 β-amyloid 단백질 결합 DNA 앱타머의 검출능 테스트
8-1. β-amyloid 단백질 농도에 따른 β-amyloid 특이결합 DNA 앱타머의 경향성 측정
상기 실시예 7에서 선별한 β-amyloid 결합 앱타머 Aβ-1와 Aβ-3를 사용하여 β-amyloid 단백질 농도에 따른 β-amyloid 결합 DNA 앱타머의 결합 양상을 확인하였다. 상기 Aβ-1 DNA 앱타머를 아민기로 표지하고 1 μM 농도로 계산하여 1X 앱타머 선별용액으로서 전체 반응 부피를 100 ㎕로 조정한 후 NOS group으로 코팅된 well에 처리하여 상온에서 30분 동안 DNA 앱타머를 well에 고정시켰다. 상기 아민기가 표지된 Aβ-1 DNA 앱타머가 고정된 well를 1X PBS buffer로 세척한 후, 1X PBS buffer로 희석한 β-amyloid 단백질을 0.312 ng/㎖, 0.625 ng/㎖, 1.25 ng/㎖, 2 ng/㎖, 5 ng/㎖의 5개 농도를 각 well에 넣고 4℃에서 1시간 교반하며 반응시켰다. 이후 1X PBS buffer로 결합하지 못한 물질들을 제거하고 상기 앱타머 Aβ-3에 Cy5 형광물질을 표지하여 1 μM로 계산하고 1X 앱타머 선별용액으로서 최종 용액 100 ㎕가 되도록 채운 후 well에 넣었다. Well을 호일로 싸서 빛을 차단한 상태로 상온에서 20분 동안 반응시켰다. 각 well 마다 Cy5 형광물질 표지된 Aβ-3 앱타머 용액을 제거한 후 1X PBS buffer 100 ㎕로 세척하고 Excitation 646 nm와 Emission 662 nm에서 각 well마다의 형광값을 ELISA Reader로 측정하였다.
Negative control로서 NOS group (A), Cy5 형광물질로 표지된 Aβ-3 앱타머 (B), 아민기 표지 Aβ-1 앱타머 및 β-amyloid 단백질만을 처리한(C) 시료의 형광을 측정하였다. ELISA Reader를 이용한 형광 측정결과, β-amyloid 단백질을 넣지 않은 샘플들인 A, B시료에서는 형광값이 거의 나타나지 않았으나 β-amyloid이 존재한 시료에서는 높은 형광값이 측정되었으며, β-amyloid의 농도가 높아짐에 따라 형광값이 높아지는 것으로 측정되었다. (도 10, 도 11 참고).
8-2. β-amyloid 단백질과 이에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머의 특이성 실험
상기 실시예 7에서 선별한 β-amyloid 결합 앱타머 Aβ-1와 Aβ-3를 사용하여 β-amyloid 단백질에 대한 β-amyloid 결합 DNA 앱타머의 특이성을 실험하였다.
NOS group (N-oxysuccinimide esters group)으로 코팅된 각 well에 아민기 (NH2)로 표지된 Aβ-1 앱타머를 1 μM 농도로 계산하여 1X 앱타머 선별용액으로 전체 반응 부피를 100 ㎕로 조정하여 넣어주고 상온에서 30분 동안 교반하며 고정시킨 후 용액을 제거하였다. 상기 아민기가 표지된 Aβ-1 DNA 앱타머가 고정된 well를 1X PBS buffer 100㎕로 3회 헹궈준 후, β-amyloid 단백질 및 네가티브 컨트롤(Negative control)로 α-synuclein, β-secretase, Phos-pho tau, TTR, BSA 단백질을 각각 100 nM로 계산한 후 최종 용액 100 ㎕가 되도록 1X PBS buffer로 채워 각 well에 넣어 4℃에서 1시간 동안 교반하며 반응시켰다.
이후 각 well 마다 들어있는 단백질 반응 용액들을 제거하고 1X PBS buffer 100 ㎕로 3회 헹궈주어 β-amyloid 단백질을 제외한 비특이적인 물질들을 세척하여 제거하였다. 상기 실시예 7에서 선별된 앱타머 Aβ-3에 Cy5 형광물질을 표지하여 1 μM로 계산하고 1X 앱타머 선별용액으로 최종 용액 100 ㎕가 되도록 채운 후 well에 넣었다. Well을 호일로 싸서 빛을 차단한 후 상온에서 20분 동안 교반하며 반응시켰다. 각 well 마다 Cy5 형광물질이 표지된 Aβ-3 앱타머 용액을 제거한 후 1X PBS buffer 100 ㎕로 세척하고 Excitation 646 nm와 Emission 662 nm에서 각 well마다의 형광값을 ELISA Reader로 측정하였다.
Negative control로서 NOS group (A), Cy5 형광물질로 표지된 Aβ-3 앱타머 (B), 아민기 표지 Aβ-1 앱타머와 β-amyloid 단백질만을 처리한(C) 시료도 측정하였다. ELISA Reader를 이용한 형광 측정결과, β-amyloid 단백질을 넣지 않은 샘플들인 A, B 및 α-synuclein, β-secretase, Phos-pho tau, TTR, BSA를 처리한 시료에서는 형광값이 거의 나타나지 않았으나 β-amyloid가 존재한 시료에서는 높은 형광값이 측정되었다. 또한 아민기 표지 Aβ-1 앱타머와 β-amyloid 단백질만을 처리한(Cy5 형광물질이 부착된 Aβ-3 앱타머가 처리되지 않은) C 샘플도 형광값이 거의 나타나지 않음을 확인할 수 있었다 (도 12 참고).
8-3. β-amyloid 특이결합 DNA 앱타머를 활용한 인체 시료내 β-amyloid 진단 평가
상기의 실시 예를 통해 제작, 확보한 β-amyloid 결합 DNA 앱타머의 치매 진단 및 예후 진단의 산업적 활용 가능성을 확인하기 위하여, 인체 시료를 이용한 β-amyloid 검출 실험을 진행하였다.
먼저, 인간 혈청에 표적 단백질인 β-amyloid, α-synuclein, β-secretase, phos-pho Tau, TTR, BSA 단백질을 각각 다른 인간 혈청에 1 ug씩 첨가하여 각각의 단백질들이 포함된 혈청 시료들을 준비하였다.
β-amyloid 결합 항체와의 비교를 위하여, 구입한 β-amyloid ELISA kit를 활용하여 상기 실시예 8-1과 유사한 방법으로 실험을 진행하였다.
그리고 선별한 β-amyloid 특이 결합 DNA 앱타머를 활용하여 상기 β-amyloid ELISA kit를 이용한 실험과 동일하게 실험을 진행하였다.
실시예 7에서 선별한 앱타머 Aβ-1을 아민기로 표지하여 NOS group을 가지고 있는 well에 상온에서 30분 동안 교반하여 고정화시켰다. 상기 아민기 표지 Aβ-1이 고정된 well에 앞서 준비한 혈청 시료들을 각각 첨가하여 4℃에서 1시간 동안 반응시킨다. 이후 비특이적인 물질들을 제거하기 위하여 세척과정을 진행한 후, 상기 실시예 7에서 선별된 Aβ-3 앱타머에 Cy5 형광물질을 표지하여 시료를 처리했던 well에 넣어 반응시켰다. 인체 시료 내에 β-amyloid 단백질이 존재하는 경우 형광 발광이 이루어지는 원리로 실험을 진행하였다. 실험결과 선별한 β-amyloid 특이결합 DNA 앱타머가 복합물질인 인체 내 시료에서도 베타 아밀로이드 단백질을 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하였다(표 3 참조)
Serum Type Antibody Detection(pg/mL) Aptamer Detection(pg/mL)
A Normal 99.4±0.86 121.8±3.28
B Normal 85.8±1.39 967.2±2.89
C Normal 93.8±1.87 94.6±1.31
A+β-amyloid Spiking β-Amyloid 831.5±12.65 964.7±9.04
B+β-amyloid Spiking β-Amyloid 844.3±22.65 1002.4±6.26
C+β-amyloid Spiking β-Amyloid 901.1±16.62 1011.3±8.66
<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> DNA Aptamer Specifically Binding to beta-amyloid protein and Its Use <130> DP2019-0026 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence <400> 1 cgcctatcgg agagctaccg actgcgcgct ttgagttccg 40 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence <400> 2 ccccggtaac tttcaaacca gcatcagtaa ctctgagttg 40 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence <400> 3 acggaggttg cttattctct gtagtcgcac ctttttggct 40 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence <400> 4 ccttgcgccc tgacaacgtg agaagtctcc acactctggg 40 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence <400> 5 cgagttgatg tgtggtgact tttaccttat aaacttttac 40 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 6 ataccagctt attcaatt 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> backward primer <400> 7 agatagtaag tgcaatct 18 <210> 8 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 8 ataccagctt attcaattcg cctatcggag agctaccgac tgcgcgcttt gagttccgag 60 atagtaagtg caatct 76 <210> 9 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 9 ataccagctt attcaattcc ccggtaactt tcaaaccagc atcagtaact ctgagttgag 60 atagtaagtg caatct 76 <210> 10 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 10 ataccagctt attcaattac ggaggttgct tattctctgt agtcgcacct ttttggctag 60 atagtaagtg caatct 76 <210> 11 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 11 ataccagctt attcaattcc ttgcgccctg acaacgtgag aagtctccac actctgggag 60 atagtaagtg caatct 76 <210> 12 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 12 ataccagctt attcaattcg agttgatgtg tggtgacttt taccttataa acttttacag 60 atagtaagtg caatct 76 <210> 13 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> template <400> 13 ataccagctt attcaattnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnag 60 atagtaagtg caatct 76 <210> 14 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40

Claims (7)

  1. 코어 서열; 및
    상기 코어 서열의 5'말단 및 3'말단에 각각 연결된 프라이머 서열을 포함하는 DNA 앱타머로서,
    상기 코어 서열은 서열번호 1 내지 서열번호 5 로 구성된 군에서 선택되는 염기서열로 이루어지고,
    상기 DNA 앱타머의 전체 서열의 길이는 76 내지 80bp이고,
    베타 아밀로이드에 특이적으로 결합하는,
    DNA 앱타머.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 코어 서열의 5'말단에 연결된 프라이머 서열은 서열번호 6의 염기서열로 이루어지고,
    상기 코어 서열의 3'말단에 연결된 프라이머 서열은 서열번호 7의 염기서열로 이루어지고,
    상기 DNA 앱타머의 전체 서열의 길이는 76bp인,
    DNA 앱타머.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 DNA 앱타머는
    베타 아밀로이드와 결합 시 해리상수값(Kd)이 0.01 내지 0.5 nM인,
    DNA 앱타머.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 DNA 앱타머는
    알파 시누클레인(α-synuclein), 베타 세크레타제(β-secretase), 타우 단백질(Tau), TTR 단백질, 또는 BSA 단백질 중 어느 하나와 결합 시 해리상수값(Kd)이 1nM 이상인,
    DNA 앱타머.
  5. 제 1 항의 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경뇌질환 진단용 조성물.
  6. 제 5 항의 퇴행성 신경뇌질환 진단용 조성물을 포함하는 퇴행성 신경뇌질환 진단 키트.
  7. 제 5 항의 진단용 조성물을 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 퇴행성 신경뇌질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
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