KR20170096908A - 베타-아밀로이드 올리고머에 대한 압타머 및 이의 용도 - Google Patents

베타-아밀로이드 올리고머에 대한 압타머 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 베타-아밀로이드 올리고머에 특이적으로 결합하는 압타머 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 베타-아밀로이드 올리고머에 특이적으로 결합하는 압타머, 상기 압타머와 결합되는 화합물, 상기 화합물을 포함하는 영상화용 조영제 및 초기치매 또는 알츠하이머 질환 진단용 조성물에 관한 것이다. 나아가, 본 발명은 상기 압타머와 결합된 화합물을 이용하여 초기치매 또는 알츠하이머 치료제를 모니터링 및 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다.

Description

베타-아밀로이드 올리고머에 대한 압타머 및 이의 용도{Aptamer for beta oligomeric amyloids and uses thereof}
본 발명은 베타-아밀로이드 올리고머에 특이적으로 결합하는 압타머 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 베타-아밀로이드 올리고머에 특이적으로 결합하는 압타머, 상기 압타머와 결합되는 화합물, 상기 화합물을 포함하는 영상화용 조영제 및 초기 치매 또는 알츠하이머 질환 진단용 조성물에 관한 것이다. 나아가, 본 발명은 상기 압타머와 결합된 화합물을 이용하여 초기치매 또는 알츠하이머 치료제를 모니터링 및 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다.
노화에 의해 발생하는 대표적 질환 중 하나인 알츠하이머병(Alzheimer's disease) 또는 치매 관련 신경계 질환은 난치성 질환으로서, 파킨슨병, 헌팅턴병 등의 퇴행성 뇌질환과 혈관성 치매, 당뇨성 치매 등의 만성 질환과 연관이 있는 것으로 알려져 있다. 상기 질병들은 뇌 속의 염증이나 바이러스, 세균, 대사체, 중금속 유입 및 스트레스 등으로 인하여 별아 세포와 글리아 세포 내에 활성산소 (ROS)가 증가하면서 염증반응을 유도하는 사이토카인과 케모카인의 분비가 촉진됨에 따라 염증상태가 촉발되고, 뇌신경세포들의 상해가 서서히 진행되면서 최종적으로 신경 사멸로 도달된다. 즉 해마 및 대뇌피질의 신경세포가 감소되면서 뇌 공간에 점차 빈 곳이 생기게 되며, 이로 인해 인지능력과 언어장애 및 행동장애가 발생하고 결국 사망케 되는 질환이다. 최근에는 노인층 뿐만 아니라 청년층에서도 유발되는 심각한 질환으로 알려져 있다.
치매 또는 알츠하이머의 발병 원인은 아직까지 명확히 규명되지는 않았으나, 현재까지 보고된 원인으로 베타-아밀로이드 (Aβ42), 타우(tau), 아포이4(ApoE4), 엘디엘알(LDLR), 인터루킨-1베타(IL-1β), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-6(IL-6) 그리고 인터루킨-13(IL-13)과 같은 여러 사이토카인에 의하여 증세가 진행된다고 알려져 있다(Frank L. Heppner, Richard M. Ransohoff, & Burkhard Becher. Immune attack: the role of inflammation in Alzheimer disease, Nature Reviews Neuroscience,16,358-372(2015)).
특히 베타-아밀로이드 (Aβ42)는 아밀로이드 전구단백질이 베타 세크라타제, 감마세크라타제 및 알파세크라타제에 의해 생성하는 C말단 절편인 C말단 99(CT99)에서 유래한 펩타이드 절편으로서, 처음 모노머 상태에서 생성되다가 어떤 원인에 의해 수용성인 올리고머 상태로 생성되어 세포내·외로 내포화와 외포화가 진행되면서 신경세포를 지속적으로 사멸시킨다. 따라서, 실제로 생체 내에서 치매 또는 알츠하이머 질환의 시작은 베타-아밀로이드 올리고머가 생성되는 것에 기한 것으로 보는 것이 가장 설득력이 있다(Tarasoff-Conway JM, Carare RO, Osorio RS, Glodzik L, Butler T, Fieremans E, Axel L, Rusinek H, Nicholson C, Zlokovic BV, Frangione B, Blennow K, Menard J, Zetterberg H, Wisniewski T, de Leon MJ.Clearance systems in the brain-implications for Alzheimer disease.Nat Rev Neurol. 2015 Jul 21),(Frank L. Heppner, Richard M. Ransohoff, & Burkhard Becher, Immune attack: the role of inflammation in Alzheimer disease.Nature Reviews Neuroscience 16, 358-372 (2015)).
기존에 치매 또는 알츠하이머 질환 진단을 위해 연구된 물질로서, 이-5-스티릴 2,2′-비티오페네((E)-5-styryl-2,2′-bithiophene) 유도체, 디페닐프로피론 유도체, 씨알-비에스에이-(지디-디티피에이; CR-BSA-(Gd-DTPA), 5′-(4-하이도록실페닐)[2′,2′-비티오펜]-5-일]메틸렌]-프로파노디니트렐 NIAD-4, 18에프-표지 6-아미노-2-(4-프로로페닐)-1,3-벤조티아졸과 그 유도체, 6-(3′-[18플루]플루 프로필)-2-(4′-디메칠아미노)페닐이미다졸[1,2-알파] 피리딘, 가드륨-도타-항체 에이베타42, 메토시-에스40, 마가네틱 조영제 등이 있으나, 이들을 이용하여서 치매를 정확히 조기에 진단하기에는 어려움이 있다.
또한, 상대적으로 비침습적인 방법을 이용하여 치매 또는 알츠하이머를 진단하기 위한 방법으로 글루타민 합성효소를 지표로 한 진단 키트(WO2002/088706), 후성유전적마커인 DNA 메틸화 정도를 확인하는 방법을 이용한 진단 방법(WO2010/144634) 등이 존재하나, 증상이 나타나기 전 초기에 진단할 수 있는 신뢰성 있는 방법은 아직 부족한 실정이다.
특히, 치매 또는 알츠하이머와 같은 퇴행성 뇌질환의 경우, 이를 증세가 나타나기 이전, 초기에 발견하는 것이 가장 안전하고 효율적으로 치료할 수 있는 방법인 바, 조기에 정확하게 진단해 낼 수 있는 방법이 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 베타-아밀로이드 올리고머에 특이적으로 결합하고, 서열번호 1의 염기서열을 포함하며, 총 염기 길이가 25 내지 100개인 압타머를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 베타-아밀로이드 올리고머에 특이적으로 결합하는 상기 압타머와 결합된 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물을 포함하는, 자기공명영상 조영제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물을 포함하는, 초기 치매 또는 알츠하이머 진단용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물을 환자의 시료와 반응시키는 단계를 포함하는, 초기 치매 또는 알츠하이머 진단에 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 초기 치매 또는 알츠하이머 환자의 시료에 치매 또는 알츠하이머 치료제를 처리하는 단계, 및 상기 시료에서 치매 또는 알츠하이머 치료제를 처리하기 전과 처리한 후의 상기 화합물의 결합 정도를 측정하는 단계를 포함하는, 초기 치매 또는 알츠하이머 치료제의 모니터링 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 초기 치매 또는 알츠하이머 환자의 시료에 치매 또는 알츠하이머 치료제 후보물질을 처리하는 단계, 및 상기 시료에서 후보물질을 처리하기 전과 처리한 후의 상기 화합물의 결합 정도를 측정하는 단계를 포함하는, 초기 치매 또는 알츠하이머 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 구현예는 베타-아밀로이드 올리고머에 특이적으로 결합하고, 서열번호 1의 염기서열을 포함하며, 총 염기 길이가 25 내지 100개인 압타머(aptamer)에 관한 것이다.
본 발명에서, “베타-아밀로이드”란, 아밀로이드의 주요 구성 성분으로서, 아밀로이드 전구체 단백질(amyloid precursor protein; APP) 로부터 프로테아제의 작용에 의해 생산되는 40 내지 42 아미노산으로 이루어지는 펩타이드로 알려져 있다("Amyloid β-protein (Aβ) assembly: Aβ40 and Aβ42 oligomerize through distinct pathways." Proc Natl Acad Sci USA 100(1):330-5).
본 발명에서, “베타-아밀로이드 올리고머”란, 아밀로이드 전구체 단백질이 베타-분해효소에 의해 베타-아밀로이드 40 또는 42(Aβ 40 또는 Aβ42) 단량체(monomer)가 된 후 집적하여 형성된 복합체를 말한다. 예를 들어, 베타-아밀로이드 40 올리고머, 베타-아밀로이드 42 올리고머, 및 베타-아밀로이드 40 올리고머 및 베타-아밀로이드 42 올리고머 중 적어도 하나가 포함된 올리고머 일 수 있다.
이러한 여러 단계의 베타-아밀로이드 중에서 올리고머가 되는 상태부터 뇌에 강한 신경 독성을 나타내어 뇌세포를 사멸시키게 된다(Walsh, D. M., I. Klyubin, et al. (2002)). "Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo." Nature 416(6880):535-9).
본 발명에서, “압타머”란 특정 물질에 대해 높은 특이성과 친화도를 가지는 단일가닥 DNA 또는 RNA를 말한다. 압타머는 특정 물질에 대한 친화도가 매우 높고 안정하고, 비교적 단순한 방법으로 합성할 수 있으며, 결합력을 높이기 위해 다양한 변형이 가능하고, 세포, 단백질, 및 작은 유기물질까지도 표적물질이 될 수 있기 때문에, 그 특이성 및 안정성이 이미 개발되어 있는 항체에 비해 매우 높은 특징이 있다.
구체적으로, 본 발명의 압타머는 베타-아밀로이드 올리고머에 특이적으로 결합하는 압타머를 말한다. 상기 압타머는 서열번호 1의 염기서열을 포함하고, 베타-아밀로이드 올리고머에 특이적으로 결합하는 것이라면 특별히 제한되지 않으나, 총 염기 길이가 25 내지 100개, 바람직하게는 25 내지 80개, 보다 바람직하게는 25 내지 50개의 염기로 이루어진 것일 수 있다. 특히, 하기 표 1의 서열번호 1 내의 밑줄 표시된 염기 서열, 'GGTACCGTCACACTGCTGCCAA'만 포함되면 압타머 기능을 할 수 있는바, 상기 22개 염기 서열만 포함하는 것이면, 그 외 부분의 염기 서열은 변경될 수 있다.
아울러, 상기 핵산 압타머에 포함되는 각 뉴클레오티드는 동일하거나 상이한 하나 이상의 화학적 변형을 포함할 수 있는데, 예컨대, 리보스의 2' 위치에 있어서, 히드록실기가 임의의 원자 또는 기로 치환되어 있는 뉴클레오티드일 수 있다. 이러한 임의의 원자 또는 기로서는, 예컨대, 수소 원자, 불소 원자 또는 -O-알킬기 (예:-O-CH3), -O-아실기 (예, -O-CHO), 아미노기(예, -NH2)로 치환되어 있는 뉴클레오티드를 들 수 있다. 또한, 핵산 압타머는 단일가닥 RNA 또는 DNA로 제공되는 것으로서, 본 발명에서 상기 핵산이 RNA인 경우에는 서열번호 1의 핵산서열에서 T는 U로 표시되며, 이러한 서열이 본 발명의 범위에 포함됨은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 자명한 사항이라 할 것이다.
또한, 본 발명은 베타-아밀로이드 올리고머에 특이적으로 결합하는 상기 압타머와 결합된 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 상기 압타머는 5' 말단 부위, 중간 부위, 3' 말단 부위, 또는 양 말단 부위에 당업계에 널리 사용되는 검출 표지가 결합될 수 있다. 구체적으로, 상기 검출 표지는 형광물질, 자성체, 염색물질, 양자점(Quantum dot), 상자성 입자(super paramagnetic particles), 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles), 발색효소, 방사성동위원소로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있다. 일례로, 발색효소(예: 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제), 방사성 동위원소(예:124I, 125I, 111In, 99mTc, 32P, 35S), 크로모포어(chromophore), FITC, RITC, 형광단백질(GFP(Green Fluorescent Protein); EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein), RFP(Red Fluorescent Protein); DsRed(Discosoma sp.red fluorescent protein); CFP(Cyan Fluorescent Protein), CGFP(Cyan Green Fluorescent Protein),YFP(Yellow Fluorescent Protein), Cy3, Cy5 및 Cy7.5 등을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명자들은 상기 본 발명의 압타머에 검출표지 중 하나인 양자점(Quantum dot) Qd525, Qd565 또는 Cy5를 각각 결합시킨 화합물이 베타-아밀로이드 올리고머와 특이적으로 결합하여 기존의 조영제보다 훨씬 이른 시기에 이를 검출해내는 것을 확인하였다(실험예 1 내지 4). 이로부터 상기 본 발명의 압타머를 결합시킨 화합물을 이용하여 초기에 초기 치매 또는 알츠하이머를 진단해낼 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명은 상기 압타머와 가돌리늄(gadolinium, Gd) 또는 가돌리늄 착물이 결합된 화합물에 관한 것이다.
상기 압타머와 결합되는 가돌리늄 착물은 가돌리늄에 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(1,4,7,10- tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetracetic acid: DOTA) 또는 다이에틸렌트리아민펜타아세트산(diethylenetriamine pentaacetic acid, DTPA)이 결합된 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 압타머와 가돌리늄 또는 가돌리늄 착물이 결합된 화합물은, 가돌리늄 또는 가돌리늄 착물 입자이거나 상기 입자를 함유하는 구조체를 포함하는 것으로서, 입자의 크기는 직경이 100nm 이하의 입자, 바람직하게는 25nm 이하일 수 있다.
상기 본 발명의 압타머와 가돌리늄 또는 가돌리늄 착물이 결합된 화합물은 베타-아밀로이드 올리고머에 대한 결합 여부의 확인, 검출 및 영상화를 용이하게 하기 위하여 검출 표지에 직접 결합되거나 링크를 통해 결합되어 제공될 수 있다.
상기 검출 표지는 영상화 또는 이미징이 가능하도록 하는 방사선 동위원소, 플루오로포어, 양자점(quantum dot), 또는 자성입자, 예를 들어 상자성입자(super paramagnetic particles) 또는 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 일 구현예는 상기 본 발명에 따른 화합물을 포함하는, 초기 치매 또는 알츠하이머 질환 부위의 영상화용 조영제에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 자기공명영상(magnetic resonance imaging, MRI) 조영제에 관한 것이다.
본 발명에서 “초기치매”는 경도인지 장애 (mild cognitive impairment)인 기억력을 비롯해 언어 능력, 시지각 및 시공간 구성 능력, 실행 기능 등의 인지 기능 감퇴로 대인 관계, 직업 기능 및 일상생활 기능에 현저한 지장이 초래되는 치매과정보다 앞단계로 동일 연령대보다 인지능력이 감퇴된 상태시점을 의미한다.
본 발명에서“조영제”란, 진단을 목적으로 하여 혈관이나 조직 등이 보다 잘 보이도록 인위적으로 대조도의 차를 만들어 영상으로 나타내기 위해서 사용되는 제제를 말한다. 조영제는 연구 대상 표면의 가시도 및 대조도를 증가시킴으로써, 질환 또는 손상의 존재 여부 및 그 정도를 결정할 수 있다.
본 발명의 조영제는 베타-아밀로이드 올리고머가 존재하는 조직의 질환 부위에 높은 민감도 및 정확도로 결합함으로써, 가시도 및 대조도를 증가시켜 초기에 초기 치매 또는 알츠하이머의 발병 정도를 확인할 수 있도록 하였다.
본 발명의 조영제는 자기공명영상(magnetic resonance imaging, MRI), X-선 영상화 기술, 또는 PET(positron emission tomography)를 비롯한 핵 영상화 등에 적용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
자기공명영상(MRI)은 자기장 안에서 수소 원자의 스핀이 이완되는 현상을 이용해 신체의 해부학적, 생리학적, 생화학적 정보를 영상으로 얻는 영상 진단 기술을 말한다. 본 발명을 자기공명영상을 위한 조영제에 적용하는 경우, 당업계에서 널리 사용되는 상자성 입자 또는 초상자성 입자를 사용할 수 있다. 예를 들어, 상자성 입자의 경우 가돌리늄(Gd), 철(Fe), 망간(Mn) 등의 전이금속이온을 사용할 수 있고, 초상자성 입자로는 초상자성 산화철(superparamagnetic iron oxide) 등을 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 자기공명영상 조영제에 적용하기에 적합한 압타머가 결합된 가돌리늄(Gd)입자의 직경은 50nm이하, 바람직하게는 40nm 이하, 보다 바람직하게는 25nm 이하일 수 있다.
본 발명자들은 상기 압타머에 가돌리늄(Gd) 또는 가돌리늄에 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(1,4,7,10- tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetracetic acid: DOTA) 또는 다이에틸렌트리아민펜타아세트산(diethylenetriamine pentaacetic acid, DTPA)이 결합된 가돌리늄 착물의 화합물이 베타-아밀로이드 올리고머와 특이적으로 결합하여 기존의 조영제보다 훨씬 이른 시기에 이를 검출해내는 것을 확인하였다(실험예 5, 6 및 도 20).
본 발명의 또 다른 일 구현예는 상기 압타머가 결합된 화합물을 포함하는, 초기 치매 또는 알츠하이머 진단용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 초기 치매 또는 알츠하이머 진단용 약학 조성물은 비경구로 투여되고, 정맥내, 피하근육내, 복강내 등의 경로로 투여될 수 있으며, 정맥내로 투여하는 것이 바람직하다. 비경구용 제제로는 주사제, 직장용 제제, 경피용 제제의 형태로 투여할 수 있고, 정맥주사제로서 예를 들면 현탁제 또는 액제의 형태로 투여할 수 있다.
또한 본 발명은 일반적으로 허용되는 부형제, 붕해제, 결합제, 윤활제, 용해제, 보존제, 안정제, 완충제 등과 혼합하여 원하는 비경구용 제제의 투여형태로 제조될 수 있다. 본 발명은 정상인(표준 체중 60kg) 을 기준으로 1mg 내지 200mg 투여범위 내에서 1일 1회 투여할 수 있는 약학조성물로 제공될 수 있으나 반드시 이에 제한되는 것은 아니며 환자의 연령, 질병의 정도, 치료유형 등에 따라 조절할 수 있다.
그러므로 본 발명에 따른 초기 치매 또는 알츠하이머 진단용 약학 조성물은 알츠하이머성 초기 치매, 혈관성 초기 치매 또는 당뇨성 초기 치매 또는 알츠하이머 진단에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 초기 치매 또는 알츠하이머 질환의 영상화 및 진단은, 이에 제한되는 것은 아니나, 초기 치매 또는 알츠하이머 질환의 초진 목적 뿐만 아니라 진행 경과, 초기 치매 또는 알츠하이머 질환의 치료 경과, 치료제에 대한 반응 모니터링 등에 포괄적으로 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 구현예는 상기 압타머가 결합된 화합물을 환자의 시료와 반응시키는 단계를 포함하는,초기 치매 또는 알츠하이머 진단에 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명은
상기 압타머가 결합된 화합물을 초기치매 또는 알츠하이머 환자의 시료와 반응시키는 단계, 및
상기 환자의 시료에서의 압타머가 결합된 화합물의 결합 정도를 측정하는 단계를 포함하고,
상기 환자의 시료에서의 압타머가 결합된 화합물의 결합 정도가 정상 시료에서의 결합 정도보다 높은 경우 상기 환자를 초기치매 또는 알츠하이머 환자로 판단하는 것을 특징으로 하는, 초기치매 또는 알츠하이머 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명에서의 “시료”는 베타-아밀로이드 올리고머를 함유하거나 또는 함유할 것으로 추정되는 임의의 물질을 말한다. 시료는 천연 또는 합성된 것일 수 있고, 통상의 기술자에게 공지된 임의 수단을 통해 수득될 수 있다. 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈장, 혈청, 혈액, 타액, 객담, 림프액, 뇌척수액, 세포간액 또는 뇨 뿐만 아니라, 시험관 내 세포 배양 성분의 시료, 예를 들면, 세포 성분, 세포배양배지, 재조합세포 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 “환자의 시료”는 초기 치매 또는 알츠하이머의 발병 여부를 판단할 대상 개체로부터 얻어진 생물학적 시료를 말하며, 조직, 세포, 전혈, 혈장, 혈청, 혈액, 타액, 객담, 림프액, 뇌척수액, 세포간액 또는 뇨일 수 있다.
본 발명에서 “정상 시료”는 초기 치매 또는 알츠하이머가 발병하지 않은 개체로부터 얻어진 생물학적 시료를 말한다.
상기 생물학적 시료에서 압타머가 결합된 화합물의 결합 정도를 측정하는 단계는 관련 기술분야에서 통상적으로 사용되는 DNA 압타머 결합 측정 기술을 이용하여 수행될 수 있으며, 예컨대, 압타머 말단에 형광 또는 방사성 물질을 표지하여 형광 또는 방사성 세기를 측정하거나, 가돌리늄 또는 가돌리늄 착물 등을 결합하여 자기공명영상으로 이미지화하여 관찰하는 방법 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 일 구현예는,
초기 치매 또는 알츠하이머 환자의 시료에 초기 치매 또는 알츠하이머 치료제를 처리하는 단계;
상기 시료에 압타머가 결합된 화합물을 처리하는 단계; 및
상기 시료에서 초기 치매 또는 알츠하이머 치료제를 처리하기 전과 처리한 후의 압타머가 결합된 화합물의 결합 정도를 측정하는 단계를 포함하는, 초기치매 또는 알츠하이머 치료제의 모니터링 방법에 관한 것이다.
본 발명에서는 초기 치매 또는 알츠하이머 치료제를 처리한 시료에 대하여 본 발명의 압타머가 결합된 화합물을 처리한 후 압타머가 결합된 화합물의 결합 정도의 변화를 측정함으로써, 해당 초기치매 또는 알츠하이머 치료제의 치료 효과를 모니터링 할 수 있다. 예를 들어, 치매 또는 알츠하이머 치료제의 처리에 따라 시료 내 압타머 결합체의 검출 정도가 감소하는 경우, 해당 초기 치매 또는 알츠하이머 치료제의 치료 효과가 우수한 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 구현예는,
초기 치매 또는 알츠하이머 환자의 시료에 치매 또는 알츠하이머 치료제 후보물질을 처리하는 단계;
상기 시료에 압타머가 결합된 화합물을 처리하는 단계; 및
상기 시료에서 후보물질을 처리하기 전과 처리한 후의 압타머가 결합된 화합물의 결합 정도를 측정하는 단계를 포함하는, 초기 치매 또는 알츠하이머 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명에서는 초기 치매 또는 알츠하이머 치료제 후보물질을 처리한 시료에 대하여 본 발명의 압타머가 결합된 화합물을 처리하여 결합 정도의 변화를 측정함으로써, 해당 후보물질의 치료 효과를 결정할 수 있다. 예를 들어, 후보물질의 처리에 따라 시료 내 압타머 결합체의 검출 정도가 감소하는 경우, 해당 후보물질을 치매 또는 알츠하이머 치료제로 선별할 수 있다.
본 발명은 베타-아밀로이드 올리고머에 대한 높은 민감도를 통해 베타-아밀로이드 올리고머의 생성 여부를 정확히 판별하여 초기 치매 또는 알츠하이머를 초기에 진단하거나 영상으로 확인하는데 사용할 수 있다. 또한, 초기 치매 또는 알츠하이머에 대한 치료제 효과를 질환 초기 시기에 보다 정확하게 측정할 수 있다.
도 1은 초기 치매조기진단용 GdDOTA-ob5의 합성공정을 나타낸 모식도이다. 본 모식도 내에서 Gd-ob5는 GdDOTA-ob5를 나타내며, 이하 도면에서도 Gd-ob5는 GdDOTA-ob5를 나타낸다.
도 2a는 양자점(QD)인 QD525 또는 QD565와 ob5 압타머가 결합한 모식도를 나타낸 것이다.
도 2b는 GdDOTA-ob5-cy5의 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 베타-아밀로이드 올리고머를 마우스 해마세포주인 HT22에 처리하고, QD525-ob5가 이에 반응한 것을 공초점현미경으로 관찰한 녹색형광 이미징을 나타낸 것이다.
도 4는 베타-올리고머 아밀로이드의 농도에 따른 형광 강도를 관찰함으로써, 농도가 증가할수록 QD525-ob5의 결합력이 증가함을 나타낸 것이다.
도 5는 QD525-ob5 입자를 투사전자현미경을 이용하여 관찰한 입자크기 및 제타포텐셜(zeta potential)에서 관찰한 입자의 크기 분포도를 나타낸 것이다.
도 6은 QD565-ob5의 초기 치매동물모델에서의 베타-아밀로이드 올리고머 표적지향적 형광 이미징을 나타낸 것이다.
도 7은 QD565-ob5가 초기 치매동물모델에서 생성된 플라그에는 반응하지 않음을 면역조직화학 분석기법을 통해 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 QD525-ob5 및 QD565-ob5가 월령이 더 낮은 초기 치매동물모델에서 베타-아밀로이드 올리고머에 대해 형광 반응을 나타낸 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 Ob5-cy5를 이용하여 혈액 내에 존재하는 모노머 및 올리고머 아밀로이드를 관찰한 공초점 현미경 사진을 나타낸 것이다(상단: 모노머 Aβ 항체로 모노머를 관찰한 현미경 사진, 하단: Ob5 압타머로 올리고머를 관찰한 현미경 사진).
도 10은 MRI 조사시 GdDOTA-ob5(본 도 10 내에서 Gd-ob5는 GdDOTA-ob5를 나타냄)에 의해 T1 신호가 나타나는 것을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 GdDOTA-ob5-cy5가 제대로 합성이 되었는지 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 종래의 MRI 조영제인 가돌리늄(Gd)과 비교하여, GdDOTA-ob5-cy5가 베타-아밀로이드 올리고머를 정확히 검출해낼 수 있음을 형광 이미지로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 GdDOTA-ob5-cy5가 베타-아밀로이드 올리고머에 특이적으로 결합하는 항체와 마찬가지로 베타-아밀로이드 올리고머에 특이적으로 정확히 결합함을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 베타-아밀로이드 모노머 및 올리고머에 대한 GdDOTA-ob5-cy5의 반응성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 베타-아밀로이드 올리고머 처리 전후의 글리아 상태를 GdDOTA-ob5-cy5로 비교한 결과를 나타낸 것이다. 글리아 세포는 흰색 화살표로 표시하였다.
도 16은 GdDOTA-ob5-cy5를 이용하여 베타-아밀로이드 올리고머의 존재 및 이에 따른 조직의 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 GdDOTA-ob5-cy5를 이용하여 bEND3 세포주 및 HT22 세포주의 상해를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 GdDOTA-ob5-cy5를 이용하여 정상 및 초기 치매동물모델에서 베타-아밀로이드 올리고머를 검출 정도를 비교하여 초기 치매를 진단할 수 있음을 확인한 것이다.
도 19는 뇌의 각 영역인 대뇌피질(ROI1), 아미그달라(ROI2), 해마/시상 (ROI3)을 대상으로 하여, GdDOTA-ob5-cy5가 더 월령이 낮은 마우스에서도 기존의 조영제인 도타렘 조영제에 비해 상대적으로 강한 신호를 나타냄을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 GdDOTA-ob5-cy5를 11월령의 정상 마우스와 4월령의 APP/PS/ApoE KD 마우스의 꼬리정맥에 주사한 후 자기공명영상을 10분 간격으로 확인하여, 초기의 초기 치매 모델에서부터 베타-아밀로이드 올리고머의 존재를 검출할 수 있음을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 GdDOTA-ob5-cy5 및 도타렘 조영제의 T1 신호 영상을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 bEND3 세포주 및 HT22 세포주에서의 GdDOTA-ob5-cy5의 내포화 양상을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 23은 bEND3 세포주에서의 GdDOTA-ob5-cy5 능동적 내포화 경로를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 24는 HT22 세포주에서의 GdDOTA-ob5-cy5 능동적 내포화 경로를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> Ob5 압타머 합성
올리고뉴클레오티드 합성기에서 가장 보편적으로 합성하는 방법은 Koster에 의한 방법으로 시아노에틸 인산아마이드이트(-cyanoethyl phosphoramidite)를 이용하여 DNA구조의 골격을 이루는 인산이에스테르결합을 연결해가는 인산삼중에스테르방법(phosphite triester)이다 (Nucl. acids Res. 1984, 12,4539; Tetrahedron Lett. 1983, 24, 5843). 이를 통해 원하는 올리고뉴클레오티드를 높은 효율로 합성할 수 있으며(98%), 합성시 사용되는 인산아마이드이트 단량체(phosphoramidite monomer)는 커플링(coupling)을 위해 활성화되기 전에는 상당히 안정되어 있어 장기 보관도 가능하고 합성시간도 다른 방법들에 비해 단시간이라는 장점을 지니고 있다.
본 발명의 압타머는 뉴클레오티드가 부착된 고형지지체 상으로부터 시작하여 탈블로킹(deblocking), 커플링(coupling), 산화(oxidation), 캡핑(capping)으로 이루어지는 사이클(cycle)을 반복하여, 원하는 길이의 올리고뉴클레오티드를 얻는 방법으로 합성하였다.
Figure pat00001
합성 사이클의 첫 과정인 deblocking은 고형지지체로부터 디메톡시트리틸기(4.4’-dimethoxytrityl, DMT)를 해리시키는 것을 시작으로 하였다. 이는 산성 조건이 요구되므로, 3% 트리클로로아세트산 1ml을 120분 동안 처리하였다. 해리된 DMT 양이온은 진한 주황색을 띠며, 흡광도를 통해 올리고 합성 효율을 측정하는데 이용되었다. 이후, 고정지지체의 5’-히드록실기와 원하는 염기를 포함하는 뉴클레오시드 인산아마이드이트 단량체(nucleosidephosphoramidite monomer)를 커플링 반응시켜 원하는 염기 서열의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 염기 부분의 아민기인 벤조일기로 보호하였으며, 5’-히드록실기는 DMT에 의해 보호되도록 하여, 계속되는 커플링 반응의 연결부로 역할을 하도록 하였다. 인산아마이드이트 단량체와 5’-히드록실기 간의 커플링 반응을 통해 생성된 결합구조에 요오드(Iodine) 5ml을 20초 동안 처리하여, 산화 반응이 일어나도록 함으로써, 포스파이트(phosphite)를 포스페이트(phosphate)로 전환시켰다. 또한, 원하는 올리고뉴클레오티드의 정제를 어렵게 만드는 부 반응물들을 없애기 위하여 커플링 반응 후 고정지지체 내 반응하지 않은 5’-히드록실기를 아세트 무수물과 N-메틸이미디졸(NMI)이 동량, 동일 몰농도로 동시에 Daisogel C18(Daiso, Japan) 컬럼으로 전달하여, 강력한 아세틸화 시약과 5'-OH기가 반응하여 불활성화 되도록 함으로써 캡핑(capping)하였다. 이후 최종적으로 28% 암모니아 15ml를 처리하여 합성된 올리고뉴클레오티드를 고형지지체로부터 떼어낸 뒤, Daisogel C18(Daiso, Japan) 칼럼이 장착된 HPLC LC918(Japan Analytical Industry, Japan) HPLC 정제 과정을 거쳐 G/C량이 55.6%, 260nm/280nm에서 순도가 2.0이고 분자량이 166,635g/mol인 하기 표 1의 Ob5 압타머를 수득하였다. 특히, 하기 서열번호 1 내의 밑줄 표시된 염기 서열, 'GGTACCGTCACACTGCTGCCAA'만 포함되면 압타머 기능을 할 수 있다.
압타머 염기서열
압타머 서열 서열번호
Ob5 GGGAATTCGAGCTCGGTACCGTCACACTGCTGCCAACTGCAGGCATGCAAGCTTGG 1
< 실시예 2> QD525- ob5 및 QD565- ob5 화합물의 합성
형광 이미징이 가능하도록 하기 위하여, QD(Quantum Dot)가 결합된 Ob5 압타머를 제조하였다. 100pmol ob5 압타머 200ul, 0.1M Tris-HCl/EDTA 1ml 및 78 mM EDC(1-에틸-3-(3-메틸아미노프로필)카르보디이미드(1-Ethyl-3-(3-dimethylamino
propyl)carbodiimide) 0.1ml를 QD565(Quantum Dots565, 적색형광염료, Exit 425nm/Emit 565nm) 또는 QD525(Quantum Dots525, 녹색형광염료, Exit 425nm/Emit 525nm)와 혼합하여 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 이후, 15,000rpm으로 원심분리하여 상등액을 제거하고 PBS(Phosphate-buffered saline, 인산완충액)에 녹여서 QD525-ob5 및 QD565-ob5 화합물을 수득하였다(도 2a).
< 실시예 3> Ob5 - cy5 화합물의 합성
실시예 1에서 합성된 100pmol Ob5 0.1ml과 수용성 sulfo-cyanine5 NHS(N-hydroxysuccinimide) ester 1mg와 0.5% 트리에틸아민(triethylamine), 75mM EDC(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide)을 에펜도르프 튜브 안에서 혼합하여 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 이후 결합된 것만을 취하기 위해 15,000RPM으로 15분간 원심 분리하여 상등액을 제거하고 침전물을 실온상태에서 건조 후 수득하였다.
< 실시예 4> GdDOTA - ob5 화합물의 합성
1) GdDOTA 화합물의 합성
1-(1-카복시-3-카보t부톡시프로필)-4,7,10-(카보t부톡심-칠)-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸(1-(1-carboxy-3-carbotertbutoxypropyl)-4,7,10-(carbotertbutoxyme-thyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecane, DOTA-OtBu) 500mg을 디클로로메탄(Methylene Chloride, MC) 5ml에 녹여서 트리플루오로아세트산(Trifluoroacetic acid, TFA) 10ml에 첨가하고 실온에서 하룻밤 반응시켰다. 디클로로메탄으로 재용해시켜 조제액을 다시 디클로로메탄 5ml에 녹인 후에 농축하고, 디클로로메탄 10ml에 다시 녹여서 농축한 다음 디에틸에테르에 녹여 건조시켰다. 이후, 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데세칸,1-(글루타릭산)-4,7,10-트리아세트산(1,4,7,10-tetraazacyclododececane,1-(glutaric acid)-4,7,10-triacetic acid, DOTA)으로 정제하여 이를 증류수 10ml에 녹여 GdCl3.6H2O을 첨가하고 0.2M NaOH으로 pH 6~7으로 보정 후에 실온에서 1시간 동안 혼합하였다. 60에서 하룻밤 동안 교반시킨 다음 이미노다이아세트산기(iminodiacetic acid groups)가 포함된 스티렌-다이비닐벤젠 코폴리머 비드(styrene-divinylbenzene co-polymer, CHELEX®)를 첨가하여 금속이온으로 고정시켜 이온작용을 하지 못하도록 하룻밤 동안 교반하고 50um 실린저 여과기로 고형물을 제거하고 농축하여 분말화하여 가듈리늄(Gd)이 결합된 Gd-DOTA 건조분말 약 250mg을 획득하였다.
DOTA-OtBu
1HNMR(CDCl3,400MHz):δ1.22 - 1.80 (m, 45H, OtBu),1.90- 3.54 (m, 27H, NCH2CH2N+NCH2C=O+NCH(C=O)CH2CH2C=O)ppm.m/z (ESI+), C39H72N4O10Na[M+Na+] Calculated:779.51, Found:779.60
Gd-DOTA
m/z (ESI-),C19H28GdN4O10[M-]Calculated:630.10, Found:630.10, C19H27GdN4O10Na
[M--H++Na+],Calculated:652.09,Found:652.05,C19H27GdN4O10[M2-]/2 Calculated:314.55,Found:313.90
2) GdDOTA - Ob5 화합물의 합성
MRI 조영이 가능하도록 하기 위하여, GdDOTA가 결합된 Ob5 압타머를 제조하였다. 5'-아민기가 부착된 100pmol ob5 압타머 200ul, 0.1M Tris-HCl/EDTA 2ml 및 78 mM EDC(1-에틸-3-(3-메틸아미노프로필)카르보디이미드(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) 0.1ml를 카르복실기가 붙어 있는 GdDOTA 200mg을 혼합하여 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 이후, 15,000rpm으로 원심분리하여 침전물만 남긴 후, 상기 침전물을 멸균된 3차 증류수로 1회 세척 후 건조시켰다. 건조 후 총량 185mg의 GdDOTA-ob5를 PBS에 녹여 수득하였다(도 1).
< 실시예 5> GdDOTA - ob5 - cy5 화합물의 합성
MRI 조영 및 형광 이미징을 모두 확보 가능한 멀티모달 조영제 기능을 부여 하기 위하여, GdDOTA 및 형광표지 중 하나인 cy5가 결합된 압타머를 제조하였다. 100pmol ob5 압타머 200ul, 0.1M Tris-HCl/EDTA 1ml 및 78 mM EDC(1-에틸-3-(3-메틸아미노프로필)카르보디이미드(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) 0.1ml를 GdDOTA 200mg와 혼합하여 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 이후, 15,000rpm으로 원심분리하여 상등액을 제거하고 PBS 15,000rpm으로 원심분리하여 상등액을 제거하고 PBS에 녹여서 GdDOTA-ob5-cy5를 합성하였다(도 2b).
< 실험예 1> 베타-아밀로이드 올리고머( Aβ )에 대한 QD525- ob5의 결합 확인
1) 세포 내 QD525- ob5의 베타-아밀로이드 올리고머에 대한 결합 반응
마우스 해마세포주인 HT22를 공초점용 배양접시에 103 세포수로 분주하여 하룻밤 배양한 다음 여기에 베타-아밀로이드 올리고머 2uM 농도로 처리하여 상기 실시예 2에서 제조한 QD525-ob5를 10ul 처리한 다음 30분 후에 공초점 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 베타-아밀로이드 올리고머 2uM 농도로 처리하지 않은 경우, 녹색형광이 관찰되지 않았으나, 베타-아밀로이드 올리고머 2uM 농도로 처리한 경우, 녹색형광이 강하게 나타냄을 확인하였으며, 상기 베타-아밀로이드 올리고머가 대부분 세포질에 존재함을 알 수 있었다(도 3).
2) 베타-아밀로이드 올리고머( Aβ ) 농도에 따른 QD525- ob5의 결합력 확인
HT22 세포주를 96웰(well) 플레이트에 분주한 후, 베타-아밀로이드 올리고머 0.25, 0.5, 1, 2 및 5uM 의 농도로 처리하고 QD565-ob5를 10pmol로 처리하여 반응시켰다. 이후, multi-model microplate reader기(BioTek, Synergy 2, USA)으로 형광을 측정한 결과 565-585nm 대의 파장이 베타-아밀로이드 올리고머 농도 증가 의존적으로 형광 강도가 증가하는 것을 관찰하였다(도 4).
3) QD525- ob5의 입자크기 측정
세포에 처리한 QD525-ob5의 나노입자 크기를 JEM-2100F Transmission Electron Microscope(USA, JEOL)로 측정한 결과 약 25nm 정도였으며, 입자 분포도는 dynamic light scattering (DLS, Malvern, UK)으로 관찰한 결과 15nm~45nm 정도 사이였다(도 5).
< 실험예 2> 베타-아밀로이드 올리고머( Aβ )에 대한 QD565- ob5의 결합 확인
1) 초기 치매동물모델에서 QD565- ob5의 표적지향적 형광 이미징 확인
마우스 꼬리정맥에 주사한 QD565-ob5가 생체 내 흡수에 의해 뇌혈관장벽(blood brain barrier, BBB)을 통과하여 표적인자가 있는 뇌조직과 혈관 내에 존재하는 베타-아밀로이드 올리고머를 탐지하는지 확인하기 위해 optical Molecular imaging(Optix, MX3, ART) system(635nm-pulsed laser diode;Advanced Research Technologies Inc., Montreal, Canada)으로 관찰하였다.
구체적으로, 호흡마취 후 25nM QD565-ob5 50ul를 꼬리정맥으로 주사하여 30분 경과 후부터 관찰하였다. 대조군으로 11개월령의 정상 암컷 마우스를 택하였고, 11개월령 ApoE KD, 11개월령 APP/PS, 그리고 4개월령 APP/PS/ApoE KD 마우스를 대상 실험군으로 하였다. 동일한 조건하에서 등 부분의 피부를 표준 형광으로 하여, 머리 부분을 미용용 커트기로 제모 후 관찰하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 대조군은 약 2.0RI(상대적 형광강도)를 나타내었으나, ApoE KD 경우 약 97RI, APP/PS는 약 415RI, APP/PS/ApoE KD의 경우 약 1981RI를 나타내었다. 이로부터 QD565-ob5가 초기 치매동물모델에서 뇌혈관장벽을 통과하여 뇌 조직 내에 들어가 베타-아밀로이드 올리고머에 결합하여 베타-아밀로이드 올리고머를 검출해낼 수 있음을 확인하였다. 특히, APP/PS/ApoE KD마우스가 어린 월령에서도 QD565-ob5가 강하게 수치가 나타나는 것을 확인하였는바, 이 경우 이미 3개월부터 베타-아밀로이드 올리고머를 강하게 생성되었던 것으로 볼 수 있다(도 6). 특히 이 시기부터 이미 뇌 혈관벽이 파괴되고 있었음이 확인되었는바, 염증에 기해 분비되는 여러 사이토카인에 의해 뇌혈관장벽에 상해가 유발되면서 베타-아밀로이드 올리고머가 생성됨에 따라 초기 치매의 전조가 나타나는 것으로 볼 수 있다. 이하, 뇌혈관장벽의 파괴와 베타-아밀로이드 올리고머 생성 간의 관계를 알아보기 위한 실험을 수행하였다.
2) 초기 치매동물모델에서 플라그 생성에 대한 QD565- ob5의 반응 확인
뇌혈관장벽의 파괴와 베타-아밀로이드 올리고머 생성 간의 관계를 알아보기 위해 해마와 대뇌피질의 플라그 생성 여부를 면역조직화학 분석기법을 이용하여 확인하였다. 모노머 Aβ 항체로 염색하여 3,3′-디아미노벤지딘(3,3′-diaminobenzidine, DAB)으로 발색시켜 11월령 정상마우스, 11월령 APP/PS, 11월령 APP/PS/ApoE KD 및 4월령 APP/PS/ApoE KD를 비교하였다.
도 7에서 나타난 바와 같이, 대조군인 정상마우스에서는 염색이 거의 나타나지 않았고, APP/PS와 APP/PS/ApoE KD는 플라그의 수와 크기가 상대적으로 강하게 나타났으며, 4월령의 APP/PS/ApoE KD는 아주 약하거나 플라그가 존재하지 않은 것을 알 수 있었다. 또한, APP/PS/ApoE KD 마우스의 경우, 4개월에서 11개월 사이에 모노머 Aβ가 베타-아밀로이드 올리고머로 전환되었음을 알 수 있었다(도 7).
< 실험예 3> 베타-아밀로이드 올리고머( Aβ )에 대한 QD525- ob5 및 QD565- ob5의 결합 비교
11월령인 정상 마우스, 4월령의 APP/PS/ApoE KD 마우스를 비교하여 모노머 Aβ와 베타-아밀로이드 올리고머존재 유무를 알아보았다. 올리고머 Aβ 항체가 결합된 QD525-oAβ(Molecular probe, ThermoFisher, USA)를 각각 조직에 염색하고 QD565-ob5와 상호 동일부위에 존재하는지 관찰하였다.
그 결과, 대조군은 거의 형광이 존재하지 않는 반면 4월령의 APP/PS/ApoE KD 마우스의 경우 해마 영역 주변에 강하게 녹색과 적색형광을 나타내어 도 8 내의 화살표처럼 존재하는 것을 확인하였다. 이는 보다 어린 월령의 마우스일지라도 이미 ApoE KD 유전자에 의한 염증이 진행되어 APP/PS에 영향을 주어 이미 모노머 Aβ가 생성된 다음 베타-아밀로이드 올리고머가 생성되어 있음을 알 수 있었다(도 8).
< 실험예 4> 혈액 내 베타-아밀로이드 올리고머( Aβ )에 대한 Ob5 - cy5의 결합 확인
초기 치매에 걸린 가능성이 있는 코호트 노인(평균 65세) 10명을 대상으로 혈액 내 존재하는 베타-아밀로이드 모노머 및 올리고머의 존재 여부를 확인하였다. 베타-아밀로이드 올리고머는 상기 실시예 3에서 합성한 Ob5-cy5를 이용하여 검출하였다.
구체적으로, 10명의 노인 혈액 각 10ul, 베타-아밀로이드 모노머를 검출하는 10pmol QD565-모노머 아밀로이드베타 (mAβ) (Molecular probe, ThermoFisher, USA) 10ul 및 Ob5-cy5 10ul을 혼합한 후 나타난 형광 이미지를 확인하였다. 형광 이미지는 상기 실험예 2-1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 확인하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, 환자 P1 및 P2의 경우에는 베타-아밀로이드 모노머가 검출되었으며, 환자 P4, P5, P8, P10의 경우에는 베타-아밀로이드 올리고머에 대해 양성 반응을 나타내었다. 특히, 베타-아밀로이드 올리고머의 양성반응인 P4, P5, P8, P10는 초기 치매 초기에 해당함을 알 수 있었다.
이로부터 동일 코호트 혈액이라 하더라도 모노머와 올리고머가 동일하게 존재하는 것은 아님을 확인하였으며, 압타머 Ob5가 결합된 Ob5-cy5는 특이적으로 올리고머에 결합함으로써 모노머와 올리고머를 구분하여 동일 코호트 내에서도 초기 치매 환자를 정밀하게 구분해 낼 수 있음을 확인하였다.
< 실험예 5> 혈액 내 베타-아밀로이드 올리고머( Aβ )에 대한 GdDOTA - ob5의 팬텀 자기공명영상 확인
MRI 조사시 GdDOTA-ob5(도 10 내 Gd-ob5로 표시됨)에 의해 T1 신호가 나타나는지 확인하였다. 구체적으로, GdDOTA-ob5 농도 200mg/200ul를 기준으로 하여, PBS로 1/10씩 순차적으로 희석하여 2mg, 0.2mg, 0.02mg, 0.002mg, 200ug, 20ug, 2ug, 0.2ug 및 0.02ug 농도로 4.7 T animal MRI scanner (BioSpec 47/40; Bruker, Ettlingen, Germany)으로 T1 신호를 측정하였다.
그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, r2=0.0281x3E-0.6으로 직선형에 가깝게 농도 의존적으로 T1 신호를 나타냄을 확인하였다. 이로부터 GdDOTA-ob5 가 MRI 조영제로서 적절하게 기능할 수 있음을 확인할 수 있었다.
< 실험예 6> 혈액 내 베타-아밀로이드 올리고머( Aβ )에 대한 GdDOTA - ob5 - cy5의 결합 확인
1) 실시예 5에 의해 합성된 GdDOTA - ob5 - cy5의 확인
GdDOTA-ob5-cy5가 제대로 합성이 되었는지 확인하기 위해, 10 pmol ob5-cy5(lane 1 및 2), 열처리 한 10 pmol ob5-cy5(lane 3 및 4), 10 pmol GdDOTA-ob5-cy5(lane 5 및 6) 및 Gd-DOTA 조영제(lane 7)를 1% 아가로스 젤(agarose gel)에 전기영동 하였다. 상기 열처리는 압타머가 제대로 작동케 하기 위한 것으로서, 열을 95℃에서 2분간 가한 후 72℃에서 1분간 가한 다음 4℃에서 식혔다.
도 11에 나타난 바와 같이, ob5-cy5 및 열처리 한 ob5-cy5의 경우 74bp 압타머 밴드가 나타났으나, GdDOTA-ob5-cy5의 경우 Gd 입자가 젤의 입자 직경보다 큰 이유로 이동이 되지 않아 홈에 그대로 걸려 있는 것을 알 수 있었다. 또한, GdDOTA의 밴드는 전혀 나타나지 않았다(도 11).
2) GdDOTA - ob5 - cy5의 베타-아밀로이드 올리고머 검출 능력 확인
GdDOTA-ob5-cy5가 베타-아밀로이드 올리고머를 정확히 검출할 수 있는지 알아보기 위해 종래의 MRI 조영제인 가돌리늄(Gd)과 비교하였다. 11월령인 정상 암컷 마우스(non-Tg), 4월령의 APP/PS/ApoE KD 암컷 마우스 각각 6마리를 대상으로 뇌 조직을 분리하여 QD525-oAβ, QD565-Gd 및 GdDOTA-ob5-cy5로 각각 염색한 후 optical Molecular imaging(Optix, MX3, ART) system(635nm-pulsed laser diode; Advanced Research Technologies Inc., Montreal, Canada)으로 관찰하였다.
도 12에 나타난 바와 같이, 대조군인 정상 마우스에서는 어떤 형광도 나타나지 않았다. 반면, 4월령의 APP/PS/ApoE KD 마우스의 경우, QD525-oAβ가 해마주변과 대뇌피질에서 발현됨을 알 수 있었으며, GdDOTA-ob5-cy5 역시 해마주변과 대뇌피질에서 형광을 나타내었다. 이로부터 GdDOTA-ob5-cy5 는 기존의 MRI 조영제와 달리 베타-아밀로이드 올리고머에 특이적으로 결합하여 검출해낼 수 있음을 확인하였다.
3) GdDOTA - ob5 - cy5의 베타-아밀로이드 올리고머 검출 능력의 정확도 확인
11월령인 정상 암컷 마우스(non-Tg), 4월령의 APP/PS/ApoE KD 암컷 마우스 각각 6마리를 대상으로 GdDOTA-ob5-cy5를 3mg/kg의 농도로 꼬리정맥에 주사하였다. 2시간 경과 후 뇌 조직을 분리하여 Vibrotome200 (Leica, Japan)으로 20um두께로 절편한 후 H33342를 이용하여 핵을 염색하고, 녹색 형광을 나타내는 베타-아밀로이드 올리고머(oAβ42)항체-QD525, 적색 형광을 나타내는 GdDOTA-QD565 및 GdDOTA-ob5- cy5를 처리하였다.
도 13에 나타난 바와 같이, 대조군인 정상 마우스에서는 베타-아밀로이드 올리고머가 존재하지 않기 때문에, 어떤 형광도 나타나지 않았다. 반면, APP/PS/ApoE KD 마우스의 경우, 베타-아밀로이드 올리고머가 존재하기 때문에, 양성 대조군인 베타-아밀로이드 올리고머(oAβ42)항체-QD525에서 녹색 형광을 나타내는 것을 확인하였다. 베타-아밀로이드 올리고머에 특이적으로 결합하는 항체 또는 압타머가 결합되지 않은 GdDOTA-QD565의 경우에는 적색 형광이 나타나지 않은 반면, GdDOTA-ob5-cy5를 처리한 경우에는 적색 형광이 나타남을 확인하였다.
특히, 베타-아밀로이드 올리고머(oAβ42)항체-QD525를 처리한 조직에서 녹색 형광을 나타내는 부분과 GdDOTA-ob5-cy5를 처리한 조직에서 적색 형광을 나타내는 부분이 도 13 내 화살표와 같이 동일한 지점인 것을 확인하였다. 이로부터 베타-아밀로이드 올리고머(oAβ42)항체가 베타-아밀로이드 올리고머에 특이적으로 결합하는 것과 마찬가지로, GdDOTA-ob5-cy5 역시 베타-아밀로이드 올리고머에 특이적으로 정확하게 결합할 수 있음을 확인하였다.
4) 베타-아밀로이드 모노머 및 올리고머에 대한 GdDOTA - ob5 - cy5의 반응성 확인
11월령인 정상 암컷 마우스, 4월령의 APP/PS/ApoE KD 암컷 마우스 각각 6마리를 대상으로, 베타-아밀로이드 모노머 및 올리고머에 대한 GdDOTA-ob5-cy5의 반응성을 확인하였다. 글리아에 특이적 마커인 글리아 피브리성 산성 단백질(Glial fibrillary acidic protein, GFAP)을 대조군으로 하여, 상기 단백질에 녹색 형광을 나타내는 QD525를 결합시킨 후 이를 비교하여 도 14에 나타내었다.
도 14에서 나타난 바와 같이, 정상 마우스에서는 어떤 형광도 나타내지 않는 반면 4월령의 APP/PS/ApoE KD 마우스의 GFAP 및 GdDOTA-ob5-cy5는 모두 해마주변에서 상호 발현되어 형광을 나타내는 것을 확인하였다. 또한, 올리고머를 검출하는 QD525-oAβ 및 GdDOTA-ob5-cy5 각각 4월령의 APP/PS/ApoE KD 마우스에서 녹색 형광 및 적색 형광을 나타냄을 확인하였다.
그러나, 모노머는 APP/PS/ApoE KD 마우스에서도 거의 검출되지 않아, 베타-아밀로이드 올리고머의 생성이 증가되면서 해마주변의 신경세포의 사멸을 주도할 것으로 예상되었다.
상기와 같은 결과로부터 GdDOTA-ob5-cy5가 올리고머에 특이적으로 반응하여 결합함을 알 수 있었다.
5) GdDOTA - ob5 - cy5의 형광강도 확인
마우스 뇌 혈관벽 세포주인 bEND3 세포주를 공초점용 배양접시에 103 세포수로 분주하여 하룻밤 배양한 다음 여기에 베타-아밀로이드 올리고머를 2uM 농도로 처리하였다. 처리 전의 글리아의 상태가 휴지기에 있으며, 베타-아밀로이드 올리고머 처리 후 글리아 상태를 비교한 결과를 도 15에 나타내었다.
GdDOTA-ob5-cy5에 글리아에 대한 항체인 IBA1 항체(molecular probes)를 결합시켜 표지하였으며, 베타-아밀로이드 올리고머처리 후 글리아의 상태가 활성화 된 팽창상태임에 따라 GdDOTA-ob5-cy5가 글리아에 강하게 확장된 양상을 나타냄을 확인할 수 있었다. 즉, GdDOTA-ob5-cy5를 이용하여 베타-아밀로이드 올리고머에 의한 글리아의 상태를 관찰할 수 있음을 확인하였다.
6) GdDOTA - ob5 - cy5를 이용한 베타-아밀로이드 올리고머 존재 및 조직 변화 확인
마우스 뇌혈관벽 세포주인 bEND3 세포주를 공초점용 배양접시에 103 세포수로 분주하여 하룻밤 배양하였다. 베타-아밀로이드 올리고머 2uM 처리 전 및 후의 글리아의 상태를 살펴보았을 때, 글리아가 활성화되었음을 나타내는 마커인 Iba1이 녹색 형광을 나타내지 않아, 처리 전에는 휴지기에 있음을 확인하였다(도 16 내 왼쪽 그림). 또한, 베타-아밀로이드 올리고머 처리 전에는 GdDOTA-ob5-cy5 역시 세포 내로 내포화되는 정도가 매우 약함을 알 수 있었다.
반면, 베타-아밀로이드 올리고머를 처리한 후 글리아가 활성화되어 팽창 상태에 있음을 Iba1의 녹색 형광을 통해 확인하였으며, 이 경우 GdDOTA-ob5-cy5가 신경세포에 강하게 존재하는 것을 확인하였다(도 16 내 오른쪽 그림).
베타-아밀로이드 올리고머가 증가되면, 활성화 된 글리아로 인해 뇌혈관벽 주변 조직의 양상이 급격히 변화되고, GdDOTA-ob5-cy5 역시 이에 따라 적색 형광을 강하게 나타내는바, GdDOTA-ob5-cy5를 이용하여 베타-아밀로이드 올리고머의 존재 및 이로 인한 조직의 변화까지 볼 수 있음을 확인하였다.
7) GdDOTA - ob5 - cy5를 이용한 bEND3 세포 및 HT22 세포의 상해 정도 확인
H2O2, 알루미늄 및 베타-아밀로이드 올리고머 2uM 각각이 세포에 상해를 가하는 정도를 GdDOTA-ob5-cy5를 이용하여 확인하였다. 먼저 마우스 뇌 혈관벽 세포주인 bEND3 세포주를 트랜스웰(Transwell) 상층부에 분주하고, 마우스 해마 세포주인 HT22 세포주를 하층부 바닥에 분주하고 배양하였다. 그 다음 250 mM H2O2, 200ug/ml알루미늄 및 베타-아밀로이드 올리고머 2uM를 각각 처리한 다음 하룻밤 지나서 GdDOTA-ob5-cy5의 형광강도를 측정하였다.
도 17에 나타난 바와 같이, bEND3 세포주에서는 알루미늄에 의한 상해가 가장 강한 반면 HT22 세포주에서는 H2O2와 베타-아밀로이드 올리고머에 의해 강하게 상해를 받음을 알 수 있었다.
한편 마우스 뇌 혈관벽 세포주인 bEND3 세포주를 트랜스웰 하층부에, 해마세포주 HT22를 상층부에 분주하고 배양한 다음 250 mM H2O2, 200ug/ml알루미늄, 베타-아밀로이드 올리고머 2uM로 처리한 다음 하룻밤 지나서 GdDOTA-ob5-cy5 형광강도를 측정한 경우, bEND3 세포주와 HT22 세포주 모두에서 베타-아밀로이드 올리고머처리에 의해 가장 강하게 상해를 받음을 확인하였다.
본 실험을 통해, 베타-아밀로이드 올리고머를 인위적으로 처리한 경우 외에도, 다른 요인에 의해 세포에 상해가 생겨 베타-아밀로이드 올리고머가 생성되거나, 초기 치매가 시작되는 경우 GdDOTA-ob5-cy5를 이용하여 이를 진단해 낼 수 있음을 확인하였다.
8) 초기 치매동물모델에서 GdDOTA - ob5 - cy5의 표적지향적 형광 이미징 확인
마우스 꼬리정맥에 주사한 GdDOTA-ob5-cy5가 생체 내 흡수에 의해 뇌혈관장벽(blood brain barrier, BBB)을 통과하여 표적인자가 있는 뇌조직과 혈관 내에 존재하는 베타-아밀로이드 올리고머를 탐지하는지 확인하기 위해 optical Molecular imaging(Optix, MX3, ART) system(635nm-pulsed laser diode;Advanced Research Technologies Inc., Montreal, Canada)으로 관찰하였다.
구체적으로, 호흡마취 후 25nM GdDOTA-ob5-cy5 50ul를 꼬리정맥으로 주사하여 30분 경과 후부터 관찰하였다. 대조군으로 4월령의 정상 암컷 마우스를 택하였고, 4월령 APP/PS/ApoE KD 마우스를 대상 실험군으로 하였다. 동일한 조건하에서 등 부분의 피부를 표준 형광으로 하여, 머리 부분을 미용용 커트기로 제모 후 관찰하였다.
그 결과, 도 18에 나타난 바와 같이, 대조군은 약 1.5RI(상대적 형광강도)를 나타내었으나, APP/PS/ApoE KD의 경우 약 1589RI를 나타내었다. 이로부터 GdDOTA-ob5-cy5가 초기 치매동물모델에서 뇌혈관장벽을 통과하여 뇌 조직 내에 들어가 베타-아밀로이드 올리고머에 결합하여 베타-아밀로이드 올리고머를 검출해낼 수 있음을 확인였다. 특히, APP/PS/ApoE KD마우스가 어린 월령에서도 GdDOTA-ob5-cy5가 강하게 수치가 나타나는 것을 확인하였는바, 이 경우 이미 3개월부터 베타-아밀로이드 올리고머를 강하게 생성되었던 것으로 볼 수 있다(도 18). 특히 이 시기부터 이미 뇌 혈관벽이 파괴되고 있었음이 확인되었는바, 염증에 기해 분비되는 여러 사이토카인에 의해 뇌혈관장벽에 상해가 유발되면서 베타-아밀로이드 올리고머가 생성됨에 따라 초기 치매의 전조가 나타나는 것으로 볼 수 있다.
9) GdDOTA - ob5 - cy5를 이용한 다이나믹 자기공명영상 확인
마우스 뇌의 각 영역인 대뇌피질(ROI1), 아미그달라(ROI2), 해마/시상 (ROI3)을 대상으로 하여, 다이나믹 자기공명영상을 확인하였으며, 기존 상용화 되어있던 도타렘 조영제와의 상대적 강도(ROI)를 비교하였다.
11월령인 정상 암컷 마우스, 4월령 및 11월령의 암컷 APP/PS/ApoE KD 마우스각각 6마리를 대상으로 하여, APP/PS/ApoE KD 마우스의 경우 도타렘 조영제는 11월령 APP/PS/ApoE KD 마우스에 주사하였고, GdDOTA-ob5-cy5는 4월령 및 11월령 APP/PS/ApoE KD 마우스의 꼬리정맥에 주사하였다. 이후, 2시간 동안 무처리인 PRE상태에서 관찰하고, 10분 간격으로 해당영역의 T1 신호를 관찰하였다.
그 결과, 도타렘 조영제의 경우 월령이 더 높은 마우스에 주사되었음에도 불구하고 이에 비해 GdDOTA-ob5-cy5가 상대적 강도가 더욱 높게 나타난 것을 확인하였다(도 19). 이러한 결과로부터 GdDOTA-ob5-cy5가 기존의 조영제보다 베타-아밀로이드 올리고머에 대한 민감도 및 특이도가 더욱 우수함을 알 수 있었다.
10) GdDOTA - ob5 - cy5의 다이나믹 자기공명영상 신호영역 확인
GdDOTA-ob5-cy5를 11월령의 정상 마우스와 4월령의 APP/PS/ApoE KD 마우스의 꼬리정맥에 주사한 후 자기공명영상을 10분 간격으로 확인하였다.
대조군인 정상 마우스에서는 전혀 T1의 신호 영상이 나타나지 않는데 반해, 4월령의 APP/PS/ApoE KD 마우스의 경우 GdDOTA-ob5-cy5 처리 후 10분 만에 베타-아밀로이드 올리고머존재를 나타내는 T1 영상이 30분 동안 관찰되었다. 또한, 11월령의 APP/PS/ApoE KD 마우스의 경우 서서히 T1 신호가 보이고 40분에 강하게 나타나지만 이후 T1 신호가 감소하는 영상을 나타내었다.
이로부터 GdDOTA-ob5-cy5 의 경우 초기의 초기 치매 모델에서부터 베타-아밀로이드 올리고머의 존재를 검출할 수 있음을 확인하였으며, 이를 이용하여 초기 치매초기에 정확히 베타-아밀로이드 올리고머의 존재를 분석할 수 있음을 의미한다(도 20).
또한, T1 신호 영상을 확인한 결과, 대조군인 정상 마우스에서는 전혀 T1의 신호 영상이 나타나지 않았던 것처럼 T1 신호가 산란하게 분포하는 것을 확인하였다. 그러나, 4월령의 APP/PS/ApoE KD 마우스의 경우 대뇌피질(ROI1), 아미그달라(ROI2), 해마/시상(ROI3)영역 모두에서 일정한 뇌혈관장벽 통과 패턴을 나타내었다. 이로부터, GdDOTA-ob5-cy5 는 기존의 조영제인 도타렘에 비해 초기 초기 치매 모델에서 베타-아밀로이드 올리고머 존재를 정확히 인식하여 T1 영상을 나타냄을 알 수 있었다(도 21).
11) bEND3 세포주 및 HT22 세포주에서의 GdDOTA - ob5 - cy5의 내포화 양상 확인
Gd-ob5-cy5가 세포 내로 내포화되는 정도를 측정하기 위하여 마우스 뇌 혈관벽 세포주인 bEND3 세포주와 마우스 해마세포주인 HT22 세포주를 공초점용 배양접시에 각각 103 세포수로 분주하여 하룻밤 배양한 다음 여기에 베타-아밀로이드 올리고머를 2uM 농도로 처리하였다. 이후, 핵을 염색하기 위해 H33342 처리하고, 공초점 현미경 LSM710(칼자이츠, 독일)으로 관찰하였다.
그 결과, bEND3 세포주에서는 2시간부터 적색형광이 관찰되기 시작하고 HT22 세포주에서는 적색형광이 1시간 이후부터 서서히 증가하다가 8시간 째에 가장 강하게 나타났다. 이것의 형광도를 측정하기 위해 ROI(상대적 강도)를 측정한 값은 8시간 째에 가장 강하게 존재함을 관찰하였다(도 22).
12) bEND3 세포주에서의 GdDOTA - ob5 - cy5 능동적 내포화 경로 확인
GdDOTA-ob5-cy5가 세포 내로 내포화되는 경로를 알아보기 위하여 마우스 뇌 혈관벽 세포주인 bEND3 세포주를 공초점용 배양접시에 103 세포수로 분주하여 하룻밤 배양한 다음 여기에 베타-아밀로이드 올리고머를 2uM 농도로 처리하였다. 내포화 경로로서 저분자들이 통과하는 클라스린(CLATHRIN), 지질분자들이 통과하는 카베올린1(CAVEOLIN1) 및 리간드가 수용체에 의해 물질이 통과하는 트랜스페린 수용체(TRANSFERRIN RECPTOR)를 대상으로 하였으며, 각각에 해당하는 항체와 결합시킨 QD525를 표지하였다. 이후 핵을 염색하기 위해 H33342 처리하고 공초점 현미경 LSM710(칼자이츠, 독일)으로 관찰하였다.
GdDOTA-ob5-cy5에 의한 적색형광이 관찰된 시점인 2시간 째에 bEND3 세포주의 내포화 경로를 확인한 결과, 카베올린1과 트랜스페린 수용체에만 녹색형광이 관찰됨을 확인하였다(도 23). 이로부터 bEND3 세포주에서의 내포화 경로는 카베올린1과 트랜스페린 수용체를 게이트(GATE)로 함을 알 수 있었다.
13) HT22 세포주에서의 GdDOTA - ob5 - cy5 능동적 내포화 경로 확인
GdDOTA-ob5-cy5가 세포 내로 내포화되는 경로를 알아보기 위하여 상기 3)의 방법과 동일하게 HT22 세포주를 공초점용 배양접시에 103 세포수로 분주하여 하룻밤 배양한 다음 여기에 베타-아밀로이드 올리고머 2uM 농도로 처리하였다. 내포화 경로로서 저분자들이 통과하는 클라스린(CLATHRIN), 지질분자들이 통과하는 카베올린1(CAVEOLIN1) 및 리간드가 수용체에 의해 물질이 통과하는 트랜스페린 수용체(TRANSFERRIN RECPTOR)를 대상으로 하였으며, 각각에 해당하는 항체와 결합시킨 QD525를 표지하였다. 이후, 핵을 염색하기 위해 H33342를 처리하고 공초점 현미경 LSM710(칼자이츠, 독일)으로 관찰하였다.
GdDOTA-ob5-cy5에 의한 적색형광이 관찰된 시점인 2시간 째에 HT22 세포주의 내포화 경로를 확인한 결과, 클라스린, 카베올린1 및 트랜스페린 수용체 모두에서 녹색형광이 관찰됨을 확인하였다(도 24). 이로부터 HT22 세포주에서의 내포화 경로는 클라스린, 카베올린1 및 트랜스페린 수용체를 게이트(GATE)로 함을 알 수 있었다.
<110> LEE, Hee Jung <120> Aptamer for beta oligomeric amyloids and uses thereof <130> WR-15137-IDP <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ob5 aptamer <400> 1 gggaattcga gctcggtacc gtcacactgc tgccaactgc aggcatgcaa gcttgg 56

Claims (12)

  1. 베타-아밀로이드 올리고머에 특이적으로 결합하고, 서열번호 1의 염기서열을 포함하며, 총 염기 길이가 25 내지 100개인 압타머.
  2. 제1항에 기재된 압타머와 이의 5' 말단 부위, 중간 부위, 3' 말단 부위, 또는 양 말단 부위에 검출표지가 결합된 화합물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 검출표지는 형광물질, 자성체, 염색물질, 양자점(Quantum dot), 상자성 입자(super paramagnetic particles), 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles), 발색효소, 방사성동위원소로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 화합물.
  4. 제1항에 기재된 압타머와 가돌리늄(gadolinium, Gd) 또는 가돌리늄 착물이 결합된 화합물이되, 가돌리늄 착물은 가돌리늄에 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetracetic acid: DOTA) 또는 다이에틸렌트리아민펜타아세트산(diethylenetriamine pentaacetic acid, DTPA)인 화합물.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 하나의 항의 화합물을 포함하는, 초기치매 또는 알츠하이머 질환 부위의 영상화용 조영제.
  6. 제5항에 있어서, 상기 조영제는 자기공명영상(magnetic resonance imaging, MRI)용인 것을 특징으로 하는 조영제.
  7. 제2항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 기재된 화합물을 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 초기 치매 또는 알츠하이머 진단용 약학 조성물.
  8. 제2항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 기재된 화합물을 환자의 시료와 반응시키는 단계를 포함하는, 초기 치매 또는 알츠하이머 진단에 정보를 제공하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 화합물을 초기치매 또는 알츠하이머 환자의 시료와 반응시키는 단계; 및
    상기 환자의 시료에서의 베타-아밀로이드 올리고머 및 상기 화합물의 결합 정도를 측정하는 단계를 포함하고,
    상기 환자의 시료에서의 화합물의 결합 정도가 정상 시료에서의 결합 정도보다 높은 경우 상기 환자를 초기치매 또는 알츠하이머 환자로 판단하는 것을 특징으로 하는, 초기치매 또는 알츠하이머 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 환자의 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈장, 혈청, 혈액, 타액, 객담, 림프액, 뇌척수액, 세포간액 또는 뇨 시료인 방법.
  11. 초기 치매 또는 알츠하이머 환자의 시료에 치매 또는 알츠하이머 치료제를 처리하는 단계;
    상기 시료에 제2항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 기재된 화합물을 처리하는 단계; 및
    상기 시료에서 초기 치매 또는 알츠하이머 치료제를 처리하기 전과 처리한 후의 상기 화합물의 결합 정도를 측정하는 단계를 포함하는, 초기치매 또는 알츠하이머 치료제의 모니터링 방법.
  12. 초기 치매 또는 알츠하이머 환자의 시료에 초기치매 또는 알츠하이머 치료제 후보물질을 처리하는 단계; 및
    상기 시료에서 후보물질을 처리하기 전과 처리한 후의 제2항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 기재된 화합물의 결합 정도를 측정하는 단계를 포함하는, 초기치매 또는 알츠하이머 치료제의 스크리닝 방법.
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