KR102307291B1

KR102307291B1 - 인터루킨-2 단백질에 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 기반의 질병 조기진단용 스마트렌즈

Info

Publication number: KR102307291B1
Application number: KR1020190114588A
Authority: KR
Inventors: 이승재; 박대영; 안지영; 이상희
Original assignee: 주식회사 에이치피바이오
Priority date: 2018-09-18
Filing date: 2019-09-18
Publication date: 2021-10-05
Also published as: KR20200032655A

Abstract

본 발명은 인터루킨-2 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 기반의 질병 조기진단용 스마트렌즈에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 DNA 앱타머는 알츠하이머병, 류마티스 관절염 또는 암과 같은 질환에서 그 발현이 변하는 인터루킨-2 단백질에 특이적으로 결합함으로써, 쉽고 경제적으로 상기 질환을 진단할 수 있으며, 특히 상기 DNA 앱티머가 코팅된 스마트렌즈는 눈물 내 존재하는 인터루킨-2 단백질을 검출함으로써 비침습적으로 질환을 진단하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

인터루킨-2 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 기반의 질병 조기진단용 스마트렌즈{SMART-LENS FOR EARLY DISEASES DIAGNOSIS BASED ON DNA APTAMER SPECIFICALLY BINDING TO INTERLEUKIN-2 PROTEIN}

본 발명은 인터루킨-2 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 기반의 질병 조기진단용 스마트렌즈에 관한 것이다.

현대 사회의 큰 추세인 노년인구의 증가와 함께 급격히 증가하고 있는 알츠하이머병. 암, 관절염 등은 환자 자신과 가족, 그리고 의학적·사회적인 측면에서의 다각적인 접근이 강구되어야 할 질환이다.

알츠하이머병은 비정상적으로 접힌 베타 아밀로이드 단백질의 반점 축적과 뇌에 있는 타우 단백질로 인한 단백질의 잘못된 구조형성으로 인해 발병하는 것으로 확인되었다. 반점은 베타-아밀로이드(Aβ)라고 불리는, 39~43개 길이의 아미노산인 작은 펩타이드로 구성된다. Aβ는 더 큰 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 조각이다. APP는 신경 세포의 세포막을 관통하는 막전이 단백질이다. APP는 신경 세포의 성장, 생존 및 손상 후 복구에 매우 중요하다. 알츠하이머병에서, 감마 분비효소(secretase)와 베타 분비효소는 함께 단백질 분해과정에 관여하여 APP가 작은 조각으로 나뉘게 한다. 이러한 조각 중 하나는 베타 아밀로이드의 섬유화를 일으키고, 이는 다시 뉴런의 외부에 노인성 반점으로 알려진, 고밀도도 축적된 덩어리를 형성한다.

아직까지 베타-아밀로이드 펩타이드의 생성과 응집에 의한 신경전달계 교란기작에 의한 알츠하이머병의 병리는 명확히 알려져 있지 않다. 아밀로이드 가설은 전통적으로 신경세포의 퇴화를 야기시키는 중요 기전으로서 뉴런의 베타-아밀로이드 펩티드의 축적을 지적한다. 세포의 칼슘 이온의 항상성 교란을 일으키는 단백질의 독성 형태로 여겨지는 응집된 아밀로이드 섬유의 축적은 세포사멸(apotosis)을 유도한다. 또한 베타-아밀로이드는 알츠하이머에 걸린 뇌 세포내의 미토콘드리아에서 선택적으로 증가하고 특정 효소의 기능 및 신경 세포에 의한 포도당의 사용을 억제한다.

이와 함께, 다양한 염증 과정과 이 과정에서 분비되는 사이토카인 또한 알츠하이머병의 병리에 중요한 역할을 한다. 염증은 어느 질병에서나 조직 손상의 일반적인 증상이므로, 알츠하이머병에서 조직 손상의 2차적 반응이거나 면역반응의 증상일 수 있다. 또한, 뇌에서 신경세포와 면역기전 사이의 강한 상호 작용이 있다는 보고 또한 증가하고 있다. 다른 신경 강화 인자의 분포와 뇌 유래 신경 강화인자(BDNF)와 같은 신경 강화 인자의 수용체 발현의 변화가 알츠하이머병에서 보고되었다.

한편, 류마티스 관절염(Rheumatoid arthritis)은 관절 주위를 둘러싸고 있는 활막이라는 조직의 염증 때문에 일어나는 질환이다. 이는 활막이 존재하는 모든 관절, 즉 움직일 수 있는 거의 모든 관절을 침범하는 질환으로서 수개월에서 수년에 걸쳐 진행되는 소위 만성 질환이다. 류마티스 관절염이 발생하는 전형적인 연령층은 30대 전후의 여성이지만 남자에게도 발생하고 소아부터 노인에 이르는 모든 연령층에 발생할 수 있다.

정확한 원인은 알려져 있지 않지만, 유전적으로 류마티스 관절염의 소인이 있는 사람이 어떤 외부자극을 받으면 인체 내의 면역체계가 자신의 몸을 비정상적으로 공격하여 염증이 발생한다고 추정하고 있다. 다시 말하면 외부의 나쁜 균에 방어 역할을 해야 하는 인체의 면역체계가 자신의 신체조직을 공격하는 자가면역질환의 일종이다.

류마티스 관절염의 진단은 주로 문진과 진찰로서 이루어진다. 류마티스 관절염은 다른 많은 종류의 관절염과 비슷하기 때문에, 또는 바이러스 감염 후에도 일시적으로 비슷한 증상이 나타날 수 있기 때문에 최소한 6주 이상 지속적인 증상이 있는 경우에만 류마티스 관절염으로 진단하며, 혈액 검사, 엑스레이 검사 등을 보조적으로 사용한다. 이때, 혈액 검사는 어디까지나 보조적인 진단 수단이며 문진과 이학적 검사가 가장 중요한 진단의 단서가 된다. 따라서 혈액검사에 아무리 류마티스 인자가 나온다고 해도 증상이 없으면 절대로 류마티스 관절염이라고 진단하지 않는다. 일단 류마티스 관절염으로 진단되면 초기부터 꾸준하게 치료하여 관절의 염증을 억제하고 관절이 손상되는 것을 막아야 한다.

또한, 암(癌, Cancer) 혹은 악성종양(惡性腫瘍, Malignant tumor, Malignant neoplasm)은 세포주기가 조절되지 않아 세포분열을 계속하는 질병으로, 폐암·위암·유방암·대장암 등이 있다. 암은 어느 조직에서나 발생할 수 있지만, 머리카락이나 손발톱 등과 같이 성장이 없는 죽은 세포조직에서는 발생하지 않는다.

악성종양이 발생하는 원인은 명확하지 않으나, 정상적인 세포의 유전자나 암 억제 유전자에 돌연변이가 생겨서 나타난다고 알려져 있다. 대표적인 암 억제 유전자인 p53 유전자는 자연발생적인 원발성 종양의 약 50%에서 돌연변이 형태로 확인되었다. 그러나 특정 유전자 몇 개의 변이로만 암이 일어나는 것은 아니다. 유전자 치료를 통해 정상 p53 유전자를 암세포에 주입했을 경우 환자의 상태가 호전되지 않는다는 연구 결과에 기초하여도, 암은 복잡한 원인에 의해서 발생하는 것으로 생각된다.

암은 10년이 넘는 기간 동안 세계 사망원인 1위를 차지하고 있다. 암은 임상적 증상, 신체 검사 결과, 또는 선별검사 결과를 바탕으로 진단할 수 있다. 때로는 부상 등의 다른 이유로 촬영한 X-레이를 통해 암 가능성이 있는 이상 증상을 발견하기도 한다. 암 존재를 확인하려면 다른 검사(진단 검사)가 필요하다. 암을 진단하고 나면 병기를 확인한다. 병기는 암의 진행 정도를 표시하는 방법으로서 암의 크기, 인근 조직이나 원거리 림프절 또는 다른 장기로의 전이 여부 등을 기준으로 삼는다.

일반적으로 암이 의심되면 X-레이(단순 X선(Plain X-Rays)), 초음파 촬영, 또는 컴퓨터 단층 촬영(CT-컴퓨터 단층촬영(CT))을 실시한다. 예를 들어 만성 기침이 있거나 체중이 감소한 사람은 흉부 X-레이를 촬영할 수 있다. 반복적으로 두통이 있거나 시력에 문제가 있으면 뇌 CT 또는 자기공명영상(MRI-자기공명영상(MRI)) 촬영을 할 수 있다. 이들 검사가 비정상적인 덩어리의 존재, 위치, 크기를 보여줄 수 있지만 그 원인이 암인지는 확인할 수 없다. 암은 바늘 생검 또는 수술을 통해서 종양 조각을 채취하고 의심 부위의 검체를 현미경으로 검사하여 암세포를 찾는 방식으로 확인한다. 일반적으로 검체는 조직편이어야 하지만, 때로는 혈액 검사를 수행한다. 조직 검체를 채취하는 생검은 작은 칼을 사용하여 작은 조직 조각을 잘라낼 수도 있지만, 일반적으로 속이 빈 바늘을 사용하여 조직을 채취한다. 이들 검사는 일반적으로 1일 이상의 병원 입원을 하지 않고 실시한다. 의사들은 바늘을 정확한 위치로 안내하기 위해 초음파나 CT를 사용하기도 한다. 생검은 통증이 수반될 수 있기 때문에 일반적으로 국소 마취를 실시한다.

상기한 바와 같이 알츠하이머, 류마티스, 암은 아직까지 근본적인 치료가 어렵고 질병의 진행을 늦추는 방향으로만 치료가 진행되고 있기에 조기진단의 중요성이 대두되고 있으나 현재의 진단법은 오랜 시간이 소요되고 고가의 장비와 전문 인력이 필요하다는 단점이 있다. 이러한 조기진단의 문제점을 극복하기 위해 본 발명에서는 눈물에 존재하며 알츠하이머병, 류마티스, 암의 발병 기전과 연관이 있는 사이토카인(cytokine) 중 하나인 인터루킨-2(Interleukin-2, IL-2)를 신규 질병 표지자로 활용하고자 한다.

인터루킨-2(interleukin-2, IL-2)는 인체에 존재하는 인터루킨 중 하나로서, 면역계의 사이토카인 신호 전달 분자의 일종이다. 인터루킨-2는 면역에 직접적으로 관여하는 백혈구(백혈구, 종종 림프구)의 활동을 조절하는 15.5 내지 16 kDa 크기의 단백질이다. 인터루킨-2는 미생물 감염에 대한 신체의 자연적 면역반응을 조절한다. 인터루킨-2는 림프구에 의해 발현되는 인터루킨-2 수용체에 결합함으로써 면역체계를 활성화시킨다.

인터루킨-2는 4개의 알파 나선 다발을 갖는 구조를 이루고 있다. IL에는 인터루킨-2를 제외하고도 IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21 등이 포함된다. 인터루킨-2는 알파, 베타 및 감마라 불리는 3개의 사슬로 이루어진 복합체인 인터루킨-2 수용체를 통해 면역반응의 신호를 전달한다. 안터루킨 수용체의 감마 체인은 모든 인터루킨들이 공유한다는 특성을 가진다.

인터루킨-2에 대한 유전자 발현 조절은 다양한 방법으로 진행될 수 있다. 이 중 하나는 MHC-펩타이드 복합체를 인식한 후, T-림프구의 항원 수용체인 T 세포 수용체(T cell receptor, TCR)를 통한 신호 전달이다. TCR의 신호경로는 또한 PLC(phospholipase-C) 경로를 거친다. PLC는 NFAT(nuclear factor of activated T cell), NFkB(nuclear factor k-light-chain-enhancer of activated B cell) 및 AP-1(activator protein 1)과 같은 3가지 주요 전사 인자를 활성화시킨다. CD28의 보조 자극 후 인터루킨-2 및 이러한 경로의 최적 발현이 유도된다.

이러한 인터루킨-2는 인체의 눈물에 항시 존재하고 있으며 인체의 염증 및 질병에 따라 그 농도가 변한다. 최근 학계의 보고에 의하면 인터루킨-2는 알츠하이머병의 원인으로 작용하는 베타-아밀로이드 기능 상실 및 응집 이에 따른 신경전달계의 이상에 직접적으로 작용한다는 것이 확인되었다. 이 외에도 류마티스와 암의 발병 초기에 인터루킨-2의 농도가 급격히 변화된다는 보고가 있다.

한편, 앱타머(aptamer)는 짧은 길이의 올리고머(oligomer)로서, 안정한 구조를 형성하여 표적 물질에 높은 결합력과 특이성을 갖는다. 앱타머는 DNA나 RNA로 구성되어 있어 단백질로 이루어진 항체에 비해 안정성이 높으며, 화학적 합성을 통해 제작할 수 있기 때문에 경제성 또한 높은 장점을 지니고 있다. 또한, 항체와 달리 개발에 동물 실험이 필요하지 않을 뿐만 아니라 크기의 변화 및 소수성 변화를 통해 약물동력학적 성질을 쉽게 변형할 수 있으며 인체에서 면역반응 및 거부반응을 일으키지 않는다는 장점을 가지고 있어 표적 물질의 검출 및 질환 진단 기술 개발은 물론 다양한 질병에 대한 진단소재 개발에서도 활용 가능성이 높이 평가되고 있다.

나아가, 스마트렌즈 바이오진단 시스템은 질환 및 건강 관련 신체지표와 인체 내 위해물질이나 요인을 신속하게 측정하고 진단할 수 있는 바이오기반의 측정시스템이다. 이와 관련하여, 대한민국 특허공개 제10-2018-0035166호는 산화세륨 나노입자에 포도당 산화효소가 결합된 복합체를 포함하여, 간단하고 경제적으로 눈물 내 포도당 농도를 측정함으로써 비침습적인 방법으로 포도당의 농도를 실시간으로 모니터링 할 수 있는 포도당 검출을 위한 콘택트렌즈형 센서를 개시하고 있다.

최근 바이오진단의 방향은 조기진단, 치료와 동반된 진단기술을 요구하는 방향으로 진행되고 있으며, 적극적인 진단을 통하여 의료비 절감, 국민건강증진에 크게 기여할 것으로 기대되어 경제적, 사회적으로 필요성이 높은 분야이다. 이는 노령화, 소득수준 향상, 공공복지에 대한 인식 제고, 해외 의료서비스에 대한 접근성 향상 등의 환경 변화로 인해 소형화, 간편화 기기에 대한 수요가 급속히 증가하고 있다. 바이오진단 시스템은 진단 대상물질인 바이오마커의 형태에 따라 핵산기반 진단시스템, 단백질 및 항체 기반 진단시스템, 대사체 진단시스템 및 나노 융합기술 기반 진단시스템을 포함하며 진단 키트, 바이오칩, 의료용 바이오센서 및 자동화 측정시스템으로 대분류가 가능하다. 이의 타켓은 감염성 질환, 종양성 질환, 심혈관 질환, 식중독균 진단, 인수공통 질환 등 여러 가지가 있다.

특히, 의료 현장에서 간단하고 신속하게 검사를 할 수 있는 POCT(Point of Care Test) 시장은 치료보다 조기진단, 예방을 강조하고 있는 추세에서 빠르고 간단한 검진에 대한 수요가 늘어나고 있다. 이러한 추세는 장기적으로 가족 건강관리 네트워크(Home Healthcare Network)로 이어져, 기존의 의료기관에 비해 훨씬 거대한 개인수요가 생겨날 것으로 예상된다. 게다가, 바이오센서를 접목시킨 질병진단기술은 환자들에게서 나타나는 공통의 성분을 타겟으로 하여 이들을 바이오마커로 활용하여 조기진단을 할 수 있는 방법이 나타나고 있다. 최근 눈물 내 다양한 바이오마커를 콘텍트렌즈에 도입하여 당뇨 등 조기진단이 필수적인 질병을 간편하게 진단하는 사례가 증가하고 있다. 콘텍트렌즈를 활용한 콘텍트렌즈 시장은 최근 연평균 5.3%로 성장하고 있는 고부가가치산업으로 콘텍트렌즈를 도입한 POCT 시장이 지속적으로 성장할 것이라 전망된다.

대한민국 특허공개 제10-2018-0035166호

본 발명의 목적은 인터루킨-2 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머, 상기 앱타머의 질환 진단 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 DNA 앱타머를 이용하여 질환을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 DNA 앱타머를 포함하는 질환 진단용 콘택트 렌즈를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 6으로 기재되는 염기서열로 구성되고, 인터루킨-2 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 포함하는 인터루킨-2 단백질 검출용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 포함하는 인터루킨-2 단백질 검출용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 포함하는 인터루킨-2 단백질의 발현 변화와 관련된 질환 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 포함하는 인터루킨-2 단백질의 발현 변화와 관련된 질환 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 DNA 앱타머가 고정화된 기판을 갖는 인터루킨-2 단백질 검출용 마이크로어레이를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 DNA 앱타머가 고정화된 기판을 갖는 인터루킨-2 단백질의 발현 변화와 관련된 질환 진단용 마이크로어레이를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 인터루킨-2 단백질 검출 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 인터루킨-2 단백질의 발현 변화와 관련된 질환 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 DNA 앱타머가 코팅된 인터루킨-2 단백질 검출용 콘텍트렌즈를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 DNA 앱타머가 코팅된 인터루킨-2 단백질의 발현 변화와 관련된 질환 진단용 콘텍트렌즈를 제공한다.

본 발명에 따른 DNA 앱타머는 알츠하이머병, 류마티스 관절염 또는 암과 같은 질환에서 그 발현이 변하는 인터루킨-2 단백질에 특이적으로 결합함으로써, 쉽고 경제적으로 상기 질환을 진단할 수 있으며, 특히 상기 DNA 앱티머가 코팅된 스마트렌즈는 눈물 내 존재하는 인터루킨-2 단백질을 검출함으로써 비침습적으로 질환을 진단하는데 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 PCR 기법을 통해 랜덤 DNA 라이브러리를 증폭한 결과 도면이다.
도 2는 나노드랍을 이용하여 각 라운드에 따른 앱타머의 친화성을 테스트한 결과 그래프이다.
도 3은 인터루킨-2 단백질과 특이적으로 결합하는 앱타머의 구조를 확인한 결과 도면이다.
도 4는 인터루킨-2 단백질에 특이적으로 결합하는 앱타머가 코팅된 콘텍트렌즈를 이용하여 인터루킨-2 단백질을 검출한 결과 도면이다.

본 발명은 서열번호 6으로 기재되는 염기서열로 구성되고, 인터루킨-2 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "인터루킨-2(interleukin-2, IL-2) 단백질"은 인체에 존재하는 사이토카인 중 하나로, 4개의 알파 나선 다발 구조를 갖는 15.5 내지 16 kDa 크기의 단백질을 의미한다. 상기 인터루킨-2 단백질은 백혈구나 림프구의 활동을 조절할 수 있고, 인터루킨-2 수용체를 통해 면역반응과 관련된 신호를 전달할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "앱타머(aptamer)"는 특정 물질에 고친화성 및 특이성으로 결합할 수 있는 DNA 핵산분자를 의미한다. 상기 앱타머는 통상의 기술분야에 잘 알려진 방법으로 제조될 수 있고, 상기 방법은 필요에 따라 적절히 변형될 수 있다.

상기 DNA 앱타머는 전형적으로는 표적 분자의 결합에 대한 시험관 내 선택법에 의해 얻을 수 있다. 표적 분자에 특이적으로 결합하는 앱타머를 선택하는 방법은 당 분야에서 공지되어 있다. 예를 들어, 유기 분자, 뉴클레오타이드, 아미노산, 폴리펩타이드, 세포 표면상의 마커분자, 이온, 금속, 염, 다당류가 각 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 앱타머를 분리하는 적절한 타겟 분자가 될 수 있다. 앱타머의 선별은 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 방법으로 공지된 생체 내 또는 시험관 내 선택 기술을 이용할 수 있다(Ellington et al., Nature 346, 818-22, 1990; 및 Tuerk et al., Science 249, 505-10, 1990). 앱타머의 선별 및 제조에 대한 구체적인 방법은 미국특허 5,582,981, WO 00/20040, 미국특허 5,270,163, Lorsch and Szostak, Biochemistry, 33:973(1994), Mannironi et al.,Biochemistry 36:9726(1997), Blind, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3606-3610(1999), Huizenga and Szostak, Biochemistry, 34:656-665(1995), WO 99/54506, WO 99/27133, WO 97/42317 및 미국특허 5,756,291에 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.

본 발명의 DNA 앱타머는 인터루킨-2 단백질에 특이적으로 결합하는 특성을 유지하면서, 본 명세서에 명시된 DNA 앱타머의 염기서열과 실질적인 동일성을 나타내는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은 상기한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘(Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981) Needleman and Wunsch, J.Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994))을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 90％의 동일성, 보다 바람직하게는 최소 95％의 동일성, 가장 바람직하게는 최소 98％의 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.

상기 DNA 앱타머는 표적 물질에 대한 결합성 및 안정성을 높이기 위해, 각 뉴클레오티드의 당 잔기, 구체적으로 리보오스 또는 디옥시리보스가 수식될 수 있다. 상기 수식은 당 잔기의 2'위치, 3'위치 및 4'위치로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 산소 원자를 다른 원자로 치환한 것일 수 있다. 수식의 예로는 플루오로화, O-알킬화, O-알릴화, S-알킬화, S-알릴화, 아미노화 등이 포함될 수 있다. 상기와 같은 당 잔기의 변형은 통상적인 방법으로 수행될 수 있다.

또한, 상기 DNA 앱타머는 표적 물질에 대한 결합성을 높이기 위해, 핵산염기가 변형될 수 있다. 상기 핵산염기의 변형은 5위치의 피리미딘 변형, 6위치의 푸린 변형, 8위치의 푸린 변형, 환외(環外) 아민에서의 변형, 4-티오우리딘으로의 치환, 5-브로모로의 치환 또는 5-요오드-우리실로의 치환 등을 포함할 수 있다.

또한, 상기 DNA 앱타머는 뉴클레아제 및 가수분해효소 등에 대해 내성을 갖도록 인산기가 변형될 수 있다. 예를 들면, 상기 인산기는 티오에이트, 디티오에이트, 아미데이트, 포름아세탈, 3'-아민 등으로 치환될 수 있다. 나아가, 상기 DNA 앱타머는 3' 말단 또는 5' 말단의 변형을 포함할 수 있고, 상기 변형은 캡핑이나, 바이오티닐, 폴리에틸글리콜, 아미노산, 펩티드, 핵산, 뉴클레오시드, 미리스토일(myristoyl), 리소콜릭-올레일(lithocolic-oleyl), 도코사닐(docosanyl), 라우로일(lauroyl), 스테아로일(stearoyl), 팔미토일(palmitoyl), 올레오일(oleoyl), 리놀레오일(linoleoyl), 지질, 스테로이드, 콜레스테롤, 카페인, 비타민, 색소, 형광물질, 항암제, 독소, 효소, 방사성 물질, 비오틴 등이 부가된 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 포함하는 인터루킨-2 단백질 검출용 조성물 또는 키트를 제공한다.

상기 DNA 앱타머는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 DNA 앱타머는 서열번호 6으로 기재된 염기서열로 구성될 수 있다.

상기 검출용 조성물에 포함되는 DNA 앱타머는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지된 접합체일 수 있다. 발색효소는 퍼록시다제, 알칼라인 포스파타제 또는 산성 포스파타제일 수 있고, 형광물질은 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2',7'-디클로로플루오레신-5-일, 2',7'-디클로로플루오레신-6-일, 디하이드로 테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸, Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(RITC), PE(Phycoerythrin) 또는 로다민일 수 있다.

또한, 상기 DNA 앱타머는 상기 DNA 앱타머에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함할 수 있다. 상기 리간드는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지된 접합체, 및 스트렙타비딘 또는 아비딘이 처리된 리간드일 수 있다. 본 발명의 진단용 조성물은 상기 서술한 바와 같은 시약 외에도 이들의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 더 포함할 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 검출용 키트는 이에 포함되는 DNA 앱타머의 세척이나 복합체의 분리 등과 같은 이후 단계를 용이하게 하기 위해 고형 기질에 결합될 수 있다. 이때, 고형 기질로는 합성수지, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 또는 미세비드가 사용될 수 있다. 또한, 합성수지로는 폴리에스터, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, PVDF 또는 나일론 등이 사용될 수 있다.

또한, 상기 키트는 당업자에게 알려진 종래의 제조방법에 의해 제조될 수 있으며, 버퍼, 안정화제, 불활성 단백질 등을 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 시약의 양을 탐색하기 위해 검출체로서 부착된 형광물질의 형광을 검출함으로써 수행되는 형광법 또는 검출체로서 부착된 방사선 동위원소의 방사선을 검출함으로써 수행되는 방사선법을 통한 초고속 스크리닝(high throughput screening, HTS) 시스템, 검출체의 표지 없이 표면의 플라즈몬 공명 변화를 실시간으로 측정하는 SPR(surface plasmon resonance) 방법 또는 SPR 시스템을 영상화하여 확인하는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 방법을 이용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 포함하는 인터루킨-2 단백질의 발현 변화와 관련된 질환 진단용 조성물 또는 키트를 제공한다.

상기 인터루킨-2 단백질의 발현 변화와 관련된 질환은 질환의 발병으로 인해 인터루킨-2 단백질의 발현을 변화시키는 질환이라고 알려진 것이라면 모두 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 질환은 알츠하이머병, 류마티스 관절염 또는 암일 수 있다.

본 발명에 따른 인터루킨-2 단백질의 발현 변화와 관련된 질환 진단용 조성물 및 키트는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 마이크로어레이는 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 활성기가 코팅된 기판에 고정될 수 있다. 또한, 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 및 플라스틱으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상으로 제작된 것일 수 있다.

본 발명에 따른 DNA 앱타머는 통상의 기술분야에 알려진 어떠한 방법을 사용하여 기판에 고정화될 수 있고, 구체적으로, 피에조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법, 핀(pin) 형태의 스팟터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다.

상기 DNA 앱타머는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 DNA 앱타머는 서열번호 6으로 기재된 염기서열로 구성될 수 있다. 또한, 상기 마이크로어레이 또한 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 방법에 사용되는 DNA 앱타머는 인터루킨-2 단백질에 특이적으로 결합하는 본 발명에 따른 DNA 앱타머일 수 있고, 이는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 인터루킨-2 단백질 검출 방법은 시험관 내(in vitro)에서 수행되는 것일 수 있고, 그에 따라 인터루킨-2 단백질을 검출하고자 하는 시료라면 어떠한 시료도 모두 사용될 수 있다.

상기 시료는 인터루킨-2 단백질을 검출하고자 하는 시료라면 모든 시료를 포함할 수 있다. 일례로, 상기 시료는 포유동물 유래 시료일 수 있고, 구체적으로 인간 유래 시료일 수 있다. 또한, 상기 시료는 혈액, 체액, 타액, 누액, 요액, 활액, 점액, 세포 및 조직으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

또한, 상기 시료는 본 발명에 따른 방법에 사용되기 전에 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 연속추출, 원심분리 또는 젤 전기영동 등의 방법을 이용하여 전처리될 수 있다.

상기 콘텍트렌즈는 상기 서술한 바와 같은 특징을 갖는 인터루킨-2 단백질에 특이적인 DNA 앱타머가 코팅됨으로써, 체액, 구체적으로, 눈물에 존재하는 인터루킨-2 단백질을 검출할 수 있다. 또한, 상기 콘텍트렌즈는 통상의 기술분야에 알려진 모든 방법 및 소재로 제조될 수 있다. 일례로, DNA 앱타머가 표면에 코팅되기 위하여, 상기 콘텍트렌즈는 수산화기(-OH)를 가질 수 있다. 따라서, 상기 콘텍트렌즈는 렌즈의 표면에 존재하는 수산화기가 5' 말단이 실란화기로 변성된 DNA 앱타머와 결합함으로써, 제조될 수 있다.

상기 콘텍트렌즈는 상기 서술한 바와 같은 특징을 갖는 인터루킨-2 단백질에 특이적인 DNA 앱타머가 코팅된 것일 수 있다. 따라서, 상기 콘텍트렌즈는 눈물에 존재하는 인터루킨-2 단백질의 발현 변화를 검출함으로써, 이와 관련된 질환을 진단할 수 있다. 상기 콘텍트렌즈는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: DNA 앱타머의 제작

1-1. 프라이머 및 DNA 앱타머 풀의 합성

인터루킨-2 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 제작하기 위한 랜덤 주형 DNA를 확보하기 위하여, 40개의 랜덤 서열을 dA:dG:dC:dT = 1.5:1.15:1.25:1 비율로 포함하는 76 bp의 주형 DNA(서열번호 1: 5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATTN₄₀AGATAGTAAGTGCAATCT-3')와 이를 76 bp로 증폭할 수 있는 프라이머 한 쌍을 바이오니어 사(Bioneer, Korea)에 의뢰하여 합성하였다[정방향 프라이머(서열번호 2): 5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT-3'. 역방향 프라이머(서열번호 3): 5'-AGATTGCACTTACTATCT-3'].

1-2. PCR 기법을 통한 랜덤 DNA 라이브러리 증폭

임의의 DNA 라이브러리는 PCR 기법을 이용하여 증폭하였으며, 76 bp DNA 라이브러리의 증폭을 위한 PCR 반응 조성은 1 ㎕의 주형 DNA, 5 ㎕의 10X PCR 완충용액, 4 ㎕의 dNTP 혼합물, 2 ㎕의 10 μM 정방향 프라이머, 2 ㎕의 10 μM 역방향 프라이머, 0.3 ㎕의 Ex Taq 중합효소(Takara, Japan)(1 unit/㎕)와 35.7 ㎕의 증류수로 구성하였다. PCR과정의 반응 조건은 94℃에서 5분간 변성시키고, 94℃에서 30초, 52℃에서 30초, 그리고 72℃에서 30초간 반응을 20주기 반복한 후, 72℃에서 5분간 추가로 신장시키는 반응을 이용하였다. PCR 반응 후 반응산물을 4 ㎕ 취하여, 2% 아가로오스 겔 전기영동을 통하여 76 bp 증폭 산물을 확인한 뒤, PCR 정제 키트 (Qiagen, USA)를 이용하여 정제하여 증류수 50 ㎕에 회수하였다 (도 1 참고).

1-3. 가열-냉각(heating-cooling) 기법을 활용한 ssDNA 제작

PCR 기법과 PCR 정제 키트를 이용하여 회수한 DNA 라이브러리 50 ㎕에 증류수 50 ㎕를 첨가하여 부피를 100 ㎕로 조정한 후, 가열-냉각(heating-cooling) 기법을 이용하여 dsDNA를 ssDNA로 변성(Denaturation)하였다. 상기한 PCR 기법과 PCR 정제 기트를 이용한 PCR 산물 정제를 통해 확보한 dsDNA를 85℃에서 5분 동안 반응하여 dsDNA를 ssDNA로 변성시킨 후, 반응 종료 후 즉시 반응액을 4℃로 냉각하여 ssDNA를 제작하였다.

1-4. ssDNA의 선별 및 회수

가열-냉각 기법을 이용하여 확보된 ssDNA 산물 중 비오틴(Biotin)이 결합되어 있는 ssDNA와 프라이머를 제거하고 정방향의 ssDNA만을 순수하게 확보하기 위하여, 상기 실시예에서 획득한 100 ㎕의 반응액에 50 ㎕의 스트렙트아비딘 아가로즈 레진(streptavidin agarose resin, Thermo scientific, USA)을 첨가하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응액을 4℃, 13,000 rpm의 조건 하에서 15분간 원심분리한 후, 상층액만을 회수하여 동일 부피의 PCI(phenol:chloroform: isoamylalcohol=25:24:1) 용액을 첨가하고, 4℃에서 13,000 rpm의 조건으로 다시 15분간 원심분리하여 상층액만을 회수하였다. 상층액 1/100 부피의 tRNA(sigma aldrich, USA), 1/10 부피의 3 M 소듐 아세테이트(sodium acetate, pH 4.5)와 3 부피의 100% 에탄올을 첨가하여 -70℃에서 1시간 이상 반응시켰다. 반응 후에는 4℃에서 13,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 ssDNA만을 회수하였다. 회수한 ssDNA는 65℃에서 건조시킨 후, 50 ㎕의 증류수에 녹여 회수하였다.

실시예 2: Ni-NTA 아가로즈 레진 기반 SELEX 기법을 이용한 재조합 인터루킨-2 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 선별

2-1. SELEX에 사용하기 위한 DNA 앱타머 구조 제작

상기 실시예 1-4를 통해 확보한 40 ㎕의 ssDNA 앱타머에 10 ㎕의 증류수를 첨가하여 총 부피를 50 ㎕로 조정하고, 50 ㎕의 2X PBS 버퍼를 첨가하여 전체 반응 부피를 100 ㎕로 조정 후, 85℃에서 5 분간 끓여 변성시킨 후 상온에서 1시간 이상 서서히 식혀 ssDNA 앱타머의 안정한 3차원 구조를 형성시켰다.

2-2. Ni-NTA 아가로즈 레진 기반의 SELEX 기법을 이용한 인터루킨-2 단백질과 특이적으로 결합하는 ssDNA 앱타머 선별

인터루킨-2 단백질과 특이적으로 결합하는 ssDNA 앱타머를 선별하기 위하여 인터루킨-2 단백질에 상기 실시예 2-1에서 확보한 ssDNA 앱타머 풀과 혼합한 후, 1X PBS 버퍼로 전체 반응 부피를 200 ㎕로 조정하였으며, 이후 4℃에서 12시간 이상 반응시켰다. 인터루킨-2 단백질과 특이적으로 결합하는 ssDNA 앱타머를 선별하기 위하여 Ni-NTA 아가로즈 레진을 이용하여 SELEX를 수행하였다. 우선 Ni-NTA 아가로즈 레진을 활성화시킨 뒤, 인터루킨-2 단백질과 ssDNA 앱타머 반응액을 넣어주었다. 이후, 인터루킨-2 단백질과 특이적으로 결합하는 ssDNA 앱타머를 회수하기 위하여 1 ㎖의 1X PBS 버퍼로 3회 세척한 Ni-NTA 아가로즈 레진에 200 ㎕의 1X PBS 버퍼를 넣고 85℃에서 5 분간 반응시켰다. 반응이 끝난 반응물을 4℃에서 13,000 rpm으로 원심분리하여 상층액을 회수한 뒤, 동일 볼륨의 PCI를 처리하여 인터루킨-2 단백질을 제거하였다. PCI 추출을 통해 확보한 상층액은, 용액의 1/100 부피의 tRNA, 1/10 부피의 3 M NaOAc(pH4.5)와 3배 부피의 100% 에탄올을 첨가하여 -70℃에서 1시간 이상 반응시킨 뒤 4℃에서 13,000 rpm으로 20분간 원심분리 하여 ssDNA 앱타머 만을 회수하였다. 회수한 ssDNA 앱타머는 65℃에서 건조시킨 후, 50 ㎕의 증류수에 녹여 회수하였다.

2-3. 비특이적 DNA 앱타머 제거를 위한 네가티브 선별(Negative selection)

인터루킨-2 단백질이 아닌 Ni-NTA 아가로즈 레진에 결합하는 비특이적인 ssDNA 앱타머를 제거하기 위하여, SELEX 7회와 8회 사이에 인터루킨-2 단백질의 고정 없이 Ni-NTA 아가로즈 레진에 ssDNA 앱타머만을 반응시켜주는 네가티브 선별(negative selection)을 진행하였다. 활성화된 Ni-NTA 아가로즈 레진에 상온에서 구조를 형성한 ssDNA 앱타머 용액을 반응시킨 후, Ni-NTA 아가로즈 레진에 결합하지 않은 상층액의 ssDNA 앱타머 용액을 회수하여 SELEX 8회에 이용하였다. 이후, SELEX는 10회까지 진행하였으며, SELEX 라운드가 진행될수록 반응 조건을 엄격하게 하여 표적 물질인 인터루킨-2 단백질과 더욱 특이적으로 결합하는 ssDNA 앱타머를 얻고자 하였다.

실시예 3: 나노드랍을 이용한 각 라운드의 친화성 테스트

SELEX를 10회까지 수행한 뒤, SELSEX의 추가 진행 여부 및 각 라운드에서 회수된 ssDNA 앱타머의 친화성을 정량적으로 확인하기 위하여 각 라운드에서 회수된 ssDNA의 농도를 나노 드랍(Nano drop)을 이용하여 측정하였다. 나노 드랍을 이용하여 각 라운드에서 회수된 ssDNA 앱타머의 농도를 측정한 결과, 네가티브 선별 이후에 9회에서 회수된 ssDNA 농도가 461.0 ng/㎕로 가장 높았으며, 10회의 농도는 405.4 ng/㎕로 9회보다 농도가 감소하였으며, 이를 통하여 네가티브 선별 이후 인터루킨-2 단백질과 가장 특이적으로 결합하는 최적 앱타머 풀은 9회인 것을 확인하였다(도 2 참고).

실시예 4: 인터루킨-2 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군을 확보하기 위한 최적 라운드의 T-벡터 클로닝

나노 드랍을 통하여 인터루킨-2 단백질과 결합 효율이 가장 높은 것으로 판단된 9회의 ssDNA 앱타머 풀로부터 ssDNA 앱타머 후보군의 서열을 확보하기 위하여 9회에서 수득된 ssDNA 앱타머를 이용하여 T-벡터 클로닝을 수행하였다.

먼저, 9회의 ssDNA 앱타머 풀에 정방향 프라이머(서열번호 4): 5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT-3'와 역방향 프라이머(서열번호 5): 5'-AGATTGCACTTACTATCT-3'를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR을 통하여 확보한 dsDNA는 솔젠트사의 T-블런트 PCR 클로닝 키트를 이용하여 T-벡터 클로닝을 수행하였다. T-벡터 클로닝은 1㎕의 T-블런트 벡터(10 ng/㎕)와 4 ㎕의 PCR 산물, 1 ㎕의 6X T-블런트 버퍼를 섞어서 25℃에서 5분 동안 반응시켜 수행하였다. 1 ㎕의 T-블런트 클로닝 반응액을 100 ㎕의 DH5α 형질전환 세포(competent cell)와 섞은 후 얼음에서 10분 동안 반응시켰으며, 반응액에 42℃에서 30초 동안 열 충격(heat shock)을 가한 후 얼음에서 2분 동안 방치하였다. 반응액에 900 ㎕의 SOC 배지(2% 트립톤, 0.5% 효모추출물, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM MgSO₄, 20 mM 글루코즈)를 첨가한 후 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이후, 200 ㎕의 배양액을 취하여 암피실린(ampicillin, 50 ㎍/㎖), 카나마이신(kanamycin, 50 ㎍/㎖), X-gal(50 ㎍/㎖) 및 IPTG(5 ㎍/㎖)가 포함되어 있는 LB 배양 플레이트(LB plate)에 도말하고, 37℃에서 15시간 동안 배양시킨 후, 128개의 흰색 콜로니만을 선별하여 각 콜로니의 염기서열을 확인하였다(Solgent, Korea). 서열분석 결과, 비정상적이거나 중복되지 않는 인터루킨-2 단백질과 결합하는 ssDNA 앱타머 서열 20개를 확보하였다.

실시예 5: SPR을 이용한 인터루킨-2 단백질과 인터루킨-2 결합 DNA 앱타머의 친화도 정량

5-1. 인터루킨-2 단백질과 이에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머의 친화도를 정량하기 위한 인터루킨-2 단백질 코팅 센서 칩 제작

인터루킨-2 단백질과 상기 실시예 4에서 획득한 인터루킨-2 결합 ssDNA 앱타머 후보군들 간의 친화도를 정량하기 위하여, SPR 검출 시스템 기기인 BIAcore 3000(BIACORE)을 이용하여 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance, SPR) 실험을 실시하였다. 이때, 표면이 카르복실기로 코팅된 센서 칩 CM5(GE Healthcare, UK)를 이용하였다. 우선 센서 칩 CM5 표면의 카르복실기를 반응성이 더 좋은 N-히드록시석신이미드 에스테르(N-Hydroxy-succinimide ester; NHS-에스테르)로 활성화시키기 위하여 0.1 M Nhydroxysuccinimide(NHS)와 0.4 M N-ethyl-N'-(dimethylaminopropyl) carbodiimide(EDC) 혼합액을 5 ㎕/min의 속도로 10분 동안 흘려주었다. NHS-에스테르로 활성화된 센서 칩 CM5 표면에 인터루킨-2 단백질을 고정하기 위하여 10 mM 소듐 아세테이트 (pH 4.5) 완충액에 인터루킨-2 단백질을 1/20로 희석하여 센서 칩에 10 ㎕/min의 속도로 10분 동안 3회 처리하여 칩 표면을 인터루킨-2 단백질로 코팅하였다. 이후 인터루킨-2 단백질이 고정된 센서 칩에 1 M 에탄올아민 하이드로클로라이드(pH 8.5)를 10 ㎕/min의 속도로 10분 동안 흘려줌으로써 센서 칩 표면에 남아 있는 카르복실 반응기를 불활성화 시켰다. 이를 통하여 다른 시약 및 DNA 앱타머가 칩 표면에 직접 결합하는 것을 방지하였으며, 각 실험 후 센서칩은 1 M NaCl, 50 mM NaOH로 재생시켰다. 속도 변수는 BIA 평가프로그램 (BIACORE)으로 수득, 정량하였다.

6-2. 인터루킨-2 단백질 결합 DNA 앱타머 후보군의 친화력 측정

인터루킨-2 단백질과 가장 높은 친화력을 가지는 ssDNA 앱타머를 선별하기 위하여 확보된 인터루킨-2 단백질 결합 ssDNA 앱타머 후보군을 HBS-EP 버퍼(GE Healthcare, UK)에 각 100 nM, 300 nM, 500 nM, 700 nM, 1000 nM, 1200 nM, 1500 nM, 2000 nM의 농도로 녹여 준비하였다. 준비한 인터루킨-2 결합 ssDNA 앱타머는 아무것도 결합시키지 않은 센서 칩(채널 1), 인터루킨-2 단백질이 고정된 센서 칩(채널 2)에 다양한 농도(각 100 nM, 300 nM, 500 nM, 700 nM, 1000 nM, 1200 nM, 1500 nM, 2000nM)의 인터루킨-2 단백질 결합 ssDNA 앱타머 후보군을 주입함으로써 인터루킨-2 단백질과 이에 특이적으로 결합하는 ssDNA 앱타머 후보군간의 친화도를 정량화하였다. 각 인터루킨-2 단백질과 특이적으로 결합하는 ssDNA 앱타머 후보군의 해리상수(Kd, dissociation constant) 수득 결과 인터루킨-2 단백질 결합 ssDNA 앱타머 후보군 중 IL-2-A1 앱타머의 해리상수가 3.9 X 10^-14 pM로 표적단백질인 인터루킨-2에 대해 가장 높은 친화력을 가지고 있음을 확인하였다(표 1 참고).

클론	K _d (pM)
IL-2-A1	3.9 X 10^-14 pM

실시예 6: 인터루킨-2 단백질 결합 DNA 앱타머 후보군들의 구조 결정

실시예 5에서 확인된 클론 IL-2-A1 DNA 앱타머의 서열을 분석하고(표 2 참고), 그 구조를 Rensselear polytechnic institute에서 제공하는 DNA mfold 프로그램을 활용하여 이미지화하였다(도 3 참고).

클론	서열(5'→3')	크기	서열번호
IL-2-A1	GGGCATGTGGACTTGCGATTTCGGTTTGGTGTGGTTGGGG	40 bp	서열번호 6

실시예 7: 인터루킨-2 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 이용한 콘텍트렌즈 표면 기능화

7-1. 콘텍트렌즈 준비

인터루킨-2 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 이용한 질병 진단용 스마트렌즈 제작은 interojo사의 Claren Ultra-Soo렌즈를 이용하였다. 이 렌즈는 소듐 히알루로네이트를 주성분으로 하며 소듐 히알루로네이트의 수산기(-OH)는 DNA 앱타머의 결합에 사용된다.

7-2. 콘텍트렌즈 표면 기능화를 위한 DNA 앱타머 준비

인터루킨-2에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머의 -5‘말단을 광분해가 가능한 아미노 C6(PCAmC6)로 화학변형시켜, 상기 준비된 콘텍트렌즈에서 실란으로 변성된 표면에 결합될 수 있도록 DNA 앱타머를 준비하였다.

7-3. DNA 앱타머 결합을 통한 콘텍트렌즈 표면 기능화

상기 준비된 DNA 앱타머를 콘텍트렌즈 표면에 결합시키기 위한 반응은 두 단계로 진행되었다. 먼저, 콘텍트렌즈를 25%의 3-GPTMS((3-Glycidyloxypropyl) trimethoxysilane) 및 촉매량의 디이소프로필에틸아민이 포함된 증류수에 담가 65℃에서 하룻밤 동안 반응시켜 콘텍트렌즈표면을 실란화시켰다. 이후, 콘텍트렌즈 표면의 3-GPTMS 결합여부는 적외선분광법으로 확인하고, GPTMS로 코팅된 콘텍트렌즈 및 20 uM의 인터루킨-2 특이결합 DNA 앱타머를 10 mM의 KOH 용액에서 37℃에서 6시간 반응시켜 DNA 앱타머를 콘텍트렌즈 표면에 부착시켰다. 콘텍트렌즈 표면의 DNA 앱타머 결합여부는 적외선분광법으로 확인하였다.

실시예 8: 인터루킨-2 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머로 코팅된 콘텍트렌즈를 이용한 인터루킨-2 단백질의 검출

인터루킨-2 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머로 코팅된 콘텍트렌즈 조각을 96-웰 플레이트에서 다양한 농도(0.5 pg, 1.0 pg, 1.5 pg)의 인터루킨-2와 하룻 밤 동안 항온에서 반응시켰다. 반응 후에는 1X PBS를 이용하여 3회 세척함으로써, 앱타머와 결합하지 않고 표면에 있는 인터루킨-2를 제거하였다. 세척 후에는 인터루킨-2에 대한 1차 항체를 1:2,000의 비율로 희석하여 처리해 하룻 밤 동안 반응시켰다. 이후에는 HRP(Horseradish peroxidase)로 표지된 2차 항체를 1:5,000 비율로 희석 및 처리하여 1시간 동안 배양하였다. 이후 DAB 기질을 처리하여 나타나는 발색반응을 정량적으로 확인함으로써, 상기 선별된 DNA 앱타머가 코팅된 콘텍트렌즈가 인터루킨-2 단백질을 검출할 수 있음을 확인하였다(도 4 참고).

<110> HPBIOLAB INC <120> SMART-LENS FOR EARLY DISEASES DIAGNOSIS BASED ON DNA APTAMER SPECIFICALLY BINDING TO INTERLEUKIN-2 PROTEIN <130> DP-2019-0258-KR <150> KR 10-2018-0111242 <151> 2018-09-18 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> template DNA <400> 1 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa ttnagatagt aagtgcaatc 60 t 61 <210> 2 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for template DNA <400> 2 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa tt 42 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for template DNA <400> 3 agattgcact tactatct 18 <210> 4 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for ssDNA aptamer pool <400> 4 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa tt 42 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for ssDNA aptamer pool <400> 5 agattgcact tactatct 18 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-2-A1 <400> 6 gggcatgtgg acttgcgatt tcggtttggt gtggttgggg 40

Claims

서열번호 6으로 기재되는 염기서열로 구성되고, 인터루킨-2 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머.
제1항에 있어서, 상기 DNA 앱타머는 5' 말단 또는 3' 말단이 변형된, DNA 앱타머.
제1항에 있어서, 상기 DNA 앱타머는 이의 당 잔기의 2'위치, 3'위치 및 4'위치로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 산소 원자가 치환된, DNA 앱타머.
제1항의 DNA 앱타머를 포함하는 인터루킨-2 단백질 검출용 조성물.
제1항의 DNA 앱타머를 포함하는 인터루킨-2 단백질 검출용 키트.
제1항의 DNA 앱타머를 포함하는 인터루킨-2 단백질의 발현 변화와 관련된 질환 진단용 조성물.
제6항에 있어서, 상기 인터루킨-2 단백질의 발현 변화와 관련된 질환은 알츠하이머병, 류마티스 관절염 또는 암인, 인터루킨-2 단백질의 발현 변화와 관련된 질환 진단용 조성물.
제1항의 DNA 앱타머를 포함하는 인터루킨-2 단백질의 발현 변화와 관련된 질환 진단용 키트.
제1항의 DNA 앱타머가 고정화된 기판을 갖는 인터루킨-2 단백질 검출용 마이크로어레이.
제1항의 DNA 앱타머가 고정화된 기판을 갖는 인터루킨-2 단백질의 발현 변화와 관련된 질환 진단용 마이크로어레이.
제1항의 DNA 앱타머를 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 인터루킨-2 단백질 검출 방법.
제1항의 DNA 앱타머를 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 인터루킨-2 단백질의 발현 변화와 관련된 질환 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
제1항의 DNA 앱타머가 코팅된 인터루킨-2 단백질 검출용 콘텍트 렌즈.
제1항의 DNA 앱타머가 코팅된 인터루킨-2 단백질의 발현 변화와 관련된 질환 진단용 콘텍트 렌즈.