WO2020130624A1 - 치쿤군야 바이러스 e2에 특이적으로 결합하는 dna 압타머 및 이의 용도 - Google Patents

치쿤군야 바이러스 e2에 특이적으로 결합하는 dna 압타머 및 이의 용도 Download PDF

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Definitions

  • the present invention is a DNA aptamer specifically binding to Chikungunya virus envelope protein 2 (Chikungunya virus envelope protein 2; CHIKV E2), Chikungunya diagnostic composition comprising the same, Chikungunya diagnostic kit, Chikungunya diagnostic biosensor, and Chikunun It relates to a method of providing information for Gunya diagnosis.
  • Chikungunya virus envelope protein 2 Chikungunya virus envelope protein 2; CHIKV E2
  • Chikungunya diagnostic composition comprising the same, Chikungunya diagnostic kit, Chikungunya diagnostic biosensor, and Chikunun It relates to a method of providing information for Gunya diagnosis.
  • Chikungunya is an infectious disease that is accompanied by fever, muscle and joint pain, headache, fatigue and rash. In some patients, joint pain has not recovered for more than several months, and there have been reports of complications with the eyes, nerves, and heart. There is no specialized treatment method, and symptomatic therapy aimed at alleviating pain is performed. It is estimated that more than 3 million infections occur each year. Egyptian forest mosquitoes and white-line forest mosquitoes are transmitted as vectors.
  • Chikungunya has three structures: glycosylated E1 and E2 embedded in the envelope of the virus, and E3, a non-glycosylated capsid protein. It has protein.
  • E2 and E3 are known to be involved in the formation of the grown virion and the budding process.
  • a single linear epitope is located at the N-terminus of the E2 glycoprotein and shows a strong antigen-antibody reaction.
  • Chikungunya virus E2 is being studied as a major target protein in the development of existing IgM and IgG-based diagnostic methods and recombinant subunit vaccines (Republic of Korea Patent Publication No. 10-1792684).
  • aptamer has a very high affinity for a specific material and is stable, and has been developed a lot in recent years, and its application as a therapeutic and diagnostic sensor using it is actively progressing. Synthesis of aptamers is possible in a relatively simple way, and even cells, proteins, and even small organic substances can be targeted, enabling the development of new detection methods using them, and their specificity and stability are very high compared to antibodies already developed. Therefore, it is possible to develop therapeutic agents, drug delivery systems, and applications as diagnostic biosensors.
  • the present invention has been devised to solve the above problems, and confirms the specific binding capacity of the DNA aptamer prepared in the present invention to Chikungunya virus envelope protein 2 (CHIKV E2) and based on this Thus, the present invention has been completed.
  • CHIKV E2 Chikungunya virus envelope protein 2
  • an object of the present invention is a DNA aptamer specifically binding to Chikungunya virus envelope protein 2 (CIKungunya virus envelope protein 2; CHIKV E2), wherein the DNA aptamer comprises a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 , To provide a DNA aptamer.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing chikungunya or a chikungunya diagnostic kit comprising a DNA aptamer.
  • Chikungunya virus surface protein 2 (Chikungunya virus envelope protein 2; CHIKV E2) specific DNA aptamer; And a biosensor for diagnosis of chikungunya comprising a substrate on which the DNA aptamer is fixed, wherein the DNA aptamer comprises a base sequence of SEQ ID NO: 4 to provide a biosensor for diagnosis of chikungunya.
  • another object of the present invention (a) injecting a subject sample in the biosensor; (B) injecting a detection probe containing a quantum dot (quantum dot) to the biosensor processed the sample of the step (a); (c) injecting an acid into the biosensor injecting the detection probe containing the quantum dots of step (b); (d) obtaining a solution in which the quantum dot and acid of step (c) react; And (e) measuring the current (Ampere; A) of the solution in step (d), provides a method for providing information for diagnosis of chikungunya.
  • the present invention is a DNA aptamer specifically binding to Chikungunya virus envelope protein 2 (Chikungunya virus envelope protein 2; CHIKV E2), the DNA aptamer of SEQ ID NO: 4 It provides a DNA aptamer, characterized in that consisting of a base sequence.
  • the chikungunya virus E2 may be a domain protein included on the surface of the chikungunya virus antigen.
  • the present invention provides a composition for diagnosing chikungunya, comprising the DNA aptamer.
  • the present invention provides a chikungunya diagnostic kit comprising the DNA aptamer.
  • the present invention Chikungunya virus surface protein 2 (Chikungunya virus envelope protein 2; CHIKV E2) specific DNA aptamer; And a biosensor for chikungunya diagnosis comprising a substrate on which the DNA aptamer is fixed, wherein the DNA aptamer comprises a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the substrate may include a metal electrode layer and a metal nanoparticle layer, and the metal may be gold (Au).
  • the DNA aptamer may be one that is hybridized with a fixed sequence and is fixed to the substrate by double strands.
  • the present invention comprises the steps of (a) injecting a subject sample into the biosensor; (B) injecting a detection probe containing a quantum dot (quantum dot) to the biosensor processed the sample of the step (a); (c) injecting an acid into the biosensor injecting the detection probe containing the quantum dots of step (b); (d) obtaining a solution in which the quantum dot and acid of step (c) react; And (e) measuring the current (Ampere; A) of the solution in step (d), provides a method for providing information for diagnosis of chikungunya.
  • the quantum dot may be cadmium sulfide (CdS).
  • the present invention provides a diagnostic method of chikungunya comprising administering to a subject a DNA aptamer that specifically binds to CHIKV E2.
  • the present invention provides a diagnostic application for chikungunya of DNA aptamer that specifically binds to CHIKV E2.
  • the present inventors have conducted extensive research to develop a novel biomarker for diagnosis of Chikungunya, and as a result, DNA aptamer having specific binding ability to Chikungunya virus envelope protein 2 (CHIKV E2) It was confirmed that (DNA Aptamer) has a strong binding ability with CHIKV E2 and excellent specificity, and thus it is possible to expect superior stability than the ELISA method using an existing antibody, and thus, a composition for diagnosis of chikungunya, biosensor for diagnosis of chikungunya, diagnosis of chikungunya It is expected to be useful in the development of information provision methods.
  • CHIKV E2 Chikungunya virus envelope protein 2
  • Figure 1 is a graph showing the results of confirming the binding degree (%) of ssDNA (single strand DNA) and CHIKV E2, and screening.
  • Figure 2 shows the results of confirming the Kd value for the CV2 aptamer sequence through fluorescence measurement.
  • FIG. 3 is a schematic schematic diagram of a biosensor for detecting CHIKV E2 using a DNA aptamer.
  • 4A is a graph confirming the results of CHIKV E2 detection using a CV2 aptamer when the concentration of CHIKV E2 is different.
  • 4B is a graph confirming that when the concentration value of CHIKV E2 converted to Log is the x-axis, the detection result of CHIKV E2 using the CV2 aptamer appears quantitatively.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of the change in the relative current value according to each protein and reaction in the binding specificity experiment for CHIKV E2.
  • the present inventors have conducted extensive research to develop a novel biomarker for diagnosis of Chikungunya, and as a result, DNA aptamer having specific binding ability to Chikungunya virus envelope protein 2 (CHIKV E2) It was confirmed that (DNA Aptamer) had strong binding ability with CHIKV E2 and excellent specificity, and the present invention was completed.
  • CHIKV E2 Chikungunya virus envelope protein 2
  • the present invention provides a DNA aptamer that specifically binds to CHIKV E2.
  • Chikungunya virus envelope protein 2 (Chikungunya virus envelope protein 2; CHIKV E2)
  • CHIKV E2 is a glycosylated (glycosylated) E2 embedded in the envelope of the virus (glycosylated), glycosylated E1 and non-glycosylated capsid protein, one of the three structural proteins of E3.
  • E2 and E3 are known to be involved in the formation of the grown virion and the budding process.
  • a single linear epitope is located at the N-terminus of the E2 glycoprotein and shows a strong antigen-antibody reaction.
  • CHIKV E2 corresponds to a major target protein in the development of existing IgM and IgG-based diagnostic methods and recombinant subunit vaccines, and thus can effectively diagnose Chikungunya through detection of CHIKV E2, and the CHIKV E2 is Chikun Gunya virus may be a domain protein included on the surface of an antigen, but is not limited thereto.
  • aptamer is a single-stranded DNA (ssDNA) or RNA having high specificity and affinity for a specific substance.
  • ssDNA single-stranded DNA
  • RNA RNA having high specificity and affinity for a specific substance.
  • Conventional methods using antibodies are relatively time-consuming and expensive because they are made using the immune system of a living body, and their stability may be problematic because they are proteins, whereas aptamers are relatively synthetic in synthesis. Since it is possible with a simple method and can target cells, proteins, and even small organic substances, it is possible to develop new detection methods using it, and given its specificity and stability, it is very high compared to the antibody already developed.
  • DNA aptamers were used for specific detection of E2. Any DNA (ssDNA) or RNA capable of specific detection of CHIKV E2 may correspond to the aptamer of the present invention, and may preferably consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a composition for diagnosing chikungunya, comprising the DNA aptamer.
  • composition of the present invention may further include a pharmacologically or physiologically acceptable carrier, excipient, and diluent in addition to the DNA aptamer.
  • a pharmacologically or physiologically acceptable carrier such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, external preparations, suppositories, and sterile injection solutions according to a conventional method.
  • Carriers, excipients, and diluents that may be included in the composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl Cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxy benzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil.
  • diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, and the like.
  • the present invention provides a chikungunya diagnostic kit comprising the DNA aptamer.
  • the kit includes the aptamer of the present invention that specifically binds to CHIKV E2, and the aptamer can be attached with detection labels widely used in the art, for example, biotin residues. After introducing the labeling material to the biotin-attached aptamer, it can be used for the detection, quantification and diagnosis of CHIKV E2 through its analysis.
  • detection labels widely used in the art, for example, biotin residues.
  • aptamers for CHIKV E2 detection can be labeled with common labeling substances such as other fluorescent substances, magnetic substances, dyes, enzymes, and radioisotopes, and are usually detected by, for example, fluorescence. It can be detected through a microscope, Radioimmnodetection (RAID), or the like.
  • common labeling substances such as other fluorescent substances, magnetic substances, dyes, enzymes, and radioisotopes
  • kit is a variety of tools or reagents that can be used to qualitatively or quantitatively determine whether aptamer and CHIKV E2 in a sample are bound, such as a support (substrate), buffer solution, reaction stopper, solubilizer, detergent or stabilizer. It may further include.
  • the aptamer-fixed substrate may be, for example, a solid substrate, selected from the group consisting of polymers, glass, gold, paper, and biomembrane. More specifically, polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyester, polyacrylonitrile, fluororesin, agarose, cellulose, nitrocellulose, dextran, sephadex, sepharose, liposome, carboxymethyl cellulose, polyacrylamide, Polysterene, companion rock, filter paper, ion exchange resin, plastic film, plastic tube, polyamine-methyl vinyl-ether-maleic acid copolymer, amino acid copolymer, ethylene-maleic acid copolymer, nylon, metal, glass, glass beads, or Magnetic particles and the like can be used.
  • polystyrene polyethylene, polypropylene, polyester, polyacrylonitrile, fluororesin, agarose, cellulose, nitrocellulose, dextran, sephadex, sepharose, liposome, carboxymethyl cellulose, polyacrylamide,
  • Cell culture plates, ELISA plates, tubes, and polymeric membranes may be used as other solid substrates.
  • the substrate may have any possible shape, for example spherical (bead), cylindrical (inside the test tube or well), planar (sheet, test strip), more preferably a multi-well plate (eg, 24 well) , 96 well, 192 well, 384 well, 576 well, etc.).
  • the present invention Chikungunya virus surface protein 2 (Chikungunya virus envelope protein 2; CHIKV E2) specific DNA aptamer; And a substrate on which the DNA aptamer is immobilized.
  • the substrate on which the DNA aptamer is fixed is made of a metal electrode layer and a metal nanoparticle layer of a screen printed electrode (Screen Printed Gold Electrode), and the electrode layer and nanoparticle material can be attracted by an electric field or a magnetic field, and characteristics of the electric field Any material that can change the can be used, preferably made of gold (Au), but is not limited thereto.
  • the DNA aptamer immobilized on the substrate can be immobilized on a substrate by hybridizing with a fixed sequence, and is not limited to any one as long as it is a DNA aptamer that specifically binds CHIKV E2, and preferably the DNA aptamer is CV2 aptamer. May be, but is not limited to.
  • the fixed sequence is hybridized with the CV2 aptamer, can be fixed to the substrate by a thiol-gold reaction, preferably 5'-CAC ATT TCG GAT CCG CTG ACA T-(CH 2 ) 6 -SH-3' It may be a sequence, but is not limited thereto.
  • the sequence and structure of a CV2 aptamer were analyzed and confirmed (see Example 1), and CHIKV E2 and pressure were measured using fluorescence measurement.
  • the binding force between the tamers was measured (see Example 2), and further, based on the experimental results, a DNA aptamer and biosensor having excellent stability and binding ability were prepared (see Example 3), and the biosensor was added to CHIKV E2.
  • the specificity of the cells was excellent, it was confirmed that it can be used as an information provision method for diagnosis of chikungunya (see Example 4).
  • the present invention comprises the steps of (a) injecting a subject sample into the biosensor; (B) injecting a detection probe containing a quantum dot (quantum dot) to the biosensor processed the sample of the step (a); (c) injecting an acid into the biosensor injecting the detection probe containing the quantum dots of step (b); (d) obtaining a solution in which the quantum dot and acid of step (c) react; And (e) measuring the current (Ampere; A) of the solution in step (d), provides a method for providing information for diagnosis of chikungunya.
  • the sample for the diagnosis of chikungunya may be tissue, cells, whole blood, blood, saliva, sputum, cerebrospinal fluid, or urine, but is not limited thereto.
  • the detection probe fills the spot as the CHIKV E2 is combined with the biosensor aptamer and falls away, preferably the detection probe sequence is 5'-GCG GAT CCG AAA TGT GTT GTG GTT GGA GCT GC -(CH 2 ) 6 -NH 2 -3', but is not limited thereto.
  • the quantum dot may be included in the detection probe, and is not limited to any one as long as it can react with the acid, for example, cadmium sulfide (CdS), lead sulfide (PbS), and the like, preferably sulfide Cadmium, but is not limited thereto.
  • CdS cadmium sulfide
  • PbS lead sulfide
  • Cadmium preferably sulfide Cadmium
  • the acid is not limited to any one as long as it can react with the quantum dot, for example, nitric acid, sulfuric acid, hydrochloric acid, and the like, preferably nitric acid, but is not limited thereto.
  • the purified CHIKV E2 was coated with cobalt on the surface and fixed to the bead using Dynabeads (Invitrogen, Norway), a magnetic bead that binds to the His-tag of the protein.
  • a protein binding buffer (20mM Tris, 50mM NaCl, 5mM KCl, 5mM MgCl 2 , pH 8.0) were washed with a binding buffer using an external magnet and reacted at room temperature for one hour. It was fixed to the bead.
  • a specific separation method using magnetism was performed. Specifically, first, for the most stable structure formation of ssDNA, the ssDNA library (500pmole) dissolved in 100 uL of binding buffer was incubated at 90°C for 3 minutes, and then incubated at 4°C for 30 minutes. Thereafter, the mixture was reacted for 1 hour while gently shaking with CHIKV E2 previously immobilized on a magnetic bead. Then, the bead was washed twice with a binding buffer to remove ssDNA that did not bind CHIKV E2 bound to the bead.
  • the protein and the bound ssDNA were eluted using an elution buffer (20mM Tris, 50mM NaCl, 5mM KCl, 5mM MgCl 2 , 0.01% tween 20, 300mM immidazole, pH 8.0) to separate the protein-bound ssDNA from the magnetic bead.
  • the eluted ssDNA was precipitated using ethanol, dissolved in 60 uL of distilled water, and then amplified by PCR using i-pfu polymerase (Intron Bio Technology, Korea) using Forward primer and Biotin-bound Reverse primer.
  • Coupling buffer (5mM Tris-HCl, 0.5mM EDTA, 1M NaCl) with magnetic beads coated with streptavidin that binds biotin-linked PCR products with biotin to generate ssDNA for the next screening process , 0.005% tween 20, pH 7.5) and incubated for 1 hour. After cultivation, in order to separate only ssDNA, 100 ul of 100 mM NaOH and cultured for 10 minutes, and only the selected ssDNA was obtained using an external magnet. In addition, the screening was repeated using the first screened ssDNA for the next screening.
  • CHIKV of the remaining ssDNA was measured by measuring the concentration of ssDNA eluted from repeated screening with a UV spectrometer (UV spectrometer, Biochrom Libra S22 spectromether). The screening process was performed while confirming the degree of binding with E2. The degree of bonding (%) is as shown in FIG. 1.
  • the 13th repeat-selected ssDNA was amplified through PCR using unmodified Forward and Reverse primers, cloned into pENTR/TOPO vector (TOPO TA Cloning kit, Invitrogen, USA), and E.coli TOP10 cells (Invitrogen, USA). After the clone into which the ssDNA was inserted was purified using a miniprep kit (GeneAll, Korea), the base sequence was analyzed (COSMO Genetech, Korea). As a result, it was possible to analyze the sequence shown in Table 1.
  • Aptamer candidate sequence (5' ⁇ CV2 (90 mer) CACCTAATACGACTCACTATAGCGGATCCGAAATGTGTTGTGGTTGGAGCTGCATA AACCCTTTCTTCCCGCTGGCTCGAACAAGCTTGC SEQ ID NO: 5
  • CHIKV E2 After mixing 400pmole of CHIKV E2 with 10uL magnetic beads, the cells were incubated for 1 hour in 100uL of binding buffer (20mM Tris, 50mM NaCl, 5mM KCl, 5mM MgCl 2 , pH 8.0). Washed twice with binding buffer to separate unbound CHIKV E2. Thereafter, the aptamer labeled with various concentrations of 6-FAM was incubated for 1 hour, and the unbound aptamer was removed by washing.
  • binding buffer (20mM Tris, 50mM NaCl, 5mM KCl, 5mM MgCl 2 , pH 8.0). Washed twice with binding buffer to separate unbound CHIKV E2. Thereafter, the aptamer labeled with various concentrations of 6-FAM was incubated for 1 hour, and the unbound aptamer was removed by washing.
  • FIG. 3 is a schematic schematic diagram of a biosensor for detecting CHIKV E2 using the DNA aptamer of the present invention.
  • the CV2 aptamer that specifically reacts to CHIKV E2 binds to the protein and falls off, and thus a fixed sequence corresponding to that remains as a single strand.
  • the detection probe sequence (5'- GCG GAT CCG AAA TGT GTT GTG GTT GGA GCT GC -(CH 2 ) 6 -NH 2 -3') linked to cadmium sulfide quantum dots (CdS) was reacted for 40 minutes and distilled water After washing with 1M nitric acid, the solution reacted for an additional hour with 70 ⁇ L is transferred to 1 mL acetate/bismuth buffer (0.1 M acetate buffer, 400 ⁇ g/L bismuth, pH 4.5) to perform stripping square wave voltammetry analysis.
  • acetate/bismuth buffer 0.1 M acetate buffer, 400 ⁇ g/L bismuth, pH 4.5
  • CHIKV E2 combines with the biosensor surface probe, the more detection probe sequence fills the site, and cadmium sulfide (quantum dots) reacted with nitric acid releases a large amount of cadmium ions into the solution. This can be observed as a peak on the graph of stripping voltammetry technique, which detects metal ions with very high specificity and sensitivity, and it is possible to quantitatively analyze the signal-on method.
  • CHIKV E2 Based on electrochemistry, recombinant CHIKV E2 was detected using the selected CV2 aptamer. As a result, as shown in FIGS. 4A and 4B, it was confirmed that the current value increased as the concentration of CHIKV E2 increased (1 pM-100 ⁇ M) (see FIG. 4A ). A graph was drawn with the current value as the y-axis and the concentration value of CHIKV E2 converted to Log as the x-axis. Thus, it was confirmed that the detection of CHIKV E2 is quantitatively made through the biosensor produced above, and the detection limit is 0.10 pM. (See Fig. 4b).
  • the binding specificity that does not react with other proteins in the blood other than the target CHIKV E2 is important.
  • the binding specificity to various protein samples was confirmed. At this time, the concentration of each protein in PBS was mixed to detect 10 nM.
  • CHIKV E2 As a result, as shown in Fig. 5, it was confirmed that the specificity of CHIKV E2 was excellent.
  • YFV among the control proteins is a surface protein of a tropical infectious virus similar to CHIKV, and although it is generally known to have high cross-reactivity between tropical infectious diseases, it has been confirmed that it does not bind to the DNA aptamer developed in the present invention. .
  • the DNA aptamer of the present invention has high binding specificity and reacts with CHIKV E2. It also had high specificity when compared to the serum protein HSA.
  • the DNA aptamer CV2 developed in the present invention not only has a very high binding characteristic to CHIKV E2, but can also be used as a biosensor in complex biological samples.
  • Sequence list designation order SEQ ID NO: 1 ssDNA library CACCTAATACGACTCACTATAGCGGATCCGA-N40-CTGGCTCGAACAAGCTT GC SEQ ID NO: 2 Forward primer cacctaatac gactcactat agcgga SEQ ID NO: 3 Reverse primer gcaagcttgt tcgagccag SEQ ID NO: 4 CV2 Aptamer GCG GAT CCG AAA TGT GTT GTG GTT GGA GCT GC SEQ ID NO: 5 CV2 CACCTAATACGACTCACTATAGCGGATCCGAAATGTGTTGTGGTTGGAGCTGCATA AACCCTTTCTTCCCGCTGGCTCGAACAAGCTTGC SEQ ID NO: 6 fixed sequence CAC ATT TCG GAT CCG CTG ACA T
  • the DNA aptamer that specifically binds to Chikungunya virus envelope protein 2 (CHIKV E2) of the present invention has strong binding strength and excellent specificity to Chikungunya virus surface protein, and diagnosis using existing antibodies By comparison, the chikungunya virus can be diagnosed with significantly increased accuracy, and thus it is expected to be effectively used in various products for diagnosis, such as diagnostic kits and diagnostic compositions.

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Abstract

본 발명은 치쿤군야 바이러스 표면 단백질 2(Chikungunya virus envelope protein 2; CHIKV E2)에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머, 이를 포함하는 치쿤군야 진단용 조성물, 치쿤군야 진단 키트, 치쿤군야 진단용 바이오센서, 및 치쿤군야 진단을 위한 정보제공 방법에 관한 것으로서, 본 발명자들은 치쿤군야(Chikungunya)의 진단을 위한 신규 바이오 마커를 개발하기 위해 예의 연구한 결과, 치쿤군야 바이러스 표면 단백질 2(Chikungunya virus envelope protein 2; CHIKV E2)에 대하여 특이적인 결합능을 갖는 DNA 압타머(DNA Aptamer)가 CHIKV E2와의 강한 결합력과 우수한 특이성이 있다는 것을 확인하였는 바, 기존의 항체를 이용한 ELISA 방법보다 뛰어난 안정성을 기대할 수 있으므로, 치쿤군야 진단용 조성물, 치쿤군야 진단용 바이오센서, 치쿤군야 진단을 위한 정보제공 방법 등의 개발 시에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

치쿤군야 바이러스 E2에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머 및 이의 용도
본 발명은 치쿤군야 바이러스 표면 단백질 2(Chikungunya virus envelope protein 2; CHIKV E2)에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머, 이를 포함하는 치쿤군야 진단용 조성물, 치쿤군야 진단 키트, 치쿤군야 진단용 바이오센서, 및 치쿤군야 진단을 위한 정보제공 방법에 관한 것이다.
치쿤군야는 발열과 근육 및 관절의 통증, 두통, 피로와 발진 등을 동반하는 감염병이다. 일부 환자에서는 관절통증이 몇 개월 이상 회복되지 않는 경우도 있으며, 눈이나 신경, 심장 계통의 합병증을 동반하는 경우도 보고되었다. 특화된 치료 방법은 없으며 통증을 경감하기 위한 목적의 대증 요법이 시행된다. 매년 300만 건 이상의 감염이 발병하는 것으로 추정된다. 이집트숲 모기와 흰줄숲 모기를 매개체로 전염된다.
한편, 치쿤군야는 바이러스의 표면(envelope)에 내장(embedded)된 글리코실레이트된(glycosylated) E1와 E2, 그리고 비-글리코실레이트된 외피 단백질(non-glycosylated capsid protein)인 E3의 세 가지 구조 단백질을 가지고 있다. 이때, E2와 E3는 성장한 비리온(virion)의 형성과 성장하는(budding) 과정에 관여하는 것으로 알려졌다. E2 당 단백질(glycoprotein)의 N-말단에는 단일 선형 에피톱이 위치하며 강한 항원-항체 반응을 보인다. 이 때문에 치쿤군야 바이러스 E2는 기존의 IgM 및 IgG 기반 진단 방법 및 재조합 서브유닛 백신의 개발에서 주요한 목적 단백질로 연구되고 있다(대한민국 등록특허공보 10-1792684).
현재 치쿤군야와 같은 열대 풍토성 질환은 증상에 기반한 진단, 중합효소 연쇄반응(PCR)을 이용한 감염체 검출, 항원-항체 반응을 이용한 면역진단법 등에 의해 진단되고 있다. 그러나 현존하는 방법들은 의료 시설이 열악한 빈곤 국가에서는 비용 상의 문제로 널리 쓰이지 못하거나, 또는 민감도·선별도 등의 척도에서 적합한 수준에 미달되어 있다. 기존의 진단법이 갖는 한계를 극복하고 빈곤 국가에서 실제로 활용될 수 있는 소외질환 검출 플랫폼을 개발하는 것이 요구된다.
한편, 압타머는 특정물질에 대한 친화도가 매우 높고 안정하기 때문에 최근 많이 개발되고 있고 이를 이용한 치료제 및 진단용 센서로의 응용이 활발히 진행되고 있다. 압타머의 합성은 비교적 단순한 방법으로 가능하고 세포, 단백질 그리고 작은 유기물질까지도 표적물질이 될 수 있기 때문에 이를 이용한 새로운 검출방법들의 개발이 가능하며 그 특이성 및 안정성이 이미 개발되어 있는 항체에 비해 매우 높기 때문에 치료제 개발 및 약물전달 시스템, 진단용 바이오센서로의 응용이 가능하다.
따라서, 소외 질환 검출 플랫폼을 개발하기 위해, 신규 바이오 마커를 이용한 치쿤군야의 진단이 주요한 과제의 대상이 되고 있고, 이에 대한 연구가 이루어지고 있으나, 아직 미비한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명에서 제조된 DNA 압타머의 치쿤군야 바이러스 표면 단백질 2(Chikungunya virus envelope protein 2; CHIKV E2)에 대한 특이적인 결합능을 확인하고 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이에, 본 발명의 목적은 치쿤군야 바이러스 표면 단백질 2(Chikungunya virus envelope protein 2; CHIKV E2)에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머로서, 상기 DNA 압타머는 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, DNA 압타머를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 DNA 압타머를 포함하는, 치쿤군야 진단용 조성물 또는 치쿤군야 진단키트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 치쿤군야 바이러스 표면 단백질 2(Chikungunya virus envelope protein 2; CHIKV E2) 특이적 DNA 압타머; 및 상기 DNA 압타머가 고정되어 있는 기판을 포함하는 치쿤군야 진단용 바이오센서로서, 상기 DNA 압타머는 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 치쿤군야 진단용 바이오센서를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 (a) 상기 바이오센서에 피검체 시료를 주입하는 단계; (b) 상기 (a)단계의 피검체 시료를 처리한 바이오센서에 양자점(quantum dot)이 포함된 검출탐침을 주입하는 단계; (c) 상기 (b)단계의 양자점이 포함된 검출탐침을 주입한 바이오센서에 산을 주입하는 단계; (d) 상기 (c)단계의 양자점과 산이 반응한 용액을 얻는 단계; 및 (e) 상기 (d)단계의 용액의 전류(Ampere; A)를 측정하는 단계를 포함하는, 치쿤군야 진단을 위한 정보제공 방법을 제공한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 치쿤군야 바이러스 표면 단백질 2(Chikungunya virus envelope protein 2; CHIKV E2)에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머로서, 상기 DNA 압타머는 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, DNA 압타머를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예로서, 상기 치쿤군야 바이러스 E2는 치쿤군야 바이러스 항원(antigen)의 표면에 포함되는 도메인 단백질일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 DNA 압타머를 포함하는, 치쿤군야 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 DNA 압타머를 포함하는, 치쿤군야 진단 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 치쿤군야 바이러스 표면 단백질 2(Chikungunya virus envelope protein 2; CHIKV E2) 특이적 DNA 압타머; 및 상기 DNA 압타머가 고정되어 있는 기판을 포함하는 치쿤군야 진단용 바이오센서로서, 상기 DNA 압타머는 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 치쿤군야 진단용 바이오센서를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예로서, 상기 기판은 금속 전극층 및 금속 나노입자층을 포함하는 것일 수 하고, 상기 금속은 금(Au)일 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예로서, 상기 DNA 압타머는 고정서열과 혼성화되어 이중가닥으로 기판에 고정되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 상기 바이오센서에 피검체 시료를 주입하는 단계; (b) 상기 (a)단계의 피검체 시료를 처리한 바이오센서에 양자점(quantum dot)이 포함된 검출탐침을 주입하는 단계; (c) 상기 (b)단계의 양자점이 포함된 검출탐침을 주입한 바이오센서에 산을 주입하는 단계; (d) 상기 (c)단계의 양자점과 산이 반응한 용액을 얻는 단계; 및 (e) 상기 (d)단계의 용액의 전류(Ampere; A)를 측정하는 단계를 포함하는, 치쿤군야 진단을 위한 정보제공 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예로서, 상기 양자점은 황화 카드뮴(CdS)일 수 있다.
또한, 본 발명은 CHIKV E2에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 치쿤군야의 진단방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 CHIKV E2에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머의 치쿤군야 진단용도를 제공한다.
본 발명자들은 치쿤군야(Chikungunya)의 진단을 위한 신규 바이오 마커를 개발하기 위해 예의 연구한 결과, 치쿤군야 바이러스 표면 단백질 2(Chikungunya virus envelope protein 2; CHIKV E2)에 대하여 특이적인 결합능을 갖는 DNA 압타머(DNA Aptamer)가 CHIKV E2와의 강한 결합력과 우수한 특이성이 있다는 것을 확인하였는 바, 기존의 항체를 이용한 ELISA 방법보다 뛰어난 안정성을 기대할 수 있으므로, 치쿤군야 진단용 조성물, 치쿤군야 진단용 바이오센서, 치쿤군야 진단을 위한 정보제공 방법 등의 개발 시에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 ssDNA(single strand DNA)와 CHIKV E2의 결합 정도(%)를 확인하고, 선별 과정을 진행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 CV2 압타머 서열에 대한 Kd 값을 형광측정을 통하여 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 DNA 압타머를 이용한 CHIKV E2 검출용 바이오센서에 대한 개략적인 모식도이다.
도 4a는 CHIKV E2의 농도를 다르게 했을 때, CV2 압타머를 이용한 CHIKV E2 검출 결과를 확인한 그래프이다.
도 4b는 Log로 환산한 CHIKV E2의 농도 값을 x축으로 하는 경우, CV2 압타머를 이용한 CHIKV E2 검출 결과가 정량적으로 나온다는 것을 확인한 그래프이다.
도 5는 CHIKV E2에 대한 결합특이성 실험에서 각 단백질과 반응에 따른 상대적인 전류 값의 변화를 나타낸 결과를 나타낸 그래프이다.
본 발명자들은 치쿤군야(Chikungunya)의 진단을 위한 신규 바이오 마커를 개발하기 위해 예의 연구한 결과, 치쿤군야 바이러스 표면 단백질 2(Chikungunya virus envelope protein 2; CHIKV E2)에 대하여 특이적인 결합능을 갖는 DNA 압타머(DNA Aptamer)가 CHIKV E2와의 강한 결합력과 우수한 특이성이 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 CHIKV E2에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치쿤군야 바이러스 표면 단백질 2(Chikungunya virus envelope protein 2; CHIKV E2)"란, 바이러스의 표면(envelope)에 내장(embedded)된 글리코실레이트된(glycosylated) E2로서, glycosylated E1 및 비-글리코실레이트된 외피 단백질(non-glycosylated capsid protein)인 E3의 세 가지 구조 단백질 중 하나이다. 이때, E2와 E3는 성장한 비리온(virion)의 형성과 성장하는(budding) 과정에 관여하는 것으로 알려졌다. E2 당 단백질(glycoprotein)의 N-말단에는 단일 선형 에피톱이 위치하며 강한 항원-항체 반응을 보인다. 이 때문에, CHIKV E2는 기존의 IgM 및 IgG 기반 진단 방법 및 재조합 서브유닛 백신의 개발에서 주요한 목적 단백질에 해당하는 바, CHIKV E2의 검출을 통해 효과적으로 치쿤군야를 진단할 수 있고, 상기 CHIKV E2는 치쿤군야 바이러스 항원(antigen)의 표면에 포함되는 도메인 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어, "압타머"란 특정 물질에 대해 높은 특이성과 친화도를 가지는 단일가닥 DNA(ssDNA) 또는 RNA이다. 기존에 개발되어 있는 항체를 이용한 방법은 생체의 면역시스템을 이용하여 만들어지기 때문에 비교적 많은 시간이 들고 고비용이라는 점, 단백질이기 때문에 그 안정성이 문제가 되는 경우가 있는 반면, 압타머는 합성에 있어서, 비교적 단순한 방법으로 가능하고 세포, 단백질 그리고 작은 유기물질까지도 표적물질이 될 수 있기 때문에 이를 이용한 새로운 검출방법들의 개발이 가능하며 그 특이성 및 안정성이 이미 개발되어 있는 항체에 비해 매우 높은 점에 착안하여, CHIKV E2의 특이적 검출을 위하여 DNA 압타머를 사용하였다. CHIKV E2의 특이적 검출이 가능한 DNA(ssDNA) 또는 RNA라면 모두 본 발명의 압타머에 해당할 수 있고, 바람직하게는 서열번호 4의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 DNA 압타머를 포함하는, 치쿤군야 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 상기 DNA 압타머 외에 약리학적으로나 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제, 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제, 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
또한, 본 발명은 상기 DNA 압타머를 포함하는, 치쿤군야 진단 키트를 제공한다.
상기 키트는 CHIKV E2에 특이적으로 결합하는 본 발명의 압타머를 포함하고 있으며, 압타머에는 당업계에 널리 사용되는 검출 표지들, 예를 들어 바이오틴 잔기가 부착될 수 있다. 바이오틴이 부착된 압타머에 표지물질을 도입한 다음, 이의 분석을 통해 CHIKV E2의 검출, 정량 및 진단에 이용할 수 있다. 바이오틴에 사용되는 표지물질로서 다양한 공지된 분석용 표지물질이 사용될 수 있으며, 예를 들면, 스트렙타비딘, 아비딘, Cy3, Cy5, Alexa, BODIPY, Rhodamine 또는 Q-dot 등을 사용하여 형광분석을 할 수 있다. 또한, CHIKV E2 검출을 위한 압타머에는 바이오틴 잔기 외에도, 기타 형광물질, 자성체, 염색물질, 효소, 방사성동위원소 등과 같은 통상의 표지 물질로 표지할 수 있으며, 통상의 검출 수단, 예를 들어, 형광 현미경, Radioimmnodetection(RAID) 등을 통하여 검출할 수 있다.
또한, 상기 키트는 압타머와 시료 내 CHIKV E2의 결합 여부를 정성 또는 정량적으로 측정하는데 사용할 수 있는 각종 도구 또는 시약으로서, 지지체(기재), 완충용액, 반응 정지제, 용해제, 세척제 또는 안정화제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 압타머가 고정된 기재는, 예컨대 고체 기재로서 고분자, 유리, 금, 종이 및 생체막(membrane)으로 이루어진 군에서 선택된 것을 사용할 수 있다. 보다 구체적으로는, 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카복시메틸 셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 금속, 유리, 글래스 비드, 또는 자성 입자 등을 사용할 수 있다. 그 외의 다른 고체 기질로는 세포배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머성 막 등을 사용할 수 있다. 상기 기재는 임의의 가능한 형태, 예를 들어 구형(비드), 원통형(시험관 또는 웰 내면), 평면형(시트, 시험 스트립)을 가질 수 있으며, 보다 바람직하게는 멀티 웰 플레이트(예를 들어, 24웰, 96웰, 192웰, 384웰, 576웰 등)를 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 치쿤군야 바이러스 표면 단백질 2(Chikungunya virus envelope protein 2; CHIKV E2) 특이적 DNA 압타머; 및 상기 DNA 압타머가 고정되어 있는 기판을 포함하는 치쿤군야 진단용 바이오센서를 제공한다.
상기 DNA 압타머가 고정되어 있는 기판은 표면 인쇄 전극칩(Screen Printed Gold Electrode)의 금속 전극층 및 금속 나노입자층으로 이루어지며, 상기 전극층 및 나노입자 재질은 전기장 또는 자기장에 의해 유인될 수 있고, 전기장의 특성을 변화시킬 수 있는 어떠한 재질도 사용할 수 있으며, 바람직하게는 금(Au)로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 기판에 고정된 DNA 압타머는 고정서열과 혼성화되어 이중가닥으로 기판에 고정될 수 있으며, CHIKV E2에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머라면 어느 하나에 제한되지 않으며, 바람직하게는 DNA 압타머는 CV2 압타머일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 고정서열은 CV2 압타머와 혼성화되어, thiol-gold 반응에 의하여 기판에 고정될 수 있고, 바람직하게는 5'-CAC ATT TCG GAT CCG CTG ACA T-(CH 2) 6-SH-3' 서열일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는 SELEX를 이용하여 CHIKV E2에 대한 압타머를 탐색한 결과, CV2 압타머의 서열 및 구조를 분석 및 확인하였고(실시예 1 참조), 형광 측정을 이용하여 CHIKV E2와 압타머 간의 결합력을 측정하였으며(실시예 2 참조), 또한, 상기 실험 결과에 기초하여, 안정성 및 결합능이 우수한 DNA 압타머 및 바이오 센서를 제조하였으며(실시예 3 참조), 상기 바이오 센서가 CHIKV E2에 대한 특이성이 우수하다는 것을 확인 하였는 바, 치쿤군야 진단을 위한 정보제공 방법으로 이용될 수 있음을 확인하였다(실시예 4 참조).
이에, 본 발명은 (a) 상기 바이오센서에 피검체 시료를 주입하는 단계; (b) 상기 (a)단계의 피검체 시료를 처리한 바이오센서에 양자점(quantum dot)이 포함된 검출탐침을 주입하는 단계; (c) 상기 (b)단계의 양자점이 포함된 검출탐침을 주입한 바이오센서에 산을 주입하는 단계; (d) 상기 (c)단계의 양자점과 산이 반응한 용액을 얻는 단계; 및 (e) 상기 (d)단계의 용액의 전류(Ampere; A)를 측정하는 단계를 포함하는, 치쿤군야 진단을 위한 정보제공 방법을 제공한다.
상기 치쿤군야 진단을 위한 피검체 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈액, 타액, 객담, 뇌척수액, 또는 뇨 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 검출탐침은 CHIKV E2이 바이오센서 압타머와 결합하여 떨어져 나갈수록 그 자리를 더 많은 검출탐침이 채우며, 바람직하게는 검출탐침 서열은 5'-GCG GAT CCG AAA TGT GTT GTG GTT GGA GCT GC-(CH 2) 6-NH 2-3'이나 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 양자점은 검출탐침에 포함될 수 있고, 상기 산과 반응 할 수 있다면 어느 하나에 제한되지 않으며, 예를 들어, 황화 카드뮴(CdS), 황화 납(PbS) 등이 있을 수 있고, 바람직하게는 황화 카드뮴이나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 산은 상기 양자점(quantum dot)과 반응할 수 있다면 어느 하나에 제한되지 않으며, 예를 들어, 질산, 황산, 염산 등이 있으며, 바람직하게는 질산일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. SELEX을 이용한 CHIKV E2 단백질에 대한 압타머 탐색
1-1. ssDNA(single strand DNA)라이브러리의 제조
양 말단에 PCR 증폭 및 클로닝을 위한 프라이머의 결합서열을 갖고 가운데 40개의 무작위 DNA염기서열을 포함하는 90개의 서열을 가지는 합성된 라이브러리(5'-CACCTAATACGACTCACTATAGCGGATCCGA-N40-CTGGCTCGAACAAGCTTGC-3'; 서열번호 1)를 설계하였다. 또한, PCR 증폭 및 ssDNA 생성을 위하여 Forward 프라이머(5'-CACCTAATACGACTCACTATAGCGGA-3'; 서열번호 2)와 Reverse 프라이머(5'-GCAAGCTTGTTCGAGCCAG-3'; 서열번호 3) 및 비오틴이 결합된 Reverse 프라이머(5'-Biotin-GCAAGCTTGTTCGAGCCAG-3')을 사용하였다. 여기서 사용된 모든 올리고 뉴클레어티드는 바이오닉스 사(한국)에서 합성 및 PAGE 정제하였다.
1-2. CHIKV E2의 Ni-NTA 자성 비드에 고정화
정제된 CHIKV E2는 표면에 코발트로 코팅되어 있어 단백질의 His-tag과 결합하는 자성 비드 (magnetic bead)인 Dynabeads (Invitrogen, 노르웨이)를 이용하여 bead에 고정하였다.
구체적으로 단백질 결합 버퍼 (20mM Tris, 50mM NaCl, 5mM KCl, 5mM MgCl 2, pH 8.0) 100uL에 녹아 있는 단백질 1000pmole과 15ul의 bead를 외부 자석을 이용하여 결합버퍼로 세척 후, 한 시간 동안 실온에서 반응하여 bead에 고정하였다.
1-3. CHIKV E2에 특이적인 압타머 선별
CHIKV E2에 특이적인 압타머를 선별하기 위해 자성을 이용한 특이적 분리 방법을 수행하였다. 구체적으로, 먼저 ssDNA의 가장 안정한 구조형성을 위해, 100uL의 결합 버퍼에 녹아 있는 ssDNA 라이브러리(500pmole)를 90℃에서 3분 동안 배양 후, 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 그 후, 앞서 magnetic bead에 고정화된 CHIKV E2와 함께 약하게 흔들어주면서 1시간 동안 반응하였다. 그 다음, bead에 결합된 CHIKV E2와 결합하지 않는 ssDNA를 제거하기 위해 결합 버퍼로 bead를 두 번 세척하였다. 그 후, magnetic bead에서 단백질과 결합한 ssDNA를 분리하기 위해 용출버퍼(20mM Tris, 50mM NaCl, 5mM KCl, 5mM MgCl 2, 0.01% tween 20, 300mM immidazole, pH 8.0)를 이용해 단백질 및 결합 ssDNA를 용출하였다. 용출된 ssDNA는 에탄올을 이용해 침전시킨 후, 60uL의 증류수에 용해한 다음 Forward 프라이머 및 비오틴이 결합된 Reverse 프라이머를 이용하여 i-pfu polymerase(인트론 바이오 테크놀로지, 한국)를 이용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 다음 선별 과정을 위한 ssDNA를 생성하기 위해, 비오틴이 결합된 PCR 산물을 비오틴과 결합하는 스트렙타아비딘(streptavidin)이 코팅된 자성 비드와 함께 커플링 버퍼(5mM Tris-HCl, 0.5mM EDTA, 1M NaCl, 0.005% tween 20, pH 7.5) 조건에서 1시간 배양하였다. 배양 후 ssDNA만을 분리하기 위해 100ul의 100mM NaOH와 10분 동안 배양하였고, 외부 자석을 이용해 선별된 ssDNA만을 얻을 수 있었다. 또한, 첫 번째 선별된 ssDNA를 다음 선별에 사용하여 선별을 반복하였다. 이때 ssDNA의 양 및 CHIKV E2의 농도는 엄격한 선별을 위해 보다 감소시키면서 진행하였으며, 반복되는 선별에서 용출된 ssDNA를 UV 분광광도계(UV spectrometer, Biochrom Libra S22 spectromether)로 농도를 측정하여 남아 있는 ssDNA의 CHIKV E2와의 결합 정도를 확인하며 선별 과정을 진행하였다. 상기 결합 정도(%)는 도 1에 나타난 바와 같다.
1-4. 압타머 서열분석 및 구조분석
13번째의 반복 선별된 ssDNA는 변형되지 않은 Forward 프라이머와 Reverse 프라이머를 이용하여 PCR 과정을 통해 증폭하였고, pENTR/TOPO 벡터(TOPO TA Cloning kit, Invitrogen, 미국)에 클로닝한 후, E.coli TOP10 세포(Invitrogen, 미국)에 형질전환하였다. ssDNA가 삽입된 클론을 miniprep 키트(GeneAll, 한국)를 이용하여 정제한 후, 염기서열을 분석(COSMO Genetech, 한국)하였다. 그 결과, 하기 표 1과 같은 서열을 분석할 수 있었다.
Aptamer candidate sequence (5'→
CV2 (90 mer) CACCTAATACGACTCACTATAGCGGATCCGAAATGTGTTGTGGTTGGAGCTGCATA AACCCTTTCTTCCCGCTGGCTCGAACAAGCTTGC 서열번호 5
실시예 2. 형광 측정을 이용한 단백질과 압타머 간의 결합력 측정
400pmole의 CHIKV E2를 10uL 자성 비드(megnetic bead)와 혼합한 후, 100uL의 결합 버퍼(20mM Tris, 50mM NaCl, 5mM KCl, 5mM MgCl 2, pH 8.0)에서 1시간 동안 배양하였다. 결합하지 않은 CHIKV E2를 분리하기 위해 결합 버퍼로 2번 세척하였다. 그 후 다양한 농도의 6-FAM으로 표지된 압타머와 1시간 동안 배양하고, 결합하지 않은 압타머는 세척을 통해 제거하였다. CHIKV E2가 고정된 자성 비드에 결합된 6-FAM이 표지된 ssDNA 압타머의 양은 자석을 이용하여 CHIKV E2에 결합된 6-FAM가 표지된 ssDNA만을 분리하여 형광측정(1420 Victor multilabel counter, PerkinElmer, USA)을 통해 측정하였다. 그 결과, 도 2 및 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, CV2 염기서열이 갖는 DNA 압타머의 kd 값을 측정 할 수 있었다.
압타머 Kd (nM)
CV2 19.3 ± 7.3 nM
실시예 3. 검출 조건 최적화 및 바이오센서 제작
상기 실시예 1에서 발굴한 DNA 압타머를 가지고 CHIKV E2를 검출하기 위하여, 스트립핑 전압전류법(Stripping Voltammetry) 기술을 이용하여 검출 감도가 뛰어난 바이오센서를 설계하였다. 도 3는 본 발명의 DNA 압타머를 이용한 CHIKV E2 검출용 바이오센서에 대한 개략적인 모식도이다.
5'-GCG GAT CCG AAA TGT GTT GTG GTT GGA GCT GC-3'
먼저, SPGE (Screen Printed Gold Electrode) 칩의 금 전극에 금 나노입자를 흡착시킨 후 고정 서열(5'-CAC ATT TCG GAT CCG CTG ACA T -(CH 2) 6-SH-3'), CV2 압타머(5'- GCG GAT CCG AAA TGT GTT GTG GTT GGA GCT GC-3'; 서열번호 4)이 혼성화된 이중 가닥을 thiol-gold 반응에 의하여 금 표면에 고정한다. 그 후에 검출하고자 하는 CHIKV E2를 넣고 40분간 반응한 다음 증류수로 씻어내면, CHIKV E2에 특이적으로 반응하는 CV2 압타머가 단백질과 결합하여 떨어져 나가고 그만큼에 상응하는 고정 서열이 단일 가닥으로 남는다. 마지막으로 황화 카드뮴 양자점(quantum dot, CdS)에 연결된 검출 탐침서열 (5'- GCG GAT CCG AAA TGT GTT GTG GTT GGA GCT GC -(CH 2) 6-NH 2-3')을 40분간 반응하고 증류수로 씻어낸 다음, 1M 질산 70μL로 한시간 추가로 반응한 용액을 1mL 아세테이트/비스무트 버퍼 (0.1 M acetate buffer, 400μg/L bismuth, pH 4.5)로 옮겨 stripping square wave voltammetry 분석을 시행한다.
더 많은 CHIKV E2이 바이오센서 표면 탐침과 결합하여 떨어져 나갈수록 그 자리를 더 많은 검출 탐침서열이 채우며, 질산과 반응한 황화 카드뮴(양자점)이 다량의 카드뮴 이온을 용액 중으로 방출한다. 이를 금속 이온을 매우 높은 특이성과 민감성으로 탐지하는 stripping voltammetry 기법 그래프 상의 피크로 관찰할 수 있고 이로 인한 signal-on 방식의 정량분석이 가능하다.
전기화학을 기반으로, 선택된 CV2 압타머를 이용하여 재조합된 CHIKV E2를 검출하였다. 그 결과, 도 4a 및 도 4b에 나타낸 바와 같이, CHIKV E2의 농도가 높아질수록(1pM - 100μM) 전류 값이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 4a 참조). 전류 값을 y축으로, Log로 환산한 CHIKV E2의 농도 값을 x축으로 둔 그래프를 도출하였으며 이에 상기 제작된 바이오센서를 통하여 CHIKV E2의 검출이 정량적으로 이루어지며, 검출한계는 0.10pM임을 확인하였다(도 4b 참조).
실시예 4. CHIKV E2 검출 압타머의 결합특이성 확인
DNA 압타머가 바이오센서로 사용되기 위해서는, 표적 CHIKV E2 외에 혈액 안의 다른 여러 단백질과 반응을 하지 않는 결합특이성이 중요한바, DNA 압타머가 선택적으로 결합하는지 여부를 확인하기 위하여, 여러 단백질 시료에 대하여 결합특이성을 확인하였다. 이 때 PBS에 각 단백질의 농도가 10nM이 되도록 혼합하여 검출하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, CHIKV E2에 대해 특이성이 뛰어난 것을 확인하였다. 특히, 대조된 단백질 중 YFV는 CHIKV와 유사한 열대 감염성 바이러스의 표면 단백질로, 일반적으로 열대 감염병 사이에 높은 교차 반응성을 가지는 것으로 알려져 있음에도 불구하고 본 발명에서 개발된 DNA 압타머와 결합하지 않는 것으로 확인되었다. 이는 본 발명의 DNA 압타머가 높은 결합특이성을 가지고 CHIKV E2와 반응한다는 것을 의미한다. 또한 혈청 단백질인 HSA과 비교했을 때도 높은 특이성을 가졌다.
상기로부터, 본 발명에서 개발된 DNA 압타머 CV2가 CHIKV E2에 매우 높은 결합특이성을 가지고 있을 뿐 아니라, 복잡한 생물학적 시료에서도 바이오센서로 사용될 수 있음을 의미한다.
참고로, 본 발명의 서열목록 리스트는 하기 표 3과 같다.
서열목록 명칭 서열
서열번호 1 ssDNA library CACCTAATACGACTCACTATAGCGGATCCGA-N40-CTGGCTCGAACAAGCTT GC
서열번호 2 Forward primer cacctaatac gactcactat agcgga
서열번호 3 Reverse primer gcaagcttgt tcgagccag
서열번호 4 CV2 Aptamer GCG GAT CCG AAA TGT GTT GTG GTT GGA GCT GC
서열번호 5 CV2 CACCTAATACGACTCACTATAGCGGATCCGAAATGTGTTGTGGTTGGAGCTGCATA AACCCTTTCTTCCCGCTGGCTCGAACAAGCTTGC
서열번호 6 fixed sequence CAC ATT TCG GAT CCG CTG ACA T
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다름 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 아닌 것으로 이해해야 한다.
본 발명의 치쿤군야 바이러스 표면 단백질 2(Chikungunya virus envelope protein 2; CHIKV E2)에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머는 치쿤군야 바이러스 표면 단백질에 강한 결합력과 우수한 특이성을 가지고 있어, 기존의 항체를 이용한 진단과 비교하여 현저히 증가된 정확성을 가지고 치쿤군야 바이러스를 진단할 수 있으므로, 진단 키트, 진단용 조성물 등 진단을 위한 다양한 제품에 효율적으로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (9)

  1. 치쿤군야 바이러스 E2 (Chikungunya virus envelope protein 2; CHIKV E2)에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머로서,
    상기 DNA 압타머는 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, DNA 압타머.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 치쿤군야 바이러스 E2는 치쿤군야 바이러스 항원(antigen)의 표면에 포함되는 도메인 단백질인 것을 특징으로 하는, DNA 압타머.
  3. 제1항의 DNA 압타머를 포함하는, 치쿤군야 진단용 조성물.
  4. 제1항의 DNA 압타머를 포함하는, 치쿤군야 진단 키트.
  5. 치쿤군야 바이러스 표면 단백질 2(Chikungunya virus envelope protein 2; CHIKV E2) 특이적 DNA 압타머; 및 상기 DNA 압타머가 고정되어 있는 기판을 포함하는 치쿤군야 진단용 바이오센서로서,
    상기 DNA 압타머는 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 치쿤군야 진단용 바이오센서.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 기판은 금속 전극층 및 금속 나노입자층을 포함하고, 상기 금속은 금(Au)인 것을 특징으로 하는 치쿤군야 진단용 바이오센서.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 DNA 압타머는 고정서열과 혼성화되어 이중가닥으로 기판에 고정되는 것을 특징으로 하는, 치쿤군야 진단용 바이오센서.
  8. 하기 단계를 포함하는, 치쿤군야 진단을 위한 정보제공 방법.
    (a) 제5항의 바이오센서에 피검체 시료를 주입하는 단계;
    (b) 상기 (a)단계의 피검체 시료를 처리한 바이오센서에 양자점(quantum dot)이 포함된 검출탐침을 주입하는 단계;
    (c) 상기 (b)단계의 양자점이 포함된 검출탐침을 주입한 바이오센서에 산을 주입하는 단계;
    (d) 상기 (c)단계의 양자점과 산이 반응한 용액을 얻는 단계; 및
    (e) 상기 (d)단계의 용액의 전류(Ampere; A)를 측정하는 단계.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 양자점은 황화 카드뮴(CdS)인 것을 특징으로 하는, 치쿤군야 진단을 위한 정보제공 방법.
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