CN113252892B - 一种用于提高病原微生物抗原检测灵敏度的探针及试剂盒 - Google Patents

一种用于提高病原微生物抗原检测灵敏度的探针及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于提高病原微生物抗原检测灵敏度的探针及含有该探针的试剂盒。该探针为含有荧光标记的带限制性内切酶位点的双链DNA，该双链DNA由Cy5‑B‑CM‑S和NH2‑B‑CM‑AS组成；所述Cy5‑B‑CM‑S如SEQ ID No.1所示，所述NH2‑B‑CM‑AS如SEQ ID No.2所示。利用本探针与待测抗原的检测抗体结合，可以极大的降低检测背景，提高病原微生物抗原检测灵敏度，对于病原微生物抗原的单分子诊断试剂的研发奠定了基础。同时本探针限制性内切酶设计可以实现对抗原的快速检测。

Description

一种用于提高病原微生物抗原检测灵敏度的探针及试剂盒
技术领域
本发明涉及一种探针，具体地说是一种用于提高病原微生物抗原检测灵敏度的探针及含有该探针的试剂盒。
背景技术
病原微生物抗原诊断在过去30年发生了显著改变，由早期的ELISA 半定量到化学发光定量，准确性大大提高，同时敏感性也由每升微克级，上升到纳克级。传统ELISA常规线性范围在10pg/ml～1000pg/ml，对于一个生物学实验，往往要兼顾正常对照组与疾病组的样本，样本中的待测蛋白浓度分布一般从零点几个pg到几千pg不等，所以一个ELISA试剂盒的线性范围不能同时兼顾高低丰度蛋白的检测，需要非常多的预实验进行稀释度摸索，费时费力。无论是ELISA酶联免疫法还是化学发光法，样本体积都在100µl左右，对于稀少样本来说，检测所需体积太大，并且敏感度低，还不足以检测到微量微生物的感染。例如，在HBV和HIV等长期用药控制病毒的患者，他们的病毒载量和复制相关抗原已呈检测线以下，然而停止用药会出现病毒反弹，因此急需一种更超敏的诊断技术来把检测线以下的假阴性患者进一步加以发现。
目前，新型冠状病毒正在对人们的健康和生命构成了极大威胁，新型冠状病毒主要通过近距离飞沫传播、接触患者的分泌物及密切接触传播，是一种新出现的病毒，人群不具有免疫力，普遍易感，具有高传染性、高致病性，严重威胁人们的生命安全。被新型冠状病毒感染的患者，感染初期无症状发生且潜伏期长，由于早期病毒载量过低，核酸检测结果假阴性情况时有发生，检出率较低，为控制病毒传播以及患者的早期诊治制造了难题。
如何提高检测灵敏度，在单分子免疫检测过程中实现超敏检测，仍然是本领域技术人员研究的热点。
发明内容
为了解决背景技术中所提及的微量微生物感染难以检测的问题，本发明首先提供一种用于提高病原微生物抗原检测灵敏度的探针。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供一种连接有上述探针的检测抗体，所述检测抗体用于检测待测抗原。
本发明所要解决的又一技术问题在于提供一种可检测微量微生物感染的单分子诊断试剂盒。
为了实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
一种用于提高病原微生物抗原检测灵敏度的探针，其中，所述探针为含有荧光标记的带限制性内切酶位点的双链DNA，所述双链DNA由Cy5-B-CM-S和NH2-B-CM-AS组成；所述Cy5-B-CM-S如SEQ ID No.1所示，所述NH2-B-CM-AS如SEQ ID No.2所示。
一种检测病原微生物抗原的检测抗体，其中，所述检测抗体用于检测病原微生物抗原，所述检测抗体连接有上述探针。
其中较优地，所述探针中NH2-B-CM-AS用于连接检测抗体，所述Cy5-B-CM-S用于免疫荧光检测。
一种用于检测病原微生物抗原的检测试剂盒，所述试剂盒包含上述的检测抗体。
其中较优地，还包括用于检测待测抗原的生物素偶联的包被抗体及链霉亲和素磁珠。
一种利用上述探针提高病原微生物抗原检测灵敏度的方法，其中，将上述探针的NH2-B-CM-AS连接至检测抗体形成DNA-检测抗体复合物，将生物素偶联的包被抗体和链霉亲和素磁珠反应形成包被抗体磁珠复合物，将所述包被抗体磁珠复合物与待测样本进行孵育，再加入所述DNA-检测抗体复合物进行孵育反应形成抗体-抗原-抗体复合物，随后对所述抗体-抗原-抗体复合物进行酶切，将酶切产物进行荧光信号检测。
本发明是针对现有技术中无法对微量微生物感染有效检测而研发的。本发明可以实现对微量微生物抗原感染快速且超敏的检测，检测灵敏度可达0.1pg/ml。它实现快速超敏检测的原理是：首先提出一种带内切酶位点的双链DNA探针，其中一条链的5撇端带有活性氨基基团用于连接到检测抗体上，另一条链的5撇端连有Cy5荧光基团，用于单分子荧光检测。限制性内切酶位点的存在可在抗原抗体反应结束后，5分钟内就能把荧光标记寡核酸从抗原抗体复合物上切割下来，从而实现快速诊断。由于酶切反应的特异性，可极大地降低检测背景,使检测灵敏度大幅提升，从而实现微生物抗原诊断的超敏感性。基于上述快速超敏检测原理可知，该探针连接于检测抗体上，而对检测抗体本身无任何影响，也不会影响抗原和抗体的结合，因此该探针对待测抗原、检测抗体和包被抗体没有任何限制，可应用于单分子诊断适用的所有抗原检测，对待测抗原检测均可以实现本发明的超敏检测效果，待测抗原例如：HIV、HBV、COVID-19（新型冠状病毒）等。
本发明的有益效果：经实验证实，利用本发明所提供的探针与待测抗原的检测抗体结合，可以极大的降低检测背景，提高病原微生物抗原检测灵敏度，检测灵敏度可达0.09pg/ml，可以检测到极低丰度抗原。对于病原微生物抗原的单分子诊断试剂的研发奠定了基础。
附图说明
图1为不同浓度的荧光标记寡核苷酸的荧光检测结果；
图2为在线性区内2倍稀释荧光标记寡核苷酸的荧光检测结果；
图3为应用抗原超敏诊断技术检测不同浓度AFP阳性样品的结果。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细说明，需要理解的是，下述实施例作为解释和说明，不以任何形式限制本发明的范围。
本发明实施例所用样本、试剂及仪器耗材来源如下：
1．生物材料
本实施例所用组织样本均来自首都医科大学附属北京佑安医院。
试验试剂
ChromaLink Biotin One-Shot Antibody-Labeling Kit(TriLinkBioTechnologies, B-9007-009K, SanDiego,USA)；
Antibody-Oligonucleotide All-In-One Conjugation Kit（TriLinkBioTechnologies, A-9202-001, SanDiego, USA)；
Dynabeads™ MyOne™Streptavidin T1(Thermo Fisher Scientific, 65601,Massachusetts, USA)；
1 × PBS Buffer(Thermo Fisher Scientific, C10010500CP, Massachusetts,USA)；
2AFP-27(Fapon Biotech Inc, 2AFP-27, Shenzhen, China)；
2AFP-28(Fapon Biotech Inc, 2AFP-28, Shenzhen, China)。
仪器与耗材
仪器：Erenna Immunoassay System (Merk, Darmstadt, GER)
耗材：P-96-450V-C Assay Plate(Corning Incorporated, P-96-450V, NewYork, USA), 96 PCR Plate(Corning Incorporated, P-96-450V, New York, USA), 384PP Plate (Corning Incorporated, 264573, New York, USA)
下述实施例中，未特别说明的生物化学试剂均为本领域常规试剂，可按照常规方法配制而得或商购获得，规格为实验室纯级即可；未特别说明的实验器材均为本领域常规实验器材，可商购获得。
实施例1 双链DNA探针的设计和制备
一、探针的设计和筛选
本发明用于连接抗体的带内切酶位点的双链DNA（如50bpDNA），由Cy5-B-CM-S和NH2-B-CM-AS组成，在Cy5-B-CM-S和NH2-B-CM-AS的DNA序列中间插入限制性内切酶位点。
未插入酶切位点时序列为SEQ ID No.3和4所示：
SEQ ID No.3：
CM-S-5’-CCCCCATCTCATCCCTGCGTGTCACTGGTTCAAGGTTCTGGAG -3’
SEQ ID No.4：
CM-AS-5’- CTCCAGAACCTTGAACCAGTGACACGCAGGGATGAGATGG -3’。
上述双链DNA中插入限制性内切酶位点后，在CM-S寡核苷酸末端连接荧光基团修饰，CM-AS寡核苷酸末端连接活性氨基基团修饰，序列如SEQ ID No.1和2所示。
本发明中，Cy5-B-CM-S序列为SEQ ID No.1
Cy5-5’-CCCCCATCTCATCCCTGCGTGTCGGGATCCCGCACTGGTTCAAGGTTCTGGAG-3’；
本发明中，NH2-B-CM-AS序列为 SEQ ID No.2
NH2-5’-CTCCAGAACCTTGAACCAGTGCGGGATCCCGACACGCAGGGATGAGATGG-3’。
实施例2应用本探针对AFP阳性血清样本的AFP 进行超敏检测
本发明以AFP为例对本探针的使用方法和技术效果进行详细解释和说明，但不作为对本发明中待测抗原的限制。本探针可适用于所有单分子诊断抗原检测，尤其对微量抗原有超敏检测效果。超敏检测原理在于本发明中，双链DNA的结构设计。本发明中，双链DNA与检测抗体连接，对检测抗体的结构不产生影响，也不会影响抗原抗体的结合。
一、应用试剂盒对包被和检测抗体进行标记
1.按照ChromaLink Biotin One-Shot Antibody-Labeling Kit试剂盒方法将生物素偶联至包被抗体(2AFP-27)，即biotin-AFP27，分装后-20℃保存。
2.按照Antibody-Oligonucleotide All-In-One Conjugation Kit试剂盒方法将退火后的双链DNA探针偶联至检测抗体（2AFP-28），即oligo-AFP28，分装后4℃保存，将其称为B液。
上述退火步骤为：
20µl反应体系：Cy5-B-CM-S 0.9µl、NH2-B-CM-AS 1µl、16.1µl H2O、2µl PCRBuffer(不含酶)；PCR仪反应条件：80℃，5分钟，立即关机，60分钟后取出，分装后存放于-20℃冰箱。
上述双链DNA探针序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，具体结构见实施例1。
二、生物素-包被抗体（biotin-AFP27）和链霉亲和素磁珠（Strep-Beads）进行反应
以下所有实验步骤都避光操作。
1）取50µl Strep-Beads在磁力架上用PBS洗三次除去保护液，最后用50µl PBS悬浮Beads；
① Invitrogen Strep-Beads信息：100µl(1mg)可结合约20µg Biotin Antibody
② 50µl Strep-Beads置磁力架2分钟，吸弃液体，1ml PBS洗涤Beads，重复3次；
2）取标记后抗体10µl(1mg/ml)加入到悬浮的Beads中混匀；
3）将上混合液放入96孔板内，补至100µl体系；
4）30分钟后向反应孔内加入游离的Biotin 1µl 室温、振荡器500rpm混匀30分钟；
5）将反应液转入至1.5 ml EP管内，用100µl PBS洗96孔板的反应孔3次，洗液也放入EP管中，置磁力架上2分钟，小心弃废液；用500µl含有0.1% BSA的PBS，磁力架室温静置2分钟后弃废液，重复洗4次；最后用100µl PBS 悬浮，2%叠氮钠1µl，混匀后分装，4℃保存，终浓度为100ng/µl，将其称为A液。
三、包被抗体复合物+血清样本+检测抗体复合物进行反应并酶切
此步骤是将Biotin-AFP27+Strep-Beads反应后的包被抗体磁珠复合物称为A液，将检测抗体和双链DNA探针复合物称为B液，将血清样本称为C液，以下所有实验步骤都避光操作。
1）将A液与C液混匀后封口，避光在室温、振荡器500rpm混匀30分钟；
2）孵育结束后，在磁力板上静置5分钟，用100µl PBS洗涤3次，小心弃废液；
3）再将A + C液与B液混匀，室温、振荡器500rpm混匀60分钟；
4）反应期间，配1×NEB Buffer、酶反应液；
① 10×NEB Buffer用ddH2O稀释为 1×NEB Buffer （每个样品50µl）；
② 1µlBamH Ⅰ+ 125µlNEB Buffer + 1124µlH2O （每个样品25µl）；
5）孵育结束后，用100µl PBS洗涤，磁力板上静置5分钟后弃废液，重复3次；
6）加入1×NEB Buffer 悬浮Beads，置换Buffer后放置磁力板上5分钟，将废液小心弃干净；
7）加入25µl酶反应液，37℃水浴孵育30分钟；
8）磁力板上静置5分钟，吸上清转入96孔PCR板中，每个样品设置3个平行孔。
四、应用单分子免疫仪器检测上述酶切片段的荧光信号
1、将荧光标记的寡核苷酸Cy5-B-CM-S以17pg/ml作为起始浓度进行10倍梯度稀释直至0.0017pg/ml，检测浓度依次是0.0017pg/ml、0.017pg/ml、0.17pg/ml、1.7pg/ml、17pg/ml。结果如图1所示，结果显示我们的检测方法在样本浓度0.0171pg/ml～0.17pg/ml范围内开始荧光强度和寡核苷酸浓度已经呈现正相关，其中，X轴中1-5分别代表0.0017pg/ml、0.017 pg/ml、0.17 pg/ml、1.7 pg/ml和17 pg/ml。由图1可见，本发明中的检测下限可以达到0.1pg/ml。
2、在线性区内2倍稀释荧光标记寡核苷酸的荧光检测结果
根据图1的结果，在线性区域内将将荧光标记的寡核苷酸Cy5-B-CM-S进行2倍梯度稀释，一共选取10个浓度梯度，如图2所示，图2中X轴各点分别代表0.00332pg/ml、0.00664pg/ml、0.01328pg/ml、0.02656pg/ml、0.053125pg/ml、0.10625pg/ml、0.2125pg/ml、0.425pg/ml、0.85pg/ml、1.7pg/ml。由图2可知从0.2125pg/ml这个点开始进入平台期，荧光值不再呈现线形增长，说明本检测方法对于低浓度样本的检测效果更好。
3、应用抗原超敏检测技术检测不同浓度AFP阳性样品的结果
生物素标记的AFP包被抗体和AFP阳性血清进行反应后，再加入oligo-AFP检测抗体复合物进行双抗夹心反应，用BamHⅠ内切酶将带荧光标签的DNA片断酶切下来利用单分子免疫检测仪进行检测荧光信号。AFP阳性血清以90000pg/ml作为起始浓度进行10倍梯度稀释直至0.09pg/ml，检测浓度依次是90000pg/ml 、9000pg/ml、900pg/ml、90pg/ml、9pg/ml、0.9pg/ml、0.09pg/ml，上述各浓度分别对应图3中X轴的7-1各点。如图3所示AFP高浓度时测的荧光值较低,而在AFP低浓度时荧光值反而更高，结果显示本方法对于AFP低浓度样本非常敏感。
序列表
<110> 北京市肝病研究所
<120> 一种用于提高病原微生物抗原检测灵敏度的探针及试剂盒
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cccccatctc atccctgcgt gtcgggatcc cgcactggtt caaggttctg gag 53
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctccagaacc ttgaaccagt gcgggatccc gacacgcagg gatgagatgg 50
<210> 3
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cccccatctc atccctgcgt gtcactggtt caaggttctg gag 43
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctccagaacc ttgaaccagt gacacgcagg gatgagatgg 40

Claims (6)

1.一种用于提高病原微生物抗原检测灵敏度的探针，其特征在于，所述探针为含有荧光标记的带限制性内切酶位点的双链DNA，所述双链DNA由Cy5-B-CM-S和NH2-B-CM-AS组成；所述Cy5-B-CM-S的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述NH2-B-CM-AS的核苷酸序列如SEQID No.2所示。
2.一种用于检测病原微生物抗原的检测抗体，其特征在于，所述检测抗体连接有权利要求1所述探针。
3.如权利要求2所述的用于检测病原微生物抗原的检测抗体，其特征在于，所述探针中NH2-B-CM-AS用于连接检测抗体，所述Cy5-B-CM-S用于免疫荧光检测。
4.一种用于检测病原微生物抗原的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求2或3所述的检测抗体。
5.如权利要求4所述的用于检测病原微生物抗原的检测试剂盒，其特征在于，还包括用于检测待测抗原的生物素偶联的包被抗体及链霉亲和素磁珠。
6.一种利用权利要求1所述探针提高病原微生物抗原检测试剂灵敏度的方法，其特征在于，将权利要求1所述探针的NH2-B-CM-AS连接至检测抗体形成DNA-检测抗体复合物，将生物素偶联的包被抗体和链霉亲和素磁珠反应形成包被抗体磁珠复合物。
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