JP2002531098A - 表面上でのクローニング及びコピー作製方法 - Google Patents
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
-
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
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Abstract
(57)【要約】
ここで言及する本発明は、表面上での遺伝物質のクローニング及びコピー作製の方法ならびに広義でリガンド−レセプター系と分類される限りにおける生物学的物質のコピー作製の方法に関する。したがって、本発明は、特に、少なくとも２つの表面上でリガンド及びレセプターを増幅する方法であって、以下のサイクルの１以上：ａ）固相の第一の表面上でのリガンドの固定化；ｂ）レセプターの溶液の添加及び相補的レセプターのリガンドへの結合；ｃ）さらなる表面へのレセプターの移転及びその位置でのレセプターの固定化；ｄ）固定化されたレセプターへのさらなるリガンドの付着；ｅ）表面へのリガンドの移転及びその位置での固定化を含む方法に関する。核酸もまたリガンド／レセプター系として認められる。
Description
【０００１】 本発明は、表面上での遺伝物質のクローニング及びコピー作製の方法ならびに
広義においてリガンド−レセプター系として分類され得る限りの生物学的物質の
コピー作製の方法に関する。
広義においてリガンド−レセプター系として分類され得る限りの生物学的物質の
コピー作製の方法に関する。
【０００２】 分子マトリックスを指数関数的に増幅する方法は、Ｇ． ｖｏｎ Ｋｉｅｄｒ
ｏｗｓｋｉら（Ｎａｔｕｒｅ １９９８， ｖｏｌ．３４６， ２４５〜２４８
；ＤＥ１９８４８４０３）の成果を通じて既に公知である。増幅サイクルは、以
下のものを特徴とする： ａ） マトリックス上の可逆的なリンカーによる固相の表面への分子マトリック
スの結合、 ｂ） マトリックスフラグメント（それらのフラグメントのうち１つは、必要で
あれば保護されていてもよいリンカー単位を表す）の添加、 ｃ） マトリックスのコピーの合成、 ｄ） 余分のマトリックスフラグメント及び補助反応物質の除去、 ｅ） マトリックスからのコピーの脱着、及び ｆ） 固相上の遊離結合部位への合成されたマトリックスコピーの適用。
ｏｗｓｋｉら（Ｎａｔｕｒｅ １９９８， ｖｏｌ．３４６， ２４５〜２４８
；ＤＥ１９８４８４０３）の成果を通じて既に公知である。増幅サイクルは、以
下のものを特徴とする： ａ） マトリックス上の可逆的なリンカーによる固相の表面への分子マトリック
スの結合、 ｂ） マトリックスフラグメント（それらのフラグメントのうち１つは、必要で
あれば保護されていてもよいリンカー単位を表す）の添加、 ｃ） マトリックスのコピーの合成、 ｄ） 余分のマトリックスフラグメント及び補助反応物質の除去、 ｅ） マトリックスからのコピーの脱着、及び ｆ） 固相上の遊離結合部位への合成されたマトリックスコピーの適用。
【０００３】 これは、利用可能な分子マトリックスの量の指数関数的な増大を可能にし、し
たがって進化の重要な過程が起こることを可能にする、反復的な連続的増幅方法
を表す。これを達成するために、この方法は、固体単体の表面を利用する。固定
化されたマトリックスへの化学的な付着は、前駆体マトリックスからコピーが合
成されることを可能にし、それは次に放出されて新たなマトリックスとなる。こ
の方法は、何回でも繰り返すことができる。
たがって進化の重要な過程が起こることを可能にする、反復的な連続的増幅方法
を表す。これを達成するために、この方法は、固体単体の表面を利用する。固定
化されたマトリックスへの化学的な付着は、前駆体マトリックスからコピーが合
成されることを可能にし、それは次に放出されて新たなマトリックスとなる。こ
の方法は、何回でも繰り返すことができる。
【０００４】 さらに、いわゆる「ブリッジ」増幅技術が、米国特許第５，６４１，６５８号
に記載されている。これは、従来のＰＣＲ法に基づく増幅モデルであるが、局在
性の増幅を達成することを意図するものである。ブリッジ増幅技術は、多くの用
途を有し、特に一般に使用されるＰＣＲとともに行われることもできる分析方法
において用途を有するが、それは、増幅された生成物の分離及び検出工程を容易
にする。この技術の特徴は、単一の方法において増幅、選択及び検出を一緒にす
ることである。進歩した技術水準の系は、ＭＯＳＡＩＣ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ， Ｏｎｃ．（米国）のホームページに見出すことができ、この会社はブリ
ッジ増幅技術をマーケティングしている（ｗｗｗ．ｍｏｓｔｅｋ．ｃｏｍ）。こ
の技術の主な詳細は以下のとおりである：
に記載されている。これは、従来のＰＣＲ法に基づく増幅モデルであるが、局在
性の増幅を達成することを意図するものである。ブリッジ増幅技術は、多くの用
途を有し、特に一般に使用されるＰＣＲとともに行われることもできる分析方法
において用途を有するが、それは、増幅された生成物の分離及び検出工程を容易
にする。この技術の特徴は、単一の方法において増幅、選択及び検出を一緒にす
ることである。進歩した技術水準の系は、ＭＯＳＡＩＣ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ， Ｏｎｃ．（米国）のホームページに見出すことができ、この会社はブリ
ッジ増幅技術をマーケティングしている（ｗｗｗ．ｍｏｓｔｅｋ．ｃｏｍ）。こ
の技術の主な詳細は以下のとおりである：
【０００５】 ブリッジ系は、その５’末端を通じて単一の固相に共有結合により結合してい
る両方の増幅プライマーを用いる、固相上での核酸の増幅方法を記載する。結果
として、これは、周知のポリメラーゼ連鎖反応（略してＰＣＲとして知られてい
る）のさらなる開発を示す。これは、溶液中ではなく固相ＰＣＲにおいて起こる
。この方法の特別の利点は、単一の試料を用いて多くの異なる遺伝要素を同時に
増幅し解析するその能力である。ブリッジ増幅技術のための適用としては、遺伝
子発現、ゲノム研究、臨床的診断及び生物学的流体（例えば血液）の検査が挙げ
られる。より高い率の増幅は、効率的ではないプライマー構造物（ａｒｔｅｆａ
ｋｔｅ）（例えばプライマーダイマー）を排除することによって達成される。こ
れは、例えば蛍光物質を用いて、簡便で感度が良く、費用対効果の良いＤＮＡ検
出方法が開発されることを可能にする。ブリッジ増幅技術は、すべての増幅生成
物が固相に結合したままでいることを確実にするので、延長を通じた汚染は低い
ままであり、これは次に通常のＰＣＲと比較してこの方法の診断的価値を増大さ
せる。
る両方の増幅プライマーを用いる、固相上での核酸の増幅方法を記載する。結果
として、これは、周知のポリメラーゼ連鎖反応（略してＰＣＲとして知られてい
る）のさらなる開発を示す。これは、溶液中ではなく固相ＰＣＲにおいて起こる
。この方法の特別の利点は、単一の試料を用いて多くの異なる遺伝要素を同時に
増幅し解析するその能力である。ブリッジ増幅技術のための適用としては、遺伝
子発現、ゲノム研究、臨床的診断及び生物学的流体（例えば血液）の検査が挙げ
られる。より高い率の増幅は、効率的ではないプライマー構造物（ａｒｔｅｆａ
ｋｔｅ）（例えばプライマーダイマー）を排除することによって達成される。こ
れは、例えば蛍光物質を用いて、簡便で感度が良く、費用対効果の良いＤＮＡ検
出方法が開発されることを可能にする。ブリッジ増幅技術は、すべての増幅生成
物が固相に結合したままでいることを確実にするので、延長を通じた汚染は低い
ままであり、これは次に通常のＰＣＲと比較してこの方法の診断的価値を増大さ
せる。
【０００６】 上記で引用したＫｉｅｄｒｏｗｓｋｉらによって提案された方法は、集団全体
の固相増幅の利益を明らかにするが、一方、米国特許第５，６４１，６５８号に
記載された方法は、固相上で単一のマトリックスを増幅することの利点を提供す
る。このブリッジ増幅法の欠点は、増幅が生成物阻害の問題、すなわち新規に生
成されたコピーが、隣接する固定化プライマーについてのみでなく、同様に隣接
する元のマトリックス鎖についても生じ得ることである。別の欠点は、二本鎖と
してブリッジ形成を達成するのに必要なより低いリニア（線状）制限である。さ
らに、鎖間の分離がなく、診断目的のためには、ハイブリダイゼーションシグナ
ルが相補鎖とのハイブリダイゼーションによって弱められるという結果が生じる
。
の固相増幅の利益を明らかにするが、一方、米国特許第５，６４１，６５８号に
記載された方法は、固相上で単一のマトリックスを増幅することの利点を提供す
る。このブリッジ増幅法の欠点は、増幅が生成物阻害の問題、すなわち新規に生
成されたコピーが、隣接する固定化プライマーについてのみでなく、同様に隣接
する元のマトリックス鎖についても生じ得ることである。別の欠点は、二本鎖と
してブリッジ形成を達成するのに必要なより低いリニア（線状）制限である。さ
らに、鎖間の分離がなく、診断目的のためには、ハイブリダイゼーションシグナ
ルが相補鎖とのハイブリダイゼーションによって弱められるという結果が生じる
。
【０００７】 ＤＥ６９４ ０９ ６４６Ｔ２には、１つのプライマーが固相に結合されてお
り、第二のプライマーが磁場と反応する粒子に結合している、核酸を増幅する方
法が記載されている。これらのプライマーは、標的核酸配列中に取り込まれる。
伸長工程に続いて、核酸鎖は、電流の適用によって分離される。磁性プライマー
は、粒子結合型で、固相の形態として、存在することができる。アビジン／ビオ
チン系は、固相へのプライマーの結合に好適である。この方法は、クローニング
にも好適である。
り、第二のプライマーが磁場と反応する粒子に結合している、核酸を増幅する方
法が記載されている。これらのプライマーは、標的核酸配列中に取り込まれる。
伸長工程に続いて、核酸鎖は、電流の適用によって分離される。磁性プライマー
は、粒子結合型で、固相の形態として、存在することができる。アビジン／ビオ
チン系は、固相へのプライマーの結合に好適である。この方法は、クローニング
にも好適である。
【０００８】 米国特許第５，７９５，７１４号には、１つの形態において、ビオチン及びア
ビジンの間の相互反応の手段によって固相の表面につながれている、オリゴヌク
レオチドのアレイを用いる方法の記載が含まれている。この特定の形態において
は、この記載された方法は、相補鎖のアンハイブリダイゼーション（ａｎｈｙｂ
ｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、プライマー伸長反応、プライマー伸長生成物への第二
のビオチン化プライマーのアンハイブリダイゼーション、及び第二のプライマー
の伸長からなる。アビジンでコーティングされた第二の表面上でのコピーのブロ
ッティングが言及されている。したがって、米国特許第５，７９５，７１４号は
、最も近接した従来技術と考えられる。
ビジンの間の相互反応の手段によって固相の表面につながれている、オリゴヌク
レオチドのアレイを用いる方法の記載が含まれている。この特定の形態において
は、この記載された方法は、相補鎖のアンハイブリダイゼーション（ａｎｈｙｂ
ｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、プライマー伸長反応、プライマー伸長生成物への第二
のビオチン化プライマーのアンハイブリダイゼーション、及び第二のプライマー
の伸長からなる。アビジンでコーティングされた第二の表面上でのコピーのブロ
ッティングが言及されている。したがって、米国特許第５，７９５，７１４号は
、最も近接した従来技術と考えられる。
【０００９】 上述の方法の欠点は、指数関数的増幅の意味において複数の複製が可能ではな
いこと、及び電磁場によるコピーの転移が部位情報の喪失なしに達成され得ない
ことである。
いこと、及び電磁場によるコピーの転移が部位情報の喪失なしに達成され得ない
ことである。
【００１０】 したがって、この従来技術に基づいて、そして上述の欠点を回避して、部位情
報を維持しながら生物学的物質の増殖を可能にする、表面上へのクローニング及
びコピー作製の方法を提供することが、本発明の目的である。
報を維持しながら生物学的物質の増殖を可能にする、表面上へのクローニング及
びコピー作製の方法を提供することが、本発明の目的である。
【００１１】 予期せぬことに、核酸、リガンド及びレセプターが、匹敵する生物系とともに
増殖されること、電場によって互いに分離されること、及び増殖後に１以上の固
体表面上に固定化され、かくして固定されることを、部位情報を維持しながら可
能にする方法が見つかった。
増殖されること、電場によって互いに分離されること、及び増殖後に１以上の固
体表面上に固定化され、かくして固定されることを、部位情報を維持しながら可
能にする方法が見つかった。
【００１２】 本発明は、抗原／抗体複合体又は一般的な用語でのリガンド／レセプター系と
正確に同じ方法において、生物学的系を、基本的に、あらゆる種類の核酸間の及
び／又はペプチド／タンパク質／ポリメラーゼ／酵素（ＤＮＡ／ＲＮＡ／ＰＮＡ
／ｐＲＮＡ／２’−５’ヌクレオチド及びＲＮＡ／ＤＮＡミラーマー類（ＰＣＴ
／ＥＰ９７／０４７２６を参照されたい））との相互作用であると考える。
正確に同じ方法において、生物学的系を、基本的に、あらゆる種類の核酸間の及
び／又はペプチド／タンパク質／ポリメラーゼ／酵素（ＤＮＡ／ＲＮＡ／ＰＮＡ
／ｐＲＮＡ／２’−５’ヌクレオチド及びＲＮＡ／ＤＮＡミラーマー類（ＰＣＴ
／ＥＰ９７／０４７２６を参照されたい））との相互作用であると考える。
【００１３】 本発明は、核酸及び多くの他の生物学的に関連のある分子が、その電荷のため
、電場を適用された場合にそのような場の中で移動し得るという事実を利用する
。本件においては、定常的な結合分子がこのようにして対応する分子から分離さ
れ、ここにおいて、非定常的結合分子は電場の助けを得て、「同定反応」に続い
て又はその分子の合成によって他のものから分離される。それらの分子は電場の
線に沿って移動する傾向があるので、それらは移動しながらも部位情報を維持す
る。これはまた、例えばＤＥ６９４ ０９ ６４６Ｔ２においては、この場合に
おいて記載された電磁場は部位情報を維持するために役立たないため部位情報は
維持されないので、本発明において言及される方法を従来公知の技術水準から区
別する主なものである。
、電場を適用された場合にそのような場の中で移動し得るという事実を利用する
。本件においては、定常的な結合分子がこのようにして対応する分子から分離さ
れ、ここにおいて、非定常的結合分子は電場の助けを得て、「同定反応」に続い
て又はその分子の合成によって他のものから分離される。それらの分子は電場の
線に沿って移動する傾向があるので、それらは移動しながらも部位情報を維持す
る。これはまた、例えばＤＥ６９４ ０９ ６４６Ｔ２においては、この場合に
おいて記載された電磁場は部位情報を維持するために役立たないため部位情報は
維持されないので、本発明において言及される方法を従来公知の技術水準から区
別する主なものである。
【００１４】 それらの表面は互いに同一平面上であるように配置されるべきことが好ましい
（しかし必須ではない）。
（しかし必須ではない）。
【００１５】 本発明の基本的な理解のために、相補的核酸は、それ自体は伝統的な意味にお
いての相補的リガンド／レセプター系の特別の形態以上のものを表さないことを
了解することが必要である。
いての相補的リガンド／レセプター系の特別の形態以上のものを表さないことを
了解することが必要である。
【００１６】 したがって、一般的な意味において、本発明は、以下の１以上のサイクルを含
む、少なくとも２つの表面上でのリガンド及びレセプターの増殖の方法に適用さ
れる： ａ） 固相の第一の表面上へのリガンドの固定化； ｂ） レセプターの溶液の添加及びリガンドへの相補的レセプターの結合； ｃ） 更なる表面へのレセプターの移転及びその位置でのレセプターの固定化； ｄ） 固定化レセプターに対する更なるリガンドの付着； ｅ） 表面へのリガンドの移転及びその位置でのリガンドの固定化。
む、少なくとも２つの表面上でのリガンド及びレセプターの増殖の方法に適用さ
れる： ａ） 固相の第一の表面上へのリガンドの固定化； ｂ） レセプターの溶液の添加及びリガンドへの相補的レセプターの結合； ｃ） 更なる表面へのレセプターの移転及びその位置でのレセプターの固定化； ｄ） 固定化レセプターに対する更なるリガンドの付着； ｅ） 表面へのリガンドの移転及びその位置でのリガンドの固定化。
【００１７】 本発明において言及される方法における表面（以下において「担体」とも呼ば
れる）の役割は、溶液中に存在したら安定な二重体を形成するであろう相補的マ
トリックス間の分離の維持からなる。好適な担体材料は、有機又は無機材料ある
いはこれらの材料のハイブリッドからなる。有機担体材料は、糖ベース上のポリ
マーからなり、好ましくはアガロース、セルロース、及び好適な誘導体又はポリ
スチレン、ポリアクリル酸、ポリアクリルニトリル、ポリアルケン又はグラフト
コポリマーのようなテクニカルポリマー（例えばＰＳ ＰＥＧ、ＰＡＮ−ＰＥＧ
、ＰＡＮ−ＰＡＧ等）、ならびに電気伝導性ポリマー（例えばポリビニルピロー
ル、ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌ）である。好適な無機担体材料の例として
は、ガラス又は金属が挙げられ、特に重要なのは金表面（金チオレート相互作用
の結果として）及び半導体表面への付着である。
れる）の役割は、溶液中に存在したら安定な二重体を形成するであろう相補的マ
トリックス間の分離の維持からなる。好適な担体材料は、有機又は無機材料ある
いはこれらの材料のハイブリッドからなる。有機担体材料は、糖ベース上のポリ
マーからなり、好ましくはアガロース、セルロース、及び好適な誘導体又はポリ
スチレン、ポリアクリル酸、ポリアクリルニトリル、ポリアルケン又はグラフト
コポリマーのようなテクニカルポリマー（例えばＰＳ ＰＥＧ、ＰＡＮ−ＰＥＧ
、ＰＡＮ−ＰＡＧ等）、ならびに電気伝導性ポリマー（例えばポリビニルピロー
ル、ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌ）である。好適な無機担体材料の例として
は、ガラス又は金属が挙げられ、特に重要なのは金表面（金チオレート相互作用
の結果として）及び半導体表面への付着である。
【００１８】 結合は、共有結合又は非共有結合のいずれであってもよく、非共有結合にはイ
オン性及び非イオン性結合系が含まれ、特にアビジン／ストレプトアビジン及び
抗原抗体のような結合の免疫学的対が含まれる。好適な結合リンカーを選択する
場合、これらは系に存在する他の因子と望ましくない相互作用を形成するべきで
はない。特に、プライマーのアンハイブリダイゼーションにおいては、鋳型を含
有する表面域との相互反応は起こるべきではない。これは、外的条件によって影
響され得る制御可能な結合化学についての要求を課す。誤った固定化は、「活性
化可能な反応性プライマー（ａｋｔｉｖｉｅｒｂａｒｅｎ Ｒｅａｋｔｉｖｐｒ
ｉｍｅｒｓ）」の代わりにプライマー対を用いることによって（以下を参照され
たい）防止することもできる。プライマーのこれらの対の伸長生成物を直交して
固定化することが可能であるべきである。この場合、直交してとは、鋳型上にハ
イブリダイズしているプライマーについては利用可能な結合ポイントはないが、
プライマー伸長生成物を反対表面へ移動した後には結合ポイントが利用可能であ
ることを意味する。プライマーが添加される方法、及び反応が起こることが可能
になる方法は、この点を考慮に入れなければならない。本発明によって定義され
るように、活性化可能な反応性プライマーは、反応性に機能するプライマーであ
って、その反応性が好適な外的条件の選択によって影響され得るプライマーとし
て考えられる。
オン性及び非イオン性結合系が含まれ、特にアビジン／ストレプトアビジン及び
抗原抗体のような結合の免疫学的対が含まれる。好適な結合リンカーを選択する
場合、これらは系に存在する他の因子と望ましくない相互作用を形成するべきで
はない。特に、プライマーのアンハイブリダイゼーションにおいては、鋳型を含
有する表面域との相互反応は起こるべきではない。これは、外的条件によって影
響され得る制御可能な結合化学についての要求を課す。誤った固定化は、「活性
化可能な反応性プライマー（ａｋｔｉｖｉｅｒｂａｒｅｎ Ｒｅａｋｔｉｖｐｒ
ｉｍｅｒｓ）」の代わりにプライマー対を用いることによって（以下を参照され
たい）防止することもできる。プライマーのこれらの対の伸長生成物を直交して
固定化することが可能であるべきである。この場合、直交してとは、鋳型上にハ
イブリダイズしているプライマーについては利用可能な結合ポイントはないが、
プライマー伸長生成物を反対表面へ移動した後には結合ポイントが利用可能であ
ることを意味する。プライマーが添加される方法、及び反応が起こることが可能
になる方法は、この点を考慮に入れなければならない。本発明によって定義され
るように、活性化可能な反応性プライマーは、反応性に機能するプライマーであ
って、その反応性が好適な外的条件の選択によって影響され得るプライマーとし
て考えられる。
【００１９】 本発明は、特に、少なくとも２つの表面上での核酸の酵素的増殖方法であって
、以下の増幅サイクルの１以上を含む方法にも適用される： ａ） 固相の第一の表面上への第一のプライマーの固定化； ｂ） 核酸の溶液の添加及び第一のプライマーへの相補的フラグメントの結合； ｃ） ポリメラーゼによる、相補的フラグメントに対応する、第一のプライマー
のその３’末端への伸長； ｄ） 相補的フラグメントの放出； ｅ） 伸長された核酸の３’末端への第二のプライマーの付加； ｆ） ポリメラーゼによる、第二のプライマーのその３’末端への伸長； ｇ） さらなる表面への第二のプライマーの移転、及び伸長されたプライマーの
固定化； ｈ） さらなる第一のプライマーの、第二の伸長されたプライマーの３’末端へ
の伸長。
、以下の増幅サイクルの１以上を含む方法にも適用される： ａ） 固相の第一の表面上への第一のプライマーの固定化； ｂ） 核酸の溶液の添加及び第一のプライマーへの相補的フラグメントの結合； ｃ） ポリメラーゼによる、相補的フラグメントに対応する、第一のプライマー
のその３’末端への伸長； ｄ） 相補的フラグメントの放出； ｅ） 伸長された核酸の３’末端への第二のプライマーの付加； ｆ） ポリメラーゼによる、第二のプライマーのその３’末端への伸長； ｇ） さらなる表面への第二のプライマーの移転、及び伸長されたプライマーの
固定化； ｈ） さらなる第一のプライマーの、第二の伸長されたプライマーの３’末端へ
の伸長。
【００２０】 さらに、本発明は、以下の方法工程を含む、第一から第二の表面へ核酸をコピ
ーする方法の好ましい形態をも記載する： ａ） 固体担体の表面との反応を通じた核酸の固定化； ｂ） ｂａ）相補的一本鎖のハイブリダイゼーション又はｂｂ）相補的フラグメ
ントの化学的又は酵素的連結又はｂｃ）相補的プライマーの化学的又は酵素的伸
長、を通じた二本鎖分子の生成； ｃ） 第二の表面への相補鎖の移転、及びそれらの固定化。
ーする方法の好ましい形態をも記載する： ａ） 固体担体の表面との反応を通じた核酸の固定化； ｂ） ｂａ）相補的一本鎖のハイブリダイゼーション又はｂｂ）相補的フラグメ
ントの化学的又は酵素的連結又はｂｃ）相補的プライマーの化学的又は酵素的伸
長、を通じた二本鎖分子の生成； ｃ） 第二の表面への相補鎖の移転、及びそれらの固定化。
【００２１】 本発明に属するすべての手段の中で、部位情報の維持を伴う、電場による移転
が好ましい。表面の分離もまた好ましい。
が好ましい。表面の分離もまた好ましい。
【００２２】 本方法は、いわゆる「遺伝子チップ」上での生物学的物質の増殖について有用
である。基本的に、配列内の５’末端、３’末端又は中間位置が表面とのリンク
についての開始ポイントとして用いられるかは、重要ではない（いずれの場合に
も本発明に含まれる方法に入るので）。
である。基本的に、配列内の５’末端、３’末端又は中間位置が表面とのリンク
についての開始ポイントとして用いられるかは、重要ではない（いずれの場合に
も本発明に含まれる方法に入るので）。
【００２３】 対象担体上で選択的に結合する化合物の作用を明らかにする方法としての、対
象担体上への多数の固定化されたポリマー化合物の付着又は合成に関する知見は
、既に存在する（Ｆｏｄｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１，７６７−７７３，１
９９１；米国特許第５，５１０，２７０号、米国特許第５，４８９，６７８号、
米国特許第５，４４５，９３４号、米国特許第５，４２４，１８６号）。しかし
、このようなプローブのアレイの製造方法は、その前にリソグラフのマスク（ｌ
ｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｃ ｍａｓｋｓ）の作製及び使用が先行しなければならず
、最初のモノマー化合物は光感受性の保護基とともに提供されなければならない
。ペプチド合成の場合の合成サイクルは、各サイクルについて少なくとも２０の
このようなマスクを必要とする。すなわち、ｎ回のサイクルについて必要なマス
クの数はｎ×２０である。オリゴヌクレオチドの合成においては、４つのこのよ
うなリソグラフのマスクが必要であり、すなわち、ｎ回のサイクルがある場合、
ｎ×４のマスクが必要である。これらのリソグラフのマスクは、アレイ上の定義
された空間的ポイントでの照明を可能にし、かつアレイ上の他のポイントでの照
明を防止することを可能にするために必要とされる。光感受性保護基は、定義さ
れた照明されたポイントで分割され、これは、反応基が放出されることを可能に
し、そこへポリマーの新しいモノマーの建築ブロックが続いて結合することがで
きる。このようなアレイは、個々のマスクの反復された適用及びカップリングプ
ロセスの複数の反復を通じて建築される。現在まで、複雑で非常に高価なリソグ
ラフ法がこのような遺伝子チップを製造するために必要とされてきた（米国特許
第５，７００，６３７号も参照されたい）。
象担体上への多数の固定化されたポリマー化合物の付着又は合成に関する知見は
、既に存在する（Ｆｏｄｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１，７６７−７７３，１
９９１；米国特許第５，５１０，２７０号、米国特許第５，４８９，６７８号、
米国特許第５，４４５，９３４号、米国特許第５，４２４，１８６号）。しかし
、このようなプローブのアレイの製造方法は、その前にリソグラフのマスク（ｌ
ｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｃ ｍａｓｋｓ）の作製及び使用が先行しなければならず
、最初のモノマー化合物は光感受性の保護基とともに提供されなければならない
。ペプチド合成の場合の合成サイクルは、各サイクルについて少なくとも２０の
このようなマスクを必要とする。すなわち、ｎ回のサイクルについて必要なマス
クの数はｎ×２０である。オリゴヌクレオチドの合成においては、４つのこのよ
うなリソグラフのマスクが必要であり、すなわち、ｎ回のサイクルがある場合、
ｎ×４のマスクが必要である。これらのリソグラフのマスクは、アレイ上の定義
された空間的ポイントでの照明を可能にし、かつアレイ上の他のポイントでの照
明を防止することを可能にするために必要とされる。光感受性保護基は、定義さ
れた照明されたポイントで分割され、これは、反応基が放出されることを可能に
し、そこへポリマーの新しいモノマーの建築ブロックが続いて結合することがで
きる。このようなアレイは、個々のマスクの反復された適用及びカップリングプ
ロセスの複数の反復を通じて建築される。現在まで、複雑で非常に高価なリソグ
ラフ法がこのような遺伝子チップを製造するために必要とされてきた（米国特許
第５，７００，６３７号も参照されたい）。
【００２４】 本発明は、予期せぬことに、このような方法の簡便な代替法を提供し、さらに
、はるかに高いレベルの効率及び精度を提供する。このような遺伝子チップ上に
保持され得る情報の産物のため、スクリーニング目的のための遺伝子データベー
ス全体又はライブラリーを調製することさえ可能である。本発明の目的は、核酸
を二次元的に固定化担体上に配置し、それらをこの配置にしたがって移転するこ
とである。本発明によって定義されるように、二次元の配置は、「混乱（ｕｎｏ
ｒｄｎｕｎｇ； ｄｉｓａｒｒａｙ）」としても認識され得る。特に、大きなラ
イブラリーの場合には、個々の分子が特定の部位に結合することを含む方法に関
して、不可避的に特定の割り当てはない。しかし、空間的な意味においては、移
転が起こる場合、ライブラリーの割り当てられていない分子は、その元の部位特
異的情報と共に移転される。そこで、本発明者らは、「混乱」を有し、それは同
時に部位特異的情報を維持しながら整理された形で移転される。
、はるかに高いレベルの効率及び精度を提供する。このような遺伝子チップ上に
保持され得る情報の産物のため、スクリーニング目的のための遺伝子データベー
ス全体又はライブラリーを調製することさえ可能である。本発明の目的は、核酸
を二次元的に固定化担体上に配置し、それらをこの配置にしたがって移転するこ
とである。本発明によって定義されるように、二次元の配置は、「混乱（ｕｎｏ
ｒｄｎｕｎｇ； ｄｉｓａｒｒａｙ）」としても認識され得る。特に、大きなラ
イブラリーの場合には、個々の分子が特定の部位に結合することを含む方法に関
して、不可避的に特定の割り当てはない。しかし、空間的な意味においては、移
転が起こる場合、ライブラリーの割り当てられていない分子は、その元の部位特
異的情報と共に移転される。そこで、本発明者らは、「混乱」を有し、それは同
時に部位特異的情報を維持しながら整理された形で移転される。
【００２５】 本発明の適用には、ヒトの医学及び獣医学の両方における診断目的のための遺
伝子チップの製造が含まれる。
伝子チップの製造が含まれる。
【００２６】 本発明によって記載された方法においては、こうして製造された核酸のコピー
は、最初の配列（マトリックス）と同一又はそれに相補的であることができる。
本発明の場合、「相補的」とは、マトリックスのコピーが最初のマトリックスと
異なり、その一方で、このコピーのコピーは最初のマトリックスと同一であるこ
とを意味するものと受け取られる。必要であれば、これらは、「（＋）鎖」及び
「（−）鎖」として以下において略称される。反応は、同じ反応容器において起
こる。核酸は、Ｄ−及びＬ−核酸の両方（ミラーマー）、及びそれらのあらゆる
改変体を意味するとして受け取られる。
は、最初の配列（マトリックス）と同一又はそれに相補的であることができる。
本発明の場合、「相補的」とは、マトリックスのコピーが最初のマトリックスと
異なり、その一方で、このコピーのコピーは最初のマトリックスと同一であるこ
とを意味するものと受け取られる。必要であれば、これらは、「（＋）鎖」及び
「（−）鎖」として以下において略称される。反応は、同じ反応容器において起
こる。核酸は、Ｄ−及びＬ−核酸の両方（ミラーマー）、及びそれらのあらゆる
改変体を意味するとして受け取られる。
【００２７】 イムノアッセイ又はＲＩＡｓの形態の免疫反応（抗原抗体反応）を、本発明に
おいて言及される方法を用いて行うこともできる。
おいて言及される方法を用いて行うこともできる。
【００２８】 本発明は、すべての公知の関連法、すなわち従来の医学診断及び生化学／生物
工学／遺伝子工学の方法について、従来予想されなかった利点を提供し、結果と
して多くの適用分野を拓くものである。これらの適用の２，３を以下に例として
記載する。
工学／遺伝子工学の方法について、従来予想されなかった利点を提供し、結果と
して多くの適用分野を拓くものである。これらの適用の２，３を以下に例として
記載する。
【００２９】 本発明において言及される方法は、ＤＮＡ及びＲＮＡ分子の定量的及び定性的
検出のために用いることができる。この方法は、複雑な遺伝子多型及び複対立遺
伝子が同時に解析されることをも可能にする。固相上でのＤＮＡ及びＲＮＡ分子
の増殖は、プライマー人工産物（アーティファクト）（例えばプライマーダイマ
ー）を回避することを可能にする。定量されるべき試料が方法の開始時に導入さ
れるのみである、及び続いてすべての増殖生成物が特異的結合によって表面にし
っかり付着する、という事実は、さらに別の利点として認められ得る。このよう
にして、ＰＣＲ診断中に不純物によって生成されるシグナルからの頻繁な干渉は
回避される。表面の純度は、非特異的に結合したＤＮＡ又はＲＮＡ分子の静電的
排除によって改良され得る。したがって、この方法は、機能的遺伝学及び医薬遺
伝学において適用することができる（Ｏｌｉｖｅｒら、Ｔｒａｎｓ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌ． １６、３７３−３７８（１９９８）；Ｈｏｕｓｍａｎ及びＬｅｄ
ｌｅｙ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６，４９２−４９３（
１９９８）を参照されたい）。
検出のために用いることができる。この方法は、複雑な遺伝子多型及び複対立遺
伝子が同時に解析されることをも可能にする。固相上でのＤＮＡ及びＲＮＡ分子
の増殖は、プライマー人工産物（アーティファクト）（例えばプライマーダイマ
ー）を回避することを可能にする。定量されるべき試料が方法の開始時に導入さ
れるのみである、及び続いてすべての増殖生成物が特異的結合によって表面にし
っかり付着する、という事実は、さらに別の利点として認められ得る。このよう
にして、ＰＣＲ診断中に不純物によって生成されるシグナルからの頻繁な干渉は
回避される。表面の純度は、非特異的に結合したＤＮＡ又はＲＮＡ分子の静電的
排除によって改良され得る。したがって、この方法は、機能的遺伝学及び医薬遺
伝学において適用することができる（Ｏｌｉｖｅｒら、Ｔｒａｎｓ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌ． １６、３７３−３７８（１９９８）；Ｈｏｕｓｍａｎ及びＬｅｄ
ｌｅｙ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６，４９２−４９３（
１９９８）を参照されたい）。
【００３０】 本発明において言及される方法は、差次的（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）遺伝
子発現を検出するために用いることができる。さらに、この方法は、差次的ディ
スプレイＲＴ−ＰＣＲ（ＤＤＲＴ−ＰＣＲ）法、遺伝子発現の連続的解析（ＳＡ
ＧＥ）又は差次的ハイブリダイゼーション（Ｗａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４，１６８５−１６９１（１９９６））のような、従来
の技術水準の方法と組み合わせることができる。遺伝子発現の比較は、例えば、
薬学の適用についての新規な領域が同定されることを可能にする。
子発現を検出するために用いることができる。さらに、この方法は、差次的ディ
スプレイＲＴ−ＰＣＲ（ＤＤＲＴ−ＰＣＲ）法、遺伝子発現の連続的解析（ＳＡ
ＧＥ）又は差次的ハイブリダイゼーション（Ｗａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４，１６８５−１６９１（１９９６））のような、従来
の技術水準の方法と組み合わせることができる。遺伝子発現の比較は、例えば、
薬学の適用についての新規な領域が同定されることを可能にする。
【００３１】 迅速な定性的及び定量的検出のためには、本方法は、公知の従来技術のセンサ
ー方法、例えば表面プラズモン共鳴センサー、エバネッセント場（ｅｖａｎｅｓ
ｃｅｎｔ ｆｉｅｌｄ）センサー、フェーサー（ｆａｓｅｒ）光センサー、回折
格子カップラー（ｇｒａｔｉｎｇ ｃｏｕｐｌｅｒｓ）又はＲＩＦＳ（反射体干
渉計分光計測）（Ｓｃｈｅｌｌｅｒら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｅ
ｎｓｏｒｉｃｓ， Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ Ｖｅｒｌａｇ Ｂａｓｅｌ（１９９
７））と組み合わせることもできる。
ー方法、例えば表面プラズモン共鳴センサー、エバネッセント場（ｅｖａｎｅｓ
ｃｅｎｔ ｆｉｅｌｄ）センサー、フェーサー（ｆａｓｅｒ）光センサー、回折
格子カップラー（ｇｒａｔｉｎｇ ｃｏｕｐｌｅｒｓ）又はＲＩＦＳ（反射体干
渉計分光計測）（Ｓｃｈｅｌｌｅｒら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｅ
ｎｓｏｒｉｃｓ， Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ Ｖｅｒｌａｇ Ｂａｓｅｌ（１９９
７））と組み合わせることもできる。
【００３２】 本発明にしたがった遺伝子及びゲノムライブラリーの編集は、アダプター又は
リンカーの連結についての公知の従来技術の方法と組み合わせることができる。
本方法の１つの特別の利点は、表面固定化のために２つの異なるプライマーを用
いる場合、２つの異なるアダプター又はリンカーを伴う分子のみが増殖されるこ
とである。このようにして、表面上で個々の相補的な個別の鎖が別個に増殖され
る。
リンカーの連結についての公知の従来技術の方法と組み合わせることができる。
本方法の１つの特別の利点は、表面固定化のために２つの異なるプライマーを用
いる場合、２つの異なるアダプター又はリンカーを伴う分子のみが増殖されるこ
とである。このようにして、表面上で個々の相補的な個別の鎖が別個に増殖され
る。
【００３３】 さらに、部位特異的固定化及び表面結合分子の再分別を可能にする方法との組
み合わせも可能である。これらとしては、まず、１以上の特異的微小電極が選択
的に誘発される電極のアレイに基づく方法が挙げられる。このような場合には、
電極のアレイは、半導体チップ、例えばＮａｎｏｇｅｎ ｃｏｍｐａｎｙ（ｗｗ ｗ．ｎａｎｏｇｅｎ．ｃｏｍ ）によって開発されたもの等を用いて構成されてい
てもよい。他の方法は、走査技術の使用を含み、ここでは、ナノメーター以下の
範囲への非常に正確な横の接近を確実にするために圧電性要素が用いられる。好
ましいアプローチは、分子の電気化学的沈着のための走査電気化学顕微鏡（ＳＥ
ＣＭ）の使用を含むものである。これは、検出目的のための電気化学的プローブ
との関連においても用いることができる。原子力顕微鏡（ＡＦＭ）のような方法
もまた、個別の分子の横への転位について好適である。
み合わせも可能である。これらとしては、まず、１以上の特異的微小電極が選択
的に誘発される電極のアレイに基づく方法が挙げられる。このような場合には、
電極のアレイは、半導体チップ、例えばＮａｎｏｇｅｎ ｃｏｍｐａｎｙ（ｗｗ ｗ．ｎａｎｏｇｅｎ．ｃｏｍ ）によって開発されたもの等を用いて構成されてい
てもよい。他の方法は、走査技術の使用を含み、ここでは、ナノメーター以下の
範囲への非常に正確な横の接近を確実にするために圧電性要素が用いられる。好
ましいアプローチは、分子の電気化学的沈着のための走査電気化学顕微鏡（ＳＥ
ＣＭ）の使用を含むものである。これは、検出目的のための電気化学的プローブ
との関連においても用いることができる。原子力顕微鏡（ＡＦＭ）のような方法
もまた、個別の分子の横への転位について好適である。
【００３４】 本方法にしたがって編集されたライブラリーは、公知の従来技術の方法を用い
て、例えばＳａｎｇｅｒのジデオキシ鎖終止法を用いるシークエンシング、Ｍａ
ｘａｍ及びＧｉｌｂｅｒｔの化学的分割によるシークエンシング、ハイブリダイ
ゼーションによるシークエンシング、キャピラリ電気泳動又はＭＡＬＤＩ質量分
析によるシークエンシングによって配列決定することができる（Ａｄａｍｓ，
Ｆｉｅｌｄｓ， Ｖｅｎｔｅｒ、「Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎ
ｃｉｎｇ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９
９４を参照されたい）。
て、例えばＳａｎｇｅｒのジデオキシ鎖終止法を用いるシークエンシング、Ｍａ
ｘａｍ及びＧｉｌｂｅｒｔの化学的分割によるシークエンシング、ハイブリダイ
ゼーションによるシークエンシング、キャピラリ電気泳動又はＭＡＬＤＩ質量分
析によるシークエンシングによって配列決定することができる（Ａｄａｍｓ，
Ｆｉｅｌｄｓ， Ｖｅｎｔｅｒ、「Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎ
ｃｉｎｇ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９
９４を参照されたい）。
【００３５】 このようにして編集された遺伝子及びゲノムライブラリーは、ＤＮＡ及びＲＮ
Ａ結合因子を割り当てるために用いることができる。例えば、転写活性化因子又
はリプレッサーのための特異的結合部位は、同時に検出することができる。用い
る遺伝子及びゲノムライブラリーは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。
Ａ結合因子を割り当てるために用いることができる。例えば、転写活性化因子又
はリプレッサーのための特異的結合部位は、同時に検出することができる。用い
る遺伝子及びゲノムライブラリーは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。
【００３６】 この方法は、遺伝子及びゲノム合成について、及び遺伝物質の組換えについて
、用いることができる。図７に記載した方法（以下を参照されたい）は、部分的
な相補性のみを有するいかなる数のフラグメントの連結も可能にする。特に、そ
れは、生物学的発現系についての好適な出発シグナルとともにオープン走査グリ
ッド（ｏｐｅｎ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｇｒｉｄｓ）が提供されることを可能にす
る。さらに、本方法は、インビトロ転写及びインビトロ翻訳とカップリングさせ
ることもできる。本発明が言及する方法において、転写及び翻訳生成物は部位情
報を維持しながら生成されることができるため、それらが他の因子と相互作用す
る方法においてこれらの生成物の空間的配置を試験することが可能である。これ
は、現在の技術水準においては「２ハイブリッド系（Ｔｗｏ Ｈｙｂｒｉｄ−ｓ
ｙｓｔｅｍ）」（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｓｏｎ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌ． ９，９０−９６（１９９８））のような複雑な系においてし
か見出されない機能的割り当てが同時に検出されることを可能にする。したがっ
て、本発明が言及する方法においては、新規な有効な薬学的部位が見出され得る
し、また、新規な診断戦略が開発され得る。
、用いることができる。図７に記載した方法（以下を参照されたい）は、部分的
な相補性のみを有するいかなる数のフラグメントの連結も可能にする。特に、そ
れは、生物学的発現系についての好適な出発シグナルとともにオープン走査グリ
ッド（ｏｐｅｎ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｇｒｉｄｓ）が提供されることを可能にす
る。さらに、本方法は、インビトロ転写及びインビトロ翻訳とカップリングさせ
ることもできる。本発明が言及する方法において、転写及び翻訳生成物は部位情
報を維持しながら生成されることができるため、それらが他の因子と相互作用す
る方法においてこれらの生成物の空間的配置を試験することが可能である。これ
は、現在の技術水準においては「２ハイブリッド系（Ｔｗｏ Ｈｙｂｒｉｄ−ｓ
ｙｓｔｅｍ）」（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｓｏｎ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌ． ９，９０−９６（１９９８））のような複雑な系においてし
か見出されない機能的割り当てが同時に検出されることを可能にする。したがっ
て、本発明が言及する方法においては、新規な有効な薬学的部位が見出され得る
し、また、新規な診断戦略が開発され得る。
【００３７】 さらに、本方法は、コンビナトリアルライブラリーから機能的分子を見出すた
めの公知の従来技術の方法と組み合わせることができる。例えば、標的分子を第
一の表面上に固定化することができる。非結合ＲＮＡ又はＤＮＡ分子を、コンビ
ナトリアル核酸ライブラリーとの接触の後に分離することができる。コンビナト
リアルライブラリーから得られた結合分子は、本発明が言及する方法を用いて第
二の表面に移される。それらは、部位についての情報と共に提供され、次に増殖
させられる。結合分子の組成についての詳細は、配列決定を通じて得ることがで
きる。
めの公知の従来技術の方法と組み合わせることができる。例えば、標的分子を第
一の表面上に固定化することができる。非結合ＲＮＡ又はＤＮＡ分子を、コンビ
ナトリアル核酸ライブラリーとの接触の後に分離することができる。コンビナト
リアルライブラリーから得られた結合分子は、本発明が言及する方法を用いて第
二の表面に移される。それらは、部位についての情報と共に提供され、次に増殖
させられる。結合分子の組成についての詳細は、配列決定を通じて得ることがで
きる。
【００３８】 さらに、サイクル状の手順を用いて、結合分子の進化的最適化を達成すること
ができる。既に選択された分子は、固定化された標的分子と再び接触させられ、
再び増殖させられる。誤った増殖は、いくつかの場合には改良された結合特性を
有する、二次的分子の生成をもたらす。突然変異を通じて一次配列から誘導され
た配列の集団は、Ｅｉｇｅｎによって擬似配列（ｑｕａｓｉ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ
）と呼ばれる。本発明が言及する方法は、擬似種のメンバーが空間的に共局在化
（ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚｅｄ）され、擬似種のコンセプトに横の次元を与えると
いう事実によって区別される。
ができる。既に選択された分子は、固定化された標的分子と再び接触させられ、
再び増殖させられる。誤った増殖は、いくつかの場合には改良された結合特性を
有する、二次的分子の生成をもたらす。突然変異を通じて一次配列から誘導され
た配列の集団は、Ｅｉｇｅｎによって擬似配列（ｑｕａｓｉ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ
）と呼ばれる。本発明が言及する方法は、擬似種のメンバーが空間的に共局在化
（ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚｅｄ）され、擬似種のコンセプトに横の次元を与えると
いう事実によって区別される。
【００３９】 ますます厳密な条件（例えば標的濃度の低減及び増大する洗浄）を適用するこ
とにより、機能的特性の系統的な最適化を達成することが可能である。本発明が
言及する方法においては、選択圧は、静電的反発を増大させることを通じて達成
することもできる。さらに、本方法は、触媒的核酸の選択についての公知の従来
技術の方法と組み合わせることもできる（Ｔａｒｏｓｏｗら、Ｎａｔｕｒｅ ３
８９，５４−５７ （１９９７））。
とにより、機能的特性の系統的な最適化を達成することが可能である。本発明が
言及する方法においては、選択圧は、静電的反発を増大させることを通じて達成
することもできる。さらに、本方法は、触媒的核酸の選択についての公知の従来
技術の方法と組み合わせることもできる（Ｔａｒｏｓｏｗら、Ｎａｔｕｒｅ ３
８９，５４−５７ （１９９７））。
【００４０】 結果として、本方法は、特に、複製ポリメラーゼ、例えば大腸菌由来のポリメ
ラーゼIIIを用いる、特に、ＤＮＡのゲノムフラグメント、ｃＤＮＡ及びＲＮＡ
のクローニングにおいて、用いることができる。その利点は、これが、複製過程
でのエラーを回避するということである。さらに、制限消化の後にサブクローニ
ングが利用可能である。サブクローニングは、大きいゲノムフラグメントの配列
決定においてある役割を有し、本発明が言及する方法を用いる場合、利点は、例
えば「ショットガンクローニング」のようなサブクローニング技術及び選択的欠
失変異体の作製、例えばエキソヌクレアーゼIII処理の使用によって、核酸の大
きいライブラリーを分別するとき、かなりの時間的短縮を達成できることである
（Ａｄａｍｓ， Ｆｉｅｌｄｓ， Ｖｅｎｔｅｒ、「Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ＤＮ
Ａ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ、１９９４を参照されたい）。
ラーゼIIIを用いる、特に、ＤＮＡのゲノムフラグメント、ｃＤＮＡ及びＲＮＡ
のクローニングにおいて、用いることができる。その利点は、これが、複製過程
でのエラーを回避するということである。さらに、制限消化の後にサブクローニ
ングが利用可能である。サブクローニングは、大きいゲノムフラグメントの配列
決定においてある役割を有し、本発明が言及する方法を用いる場合、利点は、例
えば「ショットガンクローニング」のようなサブクローニング技術及び選択的欠
失変異体の作製、例えばエキソヌクレアーゼIII処理の使用によって、核酸の大
きいライブラリーを分別するとき、かなりの時間的短縮を達成できることである
（Ａｄａｍｓ， Ｆｉｅｌｄｓ， Ｖｅｎｔｅｒ、「Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ＤＮ
Ａ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ、１９９４を参照されたい）。
【００４１】 さらに、本方法は、ハイブリダイゼーション技術の使用を通じて隣接するフラ
グメントを分別すること（「染色体ウォーキング」）についての利点を有する。
グメントを分別すること（「染色体ウォーキング」）についての利点を有する。
【００４２】 遺伝子チップをコピーするためにこの方法を用いることは、以前は予期されな
かった可能性をも提供する。例えば、遺伝子チップは、供給源材料としてのウイ
ルス抗原のライブラリーと共に用いることができる。患者の血液との反応及びこ
れが含有する抗体を結合する作用により、免疫反応が検出されることが可能にな
る。ここで、本発明が言及する方法は、請求項９にしたがって作用し、同定され
た抗体は（抗体の電気的電荷を通じて）表面に移転される結果をもたらす。本方
法は、任意の回数繰り返すことができ、それによりシグナルが強化される。こう
して、ある範囲において直線状の増殖が起こり、それにより弱い免疫シグナルが
同定されることも可能になる。これは、例えば、一般に知られているように感染
の開始時において検出することが困難なＡＩＤＳの診断において有用である。疾
患又はアレルギーをその初期段階において同定することも可能である。本発明が
言及する方法は、固定化抗原を用いる場合に起こり得る指数関数的増殖について
も好適である。さらに、半導体技術及び／又は微小操作（「整列（ａｌｉｇｎ）
技術」）を用いて、ソーティング方法を遺伝子チップ上において行うこともでき
る。全体的な電荷において優勢な正に荷電した上部（ｈｅａｄｉｎｇｓ）の基を
有する荷電した核酸を提供することも可能である。これは、電場において分子が
整列され、チップ上が高電荷密度になることを可能にする（ＤＮＡ／ＲＮＡ）。
かった可能性をも提供する。例えば、遺伝子チップは、供給源材料としてのウイ
ルス抗原のライブラリーと共に用いることができる。患者の血液との反応及びこ
れが含有する抗体を結合する作用により、免疫反応が検出されることが可能にな
る。ここで、本発明が言及する方法は、請求項９にしたがって作用し、同定され
た抗体は（抗体の電気的電荷を通じて）表面に移転される結果をもたらす。本方
法は、任意の回数繰り返すことができ、それによりシグナルが強化される。こう
して、ある範囲において直線状の増殖が起こり、それにより弱い免疫シグナルが
同定されることも可能になる。これは、例えば、一般に知られているように感染
の開始時において検出することが困難なＡＩＤＳの診断において有用である。疾
患又はアレルギーをその初期段階において同定することも可能である。本発明が
言及する方法は、固定化抗原を用いる場合に起こり得る指数関数的増殖について
も好適である。さらに、半導体技術及び／又は微小操作（「整列（ａｌｉｇｎ）
技術」）を用いて、ソーティング方法を遺伝子チップ上において行うこともでき
る。全体的な電荷において優勢な正に荷電した上部（ｈｅａｄｉｎｇｓ）の基を
有する荷電した核酸を提供することも可能である。これは、電場において分子が
整列され、チップ上が高電荷密度になることを可能にする（ＤＮＡ／ＲＮＡ）。
【００４３】 本方法は、免疫学的リガンド／レセプター対を強化するために用い得ることも
明らかである。
明らかである。
【００４４】 他の有用な手段は、その他の従属請求項において記載されている。本発明は、
添付の図面に示されており、以下においてより詳細に記載されている。
添付の図面に示されており、以下においてより詳細に記載されている。
【００４５】 図１は、２つの表面上でのリガンド及びレセプターの増殖についての一般的な
方法を説明する。個々の工程は、以下のとおりである： （１）反応の結果として、リガンドを固体担体の表面上に固定化する； （２）リガンドをレセプターと結合させる； （３）レセプターを、第二の表面に移転する；これは電場の適用によって再び起
こる；第二の表面との接触の後、レセプターを反応によって固定化する； （４）遊離のリガンドを固定化されたレセプターに添加する； （５）リガンドを第二の表面に移転する（電場の助けによって）；ここでそれを
固定化する。
方法を説明する。個々の工程は、以下のとおりである： （１）反応の結果として、リガンドを固体担体の表面上に固定化する； （２）リガンドをレセプターと結合させる； （３）レセプターを、第二の表面に移転する；これは電場の適用によって再び起
こる；第二の表面との接触の後、レセプターを反応によって固定化する； （４）遊離のリガンドを固定化されたレセプターに添加する； （５）リガンドを第二の表面に移転する（電場の助けによって）；ここでそれを
固定化する。
【００４６】 この方法は、何回でも行うことができ、又は繰り返すことができる。
【００４７】 図１ａは、以下において図３ａ〜図３にしたがって記載されるように、図１の
方法を示す。
方法を示す。
【００４８】 図２は、少なくとも２つの表面でリガンド及びレセプターを増殖させる一般的
な方法を説明する。個々の工程は、以下のとおりである： （１）反応の結果として、固体担体の表面上にリガンドを固定化する； （２）リガンドをレセプターと結合させる； （３）レセプターを第二の表面に移転する；これは電場の適用によって再び起こ
る；第二の表面との接触の後、レセプターを反応によって固定化する； （４）遊離のリガンドを固定化されたレセプターに添加する； （５）リガンドを、反応によって表面上に固定化する。
な方法を説明する。個々の工程は、以下のとおりである： （１）反応の結果として、固体担体の表面上にリガンドを固定化する； （２）リガンドをレセプターと結合させる； （３）レセプターを第二の表面に移転する；これは電場の適用によって再び起こ
る；第二の表面との接触の後、レセプターを反応によって固定化する； （４）遊離のリガンドを固定化されたレセプターに添加する； （５）リガンドを、反応によって表面上に固定化する。
【００４９】 この方法は何回でも繰り返すことができる。
【００５０】 図３は、２つの表面上での核酸の酵素的増殖の方法を説明する。この方法の個
々の工程は、簡単に以下のように示される： （１）第一のプライマーＡを、反応によって固体担体の表面上に固定化する； （２）プライマーＡを、核酸の溶液からの相補的フラグメントと結合させる； （３）プライマーＡを、その３’末端でポリメラーゼによって伸長させる； （４）相補的フラグメントを放出させる； （５）第二のプライマーＢを、伸長された核酸の３’末端に付加する； （６）プライマーＢを、その３’末端でポリメラーゼによって伸長させる； （７）伸長された非固定化プライマーＢを、第二の表面上に移転する；これは、
好ましくは電場を適用することによって行なわれ、２つの表面は反対の極性を有
する。第二の表面との接触の後、伸長されたプライマーＢを反応によってそこに
固定化する； （８）付加的なプライマーＡを、伸長されたプライマーＢの３’末端に付加する
； （９）プライマーＡを、その３’末端でポリメラーゼによって伸長させる； （１０）伸長されたプライマーＡを、第一の又はさらなる表面に移転する；これ
も、好ましくは電場の適用によって行われ、２つの表面は反対の極性を有する。
しかし、この場合には、（工程（７）と違って）極性は反転される。表面と接触
させた後、伸長されたプライマーＡを反応によってそこに固定化する。 （１１）さらに別のプライマーＢを、伸長されたプライマーＡの３’末端に付加
する。
々の工程は、簡単に以下のように示される： （１）第一のプライマーＡを、反応によって固体担体の表面上に固定化する； （２）プライマーＡを、核酸の溶液からの相補的フラグメントと結合させる； （３）プライマーＡを、その３’末端でポリメラーゼによって伸長させる； （４）相補的フラグメントを放出させる； （５）第二のプライマーＢを、伸長された核酸の３’末端に付加する； （６）プライマーＢを、その３’末端でポリメラーゼによって伸長させる； （７）伸長された非固定化プライマーＢを、第二の表面上に移転する；これは、
好ましくは電場を適用することによって行なわれ、２つの表面は反対の極性を有
する。第二の表面との接触の後、伸長されたプライマーＢを反応によってそこに
固定化する； （８）付加的なプライマーＡを、伸長されたプライマーＢの３’末端に付加する
； （９）プライマーＡを、その３’末端でポリメラーゼによって伸長させる； （１０）伸長されたプライマーＡを、第一の又はさらなる表面に移転する；これ
も、好ましくは電場の適用によって行われ、２つの表面は反対の極性を有する。
しかし、この場合には、（工程（７）と違って）極性は反転される。表面と接触
させた後、伸長されたプライマーＡを反応によってそこに固定化する。 （１１）さらに別のプライマーＢを、伸長されたプライマーＡの３’末端に付加
する。
【００５１】 この方法は、好ましくは極性反転のサイクルによって、何回でも繰り返される
。
。
【００５２】 図３ａは、図３にしたがった方法を示すが、ここでは、中間層が２つの表面の
間に配置される。この中間層は、ゲル、メンブレン、ポリマー、セラミック及び
／又はいわゆるキャピラリチューブアレイを含む群から選択される。電場が適用
される場合、非固定化分子は中間層を介して第二の表面に移動し、そこで固定化
される。
間に配置される。この中間層は、ゲル、メンブレン、ポリマー、セラミック及び
／又はいわゆるキャピラリチューブアレイを含む群から選択される。電場が適用
される場合、非固定化分子は中間層を介して第二の表面に移動し、そこで固定化
される。
【００５３】 これに対し、より明確にするために、図４は、１つのみの表面上での核酸の酵
素的増殖の基本的な方法を示す。個々の工程は以下のとおりである： （１）第一のプライマーＡを、固体担体の表面上に反応によって固定化する； （２）プライマーＡを、核酸の溶液からの相補的フラグメントと結合させる； （３）プライマーＡを、その３’末端でポリメラーゼによって伸長させる； （４）相補的フラグメントを放出させる； （５）第二のプライマーＢを、伸長された核酸の３’末端に付加する； （６）プライマーＢを、その３’末端でポリメラーゼによって伸長させる； （７）伸長された非固定化プライマーＢを、不可逆的反応によって表面に結合さ
せる；これは、好ましくは電場の適用によって行われ、荷電したプライマーＢを
場に沿って伝導させる； （８）さらなるプライマーＡを、伸長されたプライマーＢの３’末端に付加する
。
素的増殖の基本的な方法を示す。個々の工程は以下のとおりである： （１）第一のプライマーＡを、固体担体の表面上に反応によって固定化する； （２）プライマーＡを、核酸の溶液からの相補的フラグメントと結合させる； （３）プライマーＡを、その３’末端でポリメラーゼによって伸長させる； （４）相補的フラグメントを放出させる； （５）第二のプライマーＢを、伸長された核酸の３’末端に付加する； （６）プライマーＢを、その３’末端でポリメラーゼによって伸長させる； （７）伸長された非固定化プライマーＢを、不可逆的反応によって表面に結合さ
せる；これは、好ましくは電場の適用によって行われ、荷電したプライマーＢを
場に沿って伝導させる； （８）さらなるプライマーＡを、伸長されたプライマーＢの３’末端に付加する
。
【００５４】 この方法は何回でも続けることができる。
【００５５】 これに対し、図５は、第二の表面上に核酸をコピーする方法を示す。個々の工
程は以下のとおりである： （１）固体担体の表面との反応による核酸の固定化； （２）相補的一本鎖のハイブリダイゼーションを通じての二本鎖分子の生成；あ
るいは、相補的フラグメントの化学的又は酵素的連結が起こってもよく、又は相
補的プライマーの化学的又は酵素的伸長でもよい； （３）第二の表面への相補的鎖の移転、第二の表面で、それらを固定化する；こ
れは、好ましくは電場の適用によって、反対の極性を有する２つの表面によって
行なわれる。
程は以下のとおりである： （１）固体担体の表面との反応による核酸の固定化； （２）相補的一本鎖のハイブリダイゼーションを通じての二本鎖分子の生成；あ
るいは、相補的フラグメントの化学的又は酵素的連結が起こってもよく、又は相
補的プライマーの化学的又は酵素的伸長でもよい； （３）第二の表面への相補的鎖の移転、第二の表面で、それらを固定化する；こ
れは、好ましくは電場の適用によって、反対の極性を有する２つの表面によって
行なわれる。
【００５６】 図６は、例えば遺伝子チップ又はメンブレンの場合に用いられるもののような
、２つの表面を説明する意図である多数の場を含む座標の２つの系を示す図であ
る。下の方の表面は、コピーされるべき情報を含み、その情報は、図３に記載さ
れた方法に相当する電場（示していない）の適用によって上の方の表面に移転さ
れる。次いで、それはこの表面上に固定化される。
、２つの表面を説明する意図である多数の場を含む座標の２つの系を示す図であ
る。下の方の表面は、コピーされるべき情報を含み、その情報は、図３に記載さ
れた方法に相当する電場（示していない）の適用によって上の方の表面に移転さ
れる。次いで、それはこの表面上に固定化される。
【００５７】 図７は、遺伝子及びゲノムの合成、及び組換えの方法を示す。個々の工程は以
下のとおりである： （１）プライマーＡを、固体担体の表面上での反応によって固定化する； （２）プライマーＡを、核酸の溶液からの相補的フラグメントと結合させる； （３）プライマーＡを、その３’末端でポリメラーゼによって伸長させる； （４）相補的フラグメントを放出させる； （５）伸長されたプライマーＡの３’末端と相補的である第二のフラグメントを
付加する。ここでは突出３’末端を有する部分的に相補的なフラグメントで充分
である； （６）伸長されたプライマーＡを延長させる； （７）相補的フラグメントを放出させる。工程（５）〜（７）は何回でも繰り返
すことができる； （８）第二のプライマーＢを、ポリメラーゼによってその３’末端で伸長させる
； （９）プライマーＢを、その３’末端でポリメラーゼによって伸長させる； （１０）図１、工程（７）に記載されたとおり、伸長されたプライマーＢを、第
二の表面に移転する。この工程の利点は、不完全に伸長されたプライマーＡ分子
が分離されることである。伸長されたプライマーＢは、伸長反応のために再び用
いられ得る。
下のとおりである： （１）プライマーＡを、固体担体の表面上での反応によって固定化する； （２）プライマーＡを、核酸の溶液からの相補的フラグメントと結合させる； （３）プライマーＡを、その３’末端でポリメラーゼによって伸長させる； （４）相補的フラグメントを放出させる； （５）伸長されたプライマーＡの３’末端と相補的である第二のフラグメントを
付加する。ここでは突出３’末端を有する部分的に相補的なフラグメントで充分
である； （６）伸長されたプライマーＡを延長させる； （７）相補的フラグメントを放出させる。工程（５）〜（７）は何回でも繰り返
すことができる； （８）第二のプライマーＢを、ポリメラーゼによってその３’末端で伸長させる
； （９）プライマーＢを、その３’末端でポリメラーゼによって伸長させる； （１０）図１、工程（７）に記載されたとおり、伸長されたプライマーＢを、第
二の表面に移転する。この工程の利点は、不完全に伸長されたプライマーＡ分子
が分離されることである。伸長されたプライマーＢは、伸長反応のために再び用
いられ得る。
【００５８】 図８は、核酸の選択的突然変異誘発（部位特異的突然変異誘発）の方法を示す
。個々の工程は以下のとおりである： （１）固体担体の表面上に反応によって固定化された核酸Ａ；この核酸は、上述
の方法の生成物のいずれかであってもよい； （２）核酸Ａを、欠陥のある塩基対形成を示す核酸（突然変異フラグメント）の
溶液からの相補的フラグメントと結合させる；プライマーＢも添加する；突然変
異フラグメントは、プライマーＢとも同じであってもよい； （３）突然変異フラグメント及びプライマーＢを伸長させる； （４）伸長された分子を互いに連結する； （５）伸長されたプライマーＢを、図１、工程７に記載されたように、第二の表
面に移転する；このアプローチの利点は、第二の表面が突然変異分子のみを含む
ことである。
。個々の工程は以下のとおりである： （１）固体担体の表面上に反応によって固定化された核酸Ａ；この核酸は、上述
の方法の生成物のいずれかであってもよい； （２）核酸Ａを、欠陥のある塩基対形成を示す核酸（突然変異フラグメント）の
溶液からの相補的フラグメントと結合させる；プライマーＢも添加する；突然変
異フラグメントは、プライマーＢとも同じであってもよい； （３）突然変異フラグメント及びプライマーＢを伸長させる； （４）伸長された分子を互いに連結する； （５）伸長されたプライマーＢを、図１、工程７に記載されたように、第二の表
面に移転する；このアプローチの利点は、第二の表面が突然変異分子のみを含む
ことである。
【００５９】 本発明を、以下の実施例、すなわち２つの表面上で核酸を増殖させる方法を用
いて説明する。
いて説明する。
【００６０】 プライマーＡの合成により、その５’末端でのビオチン標識をもたらし、一方
、プライマーＢには、その５’末端に蛍光標識を与えた。標識は、通常の技術水
準の方法、例えばホスホアミド化学にしたがって作製された。プライマーＡを、
メンブレンＡとカップリングさせた。表面として、紙のメンブレンを使用した。
これは、それが核酸の透過を可能にすることが公知であるためであった。
、プライマーＢには、その５’末端に蛍光標識を与えた。標識は、通常の技術水
準の方法、例えばホスホアミド化学にしたがって作製された。プライマーＡを、
メンブレンＡとカップリングさせた。表面として、紙のメンブレンを使用した。
これは、それが核酸の透過を可能にすることが公知であるためであった。
【００６１】 共有結合による、カップリングされたストレプトアビジンをこのメンブレンに
適用した。カップリングは、ビオチン及びストレプトアビジンの間の相互的な作
用を通じて起こった。プライマーＡに相補的なＤＮＡ鎖を、このプライマーＡに
ハイブリダイズさせた。プライマーＡを、ｔａｑポリメラーゼ又はポリメラーゼ
１のクレノウフラグメントを用いてその３’末端で伸長させた。続く変性は、９
０℃に加熱することによって行った（あるいは、変性は、一般的な変性試薬を用
いて行うこともできる）。プライマーＢをハイブリダイズさせるために、変性溶
液を、ＴＲＩＳ−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液を含有する溶液で置き換えた。次に、
プライマーＢを、プライマーＡと同様にして伸長させた(図３及び４も参照され
たい)。
適用した。カップリングは、ビオチン及びストレプトアビジンの間の相互的な作
用を通じて起こった。プライマーＡに相補的なＤＮＡ鎖を、このプライマーＡに
ハイブリダイズさせた。プライマーＡを、ｔａｑポリメラーゼ又はポリメラーゼ
１のクレノウフラグメントを用いてその３’末端で伸長させた。続く変性は、９
０℃に加熱することによって行った（あるいは、変性は、一般的な変性試薬を用
いて行うこともできる）。プライマーＢをハイブリダイズさせるために、変性溶
液を、ＴＲＩＳ−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液を含有する溶液で置き換えた。次に、
プライマーＢを、プライマーＡと同様にして伸長させた(図３及び４も参照され
たい)。
【００６２】 標準的電気泳動装置を用いて、メンブレンＡをゲル上に置いた（ＰＡＧＥゲル
が好ましい）。先にメンブレンＢをゲルの反対側に適用し、その上で蛍光抗体を
固定化しておいた。この「サンドイッチ」を、枠内に機械的に保持し、そこで安
定化し、次に両緩衝液の分離を確実にするように、すなわちサンドイッチが陰極
室と陽極室とを分離するように設計された電気泳動槽中に置いた。ゲルの厚さに
合わせてある電圧を適用して（この場合３００Ｖ）、続いて変性剤を（−）室中
の電解質中に流入させた（例えば尿素の溶液）。７０℃に加熱した後、電気泳動
を行った。これにより、伸長されたプライマーＢがはがれ、ゲル層を通ってメン
ブレンＢ上に移動し、そこで続いて蛍光抗体上に結合することにより結合し固定
化されることが起こった。
が好ましい）。先にメンブレンＢをゲルの反対側に適用し、その上で蛍光抗体を
固定化しておいた。この「サンドイッチ」を、枠内に機械的に保持し、そこで安
定化し、次に両緩衝液の分離を確実にするように、すなわちサンドイッチが陰極
室と陽極室とを分離するように設計された電気泳動槽中に置いた。ゲルの厚さに
合わせてある電圧を適用して（この場合３００Ｖ）、続いて変性剤を（−）室中
の電解質中に流入させた（例えば尿素の溶液）。７０℃に加熱した後、電気泳動
を行った。これにより、伸長されたプライマーＢがはがれ、ゲル層を通ってメン
ブレンＢ上に移動し、そこで続いて蛍光抗体上に結合することにより結合し固定
化されることが起こった。
【００６３】 次に、サンドイッチを電気泳動槽から取り外し、メンブレンをゲルから除き、
先に記載された方法にしたがって、プライマーＡを再びハイブリダイズさせ、伸
長させた。両メンブレンを、部位情報を維持しながら両メンブレンがその元の配
向で正確に適合することを可能にするように象られた新鮮なＰＡＧＥゲル上にの
せた。次に、上述のように、電気泳動を行い、しかし、メンブレンＢは、以前は
（＋）室（陽極室）中であったが、今度は（−）室（陰極室）に割り当てられる
ようにした。
先に記載された方法にしたがって、プライマーＡを再びハイブリダイズさせ、伸
長させた。両メンブレンを、部位情報を維持しながら両メンブレンがその元の配
向で正確に適合することを可能にするように象られた新鮮なＰＡＧＥゲル上にの
せた。次に、上述のように、電気泳動を行い、しかし、メンブレンＢは、以前は
（＋）室（陽極室）中であったが、今度は（−）室（陰極室）に割り当てられる
ようにした。
【００６４】 あるいは、実験は、微小液体装置中で行うことができ、ここでは、メンブレン
及び電極はしっかりと位置づけられ、一方、陽極室及び陰極室は別個に流出させ
て、相当する試薬を用いて洗い流すことができる。キャピラリ電気泳動において
一般に用いられる弱く架橋されたゲルは、この装置において用いられる。次に、
ゲルは、各方法のために置き換えられる。
及び電極はしっかりと位置づけられ、一方、陽極室及び陰極室は別個に流出させ
て、相当する試薬を用いて洗い流すことができる。キャピラリ電気泳動において
一般に用いられる弱く架橋されたゲルは、この装置において用いられる。次に、
ゲルは、各方法のために置き換えられる。
【００６５】 あるいは、この実験は、活性化可能な反応性プライマーを用いて行うこともで
きる。本発明の文脈において、活性化可能な反応性プライマーは、反応性機能を
有し、その反応性が好適な外的条件の選択によって影響され得るものと理解され
る。これらの外的条件は、化学的、電気化学的又は光化学的性質のものであるこ
とができる。アミノリンカーを介してシステイン単位を有し、そのチオール基が
２’−チオピリジルジスルフィド基の形態で保護されるオリゴヌクレオチドは、
活性化可能な反応性プライマーの一例である。この場合において、メンブレンは
、反応性チオエステルの形態のカルボキシ基を含む。レドックス中性反応条件が
ハイブリダイゼーションにおいて用いられる。場を通って移動した後、伸長され
たプライマーは、メンブレンに達し、そこで還元性条件が適用される。還元性条
件は、例えば、ジチオエリトロール（ｄｉｔｈｉｏｅｒｙｔｒｏｌ）又はジチオ
トレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｒｅｉｔｏｌ）のようなチオールの存在によって
作り出される。ジスルフィド置換反応は、これらの試薬の存在下で起こり、２−
チオピリドンの分割をもたらし、このようにして放出されたチオール基がメンブ
レン上で伸長されたプライマー上でチオエステルと反応し得るという結果となる
。この反応は、最初は、システインの隣接する分子内アミノ基の存在によって反
応してアミドを形成する、チオエステルの形成をもたらす。
きる。本発明の文脈において、活性化可能な反応性プライマーは、反応性機能を
有し、その反応性が好適な外的条件の選択によって影響され得るものと理解され
る。これらの外的条件は、化学的、電気化学的又は光化学的性質のものであるこ
とができる。アミノリンカーを介してシステイン単位を有し、そのチオール基が
２’−チオピリジルジスルフィド基の形態で保護されるオリゴヌクレオチドは、
活性化可能な反応性プライマーの一例である。この場合において、メンブレンは
、反応性チオエステルの形態のカルボキシ基を含む。レドックス中性反応条件が
ハイブリダイゼーションにおいて用いられる。場を通って移動した後、伸長され
たプライマーは、メンブレンに達し、そこで還元性条件が適用される。還元性条
件は、例えば、ジチオエリトロール（ｄｉｔｈｉｏｅｒｙｔｒｏｌ）又はジチオ
トレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｒｅｉｔｏｌ）のようなチオールの存在によって
作り出される。ジスルフィド置換反応は、これらの試薬の存在下で起こり、２−
チオピリドンの分割をもたらし、このようにして放出されたチオール基がメンブ
レン上で伸長されたプライマー上でチオエステルと反応し得るという結果となる
。この反応は、最初は、システインの隣接する分子内アミノ基の存在によって反
応してアミドを形成する、チオエステルの形成をもたらす。
【００６６】 本発明の他の可能な適用は、以下の説明において記載される。
【００６７】 図９は、ゲノムフラグメントのクローニング及びシークエンシングの方法を示
す。 （１）制限消化の後、ＤＮＡフラグメントを、用いるべきプライマーＡ及びＢに
配列を特定する２つの異なるリンカーと連結する。ゲノムフラグメントを、図３
に示す方法にしたがって選抜する。増殖過程において、種々のリンカーを有する
フラグメントのみが増幅される。 （２）こうして選抜され増幅されたフラグメントを、ハイブリダイゼーションに
よって分別する（染色体ウォーキング）。 （３）分別されたフラグメントを個別に増殖させ、制限エンドヌクレアーゼの使
用によって分割し、サブクローニングする。 （４）サブクローニングしたフラグメントは、ハイブリダイゼーション技術を用
いて再び分別することができる。
す。 （１）制限消化の後、ＤＮＡフラグメントを、用いるべきプライマーＡ及びＢに
配列を特定する２つの異なるリンカーと連結する。ゲノムフラグメントを、図３
に示す方法にしたがって選抜する。増殖過程において、種々のリンカーを有する
フラグメントのみが増幅される。 （２）こうして選抜され増幅されたフラグメントを、ハイブリダイゼーションに
よって分別する（染色体ウォーキング）。 （３）分別されたフラグメントを個別に増殖させ、制限エンドヌクレアーゼの使
用によって分割し、サブクローニングする。 （４）サブクローニングしたフラグメントは、ハイブリダイゼーション技術を用
いて再び分別することができる。
【００６８】 図１０は、ゲノムフラグメントの機能解析の方法を示す。 （１）ＤＮＡフラグメントを、図９に記載されるように分別する。 （２）一本鎖のフラグメントを化学的又は酵素的合成によって増大させ、二本鎖
を生成する。 （３）フラグメントを、因子（例えばリプレッサータンパク、活性化因子タンパ
ク）と接触させる。核酸の特異的フラグメントとの特異的結合の証明により、ゲ
ノムの文脈において機能的割り当てが起こることが可能になる。
を生成する。 （３）フラグメントを、因子（例えばリプレッサータンパク、活性化因子タンパ
ク）と接触させる。核酸の特異的フラグメントとの特異的結合の証明により、ゲ
ノムの文脈において機能的割り当てが起こることが可能になる。
【００６９】 図１１は、遺伝子発現の平行定量化の方法を示す。 （１）ｍＲＮＡからの逆転写の後、図９に記載するように、ＤＮＡフラグメント
にリンカーを提供し、選抜する。 （２）ｃＤＮＡフラグメントを分別する。 （３）ｃＤＮＡフラグメントをシークエンシングする。 （４）分別され配列決定されたライブラリーのコピーを、健康な細胞由来の細胞
性ｍＲＮＡと接触させる。特異的ハイブリダイゼーション事象を、公知の技術水
準の方法（例えば蛍光レポーター基）を用いて確認する。 （５）同様の方式で、病理学的に変更された細胞（例えば腫瘍細胞）由来の細胞
性ｍＲＮＡを、ライブラリーの別のコピーと接触させる。 （６）このようにして定量された遺伝子発現試料の比較により、疾患と関連する
遺伝子の同定が可能になる。
にリンカーを提供し、選抜する。 （２）ｃＤＮＡフラグメントを分別する。 （３）ｃＤＮＡフラグメントをシークエンシングする。 （４）分別され配列決定されたライブラリーのコピーを、健康な細胞由来の細胞
性ｍＲＮＡと接触させる。特異的ハイブリダイゼーション事象を、公知の技術水
準の方法（例えば蛍光レポーター基）を用いて確認する。 （５）同様の方式で、病理学的に変更された細胞（例えば腫瘍細胞）由来の細胞
性ｍＲＮＡを、ライブラリーの別のコピーと接触させる。 （６）このようにして定量された遺伝子発現試料の比較により、疾患と関連する
遺伝子の同定が可能になる。
【００７０】 図１２は、検出方法におけるシグナル対ノイズ比の改良の手段としての本方法
の使用を示す。 （１）図９又は１１に記載された方法にしたがって、ライブラリーを用意する。 （２）ライブラリーを、解析すべき一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡと接触させる。 （３）ハイブリダイズするＤＮＡ又はＲＮＡを、部位情報を維持しながら反対の
表面に移転させる。 （４）工程２及び３を繰り返す。 （５）工程４は何回でも行い、又は繰り返すことができる。シグナルの測定は、
走査電気化学顕微鏡（ＳＥＣＭ）又は原子力顕微鏡（ＡＦＭ）のような高感度の
走査技術を用いて行うことができる。
の使用を示す。 （１）図９又は１１に記載された方法にしたがって、ライブラリーを用意する。 （２）ライブラリーを、解析すべき一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡと接触させる。 （３）ハイブリダイズするＤＮＡ又はＲＮＡを、部位情報を維持しながら反対の
表面に移転させる。 （４）工程２及び３を繰り返す。 （５）工程４は何回でも行い、又は繰り返すことができる。シグナルの測定は、
走査電気化学顕微鏡（ＳＥＣＭ）又は原子力顕微鏡（ＡＦＭ）のような高感度の
走査技術を用いて行うことができる。
【００７１】 図１３は、タンパク質の機能的割り当てのために用いられる場合の本発明の方
法を示す。 （１）図９又は１１に記載された方法にしたがって、ライブラリーを編集する。
ここで、用いた２つのリンカーの一方は、ＲＮＡポリメラーゼの開始配列を含む
。プロモーターも、図７に記載された方法によって、後に付加することができる
。 （２）ＤＮＡフラグメントを分別する。 （３）化学的又は酵素的合成を用いて一本鎖フラグメントを二本鎖にする。 （４）インビトロ転写を用いて二本鎖ＤＮＡフラグメントをＲＮＡに翻訳する。
こうして生成されたＲＮＡを、電場の適用及び部位情報の提供によって新たな表
面に移転する。 （５）ＲＮＡライブラリーを、インビトロ翻訳によってタンパク質に翻訳する。
こうして生成されたタンパク質を、電場の適用及び部位情報の提供によって新た
な表面に移転する。タンパク質は広く異なる正味の電荷を有する可能性があるの
で、逆の極性で移転工程を行ってインビトロ翻訳工程を繰り返すことが好ましい
。 （６）タンパク質ライブラリーを、１以上の因子（タンパク質、ＲＮＡｓ、ＤＮ
Ａｓ、生物学的又は化学的起源の他の分子）と接触させる。特異的結合事象は、
公知の技術水準の方法によって明らかにされる。特異的結合の証明により、機能
的相互作用の同時の検出が可能になる。
法を示す。 （１）図９又は１１に記載された方法にしたがって、ライブラリーを編集する。
ここで、用いた２つのリンカーの一方は、ＲＮＡポリメラーゼの開始配列を含む
。プロモーターも、図７に記載された方法によって、後に付加することができる
。 （２）ＤＮＡフラグメントを分別する。 （３）化学的又は酵素的合成を用いて一本鎖フラグメントを二本鎖にする。 （４）インビトロ転写を用いて二本鎖ＤＮＡフラグメントをＲＮＡに翻訳する。
こうして生成されたＲＮＡを、電場の適用及び部位情報の提供によって新たな表
面に移転する。 （５）ＲＮＡライブラリーを、インビトロ翻訳によってタンパク質に翻訳する。
こうして生成されたタンパク質を、電場の適用及び部位情報の提供によって新た
な表面に移転する。タンパク質は広く異なる正味の電荷を有する可能性があるの
で、逆の極性で移転工程を行ってインビトロ翻訳工程を繰り返すことが好ましい
。 （６）タンパク質ライブラリーを、１以上の因子（タンパク質、ＲＮＡｓ、ＤＮ
Ａｓ、生物学的又は化学的起源の他の分子）と接触させる。特異的結合事象は、
公知の技術水準の方法によって明らかにされる。特異的結合の証明により、機能
的相互作用の同時の検出が可能になる。
【００７２】 図１４は、本発明の方法がいかにしてコンビナトリアルタンパク質ライブラリ
ーをスクリーニングするために使用されるかを示す。 （１）オリゴヌクレオチドのライブラリーを、公知の技術水準の方法にしたがっ
て化学合成により作製する。 （２）オリゴヌクレオチドのライブラリーを、図７に記載される方法によって３
’及び５’末端の方向に伸長させる。伸長される配列は、例えば単鎖抗体の定常
領域のコードを提供する。 （３）化学的又は酵素的合成を用いて一本鎖フラグメントを二本鎖にする。 （４）インビトロ転写を用いて二本鎖ＤＮＡフラグメントをＲＮＡに翻訳する。
こうして生成されたＲＮＡを、電場の適用及び部位情報の提供によって新たな表
面に移転する。 （５）ＲＮＡライブラリーを、インビトロ翻訳によってタンパク質に翻訳する。
こうして生成されたタンパク質を、電場の適用及び部位情報の提供によって新た
な表面に移転する。 （６）タンパク質ライブラリーを、１以上の因子（タンパク質、ＲＮＡｓ、ＤＮ
Ａｓ、生物学的又は化学的起源の他の分子）と接触させる。特異的結合事象は、
公知の技術水準の方法によって明らかにされる。特異的結合の証明により、機能
的相互作用の同時の検出が可能になる。
ーをスクリーニングするために使用されるかを示す。 （１）オリゴヌクレオチドのライブラリーを、公知の技術水準の方法にしたがっ
て化学合成により作製する。 （２）オリゴヌクレオチドのライブラリーを、図７に記載される方法によって３
’及び５’末端の方向に伸長させる。伸長される配列は、例えば単鎖抗体の定常
領域のコードを提供する。 （３）化学的又は酵素的合成を用いて一本鎖フラグメントを二本鎖にする。 （４）インビトロ転写を用いて二本鎖ＤＮＡフラグメントをＲＮＡに翻訳する。
こうして生成されたＲＮＡを、電場の適用及び部位情報の提供によって新たな表
面に移転する。 （５）ＲＮＡライブラリーを、インビトロ翻訳によってタンパク質に翻訳する。
こうして生成されたタンパク質を、電場の適用及び部位情報の提供によって新た
な表面に移転する。 （６）タンパク質ライブラリーを、１以上の因子（タンパク質、ＲＮＡｓ、ＤＮ
Ａｓ、生物学的又は化学的起源の他の分子）と接触させる。特異的結合事象は、
公知の技術水準の方法によって明らかにされる。特異的結合の証明により、機能
的相互作用の同時の検出が可能になる。
【００７３】 ここで示された代替的な方法のすべてにおいて、それぞれの方法順序のそれぞ
れの移転工程の中で、部位情報を維持しながら、移転の（幾何学的）スケールを
変更し、低減し、及び／又は増大させることが可能である。これは、例えば移転
をする元の又は先のアレイの幾何学が最初のアレイ又は標的アレイの幾何学と同
一でない場合、実際的であり得る。
れの移転工程の中で、部位情報を維持しながら、移転の（幾何学的）スケールを
変更し、低減し、及び／又は増大させることが可能である。これは、例えば移転
をする元の又は先のアレイの幾何学が最初のアレイ又は標的アレイの幾何学と同
一でない場合、実際的であり得る。
【図１】 図１は、２つの表面上でのリガンド及びレセプターの増殖についての一般的な
方法を説明する。 図１ａは、以下において図３ａ〜図３にしたがって記載されるように、図１の
方法を示す。
方法を説明する。 図１ａは、以下において図３ａ〜図３にしたがって記載されるように、図１の
方法を示す。
【図２】 図２は、少なくとも２つの表面でリガンド及びレセプターを増殖させる一般的
な方法を説明する。
な方法を説明する。
【図３】 図３は、２つの表面上での核酸の酵素的増殖の方法を説明する。 図３ａは、図３にしたがった方法を示すが、ここでは、中間層が２つの表面の
間に配置される。
間に配置される。
【図４】 図４は、１つのみの表面上での核酸の酵素的増殖の基本的な方法を示す。
【図５】 図５は、第二の表面上に核酸をコピーする方法を示す。
【図６】 図６は、例えば遺伝子チップ又はメンブレンの場合に用いられるもののような
、２つの表面を説明する意図である多数の場を含む座標の２つの系を示す図であ
る。
、２つの表面を説明する意図である多数の場を含む座標の２つの系を示す図であ
る。
【図７】 図７は、遺伝子及びゲノムの合成、及び組換えの方法を示す。
【図８】 図８は、核酸の選択的突然変異誘発（部位特異的突然変異誘発）の方法を示す
。
。
【図９】 図９は、ゲノムフラグメントのクローニング及びシークエンシングの方法を示
す。
す。
【図１０】 図１０は、ゲノムフラグメントの機能解析の方法を示す。
【図１１】 図１１は、遺伝子発現の平行定量化の方法を示す。
【図１２】 図１２は、検出方法におけるシグナル対ノイズ比の改良の手段としての本方法
の使用を示す。
の使用を示す。
【図１３】 図１３は、タンパク質の機能的割り当てのために用いられる場合の本発明の方
法を示す。
法を示す。
【図１４】 図１４は、本発明の方法がいかにしてコンビナトリアルタンパク質ライブラリ
ーをスクリーニングするために使用されるかを示す。
ーをスクリーニングするために使用されるかを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 クルスマン、スベン ドイツ国、デー‐10709・ベルリン、パウ ルスボーナー・シュトラーセ 83アー (72)発明者 クライン、トーマス ドイツ国、デー‐14109・ベルリン、フィ リップ−フランク−ベク ９ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA20 BA63 CA01 CA11 HA03 HA11 HA19 4B063 QA01 QA13 QA18 QQ13 QQ42 QQ52 QQ79 QR08 QR14 QR31 QR32 QR35 QR48 QR56 QR62 QR80 QR84 QS15 QS16 QS25 QS34 QS35 QS39 QX02 QX04 QX07
Claims (27)
- 【請求項１】 リガンド及びレセプターを少なくとも２つの表面上で増殖さ
せる方法であって、以下のサイクルの１以上を含む方法： ａ）固相の第一の表面上への、リガンドの固定化； ｂ）レセプターの溶液の添加、及びリガンドへの相補的なレセプターの結合； ｃ）さらなる表面へのレセプターの移転、及びその位置でのレセプターの固定化
； ｄ）固定化されたレセプターに対するさらなるリガンドの付着； ｅ）表面へのリガンドの移転、及びその位置での固定化。 - 【請求項２】 工程（ｃ）及び（ｅ）における表面が、第一の表面から空間
的に分離されている第二の表面である、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 工程（ｃ）及び（ｅ）における移転が、電場の適用によって
達成される、請求項１又は２記載の方法。 - 【請求項４】 電場が、第一及び第二の表面の間で適用される、請求項２及
び３記載の方法。 - 【請求項５】 少なくとも２つの表面上での核酸の酵素的増幅方法であって
、以下の増幅サイクルの１以上を含む方法： ａ）固相の第一の表面の１つの上への第一のプライマーの固定化； ｂ）核酸の溶液の添加及び第一のプライマーへの相補的フラグメントの結合； ｃ）ポリメラーゼによる、相補的フラグメントに対応する、第一のプライマーの
その３’末端での伸長； ｄ）相補的フラグメントの放出； ｅ）伸長された核酸の第二のプライマーの３’末端への付着； ｆ）ポリメラーゼによる、第二のプライマーのその３’末端での伸長； ｇ）別の表面への第二のプライマーの移転、及び伸長されたプライマーの固定化
； ｈ）別の第一のプライマーの、第二の伸長されたプライマーの３’末端への付着
； - 【請求項６】 工程（ｇ）における表面が、第一の表面から空間的に分離さ
れている第二の表面である、請求項５記載の方法。 - 【請求項７】 工程（ｇ）における移転が、電場の適用によって達成される
、請求項５又は６記載の方法。 - 【請求項８】 電場が、第一及び第二の表面の間で適用される、請求項６又
は７記載の方法。 - 【請求項９】 以下の増幅工程が、第二の表面への移転の後に起こる、請求
項６記載の方法： ａ）ポリメラーゼによる、相補的フラグメントに対応する、第一のプライマーの
その３’末端への伸長； ｂ）伸長されたプライマーの、第一又は別の表面への移転、及びプライマーの固
定化； ｃ）伸長された第一のプライマーの３’末端への別の第二のプライマーの付着。 - 【請求項１０】 第一の表面から第二の表面へ核酸をコピーする方法であっ
て、方法の以下の工程を含む方法： ａ）固体担体の表面との反応を通じた核酸の固定化； ｂ）ｂａ）相補的一本鎖のハイブリダイゼーション、ｂｂ）相補的フラグメント
の化学的又は酵素的連結、又はｂｃ）相補的プライマーの化学的又は酵素的伸長
、による二本鎖分子の生成； ｃ）第二の表面への相補鎖の移転、及びそれらの固定化。 - 【請求項１１】 工程（ｃ）における移転が、第一及び第二の表面の間で適
用される電場の適用によって起こる、請求項１０記載の方法。 - 【請求項１２】 固体担体上の核酸が、二次元的に配置され、部位情報を維
持しながら、その秩序で移転される、請求項１０記載の方法。 - 【請求項１３】 固相材料が、有機又は無機材料あるいはこれらの材料のハ
イブリッドから選択され、二次元又は三次元マトリックスを表す、請求項１〜１
２のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１４】 固定化が、共有結合又は非共有結合を通じて起こる、請求
項１〜１３のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１５】 核酸、リガンド、レセプター又はそれらの誘導体が、検出
可能な標識と共に提供される、請求項１〜１４のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１６】 標識が、放射性同位元素、安定同位体、酵素、免疫反応性
化合物、蛍光性もしくは発光性化学物質、発色団、金属又は荷電粒子の群から選
択される、請求項１５記載の方法。 - 【請求項１７】 核酸の溶液が、Ｄ−及び／又はＬ−核酸を含有する、請求
項１〜１６のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１８】 核酸及び／又はリガンド／レセプターが透過し得る中間層
が、表面の間に配置されている、請求項１〜１７のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１９】 中間層が、ゲル、メンブレン、ポリマー、セラミック及び
／又はいわゆるキャピラリチューブアレイを含む群から選択される、請求項１８
記載の方法。 - 【請求項２０】 核酸が、上部の正に荷電した基と共に提供される、請求項
１〜１９のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項２１】 それぞれの方法順序の中でのそれぞれの移転工程中に、そ
のスケールが、部位情報を維持しながら、低減及び／又は増大され得る、請求項
１〜２０のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項２２】 ＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡのゲノムフラグメントをクロ
ーニングするための、請求項５〜９記載の方法の用途。 - 【請求項２３】 制限消化の後のサブクローニングのための、請求項２２記
載の用途。 - 【請求項２４】 免疫学的リガンド／レセプター対を強化するための、請求
項１記載の方法の用途。 - 【請求項２５】 リガンドシグナルを強化するための、請求項１記載の方法
の用途。 - 【請求項２６】 ハイブリダイゼーション技術を用いて隣接フラグメントを
分別する（染色体ウォーキング）ための、請求項５記載の方法の用途。 - 【請求項２７】 遺伝子チップをコピーするための、請求項１０記載の方法
の用途。
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2001
- 2001-05-25 US US09/866,513 patent/US6534271B2/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (3)
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