CN110352243A - 使用抗体的靶标核酸浓缩和回收方法 - Google Patents

使用抗体的靶标核酸浓缩和回收方法 Download PDF

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Abstract

本发明的目的是提供一种有效的核酸回收方法，该方法能够从含有核酸的样品中浓缩核酸，使得所述核酸可用于基因扩增反应。为了解决该问题，本发明人发现了通过靶向与核酸结合的蛋白质(下文中也称为核蛋白或蛋白质‑核酸复合物)而不是靶向核酸本身，或具体地，通过使针对蛋白质的特异性抗体起作用，可以与蛋白质同时捕获核酸，从而完成本发明。此外，本发明人已经发现，如果动物细胞、细菌、病毒等具有与细胞中(在病毒的情况下在包膜中)存在的蛋白质相结合的核酸，则在用表面活性剂处理细胞后，可以通过使用针对核蛋白的特异性抗体捕获并回收结合的核酸，而不将核酸从蛋白质中解离。

Description

使用抗体的靶标核酸浓缩和回收方法
技术领域
本发明涉及从含有核酸的样品如生物样品中浓缩和回收靶核酸的技术。
背景技术
Boom方法(非专利文献1)作为从生物样品、细菌、病毒等中浓缩和回收核酸的方法而广泛应用。在该方法中，首先，在含有硫氰酸根离子、氯酸根离子等的离液盐的存在下，核酸与硅胶颗粒结合，然后，用约70％的醇水溶液(如乙醇水溶液和异丙醇水溶液)洗涤二氧化硅珠，以除去离液盐和污染物。随后，干燥二氧化硅珠以除去醇(例如乙醇和异丙醇)，然后可以用低浓度缓冲液或水分离和回收吸附在二氧化硅珠上的核酸。回收的核酸适用于基因扩增反应(PCR(聚合酶链反应)、LAMP(环介导的等温扩增)等)、与逆转录组合的基因扩增反应(逆转录PCR(RT-PCR)、使用逆转录酶的LAMP等)。
从人类生物样品(血液、尿液、组织等)中回收的核酸用于疾病诊断并且用作用于预测治疗剂效果的指标。例如，对于肺癌患者的EGFR(表皮生长因子受体)基因的突变检查是通过使用从肺癌组织中浓缩和回收的DNA以boom方法等进行，并且已经临床应用作为用于确定用酪氨酸激酶抑制剂治疗的效果的重要检查。通常，来自癌症患者的活组织检查即用于活检目的的一块组织的收集，是高度侵入性的。特别是对于易于复发的肺癌患者，经常需要活组织检查，但由于侵入性问题，在许多情况下很难进行活组织检查。作为替代，近年来还研究了回收和检查在血液中循环的DNA片段(ccfDNA；无循环细胞的DNA)的方法。已知真核生物染色体DNA包裹在组蛋白蛋白质周围，当由于细胞凋亡而发生细胞死亡时，DNA在未包裹在组蛋白周围的区域被破坏；因此，据报道，只有包裹在组蛋白周围的区域可以作为ccfDNA存在而不被破坏(非专利文献2)。该ccfDNA也可以通过应用boom方法作为DNA片段回收，并且已经出售了试剂盒(“QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit”，目录号55114，由Qiagen制造)。
用于传染病检查的细菌和病毒测试在临床上应用作为POC测试，例如使用针对细胞膜和细胞内蛋白质的特异性抗体的免疫层析法。其中，特别是对于流感感染，POC测试通常由于在感染早期缺乏灵敏度而导致假阴性，并且还开发了使用流感病毒RNA的高灵敏度检测系统。已知流感病毒RNA以螺旋方式包裹在包膜(envelope)内被称为NP蛋白的核蛋白周围，并且该RNA可通过利用boom方法的方法回收。
专利文献1公开了使用与细胞mRNA蛋白质(mRNP)复合物中包含的RNA结合蛋白或RNA缔合蛋白质相结合的配体、配体特异性的结合分子以及结合分子所附着的固体支持物来分离和表征内源性mRNP复合物的方法。
引用列表
专利文献
专利文献1：日本未审查专利申请公开No.2004-520002
非专利文献
非专利文献1：J.Clin.Microbiol.1990(28)495-503.
非专利文献2：Cell，2016(164)57-68.
发明概述
技术问题
在boom方法中或在应用boom方法的浓缩和回收核酸的方法中，当浓缩和回收的核酸用作扩增反应的模板时，如果混入离液盐，则可抑制反应，因此，需要用不会引起吸附在其上的核酸的解离的高浓度的醇(约70％的醇水溶液，如乙醇水溶液、异丙醇水溶液等)充分洗涤二氧化硅珠。此外，如果将洗涤溶液中的醇混入，则可抑制反应，因此需要对二氧化硅珠进行充分的干燥操作。因此，期望通过消除离液盐和醇的使用来实现核酸回收操作的时间减少和简化。
本发明的目的是提供一种有效的核酸回收方法，该方法能够在不使用离液盐或醇的情况下从含有核酸的样品中浓缩核酸。
解决问题的方案
为了解决该问题，本发明人发现了通过使用与核酸结合的蛋白质(下文中也称为核蛋白或蛋白质-核酸复合物)作为靶标而不是使用核酸本身作为靶标，或具体地，通过使针对蛋白质的特异性抗体起作用，可以与蛋白质同时捕获核酸，从而完成本发明。此外，本发明人已经发现，如果动物细胞、细菌、病毒等具有与细胞中(在病毒的情况下在包膜中)存在的蛋白质相结合的核酸，则可以用表面活性剂处理与核蛋白结合的核酸，并由此通过使用针对所述核蛋白的特异性抗体捕获、浓缩和回收所述核酸，而不从蛋白质中解离所述核酸用于浓缩和回收(术语“浓缩”可以替换表述为“提取”或“捕获”，以下同样适用)。
因此，本发明提供以下[实施方案1]至[实施方案27]。
[实施方案1]
浓缩核酸的方法，包括以下步骤(a)至(c)：
(a)提供含有蛋白质-核酸复合物的样品，其中蛋白质和核酸是结合的；
(b)使所述样品、与所述蛋白质特异性反应的抗体和能够吸附所述抗体的载体相互接触；和
(c)从所述样品中回收所述载体，以便在所述载体上获得浓缩的核酸。
[实施方案2]
根据实施方案1所述的方法，进一步包括步骤(d)将所述浓缩的核酸与所述载体分离。
[实施方案3]
根据实施方案1或2所述的方法，其中在步骤(b)中，接触的所述载体是抗体支持载体，其中所述抗体由所述载体支持。
[实施方案4]
根据实施方案3所述的方法，其中在步骤(d)中，通过免疫反应从附着于所述抗体支持载体的蛋白质-核酸复合物中释放所述核酸。
[实施方案5]
根据实施方案1至4中任一项所述的方法，其中在步骤(b)中，所述抗体和所述蛋白质-核酸复合物彼此结合以形成抗体-蛋白质-核酸复合物。
[实施方案6]
根据实施方案5所述的方法，其中在步骤(d)中，从通过物理吸附而吸附于所述载体的抗体-蛋白质-核酸复合物中释放所述核酸。
[实施方案7]
根据实施方案1至6所述的方法，
在步骤(a)之前、在步骤(a)中或在步骤(a)与步骤(b)之间进一步包括以下步骤(a′)：
(a′)将表面活性剂添加到含有所述蛋白质-核酸复合物的样品中。
[实施方案8]
根据实施方案7所述的方法，其中所述表面活性剂是选自非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂和两性表面活性剂中的一种或多种。
[实施方案9]
根据实施方案1至8任一项所述的方法，其中所述样品是选自生物样品和含有病原微生物或病毒的样品中的一种或多种。
[实施方案10]
根据实施方案9所述的方法，其中所述生物样品是动物细胞。
[实施方案11]
根据实施方案10所述的方法，其中所述生物样品是选自血液、血浆、血清、尿液、粪便、胆汁、胰液、鼻涕和鼻腔/咽拭子液中的一种或多种。
[实施方案12]
根据实施方案9所述的方法，其中所述含有病原微生物或病毒的样品是病原微生物或病毒的培养物。
[实施方案13]
根据实施方案9所述的方法，其中所述病毒是流感病毒。
[实施方案14]
根据实施方案1至13任一项所述的方法，其中所述蛋白质是核蛋白。
[实施方案15]
根据实施方案14所述的方法，其中所述核蛋白是选自组蛋白和核衣壳蛋白中的一种或多种。
[实施方案16]
根据实施方案1至15任一项所述的方法，其中与所述蛋白质-核酸复合物特异性反应的所述抗体是识别核蛋白的抗体。
[实施方案17]
根据实施方案16所述的方法，其中所述识别核蛋白的抗体是选自抗组蛋白抗体和识别核衣壳蛋白的抗体中的一种或多种。
[实施方案18]
根据实施方案1至17任一项所述的方法，其中所述核酸是不包括信使RNA(mRNA)的核酸。
[实施方案19]
根据实施方案1至18任一项所述的方法，其中所述所述核酸选自由以下各项组成的组：藻类DNA、藻类RNA、古细菌DNA、古细菌RNA、细菌DNA、细菌RNA、催化DNA、环状DNA、链状DNA、十字形DNA、真菌DNA、真菌RNA、蠕虫DNA、蠕虫RNA、基因间DNA、isochore、microRNA、肿瘤DNA、肿瘤RNA、核RNA、植物DNA、植物RNA、原生动物DNA、原生动物RNA、重组DNA、反转录元件、核糖体DNA、核糖体RNA、卫星DNA、卫星RNA、转移RNA、非翻译RNA、病毒DNA和病毒RNA。
[实施方案20]
根据实施方案1至19任一项所述的方法，其中所述蛋白质-核酸复合物是通过所述蛋白质和所述核酸之间的氢键形成的。
[实施方案21]
根据实施方案1至19任一项所述的方法，其中所述蛋白质-核酸复合物是仅通过所述蛋白质和所述核酸之间的氢键形成的。
[实施方案22]
根据实施方案1至21所述的方法，其中所述蛋白质-核酸复合物在所述蛋白质和所述核酸之间不具有共价键。
[实施方案23]
根据实施方案1至22所述的方法，其中在步骤(d)中，不包括用蛋白酶处理所述蛋白质-核酸复合物的步骤。
[实施方案24]
根据实施方案1至22所述的方法，其中不包括用蛋白酶处理所述蛋白质-核酸复合物的步骤。
[实施方案25]
根据实施方案1至22所述的方法，其中不包括持续0.0分钟或更长、1.0分钟或更长、2.0分钟或更长、5.0分钟或更长、10分钟或更长或20分钟或更长的超声处理步骤。
[实施方案26]
根据实施方案1至22所述的方法，其中不以0％或更多、0.01％或更多、0.02％或更多、0.05％或更多、0.1％或更多、0.2％或更多、0.5％或更多、1.0％或更多、2.0％或更多或5.0％或更多的量使用甲醛。
[实施方案27]
根据实施方案1至22所述的方法，其中不以0单位或更多、0.01单位或更多、0.02单位或更多、0.05单位或更多、0.1单位或更多、0.2单位或更多、0.5单位或更多、1.0单位或更多、2.0单位或更多或5.0单位或更多的量使用核糖核酸酶(RNase)。
本发明的有益效果
根据本发明，消除离液盐和醇的使用导致核酸回收操作的时间减少和简化，并且能够提供在样品中浓缩和回收蛋白质-核酸复合物或核酸的方法。在样品中浓缩和回收蛋白质-核酸复合物或核酸的方法是本发明的一个方面，并且在样品中捕获蛋白质-核酸复合物或核酸的方法是本发明的另一个方面。
附图简述
[图1]图1显示了分别通过使用与抗体结合的磁性颗粒和未与抗体结合的磁性颗粒从甲型流感病毒中回收的RNA的量。
[图2]图2显示了分别通过使用与抗体结合的磁性颗粒和未与抗体结合的磁性颗粒从乙型流感病毒中回收的RNA的量。
[图3]图3显示了当使用与抗体结合的磁性颗粒浓缩RNA时，用各种表面活性剂处理的甲型流感病毒的RNA的回收率。
[图4]图4显示了分别通过使用与抗组蛋白抗体结合的磁性颗粒和未与抗组蛋白抗体结合的磁性颗粒，从其中培养人肺癌细胞系NCI-H1975的无血清培养基中回收的DNA中EGFR基因T790M突变的检测结果。
具体实施方案
现在将详细描述本发明的实施方案。
如本文所用，“核酸”是核糖核酸(下文中也称为RNA)和脱氧核糖核酸(下文中也称为DNA)的通用术语，并且是指由碱基、糖和磷酸组成并通过磷酸二酯键连接的核苷酸。在本发明中，待浓缩和回收的核酸可以是DNA或RNA，并且待靶向的核酸可以是片段化的或不是片段化的。核酸可以来源于任何生物体，包括动物、植物、微生物，和病毒；然而，本发明不限于此。核酸可以是细胞核中的核酸，或由线粒体、叶绿体、核仁等代表的细胞器所保留的核外核酸。此外，核酸可以是人工合成的核酸，或通常用作载体的质粒或病毒载体。
如本文所用，“蛋白质”是指其中通过酰胺键(也称为肽键)连接α-氨基酸并且除氨基酸外还可含有糖、色素等的聚合化合物。
如本文所用，“蛋白质-核酸复合物”意指其中蛋白质和核酸相结合的复合物。蛋白质-核酸复合物通常以核蛋白为例，更具体地以形成染色质的组蛋白、核糖核蛋白、端粒酶、鱼精蛋白等为例。
在本发明中，蛋白质没有特别限制，只要蛋白质能够与样品中包含的核酸结合即可；然而，通常，核蛋白是合适的靶标。对于核蛋白，组蛋白适用于真核生物，并且各自的核蛋白适用于细菌和病毒。对于病毒的核蛋白，优选核衣壳蛋白。
蛋白质和本发明的核酸的结合方式没有特别限制，可以通过离子键、疏水键、共价键等键合；然而，蛋白质和核酸优选通过离子键或疏水键键合。这是因为通常认为在离子键或疏水键的情况下蛋白质和核酸能够容易地分离。
适用于本发明的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，只要该抗体能够捕获与核酸结合的蛋白质(蛋白质-核酸复合物)即可。尽管可以使用市售产品作为抗体，但也可以通过已知方法独特地制备抗体。
为了产生多克隆抗体，使用例如小鼠、大鼠、仓鼠、兔、山羊、绵羊、鸡等作为待免疫的动物。在向动物进行一次或多次皮下、皮内或腹膜内施用抗原后，可从血清中获得抗血清。当蛋白质或肽用作抗原时，优选通过与具有免疫刺激作用的补充液体的混合物实现免疫。
单克隆抗体可以通过已知的单克隆抗体生产方法根据例如长宗香明和寺田弘，“Monoclonal Antibodiy”，广川书店(1990)，和James WGolding，“Monoclonal Antibody”，第3版，Academic Press，1996进行生产。
在本发明中，例如，抗体优选为识别核蛋白的抗体，更优选为抗组蛋白抗体和识别病毒核衣壳蛋白的抗体。
用于抗体产生的抗原是，例如，血液、血清或血浆中的ccfDNA(circulating cellfree DNA，无循环细胞DNA，也称为无细胞DNA)，或在后述动物细胞情况下的组蛋白，在来源于后述病原微生物情况下的各自的核蛋白，和在来源于病毒情况下的核衣壳蛋白，以及当其部分片段(肽)可用时，粗制蛋白如匀浆也是可用的(粗制：天然状态的；未加工的；或未处理的)。
用于使市售的或生产的抗体固定的载体不受特别限制，只要所述抗体能够与载体结合即可，并且其实例包括添加了对免疫球蛋白具有高亲和力的蛋白A或蛋白G的树脂和磁珠，其中蛋白A和蛋白G已应用于抗体纯化。常规用作免疫层析测试条的不溶性膜载体的已知膜也是可用的。膜的实例包括由聚乙烯、聚对苯二甲酸乙酯、尼龙、玻璃、多糖如纤维素和纤维素衍生物和陶瓷制成的纤维制成的膜。其具体实例包括可从Sartorius、Millipore、东洋滤纸公司、Whatman等商购得到的玻璃纤维滤纸和纤维素滤纸。
对于制备能够吸附抗体的载体的方法，可以使用US2010/0248218或JP3899029专利公开(B2)中描述的方法，或本领域技术人员已知的任何方法。更具体地，特异性结合配偶体如生物素-抗生物素蛋白质、生物素-链霉抗生物素蛋白、还原型谷胱甘肽-谷胱甘肽S-转移酶等之一可与抗体缀合，而另一个由载体支持，以制备能够吸附抗体的载体。或者，可通过载体支持特异性结合抗体的分子，例如蛋白质A、蛋白质L和蛋白质G，以制备能够吸附抗体的载体。
在作为本发明实施方案的方法中，在将抗体固定在载体上后，使样品与固定有抗体的载体接触，以使固定有抗体的载体捕获蛋白质-核酸复合物。在这种情况下，所述捕获优选通过免疫反应实现。在作为本发明的另一个实施方案的方法中，在允许与蛋白质-核酸复合物特异性反应的抗体起作用后，通过蛋白质-核酸复合物与抗体的结合获得的蛋白质-核酸-抗体复合物是由载体捕获的。在这种情况下的捕获优选通过物理吸附(疏水、静电相互作用等)来实现。在优选的方法中，在将抗体固定在载体上后，使样品与固定有抗体的载体接触，以使固定有抗体的载体捕获蛋白质-核酸复合物。与抗体结合的磁性颗粒可以作为固定有抗体的载体的实例。
从蛋白质-核酸复合物或抗体-蛋白质-核酸复合物释放核酸的方法可以根据本领域技术人员已知的方法实施(参见Cancer Genet.2018年3月6日.pii：S2210-7762(17)30267-3.；Transl Lung Cancer Res.2016年12月；5(6)：665-672；J Mol Diagn.2017年1月；19(1)：162-168；Anal Bioanal Chem.2015年9月；407(22)：6873-8.；PLoS One.2014年3月3日；9(3)：e87838；Cancer Biomark.2013；13(5)：385-94.；Yonsei MedJ.2012年1月；53(1)：132-7.；Clin Chim Acta.2009年6月27日；404(2)：100-4.；QIAamp CirculaingNucleic Acid Handbook 10/2013；QIAamp Viral RNA Mini Handbook 12/2014)。
在本说明书中，关于“含有蛋白质-核酸复合物的样品”的来源，优选为后述的生物样品，或后述的含有病原微生物或病毒的样品。
如本文所用，“生物样品”是指可从活体收集的任何样品，例如血液、血浆、血清、尿液、粪便、胆汁、唾液、鼻涕、鼻腔/咽拭子液、精液、其他体液和分泌物，以及各种器官，如肺、心脏、肝脏、肾脏、脑、皮肤等，以及因此组织的粉碎物质。此外，生物样品可以来源于任何生物，包括动物、植物和微生物，优选动物，更优选哺乳动物，更优选人。动物包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物等。哺乳动物包括但不限于人、猴、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、绵羊、山羊、马、牛、猪、狗、猫等。生物样品还可含有后述的病原微生物或病毒和/或源自病原微生物或病毒的蛋白质-核酸复合物。
用于从生物样品浓缩和回收核酸的样品的实例优选包括从上述生物体收集的各种细胞，例如组织细胞和血细胞，或存在于尿液、粪便、唾液和其他体液和分泌物中的细胞，以及来源于上述生物体的培养细胞系。此外，生物样品的实例还包括各种疾病(实体癌、白血病等)的特征性细胞。从生物体收集的各种细胞优选是动物来源的细胞(也简称为动物细胞)，更优选哺乳动物细胞，进一步优选人源细胞。
如本文所用，“含有病原微生物或病毒的样品”是指含有后述的“病原微生物或病毒”的样品，或含有来源于病原微生物或病毒的蛋白质-核酸复合物的样品。其实例包括病原微生物或病毒的培养材料，病原微生物或病毒的灭活材料等。
如本文所用，病原微生物或病毒是指病原体中的微生物或病毒，其实例包括但不限于引起感染的原生动物、真菌、细菌、立克次体、病毒等。
适用于本发明的病原微生物或病毒不受特别限制，只要所述病原微生物或病毒具有其中核酸与蛋白质结合的蛋白质-核酸复合物即可。例如，候选物包括：真菌纲，如念珠菌属和隐球菌属；原生动物，如疟原虫属、变形虫(E.amoeba)、阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis)、卡氏肺囊虫肺炎(pneumocystis carinii pneumonia)和Echinocox；螺旋体如苍白密螺旋体(pallidum Treponema)；细菌如淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、流行性脑膜炎球菌(epidemic meningococcus)、葡萄球菌(staphylococcus)、链球菌(streptococcus)、肺炎双球菌(Diplococcus pneumoniae)、志贺杆菌属(Shigella)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肠沙门氏菌(Salmonella enterica)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、麻风分枝杆菌(Mycobacteriumleprae)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)；支原体；立克次体；衣原体；和病毒，如腺病毒、疱疹病毒、乳头瘤病毒、肝炎病毒、艾滋病病毒、麻疹病毒、流感病毒、乙型脑炎病毒、狂犬病病毒、诺如病毒(norovirus)和轮状病毒。
在本发明的方法中，如果样品至少含有动物细胞和/或病原微生物或病毒，则用含有后述的表面活性剂的试剂处理所述样品，以得到含有与蛋白质结合的核酸的浓缩物。
适用的表面活性剂的实例包括阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、两性表面活性剂、非离子表面活性剂等。本发明的一个特征是表面活性剂的使用提高了核酸的回收率。尽管提高核酸回收率的机制尚不清楚，但推测核酸回收率提高是由于动物细胞和/或病原微生物的脂质双层(也称为脂质双层膜)被溶解，并且与蛋白质结合的核酸(蛋白质-核酸复合物)被洗脱。
阳离子表面活性剂的实例包括烷基胺盐、季铵盐等；阴离子表面活性剂的实例包括胆酸、烷基硫酸酯盐、聚氧乙烯烷基醚硫酸酯盐、烷基苯磺酸盐等；两性表面活性剂的实例包括烷基甜菜碱、烷基胺氧化物、胆酰胺(cholamide)等；非离子表面活性剂的实例包括聚氧乙烯烷基醚、聚氧化烯衍生物、脱水山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯烷基胺、烷基链烷醇酰胺、烷基咪唑啉、烷基葡糖苷、烷基甘露糖苷、烷基麦芽糖苷、海藻糖化合物、酰基-N-甲基葡糖胺等。
阳离子表面活性剂的实例包括作为季铵盐的商业产品的QUARTAMIN 86P CONC(花王公司)。阴离子表面活性剂的实例包括作为胆酸的商业产品的胆酸钠(和光纯药公司)。两性表面活性剂的实例包括作为烷基甜菜碱的商业产品的AMPHITOL 20BS，作为烷基胺氧化物的商业产品的AMPHITOL 20N(花王公司)，作为胆酰胺的商业产品的CHAPS和CHAPSO(同仁化学研究所公司)。非离子表面活性剂的实例包括作为聚氧乙烯烷基醚的商业产品的EMULGEN 120和EMULGEN 430(花王公司)，以及作为酰基-N-甲基葡糖胺的商业产品的MEGA8和MEGA 9(同仁化学研究所公司)。
如本文所用，“含有表面活性剂的试剂”是指表面活性剂和缓冲液的组合物。
对于缓冲液，优选使用含有已知盐化合物的缓冲液。具体实例包括磷酸盐缓冲液(磷酸盐缓冲盐水(PBS))和Tris缓冲液(例如Tris-HCl缓冲液，由Tris和EDTA组成的TE缓冲液，由Tris、硼酸和EDTA组成的TBA缓冲液)。
关于用含有表面活性剂的试剂处理含有蛋白质-核酸复合物的样品的方法，可以将试剂加入样品中并与样品混合。待使用的表面活性剂的浓度可以根据待使用的种类适当确定，例如为样本中0.01-10质量％、0.02-5质量％、0.05-2质量％，以及优选为0.1-1质量％。处理温度优选为5至40℃，特别是10至30℃，处理时间优选为1至30分钟，更优选为1至20分钟，或1至10分钟。样品优选稀释1至100倍、2至50倍，特别是4至20倍。在这种情况下，适合使用具有约6至9的pH、6至9的pH、6.5至8.5的pH和7至8的pH的缓冲液如磷酸盐缓冲液和Tris缓冲液。
以下将通过实施例详细描述本发明；然而，本发明不仅限于这些实例。
以下将描述产生具有来源于流感病毒的核蛋白作为抗原的单克隆抗体的实例作为参考。
(参考实施例)
抗流感病毒(甲型和乙型)单克隆抗体的产生
将20微克人甲型流感病毒(A/Panama/2007/99)的核蛋白(核衣壳蛋白)的重组蛋白与等量的市售弗氏完全佐剂(Freund′s complete adjuvant)混合。通过使用其混合物，每4至8周对小鼠皮下免疫3至6次。从免疫的小鼠中摘除脾细胞，并通过常规方法使用聚乙二醇与骨髓瘤细胞(SP/2)进行细胞融合。对于人乙型流感病毒(B/Shangdon/7/97)，用与人甲型流感病毒相同的方法进行细胞融合。
通过使用ELISA方法选择产生抗甲型流感病毒单克隆抗体的融合细胞或产生抗乙型流感病毒单克隆抗体的融合细胞(下文中，这些可简称为融合细胞)。首先，将由国立传染病研究所(National Institute of Infectious Diseases，也称为NIID)的流感病毒研究中心(东京都新宿区户山1-23-1)提供的各种亚型的病毒株灭活以获得抗原。选择与获得的抗原高度反应的孔，然后根据有限稀释通过常规选择方法选择融合细胞。对于抗流感病毒单克隆抗体，将选择的融合细胞施用于姥鲛烷处理的小鼠腹腔中，并作为腹水回收。从腹水中纯化IgG(免疫球蛋白G)作为特异性抗体。通过使用阴离子交换树脂纯化特异性抗体。
实施例
[实施例1]使用抗体浓缩和回收病毒RNA
在该实施例中，首先用含有表面活性剂的试剂处理流感病毒的培养液，然后使其与固定有特异性抗体的不溶性载体接触，以浓缩和回收流感病毒的RNA。
<病毒样本>
使用以下两种类型的人流感病毒株。
A/California/07/2009(H1N1)培养液(6×106拷贝/μL)
B/Florida/4/2006培养液(6×105拷贝/μL)
<样品处理>
向100μL含有表面活性剂的试剂(20mM磷酸盐缓冲液、50mM氯化钠、0.5％EMULGEN120)中加入1μL培养上清液，混合，然后在室温下静置5分钟。
<与抗体结合的载体的制备>
磁性颗粒用作不溶性载体。在将50μL DynaBeads Protein G(粒径：2，8μm，30mg/mL；Life Technologies；DynaBeads(注册商标)蛋白质G免疫沉淀试剂盒，产品编号：10007D)的磁性颗粒悬浮液分离并用磁铁收集颗粒后，除去上清液。随后，加入200μL含有30μg参考实施例中制备的抗甲型流感病毒单克隆抗体的PBST(含有0.02％吐温20的PBS)，并在室温下搅拌30分钟，以使抗体结合(也称为固定)至颗粒，以便产生与抗体结合的磁性颗粒。用PBST洗涤与抗体结合的磁性颗粒，然后用于抗原-抗体反应。另外，加入200μL含有30μg参考实施例中制备的抗乙型流感病毒单克隆抗体的PBST(含有0.02％吐温20的PBS)，并在室温下搅拌30分钟，以使抗体结合(也称为固定)至颗粒，以便产生与抗体结合的磁性颗粒。用PBST洗涤与抗体结合的磁性颗粒，然后用于抗原-抗体反应。
<病毒RNA的捕获>
为了进行抗原-抗体反应，将100μL上述处理的样品溶液与与抗体结合的磁性颗粒混合，并在室温下反转混合10分钟。为了确认是否是抗体的特异性捕获，换句话说，是否是非特异性结合，通过使用未结合抗体的磁性颗粒(未与抗体结合的磁性颗粒)进行相同的操作。
<RNA的回收>
用磁铁收集磁性颗粒并除去上清液之后，按照市售病毒RNA纯化试剂盒(QIAampViral RNA Mini Kit：QIAGEN)的方法纯化吸附在磁性颗粒上的RNA，最后，用60μl无核酸酶的水洗脱RNA。以这种方式，获得RNA样本。
<RNA回收的确认>
通过使用纯化的RNA作为模板，使用以下试剂和条件通过实时RT-PCR确认由与抗体结合的磁性颗粒捕获的RNA的量。
[表1]
内容物 体积
5×缓冲液·(对于Q5) 5μL
10mM dNTP 0.5μL
10μM正向引物·(SEQ·ID·NO：·7) 1.25μL
10μM各自的反向引物·(SEQ·ID·NO：·8) 1.25μL
20×EvaGreen 1.25μL
2000U/mL Q5 DNA聚合酶 0.25μL
无核酸酶的水 10.5μL
DNA样本 5μL
总计 20μL
<来源于人流感病毒A/California/07/2009(H1N1)的RNA的扩增>
在45℃逆转录5分钟后，通过在95℃加热30秒使逆转录酶失活，随后，将PCR反应重复45个循环，其中所述PCR反应包括在95℃热变性3秒，50℃、5秒退火和DNA延伸反应。
<来源于人流感病毒B/Florida/4/2006的RNA的扩增>
进行与来源于人流感病毒A/California/07/2009(H1N1)的RNA扩增相同的过程。
[引物和探针]
引物和探针的序列描述如下。关于SEQ ID NO：3和6的TaqMan探针，通过委托Thermo Fisher Scientific合成TaqMan MGB探针而获得TaqMan探针。SEQ ID NO：3和SEQID NO：6中的“Q”表示“猝灭剂”。更具体地，猝灭剂具有作为Tm增强剂的MGB(Minor GrooveBinder，小沟结合物)结构和非荧光猝灭剂。虽然没有公开猝灭剂的序列信息，因为这是Thermo Fisher Scientific的机密信息；然而，通过委托合成来合成探针是本领域技术人员获得TaqMan MGB探针的常见的做法。通过委托Eurofins Genomics合成引物来获得其他SEQ ID No的引物。
对于人流感病毒A/California/07/2009(H1N1)
SEQ ID NO：1
正向引物
5′-CAGTACCAATGAACTGGCGACA-3′
SEQ ID NO：2
反向引物
5′-AGCTGGAATCAACAAGGATTTACC-3′
SEQ ID NO：3
TaqMan探针
5′-FAM-TGAATAGATCGCCAAAAT-Q-3′
对于人流感病毒B/Florida/4/2006
SEQ ID NO：4
正向引物
5′-AACACAAATTGAGGTGGGTC-3′
SEQ ID NO：5
反向引物
5′-CTTTCATAGCACTCYAGAATTCCTGC-3′
SEQ ID NO：6
TaqMan探针
5′-FAM-CAACCAATGCCACCATAAA-Q-3′
甲型流感病毒的结果如图1所示，乙型流感病毒的结果如图2所示。在使用具有结合的抗体的磁性颗粒(与抗体结合的磁性颗粒)的情况下，RNA的各自回收量为2.8×106拷贝(回收率47％)和2.86×105拷贝(回收率48％)，并且RNA被有效回收。另一方面，在使用不具有结合的抗体的磁性颗粒(未与抗体结合的磁性颗粒)的情况下，RNA的各自回收量为9.0×103个拷贝(回收率0.15％：对比例1)和6.7×103个拷贝(回收率1.1％：对比例2)，并且各自的回收效率低于当使用与抗体结合的磁性颗粒时的回收效率。
[实施例2]筛选使用抗体的病毒RNA浓缩中的表面活性剂
除了以下样品处理过程之外，进行与实施例1中相同的过程。
<样品处理>
向100μl含有以下各种表面活性剂的试剂(基于PBS)中加入1μl人流感病毒A/California/07/2009(H1N1)培养上清液，混合，然后在室温下静置5分钟。
[表面活性剂]
通过向PBS中加入以下物质来处理病毒：0.5％EMULGEN 120、0.5％EMULGEN 430(花王公司)、70mM MEGA 8、30mM MEGA 9(同仁化学研究所公司)作为非离子表面活性剂、0.5％QUARTAMIN 86P CONC(花王公司)作为阳离子表面活性剂、0.5％胆酸钠(和光纯药公司)作为阴离子表面活性剂、0.5％AMPHITOL 20BS、0.5％AMPHITOL 20N(花王公司)、10mMCHAPS、10mM CHAPSO(同仁化学研究所公司)作为两性表面活性剂。
用各种表面活性剂处理的情况下的回收率计算结果示于图3中。在不添加表面活性剂的PBS的情况下，回收率约为30％。相反，当加入表面活性剂时，回收率均为50％或更高。由上可知，通过添加表面活性剂，可以提高抗体对RNA的回收率。
[实施例3]使用抗体浓缩和回收人DNA
在该实施例中，通过使具有固定的特异性抗体的不溶性载体与含有由于人源细胞系中发生的细胞凋亡而释放的DNA的培养溶液接触，浓缩并回收人DNA。
<人源细胞系>
对于人源细胞系，使用来源于具有EGFR基因T790M突变的非小细胞肺癌患者的NCI-H1975(转移自ATCC，CRL-5908(商标))。对于培养，首先，在37℃和5％CO2的条件下，使用含有10％FCS(胎牛血清，也称为牛胎儿血清)的无血清培养基(RPMI1640)直至培养的细胞在培养瓶底部达到约80％汇合，用含有EDTA的胰蛋白酶分离细胞。
在10mL无血清培养基(RPMI1640)中，将1×107个回收的细胞悬浮，并在37℃和5％CO2的条件下静置5天。随后，将培养上清液离心以获得经DNA浓缩的培养液。
<与抗体结合的载体的制备>
在将30μL DynaBeads Protein G(粒径：2.8μm，30mg/mL；Life Technologies；DynaBeads(注册商标)蛋白质G免疫沉淀试剂盒，产品编号：10007D)的磁性颗粒悬浮液等分并用磁铁收集颗粒之后，除去上清液，并加入200μL含有20μg组蛋白H4多克隆抗体(16047-1-AP；Proteintech)的PBST(含有0.02％吐温20的PBS)，并在室温下搅拌30分钟，以使抗体结合(固定)至颗粒。用PBST洗涤与抗体结合的磁性颗粒，然后用于抗原-抗体反应。
<在培养液中捕获DNA>
为了进行抗原-抗体反应，将200μL上述培养液与与抗体结合的磁性颗粒混合，并在室温下反转混合10分钟。为了确认是否是抗体的特异性捕获，换句话说，是否是非特异性结合，通过使用未结合抗体的磁性颗粒(未与抗体结合的磁性颗粒)进行相同的操作。
<DNA的回收>
用磁铁收集磁性颗粒并除去上清液之后，按照市售核酸纯化试剂盒(QIAampCirculating Nucleic Acid Kit：QIAGEN)的方法纯化吸附在磁性颗粒上的ccfDNA，最后，用50μl无核酸酶的水洗脱DNA。以这种方式，获得DNA样本。
<回收的DNA中EGFR基因T790M突变的检测>
为了检测由与抗体结合的磁性颗粒捕获的DNA中的EGFR基因T790M突变，制备含有以下试剂的25μL反应溶液，并用两步等位基因特异性PCR通过使用CFX96(Bio-Rad)分析DNA。
[表2]
内容物 体积
5×缓冲液·(对于Q5) 5μL
10mM dNTP 0.5μL
10μM正向引物·(SEQ·ID·NO：·7) 1.25μL
10μM各自的反向引物·(SEQ·ID·NO：·8) 1.25μL
20×EvaGreen 1.25μL
2000U/mL Q5 DNA聚合酶 0.25μL
无核酸酶的水 10.5μL
DNA样本 5μL
总计 20μL
<DNA的扩增>
在98℃热变性30秒后，将PCR反应重复40个循环，其中所述PCR反应包括在98℃热变性10秒，60℃、30秒退火和DNA延伸反应。
[引物和探针]
引物的序列如下所述。通过委托Eurofins Genomics合成引物来获得SEQ ID NO：7和8的引物。
SEQ ID NO：7(等位基因特异性引物)
正向引物
5′-CCGTGCATCTCATCTTG-3′
SEQ ID NO：8
反向引物
5′-CTTTGTGTTCCCGGACATAGTC-3′
结果显示在图4中。从通过使用与抗体结合的磁性颗粒浓缩和回收的DNA中成功检测到EGFR基因T790M突变。即使当通过使用未结合抗体的磁性颗粒(称为对比例3)浓缩和回收DNA时观察到突变基因的反应，但所述反应来自于非特异性吸附于磁性颗粒的DNA，并且在PCR反应的40个循环的荧光强度的比较中，所述反应弱至具有抗体的反应的约1/10。

Claims (27)

1.浓缩核酸的方法，包括以下步骤(a)至(c)：
(a)提供含有蛋白质-核酸复合物的样品，其中蛋白质和核酸是结合的；
(b)使所述样品、与所述蛋白质特异性反应的抗体和能够吸附所述抗体的载体相互接触；和
(c)从所述样品中回收所述载体，以便在所述载体上获得浓缩的核酸。
2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括步骤(d)将所述浓缩的核酸与所述载体分离。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤(b)中，接触的所述载体是抗体支持载体，其中所述抗体由所述载体支持。
4.根据权利要求3所述的方法，其中在步骤(d)中，通过免疫反应从附着于所述抗体支持载体的蛋白质-核酸复合物中释放所述核酸。
5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其中在步骤(b)中，所述抗体和所述蛋白质-核酸复合物彼此结合以形成抗体-蛋白质-核酸复合物。
6.根据权利要求5所述的方法，其中在步骤(d)中，从通过物理吸附而吸附于所述载体的抗体-蛋白质-核酸复合物中释放所述核酸。
7.根据权利要求1至6所述的方法，
在步骤(a)之前、在步骤(a)中或在步骤(a)与步骤(b)之间进一步包括以下步骤(a′)：
(a′)将表面活性剂添加到含有所述蛋白质-核酸复合物的样品中。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述表面活性剂是选自非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂和两性表面活性剂中的一种或多种。
9.根据权利要求1至8任一项所述的方法，其中所述样品是选自生物样品和含有病原微生物或病毒的样品中的一种或多种。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述生物样品是动物细胞。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述生物样品是选自血液、血浆、血清、尿液、粪便、胆汁、胰液、鼻涕和鼻腔/咽拭子液中的一种或多种。
12.根据权利要求9所述的方法，其中所述含有病原微生物或病毒的样品是病原微生物或病毒的培养物。
13.根据权利要求9所述的方法，其中所述病毒是流感病毒。
14.根据权利要求1至13任一项所述的方法，其中所述蛋白质是核蛋白。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述核蛋白是选自组蛋白和核衣壳蛋白中的一种或多种。
16.根据权利要求1至15任一项所述的方法，其中与所述蛋白质-核酸复合物特异性反应的抗体是识别核蛋白的抗体。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述识别核蛋白的抗体是选自抗组蛋白抗体和识别核衣壳蛋白的抗体中的一种或多种。
18.根据权利要求1至17任一项所述的方法，其中所述核酸是不包括信使RNA(mRNA)的核酸。
19.根据权利要求1至18任一项所述的方法，其中所述核酸选自由以下各项组成的组：藻类DNA、藻类RNA、古细菌DNA、古细菌RNA、细菌DNA、细菌RNA、催化DNA、环状DNA、链状DNA、十字形DNA、真菌DNA、真菌RNA、蠕虫DNA、蠕虫RNA、基因间DNA、isochore、microRNA、肿瘤DNA、肿瘤RNA、核RNA、植物DNA、植物RNA、原生动物DNA、原生动物RNA、重组DNA、反转录元件、核糖体DNA、核糖体RNA、卫星DNA、卫星RNA、转移RNA、非翻译RNA、病毒DNA和病毒RNA。
20.根据权利要求1至19任一项所述的方法，其中所述蛋白质-核酸复合物通过所述蛋白质和所述核酸之间的氢键形成。
21.根据权利要求1至19任一项所述的方法，其中所述蛋白质-核酸复合物仅通过所述蛋白质和所述核酸之间的氢键形成。
22.根据权利要求1至21所述的方法，其中所述蛋白质-核酸复合物在所述蛋白质和所述核酸之间不具有共价键。
23.根据权利要求1至22所述的方法，其中在步骤(d)中，不包括用蛋白酶处理所述蛋白质-核酸复合物的步骤。
24.根据权利要求1至22所述的方法，其中不包括用蛋白酶处理所述蛋白质-核酸复合物的步骤。
25.根据权利要求1至22所述的方法，其中不包括持续0.0分钟或更长、1.0分钟或更长、2.0分钟或更长、5.0分钟或更长、10分钟或更长或20分钟或更长的超声处理步骤。
26.根据权利要求1至22所述的方法，其中不以0％或更多、0.01％或更多、0.02％或更多、0.05％或更多、0.1％或更多、0.2％或更多、0.5％或更多、1.0％或更多、2.0％或更多或5.0％或更多的量使用甲醛。
27.根据权利要求1至22所述的方法，其中不以0单位或更多、0.01单位或更多、0.02单位或更多、0.05单位或更多、0.1单位或更多、0.2单位或更多、0.5单位或更多、1.0单位或更多、2.0单位或更多或5.0单位或更多的量使用核糖核酸酶(RNase)。
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