KR102305770B1 - 결핵의 개선된 생체내 또는 시험관내 세포-매개 면역학적 진단을 위한 진단 시약 - Google Patents

Abstract

본 발명은 결핵 검출을 위한, 증강된 특이성 및 민감성을 가진 시험관내 및 생체내 진단 방법을 개시하고 있다. 본 발명의 진단 시약은 ESAT-6를 포함하는 항원의 이전의 혼합물/칵테일/풀을 대체할 수 있지만, ESAT6의 포함은 진단을 보다 더 개선한다.

Description

결핵의 개선된 생체내 또는 시험관내 세포-매개 면역학적 진단을 위한 진단 시약{DIAGNOSTIC REAGENTS FOR IMPROVED IN VIVO OR IN VITRO CELL-MEDIATED IMMUNOLOGICAL DIAGNOSIS OF TUBERCULOSIS}

본 발명은 인간 또는 동물에서, 결핵의 개선된 생체내 또는 시험관내 세포-매개 면역학적 진단용의 약학적 또는 진단 시약으로서 사용되기 위한 조성물을 개시하고 있다. 본 발명은 특이성(위양성(false positive)의 양)을 저하시키지 않으면서도 기존의 항원 조합물과 비교하여 민감성을 증가시키는(위음성(false negative)을 덜 제공하는) 항원 조합물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은, 현재 미코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 감염 검출용 등록 제품에서 사용되는 조기 분비 항원 표적 6 kDa(early secretory antigenic target 6 kDa; ESAT-6)으로 지정된 항원을 포함하지 않는 항원 조성물에 관한 것이다. 대안적으로, 신규 진단 조성물 또는 면역원성 조성물은 세포-매개 진단의 민감성을 더 증강시키기 위해, ESAT-6와 조합되어 사용될 수 있다.

결핵(TB)은 전세계적으로 이환율(morbidity) 및 사망률(mortality)의 주요 원인이다. 사람에서 4초마다 TB가 발병되며, 20초 내지 30초마다 해당 질병으로 인해 사망할 것으로 추정된다. 이에 더하여, 세계 인구 중 약 1/3은 TB의 원인 인자인 미코박테리움 튜버쿨로시스(M. 튜버쿨로시스)에 의해 잠복적으로 감염된다.

M. 튜버쿨로시스로 감염된 면역적격(Immunocompetent) 개체는 일반적으로, 활동적 TB 질병이 발병될 생명 위험도(lifetime risk)가 10%이며, 이러한 위험도는 예를 들어, 개체가 HIV로 공동-감염되거나(Sonnenberg, 2005) 또는 당뇨병을 가지고 있는 경우(Young, 2009) 급격하게 증가한다. 치료되지 않은 채 방치되면, 활동적 폐 TB를 가진 각각의 개체는 매년 10명 내지 15명을 감염시킬 것이다(세계 보건 기구 결핵 팩트 시트 번호 104, 2002). 따라서, 활동적 전염성 폐 TB로의 M. 튜버쿨로시스-감염의 진행을 예방하기 위해서는, M. 튜버쿨로시스-감염된 개체를 감염 초기에 검출할 수 있는 것이 중요하다. 이는 진단 후 가능한 한 가장 초기의 시점에서 예방적 치료에 의해 달성될 수 있다. 따라서, M. 튜버쿨로시스 감염의 신속하고 정확한 진단은 질병 관리를 위한 세계적인 건강학적 조치의 중요한 요소이다.

M. 튜버쿨로시스 감염을 확인하기 위한 현재의 진단학적 분석법은 관련 환자 물질의 배양, 현미경 관찰 및 PCR, 흉부 X-선 촬영, 표준 튜베르쿨린 피부 시험(tuberculin skin 시험; TST) 및 인터페론-감마 방출 분석법(IGRA)을 포함한다. 처음 3개의 방법들은 활동적인 전염성 TB의 진단에 사용되며, M. 튜버쿨로시스 박테리아의 동정을 토대로 하고, 따라서, 시료 내에서의 박테리아의 존재에 따라 달라진다. 이는 특정한 박테리아 부하(bacterial load) 및 감염성 물질로의 접근을 요구하며, 따라서, 이러한 방법들은 감염의 조기 진단, 즉 임상적 질병의 개시 전에 진단하기에 적합하지 않다. 흉부 X-선은 민감하지 않으며, 폐 TB 및 보다 진행된 단계의 TB의 검출에만 적용 가능하다.

지연된 유형의 과민 반응(DTH)을 표시하는 표준 튜베르쿨린 피부 시험은 노출된 개체에서 미코박테리아 항원의 면역학적 인지를 토대로 하는 단순하고 저렴한 분석법이다. 그러나, M . 튜버쿨로시스 감염을 검출하는 것과는 거리가 멀다. 이러한 시험은 미코박테리아 항원들의 미정제 및 불량하게 정의된 혼합물인 정제된 단백질 유도체(PPD)의 피내 주사를 이용하며, 이들 항원 중 일부는 백신 하위균주 M. 보비스(M. bovis) 바실 칼메테-구에린(bacille Calmette-Guerin; BCG) 및 비-결핵 환경적 미코박테리아 유래의 단백질과 공유된다. PPD의 이러한 광범위한 교차-반응성은 TST의 불량한 특이성을 유발하여, BCG 백신접종 및 비-결핵 미코박테리아에의 노출이 M. 튜버쿨로시스-감염 개체에서 나타나는 것과 유사한 시험 결과를 제공하는 상황을 초래한다.

M. 튜버쿨로시스 감염은 강한 세포 매개 면역(CMI) 반응을 매개하고, M. 튜버쿨로시스-감염에 특이적인 반응의 일부로서 발생하는 면역 세포 및 이러한 세포로부터 유래되는 임의의 생성물의 검출은 감염을 검출하는 적합한 방법일 것이다(Andersen, 2000). 이러한 특이적인 반응을 유도하기 위해, 시약은 1) 광범위하게는 M. 튜버쿨로시스-감염 개체에 의해 인지되어야 하고, 2) M. 튜버쿨로시스에 특이적이어서, TB 감염, BCG 백신접종, 및 비-결핵 환경적 미코박테리아에의 노출을 구별해야 한다.

M. 튜버쿨로시스의 게놈은 4018개의 개방형 해독틀을 예측한다(http://tuberculist.epfl.ch/, release R27 - March 2013). 그러나, 이들 중 소수만이 인간 TB 환자 유래의 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)에 의해 강하고 광범위하게 인지되는 T-세포 항원이다. T 세포 에피토프를 예측하는 알고리즘이 개발되었으나, 면역우성 항원 CFP10 및 ESAT-6를 확인하기 위해서는 실험적 입증이 필수적이었다. M. 튜버쿨로시스 세포외 또는 배양 여과물(CF) 단백질은 T 세포 항원이 농화된 단백질 분획을 구성하며(Andersen 1994), 2차원적 프로테오믹스 기재의 접근법에 의한 CF 단백질의 분리는 59가지의 인간 T 세포 항원을 확인시켜 주었으며, 이 중 35가지는 이전에 기술된 바 있다(Deenadayalan, 2010). 이러한 목록이 완전하지 않을 수 있긴 하지만, 이는 약 900개의 CF 단백질들(Albrethsen, 2013) 중 소수만이 T-세포 항원임을 강조한다. 논리적으로, M. 튜버쿨로시스 게놈으로부터 인코딩된 대부분의 면역우성 항원들이 최고 발현을 가진 서브셋일 것임이 예상될 것이며, 현재 기술을 이용하여, 특정한 성장 조건하에 전사 수준에 따라 유전자의 등급을 매길 수 있을 것이다. 그러나, 면역원성에 대한 전사 수준의 기여도는 낮으며, 어떤 유전자가 관련 항원을 인코딩하는지 정확히 찾아내는 데에는 시스템적으로 사용될 수 없다(Sidders, 2008).

매우 특이적인 시약 후보물질은 M. 튜버쿨로시스 게놈의 RD 영역(결실 영역) 유래의 항원들 중에서 고려될 수 있었다. 이들 영역은 독성 M. 튜버쿨로시스 균주 (Behr, 1999)와 비교하여 M. 보비스 BCG 백신 균주로부터의 게놈 결실을 나타낸다. 따라서, 이론상으로, 이들 영역 유래의 단백질(RD 단백질)은 TB 진단 시약으로서 우수한 후보물질일 것이며, 즉, 이들은 이들의 BCG 백신 상태 또는 비-병원성 미코박테리아 균주에의 노출과는 관계없이, 감염되지 않은 건강한 개체에 의해서는 인지되어서는 안된다. 그러나, BCG로부터 결실된 모든 예측된 게놈 ORF(개방형 해독틀) 중에서, 사실상 어떤 것이 단백질로서 발현되는지 그 자체는 알려져 있지 않으며, 더욱이, M. 튜버쿨로시스-감염 개체 유래의 감작된 림프구를 사용하여 시험할 때까지 면역반응성은 알려지지 않은 채로 있다. 이러한 시험은 예를 들어, 전혈 분석법에서, PBMC의 재자극에 의해 수행되거나, PPD/Mantoux 시험과 유사하게 투여되는 성분을 피부 내로 주사함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, Rv3872의 평가는 진단 후 1개월 내지 4개월째에 시험된 인간 TB 환자(n=7)에서 낮은 인터페론 감마(IFN-γ) 반응을 보여주었으며(WO 99/24577), 이는 이러한 RD 단백질이 자주 인지되지 않으며, 따라서 Rv3872는 CMI 기재의 진단 시험용으로 더 추구되지 않았음을 가리킨다.

잠재적인 특이적 M. 튜버쿨로시스 단백질은 RD 단백질로 한정되지 않는데, 예를 들어, EspC 단백질(Rv3615c)은 인간 TB 환자 및 M. 보비스로 감염된 소에서 특이적으로 인지되고, 심지어 유전자가 BCG에 존재하더라도 BCG 백신접종/감염된 경우에는 인지되지 않기 때문이다(WO2009060184; Sidders, 2008; Millington, 2011). BCG-백신 접종된 개체에서의 반응의 부재(lack)는 대체로, Rv3615c의 분비가 BCG에서는 무효화되기 때문인 것으로 보이며, 그 이유는 이러한 분비가 RD1 유전자 좌에 부분적으로 위치하며 BCG에는 존재하지 않는 ESX-1 분비 시스템에 의존하기 때문이다. 이러한 항원은, 유사한 강한 IFN-γ 반응(ibid)을 유도하는 ESAT-6 및 CFP10처럼 강력한 것으로 여겨지는 CMI 진단 시약이다.

잠재적으로 특이적인 T-세포 항원이 동정되었을 때, 이러한 항원이 M. 튜버쿨로시스로 감염된 개체에서 특이적으로 인지되며 BCG 백신접종된 사람에서는 인지되지 않음을 입증해야 한다. RD1 유래의 Rv3873에 있어서, 단백질은 다른 M. 튜버쿨로시스 단백질에도 존재하는 아미노산 118-135에 보존된 모티프를 가진 단백질 패밀리의 구성원이었던 것으로 보였다. 광범위하게 인지되는 T-세포 에피토프가 이러한 모티프에 존재하였기 때문에, BCG로 백신접종된 개체 또한, 이러한 서열을 스패닝(spanning)하는 펩티드에 반응하였다(Liu, 2004). 그러나, 다른 공지된 미코박테리아 단백질(Liu, 2004)의 서열을 비교한 결과 상동성이 검출되지 않았음에도, Rv3878 및 Rv3879c에서도 교차-반응성이 관찰되었으며, 이는, 잠재적인 진단 후보물질의 특이성이 실험적으로 입증될 필요가 있음을 강조한다. 동일한 방식으로, BLAST 알고리즘을 이용한 데이터베이스 검색에서 관찰된 교차-반응성을 설명할 수 있는 임의의 명백한 미코박테리아 단백질을 발견하지 못하였음에도, BCG 백신접종 수여자 및 TB 환자 둘 다에서 RD13 유래의 Rv2653c가 인지되었다(Aagaard, 2004).

CMI 기재의 분석법에 의해 M. 튜버쿨로시스 감염의 진단에 잠재성을 가진 M. 튜버쿨로시스 특이적인 단백질을 동정하였지만, 이러한 단백질/펩티드의 풀이 진단 시험에 요망되는 민감성을 제공할 것인지는 조사되어야 할 것으로 남아 있다. 이미 정의된 진단 항원과 조합된 후, 주어진 항원이 민감성에 얼마나 많은 것을 첨가할 것인지 예측하는 것은 불가능하며; 이는 각각의 항원에 대해 실험적으로 평가되어야 하며, 바람직하게는 서로 다른 유전적 배경을 가진 세계의 서로 다른 지역으로부터의 TB 환자에서 평가되어야 한다.

CFP10(Rv3874), ESAT-6(Rv 3875), RD1 영역 유래의 2개의 저분자량 단백질 및 TB7.7(Rv2654)의 진단 잠재성은 매우 잘 문서화되어 있으며(Brock, 2004; Moon, 2013, WO2004099771), 현재 인간 용도용으로 등록된 서로 다른 진단 시약들에서 사용된다. CFP10 및 ESAT-6를 포함하는 펩티드는 T-SPOT®. TB 시험에 사용되며, 이 시험은 ESAT-6 및 CFP10으로 재자극받은 PBMC에서 발견된 T 세포의 면역 반응을 검출하는 세포성 혈액 시험이다. 이러한 반응은 ELISPOT으로 지정된 고도로 민감한 효소-연결 면역스폿 방법에 의해 검출되며, T-SPOT.TB 시험으로서 상업화되어 있다. 이러한 시험은 고도로 민감하며, BCG 백신 접종 상태와 무관하다. M. 튜버쿨로시스-감염의 검출을 위한 또 다른 등록된 시험은 QuantiFERON®-TB Gold로서, 이는 ESAT-6, CFP10을 포함하는 펩티드 및 TB7.7 유래의 단일 펩티드를 사용하여 재자극 시, 전혈 시료에서 면역 반응을 검출할 수 있는 시험관내 진단 기술이다. 이들 시험 둘 다 선택된 특이적 항원 펩티드 풀에의 노출에 대한 반응에서 인터페론-감마 (IFN-γ)의 생성을 측정하며, 현재 최신 기술로서 여겨진다. T-SPOT.TB 시험 및 QuantiFERON®-TB Gold 시험은 수합해서 IFN-γ 방출 분석법(IGRA)으로서 인지된다.

IFN-γ 이외의 다른 사이토카인 및 케모카인은 또한, 미코박테리아 항원에 대한 면역학적 반응을 모니터링할 때, 관련성을 나타내었다. IFN-γ-유도 단백질 (IP-10)은 IFN-γ와 비교하여 100배 더 높은 수준에서 발현되고, IP-10의 분비를 토대로 하는 진단학적 분석법은 IFN-γ 방출 분석법과 유사한 진단 성능을 나타내었다(Ruhwald, 2009).

인간 용도용으로 이미 등록되었으며 전세계에서 사용되는 이들 시험관내 시험 외에도, ESAT-6 및 CFP10은 또한, 피부-시험 시약으로서 효과적인 것으로 입증되었다. 임상 연구에서, 재조합 단백질로서 제조 및 전달된 ESAT-6 및 CFP10을 사용하는 점을 제외하고는 PPD와 동일한 방식으로 적용된 피부 시험이 M. 튜버쿨로시 스 감염의 진단에 사용될 수 있으며, BCG 백신접종 상태에 의해 영향을 받지 않음을 보여주었다(Aggerbeck, 2013).

BCG, 및 IGRA를 포함한 몇몇 진단 방법들의 광범위한 사용에도 불구하고, TB는 여전히 매년 약 200만 명을 사망에 이르게 할 정도로 악영향을 미치며, 개선된 민감성을 가진 면역진단 시험을 개발할 것이 계속해서 요망되고 있다. 면역약화된 환자는 TB의 발병 위험이 더 높으며, 불행하게도 TST 및 IGRA는 둘 다 이들의 현재 형태로는 이들 그룹에서 차선으로 작용한다. 개선된 시험이 가장 필요한 환자 그룹은 HIV-감염 환자, 면역-매개 염증 질병을 앓고 있는 환자, 면역 억제 약제(예, 프레드니솔론 또는 TNF-α 저해제)를 복용하는 환자 및 만성 신부전을 앓고 있는 환자를 포함한다. 예를 들어, HIV 감염 환자에서, 낮은 CD4 세포 계수(예, 1 ㎕ 당 250개 미만의 세포)는 문헌에서 검토된 노출된 개체에서 보다 높은 비율의 불명확한 시험 결과, 활동적 TB에 대한 저하된(compromised) 시험 민감성, 및 양성 시험 반응에 대한 가능성 감소와 강한 관계가 있는 것으로 잘 알려져 있다(Redelman-Sidi, 2013).

표적화된 시험을 위한 또 다른 매우 적당한 그룹은 어린이이다. 어린이에서 잠복적인 TB 감염(LTBI) 및 TB의 진단은 어려우며, 감염의 미생물학적 확인은 종종 수득되지 않고, 치료는 임상 제시(clinical presentation) 단독에 의해 지시된다. 활동적으로 감염된 어린이 및 추정상(presumed) 잠복적으로 감염된 어린이 둘 다에서, 면역계는 미성숙하며, 보다 낮은 사이토카인 방출 및 저하된 IGRA 성능의 가능성 있는 원인이다. 최근, QuantiFERON®-TB Gold 시험은 TB에 걸린 것으로 미생물학적으로 확인된 81명의 어린이에서 53%의 민감성을 가졌으며, 이는 어린이에서 M. 튜버쿨로시스 감염에 대한 개선된 면역진단 시험의 필요성을 뒷받침하는 것으로 나타났다(Schopfer, 2013).

상기 언급된 고-위험 환자 그룹(예, 면역억제된 개체, HIV 감염 개체, 어린이)에서 IGRA 시험 성능이 가진 핵심 문제점은, 그 자체가 TB 질병의 위험도를 증가시키는 근본적인 면역억제 조건은 낮은 CMI 반응, 및 항원에 대한 반응에서 낮은 IFN-γ의 방출에 의해 특정된다는 것이다. IGRA 결과는 IFN-γ의 방출 규모를 컷오프와 비교한 것을 토대로 확인되기 때문에, 저하된 IFN-γ 방출은 시험 결과가 위음성으로 될 위험성을 증가시킨다. 따라서, 보다 특이적인 항원을 포함시키는 것이 보다 특이적인 T 세포를 보충하고, CMI 반응 및 IFN-γ의 방출을 증가시키고, 결과적으로 반응의 위험도를 컷오프 미만으로 낮출 것임이 당업자에게 명확하다. 따라서, 부가적인 특이적 항원을 첨가하는 것은 진단 민감성을 개선함으로써 IGRA 시험의 주요 한계를 해결한다.

보다 높은 규모의 반응을 토대로 한 M. 튜버쿨로시스의 감염의 진단 시 또 다른 이점은, 증가된 분석 정확성 및 보다 신뢰할만한 시험 결과이다. QuantiFERON®-TB Gold 시험에서, 양성 시험에 대한 컷오프는 0.35 IU/ml 또는 17.5 pg/ml이며, 이러한 농도는 ELISA와 같은 민감한 방법들을 이용하더라도, 높은 정확도로 확인하기 어려운 매우 낮은 농도이다. 예를 들어, 현재까지 IGRA의 가장 큰 정확도 연구는, 동일한 환자 시료를 재시험하는 경우 QuantiFERON-TB Gold In-튜브에 의해 측정된 TB 반응에서 상당한 가변성을 확인하였다. 개체 내에서의 가변성은 초기 반응이 0.25 IU/ml 내지 0.80 IU/ml에서였을 때 둘 중 어느 한 방향으로 0.24 IU/ml 이하의 차이를 포함하였다. 이는, 0.59 IU/ml 미만의 양성 QuantiFERON TB Gold In-Tube 시험 결과가 주의해서 해석되어야 한다는 결론을 도출하였다 (Metcalfe AJRCCM 2012).

모델링 연구는, 신규 백신 없이는 TB가 근절될 수 없으며, 신규의 보다 효과적인 백신이 국제적인 우선사항임을 제시한다. 전반적인 아이디어는 현재의 BCG 백신에 부스터 서브유닛 백신을 보충하거나, BCG를 대체하기 위한 신규의 TB 생백신 (live vaccine)을 제조하는 것이다. 임상 개발에서 실험 백신의 수는 증가하고 있으며, 신생 일치(emerging consensus)는 ESAT-6가 필수적인 백신 항원인 것으로 보인다는 것이다. 따라서, 현재 전임상(preclinical) 수준 또는 임상 시험에 있는 많은 신규 백신들은 ESAT-6를 함유한다. 최근, Aeras Foundation은, TB에 의해 이미 잠복적으로 감염된 사람을 활동적 TB 질병의 발병으로부터 보호하도록 설계된 ESAT-6-함유 백신의 최초 시험을 공표하였다(Aagaard, 2011). rBCG:GE(Yang, 2011), rM.S-e6c10(Zhang, 2010), 살모넬라/Ag85B-ESAT-6(Hall, 2009), rBCG-A(N)-E-A(C)(Xu, 2009) 또는 H1과 같이 ESAT-6를 혼입하는 융합 단백질(van Dissel, 2010; van Dissel, 2011)과 같은 몇몇 생백신 후보물질들 또한, ESAT-6를 발현하도록 직접 재조합적으로 조작된다. 불행하게도, IGRA 시험 및 ESAT-6-함유 백신을 사용한 백신접종에서 ESAT-6 기재의 진단은 TST 및 BCG의 병행 사용(parallel use)과 관련된 교차-반응 문제점의 정확한 반복이다.

결과적으로, BCG-함유 백신 및 ESAT-6-함유 백신 둘 다와 병행해서 사용될 수 있는 특이적인 진단 시약이 크게 요망되고 있다. 생체내 분석법 또는 시험관내 분석법을 사용하는 경우, 시약은 인간 및 동물에서 M. 튜버쿨로시스 감염을 검출할 수 있어야 하며, TB 감염과 BCG 또는 신규 ESAT-6-함유 백신을 사용한 백신접종뿐만 아니라 비-병원성 환경적 미코박테리아에의 노출을 구별할 수 있어야 한다. 진단 시약은 일부 진단학적 분석법 TB7.7에서 현재의 ESAT-6, CFP10의 조합과 적어도 동일한 민감성을 가져야 한다.

EP2417456은, Rv3615c를 CFP-10과 조합하여 사용하여, ESAT-6/CFP-10 조합과 매우 유사한 진단 민감성을 제공하는 이러한 시스템을 기술하고 있다.

ESAT-6의 독특한 특징이 M. 튜버쿨로시스-감염에 대한 고도의 면역원성 및 특이성이기 때문에, ESAT-6를 단일 항원으로 대체하는 것은 다양한 집단 그룹들을 연구할 때 ESAT와 비교하여 민감성을 증가시킬 것 같지 않다. 이는 예를 들어, Brock 등에 의해 언급되었으며, ESAT-6와 비교하여 TB 환자에서 14% 내지 43%의 단일 항원의 인지가 동일한 환자 그룹 중 75%에서 반응을 유도한다. 대부분의 항원이 ESAT-6와 비교하여 면역원성이 더 낮으므로, 항원 풀은 큰 규모의 반응 및 개선된 진단 민감성에 필요할 가능성이 더 크다.

예시된 바와 같이, 항원 조합의 민감성 및 특이성을 예측하는 것은 단순하지 않으며; 그보다는 이는 특이적인 항원 조합물의 상세한 설계를 필요로 한다. 이에 더하여, 진단 풀에서 펩티드의 수를 증가시킴으로써, 이는 위양성의 수를 증가시킴으로써 특이성을 더 감소시키는 위험성을 도입하며, 이는, TB의 특이적인 진단을 위한 진단 또는 면역원성 조성물이 조심스럽게 선택 및 시험될 필요가 있음을 강조한다.

따라서, 인간 또는 동물에서 M. 튜버쿨로시스로 인한 감염의 개선된 생체내 또는 시험관내 세포-매개 면역학적 진단이 시급하게 필요하다. 이는, 특이성(위양성의 양)을 저하시키지 않으면서도, 기존의 항원 조합물과 비교하여 민감성을 증가시키는(위음성을 덜 제공하는) 항원 조합물에 대한 필요성이다. 필요한 개선된 항원 조합물은, ESAT-6를 포함하는 백신이 도입될 때의 상황을 예측하기 위해 ESAT-6 항원을 포함하지 않는 항원 조성물, 및 현재의 최신 진단 시약을 개선하기 위해 ESAT-6를 포함하는 항원 조합물 둘 다에 관한 것이다.

본 발명자들의 데이터는, 진단 잠재성을 가진 3가지 신규 항원들로부터 유래된 펩티드를 첨가함으로써, CFP10/ESAT6 조합 및 CFP10/Rv3615 조합이 추가로 개선될 수 있음을 나타낸다. 이러한 신규 발견은 2가지 이유에서 예상치 못한 것이다:

a) TB 게놈 상의 대부분의(99% 초과) 항원은 비-특이적이며, 다양한 미코박테리아 종들 사이에서 공유되므로, 미코박테리움 튜버쿨로시스에 특이적인 것으로 강하게 인지되는 항원을 동정하는 것은 매우 어려웠다.

b) CFP10/RV3615c 진단 조합 및 CFP10/ESAT6 진단 조합의 민감성은 이미 매우 높아서, 민감성을 증가시키는 것은 비-특이적인 반응으로 인해 점점 훨씬 더 어려워진다.

따라서, 본 발명은 특이성을 저하시키지 않으면서도, CFP10/RV3615c 조합의 민감성뿐만 아니라 ESAT6를 포함하는 현재의 진단 칵테일의 민감성을 증가시키는 능력을 가진 펩티드를 기술하고 있으므로, 매우 고무적이다.

Abdallah, A. M., N. C. Gey van Pittius, et al. (2007). Type VII secretion-mycobacteria show the way. Nature reviews. Microbiology 5(11): 883-891. Aggerbeck, H., R. Giemza, et al. (2013). Randomised clinical trial investigating the specificity of a novel skin test (C-Tb) for diagnosis of M. tuberculosis infection. PloS one 8(5): e64215. Albrethsen, J., J. Agner, et al. (2013). Proteomic profiling of Mycobacterium tuberculosis identifies nutrient-starvation-responsive toxin-antitoxin systems. Molecular & cellular proteomics : MCP 12(5): 1180-1191. Andersen, P. (1994). Effective vaccination of mice against Mycobacterium tuberculosis infection with a soluble mixture of secreted mycobacterial proteins. Infection and immunity 62(6): 2536-2544. Andersen, P., M. E. Munk, et al. (2000). Specific immune-based diagnosis of tuberculosis. Lancet 356(9235): 1099-1104. Arnvig, K. B., I. Comas, et al. (2011). Sequence-based analysis uncovers an abundance of non-coding RNA in the total transcriptome of Mycobacterium tuberculosis. PLoS pathogens 7(11): e1002342. Behr, M. A., M. A. Wilson, et al. (1999). Comparative genomics of BCG vaccines by whole-genome DNA microarray. Science 284(5419): 1520-1523. Biselli, R., S. Mariotti, et al. (2010). Detection of interleukin-2 in addition to interferon-γ discriminates active tuberculosis patients, latently infected individuals, and controls. Clinical Microbiology and Infection 16(8): 1282-1284. Brock, I., K. Weldingh, et al. (2004). Specific T-cell epitopes for immunoassay-based diagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection. Journal of clinical microbiology 42(6): 2379-2387. Chen, J. M., S. Boy-Rottger, et al. (2012). EspD is critical for the virulence-mediating ESX-1 secretion system in Mycobacterium tuberculosis. Journal of bacteriology 194(4): 884-893. de Souza, G. A., M. O. Arntzen, et al. (2011). Proteogenomic analysis of polymorphisms and gene annotation divergences in prokaryotes using a clustered mass spectrometry-friendly database. Molecular & cellular proteomics : MCP 10(1): M1 10 002527. Deenadayalan, A., D. Heaslip, et al. (2010). Immunoproteomic identification of human T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis that differentiate healthy contacts from tuberculosis patients. Molecular & cellular proteomics : MCP 9(3): 538-549. Dewan, P. K., J. Grinsdale, et al. (2007). Low Sensitivity of a Whole-Blood lnterferon-γ Release Assay for Detection of Active Tuberculosis. Clinical Infectious Diseases 44(1): 69-73. Ewer, K., P. Cockle, et al. (2006). Antigen mining with iterative genome screens identifies novel diagnostics for the Mycobacterium tuberculosis complex. Clinical and vaccine immunology : CV1 13(1): 90-97. Fortune, S. M., A. Jaeger, et al. (2005). Mutually dependent secretion of proteins required for mycobacterial virulence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102(30): 10676-10681. Hall, L. J., S. Clare, et al. (2009). Characterisation of a live Salmonella vaccine stably expressing the Mycobacterium tuberculosis Ag85B-ESAT-SESAT-6 fusion protein. Vaccine 27(49): 6894-6904. Harboe, M., A. S. Malin, et al. (1998). B-cell epitopes and quantification of the ESAT-6 protein of Mycobacterium tuberculosis. Infection and immunity 66(2): 717-723. Kilgus, J., T. Jardetzky, et al. (1991). Analysis of the permissive association of a malaria T cell epitope with DR molecules. The Journal of Immunology 146(1): 307-315. Liu, X. Q., D. Dosanjh, et al. (2004). Evaluation of T-cell responses to novel RD1- and RD2-encoded Mycobacterium tuberculosis gene products for specific detection of human tuberculosis infection. Infection and immunity 72(5): 2574-2581. Lustig, J. V., H. L. Rieger, et al. (1976). Humoral and cellular responses to native antigen following oral and parenteral immunization with lipid-conjugated bovine serum albumin. Cellular immunology 24(1): 164-172. MacGurn, J. A., S. Raghavan, et al. (2005). A non-RD1 gene cluster is required for Snm secretion in Mycobacterium tuberculosis. Molecular microbiology 57(6): 1653-1663. Merrifield, R. B. (1963). Solid Phase Peptide Synthesis. I. The Synthesis of a Tetrapeptide. Journal of the American Chemical Society 85(14): 2149-2154. Millington, K. A., S. M. Fortune, et al. (2011). Rv3615c is a highly immunodominant RD1 (Region of Difference Independent secreted antigen specific for Mycobacterium tuberculosis infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108(14): 5730-5735. Moon, H. W. and M. Hur (2013). Interferon-gamma release assays for the diagnosis of latent tuberculosis infection: an updated review. Annals of clinical and laboratory science 43(2): 221-229. Mowat, A. M., A. M. Donachie, et al. (1991). Immune-stimulating complexes containing Quil A and protein antigen prime class I MHC-restricted T lymphocytes in vivo and are immunogenic by the oral route. Immunology 72(3): 317-322. Mustafa, A. S., R. Al-Attiyah, et al. (2008). Efficient testing of large pools of Mycobacterium tuberculosis RD1 peptides and identification of major antigens and immunodominant peptides recognized by human Th1 cells. Clinical and vaccine immunology : CVI 15(6): 916-924. Nagai, S., H. G. Wiker, et al. (1991). Isolation and partial characterization of major protein antigens in the culture fluid of Mycobacterium tuberculosis. Infection and immunity 59(1): 372-382. Pai, M., L. W. Riley, et al. (2004). Interferon-gamma assays in the immunodiagnosis of tuberculosis: a systematic review. The Lancet infectious diseases 4(12): 761-776. Pearson, W. R. and D. J. Lipman (1988). Improved tools for biological sequence comparison. Proceedings of the National Academy of Sciences 85(8): 2444-2448. Ravn, P., A. Demissie, et al. (1999). Human T Cell Responses to the ESAT-6 Antigen from Mycobacterium tuberculosis. Journal of Infectious Diseases 179(3): 637-645. Redelman-Sidi, G. and K. A. Sepkowitz (2013). IFN-gamma release assays in the diagnosis of latent tuberculosis infection among immunocompromised adults. American journal of respiratory and critical care medicine 188(4): 422-431. Rosenkrands, I., P. B. Rasmussen, et al. (1998). Identification and characterization of a 29-kilodalton protein from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate recognized by mouse memory effector cells. Infection and immunity 66(6): 2728-2735. Ruhwald, M. and P. Ravn (2009). Biomarkers of latent TB infection. Expert review of respiratory medicine 3(4): 387-401. Schopfer, K., H. L. Rieder, et al. (2013). The sensitivity of an interferon-gamma release assay in microbiologically confirmed pediatric tuberculosis. European journal of pediatrics. Sester, U., M. Fousse, et al. (2011). Whole-Blood Flow-Cytometric Analysis of Antigen-Specific CD4 T-Cell Cytokine Profiles Distinguishes Active Tuberculosis from Non-Active States. PloS one 6(3): e17813. Sidders, B., C. Pirson, et al. (2008). Screening of highly expressed mycobacterial genes identifies Rv3615c as a useful differential diagnostic antigen for the Mycobacterium tuberculosis complex. Infection and immunity 76(9): 3932-3939. Sinigaglia, F., M. Guttinger, et al. (1988). A malaria T-cell epitope recognized in association with most mouse and human MHC class II molecules. Nature 336(6201): 778-780. Skjot, R. L, T. Oettinger, et al. (2000). Comparative evaluation of low-molecular-mass proteins from Mycobacterium tuberculosis identifies members of the ESAT-6 family as immunodominant T-cell antigens. Infection and immunity 68(1): 214-220. Sonnenberg, P., J. R. Glynn, et al. (2005). How soon after infection with HIV does the risk of tuberculosis start to increase A retrospective cohort study in South African gold miners. The Journal of infectious diseases 191(2): 150-158. Stryhn, A., L. 0. Pedersen, et al. (1996). Peptide binding specificity of major histocompatibility complex class I resolved into an array of apparently independent subspecialties: quantitation by peptide libraries and improved prediction of binding. European Journal of Immunology 26(8): 1911-1918. Thompson, J. D., D. G. Higgins, et al. (1994). CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research 22(22): 4673-4680. van Dissel, J. T., S. M. Arend, et al. (2010). Ag85B-ESAT-6 adjuvanted with IC31 promotes strong and long-lived Mycobacterium tuberculosis specific T cell responses in naive human volunteers. Vaccine 28(20): 3571-3581. van Dissel, J. T., D. Soonawala, et al. (2011). Ag85B-ESAT-6 adjuvanted with IC31(R) promotes strong and long-lived Mycobacterium tuberculosis specific T cell responses in volunteers with previous BCG vaccination or tuberculosis infection. Vaccine 29(11): 2100-2109. Xu, Y., W. Liu, et al. (2009). Recombinant Mycobacterium bovis BCG expressing the chimeric protein of antigen 85B and ESAT-6 enhances the Th1 cell-mediated response. Clinical and vaccine immunology : CVI 16(8): 1121-1126. Yang, X., L. Bao, et al. (201 ). A novel recombinant Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin strain expressing human granulocyte macrophage colony-stimulating factor and Mycobacterium tuberculosis early secretory antigenic target 6 complex augments Th1 immunity. Acta biochimica et biophysica Sinica 43(7): 511-518. Young, F., J. A. Critchley, et al. (2009). A review of co-morbidity between infectious and chronic disease in Sub Saharan Africa: TB and diabetes mellitus, HIV and metabolic syndrome, and the impact of globalization. Globalization and health 5: 9. Zhang, H., P. Peng, et al. (2010). Recombinant Mycobacterium smegmatis expressing an ESAT-6ES/4T-6-CFP10 fusion protein induces anti- mycobacterial immune responses and protects against Mycobacterium tuberculosis challenge in mice. Scandinavian journal of immunology 72(4): 349-357. Zweig, M. H. and G. Campbell (1993). Receiver-operating characteristic (ROC) plots: a fundamental evaluation tool in clinical medicine. Clinical chemistry 39(4): 561-577. Aagaard, C, I. Brock, et al. (2004). Mapping immune reactivity toward Rv2653 and Rv2654: two novel low-molecular-mass antigens found specifically in the Mycobacterium tuberculosis complex. The Journal of infectious diseases 189(5): 812-819. Aagaard, C, T. Hoang, et al. (2011). A multistage tuberculosis vaccine that confers efficient protection before and after exposure. Nature medicine 17(2): 189-194.

본 발명은 TB 복합체(M. 튜버쿨로시스, M. 보비스, M. 아프리카눔)의 종에 의해 유발되는 감염의 개선된 검출에 관한 것이며, TB 감염과 백신접종을 구별한다. 개선된 진단 조성물은 1) 신규 ESAT-6를 함유하는 TB 백신, 2) BCG 또는 3) 비-병원성 환경적 미코박테리아에의 노출 중 어느 것으로부터도 유래되지 않은 항원의 효과를 방해해서는 안 된다. 본 발명은 M. 튜버쿨로시스 감염에 대한 세포 반응을 검출하기 위해 생체내 또는 시험관내에서 사용될 수 있으며, 그로 인해, TB의 진단에 사용될 수 있는 개선된 진단 조성물 또는 면역원성 조성물을 개시한다. 항원 칵테일, 항원 풀, 이들 항원을 포함하는 펩티드의 칵테일 또는 풀을 사용함으로써, 본 발명자들은 진단 면역원성 조성물에 ESAT-6가 존재하지 않음에도 불구하고, 시험을 매우 민감성 있게 만들었다. 또한, 본 발명자들은 현재 사용되는 ESAT-6-포함 진단 면역원성 조성물을 더욱 개선하였다.

이러한 진단 방법은 감염 동안에 M. 튜버쿨로시스(또는 결핵 복합체 유래의 다른 미코박테리아) 박테리아에 의해 발현되는 항원의 세포 매개의 면역학적(CMI) 인지를 토대로 한다. 따라서, 본 시험은 전형적인 배양물로서의 박테리아, 현미경 및 PCR 방법의 존재를 필요로 하지 않는다. 이는, 이러한 시험이 감염기 초기에 적용될 수 있으며, 이러한 시험이 감염의 해부학적 부위와는 상관없이 적용 가능함을 의미한다. 본 방법은 현재 사용되는 TST에 대한 대체방안으로서 이상적으로 접촉되고 있다.

이론학적 진단 잠재성을 가진 M. 튜버쿨로시스-특이적 항원을 선택하고, 일련의 인간 TB 환자에서 인지를 시험함으로써, 본 발명자들은, 1) ESAT-6를 포함하지 않으며, 이로 인해, M. 튜버쿨로시스-감염과 백신접종을 구별하기 위해, ESAT-6으로 백신접종된 개체에서 사용될 수 있으며, 2) ESAT-6를 함유하는 진단 풀로서 동일하게 높은 특이성을 보여주었고, 3) ESAT-6, CFP10 및 TB7.7의 조합에 의해 수득된 것보다 우수한 M. 튜버쿨로시스-감염에 대한 민감성을 나타낸 3개의 진단 풀을 확인할 수 있었다.

본 발명은,

a) Rv3874(SEQ ID NO 1), Rv3615(SEQ ID NO 2), 및 Rv3865(SEQ ID NO 3), Rv2348(SEQ ID NO 4), Rv3614(SEQ ID NO 5), Rv2654(SEQ ID NO 6) 및 Rv3877(SEQ ID NO 7)로부터 선택되는 부가적인 조성물로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성된 실질적으로 순수한 폴리펩티드들의 혼합물; 또는

b) 상기 폴리펩티드들의 단편들의 혼합물을 포함하거나; 또는

c) 폴리펩티드들 또는 상기 폴리펩티드 단편들의 선택된 혼합물이 a) 또는 b)에서 선택되는 폴리펩티드들 중 임의의 폴리펩티드와 적어도 80%의 서열 동일성을 가지며, 동시에 면역원성인, 진단 또는 면역원성 조성물을 개시한다.

ESAT-6-함유 백신이 사용되지 않는 영역들에서 ESAT-6-함유 백신이 인간 용도용으로 등록되지 않을 상황하에서, 그리고 예를 들어, 진단 시험의 민감성을 더 증가시키기 위한 다른 상황하에서, 상기 개시된 진단 또는 면역원성 조성물들 중 임의의 조성물에는 ESAT-6(SEQ ID NO 51) 또는 이의 하나 이상의 단편이 보충될 수 있다.

바람직한 진단 조성물은 Rv3874, Rv3615 및 선택적으로 ESAT-6의 면역원성 에피토프를 포함하는 단편들의 혼합물을 포함하며, 여기서, SEQ ID NO 1의 면역원성 에피토프를 포함하는 단편은 SEQ ID NO 9 내지 SEQ ID NO 14로부터 선택되고, SEQ ID NO 2의 면역원성 에피토프를 포함하는 단편은 SEQ ID NO 15 내지 SEQ ID NO 18 또는 SEQ ID NO 59 내지 SEQ ID NO 63으로부터 선택되고, SEQ ID NO 51의 면역원성 에피토프를 포함하는 단편은 SEQ ID NO 52 내지 SEQ ID NO 58로부터 선택되며, SEQ ID NO 3의 면역원성 에피토프를 포함하는 단편은 SEQ ID NO 19 내지 SEQ ID NO 21로부터 선택되고, SEQ ID NO 4의 면역원성 에피토프를 포함하는 단편은 SEQ ID NO 22 내지 SEQ ID NO 25로부터 선택되고, SEQ ID NO 5의 면역원성 에피토프를 포함하는 단편은 SEQ ID NO 26 내지 SEQ ID NO 45로부터 선택되며, SEQ ID NO 6의 면역원성 에피토프를 포함하는 단편은 SEQ ID NO 8이고, SEQ ID NO 7의 면역원성 에피토프를 포함하는 단편은 SEQ ID NO 46 내지 SEQ ID NO 50으로부터 선택된다.

진단 또는 면역원성 조성물 내 폴리펩티드는 별개의 엔터티로서 존재할 수 있거나, 폴리펩티드들 중 일부 또는 모두는 선택적으로 링커 또는 스페이서를 통해 함께 융합된다.

바람직한 진단 또는 면역원성 조성물은 실시예에서 펩티드 풀 A로서 언급된, SEQ ID NO 9 내지 SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15 내지 SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19 내지 SEQ ID NO 21 및 SEQ ID NO 22 내지 SEQ ID NO 25의 풀 또는 혼합물을 포함한다.

바람직한 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드의 단편에 대한 상세한 설명:

CFP10(SEQ ID NO 1)은 주요 ESX-1 단백질이다. CFP10의 전체 아미노산 서열을 포함하는 하기 6개의 펩티드가 선택되었다(SEQ ID NO 9 내지 SEQ ID NO 14).

Rv3615c(SEQ ID NO 2)는 ESX-1 시스템에 의해 분비되는 단백질이다. 아미노산 55-103을 포함하는 4개의 펩티드가 선택되었다(SEQ ID NO 15 내지 SEQ ID NO 18). Rv3615의 C-말단부를 포함하는 다른 펩티드는 아미노산 서열 SEQ ID NO 59 내지 SEQ ID NO 63을 가진 5개의 펩티드이다.

Rv3865(SEQ ID NO 3)는 ESX-1 분비-관련 단백질이며: 아미노산 9-44를 포함하는 3개의 펩티드가 선택되었다(SEQ ID NO 19 내지 SEQ ID NO 21).

Rv2348c(SEQ ID NO 4)는, BCG에 존재하지 않는 것으로 나타난 RD7 영역에 위치하며: 전체 길이 단백질 서열의 아미노산 56-109를 포함하는 4개의 펩티드가 선택되었다(SEQ ID NO 22 내지 SEQ ID NO 25).

Rv3614c(SEQ ID NO 5)는 분비 단백질이며: 전체 서열을 포함하는 20개의 펩티드가 선택되었다(SEQ ID NO 26 내지 SEQ ID NO 45).

Rv2654c(SEQ ID NO 6)는 RD11 영역에 의해 인코딩되는 미지의 기능을 가진 단백질이며: 펩티드 4가 선택되었다(SEQ ID NO 8).

Rv3877(SEQ ID NO 7)은 RD1 영역에 위치하고, BCG에 존재하지 않으며: 전체 길이 단백질(511 aa) 내의 아미노산 220-284를 포함하는 5개의 펩티드가 선택되었다(SEQ ID NO 46 내지 SEQ ID NO 50).

ESAT-6(Rv3875; SEQ ID NO 51)은 주요 ESX-1 단백질이다. 전체 서열을 포함하는 7개의 펩티드가 선택되었다(SEQ ID NO 52 내지 SEQ ID NO 58).

본 발명은 추가로, 독성 미코박테리아, 예를 들어 M. 튜버쿨로시스 , 미코박테리움 보비스 또는 미코박테리움 아프리카눔에 의해 유발되는 TB 진단용 약학적 조성물의 제조에 있어서의 진단 또는 면역원성 조성물의 용도, 및 TB의 시험관내 또는 생체내 진단용의 상기 언급된 진단 또는 면역원성 조성물을 포함하는 CMI 진단 툴 또는 키트를 개시한다.

본 발명은 또한, 상기 언급된 진단 또는 면역원성 조성물을 사용하여, 인간을 포함한 동물에서 M. 튜버쿨로시스, 미코박테리움 아프리카눔 또는 미코박테리움 보비스와 같은 독성 미코박테리아에 의해 유발되는 TB를 시험관내 또는 생체내에서 진단하는 방법을 개시한다.

생체내에서의 TB 진단 방법은, 인간을 포함한 동물에 상기 정의된 바와 같은 약학적 조성물을 피내 주사하는 단계를 포함하며, 여기서, 주사 위치에서의 양성 피부 반응(positive skin response)이 결핵을 가진 동물의 표시이며, 주사 위치에서의 음성 피부 반응(negative skin response)이 결핵을 가지지 않은 동물의 표시이다.

시험관내에서의 TB 진단 방법은, 세포의 증식 또는 IFN-γ와 같은 사이토카인의 방출과 같은 양성 반응을 검출하기 위해, 혈액 시료와 같은 시료를 본 발명에 따른 진단 또는 면역원성 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다.

본 발명의 진단 또는 면역원성 조성물은 구축된 IGRA 시험에 현재 사용되고 있는 조성물(TB.SPOT®.TB 시험에서 CFP10/Rv3874 및 ESAT-6/Rv3875, 및 QuantiFERON®-TB Gold에서 TB7.7/Rv2654c, CFP10/Rv3874 및 ESAT-6/Rv3875)을 대체할 수 있다.

더욱이, 본 방법은 TB.SPOT®.TB 시험에서의 CFP10/Rv3874 및 ESAT-6/Rv3875 및 QuantiFERON®-TB Gold에서의 TB7.7/Rv2654c, CFP10/Rv3874 및 ESAT-6/Rv3875와 비교하여 하기의 개선을 가진다.

개체가 ESAT-6-함유 백신, 예컨대 ESAT-6를 포함하는 서브유닛 단백질 백신 또는 ESAT-6를 본질적으로 발현하도록 조작된 재조합 생백신으로 백신접종된 경우, 조성물은 ESAT-6를 사용하지 않으며, 결과적으로 여전히 M. 튜버쿨로시스-감염에 특이적이다. 이는 TB.SPOT®.TB 시험에서의 CFP10 및 ESAT-6 및 QuantiFERON®-TB Gold에서의 TB7.7, CFP10 및 ESAT-6 또는 ESAT-6를 토대로 하는 임의의 다른 시험의 경우에는 그렇지 않다.

ESAT-6-함유 조성물은 CMI-기재의 M. 튜버쿨로시스 시험에 사용되고 있다. 제시된 시험은 ESAT-6를 사용하지 않을 수 있고, 하나 초과의 M. 튜버쿨로시스-특이적 항원을 사용함으로써 수득되는 광범위한 인지를 이용한다. 본 발명자들의 시험에서, 본 발명자들은 Quantiferon 항원을 사용한 경우 74%의 민감성 및 96%의 특이성과 비교하여, CFP10, Rv3615c, Rv3865 및 Rv2348의 조합(펩티드 풀 A)을 사용하여 87%의 민감성 및 98%의 특이성을 수득한다. 따라서, 고도로 민감한 항원이며, M. 튜버쿨로시스-감염을 가진 개체들 중 많은 비율에서 인지되는 ESAT-6의 결여에도 불구하고, 본원에서 시험된 조성물은 ESAT-6를 토대로 하며 현재 IGRA 분석법에 사용되는 잘-알려진 조성물과 비교하여 10% 넘게 더 높은 민감성 비율을 수득한다.

본원에서, 본 발명자들은 또한, CFP10, Rv3615c, Rv3865 및 Rv2348로 구성된 펩티드 풀에 ESAT-6를 첨가함으로써, 본 발명자들은 진단 성능을 더 개선할 수 있음을 보여주는 데이터를 제시하고 있다. 특정화된 펩티드 풀에 ESAT-6를 첨가함으로써, 본 발명자들은 HIV와 같은 서로 다른 면역억제 합병증을 앓고 있는 개체에서의 진단 또는 예를 들어 어린이에서의 사용에 적당할 수 있는 반응의 규모를 증가시킬 수 있다. 또한, 모든 5가지의 항원 유래의 펩티드들의 조합(CFP10, ESAT-6, Rv3865, Rv2348 및 Rv3615c)을 사용함으로써, 본 발명자들은 CFP10, Rv3615c, Rv2348 및 Rv3865 단독의 풀을 가진 경우와 비교하여, 확정된 TB 진단을 받은 환자의 빈도를 3% 증가시킬 수 있었다.

본 발명은 또한, TB 진단을 위한 생체내 시험을 개시한다. 이는 상기 언급된 조성물을 사용하여, 인간을 포함한 동물에서 피부 시험의 형태로 수행될 수 있다. 피부 시험은: 본 발명의 조성물을 동물에 피내 주사하거나, 예를 들어 패치 또는 밴드로서 동물의 피부에 적용하는 것이다. 주사 또는 적용 부위에서의 양성 피부 시험 반응은 동물 또는 인간이 TB를 가지고 있음을 나타내는 표시이고, 주사 또는 적용 부위에서의 음성 피부 반응은 동물이 TB를 가지고 있지 않음을 나타내는 표시이다.

면역 반응을 유도하는 데 있어서 단지 6개 내지 9개 아미노산으로 구성된 서열(T-세포 에피토프)이면 충분하지만, 전체 길이 단백질 또한 유용할 것이기 때문에, 본질적으로 본 발명의 펩티드 풀이 이들의 전체 길이의 단백질을 포함하는 것은 아니다. 당업자는, 단백질에 포매된 T-세포 에피토프에 대한 정확하고 최소의 아미노산 서열을 결정할 수 있기 때문에, 본 발명은 또한, 상기 T-세포 에피토프(선택적으로 링커 또는 스페이서를 통해 결합됨)를 포함하는 전체 길이 단백질 및 융합 단백질로서 특이적인 부가적 아미노산을 포함하지 않으며, 상기 T-세포 에피토프(또는 이의 유사체)를 포함하는 폴리펩티드의 단편(면역원성 부위), 및 이러한 폴리펩티드 또는 융합 단백질을 포함하는 칵테일 또는 풀에 관한 것이다.

본 발명의 추가적인 구현예는 실시예 및 청구항에 기술되어 있다.

정의

폴리펩티드

본 발명에서 "폴리펩티드"라는 단어는 이의 유용한 의미를 가져야 한다. 이는 임의의 길이의 아미노산 사슬이며, 전체-길이 단백질, 올리고펩티드, 짧은 펩티드 및 이들의 단편을 포함하며, 여기서, 아미노산 잔기는 공유 펩티드 결합에 의해 연결된다. 폴리펩티드는 글리코실화에 의해, 지질화, 예를 들어 Mowat 등(Mowat, 1991)에 의해 기술된 바와 같은 팔미토일옥시 숙신이미드를 사용한 화학적 지질화 또는 (Lustig, 1976)에 의해 기술된 바와 같은 도데카노일 클로라이드를 사용한 화학적 지질화에 의해, 보결 분자단의 포함에 의해, 또는 히스-태그(his-tag)또는 신호 펩티드와 같은 부가적인 아미노산의 함유에 의해, 화학적으로 변형될 수 있다.

따라서, 각각의 폴리펩티드는 특이적인 아미노산에 의해 특정화되고, 특이적인 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있다. 이러한 서열은 재조합 또는 합성 방법에 의해 제조되는 유사체 및 변이체를 포함하며, 여기서, 이러한 폴리펩티드 서열은 재조합 폴리펩티드 내의 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환, 삽입, 첨가 또는 결실에 의해 변형되었으며, 본원에 기술된 생물학적 분석법들 중 임의의 분석법에서 여전히 면역원성인 것으로 이해될 것이다. 치환은 바람직하게는, "보존적"이다. 이들은 하기 표에 따라 정의된다. 두번째 컬럼의 동일한 블록 내의 아미노산, 바람직하게는 세번째 컬럼의 동일한 라인의 아미노산은 서로 치환될 수 있다. 세번째 컬럼의 아미노산은 한 글자 코드로 표시된다.

본 발명에서 바람직한 폴리펩티드는 M. 튜버쿨로시스 유래의 면역원성 항원의 단편이다. 이러한 항원은 예를 들어, M. 튜버쿨로시스 세포 및/또는 M. 튜버쿨로시스 배양 여과물로부터 유래될 수 있다. 따라서, 상기 항원들 중 하나의 면역원성 부위를 포함하는 폴리펩티드는 전체적으로 면역원성 부위로 구성될 수 있거나, 부가적인 서열을 함유할 수 있다. 부가적인 서열은 네이티브 M. 튜버쿨로시스 항원으로부터 유래될 수 있거나 이종성일 수 있으며, 이러한 서열은 면역원성일 수 있지만 그럴 필요는 없다.

본 발명의 맥락에서, "실질적으로 순수한 폴리펩티드 단편"이라는 용어는, 해당 폴리펩티드가 본래 연관되는 다른 폴리펩티드 물질을 최대 10중량%로 함유하는 폴리펩티드 조제물을 의미한다(다른 폴리펩티드 물질의 백분율은 더 낮은 것이 바람직하며, 예를 들어, 최대 4%, 최대 3%, 최대 2% 및 최대 1%임). 실질적으로 순수한 폴리펩티드는 적어도 96% 순수한 것, 즉, 폴리펩티드가 조제물 내에 존재하는 총 폴리펩티드 물질의 적어도 96중량%를 구성하는 것이 바람직하며, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.25%, 적어도 99.5% 및 적어도 99.75%와 같이 보다 높은 백분율이 바람직하다. 폴리펩티드 단편이 "본질적으로 순수한 형태"로 존재하는 것, 즉, 폴리펩티드 단편이 본래 연관되는 임의의 다른 항원을 본질적으로 포함하지 않는 것, 즉, 튜버쿨로시스 복합체 또는 독성 미코박테리움에 속하는 박테리아 유래의 임의의 다른 항원을 포함하지 않는 것이 특히 바람직하다. 이는 하기 상세히 기술되는 바와 같이 비-미코박테리아 숙주 세포에서 재조합 방법에 의해 폴리펩티드 단편을 제조함으로써 달성될 수 있거나, 잘 알려진 고체상 또는 액체상 펩티드 합성, 예를 들어 (Merrifield 1963)에 의해 기술된 방법 또는 이의 변형 방법에 의해 폴리펩티드 단편을 합성함으로써 달성될 수 있다.

"결핵"(TB)은 동물 또는 인간에서 TB 감염 및 질병을 유발할 수 있는 결핵 복합체로부터 유래되는 독성 미코박테리움에 의해 유발되는 감염인 것으로 이해된다. 독성 미코박테리아의 예는 M. 튜버쿨로시스 , M. 아프리카눔 및 M. 보비스이다. 적당한 동물의 예는 소, 주머니쥐, 오소리 및 캥거루이다.

"TB 환자"는 독성 미코박테리아에 의해 감염된 것으로 배양 또는 현미경에 의해 입증된 개체, 및/또는 TB를 가진 것으로 임상적으로 진단되었으며 항-TB 화학치료법에 반응성인 개체인 것으로 이해된다. TB의 배양, 현미경 및 임상적 진단은 당업자에게 잘 알려져 있다.

"지연된 유형의 과민 반응"(DTH)이라는 용어는 폴리펩티드를 피부 내에 주사하거나 피부에 적용한 후 유도되는 T-세포 매개 염증 반응인 것으로 이해되며, 상기 염증 반응은 폴리펩티드 주사 또는 적용 후 72시간 내지 96시간 후에 나타난다.

"사이토카인"이라는 용어는 면역학적 반응의 표시로서 사용될 수 있는 인터루킨 및 인터페론과 같은 임의의 염증조정제인 것으로 이해된다. 이로는, 예를 들어, 인터페론-감마 "IFN-γ", CXCL10 또는 "IP-10"으로도 알려져 있는 인터페론-감마 유도성 단백질 10 및 인터루킨 2(IL-2)를 포함한다.

본 명세서 전체에서, 문맥상 다르게 필요하지 않는 한, "포함하다"라는 단어, 또는 "포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 이의 변형된 표현은, 언급된 요소 또는 정수, 또는 요소들 또는 정수들의 그룹을 포함하지만, 임의의 다른 요소 또는 정수, 또는 요소들 또는 정수들의 그룹을 배제하지 않음을 내포하는 것으로 이해될 것이다.

서열 동일성

"서열 동일성"이라는 용어는, 동일한 길이의 2개의 아미노산 서열 사이의 상동성 정도 또는 동일한 길이의 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 상동성 정도의 정량적 측정값을 가리킨다. 비교되는 2개의 서열은 단백질 서열의 말단들에 갭을 삽입하거나 대안적으로 절단함으로써 가능한 한 최상으로 맞춰지도록 정렬되어야 한다. 서열 동일성은

로서 계산될 수 있으며, 여기서, N_dif는 정렬되었을 때 2개의 서열들 내의 비-동일성 잔기의 총 수이며, N_ref는 서열들 중 하나의 서열에서 잔기의 수이다. 따라서, DNA 서열 AGTCAGTC는 서열 AATCAATC와 75%의 서열 동일성을 가질 것이다(N_dif=2 및 N_ref=8). 갭은 특이적 잔기(들)의 비-동일성으로서 계수되며, 즉, DNA 서열 AGTGTC는 DNA 서열 AGTCAGTC와 75%의 서열 동일성을 가질 것이다(N_dif=2 및 N_ref=8). 다른 예로, 서열 동일성은 BLAST 프로그램, 예를 들어 BLASTP 프로그램(Pearson, 1988)(www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST)에 의해 계산될 수 있다. 본 발명의 일 양태에서, 정렬은 http://www2.ebi.ac.uk/clustalw/에서 입수가능하며 Thompson 등(Thompson, 1994)에 의해 기술된 바와 같이 디폴트 파라미터를 사용하는 서열 정렬 방법 ClustalW에 의해 수행된다.

서열 동일성의 바람직한 최소 백분율은 적어도 80%, 예컨대, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 및 적어도 99.5%이다.

면역원성 에피토프

폴리펩티드의 면역원성 에피토프는 동물 또는 인간 및/또는 생물학적 시료에서 본원에 기술된 생물학적 분석법들 중 임의의 분석법에 의해 확인되는 면역 반응을 유도하며 폴리펩티드의 일부이다. 폴리펩티드의 면역원성 에피토프는 T-세포 에피토프 또는 B-세포 에피토프일 수 있다. 면역원성 에피토프는 폴리펩티드의 하나 또는 소수의 상대적으로 작은 부분들과 관련 있을 수 있으며, 이들은 폴리펩티드 서열 전체에 분산될 수 있거나, 폴리펩티드의 특정 부위에 위치할 수 있다. 소수의 폴리펩티드에 있어서, 에피토프는 전체 서열을 포함하는 폴리펩티드 전체에 분산되는 것으로 언급된 바 있다(Ravn, 1999).

면역 반응 동안에 인지되는 적당한 T-세포 에피토프를 동정하기 위해, "브루트 포스(brute force)" 방법을 사용할 수 있다: T-세포 에피토프가 선형이기 때문에, 폴리펩티드의 결실 돌연변이체가 시스템적으로 구축된다면, 이는, 예를 들어, 이들 결실 돌연변이체에 예를 들어 본원에 기술된 IFN-γ 분석법을 수행함으로써, 폴리펩티드 영역이 면역 인지에 필수적임을 보여준다. 또 다른 방법은 폴리펩티드 유래의 예를 들어 20개 아미노산 잔기 길이를 가진 MHC II형 에피토프, 바람직하게는 합성 에피토프의 검출을 위해 중복 펩티드를 이용한다. 이들 펩티드는 생물학적 분석법(예, 본원에 기술된 바와 같은 IFN-γ 분석법)에서 시험될 수 있고, 이들 중 일부는 펩티드 내 T 세포 에피토프의 존재에 대한 증거로서 양성 반응(및 이로 인해 면역원성)을 제공할 것이다. MHC I형 에피토프의 검출에 있어서, 결합될 펩티드를 예측하고(Stryhn, 1996), 이후 이들 펩티드를 합성 제조하고, 이들을 본원에 기술된 바와 같이 IFN-γ 분석법과 같은 적당한 생물학적 분석법에서 시험할 수 있다. 펩티드는 바람직하게는, 폴리펩티드로부터 유래되는 예를 들어 8개 내지 11개의 아미노산 잔기의 길이를 가진다.

T-세포 에피토프의 최소 길이가 적어도 6개 아미노산인 것으로 나타났지만, 이러한 에피토프는 아미노산의 더 긴 신장부(stretch)로 구성되는 것이 통상적이다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드 단편은 길이가 적어도 7개 아미노산 잔기, 예컨대 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 12, 적어도 14, 적어도 16, 적어도 18, 적어도 20, 적어도 22, 적어도 24 및 적어도 30개 아미노산 잔기인 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 방법의 중요한 실시형태에서, 폴리펩티드 단편은 길이가 최대 50 아미노산 잔기, 예컨대 최대 40, 35, 30, 25 및 20개 아미노산 잔기인 것이 바람직하다. 길이가 10개 내지 30개 아미노산 잔기인 펩티드가 MHC II형 에피토프로서 가장 효율적인 것으로 입증될 것이며, 따라서, 본 발명의 방법에 사용되는 폴리펩티드 단편의 특히 바람직한 길이는 18개, 예컨대 15, 14, 13, 12 및 심지어 11개 아미노산 잔기인 것으로 예상된다. 길이가 7개 내지 12개 아미노산 잔기인 펩티드가 MHC I형 에피토프로서 가장 효율적인 것으로 입증될 것이며, 따라서, 본 발명의 방법에 사용되는 폴리펩티드 단편의 특히 바람직한 길이는 11개, 예컨대 10, 9, 8 및 심지어 7개 아미노산 잔기인 것으로 예상된다.

면역원성 에피토프를 포함하는, 폴리펩티드의 면역원성 부위(면역원성 에피토프를 포함하는 단편)는, 유전적으로 이종성인 인간 집단의 광범위한 부분(고 빈도) 또는 최소 부분(저 빈도)에 의해 인지될 수 있다. 또한, 일부 면역원성 부위들은 높은 면역학적 반응(우성)을 유도하는 반면, 다른 부위들은 보다 낮지만 여전히 상당한 반응(아우성)을 유도한다. 고 빈도><저 빈도는 광범위하게 분포된 MHC 분자 (HLA형) 또는 심지어 다수의 MHC 분자에 결합하는 면역원성 부위에 관한 것일 수 있다(Sinigaglia, 1988; Kilgus, 1991). 상기 폴리펩티드 유래의 면역원성 에피토프를 포함하는 단편은 적어도 10개 아미노산 길이를 가진 중복 펩티드로서 제시될 수 있으며, 이로써 몇몇 에피토프를 스패닝한다.

변이체

본 발명의 조성물의 폴리펩티드들의 보편적인 특징은 실시예에 예시된 바와 같은 면역학적 반응을 유도하는 이들의 능력이다. 치환, 삽입, 첨가 또는 결실에 의해 제조되는 본 발명의 폴리펩티드의 변이체 또한, 본원에 기술된 분석법들 중 임의의 분석법에 의해 면역원성인 것으로 확인됨을 이해한다.

면역 개체

면역 개체는 독성 미코박테리아에 의한 감염을 근절 또는 조절한 인간 또는 동물, 또는 M. 보비스 BCG로 백신접종을 받은 인간 또는 동물로서 정의된다.

면역원성

면역원성 폴리펩티드는 현재 또는 과거에 독성 미코박테리움으로 감염된 생물학적 시료 또는 개체에서 면역 반응을 유도하는 폴리펩티드로서 정의된다. 면역원성 폴리펩티드는 항원 또는 항원 폴리펩티드와 동의어이며, 2개의 용어들 면역원 및 항원은 본 개시내용에서 구분없이 사용되며; 항원에 대한 엄격한 정의는, T 세포 또는 B 세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 것이며, 면역원에 대한 엄격한 정의는, 면역 반응을 촉발할 수 있는 것이나, 진단에 관해 언급할 때, 2개의 용어들의 효과는 동일하며, 따라서, 본원에서는 구분없이 사용된다.

CMI 진단

면역 반응은 하기 방법들 중 하나의 방법에 의해 모니터링될 수 있다: 시험관내 CMI 반응은, 현재 또는 과거에 독성 미코박테리움으로 감염된 동물 또는 인간으로부터 채취한 림프구로부터의 IFN-γ와 같은 적당한 사이토카인의 방출에 의해 확인되거나, 이들 T 세포의 증식의 검출에 의해 확인된다. 유도는, 바람직하게는 1개 웰 당 1x10⁵개 세포 내지 1x10⁶개 세포를 포함하는 혈액 세포 현탁액에 면역원성 조성물을 첨가함으로써 수행된다. 세포는 혈액, 비장, 간 또는 폐로부터 단리되며, 면역원성 조성물의 첨가는 예를 들어 현탁액 1 ml 당 1 ㎍ 내지 200 ㎍의 농도를 초래하고, 자극은 2일 내지 5일 사이에 수행된다. 세포 증식의 모니터링에 있어서, 세포를 방사성 표지 티미딘을 사용해 감작시키고, 16시간 내지 22시간 동안 인큐베이션한 후, 액체 섬광 계수법 또는 증식 반응을 검출하기 위한 임의의 다른 방법에 의해 증식을 검출한다. IFN-γ의 방출은 ELISA 방법에 의해 확인될 수 있으며, 이 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. IFN-γ 이외의 다른 사이토카인 및 케모카인, 예컨대 IL-2, IL-12, TNF-α, IL-4, TGF-β, IP-10, MIP-1β, MCP-1, IL-1RA 및 MIG가 폴리펩티드에 대한 면역학적 반응을 모니터링할 때 적당할 수 있다. 사이토카인(예, IFN-γ)의 존재를 확인하는 또 다른 보다 민감성있는 방법은 ELISPOT 방법으로서, 이 방법에서, 예를 들어 혈액으로부터 단리한 세포를 바람직하게는 1 x 10⁶개 세포/ml 내지 4 x 10⁶개 세포/ml의 농도로 희석시키고, 진단 또는 면역원성 조성물의 존재하에 18시간 내지 22시간 동안 인큐베이션하여, 바람직하게는 1 ml 당 1 ㎍ 내지 200 ㎍의 농도를 달성한다. 이후, 세포 현탁액을 1 x 10⁶/ml 내지 2 x 10⁶/ml로 희석시키고, 항-IFN-γ로 코팅된 폴리비닐리덴 플루오라이드 막 마이크로타이터 플레이트로 옮기고, 바람직하게는 4시간 내지 16시간 동안 인큐베이션하였다. IFN-γ 생성 세포는, 표지된 2차 항-IFN-γ 항체, 및 스폿을 발생시키는 적당한 지질을 사용하여 확인하며, 이를 해부 현미경을 사용하여 열거할 수 있다. FluoroSpot 분석법은 ELISPOT 분석법의 변형이며, 동일한 분석법에서 2개의 사이토카인을 스폿할 수 있는 다수의 형광 항사이토카인을 사용하는 것을 토대로 하며, 잠재적으로는 IL-2 및 IFN-γ 공동-확인을 통해 하기 기술된 바와 같이 질병의 위험의 개선된 예측을 가능하게 한다. 또한, 측방 흐름(lateral flow) 기술을 사용하여 사이토카인 또는 케모카인 반응의 존재를 확인할 수 있다. 이러한 유형의 분석법(신속한 임신 시험으로부터 잘 알려져 있음)은 방출된 사이토카인 또는 케모카인의 수준을 신속하게 검출할 수 있게 하며, 매우 자원 구속적 설정(very resource restraint setting)에서도 감염 및 질병을 진단할 수 있게 한다. 비탁법 (turbidimetry)과 같은 비색 분석법을 비롯한 다른 면역분석법들도 당업자에게 잘 알려져 있으며, 사이토카인 또는 케모카인 수준의 고 처리량 검출에 사용될 수 있다. 또한, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기술을 사용하여, 적당한 사이토카인을 코딩하는 mRNA의 존재를 확인할 수 있다. mRNA 전사가 단백질 합성보다 먼저 일어나기 때문에, mRNA 수준에서의 사이토카인 또는 케모카인의 검출이 단백질 수준에서의 검출보다 더 빠르다. 예를 들어, 사이토카인 IFN-γ 및 케모카인 IP-10의 mRNA 수준은 단백질 수준과 비교하여, 보다 단기간의 인큐베이션 시 최적이다. mRNA 수준에서 검출된 사이토카인 및 케모카인 신호는 자극 후 2시간째인 초기에 발생할 수 있으며, 최대 수준은 6시간 내지 10시간째에 도달된다. 통상 하나 이상의 사이토카인은 예를 들어, PCR, 측방 흐름, ELISPOT 또는 ELISA를 이용하여 측정될 것이다. 특정 폴리펩티드에 의해 유도되는 이들 사이토카인 중 임의의 사이토카인의 양의 상당한 증가 또는 감소가 폴리펩티드의 면역학적 활성의 평가에 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 당업자는, 특정 패턴의 사이토카인 방출이 특정한 임상 상태와 관련 있는 것으로 생각한다. 특히, IL-2에 비해 IFN-γ의 우세함은 막 시작된 활동적 TB 질병의 지표로서 제시되었으며, 반면, IFN-γ에 비해 IL-2의 우세함은 시험을 받은 포유류에서 감염의 존재에도 불구하고, 감염 조절 및 TB 질병의 낮은 발병 위험률을 제시한다(Biselli, 2010; Sester, 2011).

시험관내 CMI 반응은 IL-7 및/또는 IL-15와 같은 사이토카인의 첨가에 의해 증가될 수 있으며, 또한, 방출 증가는 IL-10, IL-4, IL-5 및/또는 IL-13과 같은 저해 성분을 차단함으로써 수행될 수 있다. 유사한 CMI 반응은, 시험관내 배양 조건이 자극을 받는 세포에 최적인 경우, 보다 신뢰할만하게 검출될 수 있다. 이러한 조건은 예를 들어, 단당 및 당질 복합체의 형태로 영양분을 첨가함으로써 앞당겨질 수 있다.

보다 단순하고 더욱 민감성의 방법은 단핵구 세포를 미리 단리하지 않고 전혈 시료를 사용하는 것이다. 이러한 방법을 사용하면, 헤파린처리된 전혈 시료(적혈구를 미리 용해하거나 용해하지 않음)를 50 ml 내지 1000 ml의 양으로 사용하고, 인큐베이션은 18시간 내지 6일 동안 수행하며, 본 발명의 진단 또는 면역원성 조성물을 바람직하게는 1 ㎍/ml 내지 200 ㎍/ml 현탁액 농도로 수득한다. 상층액을 수집하고, IFN-γ(또는 임의의 다른 적당한 방출된 사이토카인, 예를 들어, IP-10, IL-2 또는 기타)의 방출을 당업자에게 잘 알려져 있는 ELISA 방법에 의해 확인할 수 있다.

CMI 반응을 확인하기 위한 마찬가지로 단순하고 더욱 민감성 있는 또 다른 시험관내 방법은 Whatman 903 또는 Whatman FTA 페이퍼와 같은 필터 페이퍼 상에서 (진단 또는 면역원성 조성물과 함께 인큐베이션한 후) 시료를 스폿팅하는 것이다. 건조 후, 스폿팅된 시료를 안정화시키고, 시료 내 사이토카인 및 케모카인 수준을 이후의 단계에서 검출할 수 있다. CMI 반응은 단백질 또는 mRNA 측정용의 상기 언급된 기술들을 사용하여 쉽게 검출된다. 이러한 방법은 특히, 저 자원 설정 또는 고 처리량 시료 제조 및 분석에 적합하다.

또 다른 시험관내 방법은, 면역원성 폴리펩티드 또는 이의 융합 단백질로 예비코팅되며, 선택적으로 헤파린 및/또는 영양분과 같은 혈액 안정화제가 첨가된 진공 채혈기 혈액 수집 튜브를 포함한다. 예비코팅된 인큐베이션 튜브는 혈액 수집을 단순화시키며, 시험관내 인큐베이션용 시료를 제조하면서도 혈액-원인성 감염에의 노출 위험을 근절한다. 이러한 진공 채혈기 튜브는 고 처리량 가공 및 자동화에 이상적이다.

따라서, 본 발명은 또한, 독성 미코박테리움을 가진 동물 또는 인간에서, 진행중인 감작 또는 과거의 감작을 진단하기 위한 시험관내 방법에 관한 것이며, 본 방법은, 동물 또는 인간 유래의 혈액 시료를 제공하는 단계, 및 동물 유래의 시료를 본 발명의 폴리펩티드 또는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하며, 혈액 시료 내 단핵구 세포에 의한 적어도 하나의 사이토카인의 세포외 기(phase) 내로의 유의미한 방출은 동물이 감작되었음을 나타내는 표시이다. TB 진단을 받지 않은 환자로부터 유래된 혈액 시료로부터의 방출보다 더 큰 반응인 양성 반응은 2개의 표준편차와 합산된다.

시험관내 CMI 반응은 또한, 면역 개체 또는 M. 튜버쿨로시스로 감염된 사람으로부터 유래되는 T 세포주를 사용하여 확인될 수 있으며, 여기서, T 세포주는 살아있는 미코박테리아, 박테리아 세포 유래의 추출물 또는 배양 여과물을 사용하며, IL-2를 첨가하고 10일 내지 20일 동안 유도되었다. 유도는 바람직하게는, 1개 웰 당 1x10⁵개 세포 내지 3x10⁵개 세포를 함유하는 T 세포주에 1 ㎍ 내지 200 ㎍ 폴리펩티드/ml 현탁액을 첨가함으로써 수행되며, 인큐베이션은 2일 내지 6일 동안 수행된다. IFN-γ의 유도 또는 또 다른 적당한 사이토카인의 방출은 ELISA에 의해 검출된다. T 세포의 자극은 또한, 상기 기술된 바와 같이 방사성 표지 티미딘을 사용하여 세포 증식을 검출함으로써 모니터링될 수 있다. 두 가지 분석법 모두에서, 양성 반응은 배경보다 더 큰 반응 + 2개의 표준 편차이다.

생체내 CMI 반응(예, 피부-시험, 경피 피부-시험, 패치 피부 시험)은, 독성 미코박테리움에 의해 임상적으로 또는 아임상적으로 감염된 개체에게, 본 발명의 진단 또는 면역원성 조성물 내 각각의 폴리펩티드를 바람직하게는 1 ㎍ 내지 200 ㎍의 양으로 피내 주사 또는 국소 패치 적용한 후, 양성 DTH 반응으로서 확인될 수 있으며, 양성 반응은 주사 또는 적용 후 72시간 내지 96시간째에 적어도 5 mm의 직경을 가진다.

진단 정확도 및 컷오프

임의의 주어진 진단 시험의 민감성은 시험에 의해 올바르게 확인 또는 진단된 양성 반응을 가진 개체의 비율을 정의하며, 예를 들어, 주어진 병태를 가진 모든 개체들이 양성 시험을 가지는 경우 민감성은 100%이다. 주어진 스크리닝 시험의 특이성은 시험에 의해 올바르게 확인 또는 진단되는 병태를 가지지 않는 개체의 비율을 반영하며, 예를 들어, 병태를 가지지 않는 모든 개체들이 음성 시험 결과를 가지는 경우 특이성은 100%이다.

민감성은 본 발명의 기술된 방법에 의해 올바르게 확인된(예, 양성 IFN-γ 시험 결과를 가짐), 주어진 병태를 가진(예, 활동적 TB 감염) 개체의 비율로서 정의된다.

본원에서 특이성은, 본 발명의 기술된 방법에 의해 올바르게 확인된(예, 음성 IFN-γ 시험 결과를 가짐), 주어진 병태를 가지지 않는(예, 활동적 TB 감염에 노출되지 않음) 개체의 비율로서 정의된다.

수여자-작동 특징

진단 시험의 정확도는 이의 수여자-작동 특징(receiver-operating characteristics; ROC)에 의해 가장 잘 설명된다(Zweig, 1993). ROC 그래프는 관찰된 데이터의 전체 범위에 대해 정확도 역치를 계속해서 다르게 함으로써 생성되는 모든 민감성/특이성 쌍들의 플롯이다.

실험실 시험의 임상 성능은 이의 진단 정확성, 또는 피검자를 임상적으로 적당한 하위그룹으로 올바르게 분류하는 능력에 따라 다르다. 진단 정확도는 조사되는 피검자의 2개의 서로 다른 병태들을 올바르게 구별하는 시험의 능력을 측정한다. 이러한 병태는 예를 들어, 건강 및 질병, 잠복적인 감염 또는 최근의 감염 대 (vs) 무감염, 또는 양성 질병 대 악성 질병이다.

각각의 경우, ROC 플롯은 정확도 역치의 완전한 범위에 대해 민감성 대(vs) 1-특이성을 플롯팅함으로써 2개의 분포에서 중복을 도시한다. y-축에는 민감성 또는 진양성(true-positive) 분획[(진양성 시험 결과의 수)(진양성의 수 + 위음성 시험 결과의 수)]이 있다. 이는 또한, 질병 또는 병태의 존재에서 양성으로 지칭되었다. 이는 영향을 받은 하위그룹으로부터만 계산된다. x-축에는 위양성 분획 또는 1-특이성이 있다[(위양성 결과의 수)/(진음성의 수 + 위양성 결과의 수)로서 정의됨]. 이는 특이성의 지수이며, 영향을 받지 않는 하위그룹으로부터만 계산된다.

진양성 분획 및 위양성 분획이 모두 별개로 계산되기 때문에, 2개의 서로 다른 하위그룹들로부터의 시험 결과를 사용함으로써, ROC 플롯은 시료 내 질병의 유병률(prevalence)과는 무관하다. ROC 플롯의 각각의 지점은 특정한 정확도 역치에 상응하는 민감성/- 특이성 쌍을 나타낸다. 완벽한 구분을 가지는(2개의 결과 분포에 중복이 없는) 시험은 상위 좌측 코너를 통과하는 ROC 플롯이며, 여기서, 진양성 분획은 1.0이거나 100%(완벽한 민감성)이며, 위양성 분획은 0(완벽한 특이성)이다. 구별되지 않는(2개의 그룹에 대한 결과 분포가 일치하는) 시험에 대한 이론학적 플롯은 하위 좌측 코너로부터 상위 우측 코너까지의 45° 대각선이다. 대부분의 플롯은 이들 2개의 극값 사이에 포함된다. (ROC 플롯이 45° 대각선 아래에 완전히 포함된다면, 이는 "양성" 범주를 "보다 큰" 것에서 "보다 작은" 것으로 역전시킴으로써 또는 그 반대로 수행함으로써 쉽게 교정된다.) 정량적으로, 플롯이 상위 좌측 코너에 근접할수록, 시험의 전체 정확도는 더 높아진다.

실험실 시험의 진단 정확도를 정량화하는 하나의 통상적인 목표는 이의 성능을 단일 수치로 표현하는 것이다. 가장 보편적인 세계적인 측정은 ROC 플롯하 면적이다. 편의를 위해, 이 영역은 항상 0.5보다 크다(그렇지 않다면, 그렇게 될 수 있도록 판단 규칙을 역전시킬 수 있음). 값은 1.0(2개의 그룹의 시험 값이 완벽히 분리됨) 내지 0.5(2개의 그룹의 시험 값 사이에 명확하게 구별되는 차이가 없음)의 범위이다. 이러한 영역은 플롯의 특정한 부위, 예컨대 대각선에 가장 근접한 포인트 또는 90% 특이성에서의 민감성에 따라 다를 뿐만 아니라, 전체 플롯에 따라 다르다. 이는, ROC 플롯이 완벽한 값(영역 = 1.0)에 얼마나 근접한가에 대한 정량적이며 기술적인 표현이다.

신규 항원 풀의 임상적 이용성은 주어진 감염에 대한 다른 진단 툴과 비교하고 조합하여 평가될 수 있다. M. 튜버쿨로시스로 감염된 경우, CMI 결과의 임상적 이용성은, 수여자 작동자 곡선 분석을 사용하여 IGRA 또는 TST와 같은 구축된 진단 시험을 비교하여 평가될 수 있다.

제조 방법

일반적으로, M. 튜버쿨로시스 항원, 및 이러한 항원을 인코딩하는 DNA 서열은 여러 가지 절차들 중 임의의 하나의 절차를 사용하여 제조될 수 있다.

이들은 상기 기술된 바와 같은 절차들에 의해 M. 튜버쿨로시스 세포 또는 배양 여과물로부터 네이티브 단백질로서 정제될 수 있다. 면역원성 항원은 또한, 항원을 인코딩하는 DNA 서열을 사용하여 재조합에 의해 제조될 수 있으며, 이러한 서열은 발현 벡터 내로 삽입된 다음, 적절한 숙주에서 발현되었다. 숙주 세포의 예는 이. 콜라이이다. 폴리펩티드 또는 이의 면역원성 부위는 또한, 약 100개 미만의 아미노산, 일반적으로 50개 미만의 아미노산을 가지도록 합성적으로 제조될 수 있으며, 당업자에게 잘 알려져 있는 기술, 상업적으로 입수가능한 고체상 기술을 사용하여 생성될 수 있으며, 여기서, 아미노산은 성장중인 아미노산 사슬에 순차적으로 첨가된다.

폴리펩티드를 인코딩하는 플라스미드 DNA의 구축 및 제조에 있어서, 이. 콜라이와 같은 숙주 균주가 사용될 수 있다. 그런 다음, 플라스미드 DNA는 관심 플라스미드를 가진 숙주 균주를 밤새 배양함으로써 제조될 수 있으며, 예를 들어 내독소 제거 단계를 포함하는 Qiagen Giga-Plasmid 컬럼 키트(Qiagen, Santa Clarita, CA, USA)를 사용하여 정제될 수 있다.

융합 단백질

별개의 엔터티인 것 외에도, 2개 이상의 면역원성 폴리펩티드는 융합 단백질로서 제조될 수도 있으며, 이러한 방법에 의해 본 발명의 폴리펩티드의 우수한 특징들이 달성될 수 있다. 예를 들어, 재조합에 의해 제조될 때 폴리펩티드의 유출(export)을 촉진하는 융합 파트너, 폴리펩티드의 정제를 촉진하는 융합 파트너, 및 본 발명의 폴리펩티드 단편의 면역원성을 증강시키는 융합 파트너는 모두 흥미로운 가능성을 가진다. 따라서, 본 발명은 또한, 상기 정의된 적어도 2개(예, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상)의 폴리펩티드 또는 면역원성 단편 및 선택적으로 적어도 하나의 부가적인 융합 파트너를 포함하는 융합 폴리펩티드, 및 융합 단백질을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 면역원성을 증강시키기 위해, 융합 파트너는 M. 튜버쿨로시스 유래의 또 다른 폴리펩티드, 예컨대 결핵 복합체에 속하는 박테리아 유래의 폴리펩티드 단편, 예컨대 ESAT-6, TB10.4, CFP10, RD1-ORF2, Rv1036, MPB64, MPT64, Ag85A, Ag85B(MPT59), MPB59, Ag85C, 19 kDa 지질단백질, MPT32 및 알파-크리스탈린(alpha-crystallin), 또는 상기 언급된 항원들 중 임의의 항원의 적어도 하나의 T-세포 에피토프일 수 있다(WO0179274; WO01041519; (Nagai, 1991; Rosenkrands, 1998; Skjot, 2000). 본 발명은 또한, 본 발명의 폴리펩티드(또는 이의 면역원성 부위) 중 적어도 2개 이상(예, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상)의 상호 융합을 포함하는 융합 폴리펩티드에 관한 것이다.

도 1은 100 pg/ml의 IFN-γ의 컷오프를 토대로, 34명의 이집트인 지원자들에서 면역 인지를 보여주는 히트 맵(heat map)이다. 2가지 경우는 잠복적인 TB(피검자 1 및 2)였으며, 32개 경우는 TB 질병으로 진단받았다(피검자 3 내지 34). 백색 코드는 무반응을 가리키며, 회색 코드는 반응을 가리키고, 검정색은 주어진 항원에 대해서는 반응이 있으나 ESAT-6 또는 CFP10에 대해서는 무반응임을 가리킨다.
도 2는 50 pg/ml의 IFN-γ의 컷오프를 토대로, 31명의 그린란드인 지원자들에서 면역 인지를 보여주는 히트 맵이다. 14명은 TB로 진단받았으며(피검자 1 내지 14), 17명은 잠복적인 TB를 가졌다(피검자 15 내지 31). 백색 코드는 무반응을 가리키며, 회색 코드는 반응을 가리키고, 검정색은 주어진 항원에 대해서는 반응이 있으나 ESAT-6 또는 CFP10에 대해서는 무반응임을 가리킨다.
도 3은 100 pg/ml의 IFN-γ의 컷오프를 토대로, 30명의 이집트인 풍토병 대조군 공여자들에서 면역 인지를 보여주는 히트 맵이다. 모든 공여자들에게 BCG 백신을 접종하였으며, TB 질병의 이력이 없었거나 TB 환자와 접종한 것으로 알려져 있지 않았다. 공여자들은 중간 풍토병 국가인 것으로 간주되는 이집트에서 살고 있었기 때문에 "풍토병 대조군"인 것으로 정의되었다. 백색 코드는 무반응을 가리키며, 회색 코드는 반응을 가리킨다. 조사된 항원들은 모두, 비특이적 항원 자극의 일례로서 포함된 PPD와 대조적으로 고도로 특이적이었다. 공여자 31 및 공여자 77은 둘 다 광범위한 범위의 M. 튜버쿨로시스 항원을 인지하였으며, 이는, 언급된 선택 범주에도 불구하고 잠복적인 감염을 가리킨다.
도 4는 73명의 이집트인 TB 환자에서 Quantiferon 펩티드 풀(ESAT-6, CFP10, Rv2654c(펩티드 4)) 및 펩티드 풀 A에 대한 IP-10 반응이다. 점선은 Quantiferon 항원에 대해 6 ng/ml의 중앙 반응 및 펩티드 풀 A에 대해 5.5 ng/ml의 중앙 반응을 가리킨다.
도 5는 M. 튜버쿨로시스에 노출되지 않은 100명의 덴마크인 개체들에서 Quantiferon 펩티드 풀(ESAT-6, CFP10, Rv2654c(펩티드 4)) 및 펩티드 풀 A에 대한 IP-10 반응이다. 점선은 두 항원 풀 모두에 대해 0 ng/ml의 중앙 반응을 가리킨다. 이는 전체 펩티드 풀의 높은 특이성(소수의 위양성)을 보여주며, 각각의 펩티드가 높은 특이성을 가짐을 가리킨다.
도 6은 M. 튜버쿨로시스에 노출되지 않은 100명의 덴마크인 개체들에서 Quantiferon 펩티드 풀(ESAT-6, CFP10, Rv2654c(펩티드 4)) 및 펩티드 풀 A에 대한 IFN-γ 반응이다. 점선은 펩티드 풀 A에 대해 0 pg/ml의 중앙 반응 및 Quantiferon 항원에 대해 4.9 pg/ml의 중앙 반응을 가리킨다. 이는 전체 펩티드 풀의 높은 특이성(소수의 위양성)을 보여주며, 각각의 펩티드가 높은 특이성을 가짐을 가리킨다.
도 7은 M. 튜버쿨로시스에 노출되지 않은 100명의 개체 및 73명의 TB 환자들에서 펩티드 풀 A와 Quantiferon 항원의 진단 잠재성을 비교하는 수여자 작동 특징 (ROC) 곡선 분석이다. 이는 전체 펩티드 풀의 높은 특이성(소수의 위양성)을 보여주며, 각각의 펩티드가 높은 특이성을 가짐을 가리킨다.
도 8은 TB 환자인 것으로 미생물학적으로 확인된 68명 및 36명의 탄자니아인 풍토병 대조군에서 Quantiferon 펩티드 풀(ESAT-6, CFP10 및 Rv2654c) 및 펩티드 풀 A에 대한 IP-10(ng/ml) 반응이다.
도 9는 이집트 카이로부터 온 TB 환자인 것으로 확정된 73명의 환자에서, 펩티드 풀 A 및 ESAT-6으로 농화된 펩티드 풀 A에 대한 IP-10(ng/ml) 반응이다. 선은 중앙을 나타낸다.

실시예

실시예 1. 항원의 초기 선택

TB의 면역진단을 위해 선택된 T 세포 항원은 BCG 백신접종 및 대부분의 만연한 비정형 미코박테리아로 인한 간섭을 피하기 위해, M. 튜버쿨로시스 감염에 특이적이어야 한다. 동시에, ESAT-6가 TB에 대한 많은 신규 백신들에 존재한다면, ESAT-6를 피하는 것이 중요하다. 본 발명의 배경기술에서 기술된 바와 같이, 본 발명자들은 선택된 수백 가지의 잠재적인 항원들에 대한 이론학적 고려, 실질적인 시험 및 문헌 검색을 토대로 고비용의 엄격한 하향-선택 공정을 통해 추가적인 시험을 위한 9가지 이하의 M. 튜버쿨로시스-항원을 가진다. 이들은 하기와 같다:

CFP10 ( Rv3874 ). 10-kDa 배양 여과물 항원은 ESAT-6와 함께, IFN-γ 방출 분석법(IGRA)에 의한, M. 튜버쿨로시스 감염에 대한 현재의 세포-기재의 진단 혈액 시험의 기본이다. CFP10은 면역우성 M. 튜버쿨로시스 항원이고, CFP10 및 ESAT-6의 진단 특이성은 차이 영역 1(region of difference 1; RD1)에서 이들의 게놈 위치에 의해 유발되며, 이러한 차이 영역은 모든 BCG 균주들에 존재하지 않으며(Behr, 1999) M. 튜버쿨로시스의 병인에 관여한다. ESX-1 분비 경로의 성분을 인코딩하는 유전자 또한, RD1에 위치한다. 인터페론-γ 분석법 연구의 검토 시, TB 환자에서 CFP10에 대한 민감성은 61% 내지 71%인 것으로 기록되었다(Pai, 2004). ESAT-6와는 대조적으로, CFP10은 평가를 받는 현재의 백신 후보물질들 중 임의의 후보물질의 일부가 아니다.

Rv3877. CFP10에서와 같이, Rv3877 유전자는 M. 튜버쿨로시스 염색체의 RD1 영역에 위치하며, M. 튜버쿨로시스 게놈 중 어느 곳에서도 근접한 상동체를 가지지 않는다. 이러한 단백질은 M. 보비스 BCG 또는 환경적 미코박테리아 M. 아비움에 존재하지 않으며, 따라서, 이전의 가능한 BCG 백신접종 또는 M. 아비움과 같은 환경적 미코박테리아에의 과도한 노출로부터 방해받지 않으면서 특이적 M. 튜버쿨로시스 진단에 사용될 수 있다. Rv3877은 막관통 단백질이며, ESX-1 기질이 분비되는 기공을 형성하기 때문에 ESX-1 분비의 주요 성분이다(Abdallah, 2007). Rv3877 단백질을 포함하는 합성 펩티드 풀은 인간 TB 환자로부터 단리된 PBMC에서 양성 반응을 33% 유도하였다(Mustafa, 2008).

Rv3614c 및 Rv3615c. espA - espC - espD(Rv3616c - Rv3615c - Rv3614c) 유전자 클러스터는 ESX-1 의존적 단백질 분비 및 M. 튜버쿨로시스 발병력(virulence)에 필수적이며(Fortune, 2005; MacGurn, 2005), 3개의 유전자들은 공동-전사되는 것으로 최근에 언급되었다(Chen, 2012). Rv3616c 및 Rv3615c는 ESAT-6 및 CFP10과 함께 공동-분비되며(Fortune, 2005; MacGurn, 2005), 반면, Rv3614c 분비는 배타적으로 ESX-1 작용을 필요로 하지 않는다(Chen, 2012). 소에서, Rv3615c의 M. 보비스 대응물인 Mb3645c는 M. 보비스로 감염된 동물 중 37%에서 IFN-γ 반응을 자극하였으나, 네이브(naive) 동물 및 BCG-백신접종 동물에서는 자극하지 않았다(Sidders, 2008). Mb3645c 및 Rv3615c는 100% 아미노산 동일성을 보여준다. 소에서, Mb3645c 단백질의 C-말단부(아미노산 57-103)가 가장 면역원성이었다(Sidders, 2008). 인간에서, Rv3615c는 또한, TB 사례를 인지하며 BCG 백신접종에서는 낮은 반응을 나타내는, M. 튜버쿨로시스-특이적 T-세포 기재 면역진단에 대한 잠재적인 후보물질로서 확인되었다(Millington, 2011). 활동적 TB를 가진 환자에서, 가장 빈번하게 인지되는 펩티드는 분자의 C-말단부(아미노산 66-90)에 위치하였다. Rv3615c를 인코딩하는 유전자가 BCG에 존재하더라도, Rv3615c 단백질은 M. 튜버쿨로시스로 감염된 개체에서 특이적으로 인지되지만, BCG 백신접종된 사람에게서는 인지가 제한되었다.

EspF ( Rv3865 ). ESX-1 분비-관련 단백질 EspF 단백질 또는 M. 보비스 Mb3895 (M. 튜버쿨로시스 유래의 Rv3865와 동일함)는 Ewer 등(Ewer, 2006)에 의해, M. 보비스로 실험적으로 또는 자연스럽게 감염된 소에서 유망한 진단 마커로서 확인되었다. 실험적으로 감염된 소의 50%는 Mb3895 펩티드 풀에 반응한 반면, BCG-백신접종된 송아지들은 이러한 펩티드 풀에 반응하지 않았다.

Rv2348c. Rv2348c는 미지의 기능을 가진 가설적인 단백질이다. Rv2348c 유전자는 RD7 영역 내에 위치한다. 이러한 영역은 BCG에 존재하지 않는 것으로 나타났으며(Behr, 1999), 따라서, 이러한 단백질은 과거의 백신접종으로부터 방해받지 않고 TB 진단에 사용될 수 있다. 이러한 유전자는 시험관내에서 고도로 전사되며 (Arnvig, 2011), 단백질은 프로테옴 연구에서 확인되었다(de Souza, 2011). Rv2348c ORF(개방형 해독틀)에서 아미노산 단편 23-50은 M. 아비움 유전자 Mav_2040과 매우 높은 상동성을 가진다.

Rv3873. Rv3873의 아미노산 서열로부터, 아미노산 12-70을 포함하는 영역이 중복 펩티드에 의해 포함되었다. 평가된 몇몇 RD 펩티드 풀 중에서, Rv3873A라고 하는 이러한 Rv3873 펩티드 풀이 TB 환자의 PBMC의 46%에 의해 인지된 가장 유망한 풀들 중 하나인 것으로 확인되었다(Brock, 2004). 잠재적인 교차-반응성 신장부는 분자의 이러한 부분에 존재하지 않았다.

Rv3878. 상기 Rv3873에 대해 기술된 바와 같이, Rv3878B라고 명명된 펩티드 풀은 이러한 RD1 단백질의 아미노산 122-189를 포함하며, 정의 및 평가되었다. 이는 인간 TB 환자의 PBMC의 32%에 의해 인지되었으며, 민감성을 최대화하기 위해 ESAT-6 및 CFP10과 조합될 수 있는 펩티드 칵테일 또는 풀로서 제시되었다(Brock, 2004).

Rv2654c. Rv2654c 유전자는 RD11 영역에 의해 인코딩되며, 미지의 기능을 가진 가능한 PhiRv2 프로파지 단백질을 인코딩한다. Rv2654c(TB7.7로 지정됨)의 전체 단백질 생성물을 포함하는 중복 펩티드를 스크리닝함으로써, Brock 등은 BCG-백신접종된 개체에서 교차-인지를 발견하지 못하였으며, 더욱이, 47%의 민감성을 보여주었다(Brock, 2004). 선택된 펩티드(SEQ ID NO 8)는 QuantiFERON® TB Gold 시험에 포함된다.

[표 1] 선택된 펩티드에 대한 서열 목록

실시예 2. 항원의 선택

상기 문맥에서 열거된 항원들 중 7개를 이집트 및 그린란드에서 2개의 독립적인 연구에서 TB 환자 또는 잠복적으로 감염된 개체에서의 인지에 대해 시험하였다. 두 연구 모두에서, ESAT-6(Rv3875)을 또한, 비교용 및 기준 항원으로서 포함하였다. 더욱이, 이집트에서는 PPD를 비특이적 항원 자극의 일례로서 포함하였다.

새로 시료로 만든 희석된 전혈을 기술된 바와 같이 항원 유래의 선택된 펩티드를 사용하여 재자극시켰으며, ESAT-6 및 CFP10의 펩티드-풀에 대한 반응을 기준으로서 포함하였다.

이집트 연구에서, 34명의 지원자 공여자(8명의 여성 및 26명의 남성)를 양성 대조군으로서 포함하였다. 이들 중 32명은 문서화된 양성 객담 배양을 사용하여 TB 질병을 진단받았다(피검자 3 내지 34). 2명은 잠복적인 TB였다(피검자 1 및 2). 또한, 30명의 풍토병 음성 대조군 공여자(5명의 여성 및 25명의 남성)를 포함하였다. 이들은 모두 BCG 백신을 접종받은 것으로 추정되었으며, TB 질병의 이력이 없었고, TB 환자와 접촉한 적도 없는 것으로 알려졌다. 그린란드 연구에서, 31명의 피검자를 포함하였다(15명의 여성 및 16명의 남성). 14명은 TB 질병을 진단받았으며(피검자 1 내지 14); 11명은 문서화된 양성 객담 배양을 가졌고, 4명은 TB 진단이 임상적 배경을 토대로 수행되었다. 남은 17명의 피검자는 잠복적인 TB를 가졌다(피검자 15 내지 31).

두 시험 모두에서, 새로 시료로 만든 희석된 전혈을 선택된 항원(각각의 펩티드 10 ㎍/ml)을 사용하여 플레이트 내에서 자극시켰다. 항원 ESAT-6, CFP10, Rv3873, Rv3878, Rv3615c, Rv3865, Rv3877 및 Rv2348 유래의 합성 펩티드(Genecust로부터 수득됨)를 두 연구 모두에서 스크리닝하였고, 양성 대조군(PHA) 및 음성 대조군(배지 단독) 및 (이집트에서만) PPD 또한, 포함하였다(도시되지 않음). 희석된 전혈을 37℃에서 5일 동안 인큐베이션하고, 후속해서 상층액을 수집하고, 인-하우스 ELISA에 의해 (IFN-γ에 대해) 시험하였다. 이들 연구에서 양성 반응은 이집트 및 그린란드 연구 각각에서 100 pg/ml 또는 50 pg/ml의 IFN-γ 농도로서 정의되었다.

도 1, 도 2 및 도 3은 데이터의 그래프 표현(히트 맵)이며, 여기서, 함유된 개개의 값들은 색상으로 표시되며, 백색은 무반응을 나타내고, 회색은 주어진 항원에 대한 반응을 가리키며, 검은색은 동일한 공여자가 ESAT-6 및/또는 CFP10에는 반응하지 않는, 항원에 대한 반응을 나타낸다. 도시된 바와 같이, 몇몇 시험 항원들은 TB 환자 또는 잠복적으로 감염된 공여자에서 인지되었으며, 가장 우세한 반응은 Rv3615c를 사용한 자극으로부터 유래된다(공여자 중 49%에서 인지됨). 중요하게는, ESAT-6는 CFP10을 사용한 자극 시 인지되지 않는 3명의 환자(도 1에서 환자 번호 9 및 17, 및 도 2에서 환자 번호 3)만 인지하며, 이들 중 Rv3615는 3명의 모든 환자들을 인지할 수 있다. 더욱이, Rv3615c를 사용한 재자극은 각각 ESAT-6 및 CFP10에 의해 인지되지 않는 11 및 9 공여자에서 인지를 보여주었다. 대조적으로, 항원들 중 2개는 매우 한정된 수의 공여자들에서 인지되었으며; Rv3873은 65명의 공여자들 중 불과 2명에게서 인지되었고, Rv3878은 65명의 공여자 중 7명에서 인지되었다. 따라서, 중간 정도의 민감성(Rv3878에 대해 32% 및 Rv3873에 대해 46%)을 가진 덴마크 및 네덜란드인 TB 환자들에서 이들 항원에 대한 과거의 데이터에도 불구하고(Brock, 2004), 본원에서 수득된 데이터는, 모든 항원들이 모든 설정에서 민감하게 거동하는 것으로 예상되지 않았음을 강조한다. Rv3865, Rv3877 및 Rv2348은 중간 정도의 민감성을 보여주었으며, 65명의 공여자 중에서 공여자 16, 12 및 15에서 인지되었다. 중요하게는, 항원, Rv3615c, Rv3865 및 Rv2348은 모두 ESAT-6 및/또는 CFP10을 인지하지 않은 많은 공여자들에서 반응을 유도하며, 이는, 이들 항원의 진단 잠재성을 추가로 가리킨다. 선택된 항원의 특이성을 30명의 이집트인 풍토병 음성 대조군 공여자의 패널에서 확인하였다(도 3). 도시된 바와 같이, 조사된 항원들은 모두, 비특이적 항원 자극의 일례로서 포함된 PPD와는 대조적으로, 고도로 특이적이었다. 공여자 31 및 77은 모두 ESAT-6 및 CFP-10 둘 다를 포함하는 광범위한 M. 튜버쿨로시스 항원을 인지하였으며, 이는 언급된 선택 범주에도 불구하고 잠복적인 감염을 강하게 가리킨다.

실시예 3. CFP10 및 3615c는 CFP10 및 ESAT-6과 유사하다

CFP10과 Rv3615c의 조합의 진단 성능을 후속해서, CFP10과 ESAT-6의 조합의 진단 성능과 비교하였다. 본 발명자들은, 35명의 그린란드인 개체들의 전혈 시료를 포함시켰으며, 이들 중 18명은 양성 Quantiferon 시험으로서 정의되고/거나 M. 튜버쿨로시스에의 노출 및 튜베르쿨린 피부 시험 변환으로서 정의된 잠복적인 M. 튜버쿨로시스 감염을 가졌으며, 17명은 TB를 가진 것으로 미생물학적으로 확인되었다. 200 ㎕ 비희석 전혈의 개별 분취물을, CFP10(SEQ ID 1) 또는 Rv3615(SEQ ID 15-18) 또는 ESAT-6(SEQ ID 51)을 나타내는 중복 펩티드를 5 ㎍/ml의 최종 농도로 사용하여 습도가 유지된 37℃ 인큐베이터에서 7일 동안 자극시켰다. 음성 대조군 시료(nil)를 동시에 제조하였다. 인큐베이션 후, 혈장 상층액을 단리하고, IFN-γ의 수준을 ELISA를 사용하여 확인하였다.

IFN-γ의 항원 특이적 생성의 측정된 수준(미자극 웰에서의 수준을 차감한 자극된 전혈 수준)을, 개별 항원(들)을 사용한 자극에 대한 반응에 더하고, 후속해서 이러한 합계를 컷오프와 비교함으로써, 3가지 항원의 진단 능력을 평가하였다. 컷오프는 적어도 50 pg/ml이며 개별 환자의 nil 값보다 4배 더 높은 조합된 항원 특이적 반응으로서 정의되었다. 컷오프보다 높은 항원 특이적 수준은 개별 환자를 항원 양성으로 분류하였고, 컷오프보다 낮은 항원 특이적 수준은 항원 음성으로 분류하였다.

표 2는 개별 항원 CFP10, Rv3615c, ESAT-6 및 조합들의 민감성을 보여준다. 도시된 바와 같이, CFP10과 Rv3615c의 조합의 진단 성능은 CFP10과 ESAT-6의 조합의 진단 성능과 유사하며, 두 조합 모두 60%의 민감성을 보여준다. CFP10, Rv3615c 및 ESAT-6의 조합은 민감성을 60%에서 69% 이하로 더 개선한다.

[표 2] CFP10 , Rv3615c 및 ESAT -6 및 이들의 조합의 민감성 비교

실시예 4. 3가지 항원: Rv2348 , Rv3865 및 Rv3877을 사용한, CFP10과 Rv3615c 조합의 농화

상기와 동일한 전혈 시료(35명의 그린란드인 개체; 18명은 잠복적인 M. 튜버쿨로시스 감염을 가졌으며, 17명의 환자는 TB를 가진 것으로 미생물학적으로 확인되었음) 및 동일한 분석법 조건을 사용하여, 본 발명자들은 CFP10 및 Rv3615c와 3개의 서로 다른 항원; Rv2348, Rv3865 및 Rv3877의 조합 효과를 평가하였다.

IFN-γ의 항원 특이적 생성의 측정된 수준(미자극 웰에서의 수준을 차감한 자극된 전혈 수준)을, 개별 항원(들)을 사용한 자극에 대한 반응에 더하고, 후속해서 이러한 합계를 컷오프와 비교함으로써, 3가지 항원의 진단 능력을 평가하였다. 컷오프는 적어도 50 pg/ml이며 개별 환자의 nil 값보다 4배 더 높은 조합된 항원 특이적 반응으로서 정의되었다. 컷오프보다 높은 항원 특이적 수준은 개별 환자를 항원 양성으로 분류하였고, 컷오프보다 낮은 항원 특이적 수준은 항원 음성으로 분류하였다.

표 3은 개별 항원 Rv3865, CFP10, Rv3615c 및 조합들의 민감성을 보여준다. Rv3865의 민감성은 단지 20% 민감성으로 상대적으로 중간 정도이지만, Rv3865를 CFP10 및 Rv3615c에 첨가하면, CFP10 및 Rv3865 단독과 비교하여 전체 진단 민감성을 6% 증가시킨다.

[표 3] M. 튜버쿨로시스 감염의 진단에 대한, CFP10 , Rv3615c , Rv3865 및 이들의 조합의 비교

유사하게는, Rv3877의 진단 능력은 단지 11%였으나, 이러한 항원 또한, CFP10 및 Rv3615c의 전체 민감성을 60%에서 69%로 증강시켰다(표 4).

[표 4] M. 튜버쿨로시스 감염의 진단에 대한, CFP10 , Rv3615c , Rv3877 및 이들의 조합의 비교

마지막으로, 본 발명자들은, Rv2348 또한 CFP10 및 Rv3615c의 진단 능력을 증가시킬 수 있는지 평가하였다(표 5). 도시된 바와 같이, Rv2348의 민감성은 29%였으며, Rv2348을 CFP10 및 Rv3615c에 첨가하면, CFP10 및 Rv3615c를 단독으로 사용한 경우와 비교하여, 진단 민감성을 23% 증가시킨다.

[표 5] M. 튜버쿨로시스 감염의 진단에 대한, CFP10 , Rv3615c , Rv2348 및 이들의 조합의 비교

본 발명자들은 하기 항원들(CFP10, Rv3615c, Rv3865 및 Rv2348)을 선택하여, 이들 4가지 항원을 단일 펩티드 풀(펩티드 풀 A)에 조합할 때, 민감성 및 특이성을 추가로 평가하였다.

실시예 5. 펩티드 풀 A의 민감성-시험 및 특이성-시험

본 분야에서, ESAT-6, CFP10 및 TB7.7p4를 포함하는 면역진단 칵테일이 M. 튜버쿨로시스에 의한 감염을 진단하는 바람직한 방법인 것으로 잘 알려져 있다. 이러한 항원 칵테일은 민감성이며 특이적인 것으로 간주되며, Quantiferon 시험의 기본을 형성한다. 이전의 실시예들로부터 명백하듯이, 항원들의 조합은 IFN-γ 반응의 근본적인 규모가 항원을 단독으로 가지는 것과 비교하여 더 높으며 보다 강하게 검출되므로, 진단 민감성 및 시험 신뢰성을 개선한다.

면역진단에 대한 고도의 사용자-친화성 접근법은 칵테일에서 항원으로 미리코팅된 진공 채혈기 튜브를 사용하는 것이다. 예를 들어, Quantiferon 시험에서, 항원 칵테일을 나타내는 동결건조된 펩티드를 진공 채혈기 튜브에서 헤파린으로 코팅한다. 혈액을 이 튜브에 채혈해 넣고, 펩티드를 항원-특이적 CD4 T 세포 및 CD8 T 세포와 상호작용시킨다. 16시간 내지 24시간 동안 인큐베이션한 후, 튜브를 원심분리하고, 생성된 IFN-γ의 수준을 혈장 상층액에서 측정하고, 음성 및 양성 대조군 시료와 비교할 수 있다. IFN-γ의 수준이 양성 시험 결과에 대해 컷오프보다 높은 경우, 시험된 피검자를 감염 또는 비감염으로 추가로 분류할 수 있다.

IFN-γ 신호전달과 관련된 다른 면역 효과기 분자들도 M. 튜버쿨로시스 감염을 진단하는 데 유용한 것으로 잘 알려져 있다(Chego ERJ 2014). 케모카인 IP-10은 매우 높은 수준으로 생성되며, IFN-γ과 유사한 진단 성능을 가진다.

몇몇 항원을 하나의 항원 칵테일 내로 조합하는 유용성을 나타내기 위해, 본 발명자들은 하기 항원들을 "펩티드 풀 A"와 조합하였다. 펩티드 풀 A는 하기 펩티드들로 구성되었다:

- CFP10: CFP10의 전체 아미노산 서열을 포함하는 6개의 펩티드(SEQ ID NO 9-14)

- Rv3615c: 아미노산 55-103을 포함하는 4개의 펩티드(SEQ ID NO 15-18)

- Rv3865: 아미노산 9-44를 포함하는 3개의 펩티드(SEQ ID NO 19-21)

- Rv2348c: 전체 길이 단백질 서열의 아미노산 56-109를 포함하는 4개의 펩티드(SEQ ID NO 22-25).

펩티드 풀 A에 조합되었을 때 4가지 항원의 민감성을 시험하기 위해, 이집트에서 제2의 독립적인 연구를 수행하였다. 연구에서, 문서화된 양성 객담 배양물을 가진 73명의 TB 환자를 포함하였고, 각각의 피검자는 채혈한 혈액 시료를, 이전에 제조된 항원-코팅 진공 튜브에 바로 공여하였다. 튜브를 ESAT-6 + CFP10 + Rv2654c 펩티드(즉, Quantiferon 시험에서와 동일한 펩티드이며 기준으로서 사용되고 Quantiferon 펩티드 풀로서 지정된 펩티드) 또는 펩티드 풀 A(상기 언급된 바와 같은 CFP10 + Rv3516c + Rv3865 + Rv2348)로 코팅하였다. 16시간 내지 24시간 동안 인큐베이션한 후, 상층액을 수집하고, 인-하우스 ELISA에 의해 사이토카인 IP-10의 방출을 시험하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, 높은 비율의 TB 환자가 Quantiferon 펩티드 풀뿐만 아니라 펩티드 풀 A 둘 다 인지하였다. 중앙 반응은 펩티드 풀 A에 대해 5.5 ng/ml의 IP10였으며, Quantiferon 펩티드 풀에 대해 6.0 ng/ml의 IP10였다.

병행하여, 펩티드 풀 A의 특이성을 시험하기 위해, 독립적인 연구를 덴마크에서 수행하였다. 연구에서, TB 유병률이 매우 낮은 지역(덴마크)에 살고 있으며 M. 튜버쿨로시스에 노출된 적이 없는 100명의 피검자를 포함하였다. 17명의 경우에서, 피검자는 문서화된 BCG 백신접종을 받았으며, 19명의 경우에서, BCG 백신접종 상태는 알려져 있지 않으며/문서화되어 있지 않았다. 남은 참가자들은 BCG 백신을 접종받지 않았다. 민감성 연구와 유사하게, 새로운 전혈을, 펩티드 풀 A(CFP10 + Rv3615c + Rv3865 + Rv2348) 또는 기준 Quantiferon 펩티드 풀(ESAT-6 + CFP10 + Rv2654c)로 미리코팅한 진공 튜브에 바로 채혈하였다. 16시간 내지 24시간 동안 인큐베이션한 후, 상층액을 수집하고, 인-하우스 ELISA 분석법에 의해 사이토카인 IP-10 및 IFN-γ의 함량을 시험하였다. 펩티드 풀 A 및 Quantiferon 펩티드 풀에 대한 IP-10 반응 중앙값은 둘 다 0 ng/ml(도 5)이었지만, 소수의 비-노출된 공여자는 Quantiferon-항원으로 재자극 시, 양성 반응을 나타내었으며, 이때 IP-10의 수준은 약 5 ng/ml이었다. IFN-γ의 분비를 분석하였을 때, 위양성 반응을 보이는 비-노출된 공여자에서 동일한 경향이 관찰되었다(도 6; 펩티드 풀 A에서의 중앙값 0 pg/ml, 사분위수 범위(inter quartile range; IQR) -0.5 pg/ml 내지 5.2 pg/ml 및 Quantiferon 펩티드 풀 중앙값 4.9 pg/ml, IQR -0.6 pg/ml 내지 32.45 pg/ml).

민감성 및 특이성 연구의 데이터를 조합함으로써, 본 발명자들은 펩티드 풀 A의 진단 잠재성을 Quantiferon 항원 풀과 비교하는 수여자 작동 특징(ROC) 곡선 분석을 수행할 수 있었다(도 7). 곡선하 면적(AUC)은 펩티드 풀 A의 경우 0.979였으며, Quantiferon 항원 풀의 경우 0.947이었다. ROC 곡선 분석에 의해, 펩티드 풀 A 및 Quantiferon 펩티드 풀 둘 다에 대한 최적의 컷오프는 펩티드 풀 A의 경우 1.4 ng/ml(98.1% 특이성에서 민감성 87.7%); 및 Quantiferon 펩티드 풀의 경우 2.3 ng/ml(96.2% 특이성에서 민감성 75.3%)인 것으로 확인되었다.

이들 컷오프를 사용하여, 본 발명자들은 Quantiferon 펩티드 풀 및 펩티드 풀 A를 사용한 재자극 시, 양성 반응의 수 및 음성 반응의 수를 헤드-투-헤드 비교하였다(표 6 및 표 7). 73명의 TB 환자 중에서, 54명(74%)은 64% 내지 89%의 Quantiferon 항원의 민감성에 대해 공개된 범위 내에서 Quantiferon 펩티드 풀을 인지하였다(Dewan, 2007). 비교 시, 펩티드 풀 A는 본 연구에서 높은 비율의 TB 환자(73명의 환자 중 64명)를 인지하였으며, 이는 88%의 추정 민감성에 상응하였다. McNemar's 시험을 사용하여, 펩티드 풀 A는 본 연구에서 Quantiferon 펩티드 풀과 비교하여 유의미하게 더 높은 민감성을 나타내었다(p<0.012).

[표 6] 73명의 TB 환자에서 Quantiferon 펩티드 풀 및 펩티드 풀 A의 헤드-투-헤드 비교

[표 7] 100명의 추정된 미감염 대조군에서 Quantiferon 펩티드 풀 및 펩티드 풀 A의 헤드-투-헤드 비교

결론적으로, 펩티드 풀 A는 Quantiferon 항원과 비교하여 유의미하게 더 높은 민감성을 나타내었으며(보다 큰 진양성; 표 6), 더욱이 적어도 유사하게 특이적이었다(유사한 위양성; 표 7). 이들 결과는, 1) 현재의 Quantiferon 항원과 비교하여 보다 높은 민감성을 가진, ESAT-6-무함유 TB-진단 펩티드 풀을 설계하며, 2) 현재의 Quantiferon과 유사한 특이성을 가진 ESAT-6-무함유 항원 풀을 설계할 수 있음을 명백하게 나타낸다.

실시예 6. 펩티드 풀 A의 입증

당업자는, 면역진단 시험에 대한 컷오프의 입증이 독립적인 코호트에서의 확인을 필요로 함을 잘 알고 있다. 이를 위해, 본 발명자들은 68명의 미생물학적으로 확인된 TB 환자 및 36명의 풍토병 대조군 사례, 즉 개체를 포함하였으며, 이들 중 일부는 탄자니아로부터 기존의, 그러나 조절된 M. 튜버쿨로시스 감염을 가지고 있다.

각각의 공여자로부터, 1 ml 혈액을, 동결건조된 헤파린(18 IU) 및 하기와 같은 펩티드(5 ㎍/펩티드)를 포함하는 5개의 진공 채혈기 튜브 내로 채혈하였다: Quantiferon 펩티드 풀(ESAT-6, CFP10 및 TB7.7p4(튜브 1), Quantiferon 시험과 유사함); 펩티드 풀 A(CFP10, Rv3615, Rv3865 및 Rv2348B(튜브 2)) 및 음성 대조군 튜브(튜브 3).

도 8에서, 본 발명자들은, 음성 대조군 튜브(튜브 3)가 튜브 1 및 튜브 2의 사례들 및 대조군에서 IP-10(ng/ml) 반응을 차감하였음을 보여준다. Quantiferon 펩티드 풀 및 펩티드 풀 A는 TB 사례에서 반응의 규모가 크다는 점에서 유사한 것이 입증된다. 예상된 바와 같이, 풍토병 대조군 반응은 보다 이질적이며, 일부 시험된 개체들이 감염됨을 뒷받침한다.

실시예 5에서 확인된 미리-정의된 컷오프(1.4 ng/ml)를 사용하여, 진단 정확도를 TB 환자(표 8) 및 풍토병 대조군(표 9) 둘 다에 대해 비교하였다. TB 환자 그룹에서, 표준 Quantiferon 펩티드 풀의 진단 민감성은 66%(포함된 68명의 환자 중 45명이 양성인 것으로 정의됨)였으며, 펩티드 풀 A에서는 진단 민감성이 72%(68명의 환자 중 49명이 양성인 것으로 정의됨)로 더 높았다. 예상된 바와 같이, 2개 시험 사이의 일치점(agreement)은, 91% 일치(accordance)로 매우 높았다(44명이 두 시험 모두에서 양성이었고, 18명이 두 시험 모두에서 음성이었으며, 전체적으로 68명 중 62명이 일치하였음).

[표 8] 양성 시험에 대한 예정된 컷오프를 사용하여, 확인된 TB를 가진 68명의 환자로부터 항원 자극에 대한 반응을 분류한 후, Quantiferon 펩티드 풀과 펩티 드 풀 A의 일치점

풍토병 대조군에서, 감염에 대한 골드 기준(gold standard)은 없으며, 따라서, 본 발명자들은 비율을 양성 반응자로서 제시한다. 펩티드 풀 A는 39%(14/36)를 양성으로서 검출하였으며, 표준 Quantiferon 펩티드 풀은 31%(11/36)를 양성으로서 검출하였고, 이는 보다 높은 민감성을 제시한다. 일치점 또한 매우 높았다(포함된 36명 중에서 33명에서 92%가 일치됨).

[표 9] 양성 시험에 대한 예정된 컷오프를 사용하여, 36명의 풍토병 대조군으로부터 항원 자극에 대한 반응을 분류한 후, Quantiferon 펩티드 풀과 펩티드 풀 A의 일치점

실시예 7. 펩티드 풀 A는 ESAT-6와 조합될 때, 더 개선될 수 있다

본 발명자들은, 진단 성능을 더욱 더 개선하기 위해, ESAT-6를 펩티드 풀 A에 첨가하는 가능성을 추가로 평가하였다. 따라서, 본 발명자들은 이집트 카이로에서 TB가 확정된 73명의 코호트에서, 실시예 5에 기술된 것과 동일한 분석법 조건을 사용하여 펩티드 풀 A + ESAT-6 및 펩티드 풀 A를 시험하였다. 도 9에서, 펩티드 풀 A를 ESAT-6와 조합할 때, 반응의 규모가 증가하며, 이때, 펩티드 풀 A의 중앙 반응값은 5.50 ng/ml IP-10이며, 펩티드 풀 A와 ESAT-6의 조합의 중앙 반응값은 6.86 ng/ml IP-10임이 입증된다. 0.75 ng/ml의 컷오프를 사용하여, 본 발명자들은 2개의 그룹에서 반응자 빈도를 비교하였다. 펩티드 풀 A에서, 반응자 빈도는 93%였으며, 73명의 시험된 환자 중 68명이 양성인 반면, 펩티드 풀 A + ESAT-6에서 반응자 빈도는 96%였다(73명의 환자 중 70명이 양성 - 96%). 따라서, 펩티드 풀 A와 ESAT-6의 조합은 위음성 비율을 7%에서 4%로 감소시켰다.

<110> Statens Serum Institut <120> Diagnostic reagents for improved in vivo or in vitro cell-mediated immunologi-cal diagnosis of tuberculosis <130> 15051 <160> 63 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 100 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 1 Met Ala Glu Met Lys Thr Asp Ala Ala Thr Leu Ala Gln Glu Ala Gly 1 5 10 15 Asn Phe Glu Arg Ile Ser Gly Asp Leu Lys Thr Gln Ile Asp Gln Val 20 25 30 Glu Ser Thr Ala Gly Ser Leu Gln Gly Gln Trp Arg Gly Ala Ala Gly 35 40 45 Thr Ala Ala Gln Ala Ala Val Val Arg Phe Gln Glu Ala Ala Asn Lys 50 55 60 Gln Lys Gln Glu Leu Asp Glu Ile Ser Thr Asn Ile Arg Gln Ala Gly 65 70 75 80 Val Gln Tyr Ser Arg Ala Asp Glu Glu Gln Gln Gln Ala Leu Ser Ser 85 90 95 Gln Met Gly Phe 100 <210> 2 <211> 103 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 2 Met Thr Glu Asn Leu Thr Val Gln Pro Glu Arg Leu Gly Val Leu Ala 1 5 10 15 Ser His His Asp Asn Ala Ala Val Asp Ala Ser Ser Gly Val Glu Ala 20 25 30 Ala Ala Gly Leu Gly Glu Ser Val Ala Ile Thr His Gly Pro Tyr 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Val Val Val 450 455 460 Gly Ser Met Ala His Val Arg Arg Val Ser Pro Val Val Lys Arg Thr 465 470 475 480 Leu Glu Leu Ile Asp Gly Ala Met Ile Ala Ala Ile Ile Pro Met Leu 485 490 495 Leu Trp Ile Thr Gly Val Tyr Asp Thr Val Arg Asn Ile Arg Phe 500 505 510 <210> 8 <211> 18 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 8 Ala Trp Arg Thr Ala Ala Val Glu Leu Ala Arg Ala Leu Val Arg Ala 1 5 10 15 Val Ala <210> 9 <211> 25 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 9 Met Ala Glu Met Lys Thr Asp Ala Ala Thr Leu Ala Gln Glu Ala Gly 1 5 10 15 Asn Phe Glu Arg Ile Ser Gly Asp Leu 20 25 <210> 10 <211> 25 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 10 Gly Asn Phe Glu Arg Ile Ser Gly Asp Leu Lys Thr Gln Ile Asp Gln 1 5 10 15 Val Glu Ser Thr Ala Gly Ser Leu Gln 20 25 <210> 11 <211> 26 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 11 Asp Gln Val Glu Ser Thr Ala Gly Ser Leu Gln Gly Gln Trp Arg Gly 1 5 10 15 Ala Ala Gly Thr Ala Ala Gln Ala Ala Val 20 25 <210> 12 <211> 25 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 12 Ala Ala Gly Thr Ala Ala Gln Ala Ala Val Val Arg Phe Gln Glu Ala 1 5 10 15 Ala Asn Lys Gln Lys Gln Glu Leu Asp 20 25 <210> 13 <211> 25 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 13 Ala Ala Asn Lys Gln Lys Gln Glu Leu Asp Glu Ile Ser Thr Asn Ile 1 5 10 15 Arg Gln Ala Gly Val Gln Tyr Ser Arg 20 25 <210> 14 <211> 25 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 14 Ile Arg Gln Ala Gly Val Gln Tyr Ser Arg Ala Asp Glu Glu Gln Gln 1 5 10 15 Gln Ala Leu Ser Ser Gln Met Gly Phe 20 25 <210> 15 <211> 20 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 15 Leu Asn Val Tyr Leu Thr Ala His Asn Ala Leu Gly Ser Ser Leu His 1 5 10 15 Thr Ala Gly Val 20 <210> 16 <211> 20 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 16 Leu Gly Ser Ser Leu His Thr Ala Gly Val Asp Leu Ala Lys Ser Leu 1 5 10 15 Arg Ile Ala Ala 20 <210> 17 <211> 20 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 17 Asp Leu Ala Lys Ser Leu Arg Ile Ala Ala Lys Ile Tyr Ser Glu Ala 1 5 10 15 Asp Glu Ala Trp 20 <210> 18 <211> 19 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 18 Lys Ile Tyr Ser Glu Ala Asp Glu Ala Trp Arg Lys Ala Ile Asp Gly 1 5 10 15 Leu Phe Thr <210> 19 <211> 20 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 19 Pro Ser Phe Leu Lys Val Leu Ala Gly Met His Asn Glu Ile Val Gly 1 5 10 15 Asp Ile Lys Arg 20 <210> 20 <211> 20 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 20 Gly Met His Asn Glu Ile Val Gly Asp Ile Lys Arg Ala Thr Asp Thr 1 5 10 15 Val Ala Gly Ile 20 <210> 21 <211> 20 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 21 Asp Ile Lys Arg Ala Thr Asp Thr Val Ala Gly Ile Ser Gly Arg Val 1 5 10 15 Gln Leu Thr His 20 <210> 22 <211> 20 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 22 Asp Val Gln Ala Ala Glu Gly Ala Asp Ala Glu Ala Ala Ala Met Asp 1 5 10 15 Glu Trp Asp Glu 20 <210> 23 <211> 20 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 23 Ala Ala Ala Met Asp Glu Trp Asp Glu Trp Gln Ala Trp Asn Glu Trp 1 5 10 15 Val Ala Glu Asn 20 <210> 24 <211> 20 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 24 Ala Trp Asn Glu Trp Val Ala Glu Asn Ala Glu Pro Arg Phe Glu Val 1 5 10 15 Pro Arg Ser Ser 20 <210> 25 <211> 20 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 25 Pro Arg Phe Glu Val Pro Arg Ser Ser Ser Ser Val Ile Pro His Ser 1 5 10 15 Pro Ala Ala Gly 20 <210> 26 <211> 18 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 26 Val Asp Leu Pro Gly Asn Asp Phe Asp Ser Asn Asp Phe Asp Ala Val 1 5 10 15 Asp Leu <210> 27 <211> 18 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 27 Ser Asn Asp Phe Asp Ala Val Asp Leu Trp Gly Ala Asp Gly Ala Glu 1 5 10 15 Gly Trp <210> 28 <211> 18 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 28 Trp Gly Ala Asp Gly Ala Glu Gly Trp Thr Ala Asp Pro Ile Ile Gly 1 5 10 15 Val Gly <210> 29 <211> 18 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 29 Thr Ala Asp Pro Ile Ile Gly Val Gly Ser Ala Ala Thr Pro Asp Thr 1 5 10 15 Gly Pro <210> 30 <211> 18 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 30 Ser Ala Ala Thr Pro Asp Thr Gly Pro Asp Leu Asp Asn Ala His Gly 1 5 10 15 Gln Ala <210> 31 <211> 18 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 31 Asp Leu Asp Asn Ala His Gly Gln Ala Glu Thr Asp Thr Glu Gln Glu 1 5 10 15 Ile Ala <210> 32 <211> 18 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 32 Glu Thr Asp Thr Glu Gln Glu Ile Ala Leu Phe Thr Val Thr Asn Pro 1 5 10 15 Pro Arg <210> 33 <211> 18 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 33 Leu Phe Thr Val Thr Asn Pro Pro Arg Thr Val Ser Val Ser Thr Leu 1 5 10 15 Met Asp <210> 34 <211> 18 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 34 Thr Val Ser Val Ser Thr Leu Met Asp Gly Arg Ile Asp His Val Glu 1 5 10 15 Leu Ser <210> 35 <211> 18 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 35 Gly Arg Ile Asp His Val Glu Leu Ser Ala Arg Val Ala Trp Met Ser 1 5 10 15 Glu Ser <210> 36 <211> 18 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 36 Ala Arg Val Ala Trp Met Ser Glu Ser Gln Leu Ala Ser Glu Ile Leu 1 5 10 15 Val Ile <210> 37 <211> 18 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 37 Gln Leu Ala Ser Glu Ile Leu Val Ile Ala Asp Leu Ala Arg Gln Lys 1 5 10 15 Ala Gln <210> 38 <211> 18 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 38 Ala Asp Leu Ala Arg Gln Lys Ala Gln Ser Ala Gln Tyr Ala Phe Ile 1 5 10 15 Leu Asp <210> 39 <211> 18 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 39 Ser Ala Gln Tyr Ala Phe Ile Leu Asp Arg Met Ser Gln Gln Val Asp 1 5 10 15 Ala Asp <210> 40 <211> 18 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 40 Arg Met Ser Gln Gln Val Asp Ala Asp Glu His Arg Val Ala Leu Leu 1 5 10 15 Arg Lys <210> 41 <211> 18 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 41 Glu His Arg Val Ala Leu Leu Arg Lys Thr Val Gly Glu Thr Trp Gly 1 5 10 15 Leu Pro <210> 42 <211> 18 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 42 Thr Val Gly Glu Thr Trp Gly Leu Pro Ser Pro Glu Glu Ala Ala Ala 1 5 10 15 Ala Glu <210> 43 <211> 18 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 43 Ser Pro Glu Glu Ala Ala Ala Ala Glu Ala Glu Val Phe Ala Thr Arg 1 5 10 15 Tyr Ser <210> 44 <211> 18 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 44 Ala Glu Val Phe Ala Thr Arg Tyr Ser Asp Asp Cys Pro Ala Pro Asp 1 5 10 15 Asp Glu <210> 45 <211> 13 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 45 Asp Asp Cys Pro Ala Pro Asp Asp Glu Ser Asp Pro Trp 1 5 10 <210> 46 <211> 20 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 46 Ala Val Pro Leu Pro Arg Gly Val Asn Ser Leu Gly Ala Pro Gln Val 1 5 10 15 Ala Gly Ala Ala 20 <210> 47 <211> 20 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 47 Gly Ala Pro Gln Val Ala Gly Ala Ala Thr Ala Val Leu Phe Leu Thr 1 5 10 15 Leu Met Thr Arg 20 <210> 48 <211> 20 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 48 Val Leu Phe Leu Thr Leu Met Thr Arg Gly Gly Pro Arg Lys Arg His 1 5 10 15 Glu Leu Ala Ser 20 <210> 49 <211> 20 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 49 Pro Arg Lys Arg His Glu Leu Ala Ser Phe Ala Val Ile Thr Ala Ile 1 5 10 15 Ala Val Ile Ala 20 <210> 50 <211> 21 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 50 Val Ile Thr Ala Ile Ala Val Ile Ala Ala Ala Ala Ala Phe Gly Tyr 1 5 10 15 Gly Tyr Gln Asp Trp 20 <210> 51 <211> 95 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 51 Met Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser 1 5 10 15 Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly 20 25 30 Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser 35 40 45 Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu 50 55 60 Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly 65 70 75 80 Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met Phe Ala 85 90 95 <210> 52 <211> 20 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 52 Met Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser 1 5 10 15 Ala Ile Gln Gly 20 <210> 53 <211> 16 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 53 Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile 1 5 10 15 <210> 54 <211> 25 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 54 Ser Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu 1 5 10 15 Gly Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala 20 25 <210> 55 <211> 25 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 55 Glu Gly Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Ser Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln 20 25 <210> 56 <211> 25 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 56 Ser Gly Ser Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr 1 5 10 15 Ala Thr Glu Leu Asn Asn Ala Leu Gln 20 25 <210> 57 <211> 25 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 57 Thr Ala Thr Glu Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile 1 5 10 15 Ser Glu Ala Gly Gln Ala Met Ala Ser 20 25 <210> 58 <211> 25 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 58 Thr Ala Thr Glu Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile 1 5 10 15 Ser Glu Ala Gly Gln Ala Met Ala Ser 20 25 <210> 59 <211> 20 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 59 Val Tyr Leu Thr Ala His Asn Ala Leu Gly Ser Ser Leu His Thr Ala 1 5 10 15 Gly Val Asp Leu 20 <210> 60 <211> 20 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 60 Leu Gly Ser Ser Leu His Thr Ala Gly Val Asp Leu Ala Lys Ser Leu 1 5 10 15 Arg Ile Ala Ala 20 <210> 61 <211> 20 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 61 Gly Val Asp Leu Ala Lys Ser Leu Arg Ile Ala Ala Lys Ile Tyr Ser 1 5 10 15 Glu Ala Asp Glu 20 <210> 62 <211> 20 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 62 Arg Ile Ala Ala Lys Ile Tyr Ser Glu Ala Asp Glu Ala Trp Arg Lys 1 5 10 15 Ala Ile Asp Gly 20 <210> 63 <211> 20 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 63 Ala Lys Ile Tyr Ser Glu Ala Asp Glu Ala Trp Arg Lys Ala Ile Asp 1 5 10 15 Gly Leu Phe Thr 20

Claims (23)

1. a) Rv3874(SEQ ID NO 1); Rv3615(SEQ ID NO 2); 및 Rv3865(SEQ ID NO 3), Rv2348(SEQ ID NO 4), Rv3614(SEQ ID NO 5), Rv2654(SEQ ID NO 6) 및 Rv3877(SEQ ID NO 7)로부터 선택되는 하나 이상;으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드들; 또는
   b) 상기 폴리펩티드들 유래의 면역원성 에피토프를 포함하는 단편들의 혼합물을 포함하거나; 또는
   c) 폴리펩티드들 또는 상기 폴리펩티드 단편들의 선택된 혼합물이 a) 또는 b)에서 선택되는 폴리펩티드들 중 임의의 폴리펩티드와 적어도 80%의 서열 동일성을 가지며, 동시에 면역원성인, 결핵 진단을 위한 진단 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   Rv3874(SEQ ID NO 1), Rv3615(SEQ ID NO 2) 및 Rv3865(SEQ ID NO 3) 또는 이들의 면역원성 에피토프를 포함하는 단편을 포함하는, 결핵 진단을 위한 진단 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   Rv3874(SEQ ID NO 1), Rv3615(SEQ ID NO 2) 및 Rv2348(SEQ ID NO 4) 또는 이들의 면역원성 에피토프를 포함하는 단편을 포함하는, 결핵 진단을 위한 진단 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   Rv3874(SEQ ID NO 1), Rv3615(SEQ ID NO 2) 및 Rv3877(SEQ ID NO 7) 또는 이들의 면역원성 에피토프를 포함하는 단편을 포함하는, 결핵 진단을 위한 진단 조성물.
5. 제1항에 있어서,
   Rv3874(SEQ ID NO 1), Rv3615(SEQ ID NO 2), Rv3865(SEQ ID NO 3) 및 Rv2348 (SEQ ID NO 4) 또는 이들의 면역원성 에피토프를 포함하는 단편을 포함하는, 결핵 진단을 위한 진단 조성물.
6. 제1항에 있어서,
   SEQ ID NO 1의 면역원성 에피토프를 포함하는 단편이 SEQ ID NO 9 내지 SEQ ID NO 14로부터 선택되는, 결핵 진단을 위한 진단 조성물.
7. 제1항에 있어서,
   SEQ ID NO 2의 면역원성 에피토프를 포함하는 단편이 SEQ ID NO 15 내지 SEQ ID NO 18 또는 SEQ ID NO 59 내지 SEQ ID NO 63으로부터 선택되는, 결핵 진단을 위한 진단 조성물.
8. 제1항에 있어서,
   SEQ ID NO 3의 면역원성 에피토프를 포함하는 단편이 SEQ ID NO 19 내지 SEQ ID NO 21로부터 선택되는, 결핵 진단을 위한 진단 조성물.
9. 제1항에 있어서,
   SEQ ID NO 4의 면역원성 에피토프를 포함하는 단편이 SEQ ID NO 22 내지 SEQ ID NO 25로부터 선택되는, 결핵 진단을 위한 진단 조성물.
10. 제1항에 있어서,
    SEQ ID NO 5의 면역원성 에피토프를 포함하는 단편이 SEQ ID NO 26 내지 SEQ ID NO 45로부터 선택되는, 결핵 진단을 위한 진단 조성물.
11. 제1항에 있어서,
    SEQ ID NO 6의 면역원성 에피토프를 포함하는 단편이 SEQ ID NO 8인, 결핵 진단을 위한 진단 조성물.
12. 제1항에 있어서,
    SEQ ID NO 7의 면역원성 에피토프를 포함하는 단편이 SEQ ID NO 46 내지 SEQ ID NO 50으로부터 선택되는, 결핵 진단을 위한 진단 조성물.
13. 제1항에 있어서,
    Rv3875(SEQ ID NO 51) 또는 이의 하나 이상의 단편을 부가적으로 포함하는, 결핵 진단을 위한 진단 조성물.
14. 제13항에 있어서,
    단편 및 SEQ ID NO 51의 면역원성 에피토프를 포함하는 단편이 SEQ ID NO 52 내지 SEQ ID NO 58로부터 선택되는, 결핵 진단을 위한 진단 조성물.
15. 제1항에 있어서,
    상기 폴리펩티드 유래의 면역원성 에피토프를 포함하는 단편이, 길이가 적어도 10개 아미노산인 중복 펩티드로서 제시되는, 결핵 진단을 위한 진단 조성물.
16. 제5항에 있어서,
    혼합물이 SEQ ID NO 9 내지 SEQ ID NO 25를 포함하는, 결핵 진단을 위한 진단 조성물.
17. 제1항에 있어서,
    폴리펩티드들 중 일부 또는 모두가 선택적으로 링커 또는 스페이서를 통해 함께 융합되는, 결핵 진단을 위한 진단 조성물.
18. 삭제
19. 제1항에 따른 진단 조성물을 포함하는, 결핵 진단용 툴 또는 키트.
20. 제19항에 있어서,
    시험관내 또는 생체내에서 결핵을 진단하기 위한, 결핵 진단용 툴 또는 키트.
21. 제1항에 있어서, 결핵은 미코박테리움 튜버쿨로시스, 미코박테리움 아프리카눔 또는 미코박테리움 보비스로부터 선택된 어느 하나의 독성 미코박테리아에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는, 결핵 진단을 위한 진단 조성물.
22. 삭제
23. 제1항에 있어서,
    상기 진단 조성물은 혈액 시료와 접촉하여 세포의 증식 또는 사이토카인의 방출 중 어느 하나의 양성 반응을 검출하며,
    상기 사이토카인은 IFN-γ 또는 IP-10인 것을 특징으로 하는, 결핵 진단을 위한 진단 조성물.

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