CN107530414A - 区分活动性结核病和潜伏结核感染的结核分枝杆菌抗原及其应用 - Google Patents

区分活动性结核病和潜伏结核感染的结核分枝杆菌抗原及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了区分活动性结核病和潜伏结核感染的结核分枝杆菌抗原及其应用。具体而言，本发明提供了一种免疫原性组合物、疫苗或药物组合物，其所含的免疫原性成分包括选自以下的一种或多种多肽或其免疫性片段：(a)由SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示氨基酸序列组成的多肽或其免疫性片段；(b)与(a)限定的氨基酸序列具有至少70％一致性且与(a)具有相同功能的由(a)衍生的多肽或其免疫性片段。

Description

区分活动性结核病和潜伏结核感染的结核分枝杆菌抗原及其应用 技术领域
本发明涉及结核分枝杆菌(M.tb)抗原或编码其的核酸在诊断、治疗和预防结核分枝杆菌感染中的应用，特别涉及可区分活动性结核病和潜伏结核感染的结核分枝杆菌抗原及其相关应用。
背景技术
结核病一直是世界范围内单病因导致的死亡率最高的一种传染病。据估计世界三分之一人口受到结核分枝杆菌感染，仅2013年就有150万人死于结核。在全球范围内，结核病的有效控制依然面临许多困难和挑战，包括缺乏快速准确的诊断技术、缺乏有效的抗结核疫苗、以及疗程长达数月等。而结核菌和HIV的协同感染以及越来越多的多重抗药性和广泛抗药性TB的传播也使得结核病的防控工作进一步复杂化。基于目前情况，迫切需要快速、准确的诊断方法和更有效的疫苗。
胸部X线和痰涂片镜检是在资源有限国家用于快速诊断肺结核的主要措施。胸部X线有良好的灵敏度，但特异性差。痰涂片镜检简单、快速，价格低廉，在结核病发生率非常高的区域可具有高度特异性。然而，痰涂片镜检在其性能方面具有显著局限性，在细菌载荷小于10,000菌落/ml痰样品时检测灵敏度被严重损害，对于肺外结核、小儿结核以及TB和HIV协同感染的检测可靠性差。
核酸扩增实验(NAATs)，比如最近由世界卫生组织(WHO)认可的Xpert MTB/RIF(Cepheid公司)，使用具有更高灵敏度和特异性的技术，相比痰涂片镜检能更准确、快速诊断结核病。然而，NAATs的基础设施和投资需求往往超出了大多数结核病诊断团体特别是发展中国家的承受范围。
活动性结核病(Active TB)可以通过从痰菌M.tb培养阳性进行确诊。然而，这需要专用的微生物实验室花费几个星期才能得到结果。此外，对于儿童或肺外结核病患者很难获得痰样。
上述基于细菌培养及临床症状的传统诊断方法，进一步受到结核病患者新趋势的挑战。自2000年以来，已完成国家结核病防治规划的所有国家的结核病患病率调查一再证明大多数肺结核确诊病例痰涂片阴性，调查结果还表明，由流行细菌学确诊的肺结核中超过50％的患者不表现通常使用的标准症状怀疑疾病和提示诊断调查(即，咳嗽持续 时间超过2-3周)的对应症状；此外，这些案例中很大比例根本不表现任何症状。
潜伏性结核感染(LTBI)的诊断更具挑战性。在大多数感染结核分枝杆菌个体中，细菌建立可能持续几十年的潜在的、无症状的感染。约5-10％潜伏感染个体会在其生命过程中发展为活动性疾病而且宿主的免疫抑制(如HIV混合感染)显着地增加再活化的风险。多达三分之一的世界人口是潜伏感染，这代表结核分枝杆菌的一个潜在的再激活和随后的传播的巨大存量。通常情况下，被怀疑感染了结核分枝杆菌的人使用结核菌素皮试(TST)，该试验往往提供不同的结果，这使得它们的解释很少一致。由于接种卡介苗的个体或普遍流行非结核性分枝杆菌的地区中的个体的交叉反应，TST假阳性率较高。替代测试是干扰素γ释放测定(IGRAs)，其是检测应答于结核分枝杆菌抗原的细胞免疫(细胞因子)的血液测试，如近几年研发的、市售的Gold In-Tube(QFT-GIT)和(T-Spot)。这些测试比TST特异性更好，但它们也更加昂贵，并且不能区分已具有活性TB的人与已感染但目前尚未表现活性疾病过程的人。
血清学测试是检测应答于结核分枝杆菌抗原的体液免疫(抗体)反应的血液测试，其具有几点优势：(i)使用酶联免疫吸附测定(ELISA)形式的血清学测试可以在数小时内获得结果，且使用免疫层析测定形式，在几分钟之内可获得结果；(ii)如果将血清学测试开发成床旁监护试验，其可能会取代显微镜或扩展应用至医疗服务水平较低的地区。在鉴定结核分枝杆菌的膜组分与培养滤液蛋白中免疫反应性蛋白方面，人们已付出了相当大的努力。通常采用ELISAs及Western blots从TB患者与健康个体对照的血清中筛选候选抗原以用于血清学测试诊断。已经开发出来的基于几个常用抗原的血清学检测试剂盒，如38KD(PstS1)、65KD(GroEL2)、Ag85A、ESAT-6、CFP-10和LAM。然而，尽管有这些努力，仍然没有有效的灵敏的、特异性的血清学测试可准确诊断出结核病，特别是在感染的早期阶段。此外，目前已知的这些抗原中没有一个可鉴别诊断潜伏性结核感染与活动性结核病。
用于疫苗开发中的许多已知的抗原是以纯化的蛋白质或是以融合蛋白的形式加上合适的佐剂，或基于DNA亚单位疫苗的形式。然而，MVA85A最近的临床试验失败表明继续临床前研究并开发新的和更好的候选物的重要性。
因此，一个关键的问题是鉴定可区分活动性TB和LTBI的结核分枝杆菌抗原。在寻找鉴定结核分枝杆菌的潜伏期相关抗原方面，业界人员一直付出了很大的努力。因为缺乏忠实重演人类潜伏性TB的动物模型，包括缺氧和养分饥饿的几种体外条件(通常认为这些条件可模仿结核分枝杆菌存在宿主的肉芽肿环境)已被广泛使用，以确定结核 菌潜伏感染的关键基因。所考虑的抗原是被如下基因编码的抗原：(i)DosR调节子和持久的低氧反应(EHR)的基因，该调节子与基因分别在在早期(2小时)和晚期(7天)上调；(ⅱ)结核分枝杆菌后养分耗竭上调的基因；和(iii)随着细菌从潜伏阶段恢复生长会上调的复活基因。然而，从这些以前的研究确定的已知抗原都不能有效地作为诊断和治疗的成分。
因此，为诊断或治疗结核病，仍然需要提供来自于结核杆菌的抗原的改进的成分和方法。
发明内容
本发明公开了可区分活动性肺结核(active TB)和潜伏结核感染(LTBI)的结核分枝杆菌(M.tb)抗原。
本发明涉及免疫原性成分、疫苗和药物组合物，所述免疫原性成分、疫苗和药物组合物包括结核分枝杆菌抗原Rv2590、Rv0678、Rv0974c和/或Rv2642，或编码这些蛋白的核酸。同时，本发明还涉及合成或重组的短或长的重叠或不重叠的肽。此外，本发明还涉及结核分枝杆菌蛋白Rv2590、Rv0678、Rv0974c和/或Rv2642、或者是编码这些蛋白的基因在用于结核分枝杆菌感染的诊断、治疗和/或预防中的应用。
本案发明人发现，Rv2590、Rv0678、Rv0974c和Rv2642具有高度免疫原性，并与活动性肺结核患者、潜伏结核感染者和健康个体血清反应不同。特别是，Rv2590与活动性肺结核患者具有强烈的血清反应，但与潜伏结核感染者或健康个体血清没有反应。Rv0678、Rv0974c和Rv2642与潜伏结核感染者血清有强烈反应，而与活动性肺结核患者或健康个体无反应。因此，抗原Rv2590、Rv0678、Rv0974c和Rv2642可用于诊断结核分枝杆菌感染，能有效区分活动性肺结核患者和潜伏结核感染者。此外，由于Rv2590、Rv0678、Rv0974c和Rv2642具有高度免疫原性，这些抗原可被用于疾病的治疗(例如，以DNA疫苗的形式)和/或预防(例如，以提纯蛋白或融合蛋白的形式)。
从而，一方面，本发明提供了一种免疫原性成分、疫苗或药物组合物，其包括选自以下的一种或多种多肽或其免疫性片段：
(a)由SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示的氨基酸序列组成的多肽或其免疫性片段；
(b)与(a)限定的氨基酸序列具有至少70％一致性且与(a)具有相同功能的由(a)衍生的多肽或其免疫性片段；
所述免疫性片段例如T细胞表位。
本发明还提供了一种免疫原性成分、疫苗或药物组合物，其包括选自以下的一种或多种核酸分子：
(a)由SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示的核苷酸序列或其互补序列组成的核酸分子；
(b)由与(a)中核酸分子编码相同氨基酸序列的核苷酸序列或其互补序列组成的核酸分子；或者
(c)在严格条件下与(a)或(b)限定的核酸分子杂交且具有至少10个核苷酸长度的核酸分子。
所述核酸分子优选为DNA片段。
在本发明的一个实施方案中，本发明的免疫原性成分、多肽和核酸被用于在体外和/或体内检测，用于检测体液中针对M.tb的抗体或细胞介导的免疫反应，以进行疾病诊断、感染诊断，或监测疾病进展。核酸和多肽可用于在非人动物体内产生抗M.tb抗体。所述抗体可用于体内和/或体外检测靶抗原。在本发明的一个方面，本发明的所述免疫原性成分、多肽和核酸被用于诊断方法，以筛选不同人群(例如，活动性、潜伏感染、健康人)相关的与所述抗原有抗体反应的抗血清。
在本发明的一个实施方案中，本发明的免疫原性成分、多肽和核酸可被用于能够测定人体体液中与本发明的多肽反应的抗体的量的各种体外免疫测定装置和/或能够测定M.tb抗原-抗体结合物的量的免疫测定装置。所述的免疫测定装置包括但不限于以下方法所用到的装置：放射免疫分析法(radio-immunoassay)，酶免疫测定法(enzyme immunoassay)，免疫色谱方法(immuno-chromatographic assay)，免疫荧光测定法(Immunofluorescence)，免疫印迹和免疫斑点结合测定法(immuno-blotting and dot immuno-binding)，化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA)，胶乳凝集法(latex-agglutination)，抗体芯片技术(antibody microarray)或本领域技术人员所知晓的任何其他方法。
在本发明的一个实施方案中，本发明的免疫原性成分、多肽和核酸可被用于各种体外细胞因子释放检测，测定由本发明的多肽诱导产生的细胞因子的分泌水平，所述的细胞因子包括IFN-γ、TNF和IL-2中的至少一种。
从而，本发明还提供了一种检测生物体液中抗体存在的组合物，其包括：
(a)本发明所述的免疫原性成分；
(b)至少一种检测试剂材料和/或设备，用于定量检测抗体与(a)的结合物。
本发明还提供了一种检测生物体液中细胞因子的组合物，其包括：
(a)本发明所述的免疫原性成分；
(b)至少一种检测试剂材料和/或设备，用于检测细胞因子的分泌水平，所述细胞因子包括IFN-γ、TNF和IL-2中的至少一种。
根据本发明的具体实施方案，本发明所述的检测组合物，其中，所述检测试剂材料和/或设备包括但不限于用于以下方法检测抗体与(a)本发明所述的免疫原性成分的结合物、或者检测细胞因子的分泌水平的试剂材料和/或设备：
放射免疫分析法(radio-immunoassay)，酶免疫测定法(enzyme immunoassay)，免疫色谱方法(immunochromatographic assay)，免疫荧光测定法(Immunofluorescence)，免疫印迹和免疫斑点结合测定法(immunoblotting and dot immunobinding)，化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA)，胶乳凝集法(latex-agglutination)，抗体芯片技术(antibody microarray)。
根据本发明的具体实施方案，所述生物体液包括但不限于：人或动物的血液、血浆、血清、痰、尿液、脑脊液、胸腔积液或组织液。
本发明还提供了所述的免疫原性成分或所述的检测组合物在制备用于结核病的诊断制剂或试剂盒中的应用。其中，所述结核病的诊断包括鉴别潜伏性结核感染与活动性结核病。
本发明还提供了一种用于诊断个体活动性肺结核疾病和/或潜伏结核感染的方法，该方法包括步骤：
i)将来自个体的生物样品与本发明的至少一种多肽一起进行温育；之后
ii)定量生物样品中细胞因子的分泌水平，所述细胞因子包括IFN-γ、TNF、和IL-2中的至少一种。
在本发明的进一步的实施方案中，所述多肽可在皮试时用作体内诊断试剂。本文中所述的“皮试”是直接对患者进行的、其中通过下皮内注射一种或多种上述多肽以测量延迟型超敏反应(DTH)反应(例如肿胀，发红或皮肤炎)的任意测定法。
这种注射可以用能使所述多肽与患者真皮细胞接触的任何合适的设备来实现，例如结核菌素注射器或1mL的注射器。优选地，反应是在注射后至少48小时测量，更优选在注射后48-72小时测量。
在本发明的更进一步的实施方案中，本发明的免疫原性成分、多肽和核酸被用作疫 苗用于人类中，以增强机体对由致病性分枝杆菌，如：结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、牛型分枝杆菌(Mycobacterium africanum)、非洲分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)或溃疡分枝杆菌(Mycobacterium ulcerans)，引起的结核感染的抗性。即，本发明还提供了一种增强机体对由致病性分枝杆菌引起的结核感染的抗性的方法。该方法包括施予个体包括本发明的纯化多肽或其免疫原性片段的免疫原性组分。所述多肽或其免疫原性片段的免疫原性可通过与佐剂的融合被加强，也可以通过添加分枝杆菌多肽，或其他生物，如细菌、病毒、哺乳动物多肽来加强。添加的多肽也被包含在本发明的免疫原性组分中，以交联或非交联形式结合到所述多肽或其免疫原性片段上。
在本发明的另一实施方案中，本发明的核酸随机插入到载体，如腺病毒或牛痘病毒载体中，以DNA疫苗形式直接用于人类，在体内表达抗原，导致机体对致病性分枝杆菌，如：结核分枝杆菌、牛型分枝杆菌、非洲分枝杆菌、麻风分枝杆菌或溃疡分枝杆菌引起的结核感染的抗性。因此，本发明中的多肽和核酸可以构成治疗性成分，应用于人类，来预防和/或治疗结核分枝杆菌感染。从而，本发明还提供了一种非致病性微生物，其中整合有至少一个拷贝的包含本发明所述的核酸分子的DNA片段(例如，放在游离质粒中或整合进入微生物基因组)，且DNA片段能够以多肽形式在微生物中表达。其中所述微生物例如可为BCG。
本发明还提供了一种人类或动物优选哺乳类动物预防结核病的免疫方法，该方法包括施予个体本发明所述的免疫组分、或所述的非致病性微生物。
本发明的多肽可以作为单抗原，或组合其他试剂材料(任选地还与结核分枝杆菌的其它抗原组合)用于制备各种诊断试剂组合物、治疗性组合物或疫苗。
本发明所述的诊断试剂组合物、治疗性组合物或疫苗等可以用于人类或动物(优选哺乳类动物)。
附图说明
图1：选定抗原的克隆、表达、纯化方案。
图2：Rv2590蛋白的表达和纯化。其中，图片A中，泳道1：分子量标准；泳道2：未经IPTG诱导的全细胞；泳道3：经IPTG诱导的全细胞；泳道4：诱导细胞的可溶胞质组分(cytoplasmic fraction)；泳道5：诱导细胞的不溶细胞沉淀(cell pellet)。图片B中，泳道1：分子量标准；泳道2：纯化的Rv2590蛋白。
图3：选定抗原诱导的T细胞应答。
图4：选定抗原诱导的抗原特异性抗体的生产。
图5：选定抗原对活动性结核病(TB)、潜伏性结核感染(LTBI)和健康对照组(HC)的血清学检测。
图6：先前已知抗原对活动性结核病(TB)、潜伏性结核感染(LTBI)和健康对照组(HC)的血清学检测。
具体实施方式
结核病的全球控制面临的一个主要挑战是缺乏快速、准确的诊断。当前的免疫学诊断方法受到通常低的检测灵敏度和特异性以及不能区分活性TB与LTBI的限制。1998年，Cole等完成了结核分枝杆菌H37Rv的全基因组测序，预测有4000个开放阅读框，揭示了其核苷酸序列和推测的蛋白序列。然而，这一序列信息无法预测蛋白的抗原性。此外，即使一个蛋白具有抗原性，这一信息也不足以预测出/判断出其是一个好的诊断候选物。本领域人员都很清楚，判断一个蛋白是否是一个好的诊断候选物的唯一办法，是像下文提出的，生产该给定蛋白、并用合适的方法测试该蛋白质是否能与不同疾病期(例如，活动性疾病，潜伏感染，无感染等)人群的生物体液起差异反应。现有各种诊断试剂盒包括使用38KD(PstS1)、65KD(GroEL2)、Ag85A、ESAT-6、CFP-10和LAM等常用的结核分枝杆菌抗原，没有一个可以有效区分活动性结核病与潜伏性结核感染病例。
本发明的实验表明，Rv2590、Rv0678、Rv0974c和Rv2642具有高度的免疫原性，并与活动性结核病患者、潜伏结核感染者和健康个体血清反应不同。因此，这些抗原是有希望用于诊断的标志物，可以有效区分人类活动性结核病患者和潜伏结核感染者。Rv2590、Rv0678、Rv0974c和Rv2642的氨基酸序列请参见表1中所示的SEQ ID No.1至SEQ ID No.4，编码这些蛋白的核苷酸序列请参见表2中所示的SEQ ID No.5至SEQ ID No.8。Rv2590、Rv0678、Rv0974c和Rv2642的序列信息来源于结核分枝杆菌H37Rv菌株，网址http://www.tbdb.org/。
表1.选定抗原的氨基酸序列
表2.选定抗原的DNA序列
为了评价免疫原性，Rv2590、Rv0678、Rv0974c和Rv2642开放读码框分别克隆进入pET28a质粒，用标准化程序利用E.coli BL21菌株表达、纯化(图1和图2)。分别用10μg纯化好的蛋白与Freund’s不完全佐剂混合，隔周免疫C57BL/6小鼠(每组4只)，共免疫3次以评价这些抗原的免疫原性。首次免疫8周后处死小鼠分离脾细胞。在有/无相应抗原(浓度分别为5μg/ml、10μg/ml)刺激下培养脾细胞。3天后收集细胞培养上清用ELISA检测Th1型细胞因子(IFN-γ、TNF和IL-2)释放水平。以纯化的Ag85A抗原为对照。结果显示Rv2590、Rv0678、Rv0974c和Rv2642具有高度免疫原性，能够诱导出接近Ag85A的Th1型细胞因子(图3)。Rv2590、Rv0678、Rv0974c和Rv2642也能在免疫鼠中诱导出高水平抗原特异性抗体，产生强B细胞免疫反应(图4)。
为了测定Rv2590、Rv0678、Rv0974c和Rv2642是否可与不同疾病人群血清反应以区分不同疾病组，本发明纯化了Rv2590、Rv0678、Rv0974c和Rv2642蛋白，用于ELISA检测待测人群血清。待测人群包括三组：活动性肺结核组(20例)、潜伏性结核感染组(25例)和健康对照组(24人)。活动性肺结核组包括11例痰涂片阳性、9例患者具有临床症状和异常X射线。潜伏性结核感染组定义为与结核病患者有长时间(2-8年，平均4.3年)持续而密切的接触、但没有表现出结核病临床症状的个体。健康人的定义是那些没有与结核病患者密切接触过、并且没有临床症状或结核病史的个体。所有个体都来自同一地理区域，并已预先用BCG接种。本发明的实验结果表明，Rv2590、Rv0678、Rv0974c和Rv2642对不同疾病群体的人的血清反应不同。特别是，活动性肺结核组血清中识别Rv2590的抗体的水平显著高于潜伏性结核感染组和健康对照组(图5中A)。Rv2590特异性抗体的血清在潜伏性结核感染组和健康对照组之间没有差异。作为鲜明的对比，潜伏性结核感染组血清中结合Rv0678、Rv0974c或Rv2642的抗体水平显著高 于活动性肺结核组和健康对照组(图5中B-D)。对于这三种抗原(Rv0678、Rv0974c和Rv2642)，活动性肺结核组和健康对照组的血清中抗体水平无差异。
为了比较，本发明还克隆、表达和纯化了现有技术中已被普遍用于免疫学诊断结核病的以前已知抗原，包括杆菌Ag85A、ESAT-6、CFP-10和65kD抗原(GroEL2)，用相同待测人群血清进行平行ELISA实验。结果显示，潜伏性结核感染组和活动性肺结核组血清中识别Ag85A、ESAT-6、CFP-10和65kD抗原的抗体水平均高于健康对照组(图6)，而潜伏性结核感染组和活动性肺结核组之间没有差异，作为已知事实，Ag85A、ESAT-6、CFP-10和65-kD，不能区分潜伏性结核感染组和活动性肺结核组。
本发明的研究表明，Rv2590对于活动性肺结核组具有高度特异性，Rv0678、Rv0974c和Rv2642对于潜伏性结核感染组具有高度特异性，这与先前已知的抗原不同。本发明的这些抗原可用于区分活动性结核病和潜伏性结核感染的诊断，并且，组合使用这两种类型的抗原(即，Rv2590，与Rv0678、Rv0974c或Rv2642)将提高整体的检测灵敏度(活动性结核病和潜伏性结核感染)和特异性，并保持区分活动性结核病和潜伏性结核感染的能力。
本发明涉及Rv0976c、Rv1255c、Rv3160c和Rv0792c蛋白的免疫学诊断结核病(包括活动性结核病和潜伏性结核感染)的方法。本发明中的蛋白、多肽或肽包括天然蛋白、多肽或肽，或者与天然蛋白、多肽或肽功能相同的同系物。这些同系物包括与表1中包含的天然蛋白、多肽或肽具有至少60％，70％、80％以上(较好)、最好90％以上(如95％、96％、97％、98％或99％)的氨基酸序列同源性的蛋白、多肽或肽。这些同系物包括在表1中天然蛋白、多肽或肽的氨基酸序列基础上替换、增加和缺失一个或多个(如：1-50，1-20，1-10，1-5)氨基酸残基的蛋白、多肽或肽。这类同系物尤其包括含有保守氨基酸替换的蛋白、多肽或肽。
术语“本发明中的核酸序列”是指编码本发明的多肽的核苷酸序列。进一步，本发明的范围内所指的短或长的重叠或非重叠肽的氨基酸序列，它们与本发明中的任何一种多肽具有至少70％的氨基酸序列一致性。
本发明涉及诊断由致病性分枝杆菌在人或动物体引起的结核病的方法。在一个实施方案中，血清样品或受试者的其它生物体液与本发明的多肽接触，血清样品或其它生物体液中抗体与本发明多肽的结合表明受试者存在活动性疾病或潜伏感染。
在免疫测定中与本发明的多肽特异性反应的单克隆或多克隆抗体，或与所述抗体特异性结合的片段，也属于本发明的保护范围。来自个体体液或潜在感染器官样本与上述 抗体混合，在被感染个体中能够检测到样本和抗体的结合。
编码本发明中多肽的核酸探针也能被用作多种诊断试验，检测特定样本中病原体的存在。这种结核诊断方法可以包含至少部分核酸序列，利用PCR或成熟的杂交技术，使来自于人或动物的样本与核酸片段(或全长片段)杂交，检测样本中核酸序列的存在。
本发明涉及诊断由致病性分枝杆菌在人或动物体引起的结核病的方法。该方法包括：用本发明中的多肽皮内注射，在结核病患病个体的注射部位会产生可检测的阳性皮肤反应，在未患结核病个体的注射部位则不会检测到皮肤反应。
源于人或动物体的含有单核细胞(如：T淋巴细胞)的血样本与发明的多肽样本混合，阳性反应可能是T细胞增殖，或者是胞外细胞因子诸如IFN-γ、TNF或IL-2的释放。
在本发明进一步的实施方案中，本发明提供了上述多肽或核酸作为制备免疫原性组分、疫苗或治疗性成分的应用，它们能与BCG联合作为预防性疫苗，抗致病性分枝杆菌，如结核分枝杆菌、牛型分枝杆菌、非洲分枝杆菌、麻风分枝杆菌、溃疡分枝杆菌感染的加强疫苗或治疗性疫苗。本发明中的免疫原性组分、疫苗或治疗性成分能作为预防性疫苗用于未被致病性分枝杆菌感染的人群或接种过BCG的人群，也能作为治疗性疫苗用于被致病性分枝杆菌感染的群体。
核酸分子的多样化
修饰
本申请提供的DNA序列中的核苷酸分子可能被修饰，这对于所属领域技术人员是显而易见的。本发明包括能够直接在细菌或哺乳动物细胞表达的序列(或其片段)的核苷酸修饰。修饰包括核苷酸的置换、插入或缺失，核苷酸相对位置的改变或顺序变化。
本发明的核酸分子包括编码表1序列中保守和沉默氨基酸的核苷酸分子的变化。保守氨基酸置换的鉴定方法如文献所示：Wu,Thomas D.“Discovering Empirically Conserved Amino Acid Substitution Groups in Databases of Protein Families”(http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez/query.fcgi？cmd＝Retrieve&db＝PubMed&list_uids＝8877523&dopt＝Abstract).
本发明的核酸分子包括编码导致表1序列中非保守氨基酸的置换、添加或缺失的序列。包括使表1氨基酸中非保守氨基酸序列改变的对应功能的核酸分子(DNA和RNA)，它们编码的氨基酸序列具有非保守氨基酸置换(尤其是化学近似物的置换)、添加、或缺失，但也保留与表1相同或相似的氨基酸序列。这些DNA或RNA可能编码表1所示氨基酸序列的片段或变异体。
片段可以作为免疫原和免疫原性成分。这样的片段或变异体能通过下述方法鉴定。
序列一致性(Sequence Identity)
本发明中所涉及的核酸分子(或其片段)，与说明书中列出的核酸分子序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％，或者，最好99％或99.5％同一性(一致性)，能够在细菌或哺乳动物细胞系中表达。一致性是指两个核苷酸序列的相似性，序列对齐之后能够匹配的最高值。一致性根据现有成熟方法计算。例如，如果一段核苷酸序列(称之为序列A)与SEQ ID NO.5的参照片段具有90％一致性，则除了在每100个SEQ ID NO.5的参照核苷酸序列中，序列A存在10个点突变(例如和其他核苷酸的置换)外，其余序列完全一致。
序列一致性(每个结构都不含有编码核苷酸的插入)被优先设置成：序列与发明中提供的SEQ ID NO.5或其互补序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％，或者，最好99％或99.5％一致性。序列一致性首先用生物信息学中GCG程序进行计算(Wisconsin大学)。其他的程序也可以用于一致性计算，例如Clustal W程序(较好地用于缺省参数；Thompson,JD et al.,Nucleic Acid Res.22:4673-4680)，BLAST P，BLAST X算法，基因组研究所的鸟分枝杆菌BLASTN(http:tigrblast.tigr.org/)，Wellcome Trust Sanger研究所(http://www.sanger.ac.uk/Projects/Microbes/)的牛型分枝杆菌、牛型分枝杆菌BCG(Pastuer)、海分枝杆菌、麻风分枝杆菌、结核分枝杆菌BLASTN，Pasterur研究所(Tuberculist)(http://genolist.pasteur.fr/TubercuList/)的结核分枝杆菌BLASTN研究，Pasterur研究所(Leproma)(http://genolist.pasteur.fr/Leproma/)的麻风分枝杆菌研究，Minnesota大学(http://www.cbc.umn.edu/ResearchProjects/Ptb/和http://www.cbc.umn.edu/ResearchProjects/AGAC/Mptb/Mptbhome.html)微生物基因组计划的副结核分枝杆菌BLASTN，在美国NCBI USA-(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)的各种BLAST研究，以及GenomeNet(生物信息学中心–化学研究所)(http://blast.genome.ad.jp/)的各种BLAST研究。
由于遗传密码子的简并性，表2中所给出的核酸序列不仅仅是编码表1中多肽的唯一序列。本发明包含与表2中核酸分子具有相同基本遗传信息的核酸分子。与申请书中的核酸序列相比出现1个或更多个核苷酸变化(包括RNA)，但产生了与表1中相同的多肽产物的核酸分子也在本发明保护范围之内。
其他编码上述多肽的核苷酸功能等价物能够用常规的DNA-DNA或DNA-RNA杂 交技术分离。
杂交
本发明涉及的DNA与申请中提供的核酸分子具有足够的序列一致性，在严格的杂交条件下能够实现杂交(本领域常用的杂交技术)。本发明也包含能与表2中的序列或其互补序列中的一个或多个发生杂交的核酸分子。这种核酸分子在高度严格条件下实现杂交(Sambrook et al.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Most Recent Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)。最好用低盐洗涤液(约0.2％SSC)，约50-65℃反应温度。
疫苗
疫苗的制备众所周知。很典型的是，可注射的液体溶液或混悬液；易于在注射前溶解或悬浮在液体中的固态形式，可能通过乳化、蛋白脂质体化制备。免疫原性成分常常和可药用的、与活性成分兼容的辅料混合在一起。合适的辅料包括：水、生理盐水、葡萄糖、甘油、乙醇或其混合物。另外，如果需要，疫苗可以含有微量辅料，如浸润剂或乳化剂、pH缓冲液、和/或增强疫苗效果的佐剂。佐剂的有效成分可能包括，但不限于：氢氧化铝，N-acetyl-muramyl-L-threonyl-D-isoglutamine(thr-MDP)，N-acetyl-nor-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamine(CGP 11637，被称为nor-MDP)，N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanine-2-(1'-2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamine(CGP 19835A，被称为MTP-PE)和RIBI。RIBI是将3种细菌抽提组分：单磷酰脂质A、海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)混合在2％三十碳六烯/Tween 80TM乳液中制成的佐剂。
佐剂的效率通过免疫原性多肽直接诱导的抗体水平来评价，这种多肽含有结核分枝杆菌的免疫原性序列，与不同佐剂混合后免疫接种。通常疫苗的接种方式是皮下或肌肉注射，也有栓剂或口服配方。就栓剂而言，传统的粘合剂或载体包括诸如聚乙二醇、甘油三酯，这类栓剂是含有0.5％到10％(1％到2％较好)活性成分的混合物。口服配方包括正常使用的辅料，象药用级别的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁之类。这些成分与10％-95％(25％-70％较好)活性组分构成溶液、悬浊液、片剂、药丸、胶囊，缓释剂或粉剂等形式。
根据预防性和/或治疗性疫苗的使用目的，给予适当的疫苗免疫剂量。
疫苗可以以单剂量方案给予，或优选以多剂量方案给予。多剂量方案是这样的方案，其中初次接种疫苗过程可用在1-10个单独的剂量，接着在维持和或加强免疫应答所需 的随后时间间隔给予其他剂量，例如在1-4个月给予第二剂量，如果需要，几个月后给予随后的剂量。给药方案至少部分由个体决定，并且有赖于从业人员的判断。
另外，疫苗可以与其他的诸如免疫球蛋白类免疫调节剂协同使用，本发明的一个从属部分也是一个由本疫苗与其他疫苗，尤其是BCG或重组BCG混合组成的多价疫苗配方。
治疗性成分(药物组合物)
本发明中的治疗性成分用于人或哺乳动物抗结核分枝杆菌、牛型分枝杆菌、非洲分枝杆菌、麻风分枝杆菌或溃疡分枝杆菌的治疗或预防，也用于治疗退行性疾病，异常生理状态，如恶性肿瘤。
治疗性成分可以以片剂、喷雾、气管灌注或静脉注射方式用于人类或动物。
下面结合具体实例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，所有的出版物(包括GenBank条目)、专利和专利申请以及本领域技术人员对本发明各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所请求保护范围。例如，本发明所指的蛋白，涵盖了常用的肽或多肽；同样，本发明涉及的基因，也涵盖常用的核苷酸或基因片段。
实施例
实施例1、选定抗原的克隆、表达和纯化
抗原蛋白Rv2590、Rv0678、Rv0974c和Rv2642的克隆、表达和纯化方案如图1所示。Rv2590的开放阅读框通过使用上游PCR引物5’-ATCAGGATCCGTGAGCGTCAACGACGGGGTC-3’(SEQ ID No.9)和下游PCR引物5’-ATCGAAGCTTTCAGTCGTCCTCTCCGGTTCGCTGG-3’(SEQ ID No.10)扩增。同样，Rv0678、Rv0974c和Rv2642的PCR扩增引物分别是：5’-ATCAGGATCCGTGAGCGTCAACGACGGGGTC-3’(上游，Rv0678，SEQ ID No.11),5’-ATCGAAGCTTTCAGTCGTCCTCTCCGGTTCGCTGG-3’(下游，Rv0678，SEQ ID No.12)；5’-TATGCTAGCGTGCTGCAATCCACACTG-3’(上游，Rv0974c，SEQ ID No.13),5’-GCGAAGCTTTCACATCCGGAAGACGC-3’(下游，Rv0974c，SEQ ID No.14)；5’-GATGGATCCATGTCGAATCTGCATCCGTTACC-3’(上游，Rv2642，SEQ ID No.15),5’-TATAAGCTTTCATGCCGGTGCCCCCAG-3’(下游，Rv2642，SEQ ID No.16)。
以结核分枝杆菌基因组DNA为模板进行PCR反应(50μl体系)，其中含有模板DNA(10ng)，0.5μM引物，0.2mM dNTPs，1X反应缓冲液，1.25单位PrimeSTAR HS  DNA多聚酶(Clontech)。循环条件：95℃变性5min；30个循环的变性(98℃，10sec)、退火(65℃，20sec)、延伸(72℃，2min)；最后72℃延伸5min，4℃冷却。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后使用凝胶纯化试剂盒(Qiagen)纯化。37℃下用BamHI and HindIII酶切PCR纯化产物3h，酶切后的目的片段用凝胶纯化试剂盒(Qiagen)纯化。pET28a质粒(Novagen)用同样条件酶切回收。质粒-基因片段连接产物pET28a-Rv2590、pET28a-Rv0678、pET28a-Rv0974c和pET28a-Rv2642分别转化进入E.coli DH5α。连接反应体系(共10μl)包括：2μl PCR片段，2μl pET28a片段，1μl 10X T4连接酶缓冲液，1μl DNA T4连接酶(NEB)。室温下连接3h，65℃下孵育20min终止反应。连接反应液与E.coli DH5α感受态细胞混合，涂布在含有卡那霉素(50μg/ml)的LB平板上，37℃过夜培养，随机挑选单克隆接种入LB液体培养基。用Qiagen Miniprep试剂盒从E.coli DH5α菌体中抽提重组质粒pET28a-Rv2590、pET28a-Rv0678、pET28a-Rv0974c和pET28a-Rv2642，DNA测序验证插入序列正确。
为了获得重组蛋白，重组质粒pET28a-Rv2590、pET28a-Rv0678、pET28a-Rv0974c和pET28a-Rv2642分别转化入E.coli BL21，涂布在含有卡那霉素(50μg/ml)的LB平板上，37℃过夜培养，随机挑选单克隆接种入LB液体培养基，扩培至1L。26℃培养3h后加入1mM IPTG，26℃过夜诱导培养。4℃下12,000rpm离心10min收集菌体，重悬于BugBuster(Novagen)蛋白抽提液中。
为了纯化重组蛋白，上述E.coli裂解液在4℃下12,000rpm离心20min收集上清。吸取上清和Ni-NTAResin介质(Novagen)加入到空色谱柱中，按照操作手册的流程纯化蛋白。蛋白纯度经聚丙烯酰胺凝胶电泳判断，浓度用BCA实验(Sigma)确定。Rv2590的表达纯化如图2所示，Rv0678、Rv0974c和Rv2642用同样方法纯化。
实施例2、Rv2590、Rv0678、Rv0974c和Rv2642蛋白的免疫原性
C57BL/6小鼠(每组4只)，用50μl纯化蛋白(10μg)和50μl Freund’s不完全佐剂(Sigma)充分混合，皮下注射免疫。隔周免疫一次，共免疫3次。首次免疫8周后处死小鼠，分离脾脏。获得脾脏淋巴细胞后，加1×106个淋巴细胞入24孔细胞培养板中，给予相应蛋白刺激，浓度分别为5μg/mL、10μg/mL。37℃5％CO2100％饱和湿度下培养60小时。
离心收集细胞培养上清，检测Th1型细胞因子IFN-γ、TNF和IL-2释放水平，使用OptEIATM预包被ELISA试剂盒(BD Biosciences)，按照试剂盒推荐的程序操作。纯化的Ag85A作为参照，不同抗原细胞因子表达结果根据Ag85A结果做均一化处理。结果 显示Rv2590、Rv0678、Rv0974c以及Rv2642蛋白具有高度免疫原性，能够诱导接近于Ag85A的Th1型细胞因子分泌水平(图3)。
为了评价B细胞反应，收集小鼠血清，用ELISA法检测抗原特异性抗体水平。血清经系列稀释后(1:400到1:51200)加入96孔板，孔中预包被不同抗原。抗体亚型的ELISA检测使用HRP标记的抗鼠IgG1或IgG2c二抗。结果显示Rv2590、Rv0678、Rv0974c以及Rv2642蛋白在免疫小鼠体内诱导出高水平的抗原特异性抗体，显示出强B细胞反应能力(图4)。
实施例3、选定抗原对活动性肺结核病、潜伏性结核感染和健康人对照组(HC)的血清学测试
待测人群包括三组：活动性肺结核组(20例)、潜伏性结核感染组(25例)和健康对照组(24人)。活动性肺结核组包括11例痰涂片阳性、9例患者具有临床症状和异常X射线。潜伏性结核感染组定义为与结核病患者有长时间(2-8年，平均4.3年)持续而密切联系、但没有表现出结核病临床症状的个体。健康人的定义是那些没有与结核病患者密切接触过、并且没有临床症状或结核病史的个体。所有个体都来自同一地理区域，并已预先用BCG接种。
每种纯化抗原(Rv2590，Rv0678，Rv0974c或Rv2642)加入到96孔板(2.5微克/孔)，向抗原包被的孔中加入待测人群个体血清(1：100稀释)进行温育。通过ELISA使用标准方法测定抗原特异性抗体的产生。结果表明Rv2590特异性地与活动性TB组反应(图5A)，而Rv0678、Rv0974c和Rv2642优先与LTBI组血清反应(图5B-D)。
对比例1、先前已知抗原对活动性肺结核病、潜伏性结核感染和健康人对照组(HC)的血清学测试
纯化的Ag85A、ESAT-6、CFP-10和65-kD，用与实施例3相同的待测人群血清进行平行ELISA实验。结果显示，Ag85A、ESAT-6、CFP-10和65-kD，不能区分潜伏性结核感染组和活动性肺结核组(图6)。

Claims (13)

  1. 一种免疫原性成分，其包括选自以下的一种或多种多肽或其免疫性片段：
    (a)由SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示的氨基酸序列组成的多肽或其免疫性片段；
    (b)与(a)限定的氨基酸序列具有至少70％一致性且与(a)具有相同功能的由(a)衍生的多肽或其免疫性片段；
    所述免疫性片段例如T细胞表位。
  2. 一种检测生物体液中抗体存在的组合物，其包括：
    (a)权利要求1所述的免疫原性成分；
    (b)至少一种检测试剂材料和/或设备，用于定量检测抗体与(a)的结合物。
  3. 根据权利要求2所述的检测组合物，其中，所述检测试剂材料和/或设备包括但不限于用于以下方法检测抗体与(a)的结合物的试剂材料和/或设备：
    放射免疫分析法(radio-immunoassay)，酶免疫测定法(enzyme immunoassay)，免疫色谱方法(immunochromatographic assay)，免疫荧光测定法(Immunofluorescence)，免疫印迹和免疫斑点结合测定法(immunoblotting and dot immunobinding)，化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA)，胶乳凝集法(latex-agglutination)，抗体芯片技术(antibody microarray)。
  4. 根据权利要求2所述的检测组合物，其中，所述生物体液包括但不限于：人或动物的血液、血浆、血清、痰、尿液、脑脊液、胸腔积液或组织液。
  5. 一种检测生物体液中细胞因子的组合物，其包括：
    (a)权利要求1所述的免疫原性成分；
    (b)至少一种检测试剂材料和/或设备，用于检测细胞因子的分泌水平，所述细胞因子包括IFN-γ、TNF和IL-2中的至少一种。
  6. 根据权利要求5所述的检测组合物，其中，所述检测试剂材料和/或设备包括但不限于用于以下方法检测抗体与(a)的结合物的试剂材料和/或设备：
    放射免疫分析法(radio-immunoassay)，酶免疫测定法(enzyme immunoassay)，免疫色谱方法(immunochromatographic assay)，免疫荧光测定法(Immunofluorescence)，免疫印迹和免疫斑点结合测定法(immunoblotting and dot immunobinding)，化学发光免 疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA)，胶乳凝集法(latex-agglutination)，抗体芯片技术(antibody microarray)。
  7. 根据权利要求5所述的检测组合物，其中，所述生物体液包括但不限于：人或动物的血液、血浆、血清、痰、尿液、脑脊液、胸腔积液或组织液。
  8. 权利要求1所述的免疫原性成分或权利要求2～7任一项所述的检测组合物在制备用于结核病的诊断制剂或试剂盒中的应用。
  9. 根据权利要求8所述的应用，其中，所述结核病的诊断包括鉴别潜伏性结核感染与活动性结核病。
  10. 一种免疫原性成分，其包括选自以下的一种或多种核酸分子：
    (a)由SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示的核苷酸序列或其互补序列组成的核酸分子；
    (b)由与(a)中核酸分子编码相同氨基酸序列的核苷酸序列或其互补序列组成的核酸分子；或者
    (c)在严格条件下与(a)或(b)限定的核酸分子杂交且具有至少10个核苷酸长度的核酸分子。
  11. 一种非致病性微生物，其中整合有至少一个拷贝的包含权利要求8的核酸分子的DNA片段(例如，放在游离质粒中或整合进入微生物基因组)，且DNA片段能够以多肽形式在微生物中表达。
  12. 根据权利要求11所述的非致病性微生物，其中所述微生物为BCG。
  13. 一种人类或动物优选哺乳类动物预防结核病的免疫方法，该方法包括施予个体权利要求1或10所述的免疫组分、或权利要求11所述的非致病性微生物。
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