CN109134617A

CN109134617A - 结核分枝杆菌脂蛋白g在制备抗病毒产品中的应用

Info

Publication number: CN109134617A
Application number: CN201710452200.4A
Authority: CN
Inventors: 米凯霞; 李晓静; 陈榕; 周怡璇
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2017-06-15
Filing date: 2017-06-15
Publication date: 2019-01-04
Anticipated expiration: 2037-06-15
Also published as: CN109134617B

Abstract

本发明公开了一种结核分枝杆菌脂蛋白G的新用途。本发明所提供的结核分枝杆菌脂蛋白G的新用途具体为LprG相关生物材料(结核分枝杆菌脂蛋白G或者相关多肽、编码结核分枝杆菌脂蛋白G的核酸分子、含有所述核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌)在制备抗病毒产品中的应用。本发明发现结核分枝杆菌脂蛋白G(LprG)与抗病毒相关，且发现LprG与宿主细胞蛋白CypA互作。本发明对于抗病毒药物研发、为研发基于结核分枝杆菌‑宿主免疫应答界面的药物提供新靶标具有重要意义具有重要意义。

Description

结核分枝杆菌脂蛋白G在制备抗病毒产品中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种结核分枝杆菌脂蛋白G在制备抗病毒产品中的应用。

背景技术

结核分枝杆菌脂蛋白G(LprG)是结核分枝杆菌H37Rv Rv1411c基因编码的一种脂蛋白，是结核分枝杆菌细胞膜的组成部分，也可被分泌到胞外以分泌蛋白的形式存在。

环孢素A由11个氨基酸组成的环状多肽组成，属于强效免疫抑制剂。临床上主要用于肝、肾以及心脏移植的抗排异反应，也可与肾上腺皮质激素同用，治疗免疫性疾病。亲环素A(cyclophilin A,CypA)又称环孢素A(CsA)结合蛋白(cyclophilin)，是环孢素A的细胞内受体，介导环孢素A发挥免疫抑制作用。

目前尚未有LprG与CypA互作的报道，也没有LprG与抗病毒相关的报道。

发明内容

本发明的目的是提供结核分枝杆菌脂蛋白G的新用途。

本发明所提供的结核分枝杆菌脂蛋白G的新用途，具体涉及如下几种：

第一，LprG相关生物材料在制备抗病毒产品中的应用；

所述LprG相关生物材料可选自如下任一：结核分枝杆菌脂蛋白G或者相关多肽、编码结核分枝杆菌脂蛋白G的核酸分子、含有所述核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌。

第二，LprG相关生物材料在如下任一中的应用：

(1)制备用于抑制病毒繁殖的产品；

(2)制备用于破坏病毒颗粒形态的产品；

(3)制备用于降低病毒致病力的产品；

在上述两个应用中，所述病毒具体可为艾滋病毒或流感病毒。

第三，LprG相关生物材料在如下任一中的应用：

(1)干扰HIV假病毒包装和/或繁殖，或者制备用于干扰HIV假病毒包装和/或繁殖的产品；

(2)促进流感病毒的M1蛋白降解，或者制备用于促进流感病毒的M1蛋白降解的产品；

第四，结核分枝杆菌脂蛋白G在作为亲环素A的互作蛋白中的应用。

第五，LprG相关生物材料在分离、纯化、富集和/或筛选亲环素A，或者制备用于分离、纯化、富集和/或筛选亲环素A的产品中的应用；

在本发明中，所述结核分枝杆菌脂蛋白G的氨基酸序列具体为序列表中序列1。

相应的，编码所述结核分枝杆菌脂蛋白G的核酸分子具体为序列表中序列2所示的DNA分子。

所述亲环素A的氨基酸序列具体为序列表中序列3。

本发明首次发现结核分枝杆菌脂蛋白G(LprG)与抗病毒相关，且发现LprG与宿主细胞蛋白CypA互作。本发明对于抗病毒药物研发、为研发基于结核分枝杆菌-宿主免疫应答界面的药物提供新靶标具有重要意义。

附图说明

图1为LprG干扰HIV假病毒包装和/或繁殖结果。*表示在P<0.05水平上差异显著。

图2为LprG促进流感病毒的M1蛋白降解结果。*表示在P<0.05水平上差异显著。

图3为LprG与CypA互作研究中的荧光聚焦共定位实验结果。

图4为LprG与CypA互作研究中的pull-down实验结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

293T细胞：ATCC,CRL-3216。

pNL43R-E-luciferase质粒和pcDNA 3.1-env质粒：记载于“Shang H,Han X,ShiX,et al.Genetic and neutralization sensitivity of diverse HIV-1env clonesfrom chronically infected patients in China.[J].Journal of BiologicalChemistry,2011,286(16):14531-41.”一文，公众可从申请人处获得，尽可用于重复本发明实验使用。

ghost细胞：在无菌环境中，从6-8周的小鼠取血1mL，加入500μL 3.8％的柠檬酸钠，在4℃2000rpm的条件下离心5min，弃上清后，用1mL预冷的PBS洗3次。然后加入低渗缓冲液(10mM Tris，0.1mM EDTA，1mM CaCl₂，pH7.4)，冰上放置5分钟，在4℃下以9000rpm离心5分钟以除去细胞内容物。再用预冷的低渗缓冲液洗涤三次。再加入PBS，冰上放置20min。再通过在4℃以9000rpm离心5分钟收集ghost细胞。用PBS将ghost细胞最终体积调节至100μL，用于细胞培养。

pCI-eGFP-M1质粒：以pCI(Promega公司产品)为原始质粒，通过酶切位点NheI-EcoRI插入eGFP(序列6)，通过酶切位点EcoRI-SalIM1插入M1(序列7)后得到的重组质粒。引物分别为：

eGFP-for：5’-CTA GCTAGC GTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3’；

eGFP-rev：5’-CCG GAATTC CTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3’。

M1-for：5’-CCG GAATTC ATGAGTC TTCTAACCGA GGTC-3’；

M1-rev：5’-ACGC GTCGAC TCACTTGAACCGTTGCATCTG-3’。

实施例1、LprG干扰HIV假病毒包装和/或繁殖

一、实验步骤

1.细胞铺板：293T细胞按2×10⁶接种于6孔板，转染时细胞密度达到70-80％。

2.转染前，采用200ng/ml药物环孢素A即CsA或300ng/mL LprG蛋白(氨基酸序列为序列表中序列1，对应的编码基因的序列为序列表中序列2)预处理30min。

3.转染试剂准备：pNL43R-E-luciferase质粒、pcDNA 3.1-env质粒按照4：1(质量比)混合，DMEM稀释后加入转染试剂Nenofect，室温静止15分钟。

4.将混合物加入293T细胞培养液中，继续培养48h，包装病毒。

5.收集上清，4℃，3000rpm，离心5min，去除细胞碎片，得到HIV假病毒。

6.感染ghost细胞：ghost细胞按照2×10⁴接种于96孔板，过夜培养后，加入50μl步骤5包装的假病毒。

7.继续培养48h，测荧光酶素值变化。

实验同时设置没有加入HIV假病毒的对照组(buffer是加入PBS做对照，blank是什么都不加)，以及加入HIV假病毒但不提前经用CsA或LprG预处理的对照组。

实验中，每个处理组设置三个重复，结果取均值。

二、实验结果

结果如图1所示。buffer和blank表示没有加入HIV假病毒的实验组，作为实验的负对照，基本上测不到萤光素酶的活性。加入HIV假病毒组，萤光素酶活性大大提高，表明病毒侵入以及包装繁殖正常，提前用CsA或LprG预处理的细胞，加入HIV假病毒，萤光素酶活性明显下降(P<0.05)，表明LprG具有和CsA相似的作用，干扰HIV假病毒的包装和繁殖。因此，LprG具有抑制HIV病毒繁殖的功能。

实施例2、LprG促进流感病毒的M1蛋白降解

一、实验步骤

pCI-GFP-M1质粒的构建过程，以质粒pCI为骨架质粒，通过GFP通过酶切位点NheI-EcoRI插入，M1插入位点为EcoRI-SalI。

1.细胞铺板：293T细胞按5×10⁴接种于96孔板，转染时细胞密度达到70-80％。

2.转染前，采用200ng/ml CsA或300ng/ml LprG蛋白预处理30min。

3.转染试剂准备：pCI-eGFP-M1质粒0.1μg，DMEM稀释后加入转染试剂Nenofect，室温静止15分钟。

4.将混合物加入293T细胞培养基中，继续培养48h。

5.酶标仪检测GFP荧光值变化。

实验同时设置没有加入pCI-eGFP-M1质粒的对照组(即空白对照组blank)，以及加入pCI-eGFP-M1质粒但不提前经用CsA或LprG预处理的对照组(M1组)。

实验中，每个处理组设置至少三个重复，结果取均值。

二、实验结果

M1蛋白是流感病毒的基质蛋白，在维持病毒颗粒形态与病毒的致病性中发挥重要作用。此实验探索了LprG对M1蛋白稳定性影响，实验结果如图2所示，表明采用CsA和LprG蛋白预处理的293T细胞中，M1蛋白的量明显下降(P<0.05)，表明LprG具有和CsA相似的作用，可以加速流感病毒M1蛋白的降解。因此，LprG可通过加速降解M1蛋白从而破坏流感病毒颗粒形态、降低流感病毒的致病力。

实施例3、LprG与宿主细胞蛋白CypA直接互作

一、实验步骤

1、荧光聚焦共定位实验步骤

(1)将质粒pcDNA-lprG-flag以及pcDNA-cypA，共转染到细胞293T中。

其中，pcDNA-lprG-flag以及pcDNA-cypA构建过程如下：以质粒pcDNA3.1(+)为骨架质粒，分别将lprG-flag(序列4，第1-708位为lprG，第709-732位为flag)和cypA(序列5)通过NheI、XbaI酶切位点插入。

(2)细胞用4％的多聚甲醛固定20min，用PBS洗三遍。

(3)用0.1％曲拉通-100透膜10min(摇动)，用PBS洗三遍。

(4)用5％的BSA封闭1h或过夜(摇动)，用PBS洗三遍，加一抗(鼠抗FLAG标签单克隆抗体，北京普利莱基因技术有限公司，C1305；兔抗CypA多克隆抗体，Proteintech Group，51040-1-AP)孵育2h，用PBST洗三遍，加二抗(TRITC，Goat Anti-Rabbit IgG抗体；AlexaFluor488,Donkey Anti-Mouse IgG抗体，北京依玛博科技有限公司，EM35131-01，EM35140-01)孵育1h，碧云天DPAI 5min(不宜过长)洗三遍(可多洗几次每次5min)。

(5)封片，激光共聚焦显微镜下看片。

2、体外pull-down实验步骤

(1)pull-down用缓冲液：所有缓冲液使用前均需预冷

A.结合缓冲液：1×TBS、1mM PMSF；

B.平衡缓冲液：1×TBS、1mM PMSF；

C.洗脱缓冲液：1×TBS、1mM PMSF、400μl相应蛋白标签(Flag/Myc)

(2)取20μl Flag beads/Myc beads(上海蓝木化工有限公司，B23101,B23401)于1.5ml Ep管中，加1ml平衡缓冲液重悬beads，4℃5000rpm离心30s，轻轻吸弃上清(切勿吸到beads)，重复3次。

(3)向平衡好的Flag beads/Myc beads加1ml结合缓冲液，再加30μg LprG蛋白或者CyPA蛋白，4℃孵育1-2h。

(4)4℃5000rpm离心30s，轻轻吸弃上清。

(5)向步骤(4)中的beads加1ml结合缓冲液，再加30μg CyPA蛋白或者LprG蛋白，4℃孵育1-2h。

(6)4℃5000rpm离心30s，轻轻吸弃上清。

(7)向步骤(6)中的beads加50μl洗脱缓冲液，4℃垂直旋转洗脱1h。

(8)4℃5000rpm离心30s，轻轻吸取上清到另一新的1.5ml Ep管中。

(9)加SDS蛋白上样缓冲液，沸水中煮5min，室温12000rpm离心5min，蛋白样品制备完成，可立即进行下游实验或存于-20℃。

(10)SDS-PAGE

(11)western-blotting，一抗为鼠抗FLAG标签单克隆抗体(北京普利莱基因技术有限公司,C1305)，兔抗CypA多克隆抗体(Proteintech Group,51040-1-AP)；二抗为HRP标羊抗小鼠IgG二抗、HRP标羊抗兔IgG二抗(北京普利莱基因技术有限公司,C1308,C1309)。

二、实验结果

荧光聚焦共定位实验结果如图3所示。LprG蛋白带有绿色荧光，CypA蛋白标记红色荧光。实验结果表明，LprG与CypA可以共定位，显示黄色荧光信号。

体外pull-down实验结果如图4所示。表明：LprG与CypA有直接相互作用。

由于LprG与宿主细胞蛋白CypA直接互作，因此LprG可用于分离、纯化、富集和/或筛选CypA。

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 结核分枝杆菌脂蛋白G在制备抗病毒产品中的应用

<130> GNCLN171031

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 236

<212> PRT

<213> 结核分枝杆菌（M.tuberculosis）

<400> 1

Met Arg Thr Pro Arg Arg His Cys Arg Arg Ile Ala Val Leu Ala Ala

1 5 10 15

Val Ser Ile Ala Ala Thr Val Val Ala Gly Cys Ser Ser Gly Ser Lys

20 25 30

Pro Ser Gly Gly Pro Leu Pro Asp Ala Lys Pro Leu Val Glu Glu Ala

35 40 45

Thr Ala Gln Thr Lys Ala Leu Lys Ser Ala His Met Val Leu Thr Val

50 55 60

Asn Gly Lys Ile Pro Gly Leu Ser Leu Lys Thr Leu Ser Gly Asp Leu

65 70 75 80

Thr Thr Asn Pro Thr Ala Ala Thr Gly Asn Val Lys Leu Thr Leu Gly

85 90 95

Gly Ser Asp Ile Asp Ala Asp Phe Val Val Phe Asp Gly Ile Leu Tyr

100 105 110

Ala Thr Leu Thr Pro Asn Gln Trp Ser Asp Phe Gly Pro Ala Ala Asp

115 120 125

Ile Tyr Asp Pro Ala Gln Val Leu Asn Pro Asp Thr Gly Leu Ala Asn

130 135 140

Val Leu Ala Asn Phe Ala Asp Ala Lys Ala Glu Gly Arg Asp Thr Ile

145 150 155 160

Asn Gly Gln Asn Thr Ile Arg Ile Ser Gly Lys Val Ser Ala Gln Ala

165 170 175

Val Asn Gln Ile Ala Pro Pro Phe Asn Ala Thr Gln Pro Val Pro Ala

180 185 190

Thr Val Trp Ile Gln Glu Thr Gly Asp His Gln Leu Ala Gln Ala Gln

195 200 205

Leu Asp Arg Gly Ser Gly Asn Ser Val Gln Met Thr Leu Ser Lys Trp

210 215 220

Gly Glu Lys Val Gln Val Thr Lys Pro Pro Val Ser

225 230 235

<210> 2

<211> 711

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌（M.tuberculosis）

<400> 2

atgcggaccc ccagacgcca ctgccgtcgc atcgccgtcc tcgccgccgt tagcatcgcc 60

gccactgtcg ttgccggctg ctcgtcgggc tcgaagccaa gcggcggacc acttccggac 120

gcgaagccgc tggtcgagga ggccaccgcg cagaccaagg ctctcaagag cgcgcacatg 180

gtgctgacgg tcaacggcaa gatcccggga ctgtctctga agacgctgag cggcgatctc 240

accaccaacc ccaccgccgc gacgggaaac gtcaagctca cgctgggtgg gtctgatatc 300

gatgccgact tcgtggtgtt cgacgggatc ctgtacgcca ccctgacgcc caaccagtgg 360

agcgatttcg gtcccgccgc cgacatctac gaccccgccc aggtgctgaa tccggatacc 420

ggcctggcca acgtgctggc gaatttcgcc gacgcaaaag ccgaagggcg ggataccatc 480

aacggccaga acaccatccg catcagcggg aaggtatcgg cacaggcggt gaaccagata 540

gcgccgccgt tcaacgcgac gcagccggtg ccggcgaccg tctggattca ggagaccggc 600

gatcatcaac tggcacaggc ccagttggac cgcggctcgg gcaattccgt ccagatgacc 660

ttgtcgaaat ggggcgagaa ggtccaggtc acgaagcccc cggtgagctg a 711

<210> 3

<211> 165

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

Met Val Asn Pro Thr Val Phe Phe Asp Ile Ala Val Asp Gly Glu Pro

1 5 10 15

Leu Gly Arg Val Ser Phe Glu Leu Phe Ala Asp Lys Val Pro Lys Thr

20 25 30

Ala Glu Asn Phe Arg Ala Leu Ser Thr Gly Glu Lys Gly Phe Gly Tyr

35 40 45

Lys Gly Ser Cys Phe His Arg Ile Ile Pro Gly Phe Met Cys Gln Gly

50 55 60

Gly Asp Phe Thr Arg His Asn Gly Thr Gly Gly Lys Ser Ile Tyr Gly

65 70 75 80

Glu Lys Phe Glu Asp Glu Asn Phe Ile Leu Lys His Thr Gly Pro Gly

85 90 95

Ile Leu Ser Met Ala Asn Ala Gly Pro Asn Thr Asn Gly Ser Gln Phe

100 105 110

Phe Ile Cys Thr Ala Lys Thr Glu Trp Leu Asp Gly Lys His Val Val

115 120 125

Phe Gly Lys Val Lys Glu Gly Met Asn Ile Val Glu Ala Met Glu Arg

130 135 140

Phe Gly Ser Arg Asn Gly Lys Thr Ser Lys Lys Ile Thr Ile Ala Asp

145 150 155 160

Cys Gly Gln Leu Glu

165

<210> 4

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

atgcggaccc ccagacgcca ctgccgtcgc atcgccgtcc tcgccgccgt tagcatcgcc 60

gccactgtcg ttgccggctg ctcgtcgggc tcgaagccaa gcggcggacc acttccggac 120

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gtgctgacgg tcaacggcaa gatcccggga ctgtctctga agacgctgag cggcgatctc 240

accaccaacc ccaccgccgc gacgggaaac gtcaagctca cgctgggtgg gtctgatatc 300

gatgccgact tcgtggtgtt cgacgggatc ctgtacgcca ccctgacgcc caaccagtgg 360

agcgatttcg gtcccgccgc cgacatctac gaccccgccc aggtgctgaa tccggatacc 420

ggcctggcca acgtgctggc gaatttcgcc gacgcaaaag ccgaagggcg ggataccatc 480

aacggccaga acaccatccg catcagcggg aaggtatcgg cacaggcggt gaaccagata 540

gcgccgccgt tcaacgcgac gcagccggtg ccggcgaccg tctggattca ggagaccggc 600

gatcatcaac tggcacaggc ccagttggac cgcggctcgg gcaattccgt ccagatgacc 660

ttgtcgaaat ggggcgagaa ggtccaggtc acgaagcccc cggtgagcga ctacaaggac 720

gatgatgaca agtga 735

<210> 5

<211> 498

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 5

atggtcaacc ccaccgtgtt cttcgacatt gccgtcgacg gcgagccctt gggccgcgtc 60

tcctttgagc tgtttgcaga caaggtccca aagacagcag aaaattttcg tgctctgagc 120

actggagaga aaggatttgg ttataagggt tcctgctttc acagaattat tccagggttt 180

atgtgtcagg gtggtgactt cacacgccat aatggcactg gtggcaagtc catctatggg 240

gagaaatttg aagatgagaa cttcatccta aagcatacgg gtcctggcat cttgtccatg 300

gcaaatgctg gacccaacac aaatggttcc cagtttttca tctgcactgc caagactgag 360

tggttggatg gcaagcatgt ggtgtttggc aaagtgaaag aaggcatgaa tattgtggag 420

gccatggagc gctttgggtc caggaatggc aagaccagca agaagatcac cattgctgac 480

tgtggacaac tcgaataa 498

<210> 6

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 6

gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc 60

gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc 120

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gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag 240

cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc 300

aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 360

aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag 420

ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc 480

atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac 540

cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac 600

ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg 660

ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caagtaa 717

<210> 7

<211> 759

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 7

atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gtactctcta tcatcccgtc aggccccctc 60

aaagccgaga tcgcacagag acttgaagat gtctttgcag ggaagaacac cgatcttgag 120

gttctcatgg aatggctaaa gacaagacca atcctgtcac ctctgactaa ggggatttta 180

ggatttgtgt tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgctttgtc 240

caaaatgccc ttaatgggaa cggggatcca aataacatgg acaaagcagt taaactgtat 300

aggaagctca agagggagat aacattccat ggggccaaag aaatctcact cagttattct 360

gctggtgcac ttgccagttg tatgggcctc atatacaaca ggatgggggc tgtgaccact 420

gaagtggcat ttggcctggt atgtgcaacc tgtgaacaga ttgctgactc ccagcatcgg 480

tctcataggc aaatggtgac aacaaccaat ccactaatca gacatgagaa cagaatggtt 540

ttagccagca ctacagctaa ggctatggag caaatggctg gatcgagtga gcaagcagca 600

gaggccatgg aggttgctag tcaggctaga caaatggtgc aagcgatgag aaccattggg 660

actcatccta gctccagtgc tggtctgaaa aatgatcttc ttgaaaattt gcaggcctat 720

cagaaacgaa tgggggtgca gatgcaacgg ttcaagtga 759

Claims

1.LprG相关生物材料在制备抗病毒产品中的应用；

所述LprG相关生物材料选自如下任一：结核分枝杆菌脂蛋白G或者相关多肽、编码结核分枝杆菌脂蛋白G的核酸分子、含有所述核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌。

2.LprG相关生物材料在如下任一中的应用：

(1)制备用于抑制病毒繁殖的产品；

(2)制备用于破坏病毒颗粒形态的产品；

(3)制备用于降低病毒致病力的产品；

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述病毒为艾滋病毒或流感病毒。

4.LprG相关生物材料在如下任一中的应用：

5.结核分枝杆菌脂蛋白G在作为亲环素A的互作蛋白中的应用。

6.LprG相关生物材料在分离、纯化、富集和/或筛选亲环素A中的应用；

7.LprG相关生物材料在制备用于分离、纯化、富集和/或筛选亲环素A的产品中的应用；

所述LprG相关生物材料选自如下任一：结核分枝杆菌脂蛋白G、编码结核分枝杆菌脂蛋白G的核酸分子、含有所述核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌。

8.根据权利要求1-7中任一所述的应用，其特征在于：所述结核分枝杆菌脂蛋白G的氨基酸序列为序列表中序列1。

9.根据权利要求1-8中任一所述的应用，其特征在于：所述核酸分子为序列表中序列2所示的DNA分子。

10.根据权利要求1-9中任一所述的应用，其特征在于：所述亲环素A的氨基酸序列为序列表中序列3。