CN107722111A - 一种巨噬细胞吞噬能力促进剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种巨噬细胞吞噬能力促进剂，属于细胞生物学领域。本发明提供的所述巨噬细胞吞噬能力促进剂能提升巨噬细胞吞噬能力，所述巨噬细胞吞噬能力促进剂主要作用于β2整合素的配体，依赖表达在细胞表面的β2整合素提升巨噬细胞吞噬能力。本发明成果可为临床多种疾病的治疗提供新的工具和思路，还对寻找新的药物靶点和筛选新药具有重要的理论意义。

Description

一种巨噬细胞吞噬能力促进剂

技术领域

本发明涉及一种巨噬细胞吞噬能力促进剂，属于细胞生物学领域。

背景技术

作为结核病(Tuberculosis,TB)的病原体，结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis， Mtb)威胁着全球公众的健康。它与艾滋病、疟疾并称为当今世界威胁人类健康的三大传染病。

结核分枝杆菌H37Rv基因组含有四个mce操纵子，每个操纵子由两个yrbE基因(yrbEA、yrbEB)，五个mce基因(mceA、mceB、mceC、mceD、mceF)和一个编码脂蛋白的基因组成。已有的研究报道了mce缺失突变体衰减了结核分枝杆菌的毒力，相比于结核分枝杆菌H37Rv 感染的小鼠，mce缺失突变体菌株感染的小鼠存活时间更长。mce操纵子主要参与分枝杆菌对宿主细胞的入侵，拥有假定的N端输出信号肽，可能定位在分枝杆菌菌体表面。在四个 mce操纵子中，mce3操纵子位于结核分枝杆菌基因组的RD15区，而且在牛型结核分枝杆菌 BCG中缺少mce3操纵子。mce3操纵子参与调节结核分枝杆菌对宿主细胞的入侵以及结核分枝杆菌在宿主细胞内的存活。例如，Mce3A被报道能促进乳胶微珠侵入哺乳动物细胞，Mce3E 被报道能抑制ERK1/2信号通路促进分枝杆菌在宿主细胞内的存活。结核分枝杆菌能通过结合细胞表面的受体分子触发胞内信号通路从而促进分枝杆菌侵入宿主细胞，但关于能被mce3 操纵子编码蛋白识别并结合的细胞表面受体尚未有文献报道。

巨噬细胞属于吞噬细胞，在机体免疫功能中发挥着重要的角色。已有的研究表明，生物机体内的巨噬细胞可以随着微环境的变化而改变它们的表型和免疫功能，不断根据自身受到的刺激来改变自己的生理状态和免疫活性，从而更好的保证生物体机体和组织的健康。不同的刺激物质包括机体自身蛋白分子、小分子物质、真菌和细菌的提取物等能够刺激并激活巨噬细胞，从而增强巨噬细胞免疫反应和吞噬能力。在大多数脊椎动物细胞中，吞噬作用是保护机体处于健康状态的措施而非摄食的手段，吞噬作用的强弱是表现巨噬细胞免疫功能强弱及活性的重要标志，通过免疫细胞的吞噬作用，可以直接研究免疫学中巨噬细胞的相关作用，并深入揭示细胞吞噬这一动态过程。

发明内容

本发明提供了一种能够提升巨噬细胞吞噬能力的促进剂，通过与巨噬细胞表面的β2整合素结合促进巨噬细胞的吞噬能力。所述吞噬能力是一种保护措施而非摄食的手段。高等动物具有一些特化的吞噬细胞，包括巨噬细胞、中性粒细胞、白细胞，它们通过吞噬菌体摄取和消灭感染的细菌、病毒以及损伤的细胞、衰老的红细胞。吞噬作用对于其要消灭的对象无特异性，在免疫学中称之为非特异性免疫作用。

所述促进剂含有氨基酸序列包括如以下(a)或(b)或(c)所示氨基酸序列的多肽或蛋白质作为活性成分：

(a)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有结合Erk1/2活性的由(a)衍生的多肽或其类似物；

(c)与(a)、(b)中氨基酸序列整体相似度在85％以上的由(a)衍生的多肽或其类似物。

所述活性成分是指能够提升细胞吞噬能力的成分。

所述细胞包括巨噬细胞、中性粒细胞、白细胞。

所述吞噬能力是生物的一种保护措施而非摄食的手段。

在一种实施方式中，所述促进剂是氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白质或多肽。

在一种实施方式中，所述促进剂的制备方法，是构建含有编码SEQ ID NO：1所示蛋白的基因的重组质粒pGEX-6P-1-Mce3C，并将质粒转化到大肠杆菌中进行表达；收集表达了所述蛋白的菌体，破碎后离心后收取上清液，将上清液流过填充好的Glutathione-Sepharose beads 中，然后加入柱洗涤缓冲液充分洗涤柱子，最后加入含有谷胱甘肽的洗脱液洗脱蛋白，将收集的洗脱液加入到10kD的蛋白浓缩管中，离心浓缩；在蛋白浓缩管中加入PBS混匀后离心、分装蛋白，-80℃保存待用。

整合素位于细胞表面，在细胞与细胞和细胞与胞外基质之间起粘附和信号传导的作用。研究表明，整合素的表达与疾病发展密切相关。本发明提供的一种能促进巨噬细胞吞噬能力的促进剂，能结合细胞表面β2整合素，以提升巨噬细胞吞噬能力。由于巨噬细胞在机体免疫功能中的重要作用，调控其吞噬能力对于很多疾病都有控制作用。本发明成果可为临床多种疾病的治疗提供新的工具和思路，还对寻找新的药物靶点和筛选新药具有重要的理论意义。

附图说明

图1：Mce3C与β2整合素在体外相互作用。

图2：Mce3C促进巨噬细胞吞噬乳胶微珠。

图3：蛋白免疫印迹检测巨噬细胞中β2整合素敲除情况。

图4：流式细胞分析Mce3C依赖β2整合素促进巨噬细胞吞噬乳胶微珠情况。

具体实施方式

实施例1结核分枝杆菌蛋白Mce3C

可以提升巨噬细胞吞噬能力的结核分枝杆菌蛋白Mce3C，其氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。β2整合素基因序列如GeneID:16414所示。

实施例2 Mce3C能与β2整合素相互作用

(A)Mce3C蛋白的制备

1)构建含有编码Mce3C的基因的重组质粒pGEX-6P-1-Mce3C，并将质粒转化到大肠杆菌BL21中；

2)将携带质粒的大肠杆菌BL21在16℃条件下加入IPTG诱导蛋白表达，诱导时间为12-15小时；

3)超声破菌，高速离心后收取上清液；

4)将上清液缓缓流过填充好Glutathione-Sepharose beads(GE公司，GST柱材料)中，然后加入柱洗涤缓冲液充分洗涤柱子，最后加入2-3mL洗脱液洗脱蛋白；

5)将收集的洗脱液加入到10KD的蛋白浓缩管(millipore)中，3500rpm离心浓缩20分钟；

6)在蛋白浓缩管中加入2mL磷酸盐缓冲液(PBS)混匀后同步骤5)重复离心；

7)分装蛋白，-80℃保存待用。

(B)酶联免疫吸附试验

1)将250ngβ2整合素蛋白(TP326157，ORIGENE)包被在96孔板中，放置于4℃过夜孵育；

2)用PBST洗三次后用1％脱脂牛奶封37℃封闭2h；

3)将1μgGST、GST-Mce3C蛋白分别溶于PBS溶液后加入96孔板中，37℃静置90min；

4)用PBST洗三次后以1:1000加入小鼠抗GST一抗(TA-03，ZSGB-BIO)室温孵育 1h，然后以1：5000加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠的二抗(ZB-2305，ZSGB-BIO)，室温孵育1h；

5)使用酶标仪以OD＝450nm测定吸光度值。

(C)实验结果分析：酶联免疫吸附试验表明相比于GST蛋白，GST-Mce3C蛋白与β2整合素之间有显著的高亲和力(图1)。

实施例3 Mce3C促进巨噬细胞吞噬乳胶微珠

1)将巨噬细胞以1*10⁶细胞/孔铺在6孔板中，37℃过夜培养；

2)取5μl FITC绿色荧光标记的乳胶微珠加入含有25μg BSA、Mce3C蛋白的PBS溶液，放置在4℃混合2h，之后加入到1.5ml DMEM中；

3)用200ng/ml PMA预处理细胞10min，再将细胞培养基换成含有绿色荧光乳胶微珠的DMEM溶液培养2h；

4)之后再用PBS将细胞洗三次以除去未被细胞吞噬的乳胶微珠，再用细胞刮将细胞轻轻刮下，用4％多聚甲醛溶液固定后用细胞流式仪分析巨噬细胞对乳胶微珠的吞噬情况。

实验结果分析：流式细胞分析结果表明相比于BSA包被的乳胶微珠，巨噬细胞能吞噬内化更多Mce3C蛋白包被的乳胶微珠，说明Mce3C具有促进巨噬细胞吞噬乳胶微珠的能力(图2)。

实施例4 Mce3C依赖β2整合素促进巨噬细胞吞噬乳胶微珠

(A)利用CRISPR/Cas9系统在巨噬细胞中敲除β2整合素

1)在线设计(http://crispr.mit.edu/)靶向β2整合素的sgRNA序列；

2)将sgRNA双链完成退火后连接到pX458载体上，用Lipofectamine2000(Invitrogen, Carlsbad,CA)转染至巨噬细胞中；

3)转染24小时后用细胞流式仪进行分选，分选得到的绿色荧光标记的细胞培养于96 孔板中，待细胞长成单克隆后用蛋白免疫印迹检测内源性β2整合素敲除情况。

(B)检测β2整合素敲除对巨噬细胞吞噬乳胶微珠的影响

1)分别将野生型和β2整合素敲除细胞以1*10⁶细胞/孔铺在6孔板中，37℃过夜培养；

2)取5μl FITC绿色荧光标记的乳胶微珠加入含有25μg BSA、Mce3C蛋白的PBS溶液，放置在4℃混合2h，之后加入到1.5ml DMEM中；

3)用200ng/ml PMA预处理巨噬细胞10min，再将细胞培养基换成含有绿色荧光乳胶微珠的DMEM溶液培养2h；

4)之后再用PBS将细胞洗三次以除去未被细胞吞噬的乳胶微珠，再用细胞刮将细胞轻轻刮下，用4％多聚甲醛溶液固定后用细胞流式仪分析巨噬细胞对乳胶微珠的吞噬情况。

实验结果分析：如图3，蛋白免疫印迹检测巨噬细胞中β2整合素敲除情况；如图4，流式细胞分析结果表明相比于野生型巨噬细胞，β2整合素敲除细胞减弱了对Mce3C蛋白包被的乳胶微珠的吞噬，说明巨噬细胞对Mce3C蛋白包被的乳胶微珠的吞噬依赖于β2整合素。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 一种巨噬细胞吞噬能力促进剂

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 414

<212> PRT

<213> 结核分枝杆菌

<400> 1

Met Arg Ala Glu Met Lys Ser Phe Ala Glu Arg Asn Arg Leu Ala Ile

1 5 10 15

Gly Thr Val Gly Ile Val Val Val Ala Ala Val Ala Leu Ala Ala Leu

20 25 30

Gln Tyr Gln Arg Leu Pro Phe Phe Asn Gln Gly Thr Arg Val Ser Ala

35 40 45

Tyr Phe Ala Asp Ala Gly Gly Leu Arg Thr Gly Asn Thr Val Glu Val

50 55 60

Ser Gly Tyr Pro Val Gly Lys Val Ser Ser Ile Ser Leu Asp Gly Pro

65 70 75 80

Gly Val Leu Val Glu Phe Lys Val Asp Thr Asp Val Arg Leu Gly Asn

85 90 95

Arg Thr Glu Val Ala Ile Lys Thr Lys Gly Leu Leu Gly Ser Lys Phe

100 105 110

Leu Asp Val Thr Pro Arg Gly Asp Gly Arg Leu Asp Ser Pro Ile Pro

115 120 125

Ile Glu Arg Thr Thr Ser Pro Tyr Gln Leu Pro Asp Ala Leu Gly Asp

130 135 140

Leu Ala Ala Thr Ile Ser Gly Leu His Thr Glu Arg Leu Ser Glu Ser

145 150 155 160

Leu Ala Thr Leu Ala Gln Thr Phe Ala Asp Thr Pro Ala His Phe Arg

165 170 175

Asn Ala Ile His Gly Val Ala Arg Leu Ala Gln Thr Leu Asp Glu Arg

180 185 190

Asp Asn Gln Leu Arg Ser Leu Leu Ala Asn Ala Ala Lys Ala Thr Gly

195 200 205

Val Leu Ala Asn Arg Thr Asp Gln Ile Val Gly Leu Val Arg Asp Thr

210 215 220

Asn Val Val Leu Ala Gln Leu Arg Thr Gln Ser Ala Ala Leu Asp Arg

225 230 235 240

Ile Trp Ala Asn Ile Ser Ala Val Ala Glu Gln Leu Arg Gly Phe Ile

245 250 255

Ala Glu Asn Arg Gln Gln Leu Arg Pro Ala Leu Asp Lys Leu Asn Gly

260 265 270

Val Leu Ala Ile Val Glu Asn Arg Lys Glu Arg Val Arg Gln Ala Ile

275 280 285

Pro Leu Ile Asn Thr Tyr Val Met Ser Leu Gly Glu Ser Leu Ser Ser

290 295 300

Gly Pro Phe Phe Lys Ala Tyr Val Val Asn Leu Leu Pro Gly Gln Phe

305 310 315 320

Val Gln Pro Phe Ile Ser Ala Ala Phe Ser Asp Leu Gly Leu Asp Pro

325 330 335

Ala Thr Leu Leu Pro Ser Gln Leu Thr Asp Pro Pro Thr Gly Gln Pro

340 345 350

Gly Thr Pro Pro Leu Pro Met Pro Tyr Pro Arg Thr Gly Gln Gly Gly

355 360 365

Glu Pro Arg Leu Thr Leu Pro Asp Ala Ile Thr Gly Asn Pro Gly Asp

370 375 380

Pro Arg Tyr Pro Tyr Arg Pro Glu Pro Pro Ala Pro Pro Pro Gly Gly

385 390 395 400

Pro Pro Pro Gly Pro Pro Ala Gln Gln Pro Gly Asp Gln Pro

405 410

Claims (10)

1.一种用于提升细胞吞噬能力的物质，其特征在于，通过与细胞表面的β2整合素结合促进细胞的吞噬能力。

2.根据权利要求1所述的一种用于提升细胞吞噬能力的物质，其特征在于，所述细胞包括巨噬细胞、中性粒细胞、白细胞。

3.根据权利要求1所述的一种用于提升细胞吞噬能力的物质，其特征在于，所述物质含有氨基酸序列包括如以下(a)或(b)或(c)所示氨基酸序列的多肽或蛋白质作为活性成分：

(a)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有结合Erk1/2活性的由(a)衍生的多肽或其类似物；

(c)与(a)、(b)中氨基酸序列整体相似度在85％以上的由(a)衍生的多肽或其类似物。

4.根据权利要求1所述的一种用于提升细胞吞噬能力的物质，其特征在于，所述吞噬能力是生物的一种保护措施而非摄食的手段。

5.根据权利要求1～4任一所述的一种用于提升细胞吞噬能力的物质，其特征在于，所述物质是氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白质或多肽。

6.一种制备权利要求1～5任一所述物质的方法，其特征在于，构建含有编码SEQ IDNO：1所示蛋白的基因的重组质粒pGEX-6P-1-Mce3C，并将质粒转化到大肠杆菌中进行表达；收集表达了所述蛋白的菌体，破碎后离心后收取上清液，将上清液流过填充好的Glutathione-Sepharose beads中，然后加入柱洗涤缓冲液充分洗涤柱子，最后加入含有谷胱甘肽的洗脱液洗脱蛋白，将收集的洗脱液加入到蛋白浓缩管中，离心浓缩；在蛋白浓缩管中加入缓冲液混匀后离心、分装蛋白，保存待用。

7.权利要求1～4任一所述的一种用于提升细胞吞噬能力的物质在用于制备提升生物免疫力的药物中的应用。

8.一种提升生物免疫力的药物，其特征在于，含有权利要求1～4任一所述的一种用于提升细胞吞噬能力的物质。

9.根据权利要求8所述的一种提升生物免疫力的药物，其特征在于，还包括药物学上接受的辅料。

10.权利要求1～4任一所述的一种用于提升细胞吞噬能力的物质在药物开发中的应用。