CN102666576A - 结合甲胎蛋白 (afp) 受体的肽和其用途 - Google Patents

Abstract

本新发明提供了一种能使哺乳类动物的甲胎蛋白（AFP）与甲胎蛋白受体（AFPr或RECAF）有效结合的序列。此序列收录在包含了Lys-Glx-Glx-Xaa-Leu-Ile-Asn(SEQ.ID.NO:1)的肽以及其变异体。其中每一个Glx是从Gln或Glu独立分开选择的，并且Xaa代表了Phe或是Leu。此肽会与甲胎蛋白受体的一部分做结合。此肽可以做为AFP的替代品来做RECAF的检测、纯化以及影像化。因为此种肽可以与RECAF结合，并且RECAF量会在癌细胞中升高，所以此种肽可以做为一种诊断癌症或是用来输送细胞毒或放射性物质之化疗的方法。

Description

结合甲胎蛋白 (AFP) 受体的肽和其用途

发明领域

本发明涉及能与甲胎蛋白 (AFP) 受体结合的肽以及其用途。

特别是,它涉及了在人类和动物细胞内做甲胎蛋白 (AFP) 受体的检测以及标靶,和使用合成的甲胎蛋白肽序列来做甲胎蛋白受体 (AFPr) 的纯化以及检测。

发明背景

甲胎蛋白 (AFP) 会被细胞从细胞表面受体摄取进去（Villicampa,M.J., Moro,R., Naval,J., Failly-Cripin,Ch., Lampreave,F. and Uriel, J. Bioch. Biophys. Res Commun. 122, 1322 (1984))。如同已证明过了甲胎蛋白上的醣并不参与细胞于甲胎蛋白的摄取，就如甲胎蛋白与细胞表面受体的结合已知来自于特定的氨基酸链序列的影响。

已知甲胎蛋白受体是从癌细胞表达的,并且可以从肿瘤位置迁移到体液,所以AFPr也提供了可检测癌症存在的标记（WO-A-96/09551; andR. Moro et al., “Monoclonal antibodies against a widespread oncofetal antigen: the alpha-fetoprotein receptor”, Tumor Immunology, vol. 14, no. 2, 01 July 1993, pages 116 – 130）。甲胎蛋白受体因此也提供了一个可能的目标来对癌细胞做活体内细胞毒药剂的标靶传输,例如细胞毒药物和放射药剂。

其他来自甲胎蛋白的肽已经有过描述了，例如　CCRDGVLDC (SEQ.ID. NO: 15) (WO-A-2004/03350, Dudich et al.)，从甲胎蛋白氨基酸445-480的GIP肽(US-A-5,674,842 Mizejewski)，以及GIP里的antiestrotrophic氨基酸段落472-479 (Mesfin et al., 2000Biochim. Biophys. Acta, 1501: 33-34)。

已在US-A-2005/0036947中被描述过的合成肽　EMTXVNXGQ (SEQ. ID. NO:16)，其中Ｘ为羟基脯氨酸（Hydroxyl Proline）。

包含在US-A-6,534,479里使用重组制造的甲胎蛋白肽.

此最新发明的目的是提供有用且与甲胎蛋受体有特异性结合的新肽及其使用。

本发明的简要说明

本新发明一方面提供了肽的基本序列Lys-Glx-Glx-Xaa-Leu-Ile-Asn(SEQ. ID. NO: 1)。其中每一个Glx是从Gln或Glu独立分开选择，并且Xaa代表了Phe或是Leu的其他变异体,使此序列更好地与特别是人类的AFP受体做特异性结合。

根据此发明第一方面,此肽以及其变异体可能为水溶性或水不溶性。溶解度可以根据使用要求来选择。

根据目前的发明，此肽通常的长度小于约 25 氨基酸，示例约小于12 个氨基酸，甚至少于约 10 个氨基酸更佳。

在第二个方面,本发明提供了一种能够特异性与本发明第一点的肽结合的抗体。

在第三个方面,本发明提供一种使用本发明第二分面提供的抗体来衍生出抗个体基因型抗体,而且此抗体可以对人类AFP受体做出特异性的结合。

在第四个方面,本发明提供了一种可以纯化AFPr的方法。此方法包括了根据本发明第一与第三方面可以与AFPr结合的物质(肽,也包括抗体)。从肽与AFPr结合互作用得到的复合物可以从混合物中分离出来。然后,可以在相对纯粹的复合物状态下得到AFPr。

在第五个方面,本发明提供了一种检测AFPr的方法,经由根据本发明第一点与第三点的物质(肽)先与含有AFPr的物质反应、形成一个肽与AFPr的复合体。然后此复合体会从混合物中分离出来。

肽与AFPr的综合体可以经由标记过的肽来检测。另外,此结合可以在有标记过的AFPr的情况下出现并且与之竞争。然后AFPr在样品里的出现可以以检测标记与未标记之AFPr的相对结合量来做确定。在此两种情形下,检测是可以数量化的。

在第六个方面，本发明提供了一种从人体或是动物的生物样品来检测是否含有AFPr的方法。在这一方面，样品跟标记过的AFPr从抗AFPr之抗体、与AFPr有特异结合性的抗独特性抗体、AFP与其可跟AFPr有特异结合性的段落、还有本发明第一点提出的物质（肽）来选择一或多种与AFPr有特异结合性的伙伴接触，并且附带条件是至少一种在本发明第一与第三点提出的物质（肽）必须要出现，然后AFPr在样品里的存在或缺乏可以经由分析样品与已标记之AFPr对一或多种特异结合性的伙伴竞争下的结合。至少一种已描述过的特异结合性伙伴可以固定在固体的支柱上。

此用来检测在生物样品里是否含有AFPr的方法可以用在女性人类或是雌性动物做怀孕检测。另外，此用来检测在生物样品里是否含有AFPr的方法可以帮人类或是动物用来检测、诊断以及治疗癌症或是其中疾病。当检测癌症，对象受怀孕的可能性会被其他的测试或查询给淘汰，反之亦然。

本发明的详细说明

甲胎蛋白受体

此文中所表示之＂甲胎蛋白受体＂或＂AFP受体＂（AFPr）包括任何合成或天然的分子，或此类分子的一部分，在其正常的型态或是自然状态下对以下显示特异性结合：（甲）天然或合成的甲胎蛋白（＂AFP＂）；（乙）甲胎蛋白之段落；（丙）甲胎蛋白的修改；（丁）甲胎蛋白之段落的修改；（戊）自然或是合成且与脂肪酸或是其他分子结合的甲胎蛋白；或是（己）与脂肪酸或是其他分子结合的甲胎蛋白段落。

在此文中与甲胎蛋白有关之＂修改＂包括了仍保持相应功能但与野生型或自然形成之甲胎蛋白不同的氨基酸序列变化，包括氨基酸的插入、替换和/或是删除到至少８０％相似。举例，至少９０％的野生型序列不变，就算变化发生于氨基酸的插入、替换和/或是删除。

特异性结合

在此文中所提出的＂特异性结合＂代表了有关的分子优先但不是完全排除与其他分子做结合。此名称包括任何互相有影响力的分子在：（甲）当其中一个分子的浓度对另一个分子的浓度相对提高时，影响力变成饱和状态；以及（乙）可以与另一个分子或是过剩但没标记之同一分子做竞争。

抗体

在此文中所提出的＂抗体＂包括了抗体区段，示例Fab、F(ab)₂或是Fv。在本发明中使用的抗体可为单克隆或多克隆。如需要时，嵌合型或人源化的抗体也可以使用。

氨基酸残基

在此文中所提出的＂氨基酸＂或是＂氨基酸残基＂包括了此类组中所含的氨基酸残基：丙氨酸（Ala或A）、半胱氨酸（Cys或C）、天门冬氨酸（Asp或D）、谷氨酸（Glu或E）、苯丙氨酸（Phe或F）、甘氨酸（Gly或G）、组氨酸（His或H）、异白氨酸（Ile或I）、赖氨酸（Leu或L）、甲硫氨酸（Met或M）、天冬酰胺（Asn或N）、脯氨酸（Pro或P）、谷氨酰胺（Gln或Q）、精氨酸（Arg或R）、丝氨酸（Ser或S）、苏氨酸（Thr或T）、缬氨酸（Val或V）、色氨酸（Trp或W）以及酪氨酸（Tyr或Y）残基。

此处所使用的术语＂氨基酸＂也包含了合成氨基酸。

肽

此发明第一与第三点的主题是使用肽或是肽类来代替哺乳类甲胎蛋白与甲胎蛋白受体（AFPr或RECAF）结合达到诊断、治疗以及纯化的使用。

此处使用的术语＂肽＂包括了含有按照本发明第一点声明的肽成份的多肽以及与非肽成份所结合的结合肽。下面将更详细的描述。

在一方面，本发明提供了可以组成肽的基本序列Lys-Glx-Glx-Xaa-Leu-Ile-Asn (SEQ. ID. NO: 1)。其中每一个Glx是从Gln或Glu独立分开来选择，并且Xaa代表了Phe或是Leu的其他变化，使此序列更好地与甲胎蛋白受体做结合，特别是与人类的甲胎蛋白受体的结合。

在此处与新发明有关肽所使用的＂变化＂术语包括了与SEQ. ID. NO: 1不同但仍保有相应功能。造成不同的是至少一种从SEQ. ID. NO: 1里的七肽做氨基酸插入、替换和/或是删除的变化方法而至少四个连续的氨基酸保持跟SEQ. ID. NO: 1里的七肽一样的顺序。

每种变异体保留了绝大部分与哺乳类甲胎蛋白受体结合的能力，并且/或是仍拥有能力对甲胎蛋白与甲胎蛋白受体结合造成易发现地影响。本发明中的肽可以从任何适当的制造方法来制造。举例，化学合成以及/或是DNA重组技术。

一种典型的肽变异体是与另一个多肽的氨基酸序列不同。如果保持前段所述的功能，则其氨基酸序列中的一个或多个氨基酸可以被一个或多个其它氨基酸所取代。这些氨基酸可以从天然形成的氨基酸中来选择，例如可以选自T、M、H、A、G、V、C、K、Q、E、F、L、I、N和D。举例说，此变异体可以、但不必一定要、包含一个或多个“保守性氨基酸置换”（conservative amino acid substitution）。＂保守性氨基酸置换＂是代表一个氨基酸残基被另一个拥有类似侧链的氨基酸残基所取代。相似的氨基酸残基族群已经在文献中早有定义。这些族群包括了有碱性的氨基酸侧链（例如Lys、Arg、His），酸性侧链（例如Asp、Glu），不带电之极性侧链（例如Gly、Asn、Gln、Ser、Thr、Tyr、Cys），非极性侧链（例如Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met、Trp），β－分枝侧链（例如Thr、Val、Ile），跟芳香侧链（例如Tyr、Phe、Trp、His）。因此，在肽中一个预测非重要的氨基酸残基最好是与同一族群的氨基酸残基做更换。本发明的肽之变异体可以用与AFPr做结合来测试它的活性反应。

SEQ ID. NO: 1变异体的例子包括了包含７肽基本的肽Lys-Glx-Glx-Xaa-Ile-Asp-Leu (SEQ. ID. NO: 2)，其中Glx与Xaa与SEQ.ID. NO: 1所定义的相同。

肽也可以由KQEFLIN (SEQ. ID. NO: 3)构成，或是有包含此序列的肽。

此肽也可以是譬如说由图2(SEQ. ID. NO: 4) 所显示的609个氨基酸序列中的任何一段落，以序列KQEFLIN (SEQ. ID. NO: 3) (amino acids 549-555 of SEQ. ID. NO: 4)为保留着的为条件。

具体上，肽可由HKDLCQAQGVALQTMKQEFLIN (SEQ. ID. NO: 5) (amino acids 534-555 of SEQ. ID. NO: 4)所组成或是含有此序列。此序列在图4被称为Fragment#3。

具体上，肽可由LQTMKQEFLIN (SEQ. ID. NO: 6) (amino acids 545-555 of SEQ. ID. NO: 4) 所组成或是含有此序列。此序列在图4被称为Fragment#4。

具体上，肽可由TMKQEFLIN (SEQ. ID. NO: 7) (amino acids547-555 of SEQ. ID. NO: 4) 所组成或是含有此序列。此序列在图4被称为Fragment#10。

具体上，肽可由LQTMKQELLIN (SEQ. ID. NO: 8) (amino acids 545-555 of SEQ. ID. NO: 4其中氨基酸552从F替换成L) 所组成或是含有此序列。此序列在图4被称为Fragment#17。

具体上，肽可由KQELLIN (SEQ. ID. NO: 9) (amino acids 549-555 of SEQ. ID. NO: 4其中氨基酸552从F替换成L) 所组成或是含有此序列。此序列在图4被称为Fragment#16。

具体上，肽可由KEEFLIN (SEQ. ID. NO: 10) 所组成或是含有此序列。

具体上，肽可由KEQFLIN (SEQ. ID. NO: 11) 所组成或是含有此序列。

具体上，肽可由KQQFLIN (SEQ. ID. NO: 12) 所组成或是含有此序列。

具体上，肽可由KQQFIDL (SEQ. ID. NO: 13) 所组成或是含有此序列。

具体上，肽可由KQQLIDL (SEQ. ID. NO: 14) 所组成或是含有此序列。

至少根据本发明，一些肽（例如Fragment #4）被发现是可溶解于水介质中而不需要有机溶剂的帮助。当研发检测、诊断试剂、治疗用物和类似作用的成份时，这是个重大的且意想不到的优势。

根据本发明第一点中的肽可能包括一个或多个附加在基本七肽Ｎ端的氨基酸或其变异体，或一个或多个附加在基本七肽Ｃ端的氨基酸或其变异体，或一个或多个附加在基本七肽Ｎ跟Ｃ两端的氨基酸或其变异体。此一个或多个氨基酸可以从所有天然跟合成的氨基酸里选择，而且当多于一个氨基酸出现在其中一端或是两端时，它们可以任何的序列出现。当一个或多个氨基酸出现在两端时，它们和它们的序列是独立选择的。如果多于一个氨基酸出现在Ｎ与Ｃ端，两端的序列可以是一样也可以是不相同。在Ｎ与Ｃ两端添加氨基酸可以控制肽的水溶性和肽黏着在固体面的吸附能力。适当的选择添加的氨基酸可以使肽提高或降低其水溶性。

根据最新的发明，官能基可以纳入肽。比方说，从肽的一或两端让肽以共价键连结至一个表面或是至其他的分子或种类的官能基。

根据目前发明的第一点声明，肽可包括一个或多个提供特异性功能的构造。正常地说，任何一个或多个可能出现的构造并不会妨碍此肽对哺乳类AFPr的结合功能或是明显地干扰与AFP对哺乳类AFPr做结合竞争。举例说，在肽的任何一部份可含有一个或多个Cys (C)氨基酸在每部分间或是分子间可以有双硫键的交联作用。另一个例子，此肽可含有一个或多个Tyr (T)让放射性标记可以放在此肽上做为侦查的目的。具体上，一个或多个放射性标记过的Tyr (Y)于本发明第一点提出的肽已可提供。附加的构造最好可以出现在非基本七肽中Lys-Glx-Glx-Xaa-Leu-Ile-Asn (SEQ. ID. NO: 1)　或是在至少从氨基酸的插入、替换和/或是删除中得到其变异体里有至少4个连续的基本七肽氨基酸是不变而且与SEQ. ID. NO: 1维持同样顺序，示例七肽Lys-Glx-Glx-Xaa-Ile-Asp-Leu (SEQ. ID. NO: 2)。

如之前所描述，此新发明中的肽有结合甲胎蛋白（AFP）受体的能力并且/或是可以易检测性地影响AFP与AFPr的结合，譬如可检测地与AFP对AFPr做结合的竞争。

合成肽

此新发明中的肽可以用从任何适当的科技来制造，譬如化学合成和/或是DNA重组技术。举例说，此发明的肽可以从固相肽合成技术来合成（例如，Fmoc）。另外，此肽可以从DNA重组技术得到（例如，使用细菌或真核细胞的表达机制）。一个带有此发明多肽的核甘酸序列密码是可以由分离或是合成一个带有核甘酸序列密码的起源肽，然后改变它的核甘酸序列来达到加入（例如，插入或替换）或是移除（例如，删除或替换）有关连的氨基酸残基。

固相蛋白质合成与蛋白质重组与合成的方法在目前科技是众所周知的。譬如说，"Molecular Cloning, A Laboratory Manual" (Sambrook et al., 3d Edition, Cold Spring Harmor Press)是个众所周知的参考文献，里头有详细描述着许多适合的多肽重组合成技术。一个肽的变异体可以是自然存在着或是它可以是一个天然存在但不知的变异体。非天然存在的肽之变异体可以是直接合成制造，或者另外随机加入全部或一部分此发明的肽造成变种，譬如像是饱和突变或是特定位置突变等传统方法。

与制造方法不相干，变种的结果可以用与AFPr的结合能力来做审查来确认此发明的变种肽。

为了准备一个合成肽，一个带有肽的核酸密码可以克隆进一个表达载体，并且此核酸可连结到适合宿主细胞的调控序列来表达此多肽。也可以加入载体进入适当的宿主细胞来表达此肽。另一方面，此核酸也可连结到另一个核酸序列变成一个融合的伙伴，例如说麸胺基硫S-转换酶（GST）、T7 tag、6－His 表位标记、M13 Gene 3 Protein或是免疫球蛋白重链恒定区。融合的核酸会在适当的宿主细胞里表达融合蛋白质。适当的宿主细胞是指能够抵抗这种会造成细胞自毁的蛋白质并且可以使用现有科技的审查方法。表达出的重组肽可以使用像是硫酸铵沈淀法和分离管柱层析法来从宿主细胞里纯化。可参考Goeddel, (1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. Water-soluble polypeptides are then prepared by the methoddescribed in U.S. application Ser. No. 10/449,531 and Wang et al., 2003, Vaccine 21, 3721-3729t。分离的融合蛋白质可以做更深入地处理，例如使用酵素消化移除融合搭档来得到此发明的重组多肽。

在此发明的具体观点来说，此肽可为一个被分离的肽。特别是，此被分离的肽可为一个在非天然环境中的肽分子。此非天然环境，比方说，可为合成肽分子、重组表达的肽分子、细胞培养、一个重组的细胞或生物、制药的成份、一个外来的细胞或是生物。分离的肽可以有选择地但不是必须地在一个纯化或部分纯化的状态，比方说普遍的化学组成混合物。

在此发明的具体观点来说，肽可为分支的或是有或无分支地环式的。环式且分支的和不分支的多肽可以是转译后自然过程的结果，但也可以全程使用合成的技术。此肽可以经过F-moc化学反应从Lys来分支而变成高分子。此发明之肽分子的骨干可以从L-氨基酸或是D-氨基酸或是似肽之构造组成来抵抗分解。

此发明的肽可以分离和/或是纯化（或是大致上的分离和/或是大致上的纯化）。相对应地，此发明提供了在发明第一声明之肽一个分离或是大致上分离的状态（例如说，大致上从其他肽或是杂质中分离）。比方说，肽可以因为是个固相合成蛋白质所以从其他肽中分离。另一方面，此肽可以大致上地在从重组制造细胞分解后在其他蛋白质中分离出来。

基本的蛋白质纯话方法（例如，HPLC）可以使用来达到此发明之肽大体上地纯化。因此，此发明中之肽的准备最好是至少９０％（重量基准）无其他肽跟/或是污染物，而更好是至少９５％（重量基准）无其他肽跟/或是污染物（比方说至少９７％或９８％（重量基准）无其他肽跟/或是污染物）。此新发明中有关肽的准备可以达到至少９０％（重量基准）纯粹。

与非肽构造结合的肽

在此发明一个具体的观点上，此发明中的肽是可以与非肽构造的物质做结合。此变异体也被包括在此文中所使用的术语＂肽＂。

此肽可以使用N-羟基丁二酰亚胺（NHS）或其他亲核基与非肽构造物质做结合并且从肽的N-端与之形成一个共价键。举例说明，Fragment#4（见图4）已跟acridinium、使用NHS跟生物素以及使用普遍的过碘酸处理法跟辣根过氧化物酶做结合。

对此新发明中的肽较佳的状况里，非肽构造物质可与聚合物分子、亲脂性化合物、醣类构造（例如，在活有机体内之醣化作用较佳）和有机衍生剂做结合。这些媒介皆可以给予肽所需要的特性，特别是增强与AFPr的结合、增强活体内有机能的半衰期和/或是增强血浆半衰期。此肽通常是与其中一个非肽构造结合，但也可以跟两个或多个不同的非肽构造融合，例如说，与一个聚合物分子和一个醣类构造、与一个亲脂性类群和一个醣类构造、与一个有机衍生的媒介和一个聚合物分子，等等。与此新发明的肽做多为一种与非肽构造结合的过程可以是同时间地或是阶段性的完成。

此发明里的肽可以与非肽构造结合并且从活体细胞内制造，而此方法需要在适当并且可以有助于肽的表达的状态下培养合适的宿主细胞，并且重新取得融合后的肽。此生产方法是当融合的肽含有至少一个N-或O-醣化作用点并且宿主细胞为真核细胞而且支持活体内的醣化作用最为适当。

聚合物

要与肽连结的聚合物分子可以是任何适当的聚合物分子，比方说天然的或合成的纯多聚体或是杂多聚体，通常分子量大约在300－100,000 Da的范围，例如大约500－20,000 Da，而更好在大约500－15,000 Da的范围，特别更佳在大约2－12 kDa的范围，比方说大约3－10 kDa。此处与分子量有关的术语＂大约＂表达的是一个大概的平均分子量并且反映了通常在聚合物分子的准备时会出现的分子量机率分布。

纯多聚体的例子包括了多元醇（poly-OH），聚胺（poly-NH₂）和聚羧酸（poly-COOH）。杂多聚体是含有不同的官能基结合的聚合物，像是一个羟基与一个胺基。

适当的聚合物分子的例子包括选自以下各项的聚合物分子：聚亚烷基氧化物 (PAO)，包括聚亚烷基二醇（PAG），如聚乙二醇（PEG）和聚丙二醇（PPG）、支链PEG，聚乙烯醇（PVA），聚羧酸盐，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙烯-马来酸酐共聚物，聚苯乙烯-马来酸酐共聚物；葡聚糖，包括羧甲基葡聚糖；或是任何可以降低免疫原性和/或是提高活体内有机能的半衰期和/或是提高血清半衰期的适当的生物聚合物。另一个聚合物的例子是人体白蛋白或是其他大量的血清蛋白质。大致上，PAG衍生的聚合物都是生物相容、非毒性、非抗原、无免疫原性、有许多水溶性属性以及容易从活体里分泌出来。

比较佳的聚合物分子是PEG，因为跟，比方说，像是葡萄聚糖的聚醣类它只有一些不多的反应官能基可以做交叉结合。单一机能性的PEG例如甲氧基聚乙二醇（mPEG）是特别有趣的因为它的结合化学是比较容易的（只有一个反应官能基可以与肽上的附属官能基做结合）。因此，因为交叉反应的危险消除了，最后的结合肽变异体也就更同质且此聚合物分子与结合肽的反应也更容易控制了。

为了要达到让此发明里的肽与聚合物分子有共价的连结，聚合物分子的羟基端需要在活性化的状态，例如易反应官能基（譬如，primaryamino groups, hydrazide (HZ), thiol, succinate (SUC),succinimidyl succinate (SS), succinimidyl succinamide (SSA), succinimidyl propionate (SPA), succinimidyl butyrate (SBA), succinimidy carboxymethylate (SCM), benzotriazole carbonate (BTC), N-hydroxysuccinimide (NHS), aldehyde, nitrophenylcarbonate (NPC), and tresylate (TRES)）。合适且活性化的聚合物分子是有在市面上销售的，像是ShearwaterPolymers, Inc., Huntsville, Ala., USA或是PolyMASC Pharmaceuticals plc, UK。

另一方面，聚合物分子可以从现有技术上惯用的方法来活性化，例如像WO-A-90/13540公开的一样。特别的在此发明里使用之直线型或分支型聚合物分子活性化的例子已在Shearwater Polymers, Inc. 1997 and 2000 Catalogs (Functionalized Biocompatible Polymers for Research and pharmaceuticals, Polyethylene Glycol and Derivatives, incorporated herein by reference)里有描述了。

特定的活性化PEG聚合物的例子包括了以下的直线型PEG：NHS-PEG（例如，SPA-PEG、SSPA-PEG、SBA-PEG、SS-PEG、SSA-PEG、SC-PEG、SG-PEG以及SCM-PEG)，和 NOR-PEG、BTC-PEG、EPOX-PEG、NCO-PEG、NPC-PEG、CDI-PEG、ALD-PEG、TRES-PEG、 VS-PEG、IODO-PEG以及MAL-PEG和分支的PEG比方说PEG2-NHS跟已在文献中的U.S. Patents Nos. 5,932,462和5,643,575公开过了。此外，接下来于此文以文献结合的刊物，公开了有用的聚合物分子以及／或PEG反应的化学作用：U.S. Patent No. 5,824,778, U.S. Patent No. 5,476,653, WO-A-97/32607, EP-A-229,108, EP-A-402,378, U.S. Patents Nos.4,902,502, 5,281,698, 5,122,614 and 5,219,564, WO-A-92/16555, WO-A-94/04193, WO-A-94/14758, WO-A-94/17039, WO-A-94/18247, WO-A-94/28024, WO-A-95/00162, WO-A-95/11924,WO-A-95/13090, WO-A-95/33490, WO-A-96/00080, WO-A-97/18832, WO-A-98/41562, WO-A-98/48837, WO-A-99/32134, WO-A-99/32139, WO-A-99/32140, WO-A-96/40791, WO-A-98/32466, WO-A-95/06058, EP-A-439508, WO-A-97/03106, WO-A-96/21469,WO-A-95/13312, EP-A-921131, U.S. Patent No. 5,736,625,WO-A-98/05363, EP-A-809996, U.S. Patent No. 5,629,384,WO-A-96/41813, WO-A-96/07670, U.S. Patents Nos. 5,473,034 and 5,516,673, EP-A-605963, U.S. Patent No. 5,382,657, EP-A-510356, EP-A-400472, EP-A-183503 以及EP-A-154316。

特定的以偏好使用Cys残基做结合的PEG聚合物活性化例子包括了以下的直线型PEG：vinylsulfone-PEG (VS-PEG)更以vinylsulfone-mPEG(VS-mPEG)较佳; maleimide-PEG (MAL-PEG)更以maleimide-mPEG(MAL-mPEG)较佳以及orthopyridyl-disulfide-PEG (OPSS-PEG)更以orthopyridyl-disulfide-mPEG (OPSS-mPEG)较佳。普遍来说，此PEG或mPEG聚合物会有大约5 kDa，大约10 kDa，大约12 kDa或是大约20 kDa的大小。

任何现有普遍的技术可以带领已活性聚合物与与此新发明中的肽做结合，像是在以下已描述过的文献中（通时也描述了聚合物分子适合的活性化方法）：Harris and Zalipsky, eds., Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications, AZC, Washington; R. F. Taylor, (1991), "Protein immobilisation. Fundamental and applications", Marcel Dekker, N.Y.;S. S. Wong, (1992), "Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking", CRC Press, Boca Raton; G. T.Hermanson et al., (1993), "Immobilized Affinity LigandTechniques", Academic Press, N.Y.)。

技术人员要察觉将使用活性化的方法以及／或结合的化学反应是依据多肽变异体（此例子已在之前描述过）中的附属官能基，以及聚合物的官能基（像是amine, hydroxyl, carboxyl, aldehyde, sulfhydryl, succinimidyl, maleimide, vinysulfone or haloacetate）。PEG化反应可被任何可利用的在变异体多肽上的附属官能基所引导（例如，曝露在多肽表面的附属官能基）或是可被一个或多个特定的附属官能基引导，比方说在U.S. Patent No. 5,985,265所描述中N－端的胺基或是Cys残基。此外，结合的过程可以是一次性或是阶段性（比方说像是在WO-A-99/55377所描述的）。

为了让PEG化反应至Cys残基（参考之前描述），FVII或是FVIIa变异体通常会被还原剂做处理，像是在PEG化反应前使用dithiothreitol (DDT)。随后还原剂会用任何惯例的方法被移除，比方说除去盐份。PEG与Cys残基的结合通常发生在pH 6-9的缓冲溶液里，同时在温度变化从4℃到25℃中16个小时。

结合的方法可以立即被设计出来，特别是当已清楚所需的分子有多少的非肽构造连上、分子的大小跟型态（譬如是直线型还是分支型）还有在肽上的连结点。分肽构造成份的分子量可以像是依据目的的需要来选择。比方说，如果说主要结合的目的是为了要得到一个有高分子量（例如减低肾脏清除）结合的变异体肽，那通常会使用分子量越高的非肽物质来达到需要的分子量。当强烈需要保护时，那就可以使用多点的低分子量非肽物质（例如说，使用分子量大约300 Da到大约500 kDa，特别是分子量大约从300 Da到2 kDa）。

当与只有一个附属官能基出现的肽做结合时（例如是N-端的胺基），分子量月大且无论是直线型或是分支型的聚合物分子会越有利益，而在大约10-25 kDa特别是大约15-25 kDa较佳。举例，大约20 kDa。

普遍来说，聚合物的结合最好是当聚合物可以在能够与越多可利用的聚合物附属官能基的状况下完成。这点可以用与肽有关的聚合物在适当但过剩的莫耳数下完成。通常，已活性化之聚合物分子与肽的莫耳比可高至1000:1。比方说200:1或100:1。有时候，此莫耳比会稍微低一点，像是上至大约50:1，10:1，5:1，2:1或是1:1。

根据此发明，对使用一个连结物来连结聚合物分子与多肽也是在考虑范围内。技术人员对适合的连结物是很清楚的。较佳的例子是cyanuric chloride (Abuchowski et al., (1977), J. Biol. Chem., 252, 3578-3581; U.S. Patent No. 4,179,337; Shaferet al., (1986), J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed.,24, 375-378)。

结合后，剩余的活性化聚合物分子会被现有技术方法来封锁住，比方说加入一元胺到反应混合物里，然后剩下的失活性聚合物分子会被适当的方法给移除。

根据像是此发明之肽的氨基酸序列等之状况，活性化PEG化合物的本质跟特定的PEG化反应之条件，也包括了PEG与肽的莫耳比，会得到不同程度的PEG化反应。其中，PEG与肽的莫耳比越高则会得到越高程度的PEG化反应。从任何PEG化反应过程得到之PEG化的肽会含有稍不同程度的PEG化反应随机的分怖在结合肽产物。

醣类构造

为了要对此发明中的肽在一或多个醣化作用点达到活体内醣化作用，带有肽的核甘酸序列密码一定要放入一个会起醣化作用的真核细胞宿主。此真核细胞宿主可以从菌类植物（丝状菌类或酵母）、昆虫或动物细胞或是遗传工程的植物细胞中选择。具体上，宿主细胞是个哺乳动作细胞，像是CHO细胞、BHK或是HEK例如HEK 293细胞或是个昆虫细胞像SF9细胞，或是个酵母菌像S. cerevisiae或是Pichia pastoris，或是任何之后提到的宿主细胞。

在试管内的醣类构造（像是葡萄聚糖）与变异体多肽的氨基酸残基进行共价键连结是可以进行的，比方说，WO-A-87/05330和Aplin etal., CRC Crit Rev. Biochem, pp. 259-306, 1981中已描述过了。在试管内进行的醣类构造或PEG与蛋白质里或肽里的Gln残基合成可以经过使用transglutaminases（TGases）。TGase在俗称交叉作用反应下，催化了胺基的转换，从供者到蛋白质或是肽里的Gln残基。胺基所在的供者可以为蛋白质或是肽，像是Lys里的ε－胺基或是在小型或大型的有机分子里的一部分。小型有机分子在TGase催化之交叉反应下为胺基供者的例子有putrescine（1,4-diaminobutane）。大型有机分子在TGase催化之交叉反应下为胺基供者的例子为含有胺基的PEG(Sato et al., 1996, Biochemistry 35, 13072-13080)。

基本上，TGase是个高度特异性的酶，并且不是所有的在曝露在蛋白质表面的Gln残基都是可以被TGase催化之交叉反应给影响的。相反的，只有一些Gln残基是自然为TGase的基质，但是分辨哪些Gln残基是良好的TGase基质的精确因素仍然不为人知。因此，为了使得蛋白质容易被TGase催化交叉作用反应，通常在方便的地方加入一段已知为TGase基质的氨基酸序列是不可缺的步骤。许多氨基酸序列已经被了解或是含有天然良好的TGase基质，像substance P, elafin, fibrinogen,fibronectin, α₂-plasmin inhibitor, α-caseins, and β-caseins。

有机衍生媒介

当此发明的肽中一个或多个附属官能基与有机衍生媒介反应，就有可能出现共价的变化。在现有的技术中早已知有适当的衍生媒介以及方法。例如，Cys的残基最常与α-haloacetates（还有相对应的胺）反应，比方说chloroacetic acid或是ahloroacetamide，导致变成carboxymethyl或是carboxyamidomethyl的衍生物。Cys残基同时也是反应的衍生物，而反应包括了与bromotrifluoroacetone, α-bromo-β-(4-imidazoyl)-propionic acid, chloroacetyl phosphate, N-alkylmaleimides, 3-nitro-2-pyridyl disulfide, methyl 2-pyridyl disulfide, p-chloromercuribenzoate, 2-chloromercuri-4-nitrophenol, or chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole。His残基是与diethylpyrocarbonate在pH 5.5-7.0下反应的衍生物，因为此媒介相对地比较对His侧链有特异性。Para-bromophenacyl bromide也是很有用的。此反应在0.1M sodium cacodylate以及pH6.0下发生较佳。Lys跟胺端残基会与siccinic或其他carboxylic acid anhydrides。这些媒介的衍生物都有可以反转Lys残基的带电能力。其他适合用来取得含有α-胺基的残基的媒介包括了像是methyl picolinimidate, pyridoxalphosphate, pyridoxal, chloroborohydride, trinitrobenzenesulfonic acid, O-methylisourea, 2,4-pentanedione and 与glyoxylate有transaminase催化反应的imidoesters。Arg残基会被一个或多个普遍的试剂反应而改变，比方说phenylglyoxal, 2,3-butanedione, 1,2-cyclohexanedione和ninhydrin。Arg残基的衍生需要在碱性的状况下做反应因为guanidine官能基有较高的pKa。

此外，这样试剂都可以跟Lys的官能基做反应，也可以跟Arg的guanidino基。有羧基的侧链（Asp或Glu）当与carbodiimides (R—N =C = N--R')反应时会被选择性改变。其中，R跟R'为不同的烷基，例如1-cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-4-ethyl) carbodiimide或是1-ethyl-3-(4-azonia-4,4-dimethylphenyl)carbodiimide。此外，当Asp与Glu残基与胺离子反应时会被转变为Asn与Gln。

亲脂性化合物

此发明中的肽与亲脂性化合物是可能透过直接地或是使用连结物结合在一起的。亲脂性化合物可能是个天然的化合物就像是饱和或像a fatty acid diketone, terpene, 前列腺素, 维他命, 类胡萝卜素或类固醇等不饱和脂肪酸，也或是像有机酸，醇类，胺类和矿酸与一个或多个alkyl-、aryl-、alkenyl或其他不饱和化合物之合成化合物。比方说，脂肪酸可以包括从arachidonic acid, docohexanoicacid跟oleic acid里选择。变异体多肽与亲脂性化合物间的合成可以有选择地通过一个连结物，而且现有技术的方法也描述Bodanszkyin Peptide Synthesis, John Wiley, New York, 1976 andin WO-A-96/12505里。

固定在固相底物

此发明的肽可以是可溶解的或是固定在固相底物。固定可以直接地进行或是可以使用连结物来辅助。

当肽固定在固相底物时，底物可以是任何表面或是支柱，包括了一个或多个固体支柱（比方说像是玻璃片的玻璃，上胶的盘子，硅胶，塑料或塑料衍生物，常磁性的或无磁性的金属），半固体支柱（例如，聚合物物质，胶体，洋菜糖或是其他基础物质），和／或是多孔的支柱（例如，多孔过滤材料，尼龙或硝化纤维素膜或其他膜材质）。在一些情形下，合成的聚和物可以当成是底物，像是乳胶，聚苯乙烯、聚丙烯、polyglycidylmethacrylate、aminated或是carboxylatedpolystyrenes、polyacrylamides、polyamides、polyvinylchlorides和类似物质。在一较佳的状况下，底物包括微量滴定免疫分析盘或其他适合ELISA使用的表面。再另一个偏好的状况中，底物可以是洋菜糖(Agarose)或琼脂糖(Sepharose)珠可以用来纯化AFPr。在较佳的状况下，底物可以是有能力使肽以共价或是非共价涂上且带有磁性的micro或是nano颗粒。在另一个状况下，底物也可以是胶状的金奈米粒子。

底物或是支柱的表面可以是平面的、弯曲的、圆体的、圆柱的、尖锐的、薄片的或是任何适当的平面或是立体形状。而第二个结合的伙伴可以是固定的，像是胶卷、珠或是微珠、管子或是微管、微孔或是微量滴定盘、微纤维、毛细管、细胞培养盘、具磁性颗粒等等。在一些情况下，表面是可以使用UV解析的，像是透UV光的。

固定，在现时科技中有许多方法，像是在此解释过的或是可以继续被研发。例如说，固定可以有关任何可以达成底物与本发明的肽（与其对应结合之蛋白质，AFPr）直接和／或非直接关连的技术。它包括了任何可以暂时的阻止或妨碍肽的释放进入周围的液体或其他媒介。此方法可以是共价结合、非共价结合、离子结合、静电引力、氢键作用力结合、van der Waals引力、疏水性作用力或是其联合体。比方说，固定可以从化学反应来达成，只要底物含有一个活性的化学基可以跟第二个结合伙伴形成共价键。比方说，在醣蛋白质受体里，一个经过aldehyde改变过的支柱表面可以跟养化活性化的醣构造起反应；如果支柱表面有hydroxyl基就可以与像N,N-dissuccinimidyl carbonate (DSC)的双官能化学剂起反应，或是N-hydroxysuccinimidyl chloroformate来活化hydroxyl基并且与含有胺基的受体反应。在一些情况下，底物的支柱表面可能含有animated或是carboxylated polystyrenes; polyacrylamides; polyamines; polyvinylchlorides，或是其他类似物质。固定有时会利用一个或多个结合配对来做结合或是连结底物与受体，不完全地包括了抗原－抗体结合配对、hapten/anti-hapten系统、卵白素－生物素结合配对、streptavidin－biotin结合配对、folic acid/folate结合配对、光活化结合分子。在较佳的情况下，此发明的肽可以固定在cyanogen bromide活性后的Sepharose上。这是个简单并温和且成功率高的普遍通用方法。Sepharose是个在市面上是个聚合珠，有高度的亲水性跟防止微生物攻击的物质。化学上来说，这是个洋菜糖凝胶(poly-{b-1,3-D-galactose-a-1,4-(3,6-anhydro)-L-galactose})。此多醣上的hydroxyl基与cyanogenbromide结合变成一个高反应性的cyclic imidocarbonate。它在酶的帮助下在温碱性的状况下（pH 9-11.5）与一元胺基反应（例如，大多是Lys残基）(Immobilized Affinity Ligand Techniques. Greg T. Hermanson, A. Krishna Mallia and Paul K. Smith. Academic Press, © 1992)。

比方说，肽可能经由氢键作用力或疏水性作用力下，溶解于水或生物溶剂中并且固定与涂上一个普通的塑造板，类似ELISA使用的那种。

举例来说，Fragment #4会以cyanogen bromide活性话并以共价连结的方法连到支柱物质上，然后使用肽N-端的肽键去做连结。此肽的连结方法可以让此肽当做配位体用来吸引AFP受体帮助纯化。

肽的聚焦体或聚合肽基质

此发明的一观点中，此肽可能为肽聚集体的一部分或是含有多于一种肽部分的聚合肽基质。肽的部分在此分子里可能都一样，或不同的肽会在肽的不同部分出现。不同的肽出现的地方，有可能在此分子里会有重复单元的肽（单体），而且此重复可能为有规律或无规则的。

肽的部分可能聚集起来或是用现有的科技使不同的方法彼此结合，包括了纠结以及交叉连结。其他情况下，肽也可以从分支的Lys经由F-moc化学反应聚合。肽也可以从它的N-与C-端经由F-moc化学反应组成不同的连结肽。

肽的标记

此发明的肽可以被一种或多种可被检测的标记所标记。标记可以直接地或是经由连结物连结到肽上。

此发明的其一具体行为提供了具有结合能力且标记过的AFPr与此发明的肽之衍生物或是为了可以帮助检测已结合或未结合功能来与其他机能分子链接（从化学链接、基因融合、非肽物质或是其他）。

当此发明中的肽直接与标记结合，此直接标记如果可在常态下被检测最为适当。比方说，如果说此直接标记为一个有颜色的粒子，像是颜色染料、金属染料（例如，胶体金）跟带颜色的乳胶粒子，则可以使用肉眼来观察或可以使用滤光片的辅助来观察。如果直接标记的为荧光标记，则可以使用像是UV光的刺激来促进荧光的产生。

适当且可被检测的物质包括了不同的酶、辅助基、荧光物质、冷光材质跟放射线物质。可被检测的荧光媒介的例子包括了fluorescein、fluorescein isothiocyanate、rhodamine、5-dimethylamine-1-napthalenesulfonyl chloride、phycoerythrin跟类似物质。肽也可以为可被检测酶的衍生物，像是alkaline phosphatase、horseradishperoxidase、glucose oxidase与类似物质。肽也可以是生物素的衍生物，并且可以从与卵白素或streptavidin的连结来做非直接的检测计算。

冷光材质的例子包括了luminol；然后合适的放射线物质的例子包括了³H, ¹⁴C, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁷⁷Lu, ¹⁶⁶Ho, 或¹⁵³Sm。在此领域的技术人员在现有的技术帮助下有充分的能力去检测这些标记。放射标记可以使用照相底片或闪式放射记录器做检测，荧光标志也可以使用光讯号检测器来检测放出的光。酵素标记通常可以给予酵素基质并且检测酵素反应下的反应产物。比方说，当使用可被检测的horseradish peroxidase (HRP)，双氧水与diaminobenzidine的加入会导致有颜色的反应产物，而此产物就可被检测。

抗体也可以直接与像是HRP或是alkaline phosphatise (AP)等ELISA基本的标记做结合。此比色法信号会因为适当的基质的加入而产生。对抗体做与生物素的标记也可以使streptavidin-(HRP)或是streptavidin-(AP)当做次要的报告分子。直接或非直接的使用acridinium，抗体也可以用在化学发光的检验里。在使用抗体的检试里，固相会被肽给覆盖，然后标记过的抗体会与来自检试样品里的AFP受体做与肽的结合竞争。

与可检测、可诊断及有疗效的媒介结合并且使用在疾病的检测、诊断、判断及治疗法

在此发明中的一具体情况中，此发明的肽可为与一种或多种可检测、可诊断或有疗效的媒介结合并且选择性地输送到发病位置，特别像是人类的癌症细胞。结合的方法跟之前介绍过的连结方法一样，可能是直接地或是经由使用一个连结物地。此检测、判断以及治疗疾病的方法与此发明中的肽在检测、判断以及治疗的方法是相对应的。

检测、判断以及治疗的媒介可能是自然形成的、改变过的或合成的。治疗的媒介可促进或阻挡在人体疾病形成的过成中被牵连的生物过程。使用本发明中的肽与一个或多个可检测、可判断以及具治疗性的媒介结合，并且选择性地输送到发病位置做检测、判断以及治疗的方法，是可以在试管内使用对象的样品或在对象（病人）的身体里做活体内的检查与治疗。

比方说，附加的媒介可以是已在现有技术中明确了解可以有效治疗癌症的物质。此肽与细胞的特异结合性可以在哺乳类病患（当胎儿出生后自然的AFPr表达已经停止－出生后，血清中的AFPr通常在低程度的底线，除非此哺乳动物有发展中或已成熟的癌症。在此状况下，血清里的AFPr会因为癌细胞的表达及释放而有显著地升高；请见WO-A-09551）准确地使具治疗性的媒介对癌细胞做标靶传送。具治疗性且适当的媒介可能包括任何可导致细胞自毁、细胞死亡、细胞分化、细胞停滞、和／或反血管新生或任何其他干扰癌细胞的生存和／或生长速度。

在一特殊的情况下，此发明可能涉及到标靶有链接细胞毒媒介的肽的实施。现有科技中已有广泛的抗癌药，而且任何药都可以在此新发明使用的专注下与可标靶癌细胞的肽做连结。癌症化疗（细胞毒）媒介的例子不全包括5-fluorouracil, bleomycin, busulfan, camptothecin, carboplatin, chlorambucil, cisplatin (CDDP), cyclophosphamide, dactinomycin, daunorubicin, doxorubicin,estrogen receptor binding agents, etoposide (VP16), farnesyl-protein transferase inhibitors, gemcitabine, ifosfamide, mechlorethamine, melphalan, mitomycin, navelbine, nitrosurea, plicomycin, procarbazine, raloxifene, tamoxifen, taxol, temazolomide (一种液体型态的 (DTIC)), transplatinum, vinblastine and methotrexate, vincristine或任何类似或前述的变化衍生物。大多数的化疗物质都可被归类进烷化基药剂、抗代谢物、抗癌抗生素、皮质类固醇贺尔蒙、细胞分裂抑制物质、nitrosoureas、贺尔蒙药剂、各种药剂跟任何类似或是其变化衍生物。

此发明中所使用的肽也可连结到能促进细胞分化的化合物，像是retinoic acid。

在一特殊的情况下，此发明可能涉及到标靶有链接抗血管新生媒介的肽的实施，像是angiotensin, laminin peptides, fibronectin peptides, plasminogen activator inhibitors, tissue metalloproteinaseinhibitors, interferons, interleukin 12, platelet factor 4, IP-10, Gro-β, thrombospondin, 2-methoxyoestradiol, proliferin-related protein, carboxiamidotriazole, CM101, Marimastat, pentosan polysulphate, angiopoietin 2(Regeneron), interferon-alpha, herbimycin A, PNU145156E,16K prolactin fragment, Linomide, thalidomide, pentoxifylline, genistein, TNP-470, endostatin, paclitaxel, accutin, angiostatin, cidofovir, vincristine, bleomycin,AGM-1470, platelet factor 4或minocycline。癌细胞的增生强烈地依赖着大规模的癌血管形成，并且也伴随着癌细胞的发展。因此，使用抗血管新生药剂对新血管形成的抑制和已形成之血管做标靶毁坏已被当成是种有效且非毒性的癌症治疗方法（Arap et al., Science 279: 377-380, 1998a; Arap et al., Curr. Opin. Oncol. 10: 560-565, 1998b; Ellerby et al., Nature Med. 5:1032-1038, 1999）。多种类的抗血管新生药剂和／或血管抑制物质已被广泛的了解（例如，Folkman, In: Cancer: Principlesand Practice, eds. DeVita et al., pp. 3075-3085, Lippincott-Raven, New York, 1997; Eliceiri and Cheresh,Curr. Opin. Cell. Biol. 13, 563-568, 2001）。

在此发明特殊的情况下，此发明的肽可以与烷化基药剂结合。烷化基药剂是可以直接地与基因组DNA互相影响并阻止细胞增生的药。这类型的化疗药象征了可以影响细胞周期内的所有阶段的药剂，也就是说此药并不是针对特定阶段的。烷化基药剂不完全包括nitrogen mustard, ethylenimene, methylmelamine, alkyl sulfonate, nitrosourea或triazines。它们不完全包括busulfan, chlorambucil, cisplatin, cyclophosphamide (cytoxan), dacarbazine, ifosfamide, mechlorethamine (mustargen),和melphalan。

细胞自毁，或计划性细胞死亡，是胎儿发展、保持成人组织的恒定性以及压制癌病变的基本过程。无止境且受此发明所注视之前细胞自毁药剂的例子包括了gramicidin, magainin, mellitin, defensin和cecropin。

在此发明之下的其他情况中，此发明中的肽可以跟抗代谢物做连结。抗代谢物中断了DNA与RNA的合成。不像烷化基药剂，抗代谢物有特异性地影响了细胞周期的S阶段。抗代谢物可以分成不同的种类，像是叶酸类似物、嘧啶类似物和普林类似物还有其他相关的抑制化合物。抗代谢物不完全包括5-fluorouracil (5-FU), cytarabine (Ara-C), fludarabine, gemcitabine和methotrexate。

在一情况下，有关此发明第一点说明的肽可能包括了一个或多个寡－或聚－核酸干扰现象，像是iRNA或siRNA。这些寡－或聚－核酸干扰现象可能被适当的肽分子经由惯用的方法进行共价连结。

在不同的情况下，此发明的肽可以连结到天然的产物，而此术语通常会归类到从天然来源分离开的化合物并且已被认可含有药物学的活性。此化合物以及其类似或衍生物，从现有的科技与技术，可能自天然来源被分离出、化学合成或是重组方式生产。此天然产物可以归类为细胞分裂抑制物质、抗癌抗生素、酵素跟生物反应修饰物质。细胞分裂抑制物质包括了植物性生物碱跟其中可能抑制细胞分裂所需的蛋白质合成的天然药剂。它们在特定的细胞周期阶段内才起作用。细胞分裂抑制物质包括了docetaxel, etoposide (VP16), teniposide, paclitaxel,taxol, vinblastine, vincristine和vinorelbine。Taxoids是一种从白蜡树Taxus brevifolia的树皮分离出来的有关化合物。Taxoids不完全包括了像是docetaxel跟paclitaxel的化合物。Paclitaxel与微管蛋白结合并且促进了微管的组装。

在其他此发明观点的情况下，此发明的肽可以与抗生素连结。特定的抗生速拥有抗微生素以及细胞毒的效用。这些药也从化学方式地抑制了酵素跟细胞分裂或是改变细胞膜的方法来干扰了DNA。这些药并没有阶段独特性所以它们可以使用在任何细胞周期阶段。细胞毒之抗生素的例子不完全包括了bleomycin, dactinomycin, daunorubicin,doxorubicin (Adriamycin); plicamycin (mithramycin) 跟 idarubicin。

在其他的情况下，此发明的肽可与各种具治疗性的药剂连结。不包含在之前的归类中的各种细胞毒药剂不完全包括platinum coordination complexes, anthracenediones, substituted ureas, methyl hydrazine derivatives, amsacrine, L-asparaginase, and tretinoin。Platinum coordination复合物包括了像是carboplatin跟cisplatin (cis-DDP)的化合物。Anthracenedione的例子有mitoxantrone。Substituted urea的例子有hydroxyurea。Methyl hydrazine derivatives的例子有procarbazine (N-methylhydrazine, MIH)。并不是只有这些例子，而且只要有任何的细胞毒、细胞停滞或杀死细胞药剂可以连结到可标靶的肽上以及可实行到被标靶的器官、组织或细胞种类皆可考虑。

在特定的情况下，一个或多个可标靶的肽与特定的生物活性药剂连结并已标靶传输到器官、组织或细胞种类是最理想的。这些药剂不完全包括细胞因子和／或趋化细胞因子。此术语＂细胞因子＂是一种蛋白质的总称，而此蛋白质代表了被一种细胞所释出并且可以对另一种细胞起作用，就像是细胞间的传递者。细胞因子的例子有淋巴激素、monokine、生长因子跟传统的多肽贺尔蒙。在细胞因子中有生长激素像是人体生长激素、N-methionyl human growth hormone跟bovinegrowth hormone; parathyroid hormone; thyroxine; insulin; proinsulin; relaxin; prorelaxin; glycoprotein hormones例如follicle stimulating hormone (FSH), thyroid stimulating hormone (TSH)跟luteinizing hormone (LH); hepaticgrowth factor; prostaglandin, fibroblast growth factor;prolactin; placental lactogen, OB protein; tumor necrosis factor-α and -β; mullerian-inhibiting substance; mouse gonadotropin-associated peptide; inhibin; activin; vascular endothelial growth factor; integrin; thrombopoietin (TPO); nerve growth factors像是NGF-β; platelet-growth factor; transforming growth factors (TGFs) such as TGF-α and TGF-β; insulin-like growth factor-I and -II; erythropoietin (EPO); osteoinductive factors; interferons 像是interferon-α, -β, and -γ; colony stimulating factors(CSFs)像是macrophage-CSF (M-CSF); granulocyte-macrophage-CSF (GM-CSF); 和granulocyte-CSF (G-CSF); interleukins (ILs) 像是IL-1, IL-1.alpha., IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, LIP, G-CSF, GM-CSF,M-CSF, EPO, kit-ligand或FLT-3, angiostatin, thrombospondin, endostatin, tumor necrosis factor 跟LT。像此使用的，细胞因子此术雨包括了从天然来源的蛋白质或是从重组细胞培养与生物活性相等的自然细胞因子序列。趋化细胞因子通常表现的像chemo-attractants来吸引免疫功能细胞到趋化细胞因子表达的地方。如果把特定的趋化细胞因子基因与，比方说，细胞因子基因组合并且表达，这可以加强免疫系统分子到需治疗的地方的吸收。趋化细胞因子不完全包括RANTES, MCAF, MIP1-alpha, MIP1-Beta和IP-10。对此技术熟识的技术人员也可以认出哪些特别的细胞因子拥有chemoattractant的影响力并且把它们归类为趋化细胞因子基因。

微脂体

此发明中的肽可以以微脂体的状态出现、或是连结到微脂体、或是连结到可以成为微脂体的脂质。脂质可以，比方说，为磷脂或是脂肪酸。适当的磷脂的例子可能为phosphatidyl choline, phosphatidylglycerol, phosphatidyl inositol, 任何myristylated orstearylated or oleylated其衍生物或是任何其组合物。适当的脂肪酸的例子为arachidonic acid, docohexanoic acid, oleicacid或任何其组合物。肽可以适当的在微脂体的外围出现。此微脂体可以适当地把生物活性药剂或其他类似映像标记（像是映像的放射性标记）、治疗药剂（像是为了癌症放射治疗的放射性同位素）、治疗药物的分子、酵素、毒素、、寡－或聚－干扰核酸、病毒、在像癌细胞一样的周围有特定的结合分子像是抗体、与其构造有特定的结合能力像是抗原（AFPr）等置入胶囊或出现在微脂体的外围。

对能表达AFPr的癌细胞对应的溶瘤病毒

在新发明的情形下，此发明的肽可以与溶瘤病毒做结合。此情形可以让有表达AFPr的癌症细胞变成溶解病毒的攻击目标。术语＂溶瘤＂意思是癌细胞经由细胞自毁的过程造成溶解或是破坏。溶瘤病毒自己可以复制并毁灭瘤细胞。整个循环可以不断的从周围细胞的感染和它们经由同方式的毁坏来重复发生。此病毒复制的特色使得剂量可以不断的扩大直到被免疫反应或是没有可被影响的细胞为止（John et al., The Oncologist 7: 106-119, 2002）。

溶瘤细胞的第二个机制是使用复制时制造的蛋白质来对癌细胞直接放细胞毒。例如说，adenoviruses在晚期的细胞周期时制造死亡蛋白E311.6kD和E4ORF4蛋白质；两者皆对细胞有害（Tollefson et al.Virology 220:152-162; Shtrichman et al. J Virol;72:2975-2982. 1998）。

溶瘤细胞的第三个机制是开启了特定与非特定性的抗瘤免疫反应。加上，病毒的感染可以引起特定的抗瘤免疫力。瘤细胞具有天生地但微弱的免疫性因为它们表达了非常低剂量的主组织兼容性复合体抗原跟像是细胞因子的刺激讯号来活化局部免疫反应。比方说，adenoviruses复制时会表达E1A蛋白质，然后间接的经由提高他们对肿瘤坏死因子(TNF)的灵敏度来杀害癌细胞（Gooding et al. Infect. AgentsDis; 3:106-115, 1994）。特定抗瘤免疫力的诱发可能会导致长期对癌症复发的防御。病毒的肽会在细胞表面与MHC class I蛋白质出现；这个复合物会被胞杀性Ｔ细胞（CTLs）给认出并且吸引到病毒侵入的癌细胞。这些CTLs则会得到对癌细胞特异抗原的特异性并且以仍不清楚的方法杀害这些细胞（Toda et al. Human Gene Therapy; 10:385-393, 1999）。

在一个偏好的情况下，像adenovirus的溶瘤病毒会被基因改造成能够表达此发明中的肽在病毒的外层，这样就可以增加病毒进入且标靶有表达AFPr的细胞，同时间减少病毒进入没被标靶的细胞内。为了防止循环的病毒失去活性，此病毒可以使用PEG、微脂体或胶原物质的配方或是免疫抑制药的组合。

CD8+与CD4+的T细胞标靶肽跟其载体

CD8+ T细胞（TCD8+）是在抗病毒免疫力里很重要的讯息分子（Kaech, S. M., E. J. Wherry, and R. Ahmed. 2002. Effector and memory T-cell differentiation: implications forvaccine development. Nat. Rev. Immunol. 2:251–262;Yap, K. L., G. L. Ada, 和I. F. McKenzie. 1978. Transfer of specific cytotoxic T lymphocytes protects mice inoculated with influenza virus. Nature 273: 238–239）。它可能经由主要组织兼容复合体(MHC)第一型发现被感染的细胞上出现的病毒肽（Zinkernagel, R. M., and P. C. Doherty. 1979. MHC-restricted cytotoxic T cells: studies onthe biological role of polymorphic major transplantation antigens determining T-cell restriction-specificity, function, and responsiveness. Adv. Immunol. 27:51–177）。

基本的细胞毒性机制包含了病毒肽在MHC Class I的表达，接着被CD8+ T细胞发现，然后TCD8+会把被感染的细胞毁灭。

因为CD4+ T细胞也提供免疫反应，AFP段落可以运输长一点的肽段落、在细胞内切成肽的蛋白质或是可在细胞内表达成Class II复合物肽的核甘酸。

本发明的肽可以跟像是上述的肽、跟长一点也可当CD8+或CD4+ T细胞可识别的前驱物质、或是跟可以引诱肽或是前驱物质在细胞表面表达载体，并且可为Class I或是Class II复合物的一部分在被病毒感染，特别是癌细胞的上面。

此新发明中的肽因此可以做选择性对癌细胞传入这些物质的使用 (比方说，避免没有表达AFP受体之普通细胞的接连毁灭)。

做为此用途的例子，一个癌症病患须经过免疫/病毒感染 (例如说，给他/她注射接种牛痘、流行感冒或其他可以引发强烈的T细胞反应的病毒)。当感染的急性反应结束后，病患会被注射带有此发明的肽与任何之前描述过且可以在细胞表面建立CD8+或CD4+ T细胞市可识别的肽物质结合。比方说，一段通常会表达在Class I或Class II复合物上的牛痘病毒短肽，而此短肽也会引发细胞死亡。此肽可以直接连结或是以AFP段落加长的方法合成，或是经由一段设计可以在细胞内断开并且释放病毒肽的间隔物。

此发明中可以与AFPr结合的肽可以选择性的用来导入上述的肽/蛋白质到癌细胞里，因为这些癌细胞都会表达AFPr。普通的细胞不会表达AFPr所以不会与本发明的肽结合，因此不会与上述的肽/蛋白质有进展。在与细胞表面的AFPr有互相作用后，AFP肽会进入内在然后跟着AFP肽一起被运输进去的肽/蛋白质会经过MHC Class I过程路线形成最终在细胞表面出现的MHC Class I分子。因此会表达AFPr的细胞可以被操作的去表达可以特定的出现在MHC Class I分子的肽，因此变成了一个标靶特定肽CD8+ T细胞的目标。

测定

此发明中的肽可以用来做为检测 (包括了在测定方法里做数量性的检测) AFPr。

在一个检测AFPr的方法中，此发明第一与第三观点的肽会接触到含有或是怀疑含有AFPr的样品。在允许肽与AFPr结合的环境下，肽与任何AFPr的结论皆会被检测到。

AFPr的检测可以适当的为数量性的。

一个或多个试剂可以为了检测被标记。例如说，此发明第一与第三观点的肽可以被标记。另一方面，此发明第一与第三观点的肽可以在测定里与其他与AFPr有特异性结合伙伴做竞争，像是AFP。一个或多个带有竞争性的个体可以被标记来做检测。再说，此发明第一与第三观点的肽可以在已标记的AFPr下与样品有接触，所以标记与未标记的AFPr会与肽做结合竞争。

适当的样品为人类或是动物病患的体液或是组织。体液可以是血液、血清、血浆、黏液、尿液、排泄物、痰、唾液以及眼泪。身体组织可以是癌组织或是其他含有癌细胞的物质，比方说切片检查法得到的组织。从组织样品里得到的组织碎片也可以使用。样品可为像是子宫颈抹的悬浮细胞。

适当的癌细胞可能为从组织或体液得来的癌或肿瘤细胞，包括了子宫、淋巴结、血液、四肢、软组织、皮肤、胃、肠、乳房、腹部、卵巢、子宫颈、膀胱、摄护腺、直肠、结肠、骨盆、脑、肺、肝、肾或骨头。像WO-A-96/09551所描述过的，AFPr的检测可以揭露在这些以及其他组织的癌症，像是腺癌、血癌、agiosarcoma、肉瘤、癌原发恶性肿瘤、散发性的肿瘤、星状细胞瘤、骨肉瘤、上皮瘤和初期或转移后的新生瘤，像是子宫、淋巴结、血液、四肢、软组织、皮肤、胃、肠、乳房、腹部、卵巢、子宫颈、膀胱、摄护腺、直肠、结肠、骨盆、脑、肺、肝、肾或骨头。

另一方面，良性肿瘤或器官损害发炎可依据此新发明为了检测病患或病患的生物样品里AFPr的出现与否的肽被检测。

肽会适当地为了检测而被标记，而且可固定在一个固体支柱上。此肽对样品里任何AFPr提供了特异性的结合伙伴。当AFPr与肽或抗体结合后，标记过但没有参与结合反应的物质会被移除，然后有参与结合反应的标记物质会由测定并检测标记来当成模式。正常来说，标记的数量会与结合反应后的产物有连结并且为数量性的。

在一情况下，肽为非标记并且固定在一个固体的枝柱上。被测试的样品会在已标记的AFPr出现的情况下与固定且未标记的肽做接触，而且此标记过AFPr会跟任何样品里的AFPr对肽或抗体做结合竞争。在适当的环境下，结合反应会完成。之后固定相会被移除、清洗然后被固定相融入的标记的出现会被适当的方法给检测 (以数量性的检测方法最为适当)。这种检测方法被称为竞争型测定。根据新发明此方法较佳，因为它只需要让肽或抗体对AFPr有一个潜在的结合点。只要标记过的AFPr是在一个不会干扰结合互作用的情况下标记，那么样品内的AFPr跟标记过的AFPr，对在固定的肽与抗体结合的能力会相符合。并且标记融入在固定相的程度会与样品里AFPr的浓度成反比。

任何适当的标记都可用在肽与竞争的AFPr上。可用在肽与抗体上之标记的例子跟它们的检测系统都已在前文描述过了。

在一情况下，可用适当的支柱 (例如，膜) 涂上一个或多种有关此发明的肽做为检测AFPr的方法。要被测定或测试AFPr存在与否的样品可以跟已被适当标记过的AFPr混合 (例如，但不完全包括，胶体金、铁粒子、铁奈米粒子、带色乳胶粒子跟荧光分子) 并且彻底地跟固定住的与发明有关的肽接触 (例如，使用支撑膜来做横向流动色谱分离)。

在一个情况下，此发明用来检测AFPr的方法可为三明治法测定。此测定中，支柱会涂上一个或多种对AFPr有特异结合的伙伴。在样品里怀疑含有的AFPr与固定住且有AFPr特异结合伙伴接触后，把没结合的AFPr移除，剩下固定住的AFPr可以与具有跟AFPr特异结合性且标记过的物质接触，然后移除没结合的标记，藉以检测标记(数量性的最为适当) 来判定样品内AFPr的浓度。根据此新发明，至少在固定的跟被标记的物质里有一种是可以对样品内的AFPr有特异性结合并，且此物质要符合此发明第一或第三观点。

癌症诊断

以上描述之测定方法，在可满足测定之敏感性与特异性下设定适当的AFPr浓度门坎，做为诊断人类或非人之哺乳动物病患癌症的方法。详情请见WO-A-96/09551。

癌细胞或其他表达AFPr的病变之形象化、映像化跟听觉诊断

根据此发明中被标记的肽可以与表达AFPr的癌细胞或其他表达AFPr的病变，像是良性肿瘤或发炎性病变，做结合。只要使用了适当且可以在显微镜下见到的标记，癌组织或细胞或是其他有AFPr表达的病变都会以像是之前描述使用标记过的AFPr抗体以形象化、映像化或听觉上地检测方法从病患得到的生物样品里出现。详情请见WO-A-96/09551跟R. Moro et al., “Monoclonal antibodies against a widespread oncofetal antigen: the alpha-fetoprotein receptor”, Tumor Immunology, vol. 14, no. 2, 01 July 1993, pages 116 – 130。

因此，此发明也可以使用活体内癌症或其他有AFPr表达病变的检测和/或映像化。此发明的且为了活体内检测方便的标记肽可以对病患实施，并且病患身体里的组织或器官所保留下来的标记可以被适当标记的分布来监视。此方法中适当的标记包括了放射线同位素，而病患身体内对标记的分布，可在一段时间后，用适当的机器来监视。像是gamma计数器、gamma扫瞄器、盖氏计算器或手提式放射反应探测器。例如说，gamma照相机或扫瞄器可以用来在病患身体内做癌症或是有AFPr表达病变的映像化。盖氏计算器或任何手提式放射反应特测器可以用在手术中对肿瘤可能的位置并且用机器放出的声音来检测肿瘤重量大小。

怀孕测试

以上有关测定生物样品是否含有AFPr方法的描述，在可满足测定之敏感性与特异性下设定适当的AFPr浓度门坎，也可用来在女性人体或动物做检测怀孕。详情请见WO-A-96/09551。

AFPr的纯化

在此发明中第四个观点里提供了包含了第一与第三观点中与AFPr结合的物质 (肽，也包括抗体) 的纯化方法。经由结合互作用的结果，肽跟AFPr的复合物可以从混合物里分离出。然后可以从此复合物得到相对纯化的AFPr。

在此方法里，在允许肽或细胞与AFPr结合的环境下，AFPr或有相同表达的细胞与此发明的肽接触，没结合的肽跟着被移除，然后AFPr或细胞 (见WO-A-96/09551) 被取消与肽的结合，接着AFPr或细胞可以重新以相对纯化的状态得到。

在一种情况下，肽或是抗体可以固定在一个固体支柱上。浓度越高的固定物质出现越好，并且固定相的本质，比方说表面的形状跟肽每平方面积的浓度，是为了可以以最大的AFPr对固定相的接近来选择。可以与固定住的肽接触的是要纯化的物质。在适当的环境下，结合反应会被完全允许，之后固定相会被移除、清洗然后融入在固定相的AFPr或是细胞会被反结合给移除。纯化后的AFPr或细胞会在选择下经过更多的纯化下重新恢复 (例如说重复的纯化)。

现有发明的任一观点跟任一观点的情况可能会出现或是个别地使用其发明的观点跟情况，或是一个或多个其观点与情况依需要一起出现或使用。

图的简短描述

随文的图片:

图1显示了例一的AFP消化实验中的12% SDS PAGE gel格局;

图2 显示了在Uniprot database里发表的人类AFP氨基酸序列;

图3 显示了例三所描述的抑制实验的结果;

图4 显示了从反复操作的例三，描述不同肽彼此关系的表格化的结果;

图5 显示了例二得到的数据，是有关于使用Fragment #4来做AFPr检测的实验；

图6 显示了例二所说的使用Fragment #4管柱纯化AFPr的10% SDSPAGE gel；

图7 显示了使用例二所描述的纯化AFPr，经过放射性标记后，使用1.4G11单株抗AFPr抗体做AFPr表达之竞争型免疫测定去测试237各种癌症跟普通样品有无癌的出现；

图8 显示了例二描述过的FITC标记Fragment #4与癌细胞的结合；

图9 显示了使用Fragment #4在acridinium标记的1.4G11单株抗AFPr抗体测定里做AFPr的补捉；和

图10 显示了MCF-7人类乳癌细胞对FITC标记的Fragment #4的吸收。

图片的举例以及详细说明

以下无限的举例提供了更多对此新发明详细的解释，同时也使用图片做参考。

例一

AFP里对AFPr结合点的判定

特定的AFP生物反应在之前就已在被蛋白质分解的片段里示范过 (Dudich et al. (1999) Biochemistry, 38: 10406-10414)。与甲胎蛋黄受体结合点的判定也是使用同样的方法，即是使用蛋白质分解消化。

完整的人类AFP也经过一连串的酵素消化。AFP的来源是从人类细胞株HepG2。HepG2会分泌AFP而且此AFP比得上人体的AFP (Deutsch et al. 2000Tumour Biol; 21: 267-277)。

为了要分辨酵素消化仍然是具有生物活性，酵素消化用在使用生物素标记过之全AFP分子的竞争型ELISA中。酵素消化稀释对在MCF-7细胞抽出物出现的甲胎蛋白受体的竞争能力能够从使用固定的0.5 ug/ml生物素标记过AFP来判定。最小但仍可竞争的片段是从胃蛋白酶接着胰凝乳蛋白酶的消化制成的 (图1)，而产生的片段在使用12% SDS PAGE gel观看下为10到15 kDa左右大。此片段被放制gradient tricine gel，转换到PVDF膜然后寄出做N-端的定序。定序的结果给了氨基酸序列 V-N-P-G…，符合Uniprot Database发表的人体AFP氨基酸493 – 496 (图2)。

从AFP序列制造的合成肽也被显示拥有生物功能 (Mesfin et al.,(2000) Biochim. Biophys. Acta, 1501:33-34; Mizejewsky,et al.,(1996) Mol. Cell Endocr., 118: 15-23)。人类AFP片段从氨基酸493到554以每段小于23个氨基酸的方式用Fmoc化学反应合成。C-端的氨基酸555到609之前已经合成过且没有任何竞争反应。22氨基酸长的合成肽：HKDLCQAQGVALQTMKQEFLIN (SEQ. ID. NO:5) (Fragment #3) 被发现可以与生物素标记AFP竞争。另一个片段HKDKDLCQAQGVALQTMKQEFLIN (SEQ. ID. NO: 17)(在US专利权申请表归属于Fragment 3)也在US的申请上声明有同样的竞争作用。为了要查证此序列有没有办法变更短，把序列减少至11个氨基酸长。此序列LQTMKQEFLIN (SEQ. ID. NO: 6) (Fragment 4) 仍然被发现有竞争反应。更多的肽被合成，而最小且有竞争能力的片段为KQEFLIN (SEQ. ID. NO: 3)。查证有无其他物质也有相符合的AFP序列片段也可以跟受体反应。与人体的差不多之鼠类AFP肽片段跟着被合成。在此片段里，Phe被替换成Leu。而此肽也被发现可以与人类全AFP做与受体之结合竞争。

例二

AFP受体的检测跟纯化，以及癌症的形象化

为了显示肽Fragment #4可以直接与AFP受体(AFPr 或是 RECAF)结合，Fragment #4以100 ug/ml的浓度以及其连续半稀释的涂上了反应盘。全AFP跟单株抗体1.4G11 (可与AFP受体结合的抗体；见R. Moro et al., “Monoclonal antibodies against a widespread oncofetal antigen: the alpha-fetoprotein receptor”, Tumor Immunology, vol. 14, no. 2, 01 July 1993,pages 116 – 130) 也涂上了反应盘当做控制组。反应盘被阻挡然后与放射标记AFP受体放置并且观察有无结合发生 (图5)。

就像使用共价键连结全AFP且经由管柱层析法来纯化其受体，同一方法也可以用Fragment #4做。

此肽与被cyanogen bromide活性化后的Sepharose 6B连结。每5 mg的肽会与每ml的活性化后sepharose连结、清洗然后使用与竞争型测定一样的缓冲液做平衡化的处理。此肽的管柱被用来从癌细胞取出物中纯化RECAF (图6)。

经由AFP片段管柱纯化的AFP受体被放射性标记后，被用来显示此受体可以用来辨别癌细胞跟普通细胞 (图7)。被放射线标记后的AFPr被称为RECAF⁶²-I¹²⁵。237件各种癌与正常的样品 (癌细胞是在2006年7月在N.N.Blokhin Cancer Research Centre, Moscow, Russia采集的) 被使用抗AFPr的单株抗体 (1.4G11 Mab)做竞争型免疫测定的测试。其结果显示了有93.7%的敏感性跟95%的特异性去辨别正常跟癌症样品 (见图7)。

因为Fragment #4已经显示可以与被放射性标记的AFP受体结合，所以有FITC在N-端的Fragment #4跟着被合成出来。此肽与已知有AFP受体的癌细胞一起培养，并且展示了它对癌细胞的结合 (图8)。

为了显示根据此发明的肽，不只是与细胞表面受体结合，还可以被癌细胞吸收，我们让FITC标记过的Fragment #4肽与MCF-7细胞 (人类乳癌细胞) 接触。图10A跟B显示了此实验的结果。图10A显示了FITC标记的荧光。图10B显示了可以看到细胞形状且带有白光的荧光。此实验提供了证据可以证明此发明的肽提供了往有表达AFPr的细胞内，特别是癌细胞，输送生物反应药剂的方法。

例三

AFPr测定的使用

使用AFP-生物素的竞争型测定的设计是为了要测试肽是否在为了AFPr的测定中有用处。

反应盘可以涂上已知有AFP受体的癌细胞株抽取物 (像是，MCF-7)。100 ug/ml的全蛋白质浓度被涂上了反应盘来做测试，然后AFP-生物素与250 ug/ml的起头浓度混合，并且接连的半稀释的浓度也会准备。一开始22氨基酸长的HKDLCQAQGVALQTMKQEFLIN (SEQ. ID. NO:5) (Fragment 3)被合成。当AFP-生物素浓度不变的在0.5 ug/ml时，此肽在250 ug/ml有85%抑制力，到7.8 ug/ml时下降至50%的抑制力 (图3)。为了要找出最小但也可以像其他肽一样有竞争力的氨基酸链，包括不在Fragment #3这个AFP分子的范围外以及其他的物种，这个测定法也重复的为了接连的合成肽实施。其结果已表格化的在 (图4)。11的氨基酸长的Fragment #4肽是最容易合成且不需要溶剂就可溶解在水里的。

其他在图4中确认的肽的SEQ.ID.NOS为:

Fragment #1 - VNPGVGQCCTSSYANRRPC – SEQ. ID. NO: 18

Fragment #2 – FSSLVVDETYVPPAFSDDKFIF – SEQ. ID. NO:19

Fragment #5 – HKDLCQAQGVA – SEQ. ID. NO: 20

Fragment #6 – PAFSDDKFIFHKDLCQAQGVA – SEQ. ID. NO:21

Fragment #7 – QTMKQE – SEQ. ID. NO: 22

Fragment #8 – VALQTMKQE – SEQ. ID. NO: 23

Fragment #11 – QEFLINLVK – SEQ. ID. NO: 24

Fragment #12 – KFLIN – SEQ. ID. NO: 25

Fragment #13 – KFLI – SEQ. ID. NO: 26

Fragment #14 – KLLI – SEQ. ID. NO: 27

Fragment #15 – KLLIN – SEQ. ID. NO: 28

Fragment #16 – KQEFLINLK – SEQ. ID. NO: 29

为了显示此肽自己可以用来替换在三明治测定里的抗体，Fragment#4被使用为反应盘的涂料并且用来补捉并辨别了4个癌症与4个普通样品AFP受体。

工业的应用

此新发明构成了一个对测定跟标靶AFP受体有效且进步的系统、对测定生物样品是否有癌症有用、并且可以标靶AFPr阳性的细胞抗癌跟其他治疗药剂。

此新发明的肽媒介的使用可以像是用合成的方式准备。比方说，标记跟生物活性分子可以链接到肽媒介并且使用在此新发明里。

此肽可以用在一个诊断形式当作抗体的受质。肽会直接地使用普遍的程序标记到可以产生讯号的分子上，像是辣根过氧化物酶、acridinium、放射线同位素、荧光分子或非直接的跟生物素。肽有肽键跟侧基可以标记，就像原本的AFP分子或是抗体一样。因为肽可以加入氨基酸来改变，所以标记的程度跟特异性可以直接地控制，而这点是抗体标记所做不到的。

肽可以用在反应盘的涂膜或是去替换抗体或是AFP的基质。肽也是从普遍的F-moc化学反应合成，因为可以使肽的能力在类似抗体以及辨别AFP受体为最有效的状态。

肽自己可以当作用来经由与AFP受体的结合来确认或是改变癌细胞分子的运送物。肽或是已改变过的肽之N端或是C端可以被标记。

可水溶解或不溶解的肽可以依需要被选择，可以帮助测定系统的微调整、癌的影像化系统、AFPr纯化系统跟诊断或是治疗系统。

前述大体上无限制的描述了新发明。对在此领域的技术人员中，那些显而易见的变化跟改变型态的定义以及主张皆在此发明的范围内。

以下几个段落定义了特别的新发明的实施例以及情况：

1. 含有序列Lys-Gln-Glu-Phe-Leu-Ile-Asn (同SEQ. ID. NO:3) 且与人类甲胎蛋白 (AFP) 受体 (AFPr) 结合的肽。

2. 在第一段落的肽中几个氨基酸被替换而成为；

Lys-Gln-Gln-Phe-Leu-Ile-Asn (same as SEQ. ID. NO : 12)

Lys-Gln-Gln-Phe-Ile-Asp-Leu (same as SEQ. ID. NO: 13)

Lys-Glu-Gln-Phe-Leu-Ile-Asn (same as SEQ. ID. NO: 11)

Lys-Gln-Gln-Leu-Ile-Asp-Leu (same as SEQ. ID. NO: 14)

Lys-Gln-Glu-Leu-Leu-Ile-Asn (same as SEQ. ID. NO: 9)

Lys-Glu-Glu-Phe-Leu-Ile-Asn (same as SEQ. ID. NO: 10)。

3. 第一跟第二段落的肽是其中一些氨基酸与相同的氨基酸类群替换的。

4. 在第一到第三段落的肽的一端或两端加入氨基酸可以使肽更难溶解于水。这点可以帮助肽在固定相的吸附作用。

5. 在第一到第三段落的肽的一端或两端加入氨基酸可以使肽更溶解于水。

6. 在第一到第三段落的肽的一端或两端加入氨基酸可以使肽与其他分子做共价性的连结。

7. 在第一到第三段落的肽中加入Cys分子可以使肽与其他分子形成双硫键。

8. 在第一到第三段落的肽中加入Tyr或其他适合的分子可以使肽能够被放射性标记。

9. 在第一到第八段落中，一个多分子 (或是聚合物) 且所有的肽炼皆相同的，同时出现多于一个AFPr的结合点肽。

10. 在第一到第八段落中，一个多分子 (或是聚合物) 且肽炼为不同的，同时出现多于一个AFPr的结合点肽。

11. 第一到第十段落且被放射线同位素标记的肽。

12. 第一到第十段落且被生物素标记的肽。

13. 第一到第十段且与干扰式RNA (iRNA) 或是小型干扰式RNA(siRNA)连结的物质。

14. 第一到第十段中的且与微脂体 (liposome) 连结的物质。这些微脂体可以运送许多不同的物质，从映像化跟治疗用的放射物质到酵素、毒素、药物到iRNA或病毒等等，容许我们使用去检测或是杀死表达AFPr的细胞。

15. 第一到第十段中的且与像是retionic acid但不完全只是其之类可以引导细胞分化的物质。

16. 第一到第十段中的且与可以引导细胞自毁的物质。

17. 第一到第十段中的且可以与适当的药物或是可杀死表达AFPr细胞的毒物物质。

18. 第十七段落中的物质但AFPr表达细胞在试管内。

19. 第十七段落的物质但AFPr表达细胞在病患里且此物质被加入至病患里。

20. 第一到第十段中的且与像是arachidonic acid, docohexanoic acid, oleic acid等但不完全只是其之类的脂肪酸连结或是聚合。

21. 一个利用AFPr与第一到第十段落中的物质来纯化AFPr的方法。

22. 在第21段落中提出的方法中，第1到第10段落的物质已供价的方法与固相连结。

23. 在第21段落中提出的方法中，第1到第10段落的物质先与含有AFPr的物质反应然后其复合物从混合物中分离。

24. 在一个可以检测AFPr的方法中，第1到第10段落的物质被适当的标记给标记并且培养在有AFPr的样品里。

25. 在第24段落的方法中，样品为组织碎片。

26. 在第24段落的方法中，样品为体液。

27. 在第24段落的方法中，样品为悬浮的细胞。

28. 在一个检测AFPr的方法中，适当的支撑膜涂上了第1到第10段描述的物质，并且样品与适当的标记后AFPr混合，举例但不完全包括胶体金、铁粒子、铁奈米粒子、有色的乳胶粒子跟荧光分子，然后在固体支柱里使用横向移动的层析法上。此段落包括了使用当做抗体基质的肽在快筛。此段落必须要包括三明治以及竞争型的测定方法。在三明治方法中，测试可以使用一抗体与一个在1-10段落中的物质做组合或是只使用1-10段落中的物质也可 [换句话说，三明治的两边皆为肽]。

29. 第24,25,26跟28段落中描述的方法中，损害的是恶性肿瘤或是白血病。

30. 第24,25,26跟28段落中描述的方法中，损害的是良性肿瘤。

31. 第24,25,26跟28段落中描述的方法中，损害的是发炎型损害。

32. 第24,25,26跟28段落中描述的方法中，与其是损害，此方法被用来做怀孕的检测。

33. 段落11的方法中，标记后的物质被导入至病患中来对有累积AFPr表达的损害点做映像化。

34. 段落11的方法中，放射性物质会打入有一个或多个AFPr表达的损害之病患，所以同位素衰退中的放射线的累积可以引导损害中的细胞死亡。

35. 一个活耀性的哺乳类甲胎蛋白 (AFP) 与其受体 (AFPr)的结合序列中，Xaa₁ -Lys-Gln-Glu-Xaa₂-Leu-Ile-Asn (SEQ. ID.NO: 30)，其中Xaa₁代表了任何氨基酸，然后-Xaa₂代表了Phe或是Leu而且按同一顺序，也为人类与老鼠的AFP段落之氨基酸序列。此片段可与AFP受体结合；此肽可以在检测、纯化跟映象话RECAF中做为AFP的替代品；因为此肽可与RECAF结合，而RECAF会在癌细胞中上升，所以此肽提供了一个可以做为诊断判别癌症或是运输细胞毒或是放射线药物的化疗方法。

序列表

<110> MORO, Ricardo J

SCHMID, Ralph H

<120> 结合甲胎蛋白 (AFP) 受体的肽和其用途

<130> MORO-2

<150> US 61/279,501

<151> 2009-10-22

<160> 30

<170> 专利版本3.5

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<220>

<221> 各种特征

<222> (4)..(4)

<223> Phe or Leu

<400> 1

Lys Glx Glx Xaa Leu Ile Asn

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> 各种特征

<222> (4)..(4)

<223> Phe or Leu

<220>

<221> 各种特征

<222> (5)..(5)

<223> Phe or Leu

<400> 2

Lys Glx Glx Xaa Ile Asp Leu

1 5

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 3

Lys Gln Glu Phe Leu Ile Asn

1 5

<210> 4

<211> 609

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 4

Met Lys Trp Val Glu Ser Ile Phe Leu Ile Phe Leu Leu Asn Phe Thr

1 5 10 15

Glu Ser Arg Thr Leu His Arg Asn Glu Tyr Gly Ile Ala Ser Ile Leu

20 25 30

Asp Ser Tyr Gln Cys Thr Ala Glu Ile Ser Leu Ala Asp Leu Ala Thr

35 40 45

Ile Phe Phe Ala Gln Phe Val Gln Glu Ala Thr Tyr Lys Glu Val Ser

50 55 60

Lys Met Val Lys Asp Ala Leu Thr Ala Ile Glu Lys Pro Thr Gly Asp

65 70 75 80

Glu Gln Ser Ser Gly Cys Leu Glu Asn Gln Leu Pro Ala Phe Leu Glu

85 90 95

Glu Leu Cys His Glu Lys Glu Ile Leu Glu Lys Tyr Gly His Ser Asp

100 105 110

Cys Cys Ser Gln Ser Glu Glu Gly Arg His Asn Cys Phe Leu Ala His

115 120 125

Lys Lys Pro Thr Pro Ala Ser Ile Pro Leu Phe Gln Val Pro Glu Pro

130 135 140

Val Thr Ser Cys Glu Ala Tyr Glu Glu Asp Arg Glu Thr Phe Met Asn

145 150 155 160

Lys Phe Ile Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Phe Leu Tyr Ala Pro

165 170 175

Thr Ile Leu Leu Trp Ala Ala Arg Tyr Asp Lys Ile Ile Pro Ser Cys

180 185 190

Cys Lys Ala Glu Asn Ala Val Glu Cys Phe Gln Thr Lys Ala Ala Thr

195 200 205

Val Thr Lys Glu Leu Arg Glu Ser Ser Leu Leu Asn Gln His Ala Cys

210 215 220

Ala Val Met Lys Asn Phe Gly Thr Arg Thr Phe Gln Ala Ile Thr Val

225 230 235 240

Thr Lys Leu Ser Gln Lys Phe Thr Lys Val Asn Phe Thr Glu Ile Gln

245 250 255

Lys Leu Val Leu Asp Val Ala His Val His Glu His Cys Cys Arg Gly

260 265 270

Asp Val Leu Asp Cys Leu Gln Asp Gly Glu Lys Ile Met Ser Tyr Ile

275 280 285

Cys Ser Gln Gln Asp Thr Leu Ser Asn Lys Ile Thr Glu Cys Cys Lys

290 295 300

Leu Thr Thr Leu Glu Arg Gly Gln Cys Ile Ile His Ala Glu Asn Asp

305 310 315 320

Glu Lys Pro Glu Gly Leu Ser Pro Asn Leu Asn Arg Phe Leu Gly Asp

325 330 335

Arg Asp Phe Asn Gln Phe Ser Ser Gly Glu Lys Asn Ile Phe Leu Ala

340 345 350

Ser Phe Val His Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Gln Leu Ala Val Ser

355 360 365

Val Ile Leu Arg Val Ala Lys Gly Tyr Gln Glu Leu Leu Glu Lys Cys

370 375 380

Phe Gln Thr Glu Asn Pro Leu Glu Cys Gln Asp Lys Gly Glu Glu Glu

385 390 395 400

Leu Gln Lys Tyr Ile Gln Glu Ser Gln Ala Leu Ala Lys Arg Ser Cys

405 410 415

Gly Leu Phe Gln Lys Leu Gly Glu Tyr Tyr Leu Gln Asn Ala Phe Leu

420 425 430

Val Ala Tyr Thr Lys Lys Ala Pro Gln Leu Thr Ser Ser Glu Leu Met

435 440 445

Ala Ile Thr Arg Lys Met Ala Ala Thr Ala Ala Thr Cys Cys Gln Leu

450 455 460

Ser Glu Asp Lys Leu Leu Ala Cys Gly Glu Gly Ala Ala Asp Ile Ile

465 470 475 480

Ile Gly His Leu Cys Ile Arg His Glu Met Thr Pro Val Asn Pro Gly

485 490 495

Val Gly Gln Cys Cys Thr Ser Ser Tyr Ala Asn Arg Arg Pro Cys Phe

500 505 510

Ser Ser Leu Val Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Pro Ala Phe Ser Asp

515 520 525

Asp Lys Phe Ile Phe His Lys Asp Leu Cys Gln Ala Gln Gly Val Ala

530 535 540

Leu Gln Thr Met Lys Gln Glu Phe Leu Ile Asn Leu Val Lys Gln Lys

545 550 555 560

Pro Gln Ile Thr Glu Glu Gln Leu Glu Ala Val Ile Ala Asp Phe Ser

565 570 575

Gly Leu Leu Glu Lys Cys Cys Gln Gly Gln Glu Gln Glu Val Cys Phe

580 585 590

Ala Glu Glu Gly Gln Lys Leu Ile Ser Lys Thr Arg Ala Ala Leu Gly

595 600 605

Val

<210> 5

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 5

His Lys Asp Leu Cys Gln Ala Gln Gly Val Ala Leu Gln Thr Met Lys

1 5 10 15

Gln Glu Phe Leu Ile Asn

20

<210> 6

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 6

Leu Gln Thr Met Lys Gln Glu Phe Leu Ile Asn

1 5 10

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 7

Thr Met Lys Gln Glu Phe Leu Ile Asn

1 5

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 8

Leu Gln Thr Met Lys Gln Glu Leu Leu Ile Asn

1 5 10

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 9

Lys Gln Glu Leu Leu Ile Asn

1 5

<210> 10

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 10

Lys Glu Glu Phe Leu Ile Asn

1 5

<210> 11

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 11

Lys Glu Gln Phe Leu Ile Asn

1 5

<210> 12

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 12

Lys Gln Gln Phe Leu Ile Asn

1 5

<210> 13

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 13

Lys Gln Gln Phe Ile Asp Leu

1 5

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 14

Lys Gln Gln Leu Ile Asp Leu

1 5

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 15

Cys Cys Arg Asp Gly Val Leu Asp Cys

1 5

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> 各种特征

<222> (4)..(4)

<223> 羟脯氨酸

<220>

<221> 各种特征

<222> (4)..(4)

<223> 羟脯氨酸

<220>

<221> 各种特征

<222> (7)..(7)

<223> 羟脯氨酸

<400> 16

Glu Met Thr Xaa Val Asn Xaa Gly Gln

1 5

<210> 17

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 17

His Lys Asp Lys Asp Leu Cys Gln Ala Gln Gly Val Ala Leu Gln Thr

1 5 10 15

Met Lys Gln Glu Phe Leu Ile Asn

20

<210> 18

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 18

Val Asn Pro Gly Val Gly Gln Cys Cys Thr Ser Ser Tyr Ala Asn Arg

1 5 10 15

Arg Pro Cys

<210> 19

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 19

Phe Ser Ser Leu Val Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Pro Ala Phe Ser

1 5 10 15

Asp Asp Lys Phe Ile Phe

20

<210> 20

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 20

His Lys Asp Leu Cys Gln Ala Gln Gly Val Ala

1 5 10

<210> 21

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 21

Pro Ala Phe Ser Asp Asp Lys Phe Ile Phe His Lys Asp Leu Cys Gln

1 5 10 15

Ala Gln Gly Val Ala

20

<210> 22

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 22

Gln Thr Met Lys Gln Glu

1 5

<210> 23

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 23

Val Ala Leu Gln Thr Met Lys Gln Glu

1 5

<210> 24

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 24

Gln Glu Phe Leu Ile Asn Leu Val Lys

1 5

<210> 25

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 25

Lys Phe Leu Ile Asn

1 5

<210> 26

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 26

Lys Phe Leu Ile

1

<210> 27

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 27

Lys Leu Leu Ile

1

<210> 28

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 28

Lys Leu Leu Ile Asn

1 5

<210> 29

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 29

Lys Gln Glu Phe Leu Ile Asn Leu Lys

1 5

<210> 30

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> 各种特征

<222> (1)..(1)

<223> 任何一个或没有氨基酸

<220>

<221> 各种特征

<222> (1)..(1)

<223> 任何氨基酸

<220>

<221> 各种特征

<222> (5)..(5)

<223> Phe or Leu

<400> 30

Xaa Lys Gln Glu Xaa Leu Ile Asn

1 5

Claims (55)

1.含有序列Lys-Glx-Glx-Xaa-Leu-Ile-Asn (SEQ. ID. NO: 1) 的肽，和其与AFP受体结合的变异体，其中Glx代表Gln或Glu，同时每一个Glx是独立个别选择的，且Xaa代表Phe或Leu。

2.根据权利要求1所述的肽，其特征在于： 通过对序列SEQ. ID. NO: 1的七肽基序进行氨基酸的插入、替换和/或删除中的至少一种而使序列变得与SEQ. ID. NO: 1不同，并使得所述七肽基序中至少4个连续的氨基酸的排列顺序保持与SEQ. ID. NO: 1中相同。

3.根据权利要求1或2所述的肽，其特征在于：含有七肽基序Lys-Glx-Glx-Xaa-Ile-Asp-Leu (SEQ. ID. NO: 2) ，其中Glx代表Gln或Glu，同时每一个Glx是独立个别选择的，且Xaa代表Phe或Leu。

4.根据前面任一项权利要求所述的肽，其特征在于：所述肽的长度小于25个氨基酸。

5.根据前面任一项权利要求所述的肽，其特征在于：所述肽含有以下的序列或是由以下的序列构成：

KQEFLIN (SEQ. ID. NO: 3);

当序列KQEFLIN (SEQ. ID. NO: 3)为保守序列时，来自SEQ. ID. NO: 4的609位氨基酸序列的任何片段；

HKDLCQAQGVALQTMKQEFLIN (SEQ. ID. NO: 5);

LQTMKQEFLIN (SEQ. ID. NO: 6);

TMKQEFLIN (SEQ. ID. NO: 7);

LQTMKQELLIN (SEQ. ID. NO: 8);

KQELLIN (SEQ. ID. NO: 9);

KEEFLIN (SEQ. ID. NO: 10)；

KEQFLIN (SEQ. ID. NO: 11);

KQQFLIN (SEQ. ID. NO: 12);

KQQFIDL (SEQ. ID. NO: 13);

KQQLIDL (SEQ. ID. NO: 14);

KQEFLINLK (SEQ. ID. NO: 29)。

5.根据前面任一项权利要求所述的肽，其特征在于：所述肽直接或间接结合至表面、非肽分子、标记、细胞毒素、放射性或其他生物活性试剂、或以上各项的任意组合。

6.根据权利要求5所述的肽，其特征在于：用比色的、荧光的或冷光的分子对所述肽进行标记。

7.根据权利要求5所述的肽，其特征在于：用放射性同元素标记所述肽。

8.根据权利要求5所述的肽，其特征在于：用生物素标记所述肽。

9.根据权利要求5所述的肽，其特征在于：所述肽结合至：干扰型RNA分子 (iRNA) 或是小型干扰型RNA (siRNA)分子或是溶瘤病毒、第二肽、前驱物质或是其载体，其中在运输到细胞之后，第二肽会在MHCClass I或Class II上表达并引诱CD8+ 或CD4+ 细胞的细胞毒性。

10.根据权利5的叙述下，被微脂体连结的肽,通常会带有其他的药剂，像是为了映像与治疗用的放射性同元素、酵素、毒素、药物、iRNA、病毒或其他可以检测或是杀死AFPr表达的细胞之药剂。

11.根据权利要求5所述的肽，其特征在于：所述肽结合至引导细胞分化的物质，但不限于维甲酸。

12.根据权利要求5所述的肽，其特征在于：所述肽结合至引导细胞自毁的物质。

13.根据权利要求5所述的肽，其特征在于：所述肽结合至杀死表达AFPr的药物或毒物。

14.根据前面任一项权利要求所述的肽，其特征在于：一个或多个氨基酸被加入到N端、C端或是两端使所述肽的溶解性降低，所述一个或多个氨基酸选自20个自然形成的氨基酸：Glycine, Alanine, Leucine,Methionine, Phenylalanine, Tryptophan, Lysine, Glutamine, Glutamic acid, Serine, Proline, Valine, Isoleucine, Cysteine, Tyrosine, Histidine, Arginine, Asparagine,Aspartic acid 和 Threonine，以及其它氨基酸，像是homocystine, ornithine,和hydroxyproline；所述一个或多个氨基酸的加入是经由F-MOC合成步骤或是通过加入已合成的氨基酸基团而选择性地实现的；所述氨基酸的加入选择性地提高了所述肽对于固相的吸收。

15.根据前面任一项权利要求所述的肽，其特征在于：一个或多个氨基酸被加入到N端、C端或是两端，以为了实际操作需要而使所述肽的溶解性升高或降低，所述一个或多个氨基酸选自20个自然形成的氨基酸，以及其它氨基酸，像是homocystine, ornithine和hydroxyproline；而所述一个或多个氨基酸的加入是经由F-MOC合成步骤或是通过加入已合成的氨基酸基团而选择性地实现的。

16.根据前面任一项权利要求所述的肽，其特征在于：一个或多个氨基酸被加入到N端、C端或是两端，以使肽与其他分子共轭连接，所述一个或多个氨基酸选自20个自然形成的氨基酸，以及其它氨基酸，像是homocystine, ornithine和hydroxyproline。

17.根据前面任一项权利要求所述的肽，其特征在于：一个或多个Cys分子被加入到所述肽，以与其他分子组成双硫键。

18.根据前面任一项权利要求所述的肽，其特征在于：一个或多个Tyr分子或其他适当分子被加入到所述肽，以使所述肽能够进行放射线标记。

19.根据前面任一项权利要求所述的肽，其特征在于：生物素或是其他适当标记加入到所述肽，以使所述肽能够被检测。

20.根据权利要求10所述的肽，其特征在于：AFPr表达细胞在体外。

21.根据权利要求10所述的肽，其特征在于： AFPr表达细胞在病患体内，而且所述物质能够被引入至病患。

22.根据前面任一项权利要求所述的肽，其特征在于：所述物质与脂肪酸连接或聚合，所述脂肪酸例如但不限于arachidonic acid, docohexanoic acid或oleic acid。

23.根据前面任一项权利要求所述的肽，其特征在于：所述肽的Lys被其他有亲水性侧基的氨基酸，例如Asn、Glu、Gln、His、Arg或Asp，所取代；和/或Gln被有亲水性侧基的氨基酸，例如Asn、Glu、His、Lys、Arg、Asp，所取代；和/或Glu被有亲水性侧链的氨基酸，例如Asn、Gln、His、Lys、Arg和Asp，所取代；和/或Phe被具有疏水性侧基的氨基酸，例如Val、Leu、Ile、Met，所取代；和/或Leu被具有疏水性侧基的氨基酸，例如Val、Ile、Met、Phe，所取代；和/或Ile被具有疏水性侧基的氨基酸，例如Val、Leu、Met和Phe，所取代；和/或Asn被有亲水性侧基的氨基酸，例如Glu、His、Lys、Arg、Asp，或者有疏水性侧基的氨基酸，例如Val、Leu、Ile、Met、Phe，所取代。

24.根据前面任一项权利要求所述的肽，其特征在于：所述肽适合运输毒物或放射性物药剂到肿瘤或发炎细胞。

25.肽的聚合物或聚集体，所述肽如前面任一项权利要求所述，其特征在于：所述聚合物或聚集体表达一个以上的AFPr结合点，且其中所有的肽链皆相同。

26.肽的聚合物或聚集体，所述肽如前面任一项权利要求所述，其特征在于：所述聚合物或聚集体表达一个以上的AFPr结合点，其中的肽链皆不同。

27.用于杀死肿瘤细胞的脂质体，该脂质体包含：权利要求1至24任一项所述的肽，或者权利要求25或26所述的聚合物或聚集体。

28.用于杀死肿瘤细胞且将权利要求1到24所述的肽或是权利要求25或26所述的聚合物或聚集体表达在其衣壳上的病毒。

29.与权利要求1至24任一项所述的肽、或者权利要求25或26所述的聚合物或聚集体结合的iRNA、RNA或DNA，用于运输至细胞，以修正细胞进程和/或杀死肿瘤细胞。

30.权利要求1至24任一项所述的肽、或者权利要求25或26所述的聚合物或聚集体的作为运输试剂至肿瘤细胞的载体的用途，所述试剂例如药物、毒物、溶瘤病毒跟分化分子。

31.权利要求1至24任一项所述的肽、或者权利要求25或26所述的聚合物或聚集体的将第二肽或前驱物质或其载体运输至细胞的用途，所述第二肽被运输到细胞后，会在MHC Class I或Class II上表达并引诱CD8+ 或CD4+ 细胞的细胞毒性。

32.能够与权利要求1至24任一项所述的肽、或者权利要求25或26所述的聚合物或聚集体特异性结合的抗体。

33.针对权利要求32中的抗体所培育的、能够与AFP受体特异性结合的anti-idiotypic抗体。

34.一种AFPr纯化方法，包括：将AFPr与权利要求1-26和33中任一项所述的物质结合，然后将结合形成肽/AFPr复合体从混合物中分离出来，再从复合体中得到相对纯净的AFPr。

35.用于检测AFPr的方法，其中，将权利1-26和33中任一项所述的物质与含有AFPr的物质反应，以形成肽/AFPr复合体，然后检测此复合体。

36.根据权利要求35所述的方法，用于检测获自人体或动物对象的生物样品是否含有AFPr，所述方法包括：使样品与标记后AFPr跟一个或多个有AFPr特异结合性的物质接触，附带条件为根据权利要求1-26和33中任一项所述的至少一种物质存在为AFPr特异性结合伙伴，且通过分析样品与标记后AFPr之间与一个或多个特异性结合伙伴的结合竞争来检测样品中AFPr的存在或缺失。

37.根据权利要求35所述的方法，用于检测获自人体或动物对象的生物样品是否含有AFPr，所述方法包括：使样品与一个或多个有AFPr特异结合性且固定在一个固体支柱上的物质接触，当结合反应达到平衡且固定的AFPr与标记且具AFPr特异性结合伙伴接触后，移除没被固定的AFPr，接着检测看有多少被固定的标记留下，此方法的附带条件为至少一个AFPr的结合伙伴是根据权利要求1-26和33中任一项所述的物质。

38.根据权利要求36或37所述的方法，其特征在于，AFPr的特异性结合伙伴选自：抗AFPr抗体、拥有AFPr结合特异性的anti-idiotypic抗体、有AFPr结合特异性之AFP和其段落、和根据权利要求1-26所述的肽和聚集体。

39.根据权利要求35到38任一项所述的方法，其中，所述方法用于检测女性人类或雌性动物的怀孕，或是用于检测人类或动物的癌症或其他疾病，或是用于生物样品的癌症影像化。

40.AFPr纯化方法，其中，所述AFPr与根据权利要求1-26中任一项所述的物质结合。

41.根据权利要求40所述的方法，其中，根据权利要求1-26中任一项所述的物质与固相共轭连接。

42.根据权利要求40所述的方法，其中，根据权利要求1-26中任一项所述的物质先与含有AFPr的物质反应，然后从混合物中分离出反应复合物。

43.一直检测AFPr的方法，其中，使用适当的标记来标记根据权利要求1-26中任一项所述的物质，然后使所述物质与含有AFPr的样品反应或是将所述物质引入到人体或动物身体里。

44.根据权利要求43所述的方法，其中，所述样品是组织碎片。

45.根据权利要求43所述的方法，其中，所述样品是体液。

46.根据权利要求43所述的方法，其中，所述样品含有死亡或生存的悬浮细胞。

47.一种检测AFPr的方法，其中，在适当的支撑膜上涂敷根据任何权利要求1-26中任一项所述的物质，然后将样品与由适当标记标记过的AFPr混合，并且将样品在支撑膜上进行横向流动色谱分离，其中，所述适当标记例如但不限于胶体金、铁粒子、铁奈米粒子、带色乳胶粒子和荧光粒子。

47.根据权利要求43到46中任一项所述的方法，用于检测选自恶性肿瘤或白血病的病变的存在与否。

48.根据权利要求43到46中任一项所述的方法，用于检测良性肿瘤之病变的存在与否。

49.根据权利要求43到46中任一项所述的方法，用于检测发炎的存在与否。

50.根据权利要求43到46中任一项所述的方法，用于检测怀孕与否。

51.根据权利要求43到46中任一项所述的方法，用于检测动物，所述动物包括但不限于家养宠物或人类。

52.根据权利要求43到50中任一项所述的方法，其中，将标记过的物质引入患者体内，以便把表达AFPr积累的病变影像化。

53.根据权利要求43到50中任一项所述的方法，其中，将放射性物质注入带有一个或多个AFPr表达的病变的患者体内，以使病变里从放射性物质的衰退中累积的放射线导致细胞死亡。

54.用于体内检测人类或动物对象身体里的癌症或AFPr表达的病变的存在的方法，该方法包括：向所述对象施用由适当标记标记过的、权利要求1-26中任一项所述的物质，经过容许标记在癌症部位或其它AFPr表达的病变部位累积的合适的时间段后，通过检测所述标记来观察标记在对象体内或区域内的分布。

55.根据权利要求54所述的方法，其中，所述标记为放射性同位素，且用放射性的视觉或听觉检测器来检测所述标记，所述检测器例如γ扫描仪、γ照相机或者盖革计数器。

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