CN107098968B - 单克隆抗体mAb910及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种单克隆抗体mAb910及其应用。实验表明抗体mAb910能够与H7N9特异性结合，有较好的H7N9中和活性，进而能够预防和阻止H7N9感染。同时，由于该抗体是从感染H7N9病毒的患者外周血的单个B细胞中克隆获得的全人源抗体，其具有较鼠源、嵌合及人源化抗体更低的免疫原性，可用于制备预防或治疗H7N9病毒感染的药物或诊断H7N9病毒感染的试剂。
Description
技术领域
本发明属于细胞免疫学、分子生物学领域，涉及一种全人源的单克隆抗体，尤其涉及一种全人源抗H7N9的单克隆中和抗体。另外，本发明还涉及该中和抗体的制备方法和用途。
背景技术
H7N9病毒属于正粘病毒科，单股负链有包膜的分节段的RNA病毒，基因组分为8个节段。病毒呈球形，大小约100nm，由衣壳和包膜组成。8个病毒RNA节段被NP覆盖形成螺旋对称的病毒衣壳，包膜来自于宿主细胞膜，表面嵌有HA与NA的蛋白质刺突。HA是以三聚体形式嵌合在包膜表面，是流感病毒的最主要抗原成分，能够凝集红细胞，并且是主要的保护性抗原，目前发现的H7N9病毒中和性抗体绝大部分是针对HA蛋白的。NA主要参与病毒的芽生释放，并可促进病毒的扩散，同时NA关键位点的突变与病毒耐药性相关。HA和NA的抗原结构很不稳定，在自然流行和宿主免疫压力下很容易发生突变获得新的生物学活性或者变成新的亚型。H7N9病毒之前一直只在禽类流行，并且在禽中症状不明显，一直未被重视。
2013年3月，在我国出现了世界上首例人感染H7N9禽流感病毒的病例。目前经实验室确诊的病例报告范围覆盖我国大陆地区的13个省、市/直辖市以及香港特别行政区和台湾。作为一种新发的具有人感染性的禽流感病毒亚型，H7N9禽流感病毒以其对人类的高致病性，高病死率，以及远高于H5N1禽流感病毒的感染率而引起全球广泛关注。由于H7N9禽流感病毒过去只在禽类传播，从未感染过人类，因此对于这种新病毒几乎所有的人都没有保护性抗体。当前H7N9禽流感病例主要呈散发状态，大部分有明确的活禽接触史，少数无明确的暴露原因。自2013年发现以来，H7N9病毒已在中国引发5波疫情流行，特别是2016年10月至2017年2月的第5波流行，已经检测到H7N9病毒发生了显著的变异，包括HA的抗原性突变，NA的耐药性突变和HA蛋白切割位点的改变。随着H7N9病毒在人间的流行，病毒变异以便更适应对哺乳类动物，同时致病性逐渐加强，并可能获得人与人之间传播的能力，这将会引发世界范围内的H7N9禽流感病毒暴发流行。
人感染H7N9禽流感后潜伏期约为7天，患者一般表现为流感样症状，如发热，咳嗽，少痰，可伴有头痛、肌肉酸痛和全身不适。重症患者病情发展迅速，表现为重症肺炎，体温大多持续在39℃以上，出现呼吸困难，可伴有咯血痰，部分病例快速进展出现急性呼吸窘迫综合征、纵隔气肿、脓毒症、休克、意识障碍及急性肾损伤直至死亡。与普通的季节性流感相比，H7N9禽流感病毒感染人体后，机体保护性抗体水平较低。部分病人可以在病毒感染后2周左右其外周血检测到中等水平的H7N9中和抗体。这种相对较弱的中和抗体水平可能与H7N9禽流感病毒的致病机理有关，预示着感染的病情更重，病程更长。此外，H7的抗原性与季节性流感的H1和H3抗原的交叉性非常低，机体内的H1和H3的中和抗体无法保护H7N9禽流感病毒的感染。因此，寻找具有中和作用的特异表位对发展有效的疫苗和抗体等药物具有至关重要的意义。
目前尚无针对H7N9禽流感病毒的特异性的治疗药物和疫苗上市。抗流感病毒药物奥司他韦对治疗H7N9禽流感的作用褒贬不一，其治疗效果可能与用药时间及病情轻重有关。H7N9禽流感病毒的疫苗的研发受抗原免疫原性较低、受试者接种疫苗后产生保护性免疫反应所需的时间长以及疾病散发的流行状态的影响，疫苗的保护效果和成本效益可能都不尽理想。在这样的情况下，被动免疫可能是目前有效预防和治疗人感染H7N9禽流感病毒的有效策略。在过去的研究中，针对流感病毒的单克隆中和抗体在动物实验中显示出良好的治疗作用和预防保护作用。目前国内外针对H7N9流感的单克隆中和抗体研究多为鼠源性的单克隆抗体，由于鼠蛋白的免疫反应限制了这种鼠源性的单克隆抗体的临床应用。采用基因工程技术对鼠源性的单克隆抗体进行人源化改造的人源化抗体虽然是目前单克隆抗体制品市场的主宰，但由于其仍保留鼠源的可变区序列，再加上人源化过程复杂并且结果不可控制，其发展前景也不为乐观。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含有独特的互补决定区的抗H7N9病毒中和活性的结合分子，优选全人源单克隆抗体，该结合分子对H7N9病毒具有显著的中和作用。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供了一种分离的结合分子，所述结合分子包括：
(1)SEQ ID NO:2所示的重链CDR1、SEQ ID NO:3所示的重链CDR2、SEQ ID NO:4所示的重链CDR3；和/或
(2)SEQ ID NO:6所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:7所示的轻链CDR2、SEQ ID NO:8所示的轻链CDR3。
作为本发明的一个方面，本发明的结合分子包括：
(1)重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；和/或
(2)轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
本发明的结合分子可以是完整的免疫球蛋白分子，所述结合分子可以是抗原结合片段，包括但不限于Fab、F(ab’)、F(ab’)2、Fv、dAb、Fd、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、双特异双链抗体、三链抗体、四链抗体以及至少含有足以赋予与H7N9病毒毒株的特异性抗原结合免疫球蛋白的片段的(多)肽或其片段。
本发明的结合分子也可以特异性结合H7N9病毒的一或多个片段。对于治疗和/或预防H7N9病毒的方法而言，所述结合分子优选能特异性结合H7N9病毒的表面可及蛋白质。
作为本发明的另一方面，本发明的结合分子还包括前面所述的结合分子的功能变体。如果变体能与亲代结合分子竞争特异性结合H7N9病毒或其蛋白片段，则认为该变体分子是本发明结合分子的功能变体。换句话说，所述功能变体仍能结合H7N9病毒或其蛋白片段。
功能变体包括但不限于一级结构序列基本相似、但是含有例如在亲代结合分子中未发现的体外或体内化学和/或生物化学修饰的衍生物。这种修饰包括乙酞化、酞化、核苷酸或者核苷酸衍生物的共价附着、脂质或者脂质衍生物的共价附着、交联、二硫键形成、糖基化、羟基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化等。换句话说，亲代结合分子的氨基酸和/或核苷酸序列中的修饰不显著影响或改变由所述核苷酸序列编码的或者含有所述氨基酸序列的所述结合分子的结合特性，即所述结合分子仍能识别并结合其靶位。
所述功能变体可以具有保守序列修饰，包括氨基酸取代、添加和缺失。这些修饰可以通过本领域己知的标准技术导入，例如定向诱变和随机PCR介导的诱变，并且可包含天然以及非天然氨基酸。
保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基由具有相似结构或者化学性质的另一氨基酸残基置换的取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族己经在本领域中限定。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性侧链氨基酸(例如天冬酞胺、谷氨酞胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半肤氨酸、色氨酸)、非极性侧链氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、分支侧链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香侧链氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。本领域技术人员明白也可以使用除了上述家族之外的其它氨基酸残基家族分类方式。另外，变体可具有非保守的氨基酸取代，例如氨基酸由具有不同结构或者化学性质的另一氨基酸残基置换。相似的小变异也可包括氨基酸缺失或者插入，或者这二者。使用本领域熟知的计算机程序可以发现确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或者缺失而不消除免疫学活性的指导。
此外，功能变体可包含氨基酸序列在氨基末端或者羧基末端或者这两端的截短体。本发明的功能变体与亲代结合分子相比可具有相同或不同的、更高或更低的结合亲和性，但是仍能结合H7N9病毒或其片段。
所述功能变体还包含对高变区的修饰，高变区包含来自CDR的氨基酸残基和来自高变环的氨基酸残基。在本发明范围内的功能变体与本文所述亲代结合分子具有至少大约50％至大约99％、优选至少大约60％至大约99％、更优选至少大约70％至大约99％、甚至更优选至少大约80％至大约99％、最优选至少大约90％至大约99％、特别是至少大约95％至大约99％，以及特别是至少大约97％至大约99％的氨基酸序列同源性。
本领域技术人员已知的计算机算法如Gap或者Bestfit可用于最佳地排列氨基酸序列以进行对比以及明确相似或相同的氨基酸残基。功能变体可以通过使用本领域己知的普通分子生物学方法改变亲代结合分子或其一部分而获得，所述方法包括但不限于易错PCR、寡核苷酸指导的诱变、定点诱变以及重链和/或轻链改组法。
本发明的功能变体对于H7N9病毒具有中和活性。所述中和活性与亲代结合分子相比可以相同或者更高或更低。此后，当使用术语“结合分子”时，其也涵盖所述结合分子的功能变体。
本发明还提供了前面所述的结合分子的核酸分子。
所述核酸分子编码前面所述的结合分子。
进一步，所述核酸分子编码包括SEQ ID NO:1-8所示的氨基酸序列中至少一个氨基酸序列的的核苷酸序列。
进一步，所述核酸分子包括SEQ ID NO:9-16所示的核苷酸序列中的至少一个核苷酸序列，或包括与SEQ ID NO:9-16所示的核苷酸序列中的至少一个核苷酸序列至少在80％以上的核苷酸序列。
优选地，所述核酸分子包括SEQ ID NO:9-16所示的核苷酸序列中的至少一个核苷酸序列。
具体明确，SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列是SEQ ID NO:9；SEQID NO:2所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列是SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列是SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列是SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列是SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列是SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列是SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列是SEQ ID NO:16。
本领域技术人员将意识到这些核酸分子的功能变体也是本发明的一部分。功能变体是这样的核酸序列，通过使用标准遗传密码可以将其直接翻译以提供与从亲代核酸分子中翻译的序列相同的氨基酸序列。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明的结合分子(或其片段，或其衍生物)的核酸序列。然后可将该核酸序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明的结合分子的序列中。
本发明还提供了一种包括前面所述的核酸分子的表达载体，除了前面所述的核酸分子之外，表达载体还包括与所述核酸分子序列操作性相连的表达调控序列。
这些表达载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
本发明还提供了一种含有前面所述的核酸分子或前面所述的表达载体的宿主细胞。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞：真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO,COS,293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
在本发明的具体实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞，更优选293F细胞。
用重组DNA转化、转染宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。一些采用的转化、转染方法包括但并不限于：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，以表达本发明的结合分子。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
本发明的结合分子优选的是采用哺乳动物细胞来生产，哺乳动物细胞通常需要在含血清的培养基中进行培养。需要对细胞进行无血清的适应过程后，方可让细胞在无血清培养基中正常的生长。
本发明提供了一种抑制H7N9病毒，或者，预防或治疗H7N9病毒感染疾病的药物组合物，所述药物组合物包括有效量的本发明的结合分子。
进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
本文所用的术语“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明的结合分子相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低组合物的效果。
可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。
本发明的组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式例如可以采用注射或其它治疗方式。
本发明还提供了一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包含本文所述至少一个结合分子以及进一步包含至少一个标记物可检测的部分/物质的分子。
本发明的免疫缀合物的标记可以是治疗剂，但是它们也可以是可检测的部分/物质。适于治疗和/或预防的标记可以是毒素或者其功能部分、抗生素、酶、增强吞噬作用或者免疫刺激作用的其它结合分子。
包含可检测物质的免疫缀合物可诊断性地用于例如评定对象是否己经感染H7N9病毒毒株或者作为临床实验程序的一部分监测H7N9病毒感染的发生或进展以例如确定指定治疗方案的功效。然而，它们也可以用于其它检测和/或分析和/或诊断目的。可检测的部分/物质包括但不限于酶、辅基、荧光材料、发光材料，生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属以及非放射性顺磁性金属离子。
为了检测和/或分析和/或诊断目的用于标记结合分子的标记依赖于使用的特定检测/分析/诊断技术和/或方法例如免疫组织化学染色(组织)样品、流式细胞计量术、激光扫描细胞计量术检测、荧光免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、生物测定(例如吞噬作用测定)、蛋白质印迹应用等。对于本领域已知的检测/分析/诊断技术和/或方法合适的标记为本领域技术人员所熟知。
除了通过直接或间接(例如通过接头)缀合而化学产生免疫缀合物之外，所述免疫缀合物可以作为融合蛋白而产生，所述融合蛋白包含本发明的结合分子及合适的标记。融合蛋白可以通过本领域已知方法产生，例如通过构建核酸分子以及随后表达所述核酸分子而重组产生，所述核酸分子包含符合读框的编码结合分子的核苷酸序列以及编码合适标记的核苷酸序列。
本发明还提供了一种包括前面所述结合分子的H7N9检测产品。
所述检测产品包括但不限于检测试剂、试剂盒、芯片或试纸。凡是包括前面所述结合分子的能够检测出H7N9的检测产品均包括在本发明的范围之内。
本发明还提供了一种非诊断目的的检测H7N9水平的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)提取含有H7N9病毒的样品；
(2)将步骤(1)获取的样品与前面所述的抗H7N9病毒的单克隆抗体或其抗原结合片段的接触；
(3)检测样品与抗体或其抗原结合片段的免疫反应。
本发明还提供给了一种利用前面所述的宿主细胞产生本发明的结合分子的方法，所述方法包括在合适的条件下培养前面所述的宿主细胞并回收所述结合分子。
本发明还提供了一种通过上述方法产生的结合分子。所述结合分子是抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供了一种前面所述的结合分子的制备方法，所述制备方法采用的是单个B淋巴细胞抗体制备技术。所述单个B淋巴细胞抗体制备技术是将单细胞分离鉴定技术结合多种PCR技术形成的一种单克隆抗体的体外表达系统，即从人B淋巴细胞中直接获取全人源的单克隆抗体的方法。
进一步，所述制备方法包括如下步骤：
(1)分离感染H7N9的人外周血中的单个核细胞，之后利用流式细胞术进行细胞分选，获得具有H7N9病毒HA蛋白阳性的单个B细胞；
(2)利用单细胞RT-PCR扩增步骤(1)获得的单个B细胞中的抗体轻链和重链可变区的核苷酸片段；
(3)将步骤(2)获得的抗体轻链和重链可变区的核苷酸片段融合到含有人类抗体恒定区的表达载体中形成重组表达载体，之后导入宿主细胞表达；
(4)筛选获得具有结合活性和中和活性的本发明的抗H7N9病毒的单克隆抗体。
本发明还提供了前面所述的结合分子在制备H7N9检测产品中的应用。
所述检测产品包括前面所述的结合分子；所述检测产品包括但不限于检测试剂、试剂盒、芯片或试纸。凡是包括前面所述的结合分子能够检测出H7N9的检测产品均包括在本发明的范围之内。
本发明还提供了前面所述的结合分子在制备前面所述的药物组合物中的应用。
本发明还提供了前面所述的结合分子在制备抑制H7N9病毒，或，预防或治疗H7N9病毒感染疾病的药物制剂中的应用。
本发明的公开的抗体可以在重链和轻链可变区包含一个或多个糖基化位点，如本领域内熟知的，在可变区中存在的一个或多个糖基化位点可以导致增强的抗体免疫原性，或者由于改变了抗原结合而改变抗体的药物动力学。
本发明的抗体可以被设计为在Fc区域内包含修改，通常是改变抗体的1个或多个功能特性，如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合、和/或抗原依赖的细胞毒性。此外，本发明的抗体可以被化学修饰(如，可以将一个或多个化学基团连接于抗体)，或被修饰以改变其糖基化，从而再改变抗体的一个或多个功能特性。
本发明的抗体可以被设计的另一个修饰是聚乙二醇化。抗体可被聚乙二醇化从而，例如，增加抗体的生物(如血清)半衰期。为了使抗体聚乙二醇化，该抗体或其片段通常在适合于一个或多个聚乙二醇(PEG)集团连接到该抗体或抗体片段的条件下，与PEG反应，如聚乙二醇的活性酯或醛衍生物。优选地，该聚乙二醇化是通过与活性的PEG分子(或类似的活性水溶性聚合物)进行酰化反应或烷基化反应而实现。
本发明的结合分子可以单独应用或者于包含本发明的结合分子的混合物中应用。换句话说，所述结合分子可以组合应用，例如作为包含两或更多种本发明的结合分子、其变体或片段的药物组合物。例如，具有不同但互补活性的结合分子可以组合在一个治疗方案中以达到希望的预防、治疗或诊断作用，但是或者也可以将具有相同活性的结合分子组合在一个治疗方案中以达到希望的预防、治疗或诊断作用。
本发明的结合分子还可以与其他具有相同或者互补功能的药物联合应用，联合应用的效果可以是结合分子与其他药物功能之和，还可以远远大于结合分子与其他药物功能之和，这种情况表明该结合分子与其他药物之间产生了协同作用。
本文所用的术语“单克隆抗体”指从一类基本均一的群体获得的抗体，除少数可能存在的天然发生的突变外，该群体中包含的单个抗体是相同的。修饰语“单克隆”仅表示抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不能解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
本文所用的术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。可变性集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区(可变区中较保守的部分)，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
如本文中所用，“H7N9”和“H7N9病毒”可互换地使用。
如本文所用，术语“载体”是指表达载体和非表达载体，并包括病毒和非病毒载体，其包括染色体外载体(如，多拷贝质粒)和整合载体(其设计为可并入宿主染色体)。就本发明来说特别重要的是用于将核酸分子转移进病毒基因组的载体(所谓的转移载体)和在表达系统中使用的表达载体。
如本文所用，“有效量”是足够减轻一或多种通常与H7N9感染相关的症状或任何由H7N9感染引起或与之相关的疾病或病症的剂量。当考虑预防性的用途时，本术语意指足够预防或延缓H7N9感染确立的剂量。
本文所述的“样品”涵盖了多种样品类型，包括生物学来源的血液及其它体液样品，实体组织样品如活检组织样品或者组织培养物，或者衍生自其中的细胞或者其后代。该术语还包括在获得后已经通过任何方式处理的样品，例如用试剂处理、溶解、或者富集某些成分如蛋白质或者多核苷酸。该术语涵盖了得自任何物种的各种临床样品，也包括培养的细胞、细胞上清和细胞溶解产物。
如本文所用，术语“分离的”是指从其天然环境中分离出的蛋白质(即，从至少一种其天然伴随的其它组分中分离)。
本发明所涉及序列的具体信息如下：
SEQ IDNO:1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSAMSWVRQAPGKGLEWVSVIYSAASSTYYADSVNGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCAKDRGKITMVRGVIIRERLLGPGNPGHRLL；
SEQ IDNO:2
GFTFSSSA；
SEQ IDNO:3
IYSAASST；
SEQ IDNO:4
AKDRGKITMVRGVIIRERL；
SEQ IDNO:5
TGVHSDIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQIITNYLNWYQQKPGKAPNLLIY GASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAPYYCQQTYTFPLTFGGGTKVDIKRT；
SEQ IDNO:6
QIITNY；
SEQ IDNO:7
GAS；
SEQ IDNO:8
QQTYTFPLT；
SEQ IDNO:9
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTCTGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGTTATTTATAGCGCTGCTAGTAGCACATACTATGCAGATTCCGTGAACGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGATAATTCCaAGAACACGCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCATATATTACTGTGCGAAAGATAGGGGAAAGATTACTATGGTTCGGGGAGTTATTATAAGAGAGAGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTC；
SEQ IDNO:10
ACCGGTGTACATTCGGACATCGTGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGATCATTACCAACTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAACCTCCTGATCTATGGTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGCGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCACCTTACTACTGTCAACAGACTTACACTTTTCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAAGTGGATATCAAACGTACG；
SEQ IDNO:11
GGATTCACCTTTAGCAGCTCTGCC；
SEQ IDNO:12
ATTTATAGCGCTGCTAGTAGCACA；
SEQ IDNO:13
GCGAAAGATAGGGGAAAGATTACTATGGTTCGGGGAGTTATTATAAGAGAGAGACTA；
SEQ IDNO:14
CAGATCATTACCAACTAT；
SEQ IDNO:15
GGTGCATCC；
SEQ IDNO:16
CAACAGACTTACACTTTTCCGCTCACT。
本发明的优点和有益效果：
本发明以H7N9表面抗原HA作为抗原，利用单个B淋巴细胞抗体制备技术，获得高效价、高特异性及高亲和力的全人源单克隆抗H7N9中和抗体。由于该抗体效价高、特异性好、亲和力强，可直接作为抗H7N9抗体类药物用于预防和治疗H7N9。
附图说明
图1显示利用ELISA筛选出的mAb910抗体表达上清与H7N9病毒HA蛋白的结合情况；
图2显示利用SDS-PAGE检测抗体mAb910的表达及纯化情况；
图3显示利用免疫印迹检测纯化的mAb910抗体与H7N9病毒HA蛋白的结合情况；
图4显示利用血凝抑制实验检测mAb910抗体对H7N9病毒Wuxi-01介导的红细胞凝集反应的影响；
图5显示利用血凝抑制实验检测mAb910抗体对H7N9病毒Suzhou-03介导的红细胞凝集反应的影响；
图6显示病毒感染后注射mAb910抗体对H7N9病毒感染小鼠存活率的影响；
图7显示病毒感染前注射mAb910抗体对H7N9病毒感染小鼠存活率的影响。
具体实施方式
下面通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1抗H7N9病毒的单克隆抗体mAb910的制备
1、记忆性B细胞分选
1.1分离PBMC
采集3份H7N9恢复期病人外周抗凝血，用Ficoll密度梯度离心法分离外周血PBMC，液氮中保存。
1.2获取记忆性B细胞
将纯化的HA蛋白标记上PE和APC荧光染料，然后与Anti-CD3-Cy7APC、Anti-CD14-FITC、Anti-CD20-Cy7PE、Anti-CD19-PE-CF594、Anti-IgG-BV421、Anti-IgM-Cy55荧光标记的抗体按相应比例混合。从液氮中取出PBMC细胞，融化后经PBS洗涤，首先用AQUA染液将死细胞染色，然后再与上述混合抗体于冰上孵育结合。800g离心洗去未结合的抗体，PBS洗涤后过细胞筛去除细胞团块和可能的大块杂质，然后上BD FACSAriaⅡ流式细胞仪分选。将PE和APC双阳性以及部分GP单阳性的单个B淋巴细胞分选到已加上细胞裂解液的96孔板中，孵育裂解。
2、单细胞RT-PCR
用SuperScriptⅢ逆转录酶将96孔板中的单个B细胞的RNA逆转录成cDNA，然后先用位于抗体Leader区的混合引物进行第一轮PCR分别扩增重链、Kappa链和Lambda链，以第一轮PCR产物为模板，再用抗体起始区的混合引物进行第二轮PCR，在第二轮PCR引物中加入相应的克隆酶切位点第二轮PCR经过琼脂糖凝胶电泳，回收330bp左右的条带。
3、抗体表达
将上面获得的330bp左右的条带酶切后分别克隆入含有轻、重恒定区的IgG表达载体。重组质粒送测序，去除完全重复的序列再将轻、重链配对后转染293F细胞，表达抗体。
4、筛选抗体
待细胞克隆长成后，细胞上清采用ELISA法筛选与特异性抗原结合的抗体。步骤如下：将纯化的HA蛋白200ng/孔包被96孔ELISA板，表达上清从1:20开始倍比稀释，抗体加入ELISA板中37℃孵育1h，后PBST洗板，加入HRP标记的抗人Fc二抗，37℃孵育30min，PBST洗板后TMB显色。使用33株抗体表达上清与纯化的HA蛋白ELISA检测。图1所示，命名为mAb910的抗体的表达上清显示与HA蛋白结合，同时用H7N9病毒感染恢复期患者为阳性对照(Positive Control,PC),用健康成人血清作为阴性对照(Negative Control,NC)，对照血清从1:1000开始倍比稀释。
5、抗体结合活性的检测
选取mAb910抗体的表达上清，在包被HA的ELISA板中将其倍比稀释，孵育后用HRP标记的抗人Fc检测，TMB显色后读取OD450，数值如表1所示。用H7N9病毒感染恢复期患者为阳性对照(Positive Control,PC),用健康成人血清作为阴性对照(Negative Control,NC)
表1抗体结合活性检测
| 稀释比例 | mAb910 | PC | NC |
| 1:20 | 1.412 | 1.585 | 0.064 |
| 1:40 | 0.876 | 1.065 | 0.058 |
| 1:80 | 0.502 | 0.65 | 0.063 |
| 1:160 | 0.307 | 0.439 | 0.057 |
| 1:320 | 0.192 | 0.257 | 0.058 |
| 1:640 | 0.131 | 0.158 | 0.061 |
| 1:128 | 0.097 | 0.104 | 0.058 |
| 1:256 | 0.087 | 0.102 | 0.057 |
5、抗体大量表达与纯化
(1)将含有mAb910抗体重链可变区核苷酸序列的表达载体(重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，相应的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)和含有mAb910抗体轻链可变区核苷酸序列的表达载体(抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示，相应的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示)在原核细胞中大量扩增，将上述表达载体用PEI瞬时转染293F细胞，于转染72h后收集细胞表达上清。细胞沉淀重悬于Freestyle培养基中，再转染一次，4天后收集上清。
(2)细胞表达上清23000rpm离心20min去细胞碎片，然后过0.2μm滤膜后，用AKTA过Protein A株亲和层析纯化抗体。
(3)Protein A株经pH＝2.2的甘氨酸-盐酸洗脱抗体，Tris中和后用透析卡透析去除杂质。
(4)纯化后的抗体经13000rpm离心30min去杂质，然后过0.2μm滤膜除菌后分装冻存于-80℃备用。
(5)利用蛋白(Protein)A亲和层析法进行纯化。利用SDS-PAGE检验抗体mAb910的表达及纯化情况，图2结果显示mAb910抗体的重链和轻链蛋白条带清晰可见，表明体外大量表达mAb910抗体成功。
实施例2 mAb910抗体结合特异性的检测
利用免疫印迹方法检测纯化抗体与H7N9病毒HA蛋白的结合
1、步骤：
(1)纯化的H7N9病毒的HA蛋白经SDS-PAGE，同时用纯化的H3N2病毒的HA蛋白做对照，电泳完成后将胶中的蛋白转印至PVDF膜中，PVDF膜用5％脱脂牛奶4℃封闭过夜，然后加入50μg的纯化抗体，37℃孵育2h，然后用PBST洗脱；
(2)1:2000加入抗人IgG二抗，37℃孵育1h，然后PBST洗脱；
(3)PVDF膜加上化学发光液在暗室里曝光。
2、结果
结果如图3所示，纯化的mAb910抗体与H7N9病毒HA蛋白相结合。图3中“1”代表的是H7N9病毒HA蛋白所在的泳道，“2”代表的是H3N2病毒的HA蛋白所在的泳道。
实施例3 mAb910抗体的血凝抑制实验
1、血清、抗体的处理
一份阳性对照血清为H7N9病毒感染恢复期患者血清，一份阴性对照血清为健康成人血清，均由本中心采集并保存。血清和抗体分别加入3倍体积的RDE，37℃孵育16-18小时，56℃灭活30min待用，血清加入6倍体积的PBS终浓度为1:10，抗体不加，终浓度为1:4。
2、1％火鸡红细胞的配制
预先在注射器中吸入2ml阿氏液，采2ml火鸡翅根静脉血，形成4ml全血混合物。将4ml血液加到50ml离心管中，向离心管内加冷的PBS液至50ml，轻柔混匀2000rpm离心5分钟去除上层悬液，再用PBS液洗涤部分沉积的细胞两次，弃去上层悬液。稀释部分沉积TRBC至PBS，使最终浓度为1％(500μl RBCs+50ml PBS)。
3、抗原配制
(1)在V底中从第二孔到第十二孔每孔加入50μl PBS；
(2)测试病毒加100μl到第一个孔内(双份)然后2倍系列稀释；
(3)向反应板中每孔加入50μl的TRBC悬液，轻柔混匀，并将反应板置于室温下孵育30分钟；
(4)30分钟后倾斜板子并观察RBC的沉淀的流动性来读取病毒的滴度。产生完全凝集的最高稀释度的病毒可作为HA滴度的终点。HA的滴度即为发生完全凝集的最后一个孔的病毒稀释度的倒数。
(5)将表2中的两种病毒分别稀释于冷的PBS中，制备成含有8个血凝抑制单位/每50μl(8HAU/50μl)的工作溶液。
表2病毒信息
4、红细胞凝集抑制
(1)向V底的微量第二排及以后的孔中每孔加入25μl的冷的PBS，向第一行的孔(A1-A11)中每孔加入50μl的RDE处理过的血清(1:10)及RDE处理过的抗体(1:4)，然后进行2倍系列稀释；
(2)加入25μl标准化的病毒至系列稀释的血清中，轻轻的振荡混匀反应板，置于37℃孵育45分钟；
(3)每孔加入50μl 1％TRBC，如前混匀，盖上反应板，在室温下放置大约30分钟使血细胞沉淀。读取HAI(血凝抑制试验)滴度。
5、结果
结果如图4和图5所示，图4和图5中的结果表明mAb910抗体明显抑制了H7N9病毒导致的红细胞凝集反应。其中图4对应的是Wuxi-01病毒株的结果，图5对应的是Suzhou-03病毒株的结果。
实施例4 mAb910抗体中和活性检测
1、准备：mAb910抗体为待检抗体，对照抗体mAb32为本室制备的抗H3N2季节性流感病毒的全人源抗体，实验前用PBS稀释成终浓度为0.2mg/ml备用。
2、实验步骤(所有步骤在BSL-3实验室内完成)
(1)稀释抗体：mAb910和mAb32抗体从0.2mg/ml开始倍比稀释，每孔50μl,每个抗体做两个复孔；
(2)加入100倍TCID50/50μl病毒(病毒原液1:40稀释即可，病毒信息见表3)，于96孔板中稀释抗体轻轻混匀，37℃孵育1小时；
(3)在每个孔中加入4.5×104个细胞，37℃孵育18-20小时，取出观察病变，记录CPE；
(4)在生物安全柜中将培养上清弃去，PBS洗2次，用80％丙酮固定10min，弃去丙酮，自然晾干；
(5)加入1:1000稀释的抗甲型流感NP蛋白鼠源抗体，37℃孵育1h，PBST洗3遍；
(6)加入HRP标记的抗鼠二抗，37℃孵育1h，PBST洗3遍，OPD显色；
(7)根据阴性对照孔2.5倍标准差计算cut off值，根据计算结果判断中和滴度。
表3所用病毒信息
3、结果
(1)不同浓度的mAb910抗体对Wuxi-01病毒株的中和效果见表4。
表4不同浓度mAb910抗体对Wuxi-01病毒株的中和效果检测
(2)中和100×TCID50以下四株病毒需要的抗体质量(ng)见表5。
表5中和100×TCID50以下四株病毒需要的抗体质量
| 病毒株 | Wuxi-01 | Wuxi-02 | Nanjing-06 | Suzhou-03 |
| 抗体量(ng) | 160 | 320 | 160 | 80 |
实施例5 mAb910抗体小鼠攻毒实验
1、治疗实验
1.1步骤
6W龄雌性小鼠轻度麻醉滴鼻感染10LD50H7N9病毒，小鼠分为两个大组，一个大组感染后2h腹腔注射mAb910抗体、另一个大组感染后2h腹腔注射对照抗体mAb32(该抗体为本室制备的抗H3N2季节性流感病毒的全人源抗体。按照抗体的注射剂量将每个大组分成四个小组：1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg。每个小组小鼠8只，观察14天，记录小鼠体重变化和死亡情况(用存活率表示)。小鼠体重下降超过30％的进行人道终点。
1.2结果
(1)小鼠存活率
如表6和图6所示，注射mAb910抗体的感染小鼠，在5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg注射剂量下，从第9天一直到第14天存活率分别维持在37.5％、37.5％、75％，即从第9天开始小鼠无死亡。而注射对照抗体的小鼠到第7天的存活率就为0了。上述结果表明，mAb910抗体能有效治疗H7N9病毒感染。
表6小鼠存活率
| 攻毒后天数(d) | 0 | 1 | 3 | 5 | 7 | 9 | 11 | 14 |
| mAb910 1mg/kg存活率％ | 100 | 100 | 62.5 | 37.5 | 25 | 0 | ||
| mAb910 5mg/kg存活率％ | 100 | 100 | 100 | 62.5 | 12.5 | 12.5 | 12.5 | 12.5 |
| mAb910 10mg/kg存活率％ | 100 | 100 | 87.5 | 37.5 | 25 | 25 | 25 | 25 |
| mAb910 20mg/kg存活率％ | 100 | 100 | 75 | 62.5 | 37.5 | 37.5 | 37.5 | 37.5 |
| 对照抗体1mg/kg存活率％ | 100 | 100 | 75 | 25 | 0 | |||
| 对照抗体5mg/kg存活率％ | 100 | 100 | 75 | 25 | 0 | |||
| 对照抗体10mg/kg存活率％ | 100 | 100 | 87.5 | 62.5 | 0 | |||
| 对照抗体20mg/kg存活率％ | 100 | 100 | 100 | 62.5 | 0 |
(2)小鼠的体重变化
如表7所示，注射mAb910抗体的感染小鼠，在5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg注射剂量下经历了体重下降又回升的过程。在5mg/kg、10mg/kg注射剂量下，到第14天小鼠的体重与开始时基本相同，在20mg/kg注射剂量下，到第14天小鼠的体重平均下降了7.51g，而注射对照抗体的小鼠体重一直在下降，到第5天体重平均下降了32.84，而到第7天的体重就因为下降了30％而进行人道终点。上述结果表明，mAb910抗体能有效治疗H7N9病毒感染。
表7小鼠的体重变化
注：负值代表体重下降。
2、预防实验
2.1步骤
6W龄雌性小鼠分为两个大组，感染前1天分别腹腔注射mAb910抗体、mAb32注射1天后将小鼠轻度麻醉滴鼻感染10LD50H7N9病毒。按照抗体的注射剂量将每个大组分成三个小组：1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg。每组小鼠8只，观察14天，记录小鼠体重变化和死亡情况。小鼠体重下降超过30％的进行人道终点。
2.2结果
(1)小鼠存活率
如表8和图7所示，提前注射mAb910抗体的感染小鼠，在5mg/kg、10mg/kg、注射剂量下，从第7天到第9天存活率分别维持在为25％、75％，即从第7天开始小鼠保持无死亡。而提前注射对照抗体的小鼠到第7天的存活率就为0了。上述结果表明，mAb910抗体能有效预防H7N9病毒感染。
表8小鼠存活率
| 攻毒后天数(d) | 0 | 1 | 3 | 5 | 7 | 9 | 11 | 14 |
| mAb910 1mg/kg存活率％ | 100 | 100 | 100 | 50 | 0 | |||
| mAb910 5mg/kg存活率％ | 100 | 100 | 100 | 87.5 | 62.5 | 62.5 | 62.5 | 62.5 |
| mAb910 10mg/kg存活率％ | 100 | 100 | 87.5 | 87.5 | 62.5 | 62.5 | 62.5 | 62.5 |
| 对照抗体1mg/kg存活率％ | 100 | 100 | 50 | 25 | 0 | |||
| 对照抗体5mg/kg存活率％ | 100 | 100 | 75 | 12.5 | 0 | |||
| 对照抗体10mg/kg存活率％ | 100 | 100 | 100 | 50 | 0 |
(2)小鼠的体重变化
如表9所示，注射mAb910抗体的感染小鼠。在5mg/kg、10mg/kg注射剂量下，经历了体重下降又回升的过程，到第14天小鼠的体重平均分别下降了5.27g和1.41g，而注射对照抗体的小鼠体重一直下降，到第5天体重平均下降了28.08g，而到第7天的体重就因为下降了30％而进行人道终点。上述结果表明，mAb910抗体能有效预防H7N9病毒感染。
表9小鼠的体重变化
注：负值代表体重下降。
虽然以上仅描述了本发明的具体实施方式范例，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改，但这些变更或修改均落入本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省疾病预防控制中心
<120> 单克隆抗体mAb910及其应用
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 126
<212> PRT
<213> 人源
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Tyr Ser Ala Ala Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Arg Gly Lys Ile Thr Met Val Arg Gly Val Ile Ile Arg
100 105 110
Glu Arg Leu Leu Gly Pro Gly Asn Pro Gly His Arg Leu Leu
115 120 125
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人源
<400> 2
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser Ala
1 5
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人源
<400> 3
Ile Tyr Ser Ala Ala Ser Ser Thr
1 5
<210> 4
<211> 19
<212> PRT
<213> 人源
<400> 4
Ala Lys Asp Arg Gly Lys Ile Thr Met Val Arg Gly Val Ile Ile Arg
1 5 10 15
Glu Arg Leu
<210> 5
<211> 114
<212> PRT
<213> 人源
<400> 5
Thr Gly Val His Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
20 25 30
Ile Ile Thr Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Pro Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr
85 90 95
Tyr Thr Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105 110
Arg Thr
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> 人源
<400> 6
Gln Ile Ile Thr Asn Tyr
1 5
<210> 7
<211> 3
<212> PRT
<213> 人源
<400> 7
Gly Ala Ser
1
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人源
<400> 8
Gln Gln Thr Tyr Thr Phe Pro Leu Thr
1 5
<210> 9
<211> 324
<212> DNA
<213> 人源
<400> 9
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctctgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtt atttatagcg ctgctagtag cacatactat 180
gcagattccg tgaacggccg gttcaccatc tccagagata attccaagaa cacgctgtat 240
cttcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccatat attactgtgc gaaagatagg 300
ggaaagatta ctatggttcg gggagttatt ataagagaga gactactggg gccagggaac 360
cctggtcacc gtctcctc 378
<210> 10
<211> 342
<212> DNA
<213> 人源
<400> 10
accggtgtac attcggacat cgtgatgacc cagtctccat cctccctgtc tgcatctgtg 60
ggagacagag tcaccatcac ttgccgggca agtcagatca ttaccaacta tttaaattgg 120
tatcagcaga aaccagggaa agcccctaac ctcctgatct atggtgcatc cagtttgcaa 180
agtggcgtcc catcaaggtt cagtggcagt ggatctggga cagatttcac tctcaccatc 240
agcagtctgc aacctgaaga ttttgcacct tactactgtc aacagactta cacttttccg 300
ctcactttcg gcggagggac caaagtggat atcaaacgta cg 342
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<212> DNA
<213> 人源
<400> 11
ggattcacct ttagcagctc tgcc 24
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<212> DNA
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atttatagcg ctgctagtag caca 24
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<212> DNA
<213> 人源
<400> 13
gcgaaagata ggggaaagat tactatggtt cggggagtta ttataagaga gagacta 57
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<212> DNA
<213> 人源
<400> 14
cagatcatta ccaactat 18
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<211> 9
<212> DNA
<213> 人源
<400> 15
ggtgcatcc 9
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> 人源
<400> 16
caacagactt acacttttcc gctcact 27
Claims (15)
1.一种分离的结合分子，其特征在于，所述结合分子包括：
（1）SEQ ID NO:2所示的重链CDR1、SEQ ID NO:3所示的重链CDR2、SEQ ID NO:4所示的重链CDR3；和
（2）SEQ ID NO:6所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:7所示的轻链CDR2、SEQ ID NO:8所示的轻链CDR3。
2.根据权利要求1所述的结合分子，其特征在于，所述结合分子包括：
（1）重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；和
（2）轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的结合分子，其特征在于，所述结合分子是全人源单克隆抗体。
4.编码权利要求1-3中任一项所述的结合分子的核酸分子。
5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括SEQ ID NO:9-10所示的核苷酸序列或SEQ ID NO:11-16所示的核苷酸序列。
6.一种包括权利要求4所述的核酸分子的表达载体。
7.一种包括权利要求4所述的核酸分子或权利要求6所述的表达载体的宿主细胞。
8.一种包括治疗有效量的权利要求1-3中任一项所述的结合分子的药物组合物。
9.一种包括权利要求1-3中任一项所述的结合分子的H7N9病毒检测产品。
10.一种利用权利要求7所述的宿主细胞产生结合分子的方法，其特征在于，所述方法包括在合适的条件下培养所述的宿主细胞并回收结合分子。
11.一种通过权利要求10所述的方法产生的结合分子。
12.一种非诊断目的的检测H7N9病毒水平的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）提取含有H7N9病毒的样品；
（2）将步骤（1）获取的样品与权利要求1-3中任一项所述的结合分子接触；
（3）检测样品与结合分子的免疫反应。
13.权利要求1-3中任一项所述的结合分子在制备H7N9病毒检测产品中的应用。
14.权利要求1-3中任一项所述的结合分子在制备抑制H7N9病毒的药物中的应用。
15.权利要求1-3中任一项所述的结合分子在制备预防或治疗由H7N9病毒感染引起的疾病的药物制剂中的应用。
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