KR20070001149A - Ｍｓｒｖ/ｈｅｒｖ-ｗ와 관련된 질병 치료를 위한 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명의 조성물은 MSRV/HERV-W의 Env 단백질의 가용 분획(soluble fraction) 또는 MSRV/HERV-W의 Env 단백질의 가용 분획(soluble fraction)을 위한 TLR4 수용체에 특정적으로 결합할 수 있는 항-Env-SU MSRV/HERV-W 항체 그룹 또는 항-TLR4 항체 그룹에서 선택되는 적어도 하나의 항체를 포함한다.
레트로바이러스(retrovirus), 인간 내인성 레트로바이러스(HERVs), 가용 분획(soluble fraction), TLR4, 사이토카인다발성 경화증(MS), 정신분열증(SCZ)
Description
본 발명은 MSRV/HERV-W의 Env 단백질의 가용 분획(soluble fraction) 또는 MSRV/HERV-W의 Env 단백질의 가용 분획(soluble fraction)을 위한 TLR4 수용체에 특정적으로 결합할 수 있는 항-Env-SU MSRV/HERV-W 항체 그룹 또는 항-TLR4 항체 그룹에서 선택되는 적어도 하나의 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
수년 동안, 당뇨병[1], 다발성 경화증(MS)[2] 및 정신분열증(SCZ)[3]과 같은 질환에서 여러 가지 레트로바이러스(retrovirus), 특히 인간 내인성 레트로바이러스(HERVs)의 중요한 발현에 대한 많은 연구들이 보고되었다. HERVs는 이미 알려진 동물 레트로바이러스와 상동관계를 가지며 아마도 인간 생식 계열에 삽입되어 존재하는 것으로 추정된다. 인간 게놈에서 이러한 HERVs의 서열은 비록 전체의 프로바이러스(proviral) 서열이 이미 확인되었지만 일반적으로 불완전하다.
다발성 경화증(MS)에 걸린 환자의 연수막(軟髓膜) 세포의 배지에서 레트로바이러스 입자를 이미 분리하였다[4]. 이러한 입자의 연구를 통해서, 그 레트로바이 러스는 인간 DNA에 상동인 유전 서열을 가지고 있지만 새로운 내인성 레트로바이러스 과(family)(HERV-W)를 정의한다는 것을 알 수 있다[2, 5, 6]. 환자의 혈청 및/또는 뇌척수액(CSF)에서 MSRV의 존재는 현재 여러 연구팀에 의해 확인되었고[7-9] 바이러스와 질병의 발생과의 연관 관계가 보고되었다[10]. 결과적으로 MSRV 및 그 외피 단백질(envelope protein)은 초항원(SAg) 형태의 T-림프구-매개 전염증(pro-inflammatory) 성질을 가지는 것으로 보고되었다. 동물 모델(인간화한 SCID 마우스)은 개발되고, 생체 내에서 이러한 입자의 면역질환 가능성 및 특히 T 림프구에 의해 매개되는 전염증성 사이토카인의 분비를 유도하는 능력을 확인시켜준다.
이하에서 MSRV/HERV-W 과(family)의 바이러스는 MSRV 또는 MSRV/HERV-W로 구분없이 사용된다.
다발성 경화증(MS)과 같은 다른 질환은 많은 양의 IL-6의 출현을 특징으로 하는 면역 시스템 활성 특성을 나타낸다. 이러한 것들 중에서, 정신분열증(SCZ)- 유전 및 환경 요인과 관계가 있는 신경정신질환-은 경우에 따라 정상치 보다 더 많은 혈청-IL-6 농도를 나타낸다[13]. 또한, MSRV의 서열에 유사한 레트로바이러스 서열이 SCZ 환자에게서 확인되었다[3]. 또한, 최근에는 새로이 진단을 받은 SCZ 환자의 SCF가 순환하는 입자와 연관된 MSRV/HERV-W 과(family)의 레트로바이러스 서열을 나타낸다는 것이 보고되었다[14].
이러한 표현은 외피 단백질의 전염증성 효과 및 관계된 활성화 경로에 의해 여러 신경 질환에서 그 역할을 하는 MSRV/HERV-W과 양립할 수 있다. 이런 레트로바이러스 요소(활성 보조인자의 제어하에 그 자체) 및 그와 연관된 효과는 염증성 탈 수초화 질환의 경우에 전적으로 관련이 있다[15]. 정신분열증의 경우에, IL-6의 과발현을 통해 시스템 수준에서 밝혀진 이러한 염증은 국지적으로 뇌의 회색질 수준에서 뇌의 마이크로글리오사이트(microgliocytes)/대식세포에 의해 매개되는 공지된 염증의 신경독성(neurotoxicity) 및 흥분독성(excitotoxicity)에 대하여 관련이 있다[16-30].
MSRV/HERV-W RNA 서열의 분화 발현은 신경분열증 환자의 전두피질 조직에서 보고되었지만, 특히 조울병(양극성 장애)을 포함하는 대조구에서는 보고되지 않았다[31]. 또한, 이러한 "MSRV/HERV-W" 레트로바이러스 분화의 전신 반사는 정신 분열증을 앓고 있는 동형접합(homozygous) 쌍둥이의 혈액에서 보고되었고, 이는 이미 보고된 순환하는 IL-6의 과발현에서 역할을 할 수 있는 "전신" 복제의 존재를 확고하게 한다[3].
정신분열증에 걸린 환자에서 MSRV/HERV-W 외피 단백질의 효과는 피질 또는 피질하, 신경독성 및/또는 흥분독성 신호의 발생에서 특정 염증 인자의 역할 수준에서 정신분열병의 병원성 연쇄반응의 일부이다.
이 경우에, MSRV/HERV-W 과(family)의 성분과 MS 및 SCZ 사이의 연관 관계를 밝히는 여러 팀에서 보고된 간행물이 존재하며, 다른 질병도 또한 관련이 있는 것으로 증명될 수 있다.
본 발명자는 예기치않게 MSRV/HERV-W의 Env 단백질이 T 림프구에 의해 매개되는 전염증성 활성과 별개의 다른 전염증성 활성을 가지고, 이러한 새로운 전염증성 활성은 T 세포를 제외한 다른 세포를 포함하고, T 세포 수용체(TCR)을 제외한 수용체를 포함하며, 초항원(superantigen)에 의한 TCR의 활성으로 인한 활성을 제외한 전염증성 경로의 활성이 되는 것을 밝혔다. 따라서, 이러한 새로운 전염증성 활성은 정의에 의하면 T 림프구의 TCR에 대한 결합에 의한 초항원 기능에 의해 유발된 전염증성 활성화와는 다르다. MSRV/HERV-W Env-SU 외피 단백질의 가용 분획 도메인(Env-SU) 및 MSRV/HERV-W Env-SU에 의해 매개되는 전염증성 효과를 유도하는 역할을 하는 아직까지 확인이 되지 않은 수용체가 항원제시세포(대식세포, 단핵구, 수지상 세포 및 마이크로글리오사이트)에 의해 매개되는 이러한 새로운 전염증성 효과에 책임이 있다는 것을 본 발명자가 밝혔다. 따라서, 레트로바이러스 입자의 표면에 자연스럽게 존재하는 Env-SU는 항원제시세포(APCs)를 표적으로 하고, 활성화시키며 상당량의 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 분비를 유도한다. 이러한 전염증성 효과는 MS에 걸린 환자에 대하여 연구하였고 기증자에게서 획득한 전염증성 효과와 비교하였다. 본 발명자는 Env-SU에 의해 유도된 IL-6의 생산은 MS 환자에게서 증가하였고 클리닉 스코어(EDSS)와 관련이 있다는 것을 밝혔다. MS 환자의 혈청, SCF 및 환부에서 IL-6의 증가량은 MS 환자의 중추신경계에서 관찰된 손상의 발생 및 지속에 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다[32-37].
따라서, 본 발명자는 놀랍게도 이러한 새로운 전염증성 효과에 관계된 Env-SU 수용체가 인간 TLR4(톨 유사 수용체 4) 단백질이라는 것을 발견하였다. TLR4를 암호화하는 유전자는 염색체 9(9q32-q33)에 위치한다. 그 단백질은 839개의 아미노산으로 구성되고 95679 Da의 분자량을 가진다. TLR4는 MD-2라 불리는 다른 분자와 협력하고 CD14와 함께, 이러한 복합체는 박테리아 리포폴리사카라이드(LPSs)를 인식하는데 관여하며, 결과적으로 NF-kappa-B 인자의 활성화, 사이토카인의 분비 및 염증 반응을 초래한다는 것은 이미 알려졌다. 그러나, TLR4는 MSRV/HERV-W 외피 단백질의 가용 분획(soluble fraction)(Env-SU)을 위한 수용체로서의 역할이 본 발명 이전에 공지되지 않았다. TLR4 단백질은 T 림프구에서 발현하지 않기 때문에, T 림프구는 TLR4 수용체에 대하여 기술된 효과의 주요 목표는 아니다. 본 발명자는 또한 환자의 생물학적 유체에서 검출된 순환하는 RNA와 연관된 MSRV 레트로바이러스 입자는 어떤 레트로바이러스 복제에 상관없이, 대식세포, 단핵구, 수지상 세포 및 마이크로글리오사이트와 같은 항원제시세포에 존재하는 TLR4 수용체가 관여한 이러한 새로운 전염증성 활성화 경로의 유발인자라는 것을 밝혔다. 이를 위하여, 본 발명자들은 제조자 배지 상청액에서 정제된 MSRV 비리온을 불활성화시켰고[4] MSRV/HERV-W Env 단백질의 존재와 관련된 그 활성을 테스트하였다. 실험 부분에 기술된 결과는 TLR4 수용체에 의한 선천성 면역의 불활성화를 위한 조기 경로(early pathway)가 Env-SU의 가용 분획의 형태 및 MSRV 비리온의 표면에서 막-결합된 형태인 외피 단백질에 의해 표적이 된다는 것을 확인시킨다.
따라서, 본 발명에서 얻어진 결과는 질병, 특히 MS 및 SCZ와 같은 신경질환의 면역치료 전략을 계획하는 것을 가능하게 하고, 특히 하나 이상의 치료제를 혈액 뇌 장벽(blood-brain barrier)을 통과하여 수송할 수 있는 벡터를 확인하는 것을 가능하게 한다. 치료적인 면에서, 본 발명의 결과의 본질적인 측면 중 하나는 예를 들어 백색질(MS)에 위치한 마이크로글리오사이트/대식세포에서 조기 염증 신호가 발생할 때 탈수초화(demyelinating) 연쇄 반응을 시작시키거나 또는 회색질(SCZ)에서 이러한 세포에 의해 조기 염증 신호가 발생할 때 흥분독성/신경독성 연쇄반응을 시작시키는 상기 조기 염증 신호의 발생에 관계된 "MSRV/HERV-W Env-SU 및 TLR4" 리간드/수용체 시스템을 확인함으로써 이러한 도메인에 독특한 특이성으로 뇌 마이크로글리오사이트/대식세포의 활성화와 연관된 염증 성분을 표적으로 하는 것을 가능하게 한다.
따라서, 본 발명의 대상은 MSRV/HERV-W의 활성화에 의해 유도된 전염증성 연쇄반응을 억제하기 위하여, (i) MSRV/HERV-W Env 단백질의 가용 분획에 특정적으로 결합할 수 있는(특정적으로 결합하는) 항-MSRV/HERV-W Env-SU 항체 그룹 또는 (ii) MSRV/HERV-W Env-SU 단백질의 가용 분획을 위한 TLR4 수용체에 특정적으로 결합할 수 있는(특정적으로 결합하는) 항체 그룹에서 선택되는 적어도 하나의 항체 및 운반체, 또는 필요하다면 약제학적으로 수용할 수 있는 벡터를 포함하는 약제 조성물 또는 약제를 MSRV/HERV-W의 존재와 관련된 증상을 나타내는 사람에게 투여하는 단계를 포함하는 MSRV/HERV-W의 존재와 관련된 증상을 나타내는 사람의 치료 방법이다. 상기 항체는 MSRV/HERV-W Env-SU의 활성화에 의해 유발되는 전염증성 연쇄 반응을 억제한다. 상기 방법은 특히 MS 및 SCZ 치료를 위해 유용하지만, 만약 다른 질병이 MSRV/HERV-W의 전염증성 단백질의 발현과 관계된 것이라면 이러한 질병의 치료를 위해서도 사용된다.
상기 항-Env-SU 항체는 특히 서열 ID NO:1에서 확인되는 서열의 아미노산 122-131(일체를 포함)에 해당하는 부위 및/또는 아미노산 312-316(일체를 포함)에 해당하는 부위 및/또는 아미노산 181-186(일체를 포함)에 해당하는 부위에 결합할 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 적어도 하나의 항-MSRV/HERV-W Env-SU 항체 또는 적어도 하나의 항-TLR4 항체를 포함하는 조성물 또는 약제는 환자에게 투여될 수 있다. 본 발명의 방법의 일 실시 형태에서, 적어도 하나의 항-MSRV/HERV-W Env-SU 항체 및 적어도 하나의 항-TLR4 항체를 포함하는 조성물 또는 약제는 환자에게 투여된다.
바람직하게는, 본 발명의 방법에서, 항-Env-SU 항체는 이하의 항체들: 항-MSRV/HERV-W Env-SU 단클론 항체(항체 3B2H4, 13H5A5 및 3H10F10(BioMerieux))에서 선택되고, 항-TLR4 항체는 항-인체 TLR4 항체 HTA125(eBioscience에서 판매됨)이다. BioMerieux 단클론 항체의 수득 방법은 이하의 설명에서 기술된다. 상기한 항체들은 현재까지 공지되지 않은 새로운 것이고, TLR4 수용체에 의해 항원제시세포에 대하여 새로이 기술된 전염증성 활성에 대하여 중화시키는 특징을 가진다.
항-TLR4 항체 또는 항-Env-SU 항체는 약제학적으로 수용할 수 있는 운반체 및 필요하다면 그 항체를 혈관 뇌 장벽(BBB)을 통과하여 운송하는 약제학적으로 수용할 수 있는 벡터를 수단으로 사람에게 투여된다. 만약 MS의 경우처럼, 질병 발달의 어떤 단계에 혈관 뇌 장벽이 개방된다면, 이러한 벡터를 사용할 필요가 없지만, SCZ의 경우와 같이 혈관 뇌 장벽의 개방이 없는 경우에는 이러한 벡터가 필요하다. 이러한 벡터는 잘 알려져 있다[38-45]. 치료 접근법은 이러한 도메인에 독특한 특이성으로 뇌 마이크로글리오사이트/대식세포의 활성화와 연관된 염증 성분을 표적으로 한다. 이러한 특이성은 예를 들어 백색질(MS)에 위치한 마이크로글리오사이트/대식세포에서 조기 염증 신호가 발생할 때 탈수초화(demyelinating) 연쇄 반응을 시작시키거나 또는 회색질(SCZ)에서 이러한 세포에 의해 조기 염증 신호가 발생할 때 흥분독성/신경독성 연쇄반응을 시작시키는 상기 조기 염증 신호의 발생에 관계된 "MSRV/HERV-W Env-SU 및 TLR4" 리간드/수용체 시스템을 확인과 연관된다.
항-MSRV/HERV-W Env-SU 또는 항-TLR4 항체의 용도는 MSRV/HERV-W의 병리학적 발현과 연관된 여러 질병에서 MSRV/HERV-W에 의해 유발된 전염증성 연쇄 반응(질병에 따라 변할 수 있는 포진성 바이러스(herpesvirus) 형태의 감염성 보조인자, 호르몬 신호 또는 특정 사이토카인에 의해 유발되는 질병에 따라 다양한 연쇄 반응)을 "원천에서" 차단하는 것이다.
따라서, 본 발명의 대상은 MSRV/HERV-W Env 단백질의 가용 분획 또는 MSRV/HERV-W Env-SU 단백질의 가용 분획을 위한 TLR4 수용체에 특정적으로 결합할 수 있는(특정적으로 결합하는) (i) 항-MSRV/HERV-W Env-SU 항체 그룹 또는 (ii) 항-TLR4 항체 그룹에서 선택되는 적어도 하나의 항체 및 약제학적으로 수용할 수 있는 운반체를 포함하는 치료 목적을 위한 조성물이다. 만약 필요하다면, 상기 조성물은 또한 약제학적으로 수용할 수 있는 벡터를 포함할 수 있다. 상기 항체들은 MSRV/HERV-W Env-SU의 활성화에 의해 유발되는 전염증성 연쇄반응을 억제한다. 바람직하게는, 본 조성물은 적어도 하나의 항-MSRV/HERV-W Env-SU 항체 및 적어도 하나의 항-TLR4 항체를 포함한다. 본 조성물에 바람직한 항체는 항-MSRV/HERV-W Env-SU 항체(3B2H4, 13H5A5 및 3H10F10) 및 항-TLR4 항체 HTA125이다. 전술한 항체들은 TLR4 수용체를 통해서 항원제시세포에 대하여 새로이 기술된 전염증성 활성을 "중화시키는" 단클론 항체이다.
상기 항-Env-SU 항체는 특히 서열 ID NO:1에서 확인되는 서열의 아미노산 122-131(일체를 포함)에 해당하는 부위 및/또는 아미노산 312-316(일체를 포함)에 해당하는 부위 및/또는 아미노산 181-186(일체를 포함)에 해당하는 부위에 결합할 수 있다.
본 발명의 대상은 또한 약제 제조를 위해 MSRV/HERV-W Env 단백질의 가용 분획 또는 MSRV/HERV-W Env-SU 단백질의 가용 분획을 위한 TLR4 수용체에 특정적으로 결합할 수 있는 (i) 항-MSRV/HERV-W Env-SU 항체 그룹 또는 (ii) 항-TLR4 항체 그룹에서 선택되는, MSRV/HERV-W Env-SU의 활성화에 의해 유발되는 전염증성 연쇄반응을 억제하는 적어도 하나의 항체의 사용 방법이다. 특히, 적어도 하나의 항-MSRV/HERV-W Env-SU 항체 및 적어도 하나의 항-TLR4 항체가 사용된다. 항-HERV-W Env-SU 항체는 항체 3B2H4, 13H5A5 및 13H10F10에서 선택되고 항-TLR4 항체는 항체 HTA125이다. 이러한 용도는 다발성 경화증 또는 정신분열증과 같은 MSRV/HERV-W과 관련된 질환의 치료를 위한 것이다.
상기 항-Env-SU 항체는 특히 서열 ID NO:1에서 확인되는 서열의 아미노산 122-131(일체를 포함)에 해당하는 부위 및/또는 아미노산 312-316(일체를 포함)에 해당하는 부위 및/또는 아미노산 181-186(일체를 포함)에 해당하는 부위에 결합할 수 있다.
본 발명의 대상은 또한 MSRV/HERV-W의 활성화에 의해 유발되는 전염증성 연쇄반응을 억제하기 위한 MSRV/HERV-W Env 단백질의 가용 분획에 특정적으로 결합할 수 있거나(특정적으로 결합하거나) MSRV/HERV-W Env-SU 단백질의 가용 분획을 위한 TLR4 수용체에 특정적으로 결합할 수 있는(특정적으로 결합하는) 항-MSRV/HERV-W Env-SU 항체 및 항-TLR4 항체에서 선택되는 항체, 특히 항체 3B2H4, 13H5A5 및 13H10F10이다. 그러나, 다른 항체를 생산하고 선택하는 것을 관련 분야의 숙련된 자의 범위 내이며, 선택 조건은 선택된 항체들이 이하의 실험예에서 기술되는 시험관 내(in vitro) 분석에서 Env-SU의 전염증성 효과를 억제할 수 있어야 한다.
본 발명에서 사용되는 "항체"라는 용어는 단클론 항체, 키메라항체(chimeric antibody), 인간화된 항체(humanized antibodies), 재조합 항체 및 상기 항체의 단편을 포함하며, MSRV/HERV-W 외피 단백질의 가용 분획에 대한 높은 친화력을 특징으로 하고 독성을 나타내지 않거나 매우 약한 독성을 나타낸다. 특히, 가변 부위 및/또는 불변 부위는 항체가 투여된 대상에 대하여 약하게 면역성인 그러한 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 항체들은 MSRV/HERV-W와 연관된 질환에 걸린 환자를 치료하는 능력을 특징으로 하며, 동시에 독성이 없거나 매우 약한 독성을 나타내는 것을 특징으로 한다. 약한 면역성 및/또는 이러한 항체들의 높은 친화력은 달성하고자 하는 치료 결과에 이바지할 수 있다.
"항체 단편"이라는 용어는 원(native) 항체의 F(ab)2, Fab, Fab' 및 sFV 단편(Blazar 외., 1997, 면역학 저널(Journal of Immunology) 159: 5821-5833 및 Bird 외., 1988, 사이언스(Science) 242: 423-426)을 의미하기 위한 것이고, "키메라 항체(chimeric antibody)"는 특히 원(native) 항체의 키메라 유도체를 의미하기 위한 것이다(예를 들어, Arakawa 외., 1996, 생화학 저널(J. Biochem) 120: 657-662 및 Chaudry 외., 1989, 네이처(Nature) 339: 394-397 참조).
단클론 항체의 생산은 관련 분야의 숙련된 자의 일반적인 지식의 일부이다. 참조적으로, Kohler G. 및 Milstein C.(1975): 미리 한정된 특이성을 가진 항체를 분비하는 융합 세포의 연속 배양(Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity), 네이처(Nature) 256: 495-497 및 Galfre G. 외.(1977) 네이처(Nature), 266: 522-550을 언급할 수 있다. 면역원은 면역화를 위한 지지체로서 열쇠구멍삿갓조개헤모시아닌(keyhole-limpet hemocyanin:KLH 펩티드)에 연결되거나 혈청 알부민(SA 펩티드)에 결합될 수 있다. 프로인트 보강제(Freund's adjuvant)를 사용하여 면역원을 동물에게 주입한다. 면역화된 동물로부터 얻은 혈청 및 하이브리도마 배양 상청액을 종래 기술, 즉 예를 들어 ELISA 분석법 또는 웨스턴 블롯법(Western Blotting)을 사용하여 그 특이성 및 선택성을 분석하였다. 가장 특이적이고 민감한 항체를 생산하는 하이브리도마를 선택한다. 단클론 항체는 또한 생산된 하이브리도마의 세포 배양 또는 생마우스에 하이브리도마의 복막내 주입 후에 복수(ascitic fluid)의 회수에 의해 시험관 내(in vitro)에서 제조될 수 있다. 생산 방법에 상관없이, 상청액 또는 복수에서 항체들은 정제된다. 사용되는 정제 방법은 본질적으로 이온 교환 겔에서 여과 및 배제 크로마토그래피 또는 친화 크로마토그래피일 수 있다(단백질 A 또는 G). 가장 효과적인 항체를 선택하기 위하여 기능 분석으로 항체를 선별한다. 항체, 항체 단편 및 유전 공학에 의해 생산되는 키메라 항체의 시험관 내 생산은 관련 분야의 숙련된 자에게 잘 알려져 있다. 일 예로서, 항체는 그 항체의 가변 단편(scFv)을 암호화하는 RNA로부터 획득된 cDNA의 클로닝(cloning)에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어 마우스 항체와 같은 비인간 항체의 "인간화된(humanized)" 형태는 비인간 면역글로블린에서 유래된 최소 서열을 포함하는 키메라 항체이다. 대부분, 인간화된 항체는 수용체의 고변이부위(hypervariable region)의 잔기가 비인간 공여체 종(공여체 항체), 즉 마우스, 토끼 또는 인간이 아닌 영장류의 고변이 부위의 잔기로 치환되는 인간 면역글로불린(수용체 항체)이며, 원하는 특이성, 친화성 및 수용력을 가진다. 어떤 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 부위의 잔기(FR)는 대응하는 비인간 잔기로 치환된다. 또한, 인간화된 항체는 수용체 항체 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체의 효율을 향상시키기 위하여 만들어질 수 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 적어도 하나, 바람직하게는 두 개의 가변 도메인을 포함하며, 그 도메인에서 모든 또는 실질적으로 모든 고변이 루프는 비인간 면역글로블린에 해당하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 부위는 인간 면역글로블린의 FR 부위에 해당한다. 인간화된 항체는 또한 임의적으로 인간 면역글로불린과 같은 면역글로불린의 불변부위(Fc)의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 일반적으로, 가변 부위는 비인간 포유류 항체에서 파생되고 불변 부위는 인간 면역글로불린에서 파생된다. 바람직하게는, 선택된 가변 부위는 약한 면역원성을 나타내고 역시 약한 면역원성을 나타내는 불변 부위와 결합한다.
이러한 항체들은 바람직하게는 이하의 "중화(neutralizing)" 항체이다:
- 항-MSRV/HERV-W Env-SU 단클론 항체: 항체 3B2H4, 13H5A5 및 3H10F10(BioMerieux),
- 항-TLR4 항체: 항-인체 TLR4 항체 HTA125(eBioscience에서 판매됨).
항-MSRV/HERV-W Env-SU 항체는 이하의 프로토콜에 따라 제조된다.
- 항체 3B2H4의 생산:
생마우스를 이하의 프로토콜에 따라 면역화시킨다: D0 일에, 정제된 재조합 MSRV/Env 단백질로 구성된 면역원 20㎍을 이미 기술된 것처럼[11] 프로인트 완전면역보강제(complete Freund's adjuvant) 존재시에 복막 내에 주입한다. D14 및 D28에, 프로인트 불완전면역보강제(incomplete Freund's adjuvant) 존재하에 동일한 양의 면역원을 복막 내에 더 주입한다. 융합 전 4일, 3일 및 2일 전에, 생리 식염수로 희석한 면역원 100㎍을 복막 내에 주입한다.
간접(indirect) ELISA 기술로 400 상청액을 선별하였다. 플레이트를 0.05M 중탄산염 완충용액(pH 9.6)에서 1㎍/㎖로 항원 100㎕를 코팅하였다. 코팅된 플레이트를 18-22℃에서 밤새도록 배양하였다. 그 플레이트를 200㎕ PBS-1% 밀크(milk)로 포화시키고 37℃/-2℃에서 1시간 동안 배양하였다. PBS 완충용액-0.05% Tween 20으로 희석된 상청액 또는 복수(ascites fluid) 100㎕를 첨가하고 플레이트를 37℃/-2℃에서 1시간 동안 배양하였다. PBS 완충용액-1% BSA로 1/2000으로 희석되고, 알칼리 포스파타아제(AP)(Jackson Immunoresearch ref:115-055-062)에 결합된 염소 항-마우스 Ig(H+L) 다클론 항체 100㎕를 첨가하고 플레이트를 37℃/-2℃에서 1시간 동안 배양하였다. DEA-HCL(Biomerieux ref 60002989)(pH=9.8)에서 2㎎/㎖ 농도인 PNPP(Biomerieux ref 60002990) 100㎕를 첨가하였다. 그런 다음 그 플레이트를 7℃/-2℃에서 30분 동안 배양하였다. 반응은 1N NaOH 100㎕의 첨가에 의해 멈춰진다. 각 단계 사이에 300㎕의 PBS-0.05% Tween 20으로 세 번 세척을 하였다. PNPP가 첨가되기 전에 증류수로 보충 세척을 하였다.
간접 ELISA로 22개의 상청액이 배경 노이즈의 4배에 상응하는 OD>0.2인 양성으로 밝혀졌다. 특이성 분석 후에, 하나의 항체가 제조된다.
- 항체 13H5A5 및 3H10F10의 생산:
생마우스를 이하의 프로토콜에 따라 면역화시킨다: D0 일에, 정제된 재조합 MSRV/Env 단백질로 구성된 면역원 40㎍을 이미 기술된 것처럼[11] 프로인트 완전면역보강제(complete Freund's adjuvant) 존재시에 복막 내에 주입한다. D14, D28 및 D79일에, 프로인트 불완전면역보강제(incomplete Freund's adjuvant) 존재하에 동일한 양의 면역원을 복막 내에 더 주입한다. 융합 전 4일, 3일 및 2일 전에, 생리 식염수로 희석한 면역원 50㎍을 복막 내에 주입한다.
상기한 것처럼, 간접 ELISA 기술로 1350개의 상청액을 선별하였다.
간접 ELISA로 39개의 상청액이 배경 노이즈의 4배에 상응하는 OD>0.4인 양성으로 밝혀졌다. 특이성 분석 후에, 두 항체가 제조된다.
전술한 항-Env-SU 및 항-TLR4 항체는 상기한 것처럼 MSRV/HERV-W와 연관된 질환의 치료를 위한 약제 또는 치료 조성물의 제조를 위해 사용된다. 본 발명의 치료 목적을 위한 조성물에서, 항체 또는 활성 성분은 약제학적으로 수용할 수 있는 운반체와 결합하고 임의적으로는 약제학적으로 수용할 수 있는 벡터와도 결합한다. 약제학적으로 수용할 수 있는 운반체는 선택된 투여 방법 및 약학 분야에서의 일반적인 관행에 따라 결정되고 선택된다. 단백질은 경구적 또는 정맥내, 피하 또는 근육내와 같은 비경구적으로 투여될 때 소화되기 때문에, 투여는 일반적으로 흡수에 적합하게 이루어져야 한다. 약제학적으로 수용할 수 있는 운반체는 예를 들어 레밍턴의 약학(Remington's Pharmaceutical Science) 16판(Mack 출판사)에 기술되어 있다. 예를 들어, 주사로 투여하기에 적절한 비경구적 조성물은 활성 성분 1.5 중량%를 0.9% 염화나트륨 용액에 용해시킴으로써 제조된다. 항체를 그 항체가 BBB를 통과하게 하는 선택된 벡터와 결합할 필요가 있다. 따라서, 이동성이 없는 항체는 양이온화된 알부민, 트랜스페린(transferrin), 인슐린 또는 인슐린 유사 성장 인자와 같은 이동성이 있는 벡터에 결합될 수 있고, 또는 상기 단백질의 단편에 결합될 수 있다. 트랜스페린 또는 인슐린 유사 성장 인자와 같은 이동성이 있는 벡터에 결합된 이동성이 없는 단클론 항체(IgG3)는 BBB를 통과할 수 있을 뿐만 아니라 이러한 항체의 기능적인 특징이 보존된다는 것이 이미 밝혀졌다. 다른 연구로부터 신경-약제 성분들은 리포솜을 통해서 뇌로 전달될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이러한 방법은 리포솜 캡슐에 싸인 어떤 분자가 직접 뇌로 전달될 수 있는 메카니즘을 제공하기 때문에 중요하다.
항체는 약제로서 단독으로 또는 치료를 증가시키고 향상시키기 위하여 다른 약제 성분과 공동으로 투여될 수 있다. 투여량은 물론 특정 성분의 약동학적 특성과 같은 공지된 요인 및 투여 경로 뿐만 아니라 환자의 나이, 체중, 치료 빈도 및 원하고 기대하는 효과와 같은 요인에 따라 좌우될 것이다. 일반적으로, 활성 성분의 일일 투여량은 사람 체중 1킬로그램당 0.01 내지 100 밀리그램이다. 통상, 한 번 이상의 일일 투여로서 1-40 밀리그램/킬로그램/일이 원하는 효과를 달성하기 위한 유효한 양이다.
본 발명은 또한 IL-6, IL-12-p40 및 TNF-α 중에서 선택되는 사이토카인을 분석하여 다발성 경화증 또는 정신분열증을 앓고 있는 환자의 혈액 단핵세포의 반응성 상태를 측정하기 위해 MSRV/HERV-W Env-SU를 사용하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 Env-pV14 외피의 구조, Env-SU 외피의 신호 펩티드 및 가용 분획의 구조 및 Env-SU 외피의 신호 펩티드 및 가용 분획의 아미노산 서열을 나타내는 도면;
도 2는 Env-SU가 인간 PBMCs(단핵세포) 배지에서 전염증성 사이토카인의 생산을 유도하는 것을 나타내는 도면;
도 3은 Env-SU의 사이토카인 자극 활성이 내독소에 의한 오염 때문이 아님을 나타내는 도면;
도 4는 항-Env-SU 단클론 항체(13H5A5)가 Env-SU의 사이토카인-자극 활성을 차단함을 나타내는 도면;
도 5는 Env-SU가 정제된 인간 단핵구를 직접적으로 활성화 시키는 것을 나타내는 도면;
도 6은 Env-SU가 단핵구-유도 수지상 세포(MDDCs)를 활성화 시키는 것을 나 타내는 도면;
도 7은 CD14 및 TLR4가 Env-SU의 전염증성 특성에 관련이 있음을 나타내는 도면;
도 8은 TLR4 경로의 활성화에 이어 발생하는 면역 증폭 연쇄 반응 및 본 연쇄 반응에서 치료 목표의 예를 나타내는 도면;
도 9는 MSRV/HERV-W ENV 단백질의 전염증성 효과로부터 두 개의 질병을 발생시키기 위한 네 개의 주요 단계를 나타내는 도면;
도 10은 다발성 경화증(MS)을 앓고 있는 환자 및 정상 공여자(ND)의 PMBCs에서 ENV-SU에 의해 유발된 사이토카인:TNF-α, IL-β 및 IL-10의 생산량을 나타내는 도면;
도 11은 다발성 경화증(MS)을 앓고 있는 환자 및 정상 공여자(ND)의 PMBCs에서 ENV-SU에 의해 유발된 사이토카인: IL-12p40 및 IL-6의 생산량을 나타내는 도면;
도 12는 사이토카인 생산량과 환자의 치료 변수와의 상관 관계를 나타내는 도면;
도 13은 정신분열증(SCZ)을 앓고 있는 환자 및 정상 공여자(ND)로부터 수득된 PBMCs에서 사이토카인: IL-10의 자발적인 생산량 (a) 또는 ENV-SU-유도 생산량 (b)을 나타내는 도면;
도 14는 정신 분열증(SCZ)을 앓고 있는 환자 및 정상 공여자(ND)로부터 수득된 PMBCs에서 사이토카인: IL-12p40의 자발적인 생산량 (a) 또는 ENV-SU에 의해 유 발된 생산량 (b)과 상대적인 증가의 계산량 (c)을 나타내는 도면;
도 15는 정상 공여자로부터 수득한 인간 PBMC 배지에서 ENV-SU 단백질에 의해 유발된 단핵구-대식세포의 전염증성 활성을 억제하는 항-MSRV/HERV-W ENV 단클론 항체의 확인 및 선택을 의한 실험 예를 도시한 도면;
도 16은 PBMCs에서 TNF-α 생산의 동역학을 나타내는 도면;
도 17은 인간화된 SCID에서 ENV-SU의 전염증성 효과를 나타내는 도면;
도 18은 MSRV ENV 단백질로 EAE를 유도한 실험 예를 도시한 도면;
도 19은 MSRV ENV 단백질로 EAE의 유도의 재생산을 도시한 도면;
도 20은 "EAE/MOG/ENV-SU" 마우스 모델 및 ENV가 없는 면역화된 대조구 모델에서 MOG 자가 항원의 증가량에 대한 자가 면역 반응의 24h 평가를 나타내는 도면;
도 21는 "EAE/MOG/ENV-SU"의 마우스 모델 및 ENV가 없이 면역화된 대조구에서 인터페론 감마의 분비에 의해 밝혀진 항-MOG 자가 면역 T 림프구 반응의 동역학을 나타내는 도면;
도 22는 본 발명에서 발생하고 확인된 MS 모델에서 증명된, ENV-SU의 전염증성 활성에 대한 억제 효과를 위해 선택된 항-MSRV ENV 항체의 치료 활성을 나타내는 도면;
도 23은 MSRV ENV 단백질(하부 라인)과 HERV-W 7q 카피(copy)에 의해 암호화된 ENV 단백질(상부 라인) 사이를 비교한 아미노산 서열을 나타내는 도면;
도 24는 웨스턴 블롯팅(Western blotting) 분석의 결과를 나타내는 도면;
도 25는 ENV-SU 단백질의 항원 특성의 분석 결과를 나타내는 도면;
도 1은 Env-pV14 외피의 구조, Env-SU 외피의 신호 펩티드 및 가용 분획의 구조 및 Env-SU 외피의 신호 펩티드 및 가용 분획의 아미노산 서열을 나타낸다. 도 1(a)는 Env-Pv14(MSRV의 완전한 외피 단백질)의 구조 및 Env-SU 외피의 신호 펩티드 및 가용 분획의 구조에 해당한다. 외피(Env-SU)의 가용 분획은 완전한 Env pV14 단백질의 K316 위치에서 절개된, 가용성 세포외 단위를 나타내는 287 아미노산 분획에 해당한다. 도 1(b)는 Env-SU의 신호 펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다. 도 1(b)에서, 신호 펩티드의 아미노산 서열은 박스 안에 있으며 외피(Env-SU)의 가용 분획은 굵은 글씨체로 되어 있다. Env-SU 서열은 서열 ID NO: 1의 서열 식별자에서 참조할 수 있다. Env-pV14 외피의 완전한 서열은 수납 번호 AF331500으로 GenBank에서 이용할 수 있다. Env-pV14 단백질의 여러 부분은 도 1(a)를 참조하여 이하처럼 한정된다:
- 신호 펩티드는 아미노산 1에서 시작하여 아미노산 29에서 종결한다(일체를 포함);
- Env-SU은 아미노산 30에서 시작하여 아미노산 316에서 종결한다(일체를 포함); 및
- 막을 관통하는 부위(transmembrane domain)는 아미노산 317에서 시작하여 아미노산 542에서 종결한다(일체를 포함).
계산된 Env-SU의 평균 분자량은 32061.59이다. 추정된 pI는 9.61과 같다. 그 아미노산 조성은 다음과 같다.
비극성 아미노산:
수 백분율
A 9 3.14
V 16 5.57
L 25 8.71
I 13 4.53
P 21 7.32
M 7 2.44
F 11 3.83
W 6 2.09
극성 아미노산:
수 백분율
G 16 5.57
S 31 10.80
T 34 11.85
C 12 4.18
Y 10 3.48
N 18 6.27
Q 9 3.14
산성 아미노산:
수 백분율
D 4 1.39
E 10 3.48
염기성 아미노산:
수 백분율
K 9 3.14
R 12 4.18
H 14 4.88
도 2 : Env-SU는 인간 PBMCs(단핵세포) 배지에서 전염증성 사이토카인의 생산을 유도한다. 도 2a는 Env-SU의 양을 증가시키면서 24시간 동안 자극시킨 정상 공여자의 PBMCs의 배지 상청액의 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 분비량을 ELISA 분석법(효소면역측정법)으로 분석한 결과를 나타낸다. 결과는 세 개의 독립적인 실험에 일치한다. x축은 Env-SU의 투여량(㎍/㎖)을 나타낸다. y축은 사이토카인의 양(ng/㎖)을 나타낸다. 그래프에서, ■ 표시는 IL-6의 분비량에 해당하고, ● 표시는 IL-1β의 분비량에 해당하며 ▲ 표시는 TNF-α의 분비량에 해당한다. 도 1b는 PBMCs를 자가(autologous) 대조구, Env-SU, LPS 또는 SEB 1 ㎍/㎖으로 자극하고 ELISA에 의한 사이토카인 분비량을 분석하기 전 24, 48 및 72 시간 동안 배양한 결과를 나타낸다. x축은 시간(h)에 해당하고 y축은 ng/㎖로 표시된 사이토카인 IFNγ 및 IL-6(도 1b(a) 및 도 1b(c))와 pg/㎖로 표시된 사이토카인 TNFα 및 IL-1β(도 1b(b) 및 1b(d))의 생산량에 해당한다. 도면에서, -●-는 Env-SU에 해당하고, --x--는 LPS에 해당하며, -▲-는 자가(autologous) 대조구에 해당하고 --■--는 SEB에 해당한다.
도 3 : Env-SU의 사이토카인 자극 활성은 내독소에 의한 오염 때문이 아니다. PBMCs를 자가(autologous) 대조구(MOCK), Env-SU, LPS 또는 SEB로 24 시간 동안 자극하였다. 지시가 있을 때, 세포들을 자극하기 전에 폴리믹신(polymyxin) B(PdyB) 10 ㎍/㎖로 처리하였다(도면에서 검게 표현됨). 동시에, 세포들을 또한 30분간 끊인(100℃) 단백질 및 독소로 배양하였다(도면에서 회색으로 표현됨). 배지 상청액을 수거하여 ELISA로 TNF-α의 방출량을 시험하였다. 도면에 도시된 결과는 세 번의 실험의 평균에 해당한다. y축은 방출된 TNF-α의 양(pg/㎖)에 해당한다.
도 4 : 항-Env-SU 단클론 항체(13H5A5)는 Env-SU의 사이토카인-자극 활성을 차단한다. PBMCs를 자가(autologous) 대조구 CK2, Env-SU 및 LPS 1 ㎍/㎖로 자극하였고 항-Env-SU 단클론 항체 및 항-Gag 단클론 항체(3H1H6) 30 ㎍/㎖로 미리 배양하거나 그렇지 않았다. 배지 상청액을 수거하여 ELISA로 TNF-α의 방출량을 시험하였다. 도면에 도시된 결과는 세 번의 실험의 평균에 해당한다. y축은 방출된 TNF-α의 양(pg/㎖)에 해당한다.
도 5 : Env-SU는 정제된 인간 단핵구를 직접적으로 활성화 시킨다. 인간 단핵구를 인간 PBMCs로부터 정제하였고(95% 이상의 정제도) 자가(autologous) 대조구(MOCK), Env-SU 또는 LPS 1 ㎍/㎖로 24시간 동안 자극하였다. 도 5a는 흐름세포측정법으로 분석된 활성화 표지 CD80(왼쪽 도면) 및 CD86(오른쪽 도면)의 발현을 나타낸다. x축은 계수된 세포의 수를 나타내고 y축은 세포당 형광강도를 나타낸다("총계(counts)"). 결과는 각 형광 강도에서 계수된 세포의 수를 나타낸다. 그래프로 한정된 면적은 시험된 각 조건에서 전체 세포 수를 나타낸다. 형광 강도의 함수로서 세포 분포는 그래프로 표현된다. 도면에서 흰 부분은 대조구(Mock)로 획득한 결과이고, 가는 선으로 표시된 음영 처리된 부분은 Env-SU로 획득한 결과이며 매우 두꺼운 선으로 표시된 음영 처리된 부분은 LPS로 획득한 부분이다. 도 5b는 ELISA로 분석된 TNF-α, IL-1β, IL-6 및 IL-12p40의 분비량을 나타낸다. 흰색 부분은 자가(autologous) 대조구로 자극된 후에 획득된 결과이다. Env-SU 및 LPS로 자극된 후 획득된 결과는 각각 검은색과 회색으로 표현되었다. y축은 분비된 사이토카인의 양(ng/㎖)에 해당한다. 결과는 세 번의 실험의 평균을 나타낸다.
도 6 : Env-SU는 단핵구-유도 수지상 세포(MDDCs)를 활성화 시키는 것을 나타낸다. 정제된 단핵구에서 생성된 MDDCs를 자가(autologous) 대구(MOCK), Env-SU 또는 LPS 1㎍/㎖로 24시간 동안 자극하였다. 도 6a는 흐름세포측정법으로 분석된 활성화 표지 CD80, CD86, CD40 및 HLA-DR의 발현을 나타낸다. x축은 계수된 세포수를 나타내고 y축은 세포당 형광강도를 나타낸다("총계"). 상단 좌측 도면은 CD80의 분석 결과를 나타내고 상단 우측의 도면은 CD40의 결과를 나타내며, 하단 좌측 도면은 CD40의 분석 결과를 나타내고 하단 우측은 HLA-DR의 분석 결과를 나타낸다. 이러한 결과는 각 형광 강도에서 계수된 세포의 수를 나타낸다. 그래프로 한정된 면적은 시험된 각 조건에서 전체 세포수를 나타낸다. 형광 강도의 함수로서 세포 분포는 그래프로 표현된다. 좌측의 흰 부분은 대조구(Mock)로 획득한 결과이고, 두 꺼운 선으로 표시된 우측의 흰 부분은 Env-SU로 획득한 결과이며 음영 처리된 부분은 LPS로 획득한 결과이다. 도 6b는 ELISA로 분석된 배양 상청액에서의 TNF-α, IL-6, IL-12p40 및 IL-12p70의 분비량을 나타낸다. y축은 분비된 사이토카인의 양(ng/㎖)에 해당한다. 도 6b에서 표현된 히스토그램에서, Mock는 자가(autologous) 대조구로 자극된 후 획득된 결과에 해당하고, Env-SU(검정)은 Env-SU로 자극된 후 획득된 결과에 해당하며, LPS(회색)는 LPS로 자극된 후 획득된 결과에 해당한다. 도 6c는 미리 Env-SU -■-, LPS --▲--, 대조구 CK2 -●-로 자극된 수지상 세포에 의한 T 세포의 동종 이형 증식을 나타낸다. x 축은 수지상 세포의 수(각각 0, 1000, 5000 및 10,000)를 나타낸다. y축은 수지상 세포에 의해 방출되는 3H-티미딘의 분당 계수를 나타낸다.
도 7 : CD14 및 TLR4는 Env-SU의 전염증성 특성에 관련이 있다. PBMCs를 20 ㎍/㎖ 및 5 ㎍/㎖ 농도의 항-CD14(rhCD14, ref.: AB383, R&D Systems-UK)(도 7a) 중화 항체 및 항-TLR4(도 7b) 중화 항체가 존재하거나 그렇지 않은 상태에서 1시간 동안 미리 배양하였다. 그런 다음, 세포를 농도 1 ㎍/㎖인 CK2 대조구, Env-SU(ENV1), LPS 및 SEB로 24시간 동안 자극하였다. ELISA로 배지 상청액에서 TNF-α의 방출량을 분석하였다. 결과는 도 7a 및 도 7b의 히스토그램으로 표시된다. y축은 방출된 TNF-α의 양(ng/㎖)에 해당한다. 검정 히스토그램은 항체의 첨가없이 얻어진 결과에 해당하고, 흰색 히스토그램은 항-CD14 및 항-TLR4 항체가 20㎍/㎖로 존재시에 얻어진 결과에 해당하며 회색 크로마토그램은 항-CD14 및 항-TLR4 항체가 5㎍/㎖로 존재시에 얻어진 결과에 해당한다. 결과는 세 번의 실험의 평균에 해당한다.
도 8 : TLR4 경로의 활성화에 이어 발생하는 면역 증폭 연쇄 반응. 본 연쇄 반응에서 치료 목표의 예.
도 8은 MSRV/HERV-W 외피 단백질의 병리학적 발현에 의한 활성화 연쇄 반응을 개략적으로 나타낸 것이다. MSRV/HERV-W 외피 단백질은 가능하게는 CD14 보조 수용체와 연관하여 처음에는 TLR4 수용체를 자극한다. 이런 상호작용 전에, 작용제로는 단지 MSRV/ENV 단백질만이 존재한다. 이러한 활성화 후에, 선천성 면역(innate immunity)의 세포들은 활성화되고 수 십개의 분자 작동체(effectors)(사이토카인, 효소, 지질, 자유 라디칼 또는 산화환원 화합물 등) 및 활성화된 세포들은 동시에 발생한다. 다발성 경화증에서, 두 번째 성분은 뇌의 백색질의 파괴 및 T 림프구에 미엘린(myelin) 항원의 제시, 즉 적응성 면역(adaptive immunity)의 자가반응 T 세포와 연관된 자가 면역 성분의 제시 후에 활성화된다. 이 단계에서, 수백 심지어 수천 개의 서로 다른 분자 및 세포들은 면역병리학적 효과를 중재하는데 관여한다. 이는 일반적으로 그 가능성이 초기 자극제(MSRV/HERV-W ENV)에 어떠한 유사성도 가지지 않는 면역병리학적 증폭 연쇄반응을 제공한다.
현재까지 이용할 수 있거나 또는 제안된 치료법은 증폭 연쇄 반응의 단계에 존재하는 수 많은 다른 작용제 중에서 전염증성 또는 병원성 작용제의 "하류 부분"을 표적으로 한다(예를 들어, 항-TNF-알파 항체, 인터페론 베타 및 페룰린산과 같은 자유 라디칼 분해 분자). 본 발명의 내용에서, 그것들은 그 약동학적 효과에 민 감하지 않는 수많은 작동체(분자 및 세포)의 효과를 억제할 수 없다. 이는 MS와 같은 질병의 현재의 많은 치료책의 부분적이고 상대적인 효과를 설명한다.
또한, 이러한 치료책은 (예를 들어 헤르페스바이러스(herpesviridae)와 같은 반복적인 환경 보조인자의 효과 하에서) 병원성 MSRV/HERV-W 카피(copy)를 발현시키는 다른 세포들이 같은 손상 부위 또는 다른 대뇌 부위에서 동시에 또는 서로 다른 시간에 전염증성 외피를 생산하는 것을 방지하지 못한다(MS를 대뇌 부위 및 질병의 발생 시간의 면에서 정의하는 다초점 손상 및 재발/완화의 원리).
따라서, 단백질-표적에 의해 유도할 수 있는 모든 하류 작동체가 생산되지 않는 연쇄 반응의 단계에서 초기 효과를 억제하는 치료는 훨씬 더 적절하고 이러한 MSRV/HERV-W 외피 단백질의 전염증성 효과와 연관된 이러한 질병에서 일반적으로 계획되고 사용되는 접근법보다도 훨씬 더 높은 유효성을 가진다. 사실상, 설령 연쇄 반응이 활성화되더라도, 이러한 치료 전략에 의하여 상류 부분은 "고갈될" 것이고, 반면에 상부 자극은 다른 "하류" 치료 접근법에 계속될 것이다. 마지막으로, 질병의 완화 기간 동안 재발을 방지하고자 하는 접근법에서, 이러한 항체들은 "MSRV/HERV-W ENV" 단백질이 상기한 연쇄 반응을 시작하기 전에 그 단백질을 중화시킬 수 있는데 반해, 다른 "하류" 분자 또는 세포를 목표로 하는 치료법은 단지 이러한 염증 연쇄 반응이 시작된 후에 간섭할 수 있다.
도 9 : MSRV/HERV-W ENV 단백질의 전염증성 효과로부터 두 개의 질병을 발생시키기 위한 네 개의 주요 단계:
(i) 두 개의 공통 "상부" 단계: I-TLR4 수용체의 활성화 및 Ⅱ-국부적인 염 증, 및
(ⅱ) 두 개의 서로 다른 "하부" 단계: Ⅲ-신경 탈수초화(neuronal demyelination) 또는 흥분독성(excitotoxicity) 및 Ⅳ-다발성 경화증 또는 정신 분열증.
외피 단백질(Env)은 헤르페스바이러스(herpesviridae) 과(family)의 감염성 보조인자[46-49]의 친화성 및 이러한 인자에 의해 활성화될 수 있고 외피 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 프로바이러스(proviral) MSRV/HERV-W 카피(copy)를 품는 표적 조직에서 세포의 존재에 의해 결정되는 조직 부위에서 이러한 감염성 보조 인자로 전사 활성을 한 후와 같은 병리학적 활성화의 내용에서 MSRV/HERV-W 과(family)의 레트로바이러스 카피(copy)에 의해 생산된다.
이렇게 제조된 이러한 ENV 단백질은 TLR4 수용체에 결합하고 경우에 따라 MSRV/HERV-W ENV 및/또는 MSRV 비리온을 생산하는 세포의 부근에서 대뇌 조직에 존재하는 대식세포 또는 마이크로글리오사이트 형태의 세포의 CD14와 같은 TLR4 보조 수용체에 결합한다. 만약 그 세포가 대식세포 또는 마이크로글리오사이트라면, 이러한 동일한 세포의 TLR4 수용체에 자가분비(autocrine) 효과가 있을 것이다.
TLR4 수용체와의 상호 작용 단계 후에, 면역병리학적 증폭 연쇄 반응은 수 십개의 전염증성 및 조직 파괴-매개 분자의 생산과 함께 MSRV/HERV-W 재활성화의 자리 부근에 관계된 조직에서 국지적인 염증을 발생시킨다.
이 단계 후에, 상황은 MSRV/HERV-W 재활성화 보조 인자 및 이러한 "반응자(responder)" 프로바이러스를 포함하는 세포의 국재성(localization)이 백색질 또는 회색질에서 발현하는 쪽으로 수렴하는지에 따라 분기한다.
결과적으로 정신 분열증과 같은 질환이 되는 병리학적 경로를 결정하는 첫 번째 경우에, 전두 피질의 신경 구조 부근에서 MSRV/HERV-W 성분의 유도된 재활성화 또는 유도된 과발현은 회색질 조직에서 주요한 손상 전(pro-lesional) 활성 및 특정 면역의 회복을 허락하지 않는 국부 염증을 유발한다. 이러한 국부 염증은 이러한 농도에서 T 림프구의 침투를 허용하지 않을 것이다. 다른 한편, "지적(intellectual)" 및 인지 활성에 책임이 있는 신경 세포 부근에서 생산된 전염증성 매개체는 이러한 전염증성 생산이 발생하는 동안[17, 20, 22-26, 29, 50, 51]의 시간 동안 감염된 대뇌 부위에서 연관된 신경 네트워크의 기능 이상을 결정하는 국부적인 신경 흥분독성을 유발한다. 영향을 받은 면적에 따라, 흥분 독성 신경 활성화의 원인이 되는 "정신(psychic)" 조건은 정신 분열증의 임상 병리학적 발작을 특징으로 하는 환각 증세 및 정신 착란 증세에 의해 반영된다. 결국, 이러한 신경 흥분 독성은 세포사(신경 독성)에 이르게 되고, 이는 정신 분열증을 앓고 있는 환자의 뇌에서 MRI로 측정되는 비대함으로 구체화된다[52].
다발성 경화증이 되는 병리학적 경로를 결정하는 두 번째 경우에, 백색질의 미엘린(myelin)은 이전 염증에 의해 모인 림프구에 자가 항원(autoantigens)을 제시하는 1차 탈수소화를 발생시키는 자유 라디칼 및 전염증성 작용제에 상당히 민감하다. 이러한 조건 하에서, 림프구 반응성 편향은 이미 대식세포/마이크로글리오사이트 형태의 세포(Th1 bias)에 이미 분비된 사이토카인에 의해 조절되고, 이러한 조건하에서 존재하는 "자기(self)" 항원의 자가 면역 반응을 발생시키기에 충분할 수 있다. 그러나, 또한 전체 MSRV 외피 단백질 또는 MSRV 비리온은 T 림프구에 다른 활성, 즉 "TCR" 수용체와의 상호 작용을 특징으로 하는 초항원 활성을 발휘할 수 있다. 1차 염증에 의해 모인 T 림프구가 조직을 통과하는 이러한 "하부"에서 초항원 특성은 궁극적으로 1차 염증에 의해 이미 손상된 조직에 노출된 미엘린 항원에 반응하는 특이적인 자가 면역 T 림프구를 더 촉진하는 T 림프구의 다클론 활성을 더한다. 본 발명의 내용에서, 임상병리학적 반응의 두 번째 측면은 자가 면역 및 활성화된 T 림프구에 의해 매개된 염증의 효과로 발생한다.
도 10 : 다발성 경화증(MS)을 앓고 있는 환자 및 정상 공여자(ND)의 PMBCs에서 ENV-SU에 의해 유발된 사이토카인:TNF-α, IL-β 및 IL-10의 생산.
도 10은 우선 다발성 경화증(MS)을 앓고 있는 환자 및 정상 공여자(ND)에서 생체 외에서 수득된 혈액 단핵세포(PMBCs)에서 MSRV ENV-SU 단백질에 의해 유발된 사이토카인 생산량을 나타낸다. ND 또는 MD 다음의 "n="라는 표시는 사이토카인에 대해 각 개체수에서 시험된 대상의 수를 의미한다.
x축은 자극을 받은 PBMC 배지 상청액에서 사이토카인의 양(ng/㎖)을 나타낸다. 각 그래프는 시험된 각 개체에 대해서 결과를 비교하며, 각 개체(ND 및 MS)에서 (원형) 포인트로 표시되었다. 세 개의 그래프는 좌측에서 우측으로 종양괴사인자(TNF)-알파, 인터루킨(IL)-1베타 및 인터루킨(IL)-10의 반응성을 나타낸다. 계산된 것처럼, ND 및 MS 개체 사이에 비교된 결과는 이러한 세 개의 사이토카인에서 크게 다르지 않다(상당하지 않음, NS). 통계 분석은 Student's test로 행해졌다.
도 11 : 다발성 경화증(MS)을 앓고 있는 환자 및 정상 공여자(ND)에서 수득 된 PMBCs에서 ENV-SU에 의해 유발된 사이토카인: IL-12p40 및 IL-6의 생산량.
도 11은 우선 다발성 경화증(MS)을 앓고 있는 환자 및 다음으로 정상적인 공여자(ND)로부터 생체 외에서 수득한 혈액 단핵세포(PMBCs)에서 MSRV ENV-SU 단백질에 의해 유발된 사이토카인 생산을 나타낸다. ND 또는 MD 다음의 "n="라는 표시는 사이토카인에 대한 각 개체수에서 시험된 대상의 수를 의미한다.
x축은 자극을 받은 PBMC 배지 상청액에서 사이토카인의 양(ng/㎖)을 나타낸다. 각 그래프는 시험된 각 개체에 대해서 결과를 비교하며, 각 개체(ND 및 MS)에서 (원형) 포인트로 표시되었다. 두 그래프는 좌측에서 우측으로 인터루킨(IL)-12p40 및 인터루킨(IL)-6의 반응성을 나타낸다. 계산된 것처럼, ND 및 MS 개체 사이에 비교된 결과는 이러한 두 사이토카인에 대하여 MS 개체에서 훨씬 더 높다(IL-12p40에 대하여 p=0.003 및 IL-6에 대하여 p=0.006). 통계 분석은 Student's test로 행해졌다.
도 12 : 사이토카인 생산량과 환자의 치료 변수와의 상관 관계.
도 12는 연구된 MS 개체의 치료 변수(x 축)와 MSRV-SU ENV 단백질에 의한 PBMCs의 자극에 반응하여 생산된 어떤 사이토카인의 양(y 축) 사이의 상관 관계의 분석 결과를 그래프로 나타낸다. 각 그래프에서, "r"로 표시된 값은 상관 관계 라인에 대한 포인트 분포의 통계적인 계산을 나타낸다. "p" 값은 이러한 상관 관계가 우연히 획득될 통계적인 가능성을 나타낸다; 따라서, 0.05보다 큰 p 값은 "의미가 없는" 것이고, 0.05보다 작은 값은 분석된 인자들 사이에 존재하는 상관관계를 나타낸다.
상단의 두 그래프는 MS 환자의 클리닉 스코어, 1에서 10의 심각한 정도로 측정된 EDSS[53]와 IL-6(좌측) 또는 IL12p40(우측) 사이의 상당한 상관 관계가 발견된 변수를 보여준다.
하단의 두 그래프는 상당한 상관 관계가 발견되지 않은 변수의 두 가지 예를 나타낸다: 질병의 지속 기간과 IL-6(좌측) 또는 감마 인터페론과 치료 스코어 EDSS(우측).
도 13: 정신분열증(SCZ)을 앓고 있는 환자 및 정상 공여자(ND)로부터 수득된 PBMCs에서 사이토카인: IL-10의 자발적인 생산량 (a) 또는 ENV-SU-유도 생산량 (b).
도 13은 우선 정신 분열증(SCZ)을 앓고 있는 환자 및 다음으로 정상 공여자(ND)로부터 생체 외에서 수득된 혈액 단핵세포(PMBCs)에서 MSRV ENV-SU 단백질에 의해 유발된 사이토카인 생산량을 나타낸다.
x 축은 자극을 받은 PBMC 배지 상청액에서 사이토카인의 양(ng/㎖)을 나타낸다. 각 그래프는 시험된 각 개체에 대한 결과를 비교하며, 각 개체(ND 및 MS)에서 포인트로 표시되었다. 두 그래프는 좌측에서 우측으로 배지에서 인터루킨(IL)-10의 자발적인 생산량 및 ENV-SU로 자극된 후 유발된 인터루킨(IL)-10의 생산량을 나타낸다.
도 14 : 정신 분열증(SCZ)을 앓고 있는 환자 및 정상 공여자(ND)로부터 수득된 PMBCs에서 사이토카인: IL-12p40의 자발적인 생산량 (a) 또는 ENV-SU에 의해 유발된 생산량 (b)과 상대적인 증가의 계산량 (c).
도 14는 우선 정신 분열증(SCZ)을 앓고 있는 환자 및 다음으로 정상 공여자(ND)로부터 생체 외에서 수득된 혈액 단핵세포(PMBCs)에서 MSRV ENV-SU 단백질에 의해 유발된 사이토카인 생산량을 나타낸다.
x 축은 자극을 받은 PBMC 배지 상청액에서 사이토카인의 양(ng/㎖)을 나타낸다. 각 그래프는 시험된 각 개체(ND 및 MS)에 대한 결과를 비교하여 포인트로 표시하였다. 세 개의 그래프는 좌측에서 우측으로 a) 배지에서 인터루킨(IL)-12p40의 자발적인 생산량, b) ENV-SU로 자극된 후 유발된 인터루킨(IL)-10의 생산량 및 c) 공식: (ENV-SU 자극 후 생산량-자발적인 생산량)/자발적인 생산량에 따라 계산된 IL12p40의 생산에서 상대적인 증가를 나타낸다.
도 15 : 정상 공여자로부터 수득한 인간 PBMC 배지에서 ENV-SU 단백질에 의해 유발된 단핵구-대식세포의 전염증성 활성을 억제하는 항-MSRV/HERV-W ENV 단클론 항체의 확인 및 선택. a) 두 항-ENV 항체 및 대조 항체를 사용한 분석, b) 분석의 특이성을 위한 조건의 확인, c) 독립적인 실험의 예, d) 독립적인 실험의 다른 예:
도 15a는 정상 공여자로부터 수득된 PBMCs의 배지에서, (x 축의) "MOCK" 대조 단백질(1㎍/㎖), ENV-SU(1㎍/㎖) 및 LPS(1㎍/㎖)에 의해 유발된 TNF-알파(ng/㎖)의 분비량(y 축)을 나타낸다. 좌측에서 우측으로 각 자극 조건에서 흰색 막대는 항체가 없을 때의 결과를 나타내고, 검정 막대는 항-MSRV ENV 항체 3B2H4(30㎍/㎖) 존재시의 결과를 나타내며, 빗금친 막대는 항-MSRV ENV 항체 13H5A5(30㎍/㎖) 존재시의 결과를 나타내고 음영 처리된 막대는 항-MSRV GAG 항체 3H1H6(30㎍/㎖) 존재 시의 결과를 나타낸다.
도 15b는 15a처럼 (x 축의) "MOCK" 대조 단백질(1㎍/㎖), ENV-SU(1㎍/㎖) 및 LPS(1㎍/㎖)에 의해 유발된 TNF-알파(ng/㎖)의 분비량(y 축)을 나타낸다. 좌측에서 우측으로 각 자극 조건에서 흰색 막대는 항체가 없을 때의 결과를 나타내고, 검정 막대는 폴리믹신(polymyxin) B(25㎍/㎖) 존재시의 결과를 나타내며, 음영 처리된 막대는 PBMC 배지에 첨가 전에 100℃에서 30분간 가열된 MOCK, ENV-SU 또는 LPS 존재시의 결과를 나타낸다.
도 15c는 정상 공여자로부터 수득된 PBMCs의 배지에서, (x 축의) 흰색 막대로 표시된 "MOCK" 대조 단백질(1㎍/㎖), 검정 막대로 표시된 ENV-SU(1㎍/㎖) 및 빗금친 막대로 표시된 LPS(1㎍/㎖)에 의해 유발된 TNF-알파(pg/㎖)의 분비량(y 축)을 나타낸다. 좌측에서 우측으로 각 자극 조건에서, 결과는 x 축을 따라 표기된 항체: 3B2H4와 같은 동일한 동형의 항-톡소플라스마 항체 X(30㎍/㎖), 항-MSRV ENV 항체 3B2H4(30㎍/㎖), 항-MSRV ENV 항체 13H5A5(30㎍/㎖), 항-MSRV ENV 항체 3H10F10(30㎍/㎖), 항-MSRV GAG 항체 3H1H6(30㎍/㎖)에 대하여 제공된다.
도 15d는 정상 공여자로부터 수득된 PBMCs의 배지에서, (x 축의) 흰색 막대로 표시된 "Mock CK2" 대조 단백질(1㎍/㎖) 및 검정 막대로 표시된 ENV-SU(1㎍/㎖)에 의해 유발된 TNF-알파(pg/㎖)의 분비량(y 축)을 나타낸다. 좌측에서 우측으로 각 자극 조건에 대하여 결과는 x 축을 따라 표기된 항체: 3B2H4와 같은 동일한 동형의 항-톡소플라스마 항체 X(30㎍/㎖), 항-MSRV ENV 항체 3B2H4(30㎍/㎖), 항-MSRV ENV 항체 6A2B2(30㎍/㎖), 항-MSRV ENV 항체 3H10F10(30㎍/㎖) 및 항-MSRV ENV 항체 13H5A5(30㎍/㎖)에 대하여 주어진다.
도 16 : PBMCs에서 TNF-α 생산의 동역학
정상 공여자로부터 수득된 PBMCs를 완충용액 5㎕(원이 있는 점선), ENV-SU 1 ㎍/㎖(네모가 있는 두꺼운 선) 또는 LPS 1 ㎍/㎖(삼각형이 있는 가는 선)으로 자극하였고 ELISA로 TNF-α의 생산량(y 축, pg/㎖)을 분석하기 전에 2h, 24h 또는 48h(x 축) 동안 배양하였다.
도 17 : 인간화된 SCID에서 ENV-SU의 전염증성 효과
체중이 약 25g인 SCID 생마우스에게 x 축에 표시된 것처럼 동물마다 완충용액, ENV-SU 50 ㎍ 또는 LPS 50 ㎍을 주입하였다. 각 접종의 경우에 x 축에 표시된 것처럼, 2h, 24h 및 48h에 안락사시킨 생마우스의 혈청 또는 복막 세정(IP)에서 유도된 유체를 ELISA로 분석하였다.
좌측의 그래프는 TNF-α의 양(pg/㎖)을 나타낸다. 상단 그래프는 마우스 사이토카인의 양을 나타내고 하단 그래프는 인간 사이토카인의 양을 나타낸다.
우측의 그래프는 IL-6의 양(pg/㎖)을 나타낸다. 상단 그래프는 마우스 사이토카인의 양을 나타내고 하단 그래프는 인간 사이토카인의 양을 나타낸다.
도 18 : MSRV ENV 단백질로 EAE의 유도
도 18은 C57B16 마우스에서 MSRV ENV 단백질로 EAE를 유도한 예비 실험의 결과를 나타낸다.
x 축은 주입 후 일(days)을 나타낸다. y축은 시험된 동물의 평균 클리닉 스코어를 나타낸다.
네모를 가진 그래프는 MOG(미엘린 희소돌기아교세포 당단백질) 자가 항원 및 프로인트 완전면역보강제(결핵균의 추출물을 포함)이 주입된 양성 대조 동물을 나타낸다. 이러한 일련의 연구는 이 경우 18일에 끝이 났다.
세모를 가진 그래프는 MOG(미엘린 희소돌기아교세포 당단백질) 자가 항원, 프로인트 불완전면역보강제(결핵균의 추출물을 포함하지 않음) 및 MSRV ENV-SU 단백질이 주입된 동물을 나타낸다. 이러한 일련의 연구는 이 경우 25일까지 계속 되었다.
다이아몬드를 가진 그래프는 MOG(미엘린 희소돌기아교세포 당단백질) 자가 항원 및 프로인트 불완전면역보강제(결핵균의 추출물을 포함하지 않음)이 주입된 음성 대조 동물을 나타낸다. 이러한 일련의 연구는 이 경우 25일까지 계속 되었다.
도 19 : MSRV ENV 단백질로 EAE의 유도의 재생산
도 19는 C57B16 마우스에서 MSRV ENV 단백질로 EAE의 유도를 확인시켜주는 실험의 결과를 나타낸다.
x 축은 주입 후 일(days)을 나타낸다. y축은 시험된 동물의 평균 클리닉 스코어를 나타낸다.
네모를 가진 그래프는 MOG(미엘린 희소돌기아교세포 당단백질) 자가 항원 및 프로인트 완전면역보강제(결핵균의 추출물을 포함)가 주입된 양성 대조 동물을 나타낸다. 이러한 일련의 연구는 이 경우 21일에 끝이 났다.
세모를 가진 그래프는 MOG(미엘린 희소돌기아교세포 당단백질) 자가 항원, 프로인트 불완전면역보강제(결핵균의 추출물을 포함하지 않음) 및 MSRV ENV-SU 단 백질이 주입된 동물을 나타낸다. 이러한 일련의 연구는 이 경우 42일까지 계속 되었다.
다이아몬드를 가진 그래프는 MOG(미엘린 희소돌기아교세포 당단백질) 자가 항원 및 프로인트 불완전면역보강제(결핵균의 추출물을 포함하지 않음)이 주입된 음성 대조 동물을 나타낸다. 이러한 일련의 연구는 이 경우 42일까지 계속 되었다.
십자가를 가진 그래프는 MOG(미엘린 희소돌기아교세포 당단백질) 자가 항원, 프로인트 불완전면역보강제(결핵균의 추출물을 포함하지 않음) 및 LPS가 주입된 동물을 나타낸다. 이러한 일련의 연구는 이 경우 42일까지 계속 되었다.
도 20 : "EAE/MOG/ENV-SU" 마우스 모델 및 ENV가 없는 면역화된 대조구 모델에서 MOG 자가 항원의 증가량에 대한 자가 면역 반응의 24h 평가
x 축은 도 19에서 기술된 프로토콜의 과정에서 추출된 마우스의 PBMCs와 접촉된 MOG 자가 항원(㎍/㎖)의 농도를 나타낸다. y축은 MOG 항원의 증가량과 접촉한 PBMCs에 존재하는 자가 면역 T 림프구에 의해 시험관 내(in vitro)에서 분비된 인터페론 감마의 양을 나타낸다.
흰 막대는 MOG(미엘린 희소돌기아교세포 당단백질) 자가 항원, 프로인트 불완전면역보강제(결핵균의 추출물을 포함하지 않음) 및 MSRV ENV-SU 단백질의 생체 내 주입(도 19에 도시된 일련의 "0" 일(day))이 행해진 마우스의 PBMCs를 나타낸다.
검정 막대는 MOG(미엘린 희소돌기아교세포 당단백질) 자가 항원 및 프로인트 불완전면역보강제(결핵균의 추출물을 포함하지 않음)의 생체 내 주입(도 19에 도시된 일련의 "0"일(day))이 행해진 대조 마우스의 PBMCs를 나타낸다.
도 21 : "EAE/MOG/ENV-SU"의 마우스 모델 및 ENV가 없이 면역화된 대조구에서 인터페론 감마의 분비에 의해 밝혀진 항-MOG 자가 면역 T 림프구 반응의 동역학.
x 축은 PBMCs 샘플이 도 19에 도시된 일련의 마우스로부터 취해지는 "MOG 및 보강제" 제조물의 후-접종 기간(시간)을 나타낸다. y 축은 PMBCs에 존재하는 자가 면역 T 림프구에 의해 시험관 내(in vitro)에서 분비된 인터페론 감마의 양을 나타낸다.
흰 막대는 MOG(미엘린 희소돌기아교세포 당단백질) 자가 항원, 프로인트 불완전면역보강제(결핵균의 추출물을 포함하지 않음) 및 MSRV ENV-SU 단백질의 생체 내 주입(도 19에 도시된 일련의 "0"일)이 행해진 마우스의 PBMCs를 나타낸다.
검정 막대는 MOG(미엘린 희소돌기아교세포 당단백질) 자가 항원 및 프로인트 불완전면역보강제(결핵균의 추출물을 포함하지 않음)의 생체 내 주입(도 19에 도시된 일련의 "0"일)이 행해진 대조 마우스의 PBMCs를 나타낸다.
도 22 : 본 발명에서 발생하고 확인된 MS 모델에서 증명된, ENV-SU의 전염증성 활성에 대한 억제 효과를 위해 선택된 항-MSRV ENV 항체의 치료 활성.
도 22는 C57B16 마우스에서 MSRV ENV 단백질로 EAE의 유도 및 TLR4에 의해 매개되고, ENV 단백질의 ENV-SU 가용 분획에 의해 유도된 전염증성 활성의 억제에 대한 평가에서 이미 선택된 단클론 항-MSRV/HERV-W ENV 항체의 억제 효과를 확인시켜주는 실험의 결과를 나타낸다.
x 축은 주입 후 일(days)을 나타낸다. y축은 시험된 동물의 평균 클리닉 스코어를 나타낸다.
네모를 가진 그래프는 MOG(미엘린 희소돌기아교세포 당단백질) 자가 항원 및 프로인트 완전면역보강제(결핵균의 추출물을 포함)이 주입된 양성 대조 동물을 나타낸다. 이러한 일련의 연구는 이 경우 28일에 끝이 났다.
세모를 가진 그래프는 MOG(미엘린 희소돌기아교세포 당단백질) 자가 항원, 프로인트 불완전면역보강제(결핵균의 추출물을 포함하지 않음) 및 MSRV ENV-SU 단백질이 주입된 동물을 나타낸다. 이러한 일련의 연구는 이 경우 28일까지 계속 되었다.
다이아몬드를 가진 그래프는 MOG(미엘린 희소돌기아교세포 당단백질) 자가 항원 및 프로인트 불완전면역보강제(결핵균의 추출물을 포함하지 않음)이 주입된 음성 대조 동물을 나타낸다. 이러한 일련의 연구는 이 경우 28일까지 계속 되었다.
십자가를 가진 점선 그래프는 MOG(미엘린 희소돌기아교세포 당단백질) 자가 항원, 프로인트 불완전면역보강제(결핵균의 추출물을 포함하지 않음) 및 MSRV ENV-SU 단백질이 주입된 동물을 나타낸다. 이러한 동물들은 또한 항-MSRV GAG 대조 항체 3H1H6를 50㎍/㎏, 즉 20g인 생마우스에게 1㎍이 투여된다. 이러한 일련의 연구는 이 경우 28일까지 계속 되었다.
원을 가진 그래프는 MOG(미엘린 희소돌기아교세포 당단백질) 자가 항원, 프로인트 불완전면역보강제(결핵균의 추출물을 포함하지 않음) 및 MSRV ENV-SU 단백질이 주입된 동물을 나타낸다. 이러한 동물들은 또한 항-MSRV ENV 대조 항체 3B2H4 를 50㎍/㎏, 즉 20g인 생마우스에게 1㎍이 또한 투여된다. 이러한 일련의 연구는 이 경우 28일까지 계속 되었다.
도 23 : MSRV ENV 단백질(하부 라인)과 HERV-W 7q 카피(copy)에 의해 암호화된 ENV 단백질(상부 라인) 사이를 비교한 아미노산 서열; 박스안에 있는 서열은 동일한 부분이다(보존 부위).
도 24 : 웨스턴 블롯팅(Western blotting) 분석
MSRV ENV 단백질과 7q 염색체에 어디에나 위치하는 HERV-W 카피(copy)의 env orf에 의해 암호화되는 ENV 단백질, 클론 MSRV pV=14에 의해 암호화되는 V14=ENV 재조합 단백질, 클론 HERV-W7q pH74에 의해 암호화되는 H=74 ENV 재조합 단백질 사이의 항원 교차 반응성.
3C1D5 : MSRV 클론에서 파생된 재조합 단백질로 면역화 후에 획득한 단클론 항체.
화살표는 검출된 밴드의 수준을 나타낸다. 60kda는 대응하는 분자량의 정도를 나타낸다.
도 25 : ENV-SU 단백질의 항원 특성의 분석
웨스턴 블롯팅에 의한 분석
도 25 a, b 및 c는 "단백질 분석 툴박스" 기능이 있는 "Mac Vector" 분석 소프트웨어를 사용하여 MSRV ENV-SU 단백질의 아미노산 서열을 분석한 것을 나타낸다. 3개의 수직 직사각형으로 박스화된 부위는 1차 및 2차 서열 분석에 따른 세 개의 가장 가능성이 있는 항원 부위를 나타낸다.
도 25a는 "ENV-SU" 부위의 항원성을 나타내는 세 개의 그래프이다. y 축 상의 "0"보다 위의 음영처리된 부분은 양성 항원성을 가지고, 그 아래의 것은 그렇지 않다(음성 항원성).
도 25b에서 상부의 두 그래프는 "ENV-SU" 부위의 친수성을 나타낸다. y 축 상의 "0"보다 위의 음영처리된 부분은 양성 친수성을 가지고, 그 아래의 것은 음성 친수성을 가진다.
바닥 그래프는 "ENV-SU" 부위의 유연성을 나타낸다. y 축 상의 "0"보다 위의 음영처리된 부분은 양성 유연성을 가지고, 아래의 것은 음성 유연성을 가진다.
도 25c는 "ENV-SU" 부위의 표면 확률(surface probability)을 나타내는 그래프이다. y 축 상의 "0"보다 위의 음영처리된 부분은 양성 표면 확률을 가지고, 그 아래의 것은 음성 표면 확률을 가진다.
실험예
시험관 내(in vitro) 연구
물질 및 방법
단백질 및 독소
MSRV 외피의 표면 단백질(Env-SU)은 전체 외피 단백질의 287 아미노산의 단백질 서열에 해당한다(Env Pv14, GenBank AF331500). Env Pv14 및 Env-SU의 구조 및 아미노산 서열은 각각 도 1(a) 및 도 1(b)에 도시되어 있다. 재조합 MSRV Env-SU 단백질은 E. coli에서 발현되고 FPLC 컬럼으로 정제된다. 상기 단백질의 품질 및 순도는 질량 분광법 및 웨스턴 블롯팅(Western blotting)으로 확인된다. 카세인 키나아제(casein kinase)는 자가(autologous) 음성 대조구로서 사용된다. 이러한 대조 단백질은 Env-SU와 같은 조건하에 제조되고 정제되었다.
CleanCells 회사(Bouffere, 프랑스)에 의해 실행되는 Limulus amebocyte lysate(LAL) 테스트를 이용하여 내독소의 존재에 대하여 두 단백질을 시험하였다. 모든 분획은 5 IU/㎖의 검출 역치 이하이다. Toxin Technology(Sarasota, F1, 미국)로 획득한 포도상구균 장독소 B(SEB)는 95% 순수하였다. E. coli 균주 026:B6의 지질다당질(LPS)은 시그마 알드리히(Sigma Aldrich)에서 구입하였다.
배양 배지
배양 배지는:
- 1% L-글루타민(시그마-알드리히),
- 1% 페니실린/스트렙토마이신(시그마-알드리히),
- 1% 소디움 피루베이트(sodium pyruvate)(시그마-알드리히),
- 1% 비필수 아미노산(시그마-알드리히), 및
- 10% 가열로 불활성화된 FCS(우태아 혈청)(바이오웨스트(BioWest))가 채워진 RPMI 1640 배지(Gibco)이다.
T 세포 증식 분석을 위하여, 인간 AB 혈청(시그마-알드리히)을 FCS 대신에 사용하였다.
세포의 분리 및 준비
인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMCs)를 Ficoll Paque 밀도 경사 원심분리에 의 해 정상 공여자로부터 분리하였다. Miltenyi Biotec 회사에서 판매되는 단핵구 분리 키트를 사용하여 PBMCs 단핵구의 T 세포, B 세포, 수지상 세포, NK 세포 및 호염세포(basophils)를 제거함으로써 그 단핵구를 정제하였다. 간략히 말해서, 우선 PBMCs를 단클론 항체 및 합텐에 결합되고 자성을 띄게 표지된(항-CD3, 항-CD7, 항-CD19, 항-CD45RA, 항-CD56 및 항-IgE)항-인간 면역글로불린의 칵테일로 배양하고 그런 다음 항-합텐 단클론 항체에 연결된 마이크로비드(microbeads)(MACs MicroBeads)와 배양한다. 자성의 띄게 표지된 세포는 자기장이 형성된 컬럼에서 그 세포들을 보관함으로써 최종적으로 제거된다. 회수된 단핵구 모집단의 순도는 흐름 세포 측정 분석에 의해 CD14의 발현에 의해 측정된 것처럼, 항상 95% 보다 더 높다. 단핵구-유도 수지상 세포(monocyte-derived dendritic cells : MDDCs)의 발생을 위하여, 정제된 단핵구를 배양 배지 2㎖에서 IL-4 25ng/㎖ 및 GM-CSF 50ng/㎖를 포함하는 6-웰 플레이트에서 5일 동안 배양하였다. 배양 D3에, 완전한 양의 사이토카인을 세포에 첨가하였다. 형태학적 분석 및 흐름세포측정법에 의해 밝혀진 것처럼, 생성된 세포들은 CD1a-양성 수지상 세포를 90% 이상 포함한다.
세포 자극(Cell stimulation)
세포들(PBMCs, 단핵구 또는 MDDCs)을 Env-SU, LPS, SEB 또는 자가(autologous) 대조구로 자극하기 전에 1㎖의 배양 배지의 24-웰에 한 웰(well) 당 1 × 106 세포 농도로 배치하였다. 그런 다음, CO2가 5%인 습한 대기에서 37℃로 배양하였다. 지시가 있었을 때에는, 세포들을 자극하기 전에 폴리믹신(polymyxin) B(시그마-알드리히) 10 ㎍/㎖, 항-CD14 단클론 항체 20 ㎍/㎖ 및 5 ㎍/㎖, 항-TLR-4 항체(HTA124, eBioscience) 20 ㎍/㎖ 및 5 ㎍/㎖로 미리 배양하거나 또는 2a 동형의 대조 IgG(IgG2a)(eBM2a, eBioscience)로 미리 배양하였다. 특정 실험에서는, Env-SU, LPS, SEB 또는 자가(autologous) 대조구를 세포 처리 전에 30분 동안 끓인다.
결과의 특이성을 측정하기 위하여, Env-SU, LPS, SEB 또는 자가(autologous) 대조구 1 ㎍을 Env-SU에 대항하는 단클론 항체(13H5A5; IgG1; biomerieux) 또는 GAG에 대항하는 단클론 항체(3H1H6; IgG1; biomerieux) 30 ㎍/㎖와 4℃에서 1시간 동안 미리 배양하였다.
다음으로, 세포들을 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음 ELISA로 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 분비량을 분석하기 위하여 배지의 상청액을 수거하였다.
T 세포 증식 분석
자극을 받은 단핵구 및 MDDCs를 T-세포 자극제로서 사용하였다. 동종이형(allogenic)의 T 세포를 96-웰 둥근 바닥 마이크로플레이트에서 "반응자(reponder)" 세포로서 웰당 1 × 105 세포로 사용하였다. 자극제 세포를 양을 증가시키면서 T 세포에 첨가하였고 배양은 배양 배지 200 ㎕의 최종 부피로 세 번 실행하였다. 37℃에서 5일 동안 배양한 후에, 부착된 방사능을 측정하여 T 세포 증식을 평가하였다. 이를 위하여, 배양의 마지막 18시간에, 3H 티미딘 1μCi를 각 웰에 첨가하였다. 그런 다음 부착된 방사능을 측정하기 위하여 세포들을 유리 필터층에 회수하였다.
면역 형광에 의한 표지(labeling) 및 세포 흐름 측정
세포들을 회수하여, PBS로 세척한 다음 서로 다른 표면 표지로 염색하였다. 이하의 단클론 항체(Becton-Dickinson, San Jose, CA)를 사용하였다: 항-CD1a 알로피코시아닌(allophycocyanin)(HI149-APC), 항-CD14 플루오레신 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate)(MOP9-FITC), CD40 피코에리트린(phycoerythrin)(5C3-PE), CD80 피코에리트린(phycoerythrin)(L307.4-PE), CD86 피코에리트린(phycoerythrin)(IT2.2-PE) 및 HLA-DR 페리딘 코로필(peridine chorophyll)(L243-PerCP).
세포의 직접 면역 형광 염색은 2% FCS가 보충된 얼음으로 냉각된 PBS에서 제조자에 의해 추천된 농도의 여러 항체로 실행된다. 4℃에서 30분 후에, 세포들을 세척하고 FACS Calibur(상표명) 및 CellQuest 소프트웨어(상표명)(Becton Dickinson)를 사용하여 분석하였다.
사이토카인-생산 분석
사이토카인 분비에 대한 분석을 하기 전에 배양 배지의 상청액을 수거하여 -20℃에서 보관하였다. 사이토카인의 양은 제조자의 지시에 따라 IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12p40, IL-12p40 및 TNF-α을 위한 OptEIA(상표명) ELISA 키트(Pharmigen)를 사용하여 측정하였다.
결과
Env-SU는 인간 PBMCs로부터 전염증성(pro-inflammatory) 사이토카인의 생산 을 유발한다.
PBMCs 배양에서 사이토카인의 분비를 자극하는 재조합 Env-SU 단백질의 능력을 시험하였다. 정상 공여자의 PBMCs를 재조합 Env-SU 단백질의 양을 증가시키면서 24시간 동안 배양하였고 ELISA로 사이토카인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 분비량을 평가하였다. 분비된 사이토카인의 양을 자가(autologous) 대조구, SEB(잘 특징화된 박테리아 초항원) 및 인간 PBMCs에 대하여 전염증성 특성을 가지는 것으로 이미 알려진 LPS로 획득한 사이토카인의 양과 비교하였다. 모든 단백질 및 독소를 1 ㎍/㎖의 농도(투여량/반응 실험에 의해 측정된 전염증성 사이토카인의 유도를 위한 최적의 농도)로 사용하였다. Env-SU는 심지어 10 ng/㎖의 농도에서도 투여량에 따라 세 개의 사이토카인의 분비를 유발한다는 것을 알 수 있었다. 도 2에 도시된 것처럼, Env-SU로 획득된 사이토카인 분비 동역학은 SEB 보다는 LPS의 동역학에 유사하다. 사실상, 본 발명에서 기술된 시험관 내 분석의 조건하에 Env-SU에 의한 자극은 SEB 항원에 의한 초항원성 자극과 전적으로 다르다: (i) (초항원에 의한 T-세포 수용체(TCR) 수준에서 특히 인식되는 T 림프구의 활성화를 신호하는)인터페론 감마의 조기 분비가 없고, (ii) (SEB의 예로 도시된 것처럼) 초항원의 시험관 내 분석의 조건하에서는 생산되지 않는 (T 림프구에 의한 것이 아니라 단핵구-대식세포에 의해 분비되는) IL-6 및 TNF-α의 실질적인 조기 분비가 있다. 또한, Env-SU 부위를 통한 MSRV/HERV-W Env 단백질의 정제된 단핵구 및 수지상 세포에 대한 활성을 나타내는 예들은 이러한 효과들이 이러한 세포에 존재하지 않는 TCR과 관련이 없고 따라서 이미 기술된 특이적인 전염증성 효과는 사실상 TCR 및 T 림프구에 대한 결합 과 관계있는 초항원 기능에 의해 유발되는 전염증성 활성과 다르다는 것을 확인시킨다. 본 발명에서 주장하는 MSRV/HERV-W Env 단백질의 전염증성 활성화 경로는 임의적으로 보조 수용체 CD14의 도움으로, "톨 유사 수용체(Toll-like receptor) 4"(TLR4)와 관련이 있으며, 이는 도 8에 도시한 것처럼 T 림프구의 활성화의 상부 부분에서 활성화된다. 이러한 전염증성 경로(TLR4)는 면역 시스템의 "선천성(innate)" 성분들을 결집시키며, T 림프구-관련 면역성(적응성 면역)의 상부에 잘 결집된다. 이런 상부 경로는 수지상 세포의 활성화 후에, TLR4와 같은 선천성 면역의 수용체의 활성화에 반응하여 분비되는 사이토카인을 수단으로 적응성 면역(Th1 또는 Th2) 특성의 활성화 상태에 영향을 미친다. 이러한 효과는 선천성 면역 경로가 T-림프구-매개 적응성 면역의 상부를 활성화시키는 것을 제외하고 심지어 T 림프구에 결과로 생기는 하부 효과가 TCR 수용체와 관계가 없다는 것을 보여준다. 이는 이러한 수준(TLR4)에서 관찰된 MSRV/HERV-W Env (Env-SU) 단백질의 효과와 T 림프구 수용체(TCR)와 관련이 있는 초항원 효과(본 실험에서 SEB 초항원으로 설명됨) 사이의 차이를 명백히 나타낸다. TLR4 경로는 이런 단계에서 T 림프구의 1차 활성을 배제하고 다른 세포에 관계한다(단핵구-대식세포, 수지상 세포, B 림프구). 본 발명에서 관찰된 활성화 경로는 초항원 효과의 상류이며, 이는 본 발명에서 사용되는 세포 분석에서 "SEB"라기 보다는 "LPS" 해당하는 동역학을 확실하게 한다.
사실상, Env-SU 및 LPS는 24시간 후 상당량의 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 분비를 유도할 있는 반면, SEB는 심지어 72시간의 유도 후에도 단지 TNF-α의 분비만 유발한다. Env-SU 및 LPS는 그 TNF-α 분비 최고점에 도달하는 반면, SEB는 일정한 양의 TNF-α의 분비를 유발한다는 것은 흥미롭다. IL-1β에 대하여, Env-SU 및 LPS는 24시간 배양 후 분비 피크 및 그 이후의 일정한 감소를 특징으로 하는 TNF-α와 유사한 분비 특성을 유발한다. 동일한 TCR Vβ 특이성을 지닌 상당량의 T 림프구를 활성화시키는 것으로 알려진 SEB는 어떤 IL-1β의 분비도 유발하지 않는다. IL-6는 Env-SU 및 LPS에 자극받은 PBMCs에 의해 일정하게 분비되지만, SEB에 의해서는 그렇지 않다. IL-6 및 IL-1β는 활성화된 단핵구/대식세포에 의해 우선적으로 방출되는 두 사이토카인이다. 이러한 결과는 LPS와 유사하게, Env-SU는 전염증성 사이토카인의 방출을 위해 단핵구 및 대식세포처럼 선천적 면역 시스템의 세포를 표적으로 하고, T 림프구는 이런 수준의 활성화에서 표적이 아니라는 것을 말해 준다.
Env-SU 재조합 단백질의 내독소의 오염 가능성을 제거하기 위하여, 인간 PBMCs를 자극 전에 LPS 억제제, 즉 폴리믹신 B(PB)로 처리하거나 또는 끓인 단백질 및 독소와 배양하였다. 동시에, 같은 반응물 및 물질로 같은 조건 하에서 제조되고 정제된 자가 대조구: 인간 카세인 키나아제 CK2를 또한 첨가하였다.
24시간 배양 후에, 배양 배지 상청액을 수거하여 TNF-α 분비량을 분석하였다. 도 4에 도시된 것처럼, Env-SU 및 SEB에 의해 유발된 TNF-α는 PB에 의해 단지 부분적으로 억제되었고, 이에 반해 LPS의 효과는 완전히 없어졌다. 자가 대조구 단백질은 어떤 사이토카인 분비도 유발하지 않았다. TNF-α의 방출은 또한 Env-SU가 30분 동안 끓여졌을 때 상당히 억제되었고, 반면 LPS 활성은 영향을 받지 않았다. 이는 미국 식품 의약국에서 승인된 LAL 테스트를 사용하여 Env-SU의 정제된 샘플 및 자가(autologous) 대조구의 정제된 샘플 둘 다에서 실행된 품질 조절 분석 동안에 획득된 음성 결과에 일치한다.
이러한 결과는 초기에 관찰된 전염증성 효과는 내독소로 인한 오염 때문이 아니며 이러한 효과에 책임이 있는 성분들은 사실상 단백질이라는 것을 말해준다.
Env-SU의 전염증성의 특이성을 확인하기 위하여, 단클론 항체들의 효과를 연구하였다. PBMCs를 Env-SU에 대항하는 단클론 항체 또는 Gag에 대항하는 단클론 항체와 4℃에서 1시간 동안 미리 배양한 자가 대조구, Env-SU 또는 LPS와 24시간 동안 배양하였다. 이러한 단클론 항체의 발생을 위해 사용되는 Gag 단백질은 어떤 전염증성 활성을 나타내지 않고 적절한 대조구를 구성한다. 도 4에 도시된 것처럼, 항-Env-SU 단클론 항체는 Env-SU에 의해 매개되는 TNF-α의 방출을 특이적 차단하지만, LPS에 의해 매개되는 TNF-α의 방출은 차단하지 못한다. 사이토카인의 분비는 항-Gag 단클론 항체에 의해 영향을 받지 않는다. 이러한 결과는 사이토카인의 유도 및 세포 활성화에 대한 Env-SU의 특이성을 말해준다.
Env-SU는 PBMCs 배양에서 전염증성 사이토카인을 유도하는 능력을 가진다. 결과적으로 Env-SU는 정제된 단핵구를 직접적으로 활성화 시킬 수 있다는 것이 증명되었다. 정제된 단핵구를 자가 대조구, Env-SU 또는 LPS로 24시간 동안 자극하였고 CD80 및 CD86과 같은 여러 활성화 표지를 흐름 세포 측정으로 평가하였다. 자가 대조구와 비교하여, Env-SU는 두 표지의 상부 조절을 유발하고 획득된 발현 수준은 LPS에 의한 발현 수준과 유사하였다(도 5a). 상당량의 TNF-α, IL-1β, IL-6 및 IL-12p40은 Env-SU에 반응하여 생성되었다. 이러한 결과는 Env-SU가 전염증성 사이 토카인의 생산과 연관하여 빠르고 직접적인 단핵구의 활성을 유발한다는 것을 의미한다.
수지상 세포는 새로운 T-세포의 활성화를 조절하는 독특한 능력을 지닌 선천성 면역 및 적응성 면역과 연관된 항원-제시 세포이다. 단핵구-유도 수지상 세포(MDDCs)를 직접적으로 활성화시키는 Env-SU의 능력을 연구하였다. 자가 대조구, Env-SU 또는 LPS로 24시간 동안 자극된 상당히 정제된 단핵구로부터 시험관 내에서 수지상 세포를 발생시켰다. Env-SU는 CD80, CD86, CD40 및 HLA-DR 표지의 활성을 상당히 증가시킬 수 있다(도 6a). 전염증성 사이토카인 IL-6, TNF-α, IL-12p40 및 IL-12p70은 상당한 농도로 분비된다. Env-SU로 자극된 MDDCs는 심지어 자극을 받은 세포의 수가 적을 때에도, 자가 대조구 보다도 훨씬 더 T 세포의 동종 이형 증식을 유도할 수 있다는 것을 알 수 있다(도 6c). 따라서, LPS(양성 대조구)와 유사하게, Env-SU는 수지상 세포의 숙성을 유도하여 IL-12의 분비를 유도할 수 있고 1차 특정의 면역 반응을 유도할 수 있다.
Env-SU가 LPS처럼 동일한 활성화 경로를 사용하는지를 측정하기 위하여, 항-CD14 또는 항-TLR4 중화 항체로 미리 배양되거나 그렇지 않고 자극 후에 인간 PBMCs에 의해 분비되는 TNF-α의 농도를 측정하였다. 도 7a에 도시된 결과는 CD14의 차단이 결국 Env-SU 및 LPS에 의해 매개되는 TNF-α 분비의 상당한 농도 의존적인 억제가 된다는 것을 말해준다(항-CD14 항체 20 ㎍으로 각각 83% 및 56%의 억제). T 세포를 활성화 시키고 T 세포 수용체 및 HLA-DR을 통해서 항원 제시 세포를 활성화 시키는 것으로 알려진 SEB는 억제되지 않는다. 항-TLR4 항체 20 ㎍으로의 TLR4의 억제는 결과적으로 Env-SU 효과의 37% 억제 및 LPS 효과의 43% 억제에 해당한다(도7b). 대조구 항체에 대한 두 실험에서는 어떤 억제 효과도 관찰되지 않았다. 따라서, CD14 및 TLR4 수용체는 Env-SU에 의해 매개되는 전염증 특성에 관여한다.
결론적으로, MSRV/HERV-W 외피 단백질의 가용 분획은 CD14 및 TLR4 인식 수용체를 통해 선천성 면역 반응을 자극하고 본 발명에서 결국 염증 손상이 되는 면역 병리학적 연쇄 반응은 항-Env-SU 및/또는 항-TLR4 항체에서 선택되는 적어도 어느 하나의 항체를 포함하는 약제 조성물 또는 약제의 투여에 의해 매우 이른 단계에 차단될 수 있다는 것이 밝혀졌다.
따라서, 본 발명에서는 bioMerieux에 의해 생산된 MSRV/HERV-W 외피 단백질에 대항하는 여러 단클론 항체를 시험 한 후, 본 발명에서 정해지고 실행된 세포 분석은 TLR4 경로를 활성화시키는 전염증성 효과를 억제하는 특성을 가진 항체를 확인하고 이러한 억제성 항체들 중에서 억제 효율이 거의 100%에 달하는 항체를 선택하는 것을 가능하게 하였다. 이러한 항체들 중에서, 항체 3B2H4 및 13H5A5가 바람직한 항체이다.
따라서, 도 8 및 도 9에 도시된 것처럼, MS 및 SCZ와 같은 두 질환의 경로에서 하부로 분기하는 병리학적 연쇄 반응의 상부에서 MS 및 SCZ와 같은 질환에 관계된 염증의 초기 경로의 억제 특성을 확인하는 것이 가능하다.
약제 조성물 또는 약제의 제조를 위한 상기의 정의에 일치하는 이러한 항체의 유용함은 그 항체들이 MS 또는 SCZ와 같은 질환에서 병리학적 연쇄 반응의 상부 를 차단할 수 있기 때문에 명백히 존재한다. 그 장점은 또한 TLR-4 수용체와의 상호작용 전에 존재하는 억제 효과에 의해 증명되며, 이는 그 억제 효과가 초기 활성화 연구에 공헌한 작은 세포 분석에서 항-TLR4 항체로 획득된 억제 효과와 등가이다. 이러한 T 림프구의 활성화의 상부에서의 효과는 이 단계에서 MS와 같은 자가 면역 질환 및 SCZ와 같은 비-자가 면역 질환에 공통인 병리학적 작용을 차단하는 것을 가능하게 한다(참조: 도 9). 따라서, 본 발명의 항체들은 MS 및 SCZ와 같은 질환에서 하부와 다른 병리학적 연쇄 반응의 상부를 차단하는 것을 가능하게 한다. 도 8은 본 발명의 항체들이 MS의 병리학적 연쇄 반응에서 향하고, 현존하는 치료제들이 향하는 모든 표적을 나타낸다. 사실상, 본 발명의 항체들이 간섭하는 단계에서, 단지 하나의 작용제(MSRV/HERV-W Env) 및 하나의 수용체(TLR4)가 있는데 비해, 수용체의 활성화 후에는 생활성 분자(사이토카인, 효소, 자유 라디칼 등) 형태인 수 백 개의 작용제가 염증 과정에 관여하며, MS의 경우에 수천 개의 분자 및 세포성 작용제는 자가 면역 T 림프구 클론의 활성화를 구성하는 단계 후에 관여하게 된다. 정신 분열증(SCZ)의 경우에, 자가 면역 경로에서 활성화되는 것은 T 림프구가 아니라, 인접한 신경 수준에서 흥분 독성을 유발하는 뇌 회색질의 세포에서 TLR4 경로의 활성화 후에 생산된 전염증성 매개체이다. 전염증성 분자에 의해 유도되는 이러한 흥분 독성 현상은 잘 기술되어 있으며 환각 현상을 유발하는 사람의 전두 피질(frontal cortex)에서 신경 매개체의 비정상적인 방출을 유발한다. 이러한 흥분 독성 현상은 종종 신경사로 반영되는 신경 독성이 된다는 것을 깨닫는 것이 훨씬 바람직하다. 이러한 신경사는 SCZ에 알려져 있고 질환의 발전된 단계에서 환자 의 MRI 영상에 의해 일반적으로 가시화되는 심실 확장으로 구체화된다. 사실상, 이러한 환자의 뇌에서 신경의 급진적인 손실은 뇌의 공간의 부피 증가에 의해 보충되며, 이는 질환이 어느 정도 발전된 후에 MRI에 의해 검출될 수 있다. 도 8 및 도 9는 본 발명의 내용에서 개발된 세포 분석을 수단으로 확인되고 선택된 항-Env 항체가 MSRV/HERV-W 과(family)의 하나 이상의 병리학적 카피(copy)의 활성화 후에 이어지는 이러한 연쇄 반응에서 "1차" 자극제를 차단한다는 사실을 명백히 나타낸다.
MSRV/HERV-W 레트로바이러스 과(family)의 외피 단백질(Env)의 발현과 MS 및 SCZ 사이의 상관 관계를 더욱더 정확히 확인하기 위하여, 정상 대조구와 비교하여 MS 또는 SCZ 환자에서 면역 활성의 편향(bias)에 대해 연구하기 위한 본 발명에서 기술된 선천성 면역 활성화 분석법을 실행하였다.
생체 밖(ex vivo) 연구
다발성 경화증(MS)에 걸린 환자의 생체 밖 연구
Env-SU-유도 IL-6 분비는 MS 환자로부터 생체 밖으로 취해진 혈액 단핵 세포에서 증가하였고 그 클리닉스코어(EDSS)와 연관이 있다.
본 연구에서는 MS 환자 및 정상 공여자의 PBMCs의 Env-SU에 대한 반응성을 비교하였다. 32명의 환자가 포함되었으며, MRI에 의한 분석에 따라 그 중 20명은 급성 단계이고 12명은 안정 단계이다. 그들의 신체적인 장애 역시 EDSS(확장 장애 스코어) 분류에 따라 결정되었다. 동시에, 19명의 정상 공여자를 시험하였다. 간략히 말해서, 1 × 106 PBMCs를 Env-SU 또는 Mock 대조구로 24시간 배양하였고, 그런 다음 IFN-γ, TNF-α, IL-1β, IL-6 및 IL-10과 같은 사이토카인의 분비에 대하여 배양 배지의 상청액을 분석하였다. 획득된 결과(Env-SU - Mock)는 무엇보다도 우선 그룹 사이를 비교하였다. IFN-γ, TNF-α, IL-1β 및 IL-10에 대해서는 어떠한 상당한 차이도 관찰되지 않았다(도 10). 한편, IL-6와 IL12p40에서 상당한 차이가 관찰되었다(도 11). 또한, IL-6 또는 IL-12p40의 분비 정도와 환자의 클리닉 스코어 사이에 양의 관계가 관찰되었다(도 12). 다른 사이토카인 또는 치료 데이타(나이, 성별, 치료)에 대해서는 어떤 다른 상관 관계도 획득되지 않았다. 도 12에서는 유도된 IL-6와 질병의 기간 사이의 상관 관계의 부재 및 인터페론 감마와 EDSS 사이의 상관 관계의 부재를 예로서 도시하였다.
T 림프구에 의해 절대적으로 분비된 인터페론 감마에 대하여, 단핵구/대식 세포에 의해 분비된 선천성 면역과 관련된 사이토킨과 대조적으로, 치료 스코어(EDSS)와 연관되지 않는다는 것은 매우 흥미롭다. 이는 시험관 내 세포 분석으로 증명된 것처럼, 생체 밖에서 밝혀진 효과는 T 림프구에 의해 이러한 단계에서 매개되지 않은 효과와 명백히 관련이 있고, 따라서 초항원 효과와 관련이 없다.
이러한 결과는 가장 발전된 치료 신호(높은 EDSS)를 나타내는 MS 환자가 Env-SU와 같은 레트로바이러스 인자에 "지나치게 민감하다"는 것을 나타내고, 또한 전염증성 사이토카인 및 IL-6을 통한 MS 발병기전에서 Env-SU의 역할을 제안한다.
이는 질병을 악화시키는 MSRV 바이러스 부하의 점차적인 증가를 밝힌 Sotgiu 외[10]에 의한 연구에서, MS 환자의 CSF에서 MSRV 바이러스 부하로 획득된 데이타를 확인한다. 본 발명의 결과에 따르면, MSRV 외피 단백질에 의해 유도된 반응은 EDSS에 의해 측정된 질병의 심각성에 연관된 방식으로 증가한다. MS 환자에게 서로 다른 접근법으로 생체 밖에서 실행된 두 독립적인 연구(우선, RT-PCR에 의한 MSRV 핵산의 평가 및 다음으로 MSRV 외피 단백질에 대한 면역학적 반응의 평가)는 질병의 과정과 MSRV 레트로바이러스 사이의 관련성을 확인한다.
정신 분열증(
SCZ
)에 걸린 환자의 생체 밖 연구
Env-SU-유도 IL-12p40 분비는 SCZ 환자로부터 생체 밖으로 취해진 혈액 단핵 세포에서 증가하였고, 또한 가장 높은 농도에서 항-정신병 치료제에 저항하고 및/또는 특히 SCZ의 진화된 형태를 가지는 환자의 특정 생물형군을 확인하는 것을 가능하게 한다.
본 연구에서는 SCZ 환자 및 정상 공여자의 PBMCs의 Env-SU에 대한 반응성을 비교하였다. 25명의 환자를 포함하였다. 동시에, 15명의 정상 공여자를 MS 환자에 대하여 행해진 이전 연구의 프로토콜과 동일하게 시험하였다.
TNF-α, IL-12p40, IL-1β, IL-6 및 IL-10과 같은 사이토카인의 분비에 대하여 배양 배지의 상청액을 분석하였다. 본 연구의 이런 단계에서, 여러 시험된 사이토카인에서 대하여, SCZ에 걸린 일부 환자와 모든 대조구 사이에 주목할 만한 차이가 관찰되었다. 결과는 표 1 및 표 2에 기술되었다. 표 1은 그 코드가 첫 번째 컬럼에 존재하는 여러 정상 공여체에 대하여 분석된 사이토카인의 양(ng/㎖)을 나타내는 것으로, 각 라인은 각 컬럼에 기술된 두 개의 조건(Mock 및 ENV-SU 자극)을 지닌 컬럼의 상부에 기술된 여러 사이토카인의 분석량을 나타낸다. 표 2는 그 코드가 첫 번째 컬럼에 존재하는 여러 MS 환자에 대하여 분석된 사이토카인의 양(ng/ ㎖)을 나타내는 것으로, 각 라인은 각 컬럼에 기술된 두 개의 조건(Mock 및 ENV-SU 자극)을 지닌 컬럼의 상부에 기술된 여러 사이토카인의 분석량을 나타낸다.
표 1 및 표 2에서, 바닥의 두 라인(평균 및 표준 편차)은 각각 각 컬럼에 대하여 평균 및 측정된 데이타의 표준 편차를 나타낸다.
이미 연구된 MS 모집단과 비교했을 때, 일부 환자의 배양 배지에서 차이가 이미 관찰된다(IL-10 및 IL-12p40에 대한 도 13 및 도 14에 도시됨). 이는 기대하지 않은 데이타, 즉 SCZ는 비록 조직 염증 질병은 아니지만, 심지어 자가 면역 질병도 아니지만, 정상 대조구의 면역 활성 및 같은 조건에서 MS 환자의 면역 활성을 능가하는 자발적인 면역 활성을 나타낸다는 것을 확인시켜 준다. 이는 이러한 환자에게서 면역의 조직 활성화 개념에 중요한 자료를 도입하고 따라서 이러한 질병에서 이러한 전염증성 면역 성분의 실재를 확인시켜 준다.
Env-SU로의 자극에 대한 반응은 일련의 SCZ 환자에게서 더 증가하였고, 어떤 환자들은 정상 대조구보다 훨씬 더 크고 심지어 일련의 대조구에서 관찰되는 최대값보다 몇 배 더 큰 사이토카인 분비 수준에 반응한다(IL-10 및 IL-12p40에 대한 도 13 및 도 14에 도시된 것처럼). 이는 또한 Env-SU에 대한 반응이 SCZ에 걸린 일부 환자에게서 상당히 증가하였고 따라서 Env-SU는 그 치료 상태가 일치하는 이러한 환자들의 일부에서, TLR4 경로를 통해 활성화된 선천성 면역의 성분을 포함하는 면역 경향을 나타낸다는 것을 확인한다.
그러나, 이러한 환자들에게서, Env-SU로 자극 후에 자발적 사이토카인 농도에 대한 증가(자극된 수준- 자발적 수준/자발적 수준)는 전체적으로 정상 공여체보다도 SCZ 환자가 더 적다; 이는 ENV-1에 의해 유발된 분비 수준이 모든 정상 대조구의 수준을 초과할 때(IL-12p40에 대한 도 14b 및 c)이다. 이는 MSRV/HERV-W 과(family)의 레트로바이러스 성분의 병인 병리학적 역할과의 관계에서 MS와 같은 질환에서 이미 기술된 것에 대하여 새로운 구성 요소를 소개한다. 사실상, SCZ에서 MSRV/HERV-W 과(family)의 레트로바이러스 성분의 역할은 서로 다른 방법에 의해 여러 다른 연구 팀에 의해 증명되었고 확인되었지만[3, 14, 31, 54], SCZ는 MS와 같이 자가 면역 질환 성분을 가진 질병은 아니다. 따라서, SCZ 환자의 PBMCs에 대한 Env-SU 단백질로 얻어진 결과는 비록 T 림프구(자가 면역에 책임이 있는 세포)에 관계가 있는 면역 활성화의 하부 결과가 MS와 다르긴 하지만, 그럼에도 불구하고 TLR4 수용체(T 림프구에 존재하지 않음)를 포함하는 선천성 면역의 조기 활성화 경로가 이러한 두 질병과 MSRV/HERV-W 레트로바이러스 과(family) 사이에 초기 병원성 경로를 구성할 수 있다.
이미 언급한 것처럼, 이러한 환자들에게서 MSRV/HERV-W 외피 단백질의 역할은 Env-SU 단백질에 대하여 혈액 단핵 세포(PBMCs)의 특정 면역 반응성에 의해 구체화된다.
본 연구의 이런 단계에서 SCZ를 앓고 있는 환자의 치료 자료에 대하여 가장 바람직하고 가장 관련 있는 차이는 IL12p40에서 관찰되었다(도 14).
사실상, 가장 높은 Env-SU-유도 IL-12p40 농도(여기서는 400 pg/㎖ 보다 큼, 따라서 일련의 시험된 정상 대조구의 최대 수준) 중 하나를 나타내는 환자는 시험된 항-정신 치료에 견디고 특정의 진화 형태의 정신 분열증을 지닌 환자를 포함한다는 것이 증명되었다.
이는 MS 환자로 이미 획득한 특징과 다른 특징을 가지고서, 진화 형태 및/또는 동일할 수 있는 현존 치료에 저항하고 평균보다 더 큰 Env-SU-유도 IL12p40 분비를 특징으로 하는 형태를 앓고 있는 환자의 적어도 하나의 특정 생물형군이 존재한다는 것을 보여 준다.
SCZ 환자의 PBMCs에서 Env-SU 활성화에 의해 유도된 적어도 IL12p40은 진화 형태 및/또는 현재 치료책에 저항하는 형태에서 최대라는 사실은 진화의 조건과 질병의 심각성 조건 사이의 연관 관계에 더하여, 이러한 환자를 위한 새로운 치료 목표, 즉 환자에게서 이러한 면역학적 편향(bias)과 연관된 MSRV/HERV-W 단백질을 설명한다.
또한, MS 모델에 대하여 기술된 것처럼, TLR4 수용체에 의해 매개된 "상부" 경로의 연관 전에 면역 시스템의 활성화를 억제할 수 있는 항체는 중요한 치료 수단이고 그 표적은 새로이 확인된 치료 생물학적 내용에서 매우 바람직하다.
이러한 효과의 연속 결과가 미엘린의 항원성 성분을 목표로 하는 자가 면역 반응성인 MS에 대조적으로, MS에서보다 더 높은 생체 밖 자발적 농도를 가진 선청성 면역(TLR4)의 초기 단계에 생산된 매개체는 외피 신경에 흥분 독성의 가능성을 가진다[17, 21, 23-25, 29, 50, 51, 55].
따라서, 여러 보조인자에 의한 MSRV/HERV-W 프로바이러스의 활성화는 뇌 세포에서 MSRV/HERV-W Env 단백질의 발현을 활성화시킬 수 있고[56], 그 보조 인자의 성질 및 환경에 따라, 뇌의 다른 면적을 목표로 할 수 있다. 이러한 조건하에서, 전두 피질 부위에서 활성화는 영향을 받은 면적에 따라 여러 환각을 일으킬 수 있는 신경의 흥분 독성을 초래할 수 있다.
(유수의) 백색질에서 활성화의 경우에, 대식세포 및/또는 마이크로글리오사이트 수준에서 Env 단백질에 의해 형성된 초기 염증은 미엘린 붕괴를 자극할 수 있고, T 림프구의 도움으로 미엘린의 초항원에 대한 자가 면역을 유도할 수 있다.
밝혀진 이러한 여러 개념들은 도 9에 도시되어 있다. 상기 도면은 정신 분열증을 앓고 있는 환자에게서 확인된 치료 생물학적 내용에서, 명백히 이러한 질병의 증상에 관련된 신경 독소 염증 성분을 억제하는 것이 유용하다는 것을 보여준다.
또한, 도 8에 도시된 것처럼, 이러한 항체들이 Env 단백질의 생물학적 효과를 억제하는 수준은 하부에서 생산되고 종래 항-염증 치료제의 유용한 표적(사이토카인, 자유 라디칼, 산화 환원 화합물, 효소, 프로스타글란딘(prostaglandin), 전염증성 단백질 및 지질, 활성화된 T 림프구 등)인 모든 병리학적 매개체의 상부이다. 이런 단계에서, 유일한 작용제는 MSRV/HERV-W Env 단백질 자체이며 상기 MSRV/HERV-W Env 단백질이 TLR4 수용체를 활성화시키는 것을 방지하는 것은 도 8 및 9에 도시된 것처럼, 하부의 원인이 되는 여러 면역 생물학적 연쇄 반응의 입구의 초기 경로를 차단하는 것이다.
이하와 같은 전임상(proclinical) 시험을 수행하는 것은 관련 분야의 숙련된 자의 범위 내이다:
- 항-TNF-알파 REMICADE와 같은 공지된 치료 항체를 위해 사용되는 방법에 따른 단클론 항체 인간화(humanization). 치료 항체의 뇌내 통과의 최적화는 잘 알려진 기술에 따라 실행되고, 그 기술의 대부분은 예를 들어 Merlo 외., 또는 Pranzatelli[57, 58]에 의해 기술된 것처럼 수 많은 과학 및 약학 간행물에 기술되어 있다;
- 본 발명에 기술된 것처럼, PBMCs에 대한 Env-SU에 의한 전염증성 활성화에 대한 테스트로 이러한 인간화된 또는 변형된 항체의 억제 활성의 검증;
- 뇌에서 MSRV/HERV-W 단백질의 비정상 발현의 거동 효과를 나타내는 동물 모델에 대한 항체의 치료 효과의 검증[59].
따라서, 본 발명의 구성 요소, 즉:
- 선천성 면역의 세포 수준에서 "상부" 전염증성 활성화를 위한 유입 경로로서 MSRV/HERV-W 외피 단백질을 위한 "TLR4" 수용체의 증명,
- 이러한 효과의 검출 및 측정을 가능하게 하는 세포 분석,
- 이러한 단백질의 효과를 억제할 수 있는 항-Env 단클론 항체,
- 정신 분열증을 앓고 있는 환자로부터 생체 밖으로 취해진 혈액 면역 세포의 수준에서 이러한 효과의 생물학적 증거의 단편,
- 이러한 효과를 질병에 연결하는 생물학적 증거의 단편들은 현재까지 알려진 지식, 기술 및 동물 모델을 가진 관련 분야의 숙련된 자가 임상전 발생 단계를 실행하게 하고 적절한 조건하에서 인간에게 치료 연구를 실행하게 한다. 또한, 본 발명에 기술된 생물학적 테스트는 간단한 혈액 샘플을 수단으로, 환자의 치료 전, 중 및 후에 이러한 치료 항체에 의해 표적이 된 변수의 생체 밖 생물학적 조사를 가능하게 한다.
이러한 치료 가이드는 정해진 순간에 또는 정해진 소집단에서 치료를 받기에 적합한 환자의 한정을 위해 매우 바람직하고 생물학적 결과에 따라 투여량 및 투여 빈도를 조절하는 것을 가능하게 한다.
동물 모델
치료 항체 및 동물 모델에서 대조구의 약동학적 분포 및 독성을 연구하기 위한 모델의 생산
항체:
1. 항체의 특성:
간에서 항체가 너무 빨리 그리고 많이 분해되는 것을 방지하기 위하여, 항체를 관련 분야의 숙련된 자에게 알려진 기술에 따라 단클론 항체로부터 획득된 Fab' 또는 Fab2 단편 형태로 사용한다[60]. TLR4에 의해 매개되는 전염증성 효과를 억제하는 항-MSRV/HERV-W Env 항체는 항체 13H5A5 및 3B2H4이다. 항-MSRV/HERV-W Gag 대조 항체는 항체 3H1H6이다.
2. 항체 표지 프로토콜:
우선 단편들을 희석하였다. 농도가 1 ㎍/㎕ 단편 100㎕를 준비하였고, 제조자에 의해 추천된 것처럼 비드(Iodobeads No. 28665 Pieerce Rockford, Illinois, USA)에 흡수된 요오드화 나트륨(NaI125 NEN, 5mCi/50 ㎕)과 접촉시켰다.
10분간 배양한 후에, 용액을 제거하고 비드가 없는 튜브로 옮겼다. 이러한 공정은 반응을 멈추게 하여 항체의 기능을 손실시키는 그 항체의 활성 부위의 산화를 방지할 수 있다.
그런 다음, 샘플을 4㎎/㎖ 피로아황산나트륨(sodium pyrosulfite)(Fluka) 10 ㎕로 중화시켰다. 마지막으로, 요오드화 나트륨을 차가운 혼화제(entraining agent) 10 ㎕를 사용하여 250 nM/㎖ 양으로 혼화시켰다.
3. 정제
정제는 음이온-교환-컬럼 분리법으로 실행된다. 상기 방법은 자유로운 요오드를 결합하기 위하여 음이온 교환 컬럼을 사용한다. 우선, 이동 완충 용액(migration buffer)인 0.9% NaCl 용액(Aguettant) 2㎖로 활성화 시킨다. 정제는 0.9% NaCl 용액 0.5㎖로 혼화된 네 개의 통로에서 실행된다. 네 개의 튜브에 포함된 방사능을 계수한다.
4. 수득률
결과는 표 3에 기술되어 있으며, 정제 후의 각 항체의 회수 백분율을 나타낸다.
표지 수득률은 배양 10분 후 교정된다. 시간에 따라 증가하지 않는다. 모든 단편에서 획득된 백분율은 70% 내지 80% 사이이다.
이온-교환 정제법은 표지된 항체의 회수율을 상당히 좋게 한다. 3B2H4 Fab2 단편에 대하여, 비율은 단지 50%이다.
체내 분포(
biodistribution
)의 평가:
1. 마우스
실험에 사용된 동물은 Charles River Laboratories(Wilmington, North Carolina, USA)에서 공급된 7-주된 BALB/c 마우스이다. 공급자는 그 동물이 건강함을 보장하였다.
실험을 기다리는 동안, 마우스를 주기적으로 빛을 비추면서 온도 조건하에서 유지하였다.
2. 프로토콜
배치(batch)는 시험될 각 단편에 대하여 3 마리의 7-주된 BALB/c 흰 마우스로 구성된다.
첫 번째 단계에서, 1㎕/체중(g)으로 투여된 펜토바르비탈(pentobarbital) 또는 2% 케타민(ketamine)-자일라민(xylamine) 10 g/100 ㎖의 부피-대-부피 혼합물로 마우스를 마취시켰다.
그런 다음, 마우스의 정맥내(IV)로 700 μCi/㎎로 표지된 항체 0.15㎎을 주입하였다(마우스는 시험될 세 개의 항체들(3B2H4, 13H5A5 및 3H1H6) 중 어느 하나의 단편으로 접종된다).
결과의 확인은 주입 후 10, 45, 90 및 210 분 후에 실행된다.
210분 후에, 마우스를 안락사시키고 비장, 간, 신장, 뇌, 심장, 폐 및 혈액을 적출한다. 꼬리 역시 획득된 값을 조정하기 위하여 보관한다.
3. 결과
이러한 항체들과 관련된 급성 독성을 발생시키는 어떤 조직 질환도 관찰되지 않았다.
항체의 생체 분포의 결과는 표 4에 기록되어 있으며, IV 주입 210분 후에 여러 기관에서 표지된 항체의 분포량을 나타낸다.
표 4는 시험된 단편들 중 어느 것도 조직에 비정상적으로 결합하지 않았음을 나타낸다.
이러한 결과는 항체들이 급성 독성을 가지지 않고, 생물학적 유체 및 조직에서 분석될 수 있으며, 그 분포는 관련 분야의 숙련된 자에 의해 예상되는 것과 일치함을 나타낸다.
따라서, 이러한 항체의 생체 분포의 어떤 최적화 및/또는 변형 후 이러한 일정함의 어떠한 검증은 같거나 등가의 프로토콜에 따른 약동학적 및 독성학적 관련성에 관하여 평가될 수 있다.
환자에 대한 직접 연구와 동시에, 동물 모델을 생산하였으며 이는 이하를 확인하는 것을 가능하게 한다:
- MSRV/HERV-W Env 단백질에 의해 형성되고, 활성화 경로 "단지 선천성 면역"(모델 SCID-hu 및 Env-SU 단백질) 또는 "선천성 면역 및 T 림프구에 대한 초항원 효과"(모델 SCID-hu 및 비리온)에 해당하는 "전염증성" 질환은 생체 내에서 명백히 관찰되고 목적 분류(objective criteria)를 수단으로 분석될 수 있다. "선천성 면역/TLR4 +/- CD14 활성화 경로"는 본 발명의 대상이고 전염증성 연쇄 반응의 상부를 차단하는 이점을 가진다.
- MS에서처럼 미엘린 자가 항원에 대항하는 자가 면역 질환은 MSRV/HERV-W Env 단백질(모델 EAE MOG Env-SU)로 명백히 획득될 수 있고 분석될 수 있다.
- 억제 특성으로 선택된 항-Env 단클론 항체 및 면역 인식 특이성을 갖는 그 단편의 용도는 동물에서 측정할 수 있는 유기 분포 및 낮은 유기 독성을 나타내는 치료 조성물과 양립할 수 있다(모델 BALB/c 방사능 표지된 항체).
항-Env 항체의 치료 용도는 TLR4/선천성 면역 경로의 "세포(cellular)" 활성화를 위한 테스트에서 항-Env 단클론의 선행 선택에 의해 획득되었다. 이러한 용도는 Env에 의해 유발된 "MOG"(미엘린 희소돌기아교세포 당단백질) 자가항원의 존재시에 "EAE"(실험 알레르기 뇌척수염)과 같은 모델에서 설명되고, 본 발명에서 잘 기술된 전염증성 활성화 단계의 억제를 넘어 병리학적 결과를 훨씬 더 하부에서 억제할 수 있다(참조: EAE-MOG 모델에서 항-Env 항체에 의한 억제).
또한, 본 발명에 기술된 시험관 내(in vitro) 세포 분석을 수단으로 전염증성 효과를 억제하는 항-Env 항체의 선택 후에, 동물 모델은 이러한 첫 번째 선택으로부터 질병에 대한 치료 용도에 따른 해로운 부작용을 가지지 않는 치료 항체를 선택하는 것을 가능하게 한다. 사실상, "EAE-MOG" 예에서 신경 손상을 가능하게 하는 항체가 밝혀진 것처럼(참조: EAE-MOG 및 항체 3H1H6), 일부 항체들은 특이성에 상관없이 심지어 질환의 표적을 억제한다 하더라도 치료에 사용하기가 부적절할 수 있으며, 이러한 부작용으로 인하여 그 항체들을 제거하거나 치료 용도로 사용하기 전에 변형시켜야 한다. 본 발명에서 개발된 수단은 이러한 병리학적 용도에서 가능한 부작용을 확인하는 것을 가능하게 하고, 적절한 새로운 방식으로 적절한 치료 항체의 선택 및 검증을 가능하게 한다.
세포 및 동물 모델에 대한 염증 모델:
물질 및 방법
단백질 및 독소
E. coli 스트레인 0.26:B6의 리포폴리사카라이드(LPS)를 시그마(St Louis, Mi)로부터 구입하였다. 재조합 Env-SU 단백질은 전체 MSRV 외피 단백질, 즉 ENV pV1의 약 33 kDa 및 287 아미노산으로 구성된 분획을 나타낸다. Env-SU를 E. coli에서 제조하였고, 크로마토그래프로 정제하였으며, 웨스턴 블롯팅(Protein Expert, Grenoble)으로 분석하였다. 내독소의 가능한 존재를 검출하기 위하여 LAL 테스트(limulus amebocyte lysate, Clean Cell, Bouffere, 프랑스)를 실행하였다. 그 결과는 5 IU/㎖의 검출 역치 이하의 음성이었다. 단백질을 보존하기 위하여 사용된 완충 용액은 음성 대조구로서 실험에서 사용될 것이다. 상기 완충 용액은 50mM Tris, pH 8, 0.3M NaCl, 1 mM β-메르캅토에탄올, 2% 수크로오스, 2% 글리세롤 및 5.3 mM 요소로 구성된다.
세포 배양
PBMCs의 제조
Ficoll(Amersham Bioscience, Freiburg, 독일) 밀도 경사에 의해 정상 공여자의 구연산염을 첨가한 신선한 전혈(구연산염을 첨가한 전혈 백(bags), Centre de Transfusion Sanguine [Blood Bank] of Valence, 프랑스)로부터 PBMCs를 제조하였다. PBS-2% FCS(우태아 혈청) 10 ㎖로 혈액 25 ㎖를 희석한 것을 조심스럽게 Ficoll 15 ㎖에 집어 넣고 실온(AT)에서 20분간 2400 rpm으로 원심 분리하였다. 세포를 포함하는 밴드를 회수하여 PBMCs를 PBS-2% FCS 50 ㎖로 세척하였다(도 11). 트리판 블루(trypan blue)로 집계한 후, 세포들은 90% dFCS-10% DMSO 혼합물 속에서 -80℃로 냉각되고 세포 분석 또는 마우스에 주입을 위해 배양에 직접 사용된다.
마우스의 비장 림프구(
splenocyte
) 현탁액의 제조
경추탈골(Cervical Dislocation)에 의해 마우스를 안락사 시킨 후에, 비장을 적출하여 RPMI에서 금속 필터로 갈았다. 세포 현탁액을 4℃에서 10분간 1200 rpm으로 원심분리하였다. 그런 다음, 세포 펠렛을 약 4 ㎖의 생리 식염수 또는 dFCS에 넣었다(각각 C57B16 마우스에 주입 또는 냉동을 위해). 트리판-블루 집계를 실행한 다음 세포 농도를 조절하였다. 그런 다음, 세포를 냉동하거나 동물 모델을 위해 사용하였다. 마우스에 주입하기 위하여, 겐타마이신(gentamycin)을 0.2 ㎎/㎖ 농도로 첨가하였다. 마지막으로, 500 ㎕, 즉 50×106 세포를 각각의 C57B16 마우스에 복막내(IP)로 주입하였다.
세포의 냉동 및 해동
세포 현탁액을 4℃에서 PBS(bioMerieux, 프랑스) 50 ㎖로 한 번 세척하고 4℃에서 7분 동안 1400 rpm으로 원심분리하였다. 세포들을 몇 ㎖의 FCS에 넣고 계수하였다. 세포 농도를 일반적으로 20×106으로 조절하였다. 이러한 용액 500 ㎕를 크라이오튜브(cryotubes)에 넣고 냉동 용액(80% dFCS-20% DMSO (시그마)) 500 ㎕를 첨가하였다. 따라서, 세포들은 90% FCS-10% DMSO 용액 1 ㎖에 보존된다. 온도가 천천히 내려가도록 하기 위하여 크라이오튜브(cryotubes)를 이소프로판올을 포함하는 냉동 접시에 위치시키고, -80℃에 두었다.
세포를 37℃ 수조에서 해동시켰다. 튜브를 개방하기 전에 알콜로 세척하였다. 세포들을 재빨리 50 ㎖의 RPMIc-10% dFCS로 옮기고 4℃에서 7분 동안 1400 rpm으로 원심 분리한 다음, RPMIc-10% FCS로 두 번의 세척을 하였다.
배양 유지
세포(PBMC) 배지를 5% CO2를 포함하는 습한 대기(37℃)에서 배양하였다. 사용되는 배양 배지는 1% L-글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 1% 소디움 피루베이트(sodium pyruvate), 1% 비필수 아미노산(시그마) 및 56℃에서 30분간 가열하여 보체 제거된(dFCS) 10% 우태아 혈청(Biowest, Nuaille, 프랑스)이 공급된 RPMI 1640(Gibco, Rockeville, MD)로 구성된다.
세포 자극
세포 현탁액(PBMCs 또는 비장 림프구)을 해동하였고 트리판-블루(trypan-blue) 집계를 하였다: 세포 농도는 1×106 세포/㎖로 조절하였다. 배양은 48-웰 플레이트(웰당 500 ㎕ 세포 현탁액) 또는 24-웰 플레이트(웰당 1 ㎖ 세포 현탁액)로 하였다. 세포를 플레이트에 넣은 후에, 시험될 여러 물질을 첨가하여 세포를 서로 다른 시간 동안 배양하였다. 세포 현탁액을 AT에서 10분 동안 6000 rpm으로 원심분리하여 상청액을 수거하였다. 그런 다음, 상청액을 에펜도르프(Eppendorf) 튜브에서 -20℃로 냉동하였다. 만약 특별한 지시가 없다면, 세포 분석을 위해 사용되는 Env-SU 및 LPS의 농도는 1 ㎍/㎖이다. 일부 실험에서, Env-SU 및 LPS를 30분 동안 끓였다. 폴리믹신(polymyxin) B(PB)은 25 g/㎖로 사용되었고, 완충 용액, LPS 또는 Env-SU의 첨가 전에 세포와 37℃에서 45분간 미리 배양되었다. 항체의 사용을 필요로 하는 실험을 위해서, 항체가 포함된 세포, 항체와 Env-SU, LPS 또는 완충 용액의 4℃ 또는 37℃에서의 전항온처리(preincubation)가 여러 기간의 시간에서 필요하다. 항-Env-SU(13H5A5 및 3B2H4) 및 항-Gag(3H1H6) IgG 단클론 항체(bioMerieux)는 마우스를 각각 재조합 Env-SU 또는 Gag 단백질로 면역화시킨 후 하이브리도마의 배양에 의해 수득되었다. 항-Env-SU 항체의 특이성은 ELISA로 증명되었다. 만약 특별한 지시가 없다면, 세포 분석을 위해 사용되는 13H5A5, 3B2H4 및 3H1H6의 농도는 30 ㎍/㎖이다.
동물 모델
마우스의 관리
5 또는 6주된 C57B16, Balbc 또는 SCID 마우스(Charles River, L'Arbresle, 프랑스)를 구입하여 쉬게 하면서 일주일 동안 보관하였다. 상기 마우스를 24℃인 멸균 여과 우리에 가두었다. 모든 조작은 층류 후드 하에 실행된다.
SCID
마우스의 인간화 및
C57B16
마우스의 생산
일 주일의 적응 기간 후에, 페놀 레드(Eurobio, Les Ulis, 프랑스)가 없고 농도 0.25 ㎎/㎖인 겐타마이신(gentamycin)이 공급된 RPMI 2 ㎖에서의 50×106 신선한 인간 PBMCs를 SCID 마우스에 복막내(IP) 주입하였고, 다시 일 주일 쉬게 하였다. 우수한 인간화(humanization)를 보장하기 위하여, 항-NK 항체 50 ㎕(생리 식염수 25 마이크롤(microl)에 희석된 순수한 항체 25 ㎕)를 PBMCs의 주입 이틀 전에 RO 경로를 통하여 주입하였다. 인간화 과정의 일주일 후에, 각 마우스로부터 RO 경로를 통하여 혈액 샘플을 획득하여 혈청은 마우스의 인간화 정도를 평가할 수 있도록 하기 위하여 -80℃에서 보존하였다 .
일 주일의 적응 기간 후에, 페놀 레드(Eurobio, Les Ulis, 프랑스)가 없고 농도 0.25 ㎎/㎖인 겐타마이신(gentamycin)이 공급된 RPMI 2 ㎖에서의 50×106 신선한 마우스 비장 림프구를 C57B16 마우스에 복막내(IP)로 주입하였고, 다시 일 주일 동안 쉬게 하였다. IP 주입 동안에, SCID 마우스에서처럼 C57B16 마우스에서, 유체는 재빨리 다수 흡수되었지만, 일부 손실이 관찰되었다.
인간화된
SCID
마우스에서 인간
IgGs
의 분석
SCID 마우스의 혈청에서 인간 IgGs의 분석은 제조자의 지시에 따라 방사상 면역확산법으로 실행하였다(결합 부위, Birmingham, 영국). 겔에 대한 혈청의 침착 후 96 h에 침전물의 직경의 측정은 교정 그래프를 수단으로 그 직경의 제곱을 시험된 샘플의 IgG 농도와 연관시키는 것을 가능하게 한다.
마우스에서 취해진 여러 물질 및 샘플의 주입
D0에, 단백질(Env-SU), 독소(LPS) 또는 완충 용액를 생리 식염수 1 ㎖에 원하는 농도로 희석한 후에 상기 물질들을 IP 주입으로 마우스에 주입하였다(Fresenius Kabi, Bad Homburg, 독일). 항-Env-SU 또는 항-Gag 항체의 주입을 위해, 상기 항체들을 Env-SU, LPS 또는 완충 용액과 4℃에서 3h 동안 미리 배양하였다. 대조 마우스에는 생리 식염수 1 ㎖를 주입하였다. 샘플은 몇 시간(1h, 2h) 또는 몇 일(24, 48, 72 h) 후에 채취하였다. 마우스를 에테르로 마취시킨 후, 최대량의 혈액(약 1 ㎖)을 파스퇴르 피펫을 사용하여 레트로오비탈(retroorbital)(RO) 경로를 통해 획득하였다. 생리 식염수 2 ㎖를 복막내(IP) 동공을 통해 주입하고, 복부를 마사지한 후에, 최대량(1 내지 1.5 ㎖)의 유체를 인출하였다. 마지막으로, 경추탈골에 의해 마우스를 안락사시키고 비장을 적출하였다. 사용되는 여러 프로토콜은 도 12, 13 및 14에 도시되어 있다. 실험이 끝날 때까지 모든 마우스를 임상적으로 관찰하였다. 특히, 염증 신호 및 신경 시스템 손상의 신호를 관찰하였다.
마우스로부터
수득된
샘플의 처리
적출된 비장을 두 조각으로 나누었다. 그 일부를 RPMI에서 스크린 상에 분쇄함으로써 부유시켰다. 4℃에서 10분간 1200 rpm으로 원심분리한 후, 세포들을 4℃ PBS에 담은 다음, 원심분리하고 냉동 용액(10% DMSO-90% FCS) 1 ㎖가 담긴 크라이오튜브(cryotube)에 넣어 냉동하였다. 비장의 다른 부분은 에펜도르프에 넣어 -80℃로 상기처럼 냉각하였다. 세포 펠렛을 제거하기 위하여, 복막 내에서 인출된 유체를 AT에서 10분간 6000 rpm으로 원심 분리한 다음, 에펜도르프에 넣어 -80℃로 냉각하였다. PMS에서 세척한 다음, 복막 동공에서 적출된 세포를 냉동하였다. 혈청을 회수하기 위하여, 혈액을 AT에서 10분간 6000 rpm으로 원심분리하였다. 그 혈청 및 세포 펠렛을 분리하여 에펜도르프 튜브에 넣고 -80℃로 냉각하였다.
결과의 처리
세포 표지 및 세포 흐름 측정
세포 현탁액을 해동하고 세포들을 PBS-2% dFCS-1mM EDTA 50 ㎖에 옮긴 다음, 4℃에서 7분간 1400 rpm으로 원심분리 하였다. 트리판-블루 집계를 실행하였고 세포들을 96-웰 플레이트에 넣었다(약 1×106 세포/웰). 플레이트를 4℃에서 1분간 4000 rpm으로 원심분리한 후, 상청액을 제거하고 표면 표지 항체의 칵테일(PBS-2% dFCS-1mM EDTA에서 희석) 50 ㎕를 각 웰에 첨가하였다. 세포들을 재분배시키고 4℃에서 30분 배양하였다. 그런 다음, 웰(well)마다 PBS-2% dFCS-1mM EDTA 100 ㎕를 첨가함으로써 세포들을 세척하였고 4℃에서 1분간 4000 rpm으로 원심분리 하였다. 상청액을 제거하고 PBS-2% dFCS-1mM EDTA 200 ㎕을 웰당 첨가하였다. 세포들을 재분배하고 FACS 분석을 위해 튜브로 옮겼다(도 15). 스트렙타비딘(streptavidine)-APC 두 번째 표지를 필요로 하는 항체를 위해, 같은 주기를 한 번 더 반복하였다. 항체(Pharmingen, San Diego, CA) 및 마우스 세포의 표지를 위해 사용되는 희석물은 CD3-FITC(1/500), CD4-PE(1/1000), CD8-시토크롬(1/600), CD25-APC(1/1000), CD69-APC(1/500, 시작시에 비오티닐화됨)이다. 인간 세포 표지를 위해, 각 항체: CD3-시토크롬, CD4-APC, CD8-PE, CD25-PE, CD69-FITC 2 ㎕가 사용된다.
사이토카인 분석
배양 상청액, 혈청 및 복막내 세척에서 획득한 유체를 ELISA로 사이토카인을 분석하기 전에 -20℃로 보관하였다. ELISA에 의한 인간 또는 마우스 사이토카인(TNF-α 및 IL-6) 분석을 제조자(Pharmingen)의 지시에 따라 실행하였다.
(
TLR4
활성화 경로를 통해)선천성 면역의 세포 수준에서
MSRV
외피 단백질에 의해 유발된
전염증성
효과를 억제하는 항-외피 항체의 선택
Env-SU 단백질의 존부시에, 사이토카인(IL-6 및/또는 TNF-알파)의 분석을 통해 bioMerieux의 단클론 항체 연구소에서 생산된 여러 항-MSRV/HERV-W 외피 항체를 정상 공여자로부터 획득된 혈액 단핵 세포(PBMCs)의 배양 배지에서 시험하였다. 이는 하이브리도마 3H10F10, 13H5A5, 6A2B2, 2A12A5, 3C1D5 및 3B2H4에 의해 형성된 항체를 사용하여, 본 발명에 따른 프로토콜에 따른 "TLR4" 수용체에 의해 증명되는 경로를 통해서 정상 공여체로부터 획득된 혈액 단핵 세포(PBMCs)의 배양 배지에 존재하는 단핵구/대식세포의 활성화에 대한 그 효과를 측정하기 위한 것이다.
어떤 항-Env 항체는 이러한 분석에서 검출할 수 있는 억제 활성을 나타내지 않았고(6A2B2 및 2A12A5), 중간 정도의 억제 활성을 나타냈으며(3C1D5) 또는 여러 공여자의 PBMCs로 실행된 실험에 따른 것과 동일하지 않은 활성을 나타냈다(3H10F10). 이러한 분석의 예는 도 15(15a, b, c 및 d)에 도시되어 있으며, 상기 도면은 여러 실험에서 Env-SU 단백질에 의해 생산된 전염증성 활성에 대한 이러한 항체의 효과를 나타낸다.
또한, Env-SU 단백질에 대한 억제 활성이 없는, 하이브리도마 2A12A5에 의해 생산된 것과 같은 항체는 역설적으로 심지어 Env-SU 단백질 부재시에도 비특이적인 면역자극을 생산하였다.
이러한 같은 분석에서 시험된 대조 항체, 특히 항-Gag 항체 3H1H6는 어떤 특별한 억제 또는 자극 활성을 나타내지 않았다.
하이브리도마 13H5A5 및 3B2H4에 의해 생산된 항-MSRV/HERV-W Env 단클론 항체는 어떤 역설적인 전염증성 효과 또는 여러 정상 공여자의 PBMCs로 실행된 분석 사이의 어떤 중요한 변화없이, 여러 정상 인간 공여자의 PBMCs에 대한 Env-SU 단백질의 효과에 대하여 일정한 억제 효과를 가지는 것으로 증명되었다.
항체 3B2H4 및 13H5A5의 억제 활성 및 항-MSRV GAG 항체 3H1H6의 효과의 부재의 예는 도 15a에 도시되어 있다. 억제 특이성의 조건은 이러한 항체가 어떤 효과도 가지지 않는 활성화 경로를 자극하는 다른 리간드(LPS)와의 관계에서 검증되었다. 도 15b는 Env-SU 단백질에 의한 활성화의 특이성의 조건이 동일한 조건에서 생산되고 정제된 대조(mock) 단백질의 효과의 부재 및 박테리아 LPS로 사용되는 Env-SU 샘플의 오염의 부재를 확인시키는 테스트에 의해 유효화됨을 나타낸다(100℃로의 가열에 의한 억제, 이는 단백질을 변성시키지만 LPS는 그렇지 않으며, 폴리믹신 B의 억제의 부재, 이는 LPS의 효과를 억제한다).
따라서, bioMerieux에 의해 생산된 여러 단클론 항체를 MSRV/HERV-W 외피 단백질에 대하여 시험한 후, 본 발명에서 성립되고 개발된 세포 분석은 TLR4 경로를 활성화 시키는 전염증성 효과를 억제할 수 있는 항체를 확인하고, 억제성 항체들 중에서 100%에 가까운 억제 가능성을 가진 항체들을 선택하는 것을 가능하게 한다. 이러한 항체들 중에서, 항체 3B2H4 및 13H5A5가 바람직하다. 이러한 항체들 또는 상기한 것처럼 관련 분야의 숙련된 자의 범위 내의 종래 기술에 의해 생산될 수 있는 다른 항체들 역시 확인된다.
기능성 인간 림프구 시스템이 이식된 동물 모델에서, 인간 면역 시스템에 대한
MSRV
Env
단백질의 효과
- 마우스의 생산:
이하의 실험은 6주가 된 암컷 C57B16 마우스 17마리를 사용하였다. 첫 번째 단계는 복막 내로 50 밀리온(million)의 인간 PBLs을 주입하는 것으로 구성된다. 마우스들은 이미 방사선 조사가 되었으며 항-NK 항체가 주입되었다(Firouzi 외, Journal of Neurovirology 2003). 면역 시스템의 안정화를 위해 필요한 시간을 위해 일주일 동안 마우스를 쉬게 하였다.
인간 PBLs의 제조
세포 현탁액을 50 ㎖ 튜브에서 함께 분쇄하였고 4℃에서 10분간 1200 rpm으로 원심분리 하였다. 세포 펠렛을 약 4 ㎖의 생리 식염수에 넣었다. 트리판-블루 집계를 실행하였으며 세포의 농도를 조절하였다. 겐타마이신을 0.2 ㎎/㎖ 농도로 첨가하였다. 마지막으로, 50×106 세포 500 ㎕를 17 마리의 C57B16 마우스 각각에 복막내로 주입하였다. 배양 배치(batch)의 구성:
마우스를 3 또는 4마리의 그룹으로 나누었다. 형성된 각 배치(batch)는 다음의 방식으로 명명된다:
- ENV1 완충 용액가 주입될 음성 대조구에 대해 3 * "C".
- LPS가 주입될 염증성 반응을 위한 양성 대조구에 대해 3 * "LPS".
- MSRV 바이러스의 외피 단백질 용액이 주입될 배치(batch)에 대해 3 * "Env".
- (바이러스 복제 부재시에 비리온의 외피 단백질의 효과를 테스트하기 위하여)56℃에서 30분간 가열함으로써 비활성화된 MSRV 바이러스로 감염될 배치(batch)에 대한 4 * "2GR412".
- (바이러스 혈증(viremic) 공여체를 포함하는 유도된 산물의 수혈을 위한 혈액 풀(blood pool)의 경우에, 이러한 비리온으로 생물학적 샘플의 어떤 가능한 오염의 효과를 평가하기 위하여)열로 불활성화되고 음성 대조구에서 상당히 희석된 GRE 바이러스로 감염될 배치(batch)에 대한 4 * "GRE".
각 배치의 마우스는 단일 IP 투여로 적절한 양의 용액으로 감염되었다(LPS 및 Env의 양은 PBMCs에 대한 분석을 위해 사용된 농도에 일치한다). 그 용액은 다음의 방식으로 적정될 것이다:
"LPS": 50 ㎍/마우스; "Env": 50 ㎍/마우스(500 ㎕의 주입); "2GR412" 및 "GRE": 100 ㎍ 초원심분리 펠렛/마우스.
모든 필요한 희석물은 멸균된 생리 식염수로 제조된다.
관찰 및 샘플:
D+1h/D+2h/D+24h/D3: 희생 및 샘플.
각 그룹에서, 한 마리의 마우스를 안락사시켰다. 생리 식염수 2 ㎖를 복막내에 주입하고, 복부를 가볍게 두드린 다음 최대량의 유체를 인출하였다(최대 1-1.5 ㎖). 가능성이 있는 세포 펠렛을 제거하기 위하여 현탁액을 원심분리(6000 rpm/10분/AT) 하였고, 에펜도르프 튜브에서 -80℃로 냉동하였다.
파스퇴르 튜브로 레트로오비탈 경로를 통해서 획득된 최대량의 혈액을 헤파린(heparin) 튜브에 넣었다. 혈액을 AT에서 10분간 6000 rpm으로 원심분리 하였다. 혈장 및 세포 펠렛을 회수하여 각각 에펜도르프 튜브에서 -80℃로 냉동하였다.
적출된 비장을 두 부분으로 나누었다. 한 부분은 (FACs에 의해 인간 및 마우스 표현형을 실행하기 위하여) 현탁액으로 만들었다: 약 10 ㎖ RPMI에서 스크린 상에 분쇄하고, 1200 rpm/4℃/10분으로 원심분리하며, 약 15 ㎖ PBS/4℃로 세척하고, 원심분리하며, 크라이오튜브(cryotube)에서 냉동 용액(10% DMSO-90% FCS) 1 ㎖로 냉동한다. 또한, 다른 부분은 (가능한 PCR을 위해) 상기에서처럼 에펜도르프에서 -80℃로 냉동하였다.
이러한 공정은 만약 치료 신호가 일찍 나오지 않으면 24h 및 48h 후에 실행된다(마우스를 관찰하고 죽기 전에 회수한다). "2GR412" 및 "GRE" 배치(batch)의 남아있는 두 마리 마우스는 15-20일 후에 안락사시키거나 이보다 일찍 죽으면 죽은 뒤 바로 즉시 회수하였다.
이러한 샘플의 분포는 즉시(2h), 조기(24h) 및 지연된(10-15일) 면역 반응을 관찰하는 것을 가능하게 한다.
생물학적 유체 샘플을 인간 및 마우스 사이토카인(IL-6 및 TNF-α)에 대하여 분석하였고 또한 "Env" 단백질에 대한 분석을 하였으며 및/또는 ELISA 및 세포 배양에 대한 생물학적 검정에 의해 바이러스에 대하여 적정되었다.
이러한 분석은 면역 반응: 염증(사이토카인) 및 세포 분포(FACS)를 평가하는 것을 가능하게 하고, 어떤 바이러스 복제에 대한 검출을 가능하게 한다(ELISA, 생물학적 검정법).
치료 관찰
실험이 끝날 때까지 모든 마우스를 임상적으로 관찰하였다. 염증의 신호 및 신경 손상의 신호를 특히 관찰하였다.
결과:
이런 관찰의 목적은 이미 실행된 유용성 연구에 의해 측정된 변수를 수단으로 인간화된 SCID 모델에 대한 Env-SU의 성질을 생체 내에서(in ivo) 연구하는 것이다.
PBMCs
의 배양 배지에 대한
Env
-
SU
의
전염증성
효과
처음에, 본 연구자들은 인간 PBMCs의 배지에서 Env-SU 및 LPS에 의해 유발된 TNF-α의 생성 속도를 연구하였다. 그 단백질 및 독소는 1 ㎍/㎖ 농도로 사용되었다(도 16). 사이토카인의 생성은 2h 후-주입에서 피크에 도달하였고 그런 다음 점차적으로 감소하여 48h 후에 0이 되는 것을 관찰할 수 있었다. Env-SU를 사용하여 TNF-α 후-주입을 검출하는 것은 매우 중요하다. 특히, 완충 용액으로 배양된 세포들은 단지 매우 적은 양, 즉 2h에 겨우 30 pg/㎖에 해당하는 TNF-α를 생산한다. Env-SU를 사용하여 자극하는 경우 2h, 24h 및 48h 후-자극 각각에 대하여 550, 350, 160 pg/㎖를 생산하였다. LPS의 작용은 조금 더 크며, 2h, 24h 및 48h에 650, 180, 50 pg/㎖을 생산한다. 이러한 연구로부터 이미 밝혀진 것처럼, PBMCs에 대한 Env-SU의 전염증성 특성을 확인할 수 있다. 또한, TNF-α의 생산은 2h 후-주입에서 최대인 것을 관찰할 수 있다. 이러한 데이타는 SCID 모델에 대한 연구를 위해 채택될 샘플링의 속도, 즉 2h, 24h 및 48h를 결정하는 것을 가능하게 한다.
인간화된
SCID
마우스(
SCID
-h)에서
Env
-
SU
의
전염증성
효과
여러 인간 및 마우스 세포 배양에서 Env-SU 단백질에 의해 유발된 전염증성 효과를 관찰한 후에, SCID-hu 마우스에서 이러한 동일한 물질의 생체 내 병원성을 평가하였다.
레트로오비탈 경로를 통해 항-NK 50 밀리리터를 주입한 후에 16마리의 마우스에게 50×106 인간 PBMCs를 복막내에 이식하였다. 일 주일 후, 마우스의 인간화를 확인할 목적으로, 혈청에서 인간 IgGs를 분석하기 위하여 각각의 마우스로부터 혈액을 채취하였다. 방사상 면역확산 분석을 통해서, 모든 SCID-hu 마우스의 혈청에서 인간 IgGs의 농도가 4.5 ㎎/l 이상인 것을 확인할 수 있었다. SCID-hu 마우스에서 IgG 반감기는 12일이다. 따라서, 마우스의 인간화가 성공적이었다고 단언할 수 있었다.
그런 다음, 마우스를 5개 배치(batch)로 나누었고, 각 배치는 생리 식염수 2 ㎖로 희석된 완충 용액 0.2 ㎖, Env-SU 50 ㎍ 또는 LPS 50 ㎍가 각각 주입된 세 마리의 마우스를 포함한다. 각 배치의 마우스 중 한 마리를 주입 후 2h, 24h 및 48h에 안락사시켰다. 모든 마우스는 생존하였고 희생될 때까지 어떤 신경 시스템의 외부 신호를 나타내지 않았다.
인간 및 마우스 TNF-α 및 IL-6 사이토카인을 ELISA로 분석하였다. 도 17의 결과는 인간 또는 마우스 사이토카인의 생산이 같은 경향을 따른다는 것을 보여준다: 갑자기 2h 후-주입에서 검출되었고, 그런 다음에는 다음 날에 0이 되었다. 결국, 이러한 동역학은 PBMCs에 대해 시험관 내에서 관찰된 결과와 동일하다. 완충 용액이 주입된 마우스는 상당한 양의 사이토카인을 생산하지 않았다. 마우스 TNF-α분석에서는 단지 하나의 큰 피크가 나타났다: LPS가 주입된 마우스는 혈청에서 1000 pg/㎖ 보다 더 큰 수준의 TNF-α 농도를 나타냈다. 마우스 IL-6을 분석했을 때, Env 또는 LPS가 주입된 마우스의 IP 유체에서 약 20,000 pg/㎖ 농도에 도달하였다. 이러한 Env 또는 LPS의 마우스 혈청에서의 농도는 각각 6200 pg/㎖ 및 20,000 pg/㎖ 이상에 달한다.
인간 사이토카인 분석으로 사이토카인이 혈청에서 보다도 IP 유체에서 더 높다는 것을 알 수 있다. 이는 마우스가 단백질 및 독소의 투여 전 약 10일 정도에 이식된 이래로, PBMCs가 비장 및 2차 림프기관으로 이동하고 성장할 시간이 짧기 때문이다(이동하는 세포의 양은 상대적으로 낮다). 또한, Env-SU는 주로 조직에서 대식세포로 빠르게 분화하는 단핵구를 표적으로 한다. 이러한 세포들은 매우 접착성이 있으므로 2차 림프 기관에서 성장하기보다는 우선적으로 복막에 접착한다. 따라서, 세포의 이식 장소인 복막 내(IP) 동공에서 사이토카인의 많은 양을 발견하는 것이 논리적이다.
인간 TNF-α 분석으로부터 Env-SU가 주입된 마우스의 IP에서 그 농도가 1400 pg/㎖ 및 LPS가 주입된 마우스의 IP에서 그 농도가 3000 pg/㎖ 및 혈청에서 그 농도가 1200 pg/㎖에 달하는 것을 밝혔다. 같은 경향은 IL-6 분석에서도 관찰되었으며, Env-SU가 주입된 마우스에서 그 농도가 1700 pg/㎖ 및 LPS가 주입된 마우스의 IP에서 그 농도가 9600 pg/㎖ 및 혈청에서 그 농도가 1400 pg/㎖에 달하는 것을 밝혔다.
SCID-hu 마우스에서 마우스 사이토카인을 분석하는 결정은 그 마우스가 T 및 B 림프구가 부족하기 때문에 놀라운 것이었다. 그러나, 단핵구-대식세포 집단은 활성을 나타내고 이러한 마우스에서 TNF-α 및 IL-6의 생산에 기여한다. 따라서, 검출된 마우스의 IL-6 농도는 항상 인간 IL-6 농도보다 더 크며, 이는 TNF-α의 경우에는 그렇지 않다. 따라서, 이러한 점은 이러한 SCID 모델에서 기능성 림프구 부재시에, 선천성 면역 성분에 대한 MSRV 외피의 직접 효과를 생체 내에서 완벽하게 나타낸다(마우스 성분에 대하여).
본 연구의 목적은 인간 PBMCs에 대한 시험관 내에서 재조합 외피 단백질, 즉 Env-SU의 병원성 효과를 증명한 후에, 그 재조합 외피 단백질과 연관된 병원성을 생체 내에서 평가하는 것이었다. TNF-α 및/또는 IL-6의 상당하고도 분리된 생산(2h 후-주입)을 특징으로 하는 Env-SU 및 LPS의 전염증성 효과는 SCID-hu 마우스에서 관찰되었다. 획득된 결과에 이어, C57B16 마우스에 대한 선행의 "기술적인" 유연성 연구에서 마우스 모델에 대하여 개발된 것처럼, 샘플을 채취하고 인간화된 SCID 마우스에 사용하기 위해 사이토카인 생산량(혈청 및 IP 세척에서)을 분석하기 위한 실험 프로토콜을 확인하는 것이 가능하다.
EAE
모델
EAE 모델은 미엘린 결정인자에 직접 대항하는 자가 면역의 말초 유도에 기초한 다발성 경화증의 동물 모델이다.
이러한 모델은 현재까지 다발성 경화증의 치료를 위한 치료 분자의 "임상 전" 검증을 위한 모든 프로토콜을 위해 사용되는 참조 모델이다.
이러한 모델은 자가 반응 T 림프구의 존재 및 심각한 신경계 장애가 되는 탈수초화를 특징으로 한다.
그 발생은 백일해 독소(pertussis toxin)의 첨가와 함께, 적절한 첨가제(프로인트 완전면역보강제)에 결합된 미엘린 펩티드로 C57b16 마우스에 주입하는 것에 기초한다.
불활성화된 항산균(mycobacteria)으로 구성된 상기 첨가제는 주입된 미엘린에 대한 내성을 파괴하고 자가 반응 T 림프구의 발생을 촉진시킨다.
상기 백일해 독소는 혈액-뇌 장벽의 개방을 촉진할 뿐만 아니라 내성을 파괴하는 역할을 한다.
Env-SU는 TLR4 수용체를 통해서 선천성 면역을 활성화시키고 Th1 형태 림프구 반응의 발생을 유도할 수 있다는 것을 알 수 있다. 따라서, Env-SU는 자가 면역의 메카니즘을 유발하는 첨가제의 역할 및 MS와 연관된 탈수소화의 역할을 할 수 있다. 이러한 가능성 있는 역할은 EAE 모델에서 연구되었다.
세 개의 서로 다른 실험을 실행하였다.
1- 예비 실험
물질 및 방법
종래에 다발성 경화증 모델 "EAE"를 위해 일반적으로 사용되는 프로인트 완전면역보강제(불활성화된 항산균)의 활성 성분을 MSRV 외피 단백질의 Env-SU 분획으로 치환하였다.
물질
C57B16 마우스(Charles River) 8 마리;
네오시스템(Neosysten)으로부터 미엘린 펩티드 MOG(미엘린 희소돌기아교세포 당단백질) 35-55 이뮤노그레이드(immunograde);
시그마(Sigma)로부터 프로인트 완전면역보강제(CFA);
시그마(Sigma)로부터 프로인트 불완전면역보강제(IFA);
칼바이오캠(Calbiochem)으로부터 백일해 독소(염이 없는 백일해 유발균); 및
프로페인 엑스퍼트(Protein Expert)로부터 Env-SU.
방법
이하 물질 200 ㎕의 피하 주입하고:
- 양성 대조구:
- 150 ㎍ MOG + CFA: 3마리 마우스를 시험함.
- 음성 대조구:
- 150 ㎍ MOG + IFA: 2마리 마우스를 시험함.
- Env-SU:
- 150 ㎍ MOG + IFA + Env-SU(50 ㎍): 3마리 마우스를 시험함.
그런 다음, D0 및 D2에 백일해 독소(200ng) 200 ㎕(IV)의 주입한다.
신경계의 신호를 매일 측정한다.
관찰된 신경계 신호에 따라 이하의 여러 단계가 기술된다.
0 단계는 어떤 임상 신호도 나타내지 않고,
1 단계는 부드러운 꼬리를 나타내고,
2 단계는 걷기에 문제를 나타내고,
3 단계는 뒷 다리에 부분적인 마비 증상을 나타내고,
4 단계는 뒷 다리의 전체적인 마비 증상을 나타내고,
5 단계는 뒷 다리의 전체적인 마비 증상 및 앞 다리의 부분적인 마비 증상을 나타내며,
6 단계는 동물들이 다 죽어 가거나 또는 죽었다.
결과:
- MOG(150 ㎍) + CFA: 3마리 중에서 2마리에서 질병이 발생함(4 단계).
- MOG(150 ㎍) + IFA: 어떤 신호도 관찰되지 않음.
- MOG(150 ㎍) + Env-SU(50 ㎍): 3마리 중에서 3마리 모두 질병이 발생함(1 단계에서 6 단계).
이러한 예비 연구의 결과는 도 18에 도시되어 있다.
이러한 예비 연구는 TLR4 수용체를 통해서 면역 시스템을 활성화시키는 Env-SU가 MS 모델, EAE의 발생을 위한 첨가제로서 사용될 수 있다는 것을 보여준다.
"종래" 첨가제(CFA)를 가진 양성 대조구는 본 실험의 정당성을 입증한다. 자가 면역을 유발할 가능성이 없는 불완전한 첨가제(IFA)를 가진 음성 대조구는 자가 면역 반응을 유도하기 위하여 특정 경로에 따른 면역 시스템을 유발할 필요를 입증한다.
따라서, 이러한 예비 단계로부터, MSRV/HERV-W 레트로바이러스의 Env 단백질은 EAE 모델를 위해 일반적으로 사용되는 "실험적인" 첨가제와 같이 중추 신경계에 영향을 미치는 자가 면역 민감화를 유발할 수 있다는 것이 명백하다.
그 활성 성분이 결핵균의 용해질인 CFA와의 주요한 차이점은 이러한 박테리아가 인간의 다발성 경화증과 전혀 관계가 없는 반면, MSRV 레트로바이러스 및 그 HERV-W 과(family)의 유전적인 유사체가 인간에서 다발성 경화증과 명백히 관련이 있다는 것이다[2, 7, 8, 10, 61-63]. 또한, 이러한 외피 단백질을 품고 있는 비리온의 생물학적 유체에서 발현 및 순환은 질병의 발전과 관련이 있다[10].
결과적으로, 이러한 예비 단계로부터, 이러한 레트로바이러스 과(family)의 Env 외피 단백질의 "자가 면역-유도" 면역화 가능성을 억제할 수 있는 어떤 치료제는 시험관 내 세포 분석에 의한 본 발명에서 기술된 것과 같은 항-염증 효과에 대하여 억제 활성으로 선택된다면 특히 바람직하다. 사실상, MSRV/HERV-W Env 단백질에 직접 대항하는 단클론 항체는 이러한 단백질이 MS를 앓고 있는 환자에서 검출할 수 있는 비리온의 표면에서 발현될 때 이러한 단백질의 "자가 면역-유도" 효과의 억제제이다[8, 10, 62]. 인간 치료에서 상기 억제제의 용도는 명백하며, 특히 류마티스 관절염의 치료를 위해 처방된 상표명 REMICADE로 판매되는 항-TNF 알파 항체와 같은 인간 치료를 위해 허가받고 판매되는 치료 항체에 대한 공지된 방법에 따라 관련 분야의 숙련된 자의 범위 내에 존재한다. 또한, 상업적으로 구입할 수 있는 이러한 항체는 전염증성 활성화 연쇄 반응의 "하부" 산물을 표적으로 하는데 비해, 본 발명에 따른 항체의 치료 표적은 특히 TLR4를 통한 TNF-α 유도 전에 억제 한다는 것이 매우 흥미롭다.
또한, 현재 MS 치료제로 제안되는 치료제(코르티코스테로이드, 인터페론 베타 등)는 단지 면역 생리학적 연쇄 반응의 개시에 이어 생산된 전염증성 성분의 제한된 부분에만 작용하며, 이는 환자의 치료에서 부분적이고 상대적인 효율성을 설명한다는 것을 인지하는 것이 중요하다.
다른 한편, TLR4 수용체 경로의 활성화 및 이러한 초기 단계에 관계된 선천성 면역의 활성화 전에 MSRV/HERV-W Env 단백질의 1차 효과를 억제함으로써, 이러한 단계에서 존재하는 면역 생리학적 작용제만이 억제되고, 더 이상 이러한 경로의 1차 활성화 후에 분비되는 다수의 전염증성 산물이 억제되는 것은 아니다(도 8). 이러한 "생물학적" 이점은 환자에게서 유효성을 위한 독특한 가능성을 제공하고, MS의 원인 병리론에서 "주요" 작용제를 목표로 하며 유효성이 인간 MS 질병과 관련이 없는 결핵균(프로인트 완전면역보강제에서 결핵균)으로 유발된 EAE 모델에서 측정되는 활성화의 부산물 중 하나가 아니다.
2-실험 2
관찰되는 예비 결과를 확인하기 위하여 같은 형태의 실험을 실행하였다.
방법
이하 물질 200 ㎕의 피하 주입하고:
- MOG(150 ㎍) + CFA: 4마리 마우스를 시험함.
- MOG(150 ㎍) + IFA: 3마리 마우스를 시험함.
- MOG(150 ㎍) + IFA + Env-SU(50 ㎍): 4마리 마우스를 시험함.
- MOG(150 ㎍) + IFA + LPS(20 ㎍): 4마리 마우스를 시험함.
그런 다음, D0 및 D2에 백일해 독소 200 ㎕(IV)를 주입한다.
임상 신호의 측정
모든 마우스의 비장을 연속적으로 회수한 다음 세포 현탁액을 냉동하였다.
2 마리 마우스의 뇌를 회수한 다음 4% PFA로 관류(perfusion) 후에 냉동하였다(3 단계의 Env 마우스의 뇌; 0 단계의 LPS 마우스의 뇌).
특징적인 염증 손상은 Env 단백질이 주어진 마우스의 뇌에서 조직학적 분석에 의해 시각화되었지만, LPS의 주입이 이루어진 마우스의 뇌에서는 그렇지 않았다.
결과:
신경계 신호의 모니터링:
- MOG(150 ㎍) + CFA: 4마리 중에서 4마리 모두 질병이 발생함(2 단계에서 6 단계).
- MOG(150 ㎍) + IFA: 어떤 신호도 관찰되지 않음.
- MOG(150 ㎍) + Env-SU(50 ㎍): 4마리 중에서 4마리 모두 질병이 발생함(1 단계에서 5 단계).
- MOG(150 ㎍) + LPS(20 ㎍): 어떤 신호도 관찰되지 않음
예비 연구의 결과는 도 19에 도시되어 있다.
이러한 결과는 Env-SU가 EAE로 대표되는 MS 모델의 발생 동안 관찰된 신경계 신호의 유도에서 보조 역할을 할 수 있다는 것을 확인시켜 준다.
상기에 더하여 대조구 LPS(박테리아 리포폴리사카라이드)는 그것이 MSRV Env 단백질처럼 항원-제시 세포의 표면에서 같은 수용체, 즉 TLR4를 자극하기 때문에 사용하였다. 이러한 조건 하에서 LPS의 자가 면역 유도 효과의 부재는 Env 단백질의 면역 생리학적 가능성이 다른 TLR4의 면역 가능성보다 훨씬 더 크고, 논리적으로 이러한 단백질을 목표로 하는 억제제는 후자에 의해 활성화되는 어떤 경로를 비특이적으로 억제하는 분자보다 더 우수한 치료 수단일 것이라는 것을 확인시켜 준다.
기능성 연구:
비장을 해동하였고 비장 림프구를 시험관 내에서 MOG 펩티드로 재자극하였으며, 그런 다음 IFG-g의 생산량을 측정하였다(동역학 및 투여 반응).
2×106 비장 림프구/c-RPMI의 ㎖ + 10% FCS.
Env를 위해 3 마리 마우스 및 IFA 및 LPS를 위해 2 마리 마우스가 존재한다.
도 20은 특정 자가 항원 존재시에 T 림프구의 활성화를 신호하는 인터페론 감마의 양을 수단으로, MOG(투여 효과)의 투여량의 함수로서 반응을 나타내며 실제 자가 면역 반응은 이러한 조건하에서 TLR-4 경로를 특정적으로 자극하는 Env-SU 단편을 사용하여, MSRV-HERV-W Env 단백질에 의해 이러한 모델에서 유발되는 것을 명백히 보여준다. 이러한 MS 모델에서, T 림프구 반응은 초항원의 경우에서처럼 T 수용체(TCR)를 통해서 MSRV/HERV-W Env에 의한 직접 활성화가 원인이 아니라 본 발명의 수많은 결과에서 보여진 것처럼 선천성 면역(단핵구/대식세포, 수지상 세포 등)의 세포 수준에서 훨씬 더 상부의 활성화가 원인이다(IFN-감마 분비의 부재, 정제된 단핵구 및 수지상 세포의 자극, 어떤 기능성 마우스 림프구를 포함하지 않는 SCID 모델에서 마우스 "대식 세포" 사이토카인의 자극, LPS의 동역학과 비슷한 IL-6 동역학, IL-6 및 TNF-알파의 부재지만 인터페론 감마는 같은 조건하에서 참조 초항원 -SEB- 등에 의해 유발됨).
이는 또한 "EAE/MOG/Env-SU" 동물 및 프로인트 불완전면역보강제(IFA, 결핵균 추출물이 없음) 및 MOG를 가진 "Env가 없는" 대조구로부터 취해진 비장 림프구를 테스트하기 위하여 사용되는 배양 배지에 10 ㎍/㎖로 첨가된 미엘린 항원 MOG에 대항하는 자가면역 T 림프구 반응의 시간에 따른 동역학의 연구에 의해 확인된다. 이는 도 21에 도시되어 있으며, 상기 도면은 단지 Env-SU가 주어진 마우스에서만 시간의 경과에 따라 항-MOG 자가 면역 반응의 매우 중요한 진전을 보여준다.
따라서, 이러한 결과는 자가 항원과 연관된 Env-SU로의 자극은 항원-제시 세포(APCs, 단핵구/대식세포, 수지상 세포, 뇌 마이크로글리오사이트 등)에서 TLR4 수용체 수준에서 Env-SU에 의해 개시된 연쇄 반응의 하부를 허용하고, 매우 많은 양(그래프 참조)으로 방출된 인터페론 감마(IFN-g) 및 생체 내에서 이러한 T 림프구에 의해 매개되는 자가 면역의 단독 원인인 자가 반응 T 림프구의 발생을 허용한다.
3 - 실험 3
관측된 예비 결과를 확인하고, 항-Env-SU 항체(여기에서는 단클론 항체 3B2H4로 표현됨)의 (모델에서 측정된 치료 결과에 대한) 생체 내 치료 효과 및 동시에 등가의 특이성을 가지지 않지만 비슷한 표현형의 항체(여기에서는 항-GAG 단클론 항체 3H1H6로 표현됨)의 치료 효과를 테스트하기 위하여 같은 형태의 실험을 실행하였다.
방법
5 ㎍/㎖로 항체 200 ㎕, 즉 약 20 g인 마우스 당 항체 1 ㎍, 즉 ㎏ 당 50 ㎍의 피하 주입:
- MOG(150 ㎍) + CFA: 5마리 마우스를 시험함.
- MOG(150 ㎍) + IFA: 5마리 마우스를 시험함.
- MOG(150 ㎍) + IFA + Env-SU(50 ㎍): 5마리 마우스를 시험함.
- MOG(150 ㎍) + IFA + Env-SU(50 ㎍): 5마리 마우스를 시험함. 이러한 마우스들은 또한 Ab 3B2H4, IV 1㎎(200 ㎕)이 제공되며;
그런 다음, D0 및 D2에 백일해 독소(200 ng) 200 ㎕(IP)의 주입하고 임상 신호를 측정한다.
결과:
획득된 결과는 도 22에 도시되어 있다.
MS에서처럼 진행성 자가 면역의 발전에 더 가까운 조건을 테스트하기 위하여, 결과는 독소가 이전처럼 IV가 아니라 IP로 주입되기 때문에 이전의 조건보다 더 "적절한" 조건하에 획득되었다.
"MPG+CFA" 양성 대조구는 임상 신호를 가진 4/5 마우스에 해당하고, "MOG+IFA" 음성 대조구는 영향을 받은 0/5 마우스에 해당한다.
"MOG+CFA" 양성 대조구처럼, Env 단백질에 대한 평균 클리닉 스코어는 이전의 조건과 비교하여 감소하였다. 그러나, 항-Env 항체 존재시에 이러한 단백질의 병원성 효과의 순수한 감소는 처리된 마우스에서 관찰된 최소 손상에 의해 설명된다.
"항-Gag" 항체는 Env 단백질에 의해 유발된 면역 생리학적 효과에 어떤 억제 효과도 가지지 않고, 그 존재를 통해서 이러한 효과에 대한 조금의 가능성도 없는 반면, 항체 3B2H4는 관찰된 그래프가 "MOG+CFA" 음성 대조구의 그래프 쪽으로 가장 많이 이동하도록 유발하는 매우 명백한 억제 효과를 가진다. 따라서, EAE 타입의 "T 림프구-매개 자가 면역-유도" 효과의 생체 내 억제 효과는 3B2H4릍 통해서 항-MSRV/HERV-W Env 항체의 존재에 연결된다.
다발성 경화증 모델 "EAE"에서, 특히 측정되는 것은 치료 효과(신경계 손상)이고, 단지 연관된 생물학적 변수가 아니다. 따라서, 연구된 효과는 상기한 것처럼 더 이상 생물학적 효과가 아니라, 공헌한 병리학적 모델의 내용에서 치료 전이이다. 따라서, 여기에서 측정되는 것은 사실상 치료 효과이다. 인간 질병에 대한 어떠한 상당한 치료 유효화가 동물 모델에 대해 획득한 기준에 기초하여 인간에게도 실행되어야 하기 때문에 관련 분야의 숙련된 자는 이러한 것들이 인간 치료를 위한 "임상 전" 치료 유효화의 정성 한계라는 것을 알고 있다.
일단 후보 치료제가 확인되고 선택되며, 본 발명에서처럼 동물 모델이 발생하고 확인된다면, 실행된 일련의 테스트의 "정량적인" 확장은 임상전 기준을 만족시키기 위하여, 관련 분야의 숙련된 자에게 잘 알려져 있고 약동학적 연구에 공통인 적절한 대조구로 이미 획득된 수단 및 모델을 발생시키면서 실행될 수 있다.
획득된 구성 요소는 임상 전 유효화를 완성하고 인간의 치료 실험을 개발하기 위하여 필요하고 충분하다.
또한, MSRV ENV 및 HERV-W7q ENV(syncitin) 단백질의 아미노산 서열을 분석해보면 MSRV/HERV-W 과(family)에서 강한 동종성 및 주요 아미노산 모티프가 보존되어 있음을 알 수 있다. 이는 항-ENV 단클론 항체의 교차 반응성에 의해 반영된다(도 24). 서열 분석(참조. 도 25)은 또한 아미노산 122-131(일체를 포함) 및/또는 312-316(일체를 포함) 및/또는 181-186(일체를 포함)에 의해 정의된 구역에 대응하는 서열 ID NO:1에서 참조할 수 있는 ENV-SU의 서열에서 관심을 갖는 항원성 부위를 평가하는 것을 가능하게 한다.
결과적으로, MS의 이러한 동물 모델에서 MSRV/HERV-W 과(family)의 레트로바이러스의 Env 외피 단백질에 대항하는 단클론 항체 및 특히 세포 분석에서 TLR4 수용체에 의해 개시된 전염증성 경로에 대한 억제 특성으로 선택된 MSRV 원형의 단클론 항체는 면역 병리학적 가능성, 특히 레트로바이러스 과(family)의 ENV 외피 단백질의 "자가면역-유도" 면역 병리학적 가능성을 억제할 수 있는 치료제를 구성한다.
따라서, 이하의 것들이 증명된다:
1) 외피로 둘러싸인 MSRV 비리온은 다발성 경화증에 걸린 환자로부터 검출된다[4, 8, 10, 62, 64].
2) 그 발현은 질병의 진화와 관련이 있다[10].
3) MSRV Env 단백질에 대한 면역 생리학적 반응은 질병의 진행 및 심각성과 관련이 있다[65].
4) MSRV 비리온은 MSRV Env 단백질을 암호화하는 RNA를 소유한다[66].
5) MSRV/HERV-W 과(family)의 Env 단백질은 그 아미노산 서열 수준 및 그 아미노산을 암호화하는 유전 서열의 수준에서 매우 강한 상동성을 가진다[2, 5, 66].
6) 인간 염색체 7q21-22(HERV-W7q) 부위에서 HERV-W 카피(copy)에 의해 암호화되는 MSRV Env 단백질 및 Env 단백질은 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo)에서 전염증성 성질을 가진다(본 발명의 출원의 예 및 [11, 12, 59]).
7) MSRV Env 단백질은 미엘린으로부터 유발된 중추 신경계의 자가 항원의 존재시에 잘 알려진 다발성 경화증(MS), 즉 실험적 알레르기성 뇌척수염(EAE)을 재현할 수 있다(본 발명의 출원의 예인 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질, 즉 MOG).
8) 이러한 실험 모델은 인간의 다발성 경화증의 병인과는 어떠한 관계도 없는 결핵의 바이러스 동인인 결핵균의 항원성 추출물로 인위적으로 개시된다. 내인성 레트로바이러스 과(family) HERV-W에 속하는 MSRV 레트로바이러스의 외피 단백질을 가진 이러한 모델의 획득, 질병과 관련하여 비리온의 형태[8, 10, 62] 또는 MS의 특징인 탈수초화 증상으로 특히 표현되는 Env 단백질 형태[59, 67]로 검출될 수 있는 발현은 질병의 면역병인(immunopathogenesis)과 관련된 레트로바이러스를 표적으로 하는 치료제 연구를 가능하게 하는 새롭고 독특한 동물 모델을 구성한다.
9) 인간 세포에 대해 기술된 T 림프구의 활성화와 관련된 전염증성 효과 또한 인터페론 감마 생산을 위한 분석에 의해 증명된 것처럼, MSRV Env 단백질로 유도된 EAE 모델의 마우스 T 림프구의 수준에서 명백히 발견된다(본 특허 출원의 예).
10) MSRV Env 단백질의 전염증성 효과는 림프구 세포 및 항원-제시 세포에 의해 매개되고, 따라서 면역 시스템에 의해 매개된다(본 발명의 출원의 예, [11, 12]).
11) 항-MSRV Env 단클론 항체(3B2H4 및 13H5A5)는 인간 혈액 림프구 세포(림프구 및 단핵구)에 대한 MSRV Env 단백질의 전염증성 효과를 특정적으로 억제할 수 있다(본 발명의 출원의 예).
12) MSRV Env 단백질에 대항하는 단클론 항체(3B2H4)의 "특이적인 억제" 효과는 MSRV ENV로 유발된 EAE의 동물 모델에서 확인된다. 이러한 효과는 비처리된 동물 또는 같은 동형의 관련이 없는 항체로 처리된 동물과 비교할 때 뛰어난 치료 향상을 나타내었다(본 발명의 출원의 예).
항-MSRV/HERV-W Env 단클론 항체는 염증, 자가 면역 및 질병과 연관된 레트로바이러스제의 이러한 단백질로 유발된 신경계 치료 문제에 대하여 억제 효과를 가진다.
따라서, 시험관 내 및 생체 내에서 그 특성이 증명된 항체는 비변형된 형태 또는 생물학적 기술, 특히 유전 공학 기술로 향상된 형태로 인간 질병, 즉 다발성 경화증을 위한 새로운 치료제를 구성한다.
이러한 치료 항체의 임상 전 평가를 위해 적절한 세포 분석 및 동물 모델은 본 출원에 기술되어 있고 관련 분야의 숙련된 자가 인간에게 치료 시도를 하기 전에 필요한 검증 단계를 실행하고 그러한 치료 시도를 MSRV/HERV-W 레트로바이러스 과(family)와 연관된 여러 질병에 맞게 조절할 수 있게 해 준다.
<110> bioMerieux
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale (INSERM)
<120> Composition for treating pathology associated with MSRV/HERV-W
<130> IP2006770/FR
<160> 1
<170> KopatentIn version 1.71
<210> 1
<211> 287
<212> PRT
<213> virus MSRV/HERV-W
<400> 1
Ser Ser Ser Pro Tyr Gln Glu Phe Leu Trp Arg Thr Arg Leu Pro Gly
1 5 10 15
Asn Ile Asp Ala Pro Ser Tyr Arg Ser Leu Ser Lys Gly Asn Ser Thr
20 25 30
Phe Thr Ala His Thr His Met Pro Arg Asn Cys Tyr Asn Ser Ala Thr
35 40 45
Leu Cys Met His Ala Asn Thr His Tyr Trp Thr Gly Lys Met I1e Asn
50 55 60
Pro Ser Cys Pro Gly Gly Leu Gly Ala Thr Val Cys Trp Thr Tyr Phe
65 70 75 80
Thr His Thr Ser Met Ser Asp Gly Gly Gly Ile Gln Gly Gln Ala Arg
85 90 95
Glu Lys Gln Val Lys Glu Ala Ile Ser Gln Leu Thr Arg Gly His Ser
100 105 110
Thr Pro Ser Pro Tyr Lys Gly Leu Val Leu Ser Lys Leu His Glu Thr
115 120 125
Leu Arg Thr His Thr Arg Leu Val Ser Leu Phe Asn Thr Thr Leu Thr
130 135 140
Arg Leu His Glu Val Ser Ala Gln Asn Pro Thr Asn Cys Trp Met Cys
145 150 155 160
Leu Pro Leu His Phe Arg Pro Tyr Ile Ser Ile Pro Val Pro Glu Gln
165 170 175
Trp Asn Asn Phe Ser Thr Glu Ile Asn Thr Thr Ser Val Leu Val Gly
180 185 190
Pro Leu Val Ser Asn Leu Glu Ile Thr His Thr Ser Asn Leu Thr Cys
195 200 205
Val Lys Phe Ser Asn Thr I1e Asp Thr Thr Ser Ser Gln Cys Ile Arg
210 215 220
Trp Val Thr Pro Pro Thr Arg Ile Val Cys Leu Pro Ser Gly Ile Phe
225 230 235 240
Phe Val Cys Gly Thr Ser Ala Tyr His Cys Leu Asn Gly Ser Ser Glu
245 250 255
Ser Met Cys Phe Leu Ser Phe Leu Val Pro Pro Met Thr Ile Tyr Thr
260 265 270
Glu Gln Asp Leu Tyr Asn His Val Val Pro Lys Pro His Asn Lys
275 280 285
Claims (11)
- MSRV/HERV-W Env 단백질의 가용 분획(soluble fraction) 또는 상기 MSRV/HERV-W Env 단백질의 가용 분획(soluble fraction)을 위한 TLR4 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 (i) 항-MSRV/HERV-W Env-SU 항체 그룹 또는 (ii) 항-TLR4 항체 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 항체 및 약제학적으로 수용할 수 있는 운반체를 포함하고, 상기 항체들은 MSRV/HERV-W의 활성화에 의해 유발된 전염증성(pro-inflammatory) 연쇄 반응을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항에 있어서,약제학적으로 수용할 수 있는 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,상기 (i) 그룹의 적어도 하나의 항-MSRV/HERV-W Env-SU 항체 및 상기 (ii) 그룹의 적어도 하나의 항-TLR4 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,상기 (i) 그룹의 항-HERV-W Env-SU 항체는 항체 3B2H4, 13H5A5 및 3H10F10에서 선택되고 상기 (ii) 그룹의 항-TLR4 항체는 항체 HTA125인 것을 특징으로 하는 조성물.
- MSRV/HERV-W Env 단백질의 가용 분획(soluble fraction) 또는 상기 MSRV/HERV-W Env 단백질의 가용 분획(soluble fraction)을 위한 TLR4 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 (i) 항-MSRV/HERV-W Env-SU 항체 그룹 또는 (ii) 항-TLR4 항체 그룹으로부터 선택되고, MSRV/HERV-W의 활성화에 의해 유발된 전염증성(pro-inflammatory) 연쇄 반응을 억제할 수 있는 적어도 하나의 항체를 약제 제조에 사용하는 방법.
- 제5항에 있어서,상기 (i) 그룹의 적어도 하나의 항-MSRV/HERV-W Env-SU 항체 및 상기 (ii) 그룹의 적어도 하나의 항-TLR4 항체의 사용 방법.
- 제5항 또는 제6항에 있어서,상기 (i) 그룹의 항-HERV-W Env-SU 항체는 항체 3B2H4, 13H5A5 및 3H10F10에서 선택되고 상기 (ii) 그룹의 항-TLR4 항체는 항체 HTA125인 것을 특징으로 하는 사용 방법.
- 제7항에 있어서,MSRV/HERV-W와 연관된 질병의 치료를 위한 사용 방법.
- 제7항에 있어서,상기 질병은 다발성 경화증 또는 정신 분열증인 것을 특징으로 하는 사용 방법.
- 항체 3B2H4, 13H5A5 및 3H10F10 중에서 선택되는 항체.
- IL-6, IL12-p40 및 TNF-α에서 선택되는 사이토카인을 분석함으로써, 다발성 경화증 또는 정신 분열증을 앓고 있는 환자의 혈액 단핵세포의 반응성 상태를 측정하는데 MSRV/HERV-W Env-SU를 사용하는 방법.
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