CN1926153B - 抗tlr4抗体的制药用途 - Google Patents
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Abstract
本发明的组合物包括选自与MSRV/HERV-W的Env蛋白的可溶部分特异结合的或与MSRV/HERV-W Env蛋白包膜蛋白可溶部分的TLR4受体特异结合的抗Env-SU MSRV/HERV-W抗体组(i)，或者抗TLR4抗体组的至少一种类型的抗体。
Description
背景技术
几年来，许多研究已证明，在糖尿病[1]、多发性硬化(MS)[2]和精神分裂症(SCZ)[3]的病理学过程中存在各种逆转录病毒特别是内源性逆转录病毒(HERV)的有影响的表达。HERV与已知的动物逆转录病毒具有同源性，并可能来源于它们向人类种系的整合。在人类基因组中，这些HERV的序列通常是不完全的，虽然已经鉴定了全部的原病毒序列。
已经从MS患者的软脑脊膜细胞培养物中分离了逆转录病毒颗粒[4]。对这些颗粒的研究显示，它们是具有同源于人DNA的基因序列，但定义为内源性逆转录病毒(HERV-W)的一个新的家族[2、5、6]。不同的研究小组已经证实了患者血清和/或脑脊液(CSF)中存在有MSRV(7-9)，并且证明了病毒负载与疾病演变相关[10]。其后又证明，MSRV和其包膜蛋白具有超抗原(SAg)型的、T淋巴细胞介导的促炎特性[11]。已建立了确认这些颗粒的体内免疫病理原性，特别是它们诱导T淋巴细胞介导的促炎因子分泌能力的动物模型(人源化SCID小鼠)[12]。
在后文的描述中，将MSRV/HERV-W家族的病毒无差别地称为MSRV或MSRV/HERV-W。
如MS，其他病理学则展示一个以存在大量白介素-6(IL-6)为特征的免疫系统活化谱。其中，精神分裂症(SCZ)-一种与遗传和环境因素有关的神经精神疾病-根据病例，其血清IL-6水平大大高于正常人[13]。另外，在SCZ患者中，已鉴定了与MSRV序列相似的逆转录病毒序列[3]。再者，最近证明，新确诊的SCZ患者表现与循环颗粒有关的MSRV/HERV-W家族的逆转录病毒序列[14]。
这样的表达与MSRV/HERV-W的各种神经病理学中的作用是相匹配的，该作用借助于其包膜蛋白的促炎作用和涉及的活化途径。这种逆转录病毒元件(其本身处于活化辅因子的控制之下)及其相关作用全都与炎性脱髓鞘疾病有关[15]。在精神分裂症的情况下，这种通过IL-6的过表达在系统水平上表现的炎症，在脑灰质的局部水平上，与已知的由脑内的小神经胶质细胞/巨嗜细胞介导的炎性神经毒性和兴奋毒性作用也是相关的[16-30]。
也已报道了精神分裂症患者，包括特别是狂郁精神病(偶极紊乱)的前皮质组织中MSRV/HERV-W RNA序列的差异表达(不在正常人中表达)[31]。另外，已在具有抵触性精神分裂症的纯合双胞胎的血液中证明了这种“MSRV/HERV-W”逆转录病毒差异的系统反射，这样便确证“系统性”复制物的存在，该复制物可在以前报道的循环IL-6的高度表达中起作用[3]。
精神分裂症患者的皮质、皮质下、神经毒性和/或兴奋毒性信号的产生中，在特异性炎性因子的作用水平上，MSRV/HERV-W包膜蛋白的作用是精神分裂症病原级联反应的一部分。
此时，来自不同小组的出版物均显示，MSRV/HERV-W家族成员与诸如MS、SCZ的病理学相关，但其他疾病也证明参与其中。
本发明人现已不可预见地显示，MSRV/HERV-W的包膜蛋白具有独立于T淋巴细胞介导的另一种促炎活性，这种新的促炎活性有T细胞以外的细胞和T细胞受体(TCR)以外的受体参与，而且导致超级抗原活化TCR以外的促炎途径的活化。因此，这种新的促炎活性在定义上不同于涉及结合T淋巴细胞TCR的、由超抗原功能引起的促炎活化。发明人已明确地发现，MSRV/HERV-W包膜蛋白可溶性部分的区域(Env-SU)负责这些由抗原呈递细胞(巨嗜细胞、单核细胞(monocyte)、树突状细胞和小神经胶质细胞)介导的新的促炎作用，以及迄今没有鉴定的其作用是激发MSRV/HERV-W Env-SU介导的促炎作用的受体。因此，天然存在于逆转录病毒颗粒表面上的Env-SU以抗原呈递细胞为靶标，激活它们并诱导大量TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌。已在MS患者身上研究了这些促炎效应，然后与供体中得到的结果进行比较。因此发明人显示，MS患者体内Env-SU诱导的IL-6产生增加，而且与他们的临床记分(EDSS)有关。推测MS患者血清IL-6、SCF和损伤的增加[32-37]在MS患者中枢神经系统中观察到的损伤的发展和持续中发挥重要作用。
本发明人令人惊奇地发现，参与这些新的促炎作用的Env-SU受体是TLR4(Toll样受体4)蛋白。编码TLR4的基因定位于染色体9(9q32-q33)。该蛋白质由839个氨基酸组成，分子量为95679道尔顿(Da)。已知TLR4与另一种称为MD-2的分子并与CD14一起协同作用，这种复合物参与识别细菌脂多糖(LPSs)，在细胞因子分泌和炎性反应中导致NK-κ-B因子的活化，但在本发明之前尚不清楚MSRV/HERV-W包膜蛋白之可溶性部分(Env-SU)的受体的作用。因为T淋巴细胞上没有TLR4蛋白的表达，所以T淋巴细胞并不是本文中用TLR4受体证明的作用的主要靶标。发明人的研究还显示，无论什么逆转录病毒复制，与在患者生物液中检测到的循环RNA有关的MSRV逆转录病毒颗粒都是该新的、有存在于诸如巨嗜细胞、单核细胞、树突状细胞和小神经胶质细胞的抗原呈递细胞上的TLR4受体参与的早期促炎活化途径的诱导剂。为此，他们失活了从生产培养物上清中纯化的MSRV病毒颗粒[4]，并试验了它们的与MSRV/HERV-W包膜蛋白有关的活性。实验部分给出的结果证实，TLR4受体使先天免疫失活的早期途径是被可溶形式的包膜蛋白Env-SU和MSRV病毒颗粒表面上膜结合形式的包膜蛋白靶向的。
因此，本发明所得到的结果使之有可能在病理学特别是如MS和SCZ中的神经病理学建立免疫治疗策略，特别是有可能鉴定出能够穿过血脑屏障运输一种或多种治疗剂的载体(vector)。在治疗上，本发明所得结果的基本方面是它们有可能依靠鉴定参与早期炎性信号产生的“MSRV/HERV-W Env-SU和TLR4”配体/受体系统，靶向该区域中有独特特异性的、与脑小神经胶质细胞/巨嗜细胞的活化有关的炎性成分，该早期信号例如当它们来源于白质(MS)中的小神经胶质细胞/巨嗜细胞时便启动脱髓鞘级联反应，或者当它们是由灰质(SCZ)中的同样细胞产生时，则启动兴奋毒性/神经毒性级联反应。
发明内容
因此，本发明的主题是治疗表现有与MSRV/HERV-W的存在有关的病理学的个体的方法，该方法包括对该个体给予治疗组合物或药物，该治疗组合物或药物包括至少一种抗体，其选自：组(i)能够与MSRV/HERV-W Env蛋白的可溶性部分特异性结合的抗MSRV/HERV-WEnv-SU抗体，或者组(ii)能够与MSRV/HERV-W Env-SU蛋白的可溶部分中的TLR4受体特异性结合的抗体，从而抑制因MSRV/HERV-W活化所诱导的促炎级联反应，以及还包括赋形剂(carrier)，必要时加上医药上可接受的载体(vector)。所述的抗体抑制通过MSRV/HERV-W Env-SU活化所诱导的促炎级联。所述的方法特别适用于治疗MS和SCZ，但也能用于治疗与MSRV/HERV-W的促炎蛋白的表达有关其他疾病，其中所述的MSRV/HERV-W的促炎蛋白启动病理学级联。
所述的抗Env-SU抗体能够与对应于SEQ ID NO：1中鉴定之序列的氨基酸122-131(包括在内)的区域结合，和/或与对应于氨基酸312-316(包括在内)，和/或与对应于氨基酸181-186(包括在内)的区域结合。
根据本发明的方法，可以给予患者包括至少一种抗MSRV/HERV-WEnv-SU抗体或至少一种抗TLR4抗体的组合物或药物。在本发明方法的一个实施方案中，给予患者包括至少一种抗MSRV/HERV-W Env-SU抗体和至少一种抗TLR4抗体的组合物或药物。
优选地，在本发明的方法中，抗Env-SU抗体选自下列抗体：抗MSRV/HERV-W Env-SU单克隆抗体(抗体3B2H4、13H5A5和3H10F10(bioMérieux))，且抗TLR4抗体是抗人TLR4抗体HTA125(由eBioscience公司出售)。本说明书下文中描述了得到bioMérieux单克隆抗体的方法。最近在抗原呈递细胞上用TLR4受体证明，上述抗体具有原始的、迄今未知的中和促炎活性的特征。
借助相关的医药上可接受的赋形剂，或必要时借助医药上可接受的载体，来通过血脑屏障(BBB)运输，给予患者抗TLR4或抗Env-SU抗体。对于MS病例来说，如果在病理学的某些阶段血脑屏障是开放的，就不必使用这样的载体；但当血脑屏障没有开放时，例如SCZ病例中，则必须使用这样的载体。这些载体是已知的[38-45]。治疗途径靶向与脑的小神经胶质细胞/巨嗜细胞的活化有关的炎性成分，其在该区域中具有独特的特异性。这种特异性与参与早期炎性信号产生的“MSRV Env-SU和TLR4”配体/受体系统的鉴定有关，该早期炎性信号例如当所述的其来源于白质(MS)中的小神经胶质细胞/巨嗜细胞时，便启动脱髓鞘级联反应；或者当它们是由灰质(SCZ)中的同样细胞产生时，则启动兴奋毒性/神经毒性级联反应。
在与MSRV/HERV-W的病理学表达有关的各种疾病中，抗MSRVEnv-SU和抗TLR4抗体的使用价值是，在来源上阻断因 MSRV/HERV-W(根据病理学过程的不同，其本身可以是被疱疹病毒型感染性辅因子、激素信号或特异性细胞因子诱导的)的表达所诱导的促炎级联。
因此，本发明的主题是用于治疗目的的组合物，其包括至少一种选自能够与MSRV/HERV-W Env蛋白的可溶部分特异结合或与MSRV/HERV-W Env蛋白可溶部分的TLR4受体特异结合的组(i)抗MSRV/HERV-W Env-SU抗体或组(ii)抗TLR4抗体，以及医药上可接受的赋形剂，必要时，所述的组合物还包括医药上可接受的载体；所述的抗体能够抑制因MSRV/HERV-W Env-SU活化所诱导的促炎级联反应。优选地，该组合物包括至少一种抗MSRV/HERV-W Env-SU抗体和至少一种抗TLR4抗体。所述组合物中优选的抗体是抗MSRV/HERV-W Env-SU抗体(3B2H4、13H5A5和3H10F10)和抗TLR4抗体HTA125。上述抗体是“中和”最近通过TLR4受体在抗原呈递细胞上证明的促炎活性的单克隆抗体。
所述的抗Env-SU抗体特别能够与对应于SEQ ID NO：1中鉴定之序列的氨基酸122-131(包括在内的)的区域结合，和/或与对应于氨基酸312-316(包括在内的)，和/或与对应于氨基酸181-186(包括在内的)的区域结合。
本发明的主题也是至少一种选自能够与MSRV/HERV-W Env蛋白的可溶部分特异结合或与MSRV/HERV-W Env蛋白可溶部分的TLR4受体特异结合的组(i)抗MSRV/HERV-W Env-SU抗体或组(ii)抗TLR4抗体在药物制备中的用途；所述的抗体抑制因MSRV/HERV-W Env-SU活化所诱导的促炎级联反应。特别是，使用至少一种抗MSRV/HERV-W Env-SU抗体和至少一种抗TLR4抗体。所述抗MSRV/HERV-W Env-SU抗体选自抗体3B2H4、13H5A5和3H10F10，并且所述抗TLR4抗体是抗体HTA125。这种用途是用于治疗与MSRV/HERV-W有关的病理过程，例如多发性硬化和精神分裂症。
所述的抗Env-SU抗体特别能够与SEQ ID NO：1中鉴定之序列中对应于氨基酸122-131(包括在内的)的区域结合，和/或与对应于氨基酸312-316(包括在内的)和/或与对应于氨基酸181-186(包括在内的)的区域 结合。
本发明的主题也是选自能够与MSRV/HERV-W Env蛋白的可溶部分特异结合或与MSRV/HERV-W Env蛋白可溶部分的TLR4受体特异结合的、抑制因MSRV/HERV活化所诱导的促炎级联的抗MSRV/HERV-WEnv-SU和抗TLR4抗体，特别是抗体3B2H4、13H5A5和3H10F10。但生产和选择其他抗体，在下述实验部分所述的体外试验中选择能够抑制Env-SU的促炎作用的抗体的条件，应是本领域技术人员已知的。
本发明中使用的术语“抗体”包括单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、重组抗体以及所述抗体的片段，特征是对MSRV/HERV-W包膜蛋白的可溶部分具有高亲和力，并且没有或只有很弱毒性。具体而言，优选使用那些可变区和/或恒定区对待给药个体免疫原性很弱的抗体。本发明抗体的特征是它们能够治疗那些表现出与MSRV/HERV-W有关的病理学的患者，同时没有或只有很弱的毒性。这些抗体的微弱免疫原性和高亲和性使之有可能达到预期的治疗效果。
术语“抗体片段”是指天然抗体的F(ab)2、Fab、Fab′和sFv片段(Blazaret al.，1997，Jiurnal of Immunology 159；5821-5833和Bird et al.，1988，Science 242；423-426)，而术语”嵌合抗体”是指天然抗体的嵌合衍生物(例如参见Arakawa et al.，1996，J.Biochem.120：657-662和Chaudray et al.，1989，Nature 339：394-397)。
生产单克隆抗体是本领域技术人员的常识。例如参见Kǒhler G andMilstein C.(1975)：Continuous culture of fused cells secreting antibody ofpredefined specificity(分泌预定特异性抗体的融合细胞的连续培养)，Nature，266：522-550。免疫原可以与用作免疫支持物的钥孔戚血蓝素(KLH肽)或血清白蛋白(SA肽)偶联。给动物注射加有弗氏完全佐剂的免疫原。使用常规技术，例如ELISA和Western免疫印迹法分析被免疫动物的血清和杂交瘤培养物上清的特异性和选择性。选择产生最大特异性和最大敏感性的抗体的杂交瘤。也可以使用杂交瘤细胞培养物，或从腹腔内注射了杂交瘤的小鼠腹水液在体外生产单克隆抗体。不管是使用上清液还是腹水生产的单克隆抗体，抗体都要进行纯化。所使用的纯化方法主要是离子交换凝胶过滤和排阻层析或亲和层析(蛋白A或G)。用功能性实验 筛选方法选择出最有效的抗体。可使用本领域技术人员熟知的遗传工程方法体外生产抗体、抗体片段或嵌合抗体。举例来说，可以克隆从编码抗体可变区片段(scFv)的RNA得到的cDNA，以生产抗体。非人类抗体、例如鼠抗体的“人源化”形式是包括衍生于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。人源化抗体的绝大部分是人免疫球蛋白(接受抗体)，其中受体的超可变区残基被具有所期望特异性、亲合性和结合能力的非人类供体例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的超可变区残基所取代。在某些情况下，人免疫球蛋白Fv区的残基(FR)被相应的非人类残基所取代。另外，人源化的抗体可包括未见于接受抗体或供体抗体中的残基。这些修饰可以改善抗体的效能。总地说来，人源化抗体包括至少一个，最好两个可变区，其中所有的或实质上所有的超可变环相当于非人免疫球蛋白，所有的或实质上所有的FR区是人免疫球蛋白区域。人源化抗体也可任选地至少包括免疫球蛋白如人免疫球蛋白恒定区的一个部分。一般说来，可变区衍生于非人哺乳动物抗体，而恒定区则衍生于人免疫球蛋白。优选地，所选的可变区有弱免疫原性，并且是与也表现有弱免疫原性的恒定区结合的。
这些抗体优选下列“中和”抗体：
-抗MSRV/HERV-W Env-SU单克隆抗体：抗体3B2H4、13H5A5和3H10F10(bioMérieux)，
-抗TLR4抗体：抗人TLR4单克隆抗体HTA125(由eBioscience公司出售)。
根据下述方法生产所述的抗MSRV/HERV-W Env-SU抗体。
抗体3B2H4的生产：
按照下述程序免疫小鼠：第0天，于不完全弗氏佐剂存在下，腹腔注射20μg由先前描述的[11]纯化的重组MSRV/Env蛋白组成的免疫原。第14天和第18天，在不完全弗氏佐剂存在下，进一步腹腔注射同样量的免疫原。融合前第4、3和2天，腹腔注射100μg在生理盐水中稀释的免疫原。
用间接ELISA技术筛选400份上清液。用溶于0.05M碳酸氢盐缓冲 液(1μg/ml，pH 9.6)的100μl抗原包被平板。将包被的平板在18-22℃下孵育过夜。用200μl PBS-1％奶饱和平板，并于37±2℃下孵育1小时。加入100μl在PBS缓冲液-0.05％吐温20中稀释的上清液或腹水液，并于37±2℃将平板孵育1小时。加入在PBS缓冲液-1％BSA中1/2000稀释的、与碱性磷酸酶(AP)(Jackson Immunoresearch，115-055-062)结合的100μl羊抗小鼠Ig(H+L)多克隆抗体，然后将平板于37±2℃保温1小时。加入溶于DEA-HCl(BioMérieux，60002989)(pH＝9.8)中的浓度为2mg/ml的100μl PNPP(bioMérieux，60002990)。然后于37±2℃保温培养板30分钟。加入100μl 1N NaOH阻断反应。每步骤之间用300μl的PBS-0.05％吐温20洗3次。加入PNPP之前，在蒸馏水中加洗一次。
间接ELISA发现22份上清为OD值大于0.2的阳性，相当与本底噪音的4倍。特异性试验后，即得到所要的单一抗体。
抗体13H5A5和3H10F10的生产：
按照下述程序免疫小鼠：第0天，于不完全弗氏佐剂存在下，腹腔注射40μg由先前描述的[11]纯化的重组MSRV/Env蛋白组成的免疫原。第14、28和第78天，在不完全弗氏佐剂存在下，进一步腹腔注射同样量的免疫原。融合前第4、3和2天，腹腔注射50μg在生理盐水中稀释的免疫原。
用上述间接ELISA技术筛选1350份上清液。
间接ELISA发现39份上清为OD值大于0.4的阳性，相当与本底噪音的4倍。特异性试验后，即得到所要的两种抗体。
使用上述抗Env-SU和抗TLR4抗体制备用于治疗与上述MSRV/HERV-W有关的病理学的药物或治疗组合物。在用于治疗目的的本发明组合物中，将抗体或活性成分与医药上可接受的赋形剂，以及任选的载体结合。根据所选择的给药方法和医药领域的标准实践来确定和选择医药上可接受的赋形剂。因为口服给药时蛋白质会受到消化，所以通常选择诸如静脉内、皮下或肌肉内的胃肠道外途径给药，以利于最大吸收。例如Remington′s Pharmaceutical Science(雷明顿制药学，第16版，Mark出版公司)已描述了医药上可接受的赋形剂。可以将1.5％(重量)的活性成分溶解到0.9％的氯化钠溶液中，制备适于注射给药的组合物。将抗体与能使抗体通过血脑屏障(BBB)的载体结合可能是必要的。因此可以将不可运输的抗体与可运输的载体例如阳离子化白蛋白、运铁蛋白、胰岛素或胰岛素样生长因子，或所述蛋白质的片段偶联。特别是已经显示，将不能运输的单克隆抗体(IgG3)连接到运输载体例如运铁蛋白或胰岛素样生长因子上，不仅能够通过BBB，而且可以保留这些抗体的功能特性。其他研究已经显示，神经药物可以通过脂质体传输到脑内。这一方法是是重要的，因为它提出了一个任何能被包裹在脂质体中的分子都可以被导入脑内的机制。
抗体可以作为单独的治疗剂使用，或者与其他治疗剂联合使用以提高和改善治疗效果。剂量将依据诸如特殊治疗剂的药物动力学性质和其给药途径，以及患者年龄、体重、给药频率和预期的治疗效果的已知因素而定。通常情况下，活性成分的每日剂量为0.01-100微克/公斤体重。一般为1-40微克/公斤体重/天，每天一次或分多次给予所述的有效剂量。
本发明也涉及MSRV/HERV-W Env-SU在通过检测选自IL-6、IL-12-p40和TNF-α的细胞因子，确定多发性硬化或精神分裂症患者血液单个核细胞(mononuclear cell)的反应性状态的用途。
附图简要说明
图1代表Env-Pv14包膜、信号肽和Env-SU包膜的可溶部分的结构，以及信号肽和Env-SU包膜可溶部分的氨基酸序列。图1(a)相当于Env-Pv14(MSRV的完整包膜蛋白)的结构，信号肽的结构和Env-SU包膜之可溶部分的结构。包膜的可溶部分(Env-SU)相当于在完整Env-Pv14蛋白的位置K316处切割的可溶性细胞外单元的287个氨基酸部分。图1(b)代表信号肽和Env-SU的氨基酸序列。在图1(b)中，信号肽的序列被框起来，而包膜的可溶部分(Env-SU)则以黑体字母显示。Env-SU的序列显示为SEQ ID NO：1的序列号。Env-Pv14包膜的完整序列可在GenBank中查到，其登录为AF331500。参考图1(a)，Env-Pv14蛋白的不同部分一般限定如下：
-信号肽在氨基酸1处开始，并在氨基酸29(包括在内)处终止，
-Env-SU在氨基酸30处开始，并在氨基酸316(包括在内)处终止，
-跨膜区在氨基酸317处开始，并在氨基酸542(包括在内)处终止。
计算的Env-SU的平均分子量等于32061.59。估计的pI等于9.61。
其氨基酸组成如下：
非极性氨基酸：
数目 百分比
A 9 3.14
V 16 5.57
L 25 8.71
I 13 4.53
P 21 7.32
M 7 2.44
F 11 3.83
W 6 2.09
极性氨基酸；
数目 百分比
G 16 5.57
S 31 10.80
T 34 11.85
C 12 4.18
Y 10 3.48
N 18 6.27
Q 9 3.14
酸性氨基酸：
数目 百分比
D 4 1.39
E 10 3.48
碱性氨基酸：
数目 百分比
K 9 3.14
R 12 4.18
H 14 4.88
图2：在人PBMC(单个核细胞)的培养物中，Env-SU诱导促炎细胞因子产生。图2A代表用ELISA(酶联免疫吸附分析)分析用渐增剂量的Env-SU刺激24小时的正常供体PBMC培养物上清中测得的TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌。结果相当于3次独立的实验。X轴是Env-SU的剂量(μg/ml)。Y轴相当于细胞因子的量(ng/ml)。曲线中，符号■相当于IL-6的分泌，符号●相当于IL-1β的分泌，符号▲相当于TNF-α的分泌。图1B中，用1μg/ml自体对照物、Env-SU、LPS或SEB刺激PBMC并保温24、48和72小时，然后用ELISA方法分析细胞因子分泌。X轴相当于时间(小时)，Y轴相当于细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-1β的产生，图1B(a)和1B(c)中的IFN-γ和IL-6的浓度单位为ng/ml，而图1B(b)和1B(d)中的TNF-α和IL-1β的浓度单位为pg/ml。该图中，-●-相当于Env-SU，---x---相当于LPS，-▲-相当于自体对照物，----■----相当于SEB。
图3：Env-SU的细胞因子刺激活性并不是由于内毒素污染。用自体对照物(Mock)、Env-SU、LPS或SEB刺激PBMS 24小时。当提示时，于刺激前用10μg/ml多粘菌素(pdyB)处理细胞(图中用黑色代表)。平行地，细胞也与蛋白质和煮沸的(100℃)毒素一起孵育30分钟(图中以灰色代表)。收获培养物上清液并用ELISA方法检测TNF-α的释放。该图中显示的结果相当于三次实验的平均数。Y轴相当于所释放的TNF-α的量，单位为pg/ml。
图4：抗Env-SU单克隆抗体(13H5A5)阻断Env-SU的细胞因子刺激活性。用自体对照物CK2、Env-SU和LPS刺激PBMS 24小时，并用30μg/ml抗Env-SU单克隆抗体和抗Gag单克隆抗体(3H1H6)预孵育或不孵育。收获培养物上清并检测TNF-α的分泌。该图中显示的结果相当于 三次实验的平均数。Y轴相当于所释放的TNF-α的量，单位为pg/ml。
图5：Env-SU直接活化纯化的人单核细胞。从人PBMC中纯化人单核细胞(纯度大于95％)，然后用浓度为1μg/ml的自体对照物(Mock)、Env-SU或LPS刺激24小时。图5a显示以流式细胞术分析的活化标志物CD80(左图)和CD86(右图)的表达。沿着X轴是计数的细胞数，沿着Y轴是每个细胞的荧光强度(“计数”)。所得到的结果代表每个荧光强度所计数的细胞数。曲线所限定的面积代表实验的每个条件下的细胞总数。曲线的外貌显示细胞分布是荧光强度的函数。白色面积代表对照物(Mock)所得到的结果，用细线勾画的阴影面积代表Env-SU所得到的结果，用粗线勾画的阴影面积代表LPS所得到的结果。图5b代表用ELISA方法分析的TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-12p40的分泌。白色面积代表用自体对照物刺激后所得到的结果，黑和灰柱分别代表Env-SU和LPS刺激后所得到的结果。Y轴相当于细胞因子的分泌量，单位为ng/ml。结果是三次实验的平均数。
图6：Env-SU活化的单核细胞(monocyte)衍生的树突细胞(MDDCs)。从纯化的单核细胞中产生MDDCs，然后用浓度为1μg/ml的自体对照物(Mock)、Env-SU或LPS刺激24小时。图6a代表用流式细胞仪分析的活化标志物CD80、CD86、CD40和HLA-DR的表达。X轴是计数的细胞数，Y轴是每个细胞的荧光强度(“计数”)。上方左影象代表CD80的分析结果，上方右影象代表CD86的分析结果，下方左影象代表CD40的分析结果，下方右影象代表HLA-DR的分析结果。所得到的数值代表每个荧光强度下所计数的细胞数。曲线所限定的面积表示每个实验条件下的总细胞数。曲线的外貌显示细胞分布是荧光强度的函数。左侧白色面积代表对照物(Mock)所得到的结果，粗线勾划的右侧白色面积代表用Env-SU得到的结果，阴影面积代表用LPS得到的结果。图6b代表以ELISA分析培养物上清中的TNF-α、IL-6、IL-12p40和IL-12p70的分泌。Y轴相当于所分泌的细胞因子的量(ng/ml)。在图6b所代表的直方图中，Mock相当于用自体对照物刺激后得到的结果，Env-SU(黑体)相当于用Env-SU刺激后得到的结果，LPS相当于用LPS(灰色)刺激后得到的结果。图6c表示用Env-SU-■-、LPS--▲--、对照物CK2-●-刺激的树突细 胞诱导的异源T细胞增殖。X轴代表树突细胞数(分别为0、1000、5000和10000)。Y轴代表掺入了3H-胸苷的细胞发射的每分钟计数。
图7：CD14和TLR4参与Env-SU的促炎作用。在有或没有浓度为20μg/ml和5μg/ml的抗CD14(rhCD14，货号：AB383，R&D Systems-UK)(图7a)及抗TLR4(图7b)中和抗体存在的情况下，将PBMCs预孵育1小时。然后用浓度为1μg/ml的CK2对照物、Env-SU(ENV1)、LPS和SEB刺激PBMS 24小时。用ELISA方法分析培养物上清中的TNF-α释放。结果显示在直方图7a和7b中。Y轴相当于所释放的TNF-α的量(ng/ml)。黑色直方条相当于没有加入抗体得到的结果，白色直方条相当于在浓度为20μg/m的抗CD14和抗TLR4抗体存在下得到的结果，灰色直方条相当于在浓度为5μg/m的抗CD14和抗TLR4抗体存在下得到的结果。结果为三次实验的平均数。
图8：活化TLR4途径后的免疫放大级联反应。给出该级联反应中治疗靶的例子。
图8示意性显示由于MSRV/HERV-W包膜蛋白的病理表达所引起的活化级联反应。MSRV/HERV-W最初刺激TLR4受体，可能关联到CD14共同受体。在此相互作用之前，只有激动剂MSRV/ENV蛋白。在此活化之后，先天免疫的细胞被活化，数十种分子效应物(细胞因子、酶、脂质、自由基或氧化还原化合物等)与活化的细胞混到了一起。在多发性硬化的情况下，破坏脑的白质并向T淋巴细胞呈递髓磷质后，第二种成分，即与过继性免疫的自体反应性T细胞有关的自身免疫成分被活化。在这个阶段，数百种甚至数千种不同的分子和细胞参与介导免疫病理学效应。这就给出一个典型的免疫病理学放大级联反应，其可能与初始刺激物(MSRV/HERV-W ENV)不再有相似性。
在存在于放大级联阶段的许多其他激动剂中，迄今可利用或提出的治疗只是靶向促炎或病理激动剂“下游”(给出的例子有抗TNF-α抗体、干扰素β和如阿魏酸的自由基清除分子)。在这里，它们不能抑制很大量的对它们的药理学效应不敏感的其他效应物(分子或细胞)。这就解释了目前在诸如MS的疾病的许多治疗中的部分和相对效应。
此外，这些治疗并不能阻止表达病理学MSRV/HERV-W拷贝(在活性 环境辅因子例如疱疹病毒的影响下)的其他细胞同时或不同时间(多灶损伤或复发/缓解的原则，其以大脑空间和疾病演变时间的方式定义MS)、在同一损伤部位或脑的另一部位产生促炎包膜。
因此，抑制级联阶段的初始效应(并不产生可被蛋白-靶诱导的所有下游效应物)的治疗比在这些与该MSRV/HERV-W包膜蛋白的促炎效应有关的病理学中通常设计和使用的途径更相关，且更有效。事实上，即使级联被激活，按照这种治疗策略它也将是“干缩的”上游，而上游刺激将延续到其他“下游”治疗手段。最后，在疾病缓解期间防止进一步复发的手段中，在“MSRV/HERV-W ENV”蛋白引发所述的级联之前，这些抗体能够中和“MSRV/HERV-W ENV”蛋白，而在该炎性级联被激发之后，其他靶向“下游”分子或细胞的治疗方法仅起到干扰作用。
图9：由“MSRV/HERV-W ENV”蛋白的促炎效应引起两种疾病的四个关键步骤：
(i)两个共同的“上游”步骤：I-TLR4受体活化，和II-局部炎症，
(ii)两个不同的“下游”步骤：III-神经脱髓鞘或兴奋毒性，和IV-多发性硬化和精神分裂症。
包膜蛋白(Env)是在病理性活化中，由MSRV/HERV-W家族的逆转录病毒拷贝产生的，该活化例如，在被疱疹病毒家族的感染性辅因子[46-49]反式活化后，该活化由该辅因子的趋向性并由保藏有至少一个原病毒MSRV/HERV-W拷贝(该原病毒可被该辅因子活化，并且编码包膜蛋白)的靶组织的细胞的存在来决定。
因此，所产生的该ENV蛋白与TLR4受体结合，并且根据上下文其也可与存在于产生MSRV/HERV-W ENV和/或MSRV病毒颗粒之细胞附近的大脑组织中的巨嗜细胞或小神经胶质细胞型细胞的TLR4共同受体如CD14结合。如果所述的细胞是巨嗜细胞或小神经胶质细胞，就有可能在相同细胞的TLR4受体上表现有自分泌效应。
与TLR4受体相互作用的步骤之后，免疫病理放大级联反应产生数十种促炎和介导组织破坏的分子，从而在MSRV/HERV-W再活化部位周围的相关组织中发生局部炎症。
这个阶段之后，根据MSRV/HERV-W再活化辅因子和保藏这些“反应 物”原病毒的细胞是否已转向在白质或灰质中表达，这种状态会趋异。
在导致如精神分裂症的病理学的病理途径第一种情况中，前脑皮层神经结构附近诱导的MSRV/HERV-W元件的重新活化和过表达，诱导灰质组织中的局部炎症，将不允许主要前损伤活性和特异性免疫的复原。这种局部炎症将不允许T淋巴细胞在这个水平上浸润。另一方面，在负责智力和认知活性的神经细胞附近产生的促炎介导物，引起局部神经兴奋毒性，该毒性决定受感染的大脑空间中相关神经网络的失调，并在此期间出现这种促炎效应[17、20、22-26、29、50、51]。依据受感染的面积不同，由兴奋毒性神经活化所引起的“心理”条件通过幻觉和谵狂想象反射出来，后者体现了精神分裂症的临床病理学发作特征。最后，已知这种兴奋毒性可导致细胞死亡，其具体表现为精神分裂症患者大脑脑室的扩大(用MRI检测)[52]。
在确定导致多发性硬化的病理途径的第二种情况下，白质中的髓磷脂对自由基和促炎因子特别敏感，致使其主要产生脱髓鞘作用，同时向在先炎症募集的淋巴细胞呈递自身抗原。
在这些条件下，淋巴细胞反应性倾向是受预先由小神经胶质细胞/巨噬细胞型细胞(Th1倾向)分泌的细胞因子控制的。其足以在这些条件下对所呈递的“自身”抗原产生自身免疫反应。此外，也已显示，完整的MSRV包膜蛋白或MSRV病毒颗粒可以在T淋巴细胞上发挥不同的活性，即以与“TCR”受体相互作用为特征的超级抗原活性。在此“下游”上下文中，所述的因为原发炎症浸入组织所募集的T淋巴细胞，最后加入T淋巴细胞的多克隆活化，甚至可进一步促进针对原发炎症预先损伤的组织中的髓磷脂，产生特异性自身免疫T淋巴细胞反应。然后，随着活化的T淋巴细胞介导自身免疫和炎症，而发生次级免疫病理学反应。
图10：ENV-SU诱导的多发性硬化患者和正常供体(ND)的PBMC上的细胞因子产生：TNF-α、IL-1β和IL-10
图10代表多发性硬化患者(MS)和正常供体(ND)的体外处理回输(exvivo)的血液单个核细胞(PBMCs)中由MSRV-SU蛋白诱导的细胞因子的产生。ND或MS之后的“n＝”代表检测细胞因子的各群体中被试个体的数目。
X轴代表被刺激的PBMC培养物上清中的细胞因子剂量(ng/ml)。各图比较了点(圈)所代表的各群体(ND和MS)中每个被试个体的结果。三个图从左到右分别是肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1β和白介素(IL)-10。就这三种细胞因子来说，ND和MS两个群体之间并没有明显区别。用Student’s检验进行统计学分析。
图11：ENV-SU诱导的多发性硬化患者和正常供体(ND)PBMC上的细胞因子产生：IL-12p40和IL-6
图11代表多发性硬化患者(MS)，和正常供体(ND)的体外处理回输的单个核细胞(PBMC)中由MSRV ENV-SU蛋白诱导的细胞因子的产生。ND或MS之后的“n＝”代表检测细胞因子的各群体中被试个体的数目。
X轴代表被刺激的PBMC培养物上清中的细胞因子剂量(ng/ml)。各图比较了由点(圈)所代表的各群体(ND和MS)中每个被试个体的结果。两个图从左到右分别是白介素(IL)-12p40a和白介素(IL)-6的产生。计算比较ND和MS两群体的结果，可见MS群体的这两种细胞因子明显地高于ND群体(IL-12p40的p＝0.003，IL-6的p＝0.0006)。用Student’s检验进行统计学分析。
图12：细胞因子产生和患者临床参数之间的相关性
图12代表所研究的MS人群(X轴)的临床参数与其PBMCs受MSRV-SU ENV刺激后所产生的某些细胞因子含量(Y轴)之间的相关性。每个图中的”r”值代表相对于相关曲线的点分布统计学计算结果。“p”值代表随机得到的这种相关性的统计学概率。所以，任何p值大于0.05就是“无显著性”，而小于0.05则表明所分析的因子之间存在相关性。
上面的两个图显示MS患者的临床记分EDSS(以1到10的严重性等级测得的[53])与IL-6(左侧)或IL-12p4(右侧)之间的显著相关性的参数。
下面两个图显示未发现显著相关性的参数的例子：疾病的持续时间和IL-6(左图)，或γ-干扰素与临床记分EDSS(右图)。
图13：精神分裂症患者(SCZ)和正常供体(ND)的PBMC中自发产生(a)或Env-SU诱导产生(b)细胞因子：IL-10
图13表示Env-SU诱导的、体外处理再回输的(1)精神分裂症患者(SCZ)，和(2)正常供体(ND)的血液单个核细胞(PBMC)中细胞因子的产生。
X轴代表受刺激的PBMC培养物上清中细胞因子的剂量(ng/ml)。各图比较用点表示的各群体(ND和SCZ)的各受试者个体的结果。从左到右两个图分别表示培养物中白细胞介素(IL)-10的自发产生和Env-SU刺激后诱导的白细胞介素(IL)-10产生。
图14：在精神分裂症患者(SCZ)和正常供体(ND)的PBMC中自发产生(a)或Env-SU诱导产生(b)并计算相对增加(c)的细胞因子：IL-12p40。
图14表示MSRV Env-SU蛋白诱导的，体外处理再回输的精神分裂症患者(SCZ)，和正常供体(ND)的血液单个核细胞(PBMCs)中细胞因子的产生。
X轴代表受刺激的PBMC培养物上清中细胞因子的剂量(ng/ml)。各图比较用点表示的各群体(ND和SCZ)的各受试者个体的结果。从左到右三个图分别表示：a)培养物中白细胞介素(IL)-12p40的自发产生，b)用Env-SU刺激后诱导的白细胞介素(IL)-10的产生，c)按下列公式计算的IL-12p40产生的相对增加：(Env-SU刺激后的量-自发产生量)/自发产生量。
图15：在来源于正常供体的人PBMC的培养物中，鉴定和选择那些抑制Env-SU蛋白诱导的单核细胞-巨嗜细胞的促炎活化的抗MSRV/HERV-W ENV单克隆抗体。a)用两种抗ENV抗体和对照抗体分析，b)校准特异性分析的条件，c)独立实验的例子，d)独立实验的其他例子：
图15a显示在正常供体PBMCs培养物中，“Mock”对照蛋白(1μg/ml)、Env-SU(1μg/ml)和LPS(1μg/ml)(X轴)诱导的TNF-α分泌(ng/ml)(Y轴)。各刺激条件从左到由是：白色柱代表没有抗体所得到的结果，黑色柱代表存在抗MSRV ENV抗体3B2H4(30μg/ml)的结果，斜线柱代表存在抗MSRV ENV抗体13H5A5(30μg/ml)的结果，阴影柱代表存在抗MSRVGAG抗体3H1H6(30μg/ml)的结果。
图15b显示在与15a相同的正常供体PBMC培养物中，“Mock”对照蛋白(1μg/ml)、Env-SU(1μg/ml)和LPS(1μg/ml)(Y轴)诱导的TNF-α分泌(ng/ml)(Y轴)。各刺激条件从左到由是：白色柱代表没有抗体所得到的结果，黑色柱代表存在多粘菌素B(25μg/ml)的结果，阴影柱代表用在加入到PBMC培养物中之前于100℃加热30分钟的Mock、Env-SU或LPS 所得到的结果。
图15c显示在正常供体PBMC培养物中用下列物质诱导的TNF-α分泌(pg/ml)(Y轴)：白色柱为“Mock”对照蛋白(1μg/ml)，黑色柱为Env-SU(1μg/ml)，阴影柱为LPS(1μg/ml)。从左到右是各个刺激条件，X轴显示各抗体给出的结果：与3B2H4同型的抗弓形虫抗体“X”(30μg/ml)，抗MSRV ENV抗体3B2H4(30μg/ml)、抗MSRV ENV抗体13H5A5(30μg/ml)，抗MSRV ENV抗体3H10F10(30μg/ml)、抗MSRV GAG抗体3H1H6(30μg/ml)。
图15d显示在正常供体PBMC培养物中用下列物质诱导的TNF-α分泌(pg/ml)(Y轴)，白色柱为“Mock”对照蛋白(1μg/ml)，黑色柱为Env-SU(1μg/ml)。从左到右是各刺激条件，X轴显示各抗体给出的结果：与3B2H4同型的抗弓形虫抗体“X”(30μg/ml)，抗MSRV ENV抗体3B2H4(30μg/ml)、抗MSRV ENV抗体6A2B2(30μg/ml)，抗MSRV ENV抗体3H10F10(30μg/ml)和抗MSRV ENV抗体13H5A5(30μg/ml)。
图16：PBMC中TNF-α产生的动力学
用5□1缓冲液(带虚线和圆圈的曲线)、1□g/ml Env-SU(带方块的粗线曲线)或1□g/ml LPS(带三角的细线曲线)刺激正常供体的PBMC，并孵育2、24、或48小时(X轴)，然后用ELISA方法分析TNF-α的产生。
图17：Env-SU在人源化SCID小鼠中的促炎作用
X轴显示的是每只动物注射缓冲液、50□g的ENV-SU或50□g的LPS的体重约25g的SCID小鼠。还如每一型的接种物的X轴显示，通过ELISA分析了在2h、24h和48h处死小鼠的血清或腹腔灌洗液(IP)。
左侧图代表TNF-α的剂量(pg/ml)。其中上边一个代表鼠细胞因子的剂量，下边一个代表人细胞因子的剂量。
右侧图代表IL-6的剂量(pg/ml)。其中上边一个代表鼠细胞因子的剂量，下边一个代表人细胞因子的剂量。
图18：用MSRV ENV蛋白诱导EAE
图18显示在C57B16小鼠中用MSRV ENV蛋白诱导EAE的初步实验结果。
X轴代表注射后的天数。Y轴代表所研究的动物的平均临床记分。
带方块的曲线代表注射MOG(髓磷脂少突神经胶质细胞糖蛋白)自身抗原和完全弗氏佐剂(含结核分支杆菌的提取物)的动物。以此种方式在第18天完成该系列研究。
带三角的曲线代表注射MOG(髓磷脂少突神经胶质细胞糖蛋白)自身抗原、不完全弗氏佐剂(不含结核分支杆菌的提取物)及MSRV ENV蛋白的动物。该系列研究以此种方式持续至多25天。
带菱形的曲线代表注射MOG(髓磷脂少突神经胶质细胞糖蛋白)自身家抗原、不完全弗氏佐剂(不含结核分支杆菌的提取物)的阴性对照动物。该系列研究以此种方式持续至多25天。
图19：用MSRV ENV蛋白对EAE诱导的再生
图19是证实在C57B16小鼠中用MSRV ENV蛋白诱导EAE的实验结果。
X轴代表注射后的天数。Y轴代表所研究动物的平均临床记分。
带方块的曲线代表注射MOG(髓磷脂少突神经胶质细胞糖蛋白)自身抗原和完全弗氏佐剂(含结核分支杆菌的提取物)的阳性对照动物。该系列研究21天完成。
带三角的曲线代表注射MOG(髓磷脂少突神经胶质细胞糖蛋白)自身抗原、不完全弗氏佐剂(不含结核分支杆菌的提取物)及MSRV ENV蛋白的动物。该系列研究以此种方式持续至多42天。
带菱形的曲线代表注射MOG(髓磷脂少突神经胶质细胞糖蛋白)自身抗原、不完全弗氏佐剂(不含结核分支杆菌的提取物)的阴性对照动物。该系列研究以此种方式持续至多42天。
带十字花的曲线代表注射MOG(髓磷脂少突神经胶质细胞糖蛋白)自身抗原、不完全弗氏佐剂(不含结核分支杆菌提取物)和LPS的阴性对照动物。该系列研究以此种方式持续至多42天。
图20：在”EAE/MOG/ENV-SU”模型和没有用ENV免疫的对照小鼠中，在24小时分析针对渐增量的MOG自身抗原的自身免疫反应。
X轴代表按图19所述程序取样的小鼠PBMC接触MOG自身抗原的浓度(μg/ml)。Y轴代表由与渐增量的MOG抗原接触的PBMCs中的自身免疫T淋巴细胞体外分泌的INF-γ的剂量。
白色柱代表已经体内注射了(于图19所述系列的第0天)MOG(髓磷脂少突神经胶质细胞糖蛋白)自身抗原、不完全弗氏佐剂(不含分支结核杆菌提取物)和ENV-SU蛋白的小鼠PBMC。
黑色柱代表已经体内注射了(于图19所述系列的第0天)MOG(髓磷脂少突神经胶质细胞糖蛋白)自身抗原和不完全弗氏佐剂(不含分支结核杆菌提取物)的对照小鼠的PBMC。
图21：在”EAE/MOG/ENV-SU”模型和没有用ENV免疫的对照小鼠中，根据INF-γ的分泌所揭示的上述抗MOG自身免疫T淋巴细胞反应的动力学。
X轴代表接种“MOG和佐剂”制剂后的时间(小时)，其中PBMCs样品取自图19所述系列的小鼠。Y轴代表由存在于PBMC的自身免疫T淋巴细胞体外分泌的INF-γ的剂量。
白色柱代表已经体内注射了(于图19所述系列的第0天)MOG(髓磷脂少突神经胶质细胞糖蛋白)自身抗原、不完全弗氏佐剂(不含分支结核杆菌提取物)和ENV-SU蛋白的小鼠PBMC。
黑色柱代表已经体内注射了(于图19所述系列的第0天)MOG(髓磷脂少突神经胶质细胞糖蛋白)自身抗原和不完全弗氏佐剂(不含分支结核杆菌提取物)的对照小鼠的PBMC。
图22：如在开发的MS模型中所证实的并在本发明中验证的，所选择的抗MSRV/ENV抗体对ENV-SU的促炎活化的抑制作用的治疗活性。
图22代表在C57B16小鼠中，证实用MSRV/ENV蛋白诱导EAE的实验结果，以及在ENV蛋白的可溶性片段ENV-SU诱导的由TLR4介导的促炎活性分析中，预先选择的单克隆抗MSRV/HERV-W ENV抗体的抑制活性。
X轴代表注射后天数。Y轴代表动物的平均临床记分。
带方块的曲线代表注射MOG(髓磷脂少突神经胶质细胞糖蛋白)自身抗原和完全弗氏佐剂(含结核分支杆菌的提取物)的阳性对照动物。在这种情况下，该系列研究于第28天完成。
带三角的曲线代表注射MOG(髓磷脂少突神经胶质细胞糖蛋白)自身抗原、不完全弗氏佐剂(不含结核分支杆菌的提取物)及MSRV ENV蛋白 的动物。该系列研究持续的28天。
带菱形的曲线代表注射MOG(髓磷脂少突神经胶质细胞糖蛋白)自身抗原、不完全弗氏佐剂(不含结核分支杆菌的提取物)的阴性对照动物。这种情况下，该系列研究持续达28天。
带十字花的虚线曲线代表注射MOG(髓磷脂少突神经胶质细胞糖蛋白)自身抗原、不完全弗氏佐剂(不含结核分支杆菌的提取物)和MSRVENV-SU蛋白的动物。这些动物还另外给予50μg/Kg(即1μg/20g体重的小鼠)抗MSRV GAG对照抗体3H1H6。这种情况下，该系列研究持续28天。
带圆圈的曲线代表注射MOG(髓磷脂少突神经胶质细胞糖蛋白)自身抗原、不完全弗氏佐剂(不含结核分支杆菌的提取物)和MSRV ENV-SU蛋白的动物。这些动物还另外给予50μg/Kg(即1μg/20g小鼠体重)抗MSRVENV对照抗体3B2H4。这种情况下，该系列研究持续28天。
图23：MSRV ENV蛋白(下行)和由HERV-W 7q拷贝编码的ENV蛋白的氨基酸序列的比较；框起来的序列是相同的(保守区域)。
图24：Western印迹分析
MSRV ENV蛋白和ENV蛋白(由普遍定位在7q染色体上的HERV-W拷贝的env orf(开放阅读框)编码)之间的抗原交叉反应，V14＝由克隆MSRV pV14编码的ENV重组蛋白，H74＝由克隆HERV-W7q pH74编码的ENV重组蛋白。
3CID5：用衍生于MSRV克隆的重组蛋白免疫后得到的单克隆抗体。
箭头显示所测得的带的水平，60Kda是指示相应的分子量水平。
图25：ENV-SU蛋白的抗原性质分析：Western印迹分析。
图25a、b和c代表使用“Mac Vector”分析软件，利用其附带的“蛋白质分析工具盒”功能，分析MSRV ENV-SU蛋白的氨基酸序列。根据一级和二级序列分析结果，被3个垂直矩形框起来的区域代表三个最可能的抗原区。
图25a为用于说明“ENV-SU”区域的抗原性的三个图。X轴上“0”上方阴影面积有阳性抗原性，而下方则没有(阴性抗原性)。
图25b上面两个图说明“ENV-SU”区域的亲水性。Y轴上“0”上方阴影面积代表有阳性亲水性，而下方则显示有阴性亲水性。
下面图说明“ENV-SU”区域的柔性。Y轴上“0”上方阴影面积有阳性柔性，而下方则显示为阴性柔性。
25c说明“ENV-SU”区域的表面概率。Y轴上“0”上方阴影面积有阳性概率，而下方则有阴性表面揉曲性。
具体实施方式
体外研究
材料和方法
蛋白质和毒素
MSRV包膜(Env-SU)的表面蛋白相当于总包膜蛋白的287氨基酸的蛋白序列(Env Pv14，GenBank AF331500)。图1(a)和1(b)中分别显示EnvPv14和ENV-SU的结构及氨基酸序列。在大肠杆菌中表达重组MSRVEnv-SU蛋白并在FPLC柱上纯化之。用质谱法和Western印迹法进一步证实蛋白的质量和纯度。使用酪蛋白激酶作为自体阴性对照。按照如Env-SU的同样条件生产和纯化该对照蛋白。
由CleanCells公司(Bouffere，France)通过Limulis阿米巴细胞溶胞产物(LAL)试验进行两种蛋白中内毒素的存在的检测。所有部分均在5IU/ml检测阈值以下。由Toxin Technology公司(Sarasota，Fl，USA)得到葡萄球菌内毒素，纯度为95％。大肠杆菌菌株026:B6的脂多糖得自Sigma Aldrich公司。
培养基
培养基是添加有下列物质的RPMI 1640培养基：
1％L-谷氨酰胺(Sigma-Aldrich)，
1％青霉素/链霉素(Sigma-Aldrich)，
1％丙酮酸钠(Sigma-Aldrich)，
1％非必需氨基酸(Sigma-Aldrich)，和
10％热灭活的FCS(胎牛血清)(BioWest)。
T细胞增殖实验中使用人AB血清(Sigma-Aldrich)代替FCS。
细胞的分离和制备
用Ficoll Paque密度梯度离心方法从正常供体分离人外周血单个核细胞(PBMC)。使用购自Miltenyi Biotec公司的单核细胞分离试剂盒，除去T细胞、B细胞、树突细胞、NK细胞和嗜碱细胞以纯化PBMC中的单核细胞。总之，首先将PBMC与单克隆抗体和结合于半抗原并磁性标记的抗人免疫球蛋白(CD3、抗CD7、抗CD19、抗CD45RA、抗CD56和IgE)的混合物一起孵育，然后再与偶联于抗半抗原单克隆抗体上的微球(MACs MicroBeads)孵育。最后将细胞保留在磁场中的柱上以除去磁标记的细胞。根据流式细胞仪分析的CD14的表达，所回收的单核细胞群体的纯度总是大于95％。为了产生单核细胞衍生的树突细胞(MDDC)，在含有IL-4(25ng/ml)和GM-CSF(50ng/ml)的2ml培养基中，在6孔平板上将纯化的单核细胞培养5天。培养的第3天，向细胞中加入完全量的细胞因子。如形态学分析和流式细胞检测所示，所得到的细胞制剂含有90％以上的CD1a阳性树突细胞。
细胞刺激
将浓度1×106细胞/孔，悬浮在1ml培养基中的细胞(PBMC，单核细胞或MDDC)加入24孔平板中，然后用Env-SU、LPS、SEB或自体对照物刺激。然后于37℃在5％CO2湿化气氛中孵育。细胞刺激之前，将细胞与10μg/ml多粘菌素(Sigma-Aldrich)、20μg/ml和5μg/ml抗CD-14单克隆抗体、20μg/ml和5μg/ml抗TLR-4抗体(HTA125、eBioscience)或2a型IgG对照(IgG2a)(eBM2a、eBioscience)预孵育。在某些实验中，进行细胞处理前，将Env-SU、自体对照物、LPS和SEB煮30分钟。
为了检测所得结果的特异性，将1μg Env-SU、LPS、SEB或自体对照物4℃与30μg/ml抗Env-SU单克隆抗体(13H5A5；IgGl；biomerueux)或抗GAG(3H1H6；IgGl，biomerueux)预保温。
将细胞于37℃孵育24小时，然后收获培养物上清，用ELISA方法分析TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌。
T细胞增殖实验
使用被刺激的单核细胞和MDDC作为T细胞刺激物。在96孔圆底微量滴定板中，使用1×105细胞/孔异源T细胞作为“反应者”细胞。以渐增量加入刺激细胞，并以200μl培养基的终体积，一式三份完成培养。37℃孵育5天后检测掺入的放射活性，以估计T细胞增殖。为此目的，在最后的18小时孵育中，向各孔中加入1μCi的3H胸苷。然后将细胞回收到玻璃滤层上，以检测所掺入的放射活性。
免疫荧光标记和流式细胞术
收获细胞，在PBS中洗涤，然后标记不同的表面标志物。使用下列单克隆抗体(Becton-Dickinson，San Jose，CA)：抗CD1a异藻蓝蛋白(HI149-APC)、抗异硫氰酸荧光素(MOP9-FITC)、抗CD40藻红蛋白(5C3-PE)、CD80藻红蛋白(L307.4-PE)、CD86藻红蛋白(IT2，.2-PE)和HLA-DR Peridine chorophyll(L243-PerCP)抗体。
在添加2％FCS的冰冷PBS中利用制造商推荐浓度的各种抗体对细胞进行直接免疫荧光染色。4℃30分钟后，洗细胞并使用FACS Calibure(商标名)和CellQuest软件(商标名)(Becton-Dickinson)进行分析。
细胞因子生成实验
在分析细胞因子的分泌之前，收集培养物上清并于-20℃保存。按照制造商推荐的方法，使用OptEIA(商标名)ELISA试剂盒(Pharmigen)检测IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12p40、IL-12p40和TNF-α的量。
结果
Env-SU诱导从人PBMCs产生促炎细胞因子。
检测重组Env-SU蛋白刺激PBMC培养物分泌细胞因子的能力。将得自正常供体的PBMC与渐增量的重组Env-SU蛋白孵育24小时，并用ELISA方法评价细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌。将所分泌的细胞因子的量与使用自体对照物、SEB(一种已知性质的细菌超级抗原)和 LPS等已知对人PBMC具有促炎性质的物质得到的结果进行比较。所有蛋白和毒素的浓度均为1μg/ml(以剂量/反应实验测定诱导促炎细胞因子的最适浓度)。
结果显示，Env-SU蛋白以剂量(即使是低至10ng/ml的剂量)依赖方式诱导三种细胞因子的分泌。如图2所示，用Env-SU得到的细胞因子分泌动力学更接近于LPS，然后才是SEB。事实上，在本文建立和描述的体外分析条件下，用Env-SU刺激完全不同于以SEB抗原为代表的超级抗原刺激：(i)没有TNF-γ(其为在T细胞受体(TCR)水平上被超级抗原特异性识别的T细胞活化信号)的早期分泌，(ii)IL-6(由单核细胞-巨嗜细胞而不是T细胞分泌的)和TNF-α的基本和早期分泌(在我们使用超级抗原的体外实验条件下，不能产生这些因子)。另外，通过其Env-SU区域MSRV/HERV-W Env蛋白对纯化的单核细胞和树突细胞的活性的例子证实，没有不存在于这些细胞上的TCR的参与，因此本文所述的特异性促炎作用是不同于由超级抗原功能引起的促炎活化，按照定义，其中包括与TCR和T细胞的结合。本申请所要求保护的MSRV/HERV-W Env蛋白的促炎活化途径涉及“Toll样受体4”(TLR4)，任选地借助其共同受体CD14，该受体为如图8所示的T细胞淋巴细胞活化的上游激活的。该促炎(TLR4)途径带动免疫系统的“天然”成分，即带动T淋巴细胞相关免疫(获得性免疫)的上游。在激活树突细胞之后，该上游途径可借助在对诸如TLR4天然免疫受体活化的反应中分泌的细胞因子影响下游获得性免疫(Th1或Th2)谱的活化状态。除了天然免疫途径(T淋巴细胞介导的获得性免疫的上游)被活化这个事实外，后一种作用还显示，所得到的对T淋巴细胞的下游作用并不涉及TCR受体。这就清楚地说明在这个水平上(TLR4)观察到MSRV/HERV-W Env(Env-SU)蛋白的作用与涉及T淋巴细胞受体(TCR)的超级抗原(此例子中以SEB超级抗原为例)作用之间是不同的。在这个阶段，TLR4途径排除了T淋巴细胞的初级活化，并因此而涉及其他细胞(单核细胞-巨嗜细胞、树突细胞、B淋巴细胞)。因此这里观察到的活化途径是超级抗原作用的上游，在本文所使用的细胞检测中，进一步证实其动力学相当于“LPS”而不是“SEB”。
事实上，Env-SU和LPS能够在24小时诱导大量TNF-α、IL-6和IL-1β 的分泌，而SEB只是在孵育72小时后才诱导TNF-α的分泌。有趣的是，Env-SU和LPS诱导可达到它们的TNF-α分泌高峰，而SEB则只诱导TNF-α的恒定分泌。就IL-1β来说，Env-SU和LPS的诱导分泌谱与TNF-α相似，特征是在经过一个恒定的降低后，于诱导的大约在孵育24小时达到分泌高峰。SEB(已知其可激活大量的携带同样TCR Vβ特异性的T淋巴细胞群)并不诱导任何IL-1β。Env-SU和LPS(而不是SEB)刺激的PBMCs持续分泌IL-6。IL-6和IL-1β是优先由活化的单核细胞/巨嗜细胞释放的两种细胞因子。这些数据显示，Env-SU以与LPS相似的方式，以先天免疫系统的细胞如单核细胞和巨嗜细胞为靶标，以释放促炎细胞因子，并且在这个活化水平上，T细胞并不是靶标。
为了排除Env-SU重组蛋白中内毒素污染的可能性，刺激前用LPS抑制剂多粘菌素B(PB)处理PBMC，或者使之与煮沸的蛋白和毒素一起孵育。同时，平行地加入使用同样反应物和材料生产和纯化的自体对照物：
酪蛋白激酶CK2。
孵育24小时后，收获培养物上清并分析TNF-α分泌。如图4所示，Env-SU和LPS诱导的TNF-α只受PB的部分抑制，而LPS的效应则被完全消除。对照自体蛋白不诱导任何细胞因子的分泌。当将Env-SU蛋白煮沸30分钟时，TNF-α的释放也明显受到抑制，而LPS活性则不受影响。这是与使用食品与药品管理局批准的LAL实验，对纯化的Env-SU和自体对照蛋白进行的质量控制分析中所得到的阴性结果一致的。
这些结果证明，早期所观察到的促炎效应并不是由于内毒素的污染，而且引起这些效应的成分确实是一种蛋白质。
为了进一步证实Env-SU之促炎性质的特异性，研究了单克隆抗体的作用。将自体对照物、Env-SU或LPS与抗Env-SU单克隆抗体或抗Gag单克隆抗体4℃预孵育1小时，然后再将PBMC与这些预孵育的自体对照物、Env-SU或LPS孵育24小时。用于发展这种单克隆抗体的Gag蛋白并没有表现出任何促炎活性，所以可作为适当的对照。如图4所示，抗Env-SU单克隆抗体特异地阻断Env-SU介导的TNF-α分泌，但并不阻断LPS介导的TNF-α分泌。细胞因子的分泌不受抗Gag单克隆抗体的影响。这些结果证明Env-SU在诱导细胞因子和细胞活化上的特异性。
Env-SU具有在PBMC培养物中诱导促炎细胞因子的能力。继后证实，Env-SU能够直接激活纯化的单核细胞。用自体对照物、Env-SU或LPS刺激纯化的单核细胞24小时，然后以流式细胞术评价各种活化标志物，如CD80和CD86。与自体对照物相比较，Env-SU诱导两种标志物的上游调节作用，并且所得到的表达水平相似于用LPS得到的结果(图5a)。在对Env-SU的反应中产生了大量的TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-12p40(图5b)。这些结果显示，Env-SU可诱导与促炎细胞因子产生有关的快速直接的单核细胞活化。
树突细胞是联系先天免疫和获得性免疫的抗原呈递细胞，其具有控制幼稚T细胞活化的独特能力。研究了Env-SU直接激活单核细胞衍生的树突细胞(MDDC)的能力。体外用自体对照物、Env-SU或LPS刺激了24小时的高度纯化的单核细胞产生树突细胞。Env-SU能够显著地增加CD80、CD86、CD40和HLA-DR标志物的活化(图6a)。促炎细胞因子IL-6、TNF-α、IL-12p40和IL-12p70以较高水平分泌。其显示，Env-SU刺激的MDDC能够诱导T细胞的异源增殖，甚至当刺激细胞的数目很低时也能比使用自体对照物产生更大的增殖(图6c)。因此，与LPS相似，Env-SU能够诱导分泌IL-2的树突细胞的成熟，并因此能够诱导原发性特异免疫反应。
为了确定Env-SU是否与LPS使用同样的活化途径，检测了在用或不用抗CD14或抗TLR4中和抗体预孵育、刺激后的PBMCs分泌的TNF-α水平。图7a中给出的结果显示，阻断CD14导致Env-SU、以及LPS介导的TNF-α分泌的明显剂量依赖性抑制(用20μg抗CD14抗体分别抑制83％和56％)。已知通过T细胞受体和HLA-DR活化T细胞和抗原呈递细胞的SEB没有被抑制。用20μg抗TLR4抗体阻断TLR4，导致Env-SU效应的37％抑制和LPS效应的43％抑制(图7b)。两个实验中，没有观察到对照抗体的抑制作用。因此，可以认为CD14和TLR4受体参与了Env-SU介导的促炎性质。
总之，MSRV/HERV-W包膜蛋白的可溶性部分通过CD14和TLR4识别受体刺激先天免疫反应，本发明中显示，可以通过给予含有至少一种选自抗Env-SU和/或抗TLR4抗体的治疗组合物或药物，使导致炎性 损伤的免疫病理学级联反应在很早阶段即被阻断。
因此，本发明试验了bioMérieux生产的抗MSRV/HERV-W包膜蛋白的各种单克隆抗体，建立并开发的细胞分析有可能鉴定这些具有抑制因激活TLR4途径而显示促炎作用的抑制性抗体，并选择抑制能力接近100％的抗体。在这些抗体中，优选的是3B2H4和12H5A5。
因此有可能在病理级联反应的的长途上游水平上，鉴定参与诸如MS和SCZ的病理过程的炎症早期阶段的抑制性质，所述的病理级联在这两种疾病过程的更下游发生偏离(如图8和9所示)。
相应于上面给出的定义，这些抗体可用于制备医药组合物或药物，因为它们有可能在长途上游阻断诸如MS和SCZ的病理学的病理过程级联反应。它们的优点也可以通过在与TLR4受体相互作用之前发挥的抑制作用得到证明，因为抑制作用等同于用于其早期活化研究的同一细胞试验中用抗TLR4抗体得到的作用。因此，这种T淋巴细胞活化上游的作用使之能够在这个阶段阻断诸如MS的自身免疫病理学和诸如SCZ的非自身免疫病理学中常见的病理性激动剂(参见图9)。因此，本发明的抗体有可能阻断如MS和SCZ的上游病理级联反应，其下游病理过程不同。图8显示，本发明的抗体所针对的靶在MS级联中。该级联预测了现有治疗剂针对的所有靶。事实上，在本发明的抗体干预阶段，只有一种激动剂(MSRV/HERV-W Env)和一种受体(TLR4)，而当受体活化后，则可有数百种生物活性分子形式(细胞因子、酶、自由基等)的激动剂参与炎性过程，然后例如在MS的情况下，在自身免疫T淋巴细胞克隆激活阶段之后，更有数千种分子和细胞激动剂的参与。在精神分裂症(SCZ)的情况下，不是在自身免疫途径中被激活的T淋巴细胞而是TLR4途径活化后在脑灰质细胞中产生的促炎介质，于相邻神经元水平上引起兴奋毒性。已充分描述了由促炎分子诱导的这些兴奋毒性现象，其在患者的前皮质中引起神经介质的异常释放，出现幻觉现象。更严重的是，这些兴奋毒性现象常常导致通过神经元死亡反映出来的神经毒性。现在已经知道，SCZ中的这种神经元死亡现象通常是通过MRI影象所看到的晚期患者的脑室扩大表现出来的。事实上，这些患者脑神经元的进行性丢失是从脑室体积的增加得到补偿，其在疾病发展到某个阶段后，可用MRI影象技术检测到。 因此图8和9清楚地说明这样一个事实，即借助本发明建立的细胞分析方法鉴定并选择的抗Env抗体，确实能够在激活MSRV/HERV-W家族的一个或几个病原拷贝后，阻断该级联最上游的“原始”刺激物。
为了证实MSRV/HERV-W逆转录病毒家族包膜蛋白(Env)的表达与MS和SCZ病理学之间的相关性，使用本发明中描述的先天免疫活化方法进行研究，来寻找与正常对照组相比MS或SCZ患者免疫激活的倾向性。
体外处理回输研究
多发性硬化(MS)患者的体外处理回输研究
在取自MS患者的体外处理回输(ex vivo)的血单个核细胞中，Env-SU诱导的IL-6分泌增加，并且与他们的临床记分相关
本研究中，比较了得自MS患者和正常供体的PBMC的Env-SU反应性。包括32个患者，根据MRI分析结果，其中20个处在急性期，12个处在稳定期。也按照EDSS(扩展的残疾记分)标准确定了他们的残疾水平。同时试验了19个正常供体。简单地说，将1×106个PBMC与Env-SU或Mock对照物一起孵育24小时，然后分析培养物上清中诸如IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的细胞因子的分泌。首先比较组间所得到的结果(Env-SU与Mock)。观察到两组间的IFN-γ、TNF-α、IL-1β和IL-10没有明显不同(图10)。但另一方面，IL-6和IL-12p40却显著不同，患者的这两种细胞因子均有增加(图11)。另外，观察到IL-6或IL-12p40的分泌水平与患者的临床记分之间成阳性相关(图12)。其他细胞因子或临床数据(年龄、性别、治疗)则没有得出其他相关性。图12中，诱导的IL-6和疾病持续时间之间没有相关性，而且作为例子给出的干扰素-γ和EDSS之间也没有相关性。
谈到由T淋巴细胞专门分泌的干扰素-γ，很有趣的是，与单核细胞/巨嗜细胞分泌的先天免疫相关细胞因子相反，该因子与临床记分(EDSS)并没有关联。这就清楚地表明，如体外细胞分析所证明的，体外处理回输所揭示的效应与这个阶段由T淋巴细胞介导的效应无关，因此与超级抗原效应无关。
这些结果表明，表现有最晚期临床信号(高EDSS)的MS患者对诸如Env-SU的逆转录病毒因子是“超敏感的”，而且可能还表明Env-SU通过促炎细胞因子和IL-6在MS的发病机理中发挥作用。
这就进一步证实了在Sotgiu等人研究中用MSRV病毒负载MS患者的CSF所得到的结果，他们的实验显示，MSRV病毒负载随疾病的恶化程度逐渐增加。根据本发明的结果，MSRV包膜蛋白诱导的反应以相互关联方式，随用EDSS检测的疾病严重程度而加强。在MS患者身上以不同方法(首先是用RT-PCR方法检测MSRV核酸，其次是检测对MSRV包膜蛋白的免疫反应)完成的两个独立研究证实了疾病本身的进程与MSRV逆转录病毒之间存在相关性。
精神分裂症(SCZ)患者的体外处理回输研究
取自SCZ患者的体外处理回输的单个核细胞中Env-SU诱导的IL-12p40分泌增加，使之有可能在最高水平上鉴别出有抗心理治疗耐受性和/或具有精神分裂症的特殊演化形式的患者亚群。
在该项研究中，比较了SCZ患者和正常供体之PBMC的Env-SU反应性。研究对象包括25个患者。平行地，按照以前对MS患者使用的同样方法试验了15个正常供体。
分析培养物上清中诸如TNF-α、IL-12p40、IL-1β、IL-6和IL-10的细胞因子的分泌。该研究中，观察到某些SCZ患者和所有对照之间多种细胞因子的显著差异。表1中给出的是正常供体的结果，第一栏各行指出的是编号，栏的顶部指出的是所检测的不同细胞因子的量(ng/ml)，而它们各自所占栏下行中指出的是两种条件(Mock和Env-SU刺激)。表2给出的是不同MS患者的结果，第一栏各行指出的是编号，栏的顶部指出的是所检测的不同细胞因子的量(ng/ml)，而它们各自所占栏下行中指出的则是两种条件(Mock和Env-SU刺激)。在表1和2中，各栏底下两行(mean和St Dev)指出的是所测数据的平均数和标准差。
表1
表2
与以前研究的MS人群相比较，在某些患者的培养物中已经自然地看出了差异(如图13和14所示的IL-10和IL-12p40的示例说明)。这就证明一个不可预见的事实，即虽然SCZ不是全身性炎性疾病，甚至也不太是自身免疫病，但某些SCZ患者的PBMCs却表现有一定程度的自发性免疫活化，在同样条件下，其程度超过正常对照和MS患者。这就在这些患者的系统性免疫活化中引入了一个重要证据，并因此而进一步证实这种促炎免疫成分在该疾病中存在的真实性。
总地说来，在SCZ患者系列中，对Env-SU刺激的反应进一步增加， 并且某些患者的细胞因子分泌水平明显大于正常对照的平均数，甚至有时大于对照组系列中观察到的最大值(见图13和14中就IL-10和IL-12p40所作的举例说明)。这也证实，在某些SCZ患者中，对Env-SU的反映显著增加，并因此证明在某些临床状态相符的患者中，Env-SU能够揭示那些涉及可通过TLR4途径激活的先天免疫成分的免疫倾向。
然而，这些患者中Env-SU刺激后涉及到的自发细胞因子水平(刺激水平-自发水平/自发水平)的增加，在SCZ患者中总地是比正常对照组小；甚至ENV-1诱导的分泌水平也超过所有正常对照的情况下(见图14b和14c中就IL-12p40所作的举例说明)。相对诸如MS的病理学的上述描述中，这就在MSRV/HERV-W家族逆转录病毒成分的发病机理作用中引入了一个新的因素。事实上，独立的研究小组[3、14、31、54]用不同的方法已证明并进一步证实该MSRV/HERV-W家族逆转录病毒成分在SCZ发病中的作用。但是SCZ并不是一种有象MS那样的借助自身免疫病理成分的疾病。因此，用Env-SU在SCZ患者的PBMC上得到的结果显示，虽然涉及T淋巴细胞的免疫活化下游不同于MS，但涉及TLR4受体(其不T淋巴细胞中)的先天免疫的早期活化途径可能仍在两种疾病和MSRV/HERV-W逆转录病毒家族之间构成初始病原学途径。
如以前提到的，根据患者血单个核细胞(PBMCs)对Env-SU蛋白的特异性免疫反应性，已渐渐明确了MSRV/HERV-W包膜蛋白在这些患者中的作用。
就SCZ患者的临床数据来说，在研究的这个阶段观察到IL12p40最具优越性和最相关差异。
事实上，已证明表现一个最高水平Env-SU诱导的IL12p40(大于400ng/ml，因此为该系列中试验的对照组的最大水平)的患者包括所有对试验系列的抗心理治疗有耐受性的患者，并且表现有精神分裂症的特殊演化形式。
有不同于以前得自MS患者的特征这一点说明，至少存在有一个不同演化形式和/或对已有治疗有耐受性的形式的患者亚群，而这可以根据Env-SU诱导的IL12p40分泌大于平均值得以鉴定和表征。
在SCZ患者的PBMC中，至少Env-SU活化所诱导的IL12p40在演 化形式和/或抗目前治疗方法方面中为最大这一事实证明，除了演化标准与疾病的严重性之间的关联外，这些患者的新的治疗靶即MSRV/HERV-W Env蛋白还与患者的这种免疫倾向有关。
如在MS模型中所证明的，能够在TLR4受体介导的“上游”途径的参与之前抑制免疫系统活化的抗体具有治疗意义，而且它们的靶在新近认识到的临床生物学方面也是很有宜处的。
与MS相反，当这些效应的后继结果是靶向髓磷脂抗原成分的自身免疫反应性时，先天免疫的这个早期阶段(TLR4)产生的介质具有高于MS的体外处理回输自发水平，并且对皮质神经元具有刺激毒性潜能[17、21、23-25、29、50、51、55]。
因此，由不同辅因子活化的MSRV/HERV-W原病毒可激活脑细胞中MSRV/HERV-W Env蛋白质的表达[56]，并且根据辅因子和环境性质的不同，是靶向脑中不同的区域。在这些条件下，前皮质区域的活化可引起神经元兴奋毒性，其依赖受影响之区域的不同幻觉来反映出来。
在(有髓鞘的)白质活化的情况下，在巨嗜细胞和/或小胶质细胞水平上由Env蛋白产生的早期炎症能够刺激髓磷脂降解，并因此在来自T淋巴细胞的贡献后能够诱导抗髓磷脂自身抗原的自身免疫反应。
图9中举例说明了所揭示的这些概念。该图显示，其可在精神分裂症患者中确定的临床生物学中，用于抑制与该疾病的症状明显相关的该神经毒性炎性成分。
此外，也如图8所说明的，这些抑制Env-SU蛋白的生物学效应的抗体水平明显是所有病理学介质的上游，而病理学介质则是下游产生的，并且是常规抗炎治疗的常用靶(细胞因子、自由基、氧化还原化合物、酶、前列腺素、促炎蛋白和脂质、激活的T细胞等等)。在这个阶段，仅有的激动剂是MSRV/HERV-W Env蛋白本身，并且阻止其活化的TLR4受体阻断不同的免疫级联反应由此进入下游的初始途径(参见图8和9)。
进行下列的临床前研究是本领域技术人员应知的范围：
-按照用于诸如抗TNF-αREMICADE的已知治疗抗体的方法完成单克隆抗体的人源化。治疗抗体的大脑内传代的优化是按照许多科学和医学 出版物例如Merlo等人或Pranzatelli描述的已知技术进行的[57、58]；
-用本发明中描述的Env-SU蛋白对PBMC的促炎活化实验证实这些人源化的或修饰的抗体的抑制活性；
-用证明脑中MSRV/HERV-W Env蛋白异常表达[59]的行为效应的动物模型证实抗体的治疗作用。
因此，本发明的要素是：
-在先天免疫的细胞水平上证明MSRV/HERV-W包膜蛋白的“TLR4”受体为“上游”促炎活化的进入途径，
-使之有可能确定和检测这些效应的细胞分析，
-能够抑制此蛋白质之效应的抗Env单克隆抗体，
-这些效应在精神分裂症患者体外处理回输的血免疫细胞水平上的生物学证据，
-这些效应有关的生物学证据使得本领域技术人员用迄今已知的知识、技术和动物模型，来完成临床前开发步骤，并在适当条件下进行人的临床研究。另外，本发明中描述的生物学试验允许在治疗之前、期间和之后，借助简单的血液样品对这些治疗性抗体所针对的参数进行体外处理回输生物学研究。
这些治疗指南为在某时或某亚群中定义适合于进行治疗的患者是很有价值的，并使之有可能根据生物学研究结果调整治疗剂量和频率。
动物模型
生产用于研究治疗性抗体和对照的药代动力学分布和毒物学，动物模型。
抗体：
1、抗体的性质：
为防止在肝中过快和过度的降解，使用按照已知技术得到的单克隆抗体的Fab′或Fab2型片段[60]。抑制由TLR4介导的促炎效应的抗MSRV/HERV-W Env抗体是抗体13H5A5和3B2H4。抗MSRV/HERV-WGag对照抗体是抗体3H1H6。
2、抗体标记方法：
首先稀释这些抗体片段。因此制备100μl浓度为1μg/μl的溶液，然后与吸附到小珠(Iodobeads No.28665Pierce Rockford，Illinois，USA)上的碘化钠(NaI125NEN，5mCr/50μl)接触。
孵育10分钟后，除去溶液并转移到无小珠的管内。这种方法使之可以终止反应并因此避免抗体活性位点的氧化导致的功能丧失。
然后用10μl焦硫酸钠(Fluka)溶液(4mg/ml)中和样品。最后，使用10μl剂量浓度为250nM/ml的导引剂导引碘化钠。
3、纯化
用阴离子交换柱分离技术进行纯化。该方法使用阴离子交换柱结合游离碘。最后，用2ml 0.9％NaCl溶液(Aguettant)、迁移缓冲液活化之。分4次完成纯化，用0.5ml 0.9％NaCl导引。然后计数四个管中的放射活性。
4、产率
结果示于表3中，其代表纯化后各抗体的百分回收率。
孵育10分钟后校正标记产率。一段时间内产率没有增加。获得的所有片段的百分率均在70％-80％之间。
离子交换纯化使标记的抗体有良好的回收率。对于3B2H4 Fab2片段，该比例只有50％。
生物分布的评价
1、小鼠
用于实验的动物是由Charles River Laboratories(Wilmington，NorthCarolina，USA)提供的7周龄BALB/c小鼠。供应商保证动物是健康的。
实验前，动物一直被喂养在循环光照的温和条件的装置中。
2、方法
每个片段试验3只7周龄BALB/c小白鼠。
第一步，用戊巴比妥或2％Ketamine-xylamine混合物(10g/ml，V/V)麻醉动物(1μl/g体重)，给药剂量为1μg/g重量。
然后静脉内注射0.15mg用700μCi/mg标记的抗体(小鼠接种所试验的三种抗体(3B2H4、13H5A5和3H1H6)之一的片段)。
注射后10、45、90和210分钟进行读数。
210分钟后，杀死小鼠并分离下列组织：脾脏、肾脏、脑、心脏、肺脏和血液。尾部也保留以便调整所得到的值。
3、结果
没有观察到与这些抗体相关的、引发急性毒性的组织病理学改变。
表4中总结了抗体生物分布分析的结果，其代表静脉内注射后210分钟，标记的抗体剂量在不同器官中的分布。
表4所是结果证明所试验的片段在组织中均没有异常结合。
这些结果证明，抗体没有急性毒性，能够在生物液和组织中检测到，并且它们的分布与本领域技术人员所期望的对应。
因此，可以根据同样或等同的方法，参照其药代动力学和毒理学，评价这些抗体分布的最佳化和/或它们修饰后的这些常数的任意鉴定。
表3：用碘125标记期间抗体片段的百分回收率
表4：在BALB/c小鼠注射后210分钟见于不同器官中的抗体剂量的平均数
| 3H1H6 | 3B2H4 | 3B2H4 | 13H5H1 |
与患者的直接研究平行地制备动物模型，有可能以其进一步证实：一在体内清楚地观察到相当于活化途径“单一先天免疫”(模型SCID-hu和Env-SU蛋白)或“先天免疫和对T淋巴细胞的超级抗原作用”(模型SCID-hu和病毒颗粒)的“促炎”病理学，并可借助客观标准进行分析。途径“先天免疫/TLR4+/-CD14活化途径”是本发明的主题，并且具有阻断促炎级联反应上游的优点。
-用MSRV/HERV-W Env蛋白明确地获得如MS中的针对髓磷质自身抗原的自身免疫病理学，并可对其进行分析。
-使用根据其抑制性质选择的抗Env单克隆抗体及其携带免疫学识别特异性的片段，是与在动物(模型BALB/c，放射标记的抗体)体内具有可检测的器官分布、并且没有器官毒性的治疗组合物相容的。
在TLR4/先天免疫途径的“细胞”活化实验中，借助先前对抗Env单克隆的选择获得抗Env抗体的治疗应用。在Env诱导的“MOG”(髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白)自身抗原存在下，在模型如“EAE”(实验性变应性脑脊髓炎)中举例说明了这种应用，并使之有可能抑制除本文已充分描述的促炎活化期外，还可抑制更下游的病理学后果(参见：抗Env抗体在EAE-MOG模型中的抑制作用)。
此外，在借助本发明中描述的体外细胞实验选择了抑制促炎效应的抗Env抗体后，可利用动物模型从此首先的选择中进一步选择既具有治疗用途又没有副作用的治疗性抗体。事实上，如在“EAE-MOG”中可能会增加神经损伤的抗体所显示的，某些抗体可能证明不适用于治疗，而 不管其特异性如何，并且即使它们抑制病理靶，这些副作用也必然使之被排除或者在将其用于治疗前被修饰。因此本发明期间发展的工具使之有可能在病理学应用方面鉴定这些可能的有害作用，并因此可以以原始和适当的方式，贡献于选择和证明适用的治疗性抗体。
细胞和动物炎性模型：
材料和方法
蛋白质和毒素
大肠杆菌菌株026：B6的脂多糖(LPS)得自Sigma(St Louis，Mi)。重组Env-SU蛋白是整个MSRV包膜蛋白ENV pV14的一部分，分子量大约33KDa，287个氨基酸。在大肠杆菌中产生Env-SU，层析纯化并用Western印迹方法(Protein Expert，Grenoble)分析。进行LAL试验(鳌变形细胞溶解物试验、Clean Cell，Bouffere，France)，以检测可能存在的内毒素。结果为阴性，低于检测阈5IU/ml。实验中使用用来保存蛋白质的缓冲液作为阴性对照。该缓冲液由50mM Tris(pH8)、0.3M NaCl、lmMβ-巯基乙醇、2％蔗糖、2％甘油和5.3mM尿素组成。
细胞培养
PBMCs的制备
用Ficoll(Amersham Biosciences，Freiburg，Germany)密度梯度离心法从正常供体的枸橼酸化新鲜全血(枸橼酸化新鲜全血袋，Centre deTranfusion Sanguine[血库]，Valence，France)中制备PBMCs。用10ml的PBS-2％FCS(胎牛血清)稀释的25ml血液，小心加在15ml Ficoll上，室温(AT)下以2400rpm离心20分钟。回收含细胞的带，并用50ml PBS-2％FCS洗细胞三次(图11)。用台盼蓝染色并计数后，在90％dFCS-10％DMSO混合物中于-80℃冻存细胞，并直接用于细胞检测的培养或用于给小鼠注射。
鼠脾细胞悬液的制备
断颈处死小鼠后，除去脾脏并在RPMI中于金属过滤器上研碎。4℃下以1200rpm离心10分钟。然后在大约4ml生理盐水或dFCS中悬浮细 胞沉淀物(分别用于给C57B16小鼠注射或冷冻)。台盼篮计数后调整细胞浓度。然后冷冻细胞或用于动物模型。为了给小鼠注射，加入浓度为0.2mg/ml的庆大霉素。最后，取500μl(即50×106个细胞)给每只C57B16小鼠腹腔内注射(IP)。
细胞的冻融
在50ml PBS(bioMérieux，France)中4℃洗细胞悬液一次，并于4℃下以1400rpm离心7分钟。然后将细胞重新悬浮在少量FCS中并计数。调整细胞浓度到20×106/ml。将500μl该溶液放在冷冻试管中，然后加入500μl冷冻溶液(80％dFCS-20％DMSO(Sigma))。细胞被保存在1ml90％FCS-10％DMSO溶液中。将冷冻管放在含有异丙醇的冷冻盘中，使温度慢慢降低，并于-80℃下保存。
于37℃，将细胞悬浮液在水域中融化。在将该冷冻管打开之前，用乙醇洗之。将细胞快速地转移如50ml RPMIc-10％dFCS中并在4℃，1400rpm离心7分钟，随后用RPMIc-10％FCS另外洗两次。
培养物维持
在含5％CO2的湿气环境下37℃孵育细胞(PBMC)培养物。所使用的培养基由添加1％L-谷氨酸、1％青霉素-链霉素、1％丙酮酸钠、1％非必需氨基酸(Sigma)和1％加热(56℃，30分钟)去补体的胎牛血清(dFCS)(Biowest，Nuaille，France)的RPMI1640(Gibco Rocville，MD)组成。
细胞刺激
融化细胞悬液(PBMCs或脾细胞)并进行台盼篮计数：将细胞浓度调整到1×106细胞/ml。在48孔(每孔500μl细胞悬液)或24孔(每孔1ml细胞悬液)平板中加入该培养物。然后加入各种待测物质并孵育不同时间。室温下，将细胞悬液于6000rmp室温离心10分钟以收获上清。然后在Eppendorf管中于-20℃冷冻。除特别指出外，用于细胞检测的Env-SU和LPS浓度均为1μg/ml。对于某些实验，Env-SU和LPS被煮沸30分钟。多粘菌素B(PB)浓度为25g/ml，并在加入缓冲液、LPS或Env-SU之前于 37℃与细胞预孵育45分钟。对于需要使用抗体的实验，需要于4℃或37℃将细胞与抗体、或者Env-SU、LPS或缓冲液与抗体预孵育不同的时间。分别用重组Env-SU或Gag蛋白免疫小鼠后，培养杂交瘤细胞以得到抗Env-SU(13H5A5和3B3H4)和抗Gag(3H1H6)IgG单克隆抗体(bioMérieux)。用ELISA方法证实抗Env-SU抗体的特异性。除特别指出外，用于细胞检测的13H5A5、3B3H4和3H1H6的浓度均为30□g/ml。
动物模型
小鼠的喂养
购买5或6周龄的C57B16、BALB/c或SCID小鼠(Charles River，LArbresle，France)并于得到后喂养一周。将动物圈养在温度为24℃的无菌过滤笼内。所有操作均在层流下进行。
SCID小鼠的人源化和C57B16小鼠的准备
适应一周后，给SCID小鼠腹腔内注射(IP)50×106个悬浮在添加了庆大霉素(0.25mg/ml)但没有酚红的2ml RPMI(Eurobio，Les Ulis，France)中的新鲜人PBMCs，然后再休息一周。为了保证良好的人源化，注射PBMCs之前两天通过RO途径注射50μg抗NK抗体(25μl纯抗体稀释在25μl生理盐水中)。人源化后一周，通过RO途径采集各小鼠的血液，并将血清于-80℃保存，以试验小鼠的人源化程度。
适应一周后，给C57B16小鼠腹腔内注射(IP)50×106个悬浮在添加了庆大霉素(0.25mg/ml)但没有酚红的2ml RPMI中的新鲜鼠脾细胞，然后再休息一周。IP注射期间，如同在SCID小鼠中一样，液体被迅速吸收，但也观察到有部分丢失。
人源化SCID小鼠中人IgG的分析
按照制造商的指导(结合位点，Birmingham，UK)，用放射免疫扩散方法检测SCID小鼠血清中的人IgGs。血清在凝胶上沉淀后96小时，检测沉淀物的直径便可能借助标准曲线根据其面积估计所试样品的IgG浓度。
不同物质和小鼠样品的注射
第0天，给小鼠腹腔内注射在1ml生理盐水(Fresenius Kabi，BadHomburg，Germany)中稀释到所需浓度的蛋白质(Env-SU)、毒素(LPS)或缓冲液。为注射抗Env-SU或抗Gag抗体，预先将后者与Env-SU、LPS或缓冲液4℃孵育3小时。给予对照小鼠1ml生理盐水。几小时(1小时、2小时)或几天(24、48、72小时)后取样。用乙醚麻醉小鼠后，用Pasteur吸管通过后眼眶(RO)吸取最大量血液(大约1ml)。然后腹腔内注射2ml生理盐水，并在按摩腹部后排除最大量的液体(1-1.5ml)。最后，断颈杀死小鼠并取出脾脏。图12、13、和14中给出了所使用的各种方法。对小鼠进行临床观察，直到实验结束。特别记录了炎症征象和神经系统损伤征象。
小鼠样品的处理
将取出的脾分成两部分。将其中一部分在RPMI中制成悬液。4℃下以1200rpm离心10分钟后，将细胞重新悬浮在50ml(4℃)PBS中，然后离心并于冷冻管内在1ml冷冻溶液(10％DMSO-90％FCS)中冷冻。在离心管(Effendorf)中-80℃冷冻另一部分脾脏。室温下将腹腔内抽出的液体在6000rpm离心10分钟，以除去细胞沉淀物，并在离心管中-80℃冷冻。用PBS洗涤后，冷冻从腹腔内取出的细胞。室温下，将血液6000rpm离心10分钟，以回收血清。然后于-80℃分别在离心管中冷冻血清和细胞沉淀物。
结果的处理
细胞标记和流式细胞术
融化细胞悬液，将细胞重新悬浮于50ml PBS-2％dFCS-1mM EDTA中并于4℃下以1400rpm离心7分钟。进行台盼篮计数并将细胞加于96孔板中(大约1×106细胞/孔)。4℃下以4000rpm离心1分钟后，除去上清并在各孔中加入50μl表面标志抗体(PBS-2％dFCS-1mM EDTA中稀释)的混合物。悬浮该细胞并于4℃孵育30分钟。然后每孔加入100μlPBS-2％FCS-1mM EDTA洗细胞，并于4℃下以4000rpm离心1分钟。
除去上清并在每孔中加入200ml PBS-2％FCS-1mM EDTA。重新悬浮细胞并转移到小管中以进行FACS分析(图15)。对于需要链霉抗生物素蛋白-APC第二标记的抗体，再进行一次同样的循环。用于标记鼠细胞的抗体(Pharmingen，San Diego，CA)和其稀释度如下：CD3-FITC(1/500)、CD4-PE(1/1000)、CD8-cy-chrome(1/600)、CD25-APC(1/1000)、CD69-APC(1/500，开始时即已生物素化)。使用各2□1下列抗体标记人细胞：CD3-cy-chrome、CD4-APC、CD8-PE、CD25-PE、CD69-FITC。
细胞因子的分析
将培养物上清、血清和得自腹腔内的液体保存在-20℃，然后用ELISA方法检测细胞因子。按照制造商(Pharmingen)的指导，使用ELISA方法检测人或鼠细胞因子(TNF-α和IL-6)。
在先天免疫的细胞水平上抑制由MSRV包膜蛋白诱导的促炎效应的抗包膜抗体的选择
在正常供体的血液单个核细胞(PBMCs)培养物中，试验bioMérieux公司单克隆抗体实验室生产的多种抗MSRV/HERV-W包膜蛋白抗体，其是在有或没有Env-SU蛋白的情况下通过检测细胞因子(IL-6和/或TNF-α)，按照本发明中描述的方法，特别是用杂交瘤3H10F10、13H5A5、6A2B2、2A12A5、3C1D5和3B3H4产生的抗体来进行的，以确定它们通过已证实的途径即“TLR4”受体途径对存在于培养物中的单核细胞/巨嗜细胞的活化效应。
在这些检测中某些抗Env抗体没有可检测的抑制活性(6A2B2和2A12A5)，或有轻度抑制(3C1D5)或有用不同供体的PBMC完成的实验的不相等的活性(3H10F10)。图15(15a、b、c和d)中显示了这些检测的例子，其中举例说明了这些抗体在多个实验中对Env-SU蛋白产生的促炎活化所发挥的效应。
另外，由诸如杂交瘤2A12A5生产的抗体对Env-SU蛋白没有抑制活性，可疑是在即使没有Env-SU蛋白存在的检测中产生了非特异性免疫刺激所致。
这些相同检测中，对照抗体没有显示出任何特殊的抑制或刺激活性，特别是抗GAG抗体3H1H6。
就Env-SU蛋白对各正常人供体的PBMCs的效应来说，由杂交瘤13H5A5和3B2H4产生的抗MSRV/HERV-W Env单克隆抗体被证明是有恒定抑制性的，在实现的条件下所完成的可检测的不同的正常人供体的PBMCs之间没有任何模棱两可的抑制效应或任何明显的变异。
图15a举例显示了抗体3B2H4和13H5A5具有抑制活性，并且抗MSRV GAG抗体3H1H6没有效应。抑制作用的特异性条件被证实是与这些抗体没有作用的刺激该活化途径的另一个配体有关(LPS)。图15b显示，在没有同一条件下生产和纯化的对照(Mock)蛋白的存在情况下，在已证实没有污染、没有使用Env-SU样品的实验中，用细菌LPS证明了Env-SU蛋白活化的特异性条件(100℃加热使蛋白质而不是LPS变性而产生抑制作用，抑制LPS效应的多粘菌素则没有抑制作用)。
因此，实验了bioMérieux公司得到的抗MSRV/HERV-W包膜蛋白的多种单克隆抗体后，使用本发明中建立和开发的细胞分析便有可能从抑制性抗体中，鉴定出那些能够激活TLR4途径的抑制促炎效应并且抑制潜力接近100％的抗体。这些抗体中，优选的是3B2H4和13H5A5。因此进一步证实了上述用本领域技术人员熟知的常规技术生产的这些和其他抗体的有用性。
在移植功能性人淋巴样系统的动物模型中，MSRV Env蛋白对人免疫系统的作用
小鼠的制备
下列实验包括17只6周龄雌性C57B16小鼠。第一步包括腹腔内注射50×106个人PBLs。先照射小鼠然后给予注射抗NK抗体(fircouzi et，al.，Journal of Neurovirology 2003)。使小鼠休息一周，以稳定其免疫系统。
人PBLs的制备
将细胞悬液集合在50ml试管中，并于4℃以1200rpm离心10分钟。
然后将细胞沉淀物加于大约4ml生理盐水中。台盼篮计数后调整细胞浓度。加入浓度为0.2mg/ml的庆大霉素。最后，每只动物腹腔内注射500μl即50×106个细胞。接种批次的构成如下：
将小鼠分成3或4组。按下述方式定名如此形成的各批：
-3*“C”：给予ENV1缓冲液的阴性对照组。
-3*“LPS”：炎性反应阳性对照的LPS注射的组。
-3*“Env”：注射MSRV病毒包膜蛋白溶液的组。
-4*“2GR412”：注射经56℃加热30分钟失活的MSRV病毒的组(在没有病毒复制的情况下试验病毒颗粒包膜蛋白的作用)。
-4*“GRE”：将已被热灭活的和在阴性对照中高度稀释的GRE病毒感染的组(在输入含病毒血症供者衍生产物的血液混合物的情况下，用以评价有该病毒颗粒污染的生物学样品的任何可能的影响)。
以单一腹腔内给药的方式用适当体积的溶液感染各组小鼠(LPS和Env的量与实验中所使用的PBMCs浓度相对应)。以以下列方式滴定溶液：
“LPS”：50μg/小鼠；“Env”：50μg/小鼠(注射500μl)；“2GR412”和“GRE”：100μl超离心沉淀物/小鼠。
用无菌生理盐水制备所有必需的稀释液。
观察和样品：
D+1小时/D+2小时/D+24小时/D3：处死和样品。
每组处死一只小鼠。腹腔注射2ml生理盐水，腹腔穿刺并排除最大量液体(1-1.5ml最大量)。离心悬液(6000rpm/10分钟/室温)，以除去可能的细胞沉淀，并于-80℃在离心管内冷冻。
通过后眼眶途径用吸管采集最大量血液，并加入肝素小管中。室温下以6000rpm离心10分钟。回收血浆和细胞沉淀物并在离心管内分别于-80℃冷冻。
将切除的脾分成两部分。其中一部分被制成悬液(以用FAC方法完成人和鼠表型分型)：在大约10mlRPMI中，于筛网上研碎，4℃下以1200rpm离心10分钟后，用约15ml PBS洗(4℃)细胞，然后离心。于冷冻管 内在lml冷冻溶液(10％DMSO-90％FCS)中冷冻。在离心管中-80℃冷冻另一部分(用于可能的PCR)。
除非较早地出现临床征象，均于24和48小时后完成该过程(死亡前监测并回收小鼠)。为留下的两只“2GR412”和“GRE”组的小鼠，于15-20天后杀死它们或在其较早出现的死亡后立即回收。
样品的这一分别使我们有可能涵盖立即(2小时)、较早(24小时)和延迟(10-15天)免疫反应。
用ELISA方法和细胞培养物的生物分析检测生物体液样品中的人和鼠细胞因子(IL-6和TNF-α)，并检测“Env”蛋白和/或病毒滴度。
这些分析使评价免疫反应成为可能：炎症(细胞因子)和细胞分布(FACS)，并筛查任何的病毒复制(ELISA，生物分析)。
临床观察
实验结束前，对所有小鼠进行临床观察。特别是记录动物的炎症征象和神经损伤征象。
结果：
此部分的目的是对人源化SCID模型进行体内研究，借助此前完成的可行性研究所确定的参数来研究Env-SU的特性。
Env-SU对PBMCs培养物的促炎效应
首先，我们研究了人PBMCs培养物中由Env-SU和LPS诱导的TNF-α生产的动力学。所使用的蛋白质和毒素的浓度为1μg/ml(图16)。我们可以观察到，注射后2小时细胞因子的产生达到峰值，然后逐渐降低并在48小时后变为零。Env-SU注射后检测TNF-α是很有意义的。特别是，细胞与缓冲液孵育只产生很小量的TNF-α，2小时很少达到30pg/ml。用Env-SU刺激后2小时、24小时和48小时分别产生550、350和160pg/ml。LPS的作用稍微大些，于2小时、24小时和48小时分别产生650、180和50pg/ml。如已经显示的，这些研究进一步证实Env-SU蛋白对PBMCs的促炎特性。也观察到TNF-α的产生于注射后2小时达到最大。这些数 据有可能限定适于研究SCID模型的采样动力学，即2小时、24小时和48小时。
Env-SU对人源化SCID小鼠(SCID-hu)体内的促炎作用
在观察了Env-SU蛋白对多种人和鼠细胞培养物的促炎效应后，我们进一步在体评价了这些物质对SCID-hu小鼠的致病性。
一组16只小鼠在通过后眼眶途径给予50μl抗NK抗体后，移植(IP)50×106个人PBMCs。一周后，采集各小鼠血并分析其血清中的人IgGs，借以证实小鼠的人源化。通过放射免疫扩散实验，我们能够确定所有SCID-hu小鼠血清中人IgG的浓度远高于4.5mg/l。IgG在SCID-hu小鼠体内的半寿期为12天。因此我们可以确认，在我们的实验条件下，小鼠的人源化是成功的。
然后将小鼠分为五组，每组包括分别注射了0.2ml缓冲液、在2ml生理盐水中稀释的50μg Env-SU或50μg LPS的三只小鼠。注射后2、24和48小时分别杀死每组一只小鼠。处死之前，所有小鼠都是活的，并且未见神经系统被感染的外在征象。
用ELISA方法分析人和鼠的TNF-α和IL-6细胞因子。图17所示的结果表明，人或鼠细胞因子的产生遵循同样的趋势：注射后2小时急升，然后几天逐渐变为零。总之，这些动力学与体外观察到的PBMCs的动力学特征相同。注射缓冲液的小鼠未见明显的细胞因子产生。小鼠TNF-α的分析显示只有一个大的峰：已给予LPS的小鼠血清中的TNF-α水平大于1000pg/ml。至于小鼠IL-6的分析结果，可见注射Env或LPS的小鼠腹腔内液体中IL-6水平约达到20,000pg/ml。发现这些小鼠血清中的TNF-α和IL-6浓度分别达到6200pg/ml和高于20,000pg/ml。
对人细胞因子的分析显示，腹水液中的细胞因子水平高于血清。这是因为，在蛋白质和毒素给药之前，小鼠移植细胞只有十天左右，PBMCs向脾和次级淋巴样器官迁移并克隆的时间较短(迁移细胞的数量相对较少)。此外，Env-SU主要靶向单核细胞，并且其在组织中迅速分化为巨嗜细胞。这些细胞的黏附性很强，并且将优先粘着于腹腔内而不是克隆在次级淋巴样器官。因此，在移植细胞的部位即腹腔内(IP)发现有更多细胞 因子产生，应是符合逻辑的。
人TNF-α分析揭示，注射Env-SU的小鼠腹腔内TNF-α浓度达到1400pg/ml，并且注射LPS的小鼠腹腔内TNF-α达到3000pg/ml，血清中也达到1200pg/ml。IL-6检测也显示同样的趋势，注射Env-SU的小鼠腹腔内IL-6浓度为1700pg/ml，并且注射LPS的小鼠腹腔和血清内IL-6分别达到9600pg/ml和1400pg/ml。
决定分析SCID-hu小鼠体内的鼠细胞因子似乎是难以想象的，因为前者缺乏T和B细胞。然而，单核细胞/巨嗜细胞群体仍是有活性的，并能够在这些小鼠体内产生TNF-α和IL-6。因此显示，所测得的鼠IL-6浓度总是大于人IL-6浓度，不过TNF-α则不是这样。这全面地说明，体内，在不存在功能性淋巴细胞的SCID模型(小鼠成分)中，MSRV包膜对先天免疫成分是有直接作用的。
在提供了人PBMCs的体外实验证据后，本研究的目的则是评价与重组包膜蛋白Env-SU有关的体内致病性。Env-SU蛋白和LPS促炎作用的特征是在SCID-hu小鼠体内观察到TNF-α和/或IL-6的大量和独立产生(注射后2小时)。得到这些结果后，在对C57B16小鼠进行的现有“技术”可行性研究中，有可能证明采样和分析细胞因子(在血清中和通过腹腔)的实验方法能够用于在鼠模型上建立的人源化SCID小鼠。
EAE模型
EAE模型是一种多发性硬化的动物模型，该模型是基于外周诱导的针对髓磷脂决定基的自身免疫而建立的。
该模型是迄今用于证明多发性硬化之治疗剂的有效性的参考模型。
此模型的特征是存在自身反应性T淋巴细胞和由于脱髓鞘所导致的严重的神经损伤。
其开发通常是基于给C57B16小鼠注射偶联于适当佐剂(完全弗氏佐剂)上的髓磷脂肽(与注射百日咳有关的)。
含有失活的分支杆菌的佐剂可打破对髓磷脂的耐受性并促进自身活性T淋巴细胞的发育。
百日咳毒素促进血-脑屏障的开放，而且也在打破耐受中其作用。
其显示，Env-SU通过TLR4受体激活先天免疫系统，并且能够诱导Thl型淋巴细胞反应的发展。因此Env-SU能够为激发自身免疫机制和与MS相关的脱髓鞘发挥佐剂作用。在EAE模型中研究这种潜在作用。
进行三个不同的实验。
1-初步实验
材料和方法
用MSRV包膜蛋白的Env-SU取代常用于多发性硬化模型“EAE”的不完全弗氏佐剂的活性成分(灭活的分支杆菌)。
材料
八只C57B16小鼠(Charles River)。
髓磷脂肽MOG(髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白)(35-55免疫级，得自Neosystem公司)。
完全弗氏佐剂(CFA)(Sigma)。
不完全弗氏佐剂(CFA)(Sigma)。
百日咳毒素(无百日咳杆菌盐)(Calbiochem)。
Env-SU(Protein Expert)。
方法
皮下注射200μl：
-阳性对照：
150μgMOG+CFA：试验了3只小鼠。
-阴性对照：
150μgMOG+IFA：试验了2只小鼠。
-Env-SU：
150μgMOG+IFA+Env-SU(50μg)：试验了3只小鼠。
然后于第0天和第2天注射200μl(IV)百日咳毒素(200ng)。
然后每天检测神经学征象。根据所观察到的神经学征象，将各不同期的征象罗列如下。
0期：没有表现神经学征象，
1期：表现软尾现象，
2期：表现行走问题，
3期：表现后肢部分瘫痪，
4期：表现后肢总体瘫痪，
5期：表现后肢瘫痪和前肢部分瘫痪，
6期：表现动物濒死或死亡。
结果：
-MOG(150μg)+CFA：3只动物中2只得病(4期)。
-MOG(150μg)+IFA：没有征象。
-MOG(150μg)+Env-SU(50μg)：3只动物中3只得病(1-6期)。
图18中显示了初步研究的结果。
初步研究显示，可使用通过TLR4受体激活免疫系统的Env-SU可作为发展MS模型、EAE的佐剂。
以使用“常规”佐剂(CFA)的阳性对照来证实实验。没有诱导自身免疫潜力的利用不完全佐剂(IFA)的阴性对照证实，需要按照特殊途径刺激免疫系统，以诱导自身免疫反应。
因此，从这个初步阶段可明显看出，MSRV/HERV-W逆转录病毒的Env蛋白能够象目前用于EAE模型的“实验”佐剂一样，借助其对中枢神经系统的影响明显地能够引起自身免疫致敏。
与CFA(其活性成分是分支结核杆菌的溶胞产物)的主要不同是，该细菌与人的多发性硬化无关，而MSRV逆转录病毒和其HERV-W家族的遗传类似物则显然与人的多发性硬化有关[2、7、8、10、61-63]。此外，携带该包膜蛋白之病毒颗粒的生物体液中的表达和循环与疾病的进展有关[10]。
因此，正是从这个初步阶段可以明显看出的，任何能够抑制该逆转录病毒家族Env包膜蛋白的有“自身免疫-诱导”免疫潜能的治疗剂都是特 别优越的，而且如果它是用体外细胞分析根据其与本发明所述的抗炎效应有关的抑制活性选择的，则将更有利。事实上，当MSRV/HERV-W Env蛋白在病毒颗粒表面表达时(可在MS患者中检测到)，抗MSRV/HERV-WEnv蛋白的单克隆抗体即是这些蛋白质的“自身免疫诱导”作用的抑制剂[8、10、62]。它们在人体治疗中的应用是显而易见的，并且根据已知目前批准并销售的用于人治疗的治疗性抗体的已知方法，生产技术也是本领域技术人员已知的，例如已被特别用于治疗风湿性关节炎的商品名为REMICADE的抗TNF-α抗体。另外，令人感兴趣并且应提到的是，这种可购得的治疗性抗体是针对促炎级联的“下游”产物的，而根据本发明，治疗靶在诱导TNF-α之前特别是通过TLR4已被抑制。
也应特别提到的是，目前推荐的MS治疗剂(皮质类固醇、β-干扰素等)只是作用于启动免疫病理学级联后产生的促炎成分的有限部分，这就解释了它们在治疗患者中的部分和相对效力。
另一方面，在活化TLR4受体途径进而活化参与该启始阶段的先天免疫之前，通过抑制MSRV/HERV-W Env蛋白的原发效应，使存在于这个阶段的仅有的免疫病理激动剂受到抑制，这就不再是该途径原发活化后分泌的多种促炎产物的情况(图8)。这一“生物学”优点为在患者体内的效力提供了独特的潜力，所有这些都是因为它是针对MS发病机理中的“关键”因子的，而不是活化过程中的任何一种副产物，可在对人MS没有作用的结核病原因子(加在完全弗氏佐剂中的结核分支杆菌)诱导的EAE模型中检测其效力。
2-实验2
完成同样类型的实验，以证实所观察到的初步结果。
方法
皮下注射200μl：
-MOG(150μg)+CFA：试验了4只小鼠。
-MOG(150μg)+IFA：试验了3只小鼠。
-MOG(150μg)+IFA+Env-SU(50μg)：试验了4只小鼠。
-MOG(150μg)+IFA+LPS(20μg)：试验了4只小鼠。
然后于第0和第2天注射200μl(IV)百日咳毒素(200ng)。
临床征象的检测
然后回收所有小鼠的脾脏并冷冻细胞悬液。
收集2只小鼠的脑并在灌注4％PFA后冷冻之(一只是3期Env小鼠的脑；一只是0期LPS小鼠的脑)。
组织学观察显示，在已给予Env蛋白的小鼠脑中可见特征性炎性损伤，已注射LPS的小鼠脑中则没有。
结果：
监测神经征象：
-MOG(150μg)+CFA：4只小鼠中4只得病(2-6期)。
-MOG(150μg)+IFA：没有观察到神经征象。
-MOG(150μg)+Env-SU(50μg)：4只小鼠中4只得病(1-5期)。
-MOG(150μg)+LPS(20μg)：没有观察到神经征象。
结果如图19所示。
这些结果证明，Env-SU能够在由EAE代表的MS模型发展中所观察到的神经征象的诱导中发挥佐剂的作用。
除使用上述对照外，利用LPS(细菌脂多糖)，因为它刺激抗原呈递细胞表面如MSRV Env蛋白的同样受体：TLR4。在这些条件下没有LPS的自身免疫-诱导效应表明，Env蛋白的免疫潜能比其他TLR4配体大得多，并且从逻辑上说，针对该蛋白质的抑制剂将是比非特异性抑制该蛋白活化的某些途径的分子更好的治疗工具。
功能性研究：
融化脾组织，然后再次用MOG肽体外刺激脾细胞，并检测IFN-g的产生(动力学和剂量反应)。
2×106个脾细胞/ml c-RPMI+10％FCS。
给出3只Env小鼠和2只IFA与LPS小鼠的平均值。
图20是在特异性自身抗原存在下，借助T淋巴细胞活化信号的干扰素-γ，举例说明了作为MOG剂量函数的反应(剂量效应)，其清楚地显示，真正的自身免疫反应是在这些条件下使用特异性刺激TLR4途径的Env-SU片段，由MSRV/HERV-W Env蛋白在该模型中诱导的。在这个MS模型中，T淋巴细胞反应并不是由于如在超级抗原的情况下那样由MSRV/HERV-W Env例如通过T受体(TCR)直接活化的，而是如本发明的许多数据所显示的，是由于在先天免疫的细胞(单核细胞/巨嗜细胞，树突细胞等)水平上更远的上游活化的结果(在并不包括任何功能性鼠淋巴细胞的SCID模型中，没有干扰素-γ的分泌、纯化的单核细胞和树突细胞的刺激和鼠巨嗜细胞细胞因子的刺激，IL-6动力学与使用LPS得到的结果平行，没有IL-6和TNF-α，但显然存在由参考超级抗原-SEB-等的同样条件下诱导的干扰素-γ)。
自身免疫T淋巴细胞反应的动力学研究在一段时间上进一步证实了这一点，该反应是针对用于检测脾细胞的加入到培养基中的髓磷脂抗原MOG(10μg/ml)，所述的脾细胞得自“EAE/MOG/Env-SU”动物和“无Env”含不完全弗氏佐剂(IFA，没有结核杆菌提取物)和MOG的对照动物。图21显示，只有给予了Env-SU的小鼠一段时间后才见有抗MOG自身免疫反应的明显进展。
因此这些结果清楚地显示，用与自身抗原有关联的Env-SU刺激，可在抗原呈递细胞的TLR4受体水平上，使Env-SU引发的级联的下游、自身反应性T淋巴细胞发育，后者单独引起干扰素-γ(IFN-g)的大量释放(见附图)，并因此导致由这些体内T淋巴细胞介导的自身免疫。
3-实验3
完成同样类型的实验以证实所观察到的初步结果，但也进行抗Env-SU抗体的治疗效果(在模型中检测到的临床结果)实验，同时用同一类型但没有同样特异性的抗体(以抗GAG单克隆抗体3H1H6为代表的)完成平行的观察。
方法
皮下注射200μl浓度为5μg/ml的抗体，即每约20克小鼠体重1μg抗体，即每公斤体重50μg抗体：
-MOG(150μg)+CFA：试验了5只小鼠。
-MOG(150μg)+IFA：试验了5只小鼠。
-MOG(150μg)+IFA+Env-SU(50μg)：试验了5只小鼠。
-MOG(150μg)+IFA+Env-SU(50μg)：试验了5只小鼠。这些小鼠也接受1mg的Ab 3B2H4，静脉注射(200μl)。
然后在第0和2天注射200μl(IP)百日咳毒素(200ng)。
结果：
所得到的结果如图22所示。
为了实验更接近于如在MS患者中的进行性自身免疫发展的条件，结果是在比以前更“温和”的条件下得到的，因为毒素是腹腔内注射的而不是象以前那样静脉注射的。
“MOG+CFA”阳性对照在这里相当于五只小鼠中的四只有临床征象，“MOG+IFA”阴性对照相当于五只小鼠中的零只受影响。
与以前的条件相比，用Env蛋白与“MOG+CFA”阳性对照一样，其平均临床记分有所降低。如在被治疗小鼠中观察到的最小损伤所说明的，在抗Env抗体存在下，这种蛋白的病原作用显示为净减少。
因此注意到，“抗Gag”抗体对Env诱导的免疫病理效应没有抑制作用，或即使因其存仅有轻微的作用，而抗体3B2H4则具有很清晰的抑制作用，其引起所观察到的曲线向“MOG+CFA”阴性对照方向移动。因此EAE型“T淋巴细胞介导的自身免疫诱导”效应的体内抑制作用是通过3B2H4与抗MSRV/HERV-W Env抗体的存在相联系的。
在多发性硬化模型“EAE”中，检测到临床效应(神经损伤)且不仅仅是相关的生物学参数。因此所研究的效应不再仅仅是如上描述的生物学效应，而是所指出的病理模型的临床翻译。因此，所检测的效应确实是一种治疗效应。本领域技术人员现已很清楚，这些是对人治疗的“临床前”治疗性验证的定性界限，因为任何后继的对人类疾病治疗验证都是必须 是基于动物模型中所获得的标准在人身上开展。
一旦
因此，所得到这些数据是必要的，并且足以最后得以临床前验证并发展到人体治疗试验。
此外，对MSRV ENV和HERV-W7q ENV(syncitin)蛋白氨基酸序列分析显示，MSRV/HERV-W家族中的氨基酸基序(motif)具有强的同源性和保守性(图23)。这反映在抗ENV单克隆抗体之间的交叉反应性上(图24)。
序列分析(参见图25)使用于评价由SEQ ID NO：1表示的ENV-SU蛋白序列中的相当于氨基酸122-131(包括在内)和/或312-316(包括在内)和/或181-186(包括在内)的感兴趣的抗原区域成为可能。
因此，在该MS动物模型中证实，根据其在细胞分析实验中表现的尤其对TLR4受体启动的促炎途径的抑制特性选择的抗MSRV/HERV-W家族特别是其原型成员MSRV逆转录病毒的单克隆抗体，构成了能够抑制这种免疫病理学潜能特别是抑制该逆转录病毒家族的ENV包膜蛋白的“自身免疫诱导性”免疫病理学潜能的治疗剂。
因此现已证明：
1)在多发性硬化患者体内检测到有包膜的MSRV病毒颗粒[4、8、10、62、64]。
2)它们的表达与疾病的演化有关[10]。
3)对MSRV Env蛋白的免疫反应与疾病的进展和严重程度有关[65]。
4)MSRV病毒颗粒具有编码MSRV Env蛋白的RNA[66]。
5)MSRV/HERV-W家族的Env蛋白在氨基酸序列水平和编码它们的基因水平上具有很强的同源性[2、5、66]。
6)MSRV Env蛋白和由人染色体7q21-22区域(HERV-W7q)中的HERV-W拷贝编码的Env蛋白具有体内和体外促炎特性(参见本申请的实例和[11、12、59])。
7)MSRV Env蛋白能够在衍生于髓磷脂的中枢神经系统的自身抗原(髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白，MOG，本专利申请的例子)的存在下再现已知的多发性硬化(MS)模型，即实验性变应性脑脊髓炎(EAE)。
8)该实验性模型是用与人类多发性硬化的病原无学关的分支结核杆菌的抗原提取物(结核病原因子)人为常规启动的。用属于内源性逆转录病毒家族HERV-W之MSRV逆转录病毒的包膜蛋白得到的该模型，其与疾病相关的表达可以病毒颗粒形式、或以在MS的脱髓鞘损伤中特异性表达的Env蛋白形式[59、67]检测到，该模型构成一种新的和独特的动物模型，这使研究以参与疾病的免疫病理的逆转录病毒因子为靶目标的治疗剂成为可能。
9)如根据干扰素γ的产生分析所证实的，与人T淋巴细胞活化有关联的促炎效应也在用MSRV Env蛋白诱导的EAE模型的鼠T淋巴细胞水平上被明确地发现(例子见本专利申请)。
10)MSRV Env蛋白的促炎效应是由淋巴样细胞和抗原呈递细胞介导的，因此也是由免疫系统介导的(见本专利申请的例子，[11、12])。
11)抗MSRV Env单克隆抗体(3B2H4和13H5A5)能够特异性地抑制MSRV Env蛋白对人血淋巴样细胞(淋巴细胞和单核细胞)的促炎效应(本专利申请的例子)。
12)抗MSRV Env蛋白单克隆抗体(3B2H4)的“特异性抑制”作用在MSRV Env诱导的EAE动物模型中得到证实。这种效应反映在与未治疗的或用同型无关抗体治疗的动物相比，其显著地改善了临床表现(本专利申请的例子)。
因此，抗MSRV/HERV-W Env单克隆抗体对炎症、自身免疫和与疾病有关的逆转录病毒因子的蛋白质诱导的神经学临床问题有抑制作用。
因此显而易见的是，已在体内和体外证实了特性的抗体，以其未修饰形式或以生物学技术特别是遗传工程技术修饰的形式构成人类疾病、多发性硬化的新的治疗剂。
本文描述了适于对这些治疗性抗体进行临床前评估的细胞分析和动物模型，从而使本领域技术人员能够在人体治疗试验前完成所需的验证步骤，并使他们能够调节与MSRV/HERV-W逆转录病毒家族有关的各种病理学。
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Claims (3)
1.抗TLR4抗体HTA125用于制备治疗与MSRV/HERV-W相关病理学的药物的用途，其中所述抗体抑制因MSRV/HERV-W活化所诱导的促炎级联反应。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述病理学是多发性硬化或精神分裂症。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述抗体HTA125与用于MSRV/HERV-W的可溶性片段的TLR4受体特异性地结合。
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